CN111518923A - 用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒。本发明巧妙的应用了特异性的基因检测区分产气荚膜梭菌与其它梭菌，通过判断，得出准确的菌信息。本发明与现有的主流检测试剂盒相比，本发明用于检测产气荚膜梭菌的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。
Description
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种通过特异性基因对产气荚膜梭菌进行荧光定量PCR检测的方法和相应的检测试剂盒。
背景技术
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是临床上气性坏疽病原菌中最多见的一种梭菌，因能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿，继而影响血液供应，造成组织大面积坏死，加之本菌在体内能形成荚膜，故名产气夹膜梭菌。
产气荚膜梭菌为革兰阳菌粗短大杆菌。芽胞呈椭圆形，位于菌体中央或次极端，芽胞直径不大于菌体，在机体内可产生明显的荚膜，无鞭毛，不能运动。生长适宜温度为37-47℃，在普通培养基上能生长，若加葡萄糖，血液，则生长更好。在庖肉培养基中培养数小时即可见到生长，产生大量气体，肉渣或肉块变为略带粉色。
致病条件与全国各地破伤风梭菌相似。产气荚膜梭菌既能产生强烈的外毒素，又有多种侵袭性酶，并有荚膜，构成其强大的侵袭力，引起感染致病。毒素的毒性虽不如肉毒毒素和破伤风毒素强，但种类多，外毒素有α、β、γ、δ、ε、η、θ、ι、κ、λ、μ、ν等12种，对人致病的主要是a型，引起气性坏疽和食物中毒。C型则引起坏死性肠炎。
食品中产气荚膜梭菌的检测，最常使用的还是参照GB 4789.13-2012《食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验》，进行样品制备，培养及试验。近年来，分子生物学技术以其高灵敏度、高特异性、实验周期短、易操作等优势逐步应用产气荚膜梭菌的检测，此项目乃开发国产基因芯片针对产气荚膜梭菌做高效且高精准度的检测。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR方法。
具体地，上述方法包括如下步骤：
S1、收集样品；
S2、提取基因组DNA；
S3、检测产气荚膜梭菌特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB；
S4、读取扩增Ct值；当所述产气荚膜梭菌特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB中至少1个基因的Ct值均小于35时，产气荚膜梭菌的检测结果为阳性；当所述荚膜梭菌特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB的Ct值大于35时，产气荚膜梭菌的检测结果为阴性。
作为一种优选技术方案，所述产气荚膜梭菌特异性基因gene1(NCBI AccessionNumber：BAB81852.1)的检测引物如SEQ ID NO:1～2所示：
SEQ ID NO:1(5'-TGGGGTAATTGTTGTGGCACT-3')；
SEQ ID NO:2(5'-TGTCCACCTACACTTTCAGCC-3')。
所述产气荚膜梭菌特异性基因gene2(NCBI Accession Number：AXH51720.1)的检测引物如SEQ ID NO:3～4所示：
SEQ ID NO:3(5'-AATAAACTTTGGTGGGAACGGAC-3')；
SEQ ID NO:4(5'-TTTCCACTACAACCGCCACC-3')；
所述产气荚膜梭菌特异性基因gene3(NCBI Accession Number：BAB80441.1)的检测引物如SEQ ID NO:5～6所示：
SEQ ID NO:5(5'-TCTGGTTTGGTAGAGCACTTGT-3')；
SEQ ID NO:6(5'-AGTGCTCCTACGTTACATCCATT-3')。
所述产气荚膜梭菌特异性基因gene4(NCBI Accession Number：AOY54621.1)的检测引物如SEQ ID NO:7～8所示：
SEQ ID NO:7(5'-TGTATAGTTGCAGCCTTGGGG-3')；
SEQ ID NO:8(5'-TCTACCACTCTTCGTTGTCCC-3')。
所述产气荚膜梭菌特异性基因rpoB(NCBI Accession Number：AB055810.1)的检测引物如SEQ ID NO:9～10所示：
5'-GTCGTCACGGTAACAAAGGG-3'；
5'-ACTTGCAGCCCATCCTAAGT-3'
本发明另一目的是提供一种用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR试剂盒，其包含上述的产气荚膜梭菌特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB的检测引物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过前期对产气荚膜梭菌和其他梭菌微生物的大量研究数据中，挖掘出能够区分产气荚膜梭菌和其他梭菌的特异性的梭菌基因，通过对特异性基因的检测，准确的判断出菌类样品和环境样品中是否含有产气荚膜梭菌，具有前期大数据的挖掘和不同种属之间比对基础，选择的特异性基因具有特异性。
(2)本发明中，通过对设计条件和实验条件的优化，选取针对于每个基因检测扩增条件处于最优化的引物作为检测引物，提高引物扩增的效率，能够达到稳定、高效、高灵敏度和重现性的检测引物，实现微量样品的正确检出。
(3)本发明能够实现从10个阳性菌到10000个阳性菌的检测范围，灵敏度高，应用范围广，更高浓度的样品可以通过稀释折算同样被检测出来，检测结果稳定，具有很好的重现性。
(4)本发明检测方法能够应用于对于环境的水体样品、临床样品、食品抽检等各个领域来源样品筛查和检测，精准地判断出样品中是否含有产气荚膜梭菌，操作方便、快速、灵敏。本发明检测试剂盒能够应用于医疗卫生监控，生活用水监控，食品安全等各个方面的快速检验，无需额外进行微生物培养，使基因检验在日常民生中得到应用，具有灵敏度高、操作性强、快速、高效等优点。
附图说明
图1是rpoB基因检测引物标准曲线。
图2的gene1基因检测引物标准曲线。
图3是gene2基因检测引物标准曲线。
图4是gene3基因检测引物标准曲线。
图5是gene4基因检测引物标准曲线。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
本发明所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。
表1
在一些实施方案中，使用扩增产物构建阳性标准品质粒，并进行引物的扩增标准曲线检测和绘制，得到每对检测引物的扩增效率，本发明所提供的引物序列其扩增效率和置信程度均在最优化的水平。
在一些实施方案中，通过对不同的阳性菌株检测特异性的基因，能够正确的区分出产气荚膜梭菌和其他梭菌，从而准确检测并判断出产气荚膜梭菌。
在一些实施方案中，通过对10个、100个、1000个和10000个阳性菌进行提取和检测，能够精确区分出产气荚膜梭菌和其他梭菌，从而准确检测并判断出产气荚膜梭菌。并且能够保证低至10个阳性菌仍然能够准确检出，而更高滴度的微生物样品可以通过稀释至检测区间，同样可以准确检出。
在一些实施方案中，采集肺泡灌洗液、皮肤分泌物、痰液、厨余和过滤水的样品，通过对特异性基因的检测，能够快速和准确的检验出样品中是否含有产气荚膜梭菌，方便快捷。
本领域技术人员应能理解，本方法中检测的基因和设计的特异性引物，同样可以通过相同检测对象的其他区段的设计达到相应的检测目的。
本发明所描述的用于检测产气荚膜梭菌荧光定量PCR的方法及试剂盒可以广泛应用于医疗卫生监控、皮肤监控、痰液监控、厨房监控、饮用水监控和食品安全监控等多个检验检疫范畴，能够为日常民生提供方便、快捷、准确、高效的基于基因检测的监控产品。
实施例1检测引物扩增标准曲线
1.微生物培养
使用碱性蛋白胨水作为荚膜梭菌的培养基，pH8.8～9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。在碱性平板上菌落直径为2mm，圆形，光滑，透明。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验。
2.基因组DNA提取
按照Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。
3.扩增产物标准品质粒制作
使用源自荚膜梭菌提取的DNA，分别以rpoB基因、gene1基因、gene2基因、gene3基因和gene4基因的引物进行扩增，扩增产物经过加A处理后，使用T4连接酶连入T载体，并且通过转导感受态细胞后，质粒得到大规模扩增。5个基因的引物序列如SEQ ID NO:1～12所示，具体如表2。
表2
4.质粒的提取和标准曲线梯度的配置
分别涂板扩增rpoB基因、gene1基因、gene2基因、gene3基因和gene4基因对应的引物扩增产物的标准品克隆菌，收集单克隆的菌斑，并通过LB培养摇菌过夜扩增，最后得到5ml指数生长期的质粒阳性菌株，按照QIAGEN Plasmid Midi Kit说明书指示进行质粒DNA的提取。提取后检测质粒DNA的浓度，并通过10倍稀释的方法，配置6个浓度梯度的标准品，浓度梯度分别为1μg/μL，100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL。
5.检测引物标准曲线绘制
按照BioRad iQ SYBR Green SuperMix说明书指示进行浓度梯度标准曲线的qPCR扩增，并且绘制对应的扩增曲线，得到每对引物的扩增效率。每一个qPCR的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，qPCR反应体系和扩增反应条件如表3所示。
表3
6.结果分析
检测引物扩增标准曲线结果显示，rpoB基因、gene1基因、gene2基因、gene3基因和gene4基因对应的引物均为经过优化的引物设计和反应体系。其中线性的标准曲线可信度R2>0.990，高扩增效率在88-120％，证明引物设计和反应体系是最优状态。分析5个基因的扩增曲线的相关性系数和可信度，以及6个浓度梯度下的扩增效率，均达到最优状态的要求，5对引物在该反应条件下能够满足检测要求。
表4
| 基因名 | 斜率 | 截距 | 扩增效率 | 可信度R<sup>2</sup> |
| rpoB | -2.9291 | 30.579 | 119.48％ | 0.9962 |
| gene1 | -2.9499 | 35.448 | 118.27％ | 0.9908 |
| gene2 | -3.4278 | 37.087 | 95.76％ | 0.9964 |
| gene3 | -3.1874 | 33.572 | 105.94％ | 0.9900 |
| gene4 | -3.6427 | 35.681 | 88.16％ | 0.9907 |
实施例2阳性及阴性样品检测情况
1.微生物培养
同实施例1。
2.基因组DNA提取
同实施例1。
3.5个目标基因的qPCR检测
按照BioRad iQ SYBR Green SuperMix说明书指示进行样品的qPCR扩增，并且得到每对引物对应的Ct值读数。每一个qPCR的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，qPCR反应体系和扩增反应条件如表5所示。
表5
4.结果分析
5对引物的qPCR扩增结果显示，产气荚膜梭菌呈现gene1基因、gene2基因、gene3基因、gene4基因和rpoB基因阳性，而其他梭菌均显示阴性结果。因此，进行gene1基因、gene2基因、gene3基因、gene4基因和rpoB基因的检测，能够较好的区分产气荚膜梭菌和其他梭菌。综上所述，gene1基因、gene2基因、gene3基因、gene4基因和rpoB基因的对应引物，能够满足产气荚膜梭菌和其他梭菌的检测判断。
表6
实施例3检测体系的灵敏度
1.微生物培养
使用碱性蛋白胨水作为荚膜梭菌的培养基，pH8.8～9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。在碱性平板上菌落直径为2mm,圆形，光滑，透明。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验，收集菌体后进行浓度计算，并且10稀释得到10个菌/ml，100个菌/ml，1000个菌/ml，和10000个菌/ml，对不同浓度梯度的菌液进行后续的DNA提取实验。
2.基因组DNA提取
同实施例1。
3.5个目标基因的qPCR检测
同实施例2。
4.结果分析
5对引物的qPCR扩增结果显示，从10个菌至10000个菌的范围内，产气荚膜梭菌呈现gene1基因、gene2基因、gene3基因、gene4基因和rpoB基因的阳性结果。因此，进行gene1基因、gene2基因、gene基因3、gene4基因和rpoB基因的检测，能够较好的达到从10个菌至10000个菌的范围内产气荚膜梭菌和其他梭菌的检测和区分。综上所述，可以通过gene1基因、gene2基因、gene3基因、gene4基因和rpoB基因的检测，较好的完成产气荚膜梭菌的检测，检测范围可以从10个菌株至10000个菌株，更高的菌株浓度也可以通过稀释的方法稀释至最佳检测范围内，能够达到预期的检测要求。
表7
实施例4环境样品的检测
1.环境样品收集和基因组DNA的提取
分别收集不同的肺泡灌洗液、皮肤分泌物、痰液、厨余和过滤水，按照Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。
2.5个目标基因的qPCR检测
同实施例2。
3.结果分析
5对引物的qPCR扩增结果显示，除了皮肤分泌物、厨余、过滤水、肺泡灌洗液1、肺泡灌洗液4，其他样品均检出gene1基因、gene2基因、gene3基因、gene4基因和rpoB基因的一个或者一个以上，证明对应的样品来源中含有产气的荚膜梭菌。最终判断为产气荚膜梭菌阳性的准则为gene1基因、gene2基因、gene3基因、gene4基因和rpoB基因中的一个及以上检测得到Ct值小于35个循环。如果gene1基因、gene2基因、gene3基因、gene4基因和rpoB基因均检测得到Ct值大于35个循环，则判断为产气荚膜梭菌阴性未检出。
表10
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州微芯生物科技有限公司
<120> 用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tggggtaatt gttgtggcac t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtccaccta cactttcagc c 21
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aataaacttt ggtgggaacg gac 23
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttccactac aaccgccacc 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tctggtttgg tagagcactt gt 22
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agtgctccta cgttacatcc att 23
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgtatagttg cagccttggg g 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tctaccactc ttcgttgtcc c 21
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gtcgtcacgg taacaaaggg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acttgcagcc catcctaagt 20
Claims (7)
1.一种用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、收集样品；
S2、提取基因组DNA；
S3、检测产气荚膜梭菌特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB；
S4、读取扩增Ct值；当所述产气荚膜梭菌特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB中至少1个基因的Ct值均小于35时，产气荚膜梭菌的检测结果为阳性；当所述荚膜梭菌特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB的Ct值大于35时，产气荚膜梭菌的检测结果为阴性。
2.根据权利要求1所述的用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述产气荚膜梭菌特异性基因gene1的检测引物如SEQ ID NO:1～2所示。
3.根据权利要求1所述的用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述产气荚膜梭菌特异性基因gene2的检测引物如SEQ ID NO:3～4所示。
4.根据权利要求1所述的用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述产气荚膜梭菌特异性基因gene3的检测引物如SEQ ID NO:5～6所示。
5.根据权利要求1所述的用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述产气荚膜梭菌特异性基因gene4的检测引物如SEQ ID NO:7～8所示。
6.根据权利要求1所述的用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述产气荚膜梭菌特异性基因rpoB的检测引物如SEQ ID NO:9～10所示。
7.一种用于检测产气荚膜梭菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包含所述的产气荚膜梭菌特异性基因gene1、gene2、gene3、gene4和rpoB的检测引物。
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |