CN111534617B

CN111534617B - 一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物及其应用

Info

Publication number: CN111534617B
Application number: CN202010329886.XA
Authority: CN
Inventors: 徐云明; 朱孟玲; 孙智远; 芮敏娟
Original assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Current assignee: Jiangsu Polytechnic College of Agriculture and Forestry
Priority date: 2020-04-24
Filing date: 2020-04-24
Publication date: 2024-01-23
Anticipated expiration: 2040-04-24
Also published as: CN111534617A

Abstract

本发明公开了一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物，属于微生物检测技术领域。本发明公开了SEQ ID NO.1～4所示的LAMP检测引物以及其在检测小肠结肠炎耶尔森氏菌中的应用方法。本发明是在恒温条件下进行的，不需要昂贵的变温仪器，在诊断结果时，可以通过肉眼或是加入简单的指示试剂便可进行结果的判断，本发明检测成本低，灵敏度高，具有极高的推广应用价值。

Description

一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物及其应用

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物及其应用。

背景技术

小肠结肠炎耶尔森氏菌感染后主要症状表现为发烧、腹痛、腹泻、呕吐，属于肠杆菌科耶尔森菌属，革兰氏阴性杆菌，低温仍可繁殖。依据生化反应的结果，可分为6个生物型，分别是不具备致病能力的1A，高致病性菌株的1B，低致病性菌株的2、3、4、5型。根据菌体表面O抗原，可分为60个血清型，但对人类存在致病性的只有O:3、O:5、O:8、O:9、O:27。致病性主要是由位于染色体和pYV毒力质粒上的毒力基因决定的，分别是位于染色体上的毒力基因是ail、ystA、ystB，位于pYV毒力质粒上的基因是yadA和virF。

耶氏菌是一种需养或兼性厌氧菌，在4～40℃范围内均可生长繁殖。耶氏菌是嗜冷菌，有报道称在0℃可缓慢生长。最适生长温度在30～37℃，在30℃可以依靠周生鞭毛进行运动。最适pH值在7.2～7.4，耶氏菌对弱碱性环境有较高的抵抗能力。对培养基无严格要求，在普通琼脂培养基上便可生长，菌落形态为光滑，边缘整齐，中间凸起。某些耶氏菌菌株在血平板培养基内生长会出现溶血环。液体培养基培养耶氏菌时，会在液面上形成一层菌膜。

现有技术中对微生物的检测主要有如下几种方法：

1、微生物分离培养鉴定：此方法是应用液体培养基、半固体培养基和固体培养基将分离得到的疑似微生物进行培养，并应用溶血实验、运动性实验、产酸产气等生化实验及染色镜检对微生物进行诊断。目前，在我国境内最常见也是应用最广泛的是国标法(GB4789.8-2016)，还有其他的分离鉴定方法如FDA(美国食品药品监督管理局)法、改良FDA法、行标法(SN)和GNFIS法等。

微生物分离培养鉴定法在目前所有方法中的准确性是最高的，但是无论是哪种分离培养技术，他们都有一个共同的缺点，就是从样品的采集、到病原微生物的分离鉴定结果，需要的试验周期都会很长，一般微生物的培养需要2天左右，有些微生物的分离培养需要十多天，才能的出结果，不能够适应目前快速、准确的诊断需求市场、对实验室级别也有一定的要求，且会对操作人员构成一定的健康威胁。

2、免疫学检测方法：免疫学方法的原理是根据抗原-抗体结合形成沉淀的复合物，其中包括有凝集反应方法、沉淀反应方法、免疫荧光技术、放射免疫测定方法、酶联免疫吸附试验、补体结合试验。

免疫学诊断方法，是基于抗原与抗体特异性结合的原理进行检测的一种血清学方法。这种诊断方法的缺点是检测过程中，需要的试剂非常昂贵，同时此方法在检测过程中，根据不同的检测目标微生物，其特异性也不尽相同，容易出现假阳性结果，造成误判，同时人为的操作对于实验结果的影响也是有的，所以需要具有一定素质和能力的实验室专业人员。

3、病理组织切片方法：是取一定大小的病变组织，用病理组织学方法制成病理切片〔通常将病变组织包埋在石蜡块里，用切片机切成薄片，再用苏木精－伊红(H-E)染色〕，用显微镜进一步检查病变。病变的发生发展过程，最后作出病理诊断。

这种检测方法虽然准确性很高，但是最大的问题是，对从事病理组织学诊断的人员的专业性会非常高，需要专业的病理组织学教师或者从事病理组织学研究的研究生，才有可能进行准确的诊断，也可以说这类诊断方法需要在显微病理学知识上具有丰富经历和经验的的实验人员。

4、分子生物学方法：分子生物学是在分子水平上研究生命现象物质基础的学科。常见的应用于检测微生物方法有核酸(DNA)的凝胶电泳实验、核酸的分子杂交实验、核酸的体外扩增实验等方法，这些方法的优点是检测方法的特异性高，检测时间可以在6小时内完成。

本方法的缺点在于，需要昂贵的检测仪器。分子生物学诊断方法，在实验过程中需要复杂的变温仪器，这种仪器的价格很高，对于基层的投放使用很难做到全覆盖。

2000年，Notomi等人研发的一种新颖的核酸扩增方法——环介导等温扩增(Loop-Mediated isothermal amplification，LAMP)技术，其特点是针对目的基因特异性设计2对特异性引物，利用链置换DNA聚合酶在恒温条件下维持即可完成核酸扩增反应。LAMP工作原理是利用一套4条特异性引物与靶细胞基因上的六个不同区域进行退火杂交，在具有链置换活性功能的大分子DNA聚合酶的作用下实现等温扩增模板DNA，其反应过程大致可以分为3个阶段：第1阶段是初始原料积累(形成最终茎环结构)阶段，第2阶段是循环扩增阶段，第3阶段是茎环结构自动延伸和循环的阶段。相较于PCR技术，该方法的扩增效率，灵敏度和特异性都较高，是一种应用前景广泛的核酸扩增技术。

发明内容

发明目的：本发明要解决的技术问题是获得小肠结肠炎耶尔森氏菌特异性良好的食源性致病微生物的毒力基因，并以此设计肠结肠炎耶尔森氏菌检测引物。

本发明还要解决的技术问题是提供上述肠结肠炎耶尔森氏菌检测引物的应用。以获得性能稳定、特异性良好、高灵敏度的LAMP检测技术。

技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物，包括如SEQ ID NO.1～4所示的引物。

一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的试剂盒，包括SEQ ID NO.1～4所示的引物。

一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，SEQ ID NO.1～4所示的序列为引物，通过LAMP技术进行扩增反应；

(3)通过核酸电泳观察结果，若扩增得到符合LAMP扩增的阶梯状条带，则待测样品中含有小肠结肠炎耶尔森氏菌

步骤(2)中，所述的通过LAMP技术进行扩增反应，其反应体系如下：

2.5μL 10×反应缓冲液、6μL Mg²⁺、5μL甜菜碱、4.5μL dNTPs、2μL基因组DNA、0.5μLSEQ ID NO.1～2引物、0.25μL SEQ ID NO.3～4引物、1μL大分子核酸聚合酶，用蒸馏水2.5μL补液到25μL；

其中，Mg²⁺终浓度为0.9M；

其中，甜菜碱终浓度为1M；

其中，dNTPs终浓度为1.8mM；

其中，SEQ ID NO.1～2引物终浓度为0.2μM，SEQ ID NO.3～4引物终浓度为0.8μM；

步骤(2)中，所述的通过LAMP技术进行扩增反应，其反应条件如下：在恒温水浴锅里65℃反应60min，然后在80℃水浴锅中反应4min终止反应。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下突出的技术效果：

1.特异性更高：四种传统的诊断方法中，特异性好的是传统的分子生物学方法。传统的分子生物学方法，只锁定被检测微生物的遗传物质(DNA)的两个区域进行检测；本方法是以4条引物，锁定被检测微生物的遗传物质(DNA)的六个区域进行检测，特异性更高。

2.灵敏性更好：在传统分离培养鉴定、病理组织学、免疫学检测方法、传统分子生物学检测方法中，分子生生物学的检测方法的灵敏度是最高的，而本研究方法的灵敏性在于对比试验聚合酶链式反应中，在更短的反应时间内，本发明的检测灵敏性至少高出一个数量级。

3.试验成本更低:本方法检测过程中，是在恒温条件下进行的，因此不需要昂贵的变温仪器，在诊断结果时，可以通过肉眼或是加入简单的指示试剂便可进行结果的判断，实验的成本比其他传统方式都低。

4.快速的检测时间：四种传统的检测方法中，传统的分子生物学方法的检测速度和周期最快，本方法也是分子生物学方法中的一种，因此也保持了分子生物学诊断快速周期短的特点，在观察结果时，花费的时间比传统的分子生物学方法更快,在对比与聚合酶链式反应的对比试验中，聚合酶链式反应大约在1.5h小时完成，本方法的反应时间只需要60分钟，所以检测周期和速度是更快的。

附图说明

图1试剂盒提取的DNA电泳图；M:DNA MARKERIII；1：嗜水气单孢菌；2：福氏志贺氏菌；3：副溶血弧菌；4：哈氏弧菌；5：大肠埃希氏菌O157:H7；6：小肠结肠炎耶尔森氏菌。

图2碱液煮沸法提取DNA电泳图；M:DNA MARKERIII；1：嗜水气单孢菌；2：福氏志贺氏菌；3：副溶血弧菌；4：哈氏弧菌；5：大肠埃希氏菌O157:H7；6：小肠结肠炎耶尔森氏菌；7：大肠埃希氏菌。

图3LAMP引物的特异性电泳图；M:DNA MARKERIII；Y:耶尔森氏菌；1：大肠埃希氏菌；2：福氏志贺氏菌；3：副溶血弧菌；4：哈氏弧菌；5：大肠埃希氏菌O157:H7；6：嗜水气单孢菌。

图4Mg2+的优化(mM)电泳图；M:DNA MARKERIII；N:阴性对照；*表示最优条件。

图5甜菜碱的优化(M)电泳图；M:DNA MARKERIII；N:阴性对照；*表示最优条件。

图6dNTPs的优化(mM)电泳图；M:DNA MARKERIII；N:阴性对照；*表示最优条件。

图7内外引物比列的优化(μM)电泳图；M:DNA MARKERIII；N:阴性对照；*表示最优条件。

图8反应温度的优化(℃)电泳图；M:DNA MARKERIII；N:阴性对照；*表示最优条件。

图9反应时间的优化(min)电泳图；M:DNA MARKERIII；N:阴性对照；*表示最优条件。

图10LAMP方法的特异性电泳图；M:DNA MARKERIII；Y:耶尔森氏菌；1：大肠埃希氏菌；2：福氏志贺氏菌；3：副溶血弧菌；4：哈氏弧菌；5：大肠埃希氏菌；6：嗜水气单孢菌；7：大肠埃希氏菌(模式株)；8：大肠埃希氏菌(抗生素鉴定株)。

图11最小检测量(ng/μL)电泳图；M:DNA MARKERIII；N:阴性对照；1：基因组原液:170.6；2:170.6x10^-1；3:170.6x10^-2；4:170.6x10^-3；5:170.6x10^-4；6:170.6x10^-5；7:170.6x10^-6；8:170.6x10^-7；9:170.6x10^-8。

图12最小检测量(ng/μL)电泳图；M:DNA MARKERIII；N:阴性对照；1：170.6x10^-6；2:浓度为170.6x10-6×2^-1；3:浓度为170.6x10-6×2^-2；4:浓度为170.6x10-6×2^-3。

图13普通PCR最小检测量电泳图；M:DNA MARKERIII；N:阴性对照；1：基因组原液:170.6；2:170.6x10^-1；3:170.6x10^-2；4:170.6x10^-3；5:170.6x10^-4；6:170.6x10^-5；7:170.6x10^-6；8:170.6x10^-7；9:170.6x10^-8。

图14本发明流程图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

1实验材料与方法

1.1需要的仪器设备(表1)

表1仪器和设备

1.2实验试剂

引物的配制：由上海生工合成的引物，首先将装有粉末引物的EP管进12000r/min，离心1min，后按照EP管上提示，加入指示的无Dnase酶灭菌蒸馏水，使引物浓度为100μM，此浓度为贮存浓度。

8M betaine溶液：称取betaine粉末937.2g，充分溶解于蒸馏水定容到1000mL，分装至无菌1.5mLEP管内备用。

LB液体培养基：按照说明书配制好后，分装至试管内，每管5mL，121℃灭菌25-30min。

Bst DNA polymerase、10×thermpol reaction buffer、Mg²⁺、dNTPs

1.3实验菌种

实验中所用的菌种，详见表2。

表2试验菌株

1.4实验步骤

1.4.1细菌的复壮及培养

将灭菌的LB液体培养基分装到试管中，加入菌液，在摇床上160C/min孵育16h。将复壮后的菌液分装到EP管中，并加入甘油保存备用(甘油占总量的25％)。

1.4.2 DNA提取

试剂盒提取DNA，具体操作参照说明书。

碱液加热裂解法提取DNA，取配置好的菌液1mL，10000r/min离心12min，弃上清，加入20mmol/L的NaOH溶液150μL，混匀，煮沸10min，置于4℃冰箱中30min；10000r/min离心12min，上清液即为核酸模板。

提取完成的基因组在-20℃冰箱内保存备用。

1.4.3 LAMP的引物的设计

outL基因编码一般分泌途径蛋白L(general secretion pathway protein L)是一段含有398个氨基酸的蛋白。这段基因仅与耶尔森氏菌属中小肠结肠炎耶尔森氏菌(耶氏菌)存在同源性，与耶尔森氏菌属内的其他菌种无同源性。因此本研究以outL基因作为检测耶氏菌的靶标基因，保证所建立的检测方法具有良好的特异性，可有效检出小肠结肠炎耶尔森氏菌，而不被耶尔森氏菌属其它种干扰。在NCBI网站内搜索小肠结肠炎耶尔森氏菌outL毒力基因(登录号：FR718735.1；HF571988.1；AM286415.1；CP016946.1)，应用MEGA软件对上述outL基因序列进行对比，找出保守序列。利用LAMP引物专用设计软件PrimerExplorer V4 software progr(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)设计一系列LAMP引物，包括一对内引物和一对外引物，然后在NCBI上对系统设计的引物进行筛选。引物序列见表3。

表2 LAMP引物序列

注：引物序列来源于NCBI网站genbank(序列号：CP009846.1,)中Yersiniaenterocolitica strain 8081,complete genome

1.4.4 LAMP的引物的特异性

EP管中加入2.5μL的10×反应缓冲液(thermpol reaction buffer)，依次加入6μL镁离子(Mg²⁺)、5μL甜菜碱(betaine)、4.5μL核酸扩增原料(dNTPs)、2μL基因组模板(gDNA)、0.5μL外引物(B3和F3)、0.25μL内引物(BIP和FIP)，最后1μL大分子核酸聚合酶(Bst DNApolymerase(8U/μL)，用蒸馏水2.5μL补液到25μL，放置在恒温水浴锅里65℃反应60min，80℃反应4min终止LAMP反应，取出冷却到室温，进行2％的核酸电泳，观察结果。此试验最少重复三次。

1.5 LAMP组分条件优化

1.5.1 Mg²⁺的优化

保持上述25μL反应体系内除Mg²⁺浓度外其他组分浓度不变，优化条件范围在4，5，6，7，8，9，10mM。此试验最少重复三次。

1.5.2 betaine的优化

选取应用优化后的Mg²⁺浓度条件，保持上述25μL反应体系内除甜菜碱浓度外其他组分浓度不变，优化条件范围在0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2M。此试验最少重复三次。

1.5.3 dNTPs的优化

选取应用优化后的Mg²⁺、betaine浓度条件保持上述25μL反应体系内除dNTPs浓度外其他组分浓度不变，优化条件范围在1，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0mM。此试验最少重复三次。

1.5.4内外引物比例的优化

选取应用优化后的Mg²⁺、betaine、dNTPs，保持上述25μL反应体系内除内、外引物浓度外其他组分浓度不变，外引物固定为0.2μM，内引物优化条件范围在0.4，0.6，0.8，1.0，1.2μM。此试验最少重复三次。

1.5.5反应温度的优化

选取应用优化后的Mg²⁺、betaine、dNTPs、内外引物的比例优化条件，对反应温度进行优化，优化条件范围在61，62，63，63，65，66℃。此试验最少重复三次。

1.5.6反应时间的优化

选取应用优化后的Mg²⁺、betaine、dNTPs、内外引物的比例、反应温度的优化条件，对反应时间进行优化，优化条件范围在30，40，50，60，70，80min。此试验最少重复三次。

1.6 LAMP方法的特异性实验

应用上述优化后的反应条件，对上述表2内的菌种，进行特异性实验。此试验最少重复三次。

1.7 LAMP的灵敏性实验

1.7.1 LAMP的最小检测量

测定耶氏菌原始基因组浓度：试剂盒为170.6ng/μL。用灭菌蒸馏水对原基因组进行10倍梯度的倍比稀释，共稀释8个梯度。用LAMP方法进行检测，反应结束后进行2％的核酸电泳。此试验最少重复三次。

在上述结果基础上再进行2倍梯度的倍比稀释，共稀释3个梯度。用LAMP方法进行检测，反应结束后进行2％的核酸电泳。此试验最少重复三次。

1.7.2 PCR的最小检测量(景怀奇，马烨，徐建国，姜淑贤，张维妍，陆桂珍.致病性耶尔森氏菌PCR扩增多态性的研究[J].中华微生物学和免疫学杂志，1998，(04):67-70.)

测定耶氏菌原始基因组浓度：试剂盒为170.6ng/μL(基因提取的浓度)。用灭菌蒸馏水对原基因组进行10倍梯度的倍比稀释，共稀释8个梯度。用普通PCR方法进行检测，反应结束后进行2％的核酸电泳。此试验最少重复三次。

2实验结果

2.1 DNA提取结果

如图1为试剂盒提取结果：嗜水气单孢菌、福氏志贺氏菌、副溶血弧菌、哈氏弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7、耶尔森氏菌。

图2为碱液煮沸法提取结果：嗜水气单孢菌、福氏志贺氏菌、副溶血弧菌、哈氏弧菌、大肠埃希氏菌O157:H7、耶尔森氏菌、大肠埃希氏菌。

2.2 LAMP引物特异性的结果

如图3，引物特异性良好。

2.3 Mg²⁺优化的结果

反应体系内的Mg²⁺不仅是形成稳定碱基的中间体而且对于酶活性的激活是必要的，可影响LAMP扩增反应的特异性和扩增产物的产量。若Mg²⁺浓度太高，很大程度上会增加引物错配的机率，出现非特异性扩增；若Mg²⁺浓度太低，就不能激活Bst DNA Polymerase的活性。

Mg²⁺作为大分子聚合酶的激活剂，浓度过高会减弱扩增的特异性，浓度过低则影响扩增的产量甚至可能扩增不出条带。如图4，镁离子最适浓度为9mM。

2.4 betaine优化的结果

betaine对大分子聚合酶的活性有稳定作用，可加强反应的特异性，但浓度过高会造成反应效率的下降。如图5，甜菜碱最适浓度为1M。

2.5 dNTPs优化的结果

dNTPs是核酸扩增的原料。dNTPs的浓度和镁离子相关，过量的dNTPs会和镁离子结合，降低游离的镁离子浓度，影响反应的特异性。如图6，dNTPs最适浓度为1.8mM。

2.6内外引物比例优化的结果

根据LAMP方法的原理可知，在反应时共需要4条特异性引物。外引物的作用在于反应初始阶段通过链的置换过程，使内引物合成的链脱离DNA模板，产生哑铃状结构。自此之后的过程中，内引物的浓度直接影响着反应的扩增效率，适当提高内引物浓度可加快开始阶段的反应进程，提高反应效率。因此，适当的内、外引物比率不仅可以节约引物用量还可使反应达到最好的扩增效率。

内引物浓度过低会降低其起始扩增，外引物浓度过低会导致反应不完全。外引物浓度固定为0.2μM。如图7，内引物最适浓度为0.8μM。

2.7反应温度优化的结果

反应温度影响大分子聚合酶的活性，从而影响整个反应。如图8，最适温度为65℃。

2.8反应时间优化的结果

反应时间不仅影响反应产物的浓度，还影响反应效率。如图9，最适时间为60min。

2.9 LAMP方法特异性的结果

如图10，优化后的体系特异性良好。

2.10 LAMP灵敏性的结果

如图11，基因组10倍稀释后LAMP的最小检测量为170.6fg/μL。

如图12，基因组10^-6浓度的基础再进行2倍稀释，LAMP的最小检测量为85.3fg/μL。

如图13，基因组10倍稀释后PCR的最小检测量为17.06pg/μL。

序列表

<110> 江苏农林职业技术学院

<120> 一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的引物及其应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agacctaaaa aaagaagcac tac 23

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgggtttctc agttaatgat ga 22

<210> 3

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgatgtatta cgcattatgg caaatttttc tatggcgata atatcgacct 50

<210> 4

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tagtccgtag catgaaggcc tttttatcaa ctctaatctt ttgtcctga 49

Claims

1.一种检测小肠结肠炎耶尔森氏菌的非疾病诊断方法，其特征于，包括如下步骤：

（1）提取待测样品基因组 DNA；

（2）以步骤（1）提取的基因组 DNA 为模板，SEQ ID NO.1~4 所示的序列为引物，通过LAMP 技术进行扩增反应；

（3）通过核酸电泳观察结果，若扩增得到符合 LAMP 扩增的阶梯状条带，则待测样品中含有小肠结肠炎耶尔森氏菌；

步骤（2）中，所述的通过 LAMP 技术进行扩增反应，其反应体系如下： 2.5μL 10×反应缓冲液、6μL Mg 2+ 、5μL 甜菜碱、4.5μL dNTPs、2μL 基因组 DNA、 0.5μL SEQ ID NO.1~2引物、0.25μL SEQ ID NO.3~4 引物、1μL 大分子核酸聚合酶，用蒸馏水 2.5μL 补液到25μL；反应体系中 Mg 2+终浓度为 0.9 M；反应体系中甜菜碱终浓度为 1M；反应体系中dNTPs 终浓度为 1.8 mM；反应体系中 SEQ ID NO.1~2 引物终浓度为 0.2μM，SEQ ID NO.3~4 引物终浓度为 0.8μM；

步骤（2）中，所述的通过 LAMP 技术进行扩增反应，其反应条件如下：在恒温水浴锅里65℃ 反应 60min，然后在 80℃水浴锅中反应 4min 终止反应。