CN111534614A - 用于检测产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 - Google Patents

用于检测产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒。本发明巧妙的应用了特异性的基因检测区分脑膜炎奈瑟氏球菌与其它球菌属，以及产毒和非产毒的球菌属，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明与现有的主流检测试剂盒相比，本发明用于检测产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

Description

用于检测产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的荧光定量PCR方法及相应 的试剂盒
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种通过特异性基因对产毒脑膜炎奈瑟氏球菌进行荧光定量PCR检测的方法和相应的检测试剂盒。
背景技术
脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)是一种革兰氏染色阴性的好氧型双球菌，常呈双排列，直径约为0.8μm。脑膜炎奈瑟菌分解糖类产酸不产气。氧化酶试验阳性。脑膜炎奈瑟菌可产生自溶酶，人工培养时若不及时移种，数日后菌体自溶。脑膜炎奈瑟菌主要抗原包括荚膜多糖抗原、外膜蛋白和脂多糖抗原。根据荚膜多糖抗原性不同，可将脑膜炎奈瑟菌分为至少13个血清群。与人类疾病关系密切的主要是A、B、C、Y及W-135群。脑膜炎奈瑟菌A群及C群是引起脑膜炎流行的主要血清群。
人类是脑膜炎奈瑟菌唯一的易感宿主。细菌由鼻咽部侵入机体，依靠菌毛的作用粘附于鼻咽部粘膜上皮细胞表面。多数人感染后表现为带菌状态或隐性感染，细菌仅在体内短暂停留后被机体清除。只有少数人发展成脑膜炎。我国引起脑膜炎的主要是A群菌，B群常为带菌状态。当脑膜炎奈瑟菌侵入血流时，会引起菌血症，伴随恶寒、发热、呕吐、皮肤出血性瘀斑等症状。
流行性脑膜炎的临床诊断通常以出现发热、呕吐、头痛等临床症状为依据。进一步的确诊则需在病人脑脊液中分离到脑膜炎双球菌。但分离培养方法的检出阳性率较低，并且至少需要2～3天才能确诊感染，这对疾病的及时治疗极为不利。此外，受抗生素使用及其他非特异性因素的影响，分离培养法的灵敏度不高，极大地降低了诊断结果的可靠性。因此，寻找一种快速、灵敏并且适用于临床诊断的检测方法已显得非常紧要。近年来，丰富的基因组数据为分子诊断技术锁定脑膜炎奈瑟菌特异性序列提供了参考数据库。当前，分子生物学技术正以其高灵敏度、高特异性、实验周期短、易操作等优势逐步应用于脑膜炎奈瑟菌的诊断检测。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种用于检测产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的荧光定量PCR方法。
具体地，上述方法包括如下步骤：
S1、收集样品；
S2、提取基因组DNA；
S3、检测脑膜炎奈瑟氏球菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2和gene3以及产毒特异性基因gene4；
S4、读取扩增Ct值；当所述脑膜炎奈瑟氏球菌属特异性基因中至少1个基因和所述产毒特异性基因的Ct值均小于35时，产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的检测结果为阳性；当所述脑膜炎奈瑟氏球菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2和gene3的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene4的Ct值大于35时，产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的检测结果为阴性。
作为一种优选技术方案，所述脑膜炎奈瑟氏球菌属特异性基因rpoB(NCBIAccession Number：S74030.1)的检测引物如SEQ ID NO:1～2所示；
SEQ ID NO:1(5'-ATGCGCGCACCAATGATTAC-3')；
SEQ ID NO:2(5'-ATAGCGGCCTTCTTCGATGG-3')。
所述脑膜炎奈瑟氏球菌属特异性基因gene1(NCBI Accession Number：VEJ36534.1)的检测引物如SEQ ID NO:3～4所示；
SEQ ID NO:3(5'-ACCATCTTGATGACAGCCGG-3')；
SEQ ID NO:4(5'-TTTATTACATAGTCATCGCCGCG-3')。
所述脑膜炎奈瑟氏球菌属特异性基因gene2(NCBI Accession Number：PKU18905.1)的检测引物如SEQ ID NO:5～6所示；
SEQ ID NO:5(5'-AAAGCGGCGTAATGAGTTGC-3')；
SEQ ID NO:6(5'-GTTGCCCTGATGACCAAAGC-3')。
所述脑膜炎奈瑟氏球菌属特异性基因gene3的检测引物如SEQ ID NO:7～8所示；
SEQ ID NO:7(5'-TTGGTTTCTCGTCCGCTTTG-3')(NCBI Accession Number：VEJ44165.1)；
SEQ ID NO:8(5'-GTATTTCTTCTTTGATCGGGCCG-3')(NCBI Accession Number：VEJ44166.1)。
所述产毒特异性基因gene4(NCBI Accession Number：VEJ44168.1)的检测引物如SEQ ID NO:9～10所示。
SEQ ID NO:9(5'-GGTTTTGGAAAGCAGCCGTT-3')；
SEQ ID NO:10(5'-ACCCGCTCTCTTTCACCAAG-3')。
本发明另一目的是提供一种用于检测产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的荧光定量PCR试剂盒，其包含上述的脑膜炎奈瑟氏球菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2和gene3的检测引物和产毒特异性基因gene4的检测引物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过前期对脑膜炎奈瑟氏球菌属和其他球菌属，产毒和非产毒球菌属的微生物的大量研究数据中，挖掘出能够区分脑膜炎奈瑟氏球菌属和其他球菌属，产毒和非产毒球菌属的特异性的孤儿基因，通过对特异性基因的检测，准确的判断出菌类样品和环境样品中是否含有产毒的脑膜炎奈瑟氏球菌，具有前期大数据的挖掘和不同种属之间比对基础，选择的特异性基因具有物种和菌属的特异性。
(2)本发明中，通过对设计条件和实验条件的优化，选取针对于每个基因检测扩增条件处于最优化的引物作为检测引物，提高引物扩增的效率，能够达到稳定、高效、高灵敏度和重现性的检测引物，实现微量样品的正确检出。
(3)本发明检测方法与市面上其他的检测方法相比，本发明的两部分检测策略，能够分步判断脑膜炎奈瑟氏球菌属和其他球菌属、产毒和非产毒球菌属，判断必须两项同时阳性检出才最终判断为产毒脑膜炎奈瑟氏球菌，结果更加严谨和准确。
(4)本发明能够实现从10个阳性菌到10000个阳性菌的检测范围，灵敏度高，应用范围广，更高浓度的样品可以通过稀释折算同样被检测出来，检测结果稳定，具有很好的重现性。
(5)本发明检测方法能够应用于对于临床医学中的组织、器官灌洗液、体外分泌物、排泄物、脑脊液等多方面来源临床样品筛查和检测，精准地判断出该临床样品中是否含有产毒的脑膜炎奈瑟氏球菌，操作方便、快速、灵敏。本发明检测试剂盒能够应用于多种临床样品的快速检验，无需额外进行微生物培养，使基因检验在临床检测和日常民生中得到应用，具有灵敏度高、操作性强、快速、高效等优点。
附图说明
图1是rpoB基因检测引物标准曲线。
图2的gene1基因检测引物标准曲线。
图3是gene2基因检测引物标准曲线。
图4是gene3基因检测引物标准曲线。
图5是gene4基因检测引物标准曲线。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
本发明所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。
表1
Figure BDA0002270143750000061
Figure BDA0002270143750000071
在一些实施方案中，使用扩增产物构建阳性标准品质粒，并进行引物的扩增标准曲线检测和绘制，得到每对检测引物的扩增效率，本发明所提供的引物序列其扩增效率和置信程度均在最优化的水平。
在一些实施方案中，通过对不同的阳性菌株检测特异性的基因，能够正确的区分出脑膜炎奈瑟氏球菌属和其他球菌属，产毒和非产毒球菌属，从而准确检测并判断出产毒脑膜炎奈瑟氏球菌。
在一些实施方案中，通过对10个、100个、1000个和10000个阳性菌进行提取和检测，能够精确区分出脑膜炎奈瑟氏球菌属和其他球菌属，产毒和非产毒球菌属，从而准确检测并判断出产毒脑膜炎奈瑟氏球菌。并且能够保证低至10个阳性菌仍然能够准确检出，而更高滴度的微生物样品可以通过稀释至检测区间，同样可以准确检出。
在一些实施方案中，采集包括肺泡灌洗液、皮肤分泌物、尿液、脑脊液以及过滤水的临床样品，通过对特异性基因的检测，能够快速和准确的检验出样品中是否含有产毒脑膜炎奈瑟氏球菌，方便快捷。
本领域技术人员应能理解，本方法中检测的基因和设计的特异性引物，同样可以通过相同检测对象的其他区段的设计达到相应的检测目的。
本发明所描述的用于检测产毒脑膜炎奈瑟氏球菌荧光定量PCR的方法及试剂盒可以广泛应用于组织、器官灌洗液检测、体内外分泌物检测、体外排泄物检测、脑脊液检测、饮用水监控等多个检验检疫范畴，能够为临床医院、日常民生提供方便、快捷、准确、高效的基于基因检测的监控产品。
实施例1检测引物扩增标准曲线
1.微生物培养
使用碱性蛋白胨水作为脑膜炎奈瑟氏球菌的培养基，pH8.8～9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。在碱性平板上菌落直径为2mm，圆形，光滑，透明。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验。
2.基因组DNA提取
按照Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。
3.扩增产物标准品质粒制作
使用源自脑膜炎奈瑟氏球菌提取的DNA，分别以rpoB基因、gene1、gene2、gene3、和gene4的引物进行扩增，扩增产物经过加A处理后，使用T4连接酶连入T载体，并且通过转导感受态细胞后，质粒得到大规模扩增。5个基因的引物序列如SEQ ID NO:1～10所示，具体如表2。
表2
Figure BDA0002270143750000091
4.质粒的提取和标准曲线梯度的配置
分别涂板扩增rpoB基因、gene1、gene2、gene3、和gene4对应的引物扩增产物的标准品克隆菌，收集单克隆的菌斑，并通过LB培养摇菌过夜扩增，最后得到5ml指数生长期的质粒阳性菌株，按照QIAGEN Plasmid Midi Kit说明书指示进行质粒DNA的提取。提取后检测质粒DNA的浓度，并通过10倍稀释的方法，配置6个浓度梯度的标准品，浓度梯度分别为1μg/μL，100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL。
5.检测引物标准曲线绘制
按照BioRad iQ SYBR Green SuperMix说明书指示进行浓度梯度标准曲线的qPCR扩增，并且绘制对应的扩增曲线，得到每对引物的扩增效率。每一个qPCR的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，qPCR反应体系和扩增反应条件如表3所示。
表3
Figure BDA0002270143750000101
6.结果分析
检测引物扩增标准曲线结果显示，rpoB基因、gene1、gene2、gene3和gene4对应的引物均为经过优化的引物设计和反应体系。其中线性的标准曲线可信度R2>0.980，高扩增效率在90-105％，证明引物设计和反应体系是最优状态。分析5个基因的扩增曲线的相关性系数和可信度，以及5个浓度梯度下的扩增效率，均达到最优状态的要求，5对引物在该反应条件下能够满足检测要求。
表4
基因名 斜率 截距 扩增效率 可信度R<sup>2</sup>
rpoB -3.1359 35.265 108.40％ 0.994
gene1 -3.1321 36.366 108.58％ 0.9992
gene2 -3.5265 35.812 92.12％ 0.9982
gene3 -3.5124 35.416 92.62％ 0.9989
gene4 -3.266 35.919 102.39％ 0.9940
实施例2阳性及阴性样品检测情况
1.微生物培养
同实施例1。
2.基因组DNA提取
同实施例1。
3. 5个目标基因的qPCR检测
按照BioRad iQ SYBR Green SuperMix说明书指示进行样品的qPCR扩增，并且得到每对引物对应的Ct值读数。每一个qPCR的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，qPCR反应体系和扩增反应条件如表5所示。
表5
Figure BDA0002270143750000121
4.结果分析
如表6和表7所示，5对引物的qPCR扩增结果显示，脑膜炎奈瑟氏球菌属呈现rpoB基因、gene1、gene2和gene3的一个到多个基因的阳性结果，而其他球菌属均显示阴性结果。因此，对于脑膜炎奈瑟氏球菌属和其他球菌属，进行rpoB基因、gene1、gene2和gene3的检测，能够较好的区分脑膜炎奈瑟氏球菌属和其他球菌属。同时，gene4的检测结果，产毒的脑膜炎奈瑟氏球菌属呈现检测结果阳性，而其他非产毒脑膜炎奈瑟氏球菌属和其他球菌属呈现阴性。因此，进行gene4的检测，能够较好的区分产毒和非产毒的球菌属。综上所述，rpoB基因、gene1、gene2和gene3的对应引物，能够满足球菌属中脑膜炎奈瑟氏球菌属的检测判断，gene4的对应引物，能够满足产毒和非产毒球菌属的检测判断。
表6
Figure BDA0002270143750000131
表7
Figure BDA0002270143750000132
Figure BDA0002270143750000141
实施例3检测体系的灵敏度
1.微生物培养
使用碱性蛋白胨水作为脑膜炎奈瑟氏球菌的培养基，pH8.8～9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。在碱性平板上菌落直径为2mm,圆形，光滑，透明。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验，收集菌体后进行浓度计算，并且10稀释得到10个菌/ml，100个菌/ml，1000个菌/ml，和10000个菌/ml，对不同浓度梯度的菌液进行后续的DNA提取实验。
2.基因组DNA提取
同实施例1。
3. 5个目标基因的qPCR检测
同实施例2。
4.结果分析
如下表8和表9所示，5对引物的qPCR扩增结果显示，从10个菌至10000个菌的范围内，脑膜炎奈瑟氏球菌属呈现rpoB基因、gene1、gene2的一个到多个基因的阳性结果。因此，通过进行rpoB基因、gene1、gene2的检测，能够较好的达到从10个菌至10000个菌的范围内脑膜炎奈瑟氏球菌属的检出。同时，从10个菌至10000个菌的范围内，gene4的检测结果，产毒的脑膜炎奈瑟氏球菌属呈现检测结果阳性，而其他非产毒脑膜炎奈瑟氏球菌属呈现阴性。因此，进行gene4的检测，能够较好的达到从10个菌至10000个菌的范围内产毒和非产毒的球菌属的检测和区分。综上所述，可以通过rpoB基因、gene1、gene2、gene3和gene4的搭配检测，较好的完成产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的检测，检测范围可以从10个菌株至10000个菌株，更高的菌株浓度也可以通过稀释的方法稀释至最佳检测范围内，能够达到预期的检测要求。
表8
Figure BDA0002270143750000151
表9
Figure BDA0002270143750000161
实施例4临床样品的检测
1.临床样品收集和基因组DNA的提取
分别收集不同的肺泡灌洗液、皮肤分泌物、尿液、脑脊液以及过滤水，按照Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。
2. 5个目标基因的qPCR检测
同实施例2。
3.结果分析
5对引物的qPCR扩增结果显示，除了过滤水和一个脑脊液样本外，其他样品均检出rpoB基因、gene1、gene2和gene3中的1个及以上，证明相应的样品来源中含有脑膜炎奈瑟氏球菌。而除了一个肺泡灌洗液样本、一个皮肤分泌物样本、尿液样本、一个脑脊液样本以及过滤水样品外，其他样品均检出gene4基因，证明对应的样品来源中含有产毒的球菌。最终判断为产毒脑膜炎奈瑟氏球菌阳性的准则为，rpoB基因、gene1、gene2和gene3中的1个及以上检测得到Ct值小于35个循环，同时gene4检测得到Ct值小于35个循环。如果rpoB基因、gene1、gene2和gene3均检测得到Ct值大于35个循环，或者，gene4检测得到Ct值大于35个循环，则判断为产毒脑膜炎奈瑟氏球菌阴性未检出。
表10
Figure BDA0002270143750000171
Figure BDA0002270143750000181
表11
Figure BDA0002270143750000182
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广东美格基因科技有限公司
<120> 用于检测产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgcgcgcac caatgattac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atagcggcct tcttcgatgg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
accatcttga tgacagccgg 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttattacat agtcatcgcc gcg 23
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aaagcggcgt aatgagttgc 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gttgccctga tgaccaaagc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttggtttctc gtccgctttg 20
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtatttcttc tttgatcggg ccg 23
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggttttggaa agcagccgtt 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
acccgctctc tttcaccaag 20

Claims (7)

1.用于检测产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、收集样品；
S2、提取基因组DNA；
S3、检测脑膜炎奈瑟氏球菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2和gene3，以及产毒特异性基因gene4；
S4、读取扩增Ct值；当所述脑膜炎奈瑟氏球菌属特异性基因中至少1个基因和所述产毒特异性基因的Ct值均小于35时，产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的检测结果为阳性；当所述脑膜炎奈瑟氏球菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2和gene3的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene4的Ct值大于35时，产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的检测结果为阴性。
2.根据权利要求1所述的用于检测产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述脑膜炎奈瑟氏球菌属特异性基因rpoB的检测引物如SEQ ID NO:1～2所示。
3.根据权利要求1所述的用于检测产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述脑膜炎奈瑟氏球菌属特异性基因gene1的检测引物如SEQ ID NO:3～4所示。
4.根据权利要求1所述的用于检测产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述脑膜炎奈瑟氏球菌属特异性基因gene2的检测引物如SEQ ID NO:5～6所示。
5.根据权利要求1所述的用于检测产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述脑膜炎奈瑟氏球菌属特异性基因gene3的检测引物如SEQ ID NO:7～8所示。
6.根据权利要求1所述的用于检测产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述产毒特异性基因gene4的检测引物如SEQ ID NO:9～10所示。
7.一种用于检测产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包含所述的脑膜炎奈瑟氏球菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2和gene3的检测引物和产毒特异性基因gene4的检测引物。
CN201911101991.1A 2019-11-12 2019-11-12 用于检测产毒脑膜炎奈瑟氏球菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 Pending CN111534614A (zh)

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