CN111534608A - 用于检测产毒创伤弧菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 - Google Patents

用于检测产毒创伤弧菌的荧光定量pcr方法及相应的试剂盒 Download PDF

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CN111534608A CN201911059604.2A CN201911059604A CN111534608A CN 111534608 A CN111534608 A CN 111534608A CN 201911059604 A CN201911059604 A CN 201911059604A CN 111534608 A CN111534608 A CN 111534608A
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Abstract

本发明公开了一种用于检测产毒创伤弧菌的荧光定量PCR方法及试相应的剂盒。本发明巧妙的应用了特异性的基因检测区分创伤弧菌属与其它弧菌属，以及产毒和非产毒的弧菌属，通过综合判断，得出准确的菌属信息。本发明与现有的主流检测试剂盒相比，本发明用于检测产毒创伤弧菌试剂盒具有灵敏度高、快捷方便、特异型好、判断严谨准确等优势，具有良好的应用前景和市场价值。

Description

用于检测产毒创伤弧菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种通过特异性基因对产毒创伤弧菌进行荧光定量PCR检测的方法及相应的检测试剂盒。
背景技术
创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是一种革兰氏阴性弧菌，属于弧菌科弧菌属。创伤弧菌在液体培养基中菌体大小为0.7*2-3μm，稍弯曲；在固体培养基中形态呈多样性，有极端单鞭毛。创伤弧菌分离培养对营养要求一般，最适生长温度为30℃，兼性厌氧。在无NaCl及超过8％NaCl的培养基中不生长，可在0.5％NaCl及3％NaCl的蛋白胨水中生长，在含6％NaCl的蛋白胨水中生长良好。
创伤弧菌广泛分布在海水中，可从牡蛎等海产品中分离得到。本菌主要通过伤口接触海水造成感染，也可经口感染。经伤口感染时可导致蜂窝织炎及骨髓炎等多种炎症，经口感染时常迅速导致菌血症或败血症。创伤弧菌感染可以很快速的传播，并导致严重的肌炎和肌膜炎引发严重的坏疽。感染本菌后如不及时治疗，病死率很高。创伤弧菌感染后的症状包括呕吐、发烧、腹泻、低血压、肿胀和疼痛等，及时采用抗生素治疗有效。创伤弧菌亦是养殖虾类和鱼类的重要病原菌。
创伤弧菌一般临床上比较罕见，早期正确诊断困难，大多数均在典型的临床症状表现出来后，结合接触海水或海产品病史方可做出诊断。常用的微生物学检查方法包括分离培养和血清学检测，存在灵敏性差、试验过程复杂等特点。因此，寻找一种快速、灵敏并且适用于临床诊断的检测方法已显得非常紧要。近年来，丰富的基因组数据为分子诊断技术锁定创伤弧菌特异性序列提供了参考数据库。当前，分子生物学技术正以其高灵敏度、高特异性、实验周期短、易操作等优势逐步应用于创伤弧菌的诊断检测。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种用于检测产毒创伤弧菌的荧光定量PCR方法。
具体地，上述方法包括如下步骤：
S1、收集样品；
S2、提取基因组DNA；
S3、检测创伤弧菌属特异性基因rpoB、gene1和gene2，以及产毒特异性基因gene3和gene4；
S4、读取扩增Ct值；当所述创伤弧菌属特异性基因中至少1个基因和所述产毒特异性基因中至少1个基因的Ct值均小于35时，产毒创伤弧菌的检测结果为阳性；当所述创伤弧菌属特异性基因rpoB、gene1和gene2的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene3和gene4的Ct值大于35时，产毒创伤弧菌的检测结果为阴性。
作为一种优选技术方案，所述创伤弧菌属特异性基因rpoB(NCBI AccessionNumber：EF064441.1)的检测引物如SEQ ID NO:1～2所示；
SEQ ID NO:1(5'-CTAACCGCGCTCTAATGGGT-3')；
SEQ ID NO:2(5'-CCAGAGTCAACCGCTACGTT-3')。
所述创伤弧菌属特异性基因gene1(NCBI Accession Number：QBN16150.1)的检测引物如SEQ ID NO:3～4所示；
SEQ ID NO:3(5'-CAGCGCCTTTGATTCGTCTG-3')；
SEQ ID NO:4(5'-CTCGTTAGCTTCCACCGTGT-3')。
所述创伤弧菌属特异性基因gene2(NCBI Accession Number：QBN15561.1)的检测引物如SEQ ID NO:5～6所示；
SEQ ID NO:5(5'-TGCCAGCCGAATTCCAAGG-3')；
SEQ ID NO:6(5'-TGGGTAATACGTTCGGGTGC-3')。
所述产毒特异性基因gene3(NCBI Accession Number：QBN15319.1)的检测引物如SEQ ID NO:7～8所示；
SEQ ID NO:7(5'-CGGCAAGAGTTTAAGCGCAG-3')；
SEQ ID NO:8(5'-TAAACGCCACTGCCGGTAAT-3')。
所述产毒特异性基因gene4的检测引物如SEQ ID NO:9～10所示。
SEQ ID NO:9(5'-AAAGCCAATATCTACGCGCG-3')(NCBI Accession Number：QBN14006.1)；
SEQ ID NO:10(5'-CCCAATCGTACAACCACAGC-3')(NCBI Accession Number：QBN14007.1)。
本发明另一目的是提供一种用于检测产毒创伤弧菌的荧光定量PCR试剂盒，其包含上述的创伤弧菌属特异性基因rpoB、gene1、gene2的检测引物和产毒特异性基因gene3和gene4的检测引物。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过前期对创伤弧菌属和其他弧菌属，产毒和非产毒弧菌属的微生物的大量研究数据中，挖掘出能够区分创伤弧菌属和其他弧菌属，产毒和非产毒弧菌属的特异性基因，通过对特异性基因的检测，准确的判断出菌类样品和环境样品中是否含有产毒的创伤弧菌，具有前期大数据的挖掘和不同种属之间比对基础，选择的特异性基因具有物种和菌属的特异性。
(2)本发明中，通过对设计条件和实验条件的优化，选取针对于每个基因检测扩增条件处于最优化的引物作为检测引物，提高引物扩增的效率，能够达到稳定、高效、高灵敏度和重现性的检测引物，实现微量样品的正确检出。
(3)本发明检测方法与市面上其他的检测方法相比，本发明的两部分检测策略，能够分步判断创伤弧菌属和其他弧菌属、产毒和非产毒弧菌属，判断必须两项同时阳性检出才最终判断为产毒创伤弧菌，结果更加严谨和准确。
(4)本发明能够实现从10个阳性菌到10000个阳性菌的检测范围，灵敏度高，应用范围广，更高浓度的样品可以通过稀释折算同样被检测出来，检测结果稳定，具有很好的重现性。
(5)本发明检测方法能够应用于对于环境的水体样品、淤泥样品、食品抽检等各个领域来源样品筛查和检测，精准地判断出样品中是否含有产毒创伤弧菌，操作方便、快速、灵敏。本发明检测试剂盒能够应用于水产养殖，生活用水监控，食品安全等各个方面的快速检验，无需额外进行微生物培养，使基因检验在日常民生中得到应用，具有灵敏度高、操作性强、快速、高效等优点。
附图说明
图1是rpoB基因检测引物标准曲线。
图2的gene1基因检测引物标准曲线。
图3是gene2基因检测引物标准曲线。
图4是gene3基因检测引物标准曲线。
图5是gene4基因检测引物标准曲线。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例结合附图详细说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
本发明所用的以下试剂可通过常规途径购买得到。
表1
Figure BDA0002257536190000061
在一些实施方案中，使用扩增产物构建阳性标准品质粒，并进行引物的扩增标准曲线检测和绘制，得到每对检测引物的扩增效率，本发明所提供的引物序列其扩增效率和置信程度均在最优化的水平。
在一些实施方案中，通过对不同的阳性菌株检测特异性的基因，能够正确的区分出创伤弧菌属和其他弧菌属，产毒和非产毒弧菌属，从而准确检测并判断出产毒创伤弧菌。
在一些实施方案中，通过对10个、100个、1000个和10000个阳性菌进行提取和检测，能够精确区分出创伤弧菌属和其他弧菌属，产毒和非产毒弧菌属，从而准确检测并判断出产毒创伤弧菌。并且能够保证低至10个阳性菌仍然能够准确检出，而更高滴度的微生物样品可以通过稀释至检测区间，同样可以准确检出。
在一些实施方案中，采集养殖场水体、塘泥、河道水体、底泥和生活用水的样品，通过对特异性基因的检测，能够快速和准确的检验出样品中是否含有产毒创伤弧菌，方便快捷。
本领域技术人员应能理解，本方法中检测的基因和设计的特异性引物，同样可以通过相同检测对象的其他区段的设计达到相应的检测目的。
本发明所描述的用于检测产毒创伤弧菌荧光定量PCR的方法及试剂盒可以广泛应用于环境土壤监控、水体监控、饮用水监控和食品安全监控等多个检验检疫范畴，能够为日常民生提供方便、快捷、准确、高效的基于基因检测的监控产品。
实施例1检测引物扩增标准曲线
1.微生物培养
使用碱性蛋白胨水作为产毒创伤弧菌的培养基，pH8.8～9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。在碱性平板上菌落直径为2mm，圆形，光滑，透明。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验。
2.基因组DNA提取
按照Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。
3.扩增产物标准品质粒制作
使用源自创伤弧菌提取的DNA，分别以rpoB基因、gene1基因、gene2基因、gene3基因和gene4基因的引物进行扩增，扩增产物经过加A处理后，使用T4连接酶连入T载体，并且通过转导感受态细胞后，质粒得到大规模扩增。5个基因的引物序列如SEQ ID NO:1～10所示，具体如表2。
表2
Figure BDA0002257536190000081
4.质粒的提取和标准曲线梯度的配置
分别涂板扩增rpoB基因、gene1基因、gene2基因、gene3基因和gene4基因对应的引物扩增产物的标准品克隆菌，收集单克隆的菌斑，并通过LB培养摇菌过夜扩增，最后得到5ml指数生长期的质粒阳性菌株，按照QIAGEN Plasmid Midi Kit说明书指示进行质粒DNA的提取。提取后检测质粒DNA的浓度，并通过10倍稀释的方法，配置6个浓度梯度的标准品，浓度梯度分别为1μg/μL，100ng/μL，10ng/μL，1ng/μL，100pg/μL，10pg/μL。
5.检测引物标准曲线绘制
按照BioRad iQ SYBR Green SuperMix说明书指示进行浓度梯度标准曲线的qPCR扩增，并且绘制对应的扩增曲线，得到每对引物的扩增效率。每一个qPCR的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，qPCR反应体系和扩增反应条件如表3所示。
表3
Figure BDA0002257536190000091
6.结果分析
检测引物扩增标准曲线结果显示，rpoB基因、gene1基因、gene2基因、gene3基因和gene4基因对应的引物均为经过优化的引物设计和反应体系。其中线性的标准曲线可信度R2>0.980，高扩增效率在90-105％，证明引物设计和反应体系是最优状态。分析5个基因的扩增曲线的相关性系数和可信度，以及6个浓度梯度下的扩增效率，均达到最优状态的要求，5对引物在该反应条件下能够满足检测要求。
表4
基因名 斜率 截距 扩增效率 可信度R<sup>2</sup>
rpoB -3.324 31.964 99.91％ 0.9959
gene1 -3.1809 35.741 106.24％ 0.9946
gene2 -3.4406 33.785 95.28％ 0.9981
gene3 -3.3129 32.937 100.38％ 0.9923
gene4 -3.2814 34.087 101.72％ 0.9906
实施例2阳性及阴性样品检测情况
1.微生物培养
同实施例1。
2.基因组DNA提取
同实施例1。
3.5个目标基因的qPCR检测
按照BioRad iQ SYBR Green SuperMix说明书指示进行样品的qPCR扩增，并且得到每对引物对应的Ct值读数。每一个qPCR的反应设置3个生物学重复及3个技术重复，qPCR反应体系和扩增反应条件如表5所示。
表5
Figure BDA0002257536190000101
Figure BDA0002257536190000111
4.结果分析
如表6～表7所示，5对引物的qPCR扩增结果显示，创伤弧菌属呈现rpoB基因、gene1基因和gene2基因的一个到多个基因的阳性结果，而其他弧菌属均显示阴性结果。因此，对于创伤弧菌属和其他弧菌属，进行rpoB基因、gene1基因和gene2基因的检测，能够较好的区分创伤弧菌属和其他弧菌属。同时，gene3基因和gene4基因的检测结果，产毒的创伤弧菌属呈现检测结果阳性，而其他非产毒创伤弧菌属和其他弧菌属呈现阴性。因此，进行gene3基因和gene4基因的检测，能够较好的区分产毒和非产毒的弧菌属。综上所述，rpoB基因、gene1基因和gene2基因的对应引物，能够满足弧菌属中创伤弧菌的检测判断，gene3基因和gene4基因的对应引物，能够满足产毒和非产毒弧菌属的检测判断。
表6
Figure BDA0002257536190000112
Figure BDA0002257536190000121
表7
Figure BDA0002257536190000122
实施例3检测体系的灵敏度
1.微生物培养
使用碱性蛋白胨水作为创伤弧菌的培养基，pH8.8～9.0的碱性蛋白胨水或平板中生长良好。在碱性平板上菌落直径为2mm,圆形，光滑，透明。选取处于生长旺盛的微生物样品进行后续的实验，收集菌体后进行浓度计算，并且10稀释得到10个菌/ml，100个菌/ml，1000个菌/ml，和10000个菌/ml，对不同浓度梯度的菌液进行后续的DNA提取实验。
2.基因组DNA提取
同实施例1。
3.5个目标基因的qPCR检测
同实施例2。
4.结果分析
如表8～表9所示，5对引物的qPCR扩增结果显示，从10个菌至10000个菌的范围内，创伤弧菌属呈现rpoB基因、gene1基因和gene2基因的一个到多个基因的阳性结果。因此，通过进行rpoB基因、gene1基因和gene2基因的检测，能够较好的达到从10个菌至10000个菌的范围内创伤弧菌属的检出。同时，从10个菌至10000个菌的范围内，gene3基因和gene4基因的检测结果，产毒的创伤弧菌属呈现检测结果阳性，而其他非产毒弧菌属呈现阴性。因此，进行gene3基因和gene4基因的检测，能够较好的达到从10个菌至10000个菌的范围内产毒和非产毒的弧菌属的检测和区分。综上所述，可以通过rpoB基因、gene1基因、gene2基因、gene3基因和gene4基因的搭配检测，较好的完成产毒创伤弧菌的检测，检测范围可以从10个菌株至10000个菌株，更高的菌株浓度也可以通过稀释的方法稀释至最佳检测范围内，能够达到预期的检测要求。
表8
Figure BDA0002257536190000131
Figure BDA0002257536190000141
表9
Figure BDA0002257536190000142
实施例4环境样品的检测
1.环境样品收集和基因组DNA的提取
分别收集不同的虾塘水和对应底泥、河道污水和对应底泥，以及生活污水和过滤水，按照Qiagen的QIAamp DNA Mini Kit说明书指示进行基因组DNA的提取。
2.5个目标基因的qPCR检测
同实施例2。
3.结果分析
如表10和表11所示，5对引物的qPCR扩增结果显示，除了河道污水和过滤水，其他样品均检出rpoB基因、gene1基因和gene2基因中的1个及以上，证明相应的样品来源中含有创伤弧菌。而除了河道污水、过滤水和一个生活污水样品外，其他样品均检出gene3基因和gene4基因的一个或者两个，证明对应的样品来源中含有产毒的创伤弧菌。最终判断为产毒创伤弧菌阳性的准则为，rpoB基因、gene1基因和gene2基因中的1个及以上检测得到Ct值小于35个循环，同时gene3基因和gene4基因中的一个及以上检测得到Ct值小于35个循环。如果rpoB基因、gene1基因和gene2基因均检测得到Ct值大于35个循环，或者，gene3基因和gene4基因均检测得到Ct值大于35个循环，则判断为产毒创伤弧菌阴性未检出。
表10
Figure BDA0002257536190000151
Figure BDA0002257536190000161
表11
Figure BDA0002257536190000162
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州微芯生物科技有限公司
<120> 用于检测产毒创伤弧菌的荧光定量PCR方法及相应的试剂盒
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctaaccgcgc tctaatgggt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ccagagtcaa ccgctacgtt 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cagcgccttt gattcgtctg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctcgttagct tccaccgtgt 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tgccagccga attccaagg 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgggtaatac gttcgggtgc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cggcaagagt ttaagcgcag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
taaacgccac tgccggtaat 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aaagccaata tctacgcgcg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cccaatcgta caaccacagc 20

Claims (7)

1.一种用于检测产毒创伤弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、收集样品；
S2、提取基因组DNA；
S3、检测创伤弧菌属特异性基因rpoB、gene1和gene2，以及产毒特异性基因gene3和gene4；
S4、读取扩增Ct值；当所述创伤弧菌属特异性基因中至少1个基因和所述产毒特异性基因中至少1个基因的Ct值均小于35时，产毒创伤弧菌的检测结果为阳性；当所述创伤弧菌属特异性基因rpoB、gene1和gene2的Ct值大于35和/或所述产毒特异性基因gene3和gene4的Ct值大于35时，产毒创伤弧菌的检测结果为阴性。
2.根据权利要求1所述的用于检测产毒创伤弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述创伤弧菌属特异性基因rpoB的检测引物如SEQ ID NO:1～2所示。
3.根据权利要求1所述的用于检测产毒创伤弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述创伤弧菌属特异性基因gene1的检测引物如SEQ ID NO:3～4所示。
4.根据权利要求1所述的用于检测产毒创伤弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述创伤弧菌属特异性基因gene2的检测引物如SEQ ID NO:5～6所示。
5.根据权利要求1所述的用于检测产毒创伤弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述产毒特异性基因gene3的检测引物如SEQ ID NO:7～8所示。
6.根据权利要求1所述的用于检测产毒创伤弧菌的荧光定量PCR方法，其特征在于，所述产毒特异性基因gene4的检测引物如SEQ ID NO:9～10所示。
7.一种用于检测产毒创伤弧菌的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包含所述的创伤弧菌属特异性基因rpoB、gene1、gene3的检测引物和产毒特异性基因gene3和gene4的检测引物。
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