CN103740839B - 荧光定量pcr检测肉毒杆菌的通用型试剂盒及非诊断性检测方法 - Google Patents

荧光定量pcr检测肉毒杆菌的通用型试剂盒及非诊断性检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN103740839B
CN103740839B CN201410026867.4A CN201410026867A CN103740839B CN 103740839 B CN103740839 B CN 103740839B CN 201410026867 A CN201410026867 A CN 201410026867A CN 103740839 B CN103740839 B CN 103740839B
Authority
CN
China
Prior art keywords
botulinal
fluorescence quantitative
quantitative pcr
test kit
taqman probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410026867.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN103740839A (zh
Inventor
高珊珊
孙晓明
王新杰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BEIJING YISEN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Original Assignee
BEIJING YISEN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BEIJING YISEN BIOTECHNOLOGY Co Ltd filed Critical BEIJING YISEN BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority to CN201410026867.4A priority Critical patent/CN103740839B/zh
Publication of CN103740839A publication Critical patent/CN103740839A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN103740839B publication Critical patent/CN103740839B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了荧光定量PCR检测肉毒杆菌的通用型试剂盒及方法，所述试剂盒包括PCR反应液，所述PCR反应液包括具有如下核苷酸序列的引物对和Taqman探针：上游引物：5’-TGCCTAAAATAGGAATCGATGAA-3’，下游引物：5’-CCACCATTGATCTAAGAAGTCATAG-3’，Taqman探针:5’-ACCTAATAGTATGTTGAATC-3’。本发明提供的荧光定量PCR检测肉毒杆菌的通用型试剂盒，能够快速、有效地检测8个型肉毒杆菌，所述检测方法准确性、特异性和敏感性高，稳定性好，可实现对待测样品如食品、血液及组织样品的快速诊断和有效检测。

Description

荧光定量PCR检测肉毒杆菌的通用型试剂盒及非诊断性检测方法
技术领域
本发明涉及细菌的分子生物学检测技术领域，特别是涉及荧光定量PCR检测肉毒杆菌的通用型试剂盒及方法。
背景技术
肉毒杆菌是一种生长在缺氧环境下的细菌，在罐装食品及密封腌渍食物中具有极强的生存能力，摄食含肉毒杆菌的食品可引发食物中毒。肉毒杆菌是一种致命病菌，它在繁殖过程中分泌的毒素是毒性最强的蛋白质之一。人们食入和吸收这种毒素后，神经系统将遭到破坏，出现头晕、呼吸困难和肌肉乏力等症状。根据抗原性的不同，肉毒杆菌可分为8个型，分别是A、B、Cα、Cβ、D、E、F和G型。其中A、B、E、F和G型主要引发人类发病，Cα、Cβ、D主要引发动物发病。
目前检测肉毒杆菌所采用的方法主要还是传统常规的分离鉴定法、Elisa方法及普通PCR检测。传统常规的分离鉴定法，操作烦琐、耗时长、漏诊率高；ELISA方法相对简便、快速，但对于微量或杂质较多的样品，其特异性和灵敏度较低，可能造成漏诊或误诊。PCR作为一种新型的分子生物学技术，自诞生以来，由于它的特异性、敏感性高，能在短时间内得到大量的目的片段，使之成为当今发明研究的重要手段之一。但常规的PCR在操作中容易造成污染，假阳性较高，使之在诊断上受到一些限制。因此，有必要建立一种快速、灵敏、准确度高的肉毒杆菌检测方法。
定量检测技术-实时荧光定量PCR(Real-time PCR，qPCR)，该方法与传统方法不同，它的优点：一是单管封闭操作，有效解决了PCR污染问题；二是自动化程度高；三是特异性更强；四是PCR反应的实时监控。有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果；五是绝对定量，由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行绝对定量测定。SYBRGreen染料法已是较完善的检测体系，且反应体系中SYBRGreen染料的使用浓度亦不用进行调整优化，整个检测体系简单易行，但用SYBRGreen染料法进行Real-timePCR也存在着一定的弊端，如结果需要进行熔解曲线分析，特别是进行多重基因检测或引物质量不好时，其扩增的原始图则不能直观反映真实的扩增效率，必需经熔解曲线分析来确定最终的发明结果。实时荧光定量PCR技术自产生以来，不断发展完善，到目前为止已经非常成熟了。标记方法由最初单一的染料法，发展到了特异性更高的探针法，如Taqman、Molecular Beacon等。
发明内容
本发明的一个目的是提供荧光定量PCR检测肉毒杆菌的通用型试剂盒，使其能够快速、有效地检测8个型肉毒杆菌，准确性、特异性和敏感性高，稳定性好，实现对待测样品如食品、血液及组织样品的快速诊断和有效检测。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
荧光定量PCR检测肉毒杆菌的通用型试剂盒，包括PCR反应液，所述PCR反应液包括具有如下核苷酸序列的引物对和Taqman探针：
上游引物：5’-TGCCTAAAATAGGAATCGATGAA-3’，
下游引物：5’-CCACCATTGATCTAAGAAGTCATAG-3’，
Taqman探针:5’-ACCTAATAGTATGTTGAATC-3’。
进一步地，所述Taqman探针的核苷酸序列的3’端标记MGB荧光淬灭基团。
进一步地，所述Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记HEX或FAM荧光报告基团。
进一步地，所述PCR反应液还包括2×Premix EX Taq。
进一步地，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照，所述阳性对照为肉毒杆菌基因组DNA。
本发明的另一个目的是提供荧光定量PCR检测肉毒杆菌的方法，可快速地检测8个型肉毒杆菌，且准确性、特异性和敏感性较高。采用如下技术方案：
荧光定量PCR检测肉毒杆菌的方法，采用具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探针进行荧光定量PCR：
上游引物：5’-TGCCTAAAATAGGAATCGATGAA-3’，
下游引物：5’-CCACCATTGATCTAAGAAGTCATAG-3’，
Taqman探针:5’-ACCTAATAGTATGTTGAATC-3’。
进一步地，所述Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记HEX报告荧光基团，3’端标记MGB淬灭荧光基团。
进一步地，所述荧光定量PCR反应体系为20μl，包括：上游引物0.4μl；下游引物0.4μl；Taqman探针0.8μl；检测样品DNA 1μl；2×Premix EX Taq 10μl，余量为灭菌去离子水。
进一步地，所述20μl的荧光定量PCR反应体系还包括：50×ROX  Reference Dye Ⅰ/Ⅱ0.4μl。
进一步地，所述荧光定量PCR反应条件为：95℃30s，为第一步循环；95℃5s，60℃34s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
由于采用上述技术方案，本发明至少具有以下优点：
(1)本发明根据国家疾病控制中心标准毒株(CDC 54096)的保守序列设计通用型引物，合成特异性引物及Taqman-MGB探针，采用荧光定量PCR方法快速灵敏地检测8个型肉毒杆菌，且准确性、特异性和敏感性高，稳定性好，可实现对待测样品如食品、血液及组织样品的快速诊断和有效检测。
(2)本发明一方面采用了高拷贝的靶基因，一方面采用Taqman-MGB探针荧光定量PCR检测法，使得利用Taqman-MGB探针法荧光定量PCR检测肉毒杆菌的灵敏度约是普通PCR的100倍。
(3)由于采用定量检测技术-Taqman-MGB荧光定量PCR(Real-time PCR)，该方法(Real-time PCR)具有单管封闭操作防污染、自动化程度高、特异性强、可实时监控等优点，有效地解决了传统方法只能终点检测的局限。
(4)由于探针的3’端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间上的位置更接近，实验灵敏度更高，特异性更强。
(5)Taqman-MGB探针法荧光定量PCR方法简便、快速，整个过程(包括加样)可在一个小时内完成，计算机自动报告结果，无需电泳及其他后续的工作，即方便了操作又减少了污染。
附图说明
上述仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术 手段，以下结合附图与具体实施方式对本发明作进一步的详细说明。
图1是检测肉毒杆菌的荧光定量PCR扩增曲线。
图2是肉毒杆菌Taqman-MGB探针法荧光定量PCR特异性检测结果；图中，1：肉毒杆菌；2：灭菌的去离子水；3：大肠杆菌；4：单增李斯特菌；5：志贺氏菌。
图3是肉毒杆菌Taqman-MGB探针法荧光定量PCR的敏感性检测结果；图中，1：1×105CFU/mL；2：1×104CFU/mL；3：1×103CFU/mL；4：1×102CFU/mL；5：1×101CFU/mL；6：1×100CFU/mL；7：阴性样品(灭菌的去离子水)。
具体实施方式
除非特别指明，以下实施例中所用菌株由北京亿森宝生物科技有限公司分离保存。
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商购获得。
实施例1荧光定量PCR检测肉毒杆菌的方法
1、设计引物和Taqman-MGB探针
根据国家疾病控制中心标准毒株(CDC 54096)的部分序列，通过DNAstar软件进行序列比对，找出肉毒杆菌基因序列的特异性保守序列。运用Primer Primer 5.0软件进行引物和探针的设计。得到多对特异性引物和探针，经过比对筛选，最终确定一组最佳引物和一条Taqman-MGB探针，目的片段为143bp，其核苷酸序列为序列表中序列4。
上游引物(BL-F)：5’-TGCCTAAAATAGGAATCGATGAA-3’；
下游引物(BL-R)：5’-CCACCATTGATCTAAGAAGTCATAG-3’；
探针(BL-Taqman-MGB)：5’-HEX-ACCTAATAGTATGTTGAATC-MGB-3’。
其中探针的5’端标记HEX报告荧光基团，荧光探针的3’端标记MGB淬灭荧光基团。其中，报告荧光基团也可以选择FAM等其他基团。猝灭荧光基团选择MGB的原因在于，TaqMan-MGB探针与传统的TaqMan-TAMRA探针比较具有以下优势：(1)提高TM值--平均15bases可提高18℃，这样可以使探针的长度缩短，尤其对AT含量高的序列设计有很大的帮助，并且提高配对与非配对模板间的TM值差异。(2)提高信噪比--由于在探针的3’端的淬灭基团为不发光的荧光基团，并且与报告基团在空间的位置更接近，实验结果更精确，分辨率更高。
2、肉毒杆菌基因组DNA提取
利用细菌基因组DNA提取试剂盒(天根生化科技北京有限公司，货号DP302)提取肉毒杆菌的基因组DNA。放置于-20℃备用。
3、荧光定量PCR扩增：
按照如下反应体系进行Taqman-MGB探针法荧光定量PCR：
将一定量的检测样品的DNA模板加入PCR管中，放置于荧光定量PCR仪中进行扩增。同时分别设置阳性对照和阴性对照，其中阳性对照为肉毒杆菌基因组DNA，阴性对照为灭菌的去离子水。
荧光定量PCR反应条件如下：95℃30s，为第一步循环；95℃5s，60℃34s，为第二步40个循环。第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
实验结果如图1，结果显示肉毒杆菌基因组DNA使用荧光定量PCR检测为阳性扩增，Ct值为19.55，有S形扩增曲线。阴性样品则无扩增曲线。从扩增曲线上可以看到，在扩增的前期，特别是在荧光临界值(threshold)附近，曲线重合性较好。
实施例2、荧光定量PCR检测肉毒杆菌的方法的特异性和敏感性验证
1、特异性验证 
肉毒杆菌、大肠杆菌、单增李斯特菌、志贺氏菌菌液在胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤培养基中，置26℃培养3-5天后，提取菌液基因组DNA。将提取的肉毒杆菌、大肠杆菌、单增李斯特菌、志贺氏菌菌液基因组DNA作为模板，灭菌去离子水作为阴性对照，进行Taqman探针法荧光定量PCR反应，记录结果。结果如图2所示，肉毒杆菌DNA模板在20.08Ct处有扩增，扩增曲线呈S形，大肠杆菌、单增李斯特菌、志贺氏菌DNA模板以及阴性对照样品无非特异性扩增。所得结果与预期完全吻合。
2、敏感性验证 
肉毒杆菌菌液在胰蛋白胨葡萄糖酵母浸膏肉汤培养基中，置26℃培养3-5天后，进行菌落计数，然后将浓度为1×105CFU/mL的菌液进行10倍梯度稀释。提取各梯度浓度菌液的基因组DNA作为模板，无菌水作为阴性对照，进行Taqman探针法荧光定量PCR反应，结果显示，20μl反应体系中，最低 检测下线为27.61CFU/mL，如图3所示，在最佳反应条件下，最低检测限1×102CFU/mL的基因组DNA起始模板的Ct值大约为27.61，因此反应循环数40可大大满足最低检测要求。从不同浓度起始模板的扩增曲线可以看出，S曲线基线平整，指数区明显，斜率较大，这些均说明在该条件下模板的扩增是较为理想的。
实施例3：荧光定量PCR检测肉毒杆菌的通用型试剂盒的制备及检测
1、试剂盒的制备：
配制如下试剂并保存。
试剂1：肉毒杆菌荧光PCR反应液1mL；
试剂2：50×ROX Reference Dye Ⅰ/Ⅱ             20μl；
试剂3：阳性对照(肉毒杆菌基因组DNA)             1mL；
试剂4：阴性对照(灭菌去离子水)                  1mL。
2、试剂盒的稳定性分析
1)选取3个已知阳性的样品，分别进行批内重复检测和批间重复检测。批内重复检测：将3个已知阳性样品在同一批实验中进行，每个样品设置3个重复。批间重复实验：将3个已知阳性样品分批次检测，每个样品单独检测，每个样品设置3个重复。
2)每管肉毒杆菌荧光定量PCR反应体系为20μl：需19μl试剂1，试剂2(阳性对照)或试剂3(阴性对照)1μl。(50×ROX Reference Dye Ⅰ/Ⅱ根据荧光定量PCR仪需要选择是否添加)
3)Taqman探针法荧光定量PCR扩增反应条件为：95℃30s，为第一步循环；95℃5s，60℃34s，第二步40个循环，并记录实验结果。从表1中的检测结果分析，可以看出批内变异系数在0.27％-1.48％之间，批间变异系数在0.78％-1.20％之间，说明本试剂盒稳定性良好。
表1 试剂盒稳定性分析
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，本领域技术人员利用上述揭示的技术内容做出些许简单修改、等同变化或修饰，均落在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.荧光定量PCR检测肉毒杆菌的通用型试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括具有如下核苷酸序列的引物对和Taqman探针：
上游引物：5’-TGCCTAAAATAGGAATCGATGAA-3’，
下游引物：5’-CCACCATTGATCTAAGAAGTCATAG-3’，
Taqman探针:5’-ACCTAATAGTATGTTGAATC-3’。
2.根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测肉毒杆菌的通用型试剂盒，其特征在于，所述Taqman探针的核苷酸序列的3’端标记MGB荧光淬灭基团。
3.根据权利要求2所述的荧光定量PCR检测肉毒杆菌的通用型试剂盒，其特征在于，所述Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记HEX或FAM荧光报告基团。
4.根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测肉毒杆菌的通用型试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液还包括2×Premix EX Taq。
5.根据权利要求1所述的荧光定量PCR检测肉毒杆菌的通用型试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照、阴性对照，所述阳性对照为肉毒杆菌基因组DNA。
6.荧光定量PCR检测肉毒杆菌的非诊断性检测方法，其特征在于，采用具有如下核苷酸序列的引物和Taqman探针进行荧光定量PCR：
上游引物：5’-TGCCTAAAATAGGAATCGATGAA-3’，
下游引物：5’-CCACCATTGATCTAAGAAGTCATAG-3’，
Taqman探针:5’-ACCTAATAGTATGTTGAATC-3’。
7.根据权利要求6所述的荧光定量PCR检测肉毒杆菌的非诊断性检测方法，其特征在于，所述Taqman探针的核苷酸序列的5’端标记HEX报告荧光基团，3’端标记MGB淬灭荧光基团。
8.根据权利要求6所述的荧光定量PCR检测肉毒杆菌的非诊断性检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应体系为20μl，包括：上游引物0.4μl；下游引物0.4μl；Taqman探针0.8μl；检测样品DNA 1μl；2×Premix EX Taq 10μl，余量为灭菌去离子水。
9.根据权利要求8所述的荧光定量PCR检测肉毒杆菌的非诊断性检测方法，其特征在于，所述20μl的荧光定量PCR反应体系还包括：50×ROXReference Dye Ⅰ/Ⅱ 0.4μl。
10.根据权利要求6所述的荧光定量PCR检测肉毒杆菌的非诊断性检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应条件为：95℃30s，为第一步循环；95℃5s，60℃34s，为第二步40个循环，所述第二步每个循环的延伸结束时进行荧光信号检测。
CN201410026867.4A 2014-01-21 2014-01-21 荧光定量pcr检测肉毒杆菌的通用型试剂盒及非诊断性检测方法 Active CN103740839B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410026867.4A CN103740839B (zh) 2014-01-21 2014-01-21 荧光定量pcr检测肉毒杆菌的通用型试剂盒及非诊断性检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410026867.4A CN103740839B (zh) 2014-01-21 2014-01-21 荧光定量pcr检测肉毒杆菌的通用型试剂盒及非诊断性检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN103740839A CN103740839A (zh) 2014-04-23
CN103740839B true CN103740839B (zh) 2015-08-05

Family

ID=50497904

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410026867.4A Active CN103740839B (zh) 2014-01-21 2014-01-21 荧光定量pcr检测肉毒杆菌的通用型试剂盒及非诊断性检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN103740839B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105018633A (zh) * 2015-08-13 2015-11-04 深圳太太基因工程有限公司 一种用于以荧光pcr检测样品中肉毒杆菌的引物对、探针和包含其的试剂盒
CN109022603A (zh) * 2018-07-09 2018-12-18 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 检测b型肉毒梭菌的实时荧光定量pcr核酸序列以及试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101381774A (zh) * 2008-10-15 2009-03-11 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 肉毒梭菌环介导等温扩增快速检测方法
CN103497999A (zh) * 2013-09-29 2014-01-08 杨波 一种用于肉毒杆菌lamp核酸检测引物组和试剂盒

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101381774A (zh) * 2008-10-15 2009-03-11 山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 肉毒梭菌环介导等温扩增快速检测方法
CN103497999A (zh) * 2013-09-29 2014-01-08 杨波 一种用于肉毒杆菌lamp核酸检测引物组和试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A 型肉毒梭菌atx 基因TaqMan 探针荧光定量PCR 检测;王春晖 等;《中国公共卫生》;20120630;第28卷(第6期);863-865 *
Application of Real-Time PCR for Quantitative Detection of Clostridium botulinum Type A Toxin Gene in Food;So-Yeon Yoon 等;《Microbiol. Immunol.》;20051231;第49卷(第6期);505–511 *
肉毒梭菌的荧光定量PCR检测方法;张瑞玲 等;《农产品加工》;20111031(第10期);14-16 *
荧光定量聚合酶链反应检测乳品中肉毒梭菌;孙丽华 等;《乳业科学与技术》;20131231;第36卷(第6期);24-26 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN103740839A (zh) 2014-04-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107022644A (zh) 果蔬中六种食源性致病菌多重lamp检测引物、检测试剂盒及检测方法
CN105624330A (zh) 同时检测12种猪常见病毒及细菌Taqman-MGB荧光定量PCR试剂盒及方法
CN110734994B (zh) 用于检测嗜水气单胞菌的特异性引物对、探针和检测试剂盒
CN104726567A (zh) 一种无乳链球菌环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN108866244A (zh) 检测对虾虹彩病毒的rpa引物和探针、试剂盒及其方法
CN104059977A (zh) 一种沙门氏菌血清型鉴定方法及其试剂盒
CN105936935B (zh) 一种快速鉴定特定血清型沙门菌的pcr检测试剂盒
CN108504780A (zh) 同时检测8种羊常见病毒及细菌Taqman荧光定量PCR试剂盒及方法
CN102676664B (zh) 同时检测多种水产品致病菌的荧光定量pcr引物和探针及检测方法
CN111485028A (zh) 用于检测罗非鱼无乳链球菌的荧光定量pcr方法及相应试剂盒
CN105567874A (zh) 猪德尔塔冠状病毒荧光定量pcr检测试剂盒及非诊断性检测方法
CN103740864A (zh) 一种高致病性猪蓝耳病毒荧光定量qRT-PCR检测方法及检测试剂盒
CN103740839B (zh) 荧光定量pcr检测肉毒杆菌的通用型试剂盒及非诊断性检测方法
CN109055618A (zh) 用于检测传染性脾肾坏死病毒的特异性引物对、探针、检测试剂盒
CN110699470A (zh) 一种检测沙门氏菌并鉴别鸡白痢/鸡伤寒血清型的双重pcr引物、试剂盒、应用和方法
CN115747361A (zh) 检测海豚链球菌的实时荧光mira和mira-lfd引物组及检测方法
CN104651518A (zh) 一种海豚链球菌环介导等温扩增试剂盒及其应用
CN112195258B (zh) 水禽多种致病菌的多重pcr检测试剂盒及其应用
CN101974621B (zh) 一种牛巴贝斯虫lamp检测方法
CN102417930B (zh) 基于环介导等温扩增技术的鸭疫里默氏杆菌的核酸检测方法
CN104561343B (zh) 区分检测低致病性和高致病性莫氏巴贝虫的引物及试剂盒
CN104846067A (zh) 单核增生李斯特菌和屎肠球菌双重pcr检测试剂盒及检测方法
CN115029460A (zh) 一种副猪嗜血杆菌的即时可视化检测方法
CN104894232A (zh) 弗氏柠檬酸杆菌荧光定量pcr诊断试剂盒
CN112111584A (zh) 快速检测水中大肠埃希氏菌的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant