RU2819101C1 - Способ выявления гена холодового шока csh1 у штаммов Vibrio cholerae O1 и неО1/неО139 методом петлевой изотермической амплификации (LAMP) - Google Patents
Способ выявления гена холодового шока csh1 у штаммов Vibrio cholerae O1 и неО1/неО139 методом петлевой изотермической амплификации (LAMP) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2819101C1 RU2819101C1 RU2023122482A RU2023122482A RU2819101C1 RU 2819101 C1 RU2819101 C1 RU 2819101C1 RU 2023122482 A RU2023122482 A RU 2023122482A RU 2023122482 A RU2023122482 A RU 2023122482A RU 2819101 C1 RU2819101 C1 RU 2819101C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- primers
- amplification
- insdseq
- insdqualifier
- dna
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 32
- 230000035939 shock Effects 0.000 title claims description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 17
- 241000602423 Vibrio cholerae O1 Species 0.000 title claims description 12
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 title claims description 6
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 claims abstract description 20
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 20
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 19
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 6
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims abstract description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims abstract description 5
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 8
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 2
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 abstract description 9
- 230000036541 health Effects 0.000 abstract description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 28
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 21
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 6
- 241000025846 Vibrio cholerae non-O1/non-O139 Species 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 4
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 4
- 206010047400 Vibrio infections Diseases 0.000 description 4
- 108091093088 Amplicon Proteins 0.000 description 3
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 3
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 231100000033 toxigenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001551 toxigenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 1
- 108010049152 Cold Shock Proteins and Peptides Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 1
- 241001249853 Vibrio virus CTXphi Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000721 bacterilogical effect Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000005182 global health Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к областям медицинской микробиологии, биотехнологии и молекулярной биологии. Сущность изобретения заключается в том, что амплификацию проводят с помощью набора из шести праймеров к гену cshl следующего состава:
Реакцию петлевой изометрической амплификации проводят с помощью амплификатора по схеме двух ступеней - первая: 64,5°С, 30 сек; вторая: 65°С, 30 сек с учетом по каналу FAM, всего 50 циклов, а детекцию результатов амплификации осуществляют по каналу флуорофора FAM по геометрическому показателю Ср, выводимому в окне результатов амплификатора. Для проведения LAMP предварительно готовят 10-кратную смесь праймеров для каждого из генов, которая включает: 16 мкМ каждого FIP- и BIP- праймеров, 2 мкМ каждого F3- и В3-праймеров, 4 мкМ каждого LoopF- и Loop В-праймеров, вода без нуклеаз до конечного объема 100 мкл. Положительный контроль включает в себя все компоненты реакции и препарат ДНК cshl+ штамма V.cholerae. Отрицательный контроль - деионизованная вода, не содержащая исследуемой ДНК. Амплификацию проводят в объеме 25 мкл и инкубационная смесь содержит: 12,5 мкл буфера БиоМастер LAMP SYBR (2х) (производство Biolabmix, Новосибирск, Россия), 2,5 мкл 10-кратной смеси праймеров, 5 мкл ДНК матрицы, оставшийся объем - вода. Изобретение расширяет арсенал средств молекулярной диагностики и может быть использовано для лабораторной диагностики холеры как в практическом здравоохранении, так и в научно-исследовательских учреждениях и лабораториях. 2 з.п. ф-лы, 3 табл., 3 пр.
Description
Предполагаемое изобретение относится к областям медицинской микробиологии, биотехнологии и молекулярной биологии, а именно к молекулярной диагностике, и может быть использовано для лабораторной диагностики холеры, как в практическом здравоохранении, так и в научно-исследовательских учреждениях и лабораториях.
В настоящие время остается актуальной проблема заболевания холерой: в мире ежегодно регистрируется до 5 млн случаев, из которых 100-120 тыс. заканчиваются смертельно (1). В связи с этим холера на сегодняшний день остается глобальной проблемой мирового здравоохранения, что определяет необходимость совершенствования лабораторной диагностики данной инфекции.
Особый интерес вызывает проблема возникновения и эволюции возбудителя холеры. Недавно предложена оригинальная гипотеза формирования патогенного возбудителя из свободноживущих нетоксигенных холерных вибрионов, обитающих в водной среде Индостанского субконтинента. Процесс был реализован в два основных этапа: первый заключался в приобретении вибрионами в результате горизонтального переноса генов острова патогенности VPI-1 с генами токсин-корегулируемых пилей (tcp). Следующий этап эволюции - получение дополнительно к VPI-1 второго мобильного элемента - нитчатого фага СТХϕ, несущего гены холерного токсина. Эти события привели к появлению нового патогена и гибели миллионов людей не менее, чем за тысячелетний период существования этой болезни (2).
Согласно предложенной гипотезе среди свободноживущих нетоксигенных холерных вибрионов Индостанского субконтинента, явившихся родоначальниками патогенных вибрионов, отсутствовали варианты, адаптированные к низким температурам, что обусловило отсутствие возможности сохранения сформированных эпидемически опасных клонов в регионах с более холодным климатом, включая Россию (2).
На модели других микроорганизмов установлено, что одним из универсальных механизмов адаптации микроорганизмов к низкой температуре является продукция белков холодового шока (3). Недавно у значительного процента штаммов V.cholerae O1 и неО1/неО139, циркулирующих в Российской Федерации, было зарегистрировано наличие гена холодового шока cshl (4,5). Теоретически данное обстоятельство за счет горизонтального переноса генов подобным csh1-вариантам может привести к появлению новых клонов патогенных вибрионов, приспособленных к выживанию в водоемах при низких температурах. На сегодняшний день отсутствует метод, позволяющий выявлять ген холодового шока cshl. Новый высокоспецифичный метод петлевой изометрической амплификации (LAMP) является простым, быстрым, пригодным для масштабного скрининга и является альтернативным многообещающим инструментом для чувствительного и быстрого обнаружения холерных вибрионов.
Известен способ выявления гена холодового шока cshl у штаммов V.cholerae с помощью ПЦР в режиме реального времени, включающий выделение ДНК из исследуемого штамма, постановку ПЦР со специфическими праймерами с последующим плавлением образовавшихся ампликонов. В этом случае учет проводят по двум параметрам: формирование амплификона с низким Ср и температурой плавления 81-82,5°С (6).
Недостатком данного способа является проведение исследования в два этапа: собственно постановка ПЦР и последующая реакция плавления сформированного ампликона, что удлиняет время получения результата.
Современный уровень развития лабораторной диагностики характеризуется разработкой ускоренных способов альтернативных ПЦР. Одним из таких способов является технология петлевой амплификации LAMP (7), которая заключается в использовании четырех или шести олигонуклеотидных праймеров и фермента Bst-полимеразы, что позволяет значительно повысить специфичность реакции. Данный способ позволяет провести то же исследование, что и с помощью реакции ПЦР, но значительно быстрее, специфичнее, не требует дорогого приборного оснащения и квалифицированного персонала.
Технической задачей предлагаемого изобретения является разработка новых высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров для быстрого, выявления гена холодового шока cshl у штаммов V.cholerae O1 и неО1/неО139 в пробах чистых культур, основанного на петлевой изотермической амплификации фрагмента гена-мишени.
Поставленная задача достигается тем, что в известном способе идентификации и определения патогенности штаммов V.cholerae методом LAMP, включающем выделение ДНК из исследуемого материала, проведение петлевой изометрической амплификации и учет результатов, отличием является то, что амплификацию проводят с помощью набора олигонуклеотидных праймеров к гену cshl следующего состава:
При этом реакцию петлевой изометрической амплификации проводят с помощью амплификатора по схеме двух ступеней: первая 64,5°С, 30 сек; вторая 65°С, 30 сек с учетом по каналу FAM, всего 50 циклов, а детекцию результатов амплификации осуществляют по каналу флуорофора FAM по геометрическому показателю Ср, выводимому в окне результатов амплификатора.
При этом для проведения LAMP предварительно готовят 10-кратную смесь праймеров для каждого из генов, которая включает: 16 мкМ каждого FIP- и BIP-праймеров, 2 мкМ каждого F3- и В3-праймеров, 4 мкМ каждого LoopF- и Loop В-праймеров, вода без нуклеаз до конечного объема 100 мкл, при этом положительный контроль включает в себя все компоненты реакции и препарат ДНК cshl+ штамма V.cholerae, а в случае отрицательного контроля в реакционную смесь вместо исследуемого препарата ДНК вносят 5 мкл деионизованной воды, не содержащей исследуемой ДНК.
Амплификацию проводят в объеме 25 мкл, инкубационная смесь содержит 12,5 мкл буфера БиоМастер LAMP SYBR (2х) (производство Biolabmix, Новосибирск, Россия), 2,5 мкл 10-кратной смеси праймеров, 5 мкл ДНК матрицы, оставшийся объем - вода.
Обоснование выбора праймеров и ДНК-мишени
Объектом защиты настоящего изобретения является набор из шести праймеров L7F3, L7B3, L7FIP, L7BIP, L7LoopF и L7LoopB для выявления гена холодового шока cshl у штаммов V.cholerae O1 и не O1/не O139 с помощью LAMP.
Для конструирования праймеров был использован интернет-сервис Primer Explorer 5 (LAMP primer designing software: http://primerexplorer.jp/e/), BLAST NCBI.
В качестве мишени использовали нуклеотидную последовательность штамма V.cholerae O1 20000 ctxA- tcpA- (GenBank:CP036500.1). Сконструированные праймеры имели следующую структуру:
При изучении нуклеотидной последовательности штамма V.cholerae O1 20000 ctxA- tcpA- (NCBI accession number CP036500.1) в составе второй хромосомы идентифицирован ген холодового шока, обозначенный заявителем как cshl.
Cshl является членом семейства белка CspA, локализован в позиции 846905-846693, его размер составляет 213 нуклеотидов. Ген cshl присутствует в штаммах V. cholerae и широко используется в качестве регулирования синтеза различных клеточных белков, как при пониженных значениях температуры, так и в оптимальных для роста температурных условиях.
Способ осуществляется следующим образом:
Этапы:
1. Приготовление смеси праймеров L7F3, L7B3, L7FIP, L7BIP, L7LoopF и L7LoopB.
2. Подготовка исследуемых культур, включая контрольные штаммы и выделение ДНК.
3. Подготовка и проведение реакции петлевой изотермической амплификации (LAMP).
4. Учет результатов.
Первоначально готовят 10-кратную смесь праймеров, которая включает: 16 мкМ каждого FIP- и BIP-праймеров, 2 мкМ каждого F3- и В3-праймеров, 4 мкМ каждого LoopF- и Loop В-праймеров, вода без нуклеаз до конечного объема 100 мкл. Полученную смесь хранят при -20°С в течение 12 месяцев.
Работу проводят в соответствии с требованиями МУ 1.3.2569-09 и СанПиН 3.3686-21 (8,9). Перед постановкой ПЦР проводят предварительную подготовку материала (выделение ДНК). Бактериальную массу, сформировавшую газон на плотной питательной среде, стерильной палочкой перемещают в пробирку, содержащую 3-5 мл физиологического раствора. Доводят плотность суспензии до 109 клеток на мл среды по оптической плотности по стандарту мутности бактериальных взвесей ОСО 42-28-86-2018 (ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России) после чего выделяют ДНК для постановки ПЦР с помощью любого коммерческого набора для выделения ДНК. С полученной таким образом ДНК проводят реакцию амплификации с праймерами L7F3, L7B3, L7FIP, L7BIP, L7LoopF и L7LoopB.
Условия проведения реакции LAMP для выявления гена холодового шока cshl у штаммов V.cholerae O1 и неО1/неО139: инкубационная смесь объемом 25 мкл содержит 12,5 мкл буфера БиоМастер LAMP SYBR (2х) (производство Biolabmix, Новосибирск, Россия), 2,5 мкл 10-кратной смеси праймеров, 5 мкл ДНК матрицы, оставшийся объем - вода. В качестве негативного (К-) контроля используют деионизованную воду.
Амплификацию проводят в амплификаторе, например, DTlite5 производства НПФ ДНК-технология, по схеме двух ступеней первая: 64,5°С, 30 сек; вторая: 65°С, 30 сек с учетом по каналу FAM, всего 50 циклов. Таким образом, реакция занимает 50 минут.
Сущность изобретения поясняется примерами
Пример 1
Все штаммы взяты из коллекции патогенных микроорганизмов ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора.
Определение чувствительности реакции LAMP для выявления гена холодового шока cshl.
Бактериальную массу cshl+клеток V.cholerae 20000, сформировавших газон на плотной питательной среде, стерильной палочкой перемещают в пробирку, содержащую 3-5 мл физиологического раствора. Доводят плотность суспензии до 109 клеток на мл среды по оптической плотности по стандарту мутности бактериальных взвесей ОСО 42-28-86-2018 (ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России). Из полученной суспензии готовят десяткратные разведения на физиологическом растворе и выделяют ДНК для постановки ПНР. В качестве негативного контроля (К-) используют деионизованную воду.
Инкубационная смесь объемом 25 мкл содержит: 12,5 мкл буфера БиоМастер LAMP SYBR (2х) (производство Biolabmix, Новосибирск, Россия), 2,5 мкл 10-кратной смеси праймеров, 5 мкл ДНК матрицы, оставшийся объем - вода.
Амплификацию проводят в амплификаторе, например, DTlite5 производства НПФ ДНК-технология, по схеме двух ступеней - первая: 64,5°С, 30 сек; вторая: 65°С, 30 сек с учетом по каналу FAM, всего 50 циклов.
Вывод: результат, оцениваемый по геометрическому показателю Ср, выводимому в окне результатов амплификатора (Таблица 1) показывает, что положительный результат регистрируется в пробах №1-5. В пробах №6-8 результат отрицателен. В пробе №9 (отрицательный контроль) результат отрицателен. Положительный результат в пробе №5 (содержит 104 cshl+ клеток V.cholerae) и отрицательный в пробах №6-8 (содержат большие разведения целевой матрицы), свидетельствует, что чувствительность реакции LAMP для выявления гена холодового шока cshl составляет 104 бактериальных клеток в мл. Время получения результата составило менее 30 минут.
Пример 2
Выявление гена холодового шока cshl с помощью реакции LAMP у штаммов V.cholerae 01, выделенных в ходе мониторинга водных объектов в 2023 году в Ростовской области.
В ходе мониторинга за холерой в Ростовской области в 2023 году выделено пять штаммов V.cholerae O1. Наличие антигена O1 подтвердили проведением ПЦР с набором реагентов «АмплиСенс V.cholerae-FL». С помощью LAMP проводим выявление гена холодового шока cshl. В качестве положительного контроля (К+) использовали cshl+ клетки V.cholerae 20000. Условия культивирования, подготовки проб и проведения реакции LAMP как в Примере 1.
Результаты исследования пяти штаммов V.cholerae O1, выделенных в ходе мониторинга в 2023 году в Ростовской области, представлены в Таблице 2. Положительный результат, оцениваемый по показателю Ср, получен с образцами ДНК из штаммов 65, 66, 84 и образцом положительного контроля. В случае штаммов 63 и 83 и отрицательного контроля результат отрицателен. Полученные результаты свидетельствуют, что штаммы 65, 66 и 84 содержат ген холодового шока cshl. Время получения результата составило менее 30 минут.
Пример 3
Выявление гена холодового шока cshl с помощью реакции LAMP у штаммов V.cholerae не O1/неО139, выделенных в ходе мониторинга в 2023 году в Ростовской области.
В ходе мониторинга за холерой в Ростовской области в 2023 году выделено девять штаммов V.cholerae не O1/неО139. Отсутствие антигена O1 подтвердили проведением ПЦР с набором реагентов «АмплиСенс V.cholerae-FL».
Результаты исследования девяти штаммов V.cholerae неО1/неО139, выделенных в ходе мониторинга в 2023 году в Ростовской области, представлены в Таблице 3. Положительный результат, оцениваемый по показателю Ср, получен с образцами ДНК из штаммов 28, 35, 38, 40(41-2), 41 (41-3) и с образцом положительного контроля (К+). В случае исследования штаммов 34, 39, 44, 49 и отрицательного контроля результат отрицателен. Полученные данные свидетельствуют, штаммы 28, 35, 38, 40 (41-2) и 41 (41-3) содержат ген холодового шока cshl. Время получения результата составило менее 30 минут.
Использование предлагаемого изобретения позволяет за счет набора шести высокоспецифичных праймеров L7F3, L7B3, L7FIP, L7BIP, L7LoopF и L7LoopB быстро в течение не более 30 минут, проводить в реакции LAMP выявление гена холодового шока cshl у штаммов V.cholerae O1 и не O1/не O139.
Кроме того, простота в исполнении анализа, низкая себестоимость, высокая чувствительность (1x104 м. кл. /мл) дает возможность применять его в практике бактериологических лабораторий центров гигиены и эпидемиологии, лечебно-профилактических, противочумных и других учреждений.
Источники информации
1. Всемирная организация здравоохранения (16 декабря 2022 г.). Новости о вспышках болезней. Холера - ситуация в мире. См. по адресу: https://www.who.int/ru/emergencies/disease-outbreak-news/item/2022-DON426
2. Сергиев В.П., Кутырев В.В. Холера и гибель древнейшей Индской цивилизации. Проблемы особо опасных инфекций. 2023; 2:95-100. DOI: 10.21055/0370-1069-2023-2-95-100
3. Barria С., Malecki М., Arraiano С.М. Bacterial adaptation to cold. Microbiology. 2013;159():2437-2443. https://doi.org/10.1099/mic.0.052209-0
4. Бородина O.B., Водопьянов C.O., Водопьянов A.C., Олейников И.П., Чемисова O.C, Полеева M.B. Изучение встречаемости гена холодового шока cshl у штаммов Vibrio cholerae, циркулирующих на территории Российской Федерации // Бактериология. - 2021. - Т. 6. - №3. - С. 22-23.
5. Водопьянов C.O., Бородина О.В., Ежова М.И., Олейников И.П., Водопьянов А.С., Носков А.К. Ген холодового шока cshl у Vibrio cholerae nonO1/nonO139. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова 2022; 18(4):12-19.
6. Водопьянов C.O., Бородина О.В., Водопьянов А.С., Олейников И.П. Патент «Способ выявления гена холодового шока cshl у штаммов Vibrio cholerae с помощью ПЦР в режиме реального времени». Патент на изобретение №2783023 от 08.11.2022.
7. Notomi Т., Okayama Н., Masubuchi Н. et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA // Nucleic Acids Res. - 2000. - Vol. 28. - e63-e63. DOI: 10.1093/nar/28.12.e63.
8. СанПиН 3.3686-21. Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней.
9. Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности: методические указания МУ 1.3.2569-09.-М.; 2009.
--->
<?xml version="1.0" encoding="UTF-8"?>
<!DOCTYPE ST26SequenceListing PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing
1.3//EN" "ST26SequenceListing_V1_3.dtd">
<ST26SequenceListing originalFreeTextLanguageCode="ru"
nonEnglishFreeTextLanguageCode="ru" dtdVersion="V1_3" fileName="не
О139 с помощью методом петлевой изотермической амплификации
(LAMP).xml" softwareName="WIPO Sequence" softwareVersion="2.3.0"
productionDate="2023-08-01">
<ApplicationIdentification>
<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>
<ApplicationNumberText>191</ApplicationNumberText>
<FilingDate>2023-08-01</FilingDate>
</ApplicationIdentification>
<ApplicantFileReference>191</ApplicantFileReference>
<ApplicantName languageCode="ru">Ростовский- на –Дону противочумный
институт Роспотребнадзора</ApplicantName>
<ApplicantNameLatin>Rostov-on-Don Plague Control Research Institute
of the Rospotrebnadzor</ApplicantNameLatin>
<InventionTitle languageCode="ru">Способ выявления гена холодового
шока csh1 у штаммов Vibrio cholerae О1 и неО1/не О139 с помощью
методом петлевой изотермической амплификации (LAMP).</InventionTitle>
<SequenceTotalQuantity>6</SequenceTotalQuantity>
<SequenceData sequenceIDNumber="1">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>19</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..19</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q2">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>caggttcggttaagtggtt</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="2">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>18</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..18</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q4">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>acattcacagcctgtagg</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="3">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>47</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..47</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q6">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value> vibrio cholerae </INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>tgaacaaatacatcagagccgcttttaatgaaagtaaaggctttggc</
INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="4">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>47</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..47</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q8">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ttcaattcgatcgcttcaggtgttttccttacttccctgttcgatac</
INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="5">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q10">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ccactatcaggagtaatgaag</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
<SequenceData sequenceIDNumber="6">
<INSDSeq>
<INSDSeq_length>23</INSDSeq_length>
<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>
<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>
<INSDSeq_feature-table>
<INSDFeature>
<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>
<INSDFeature_location>1..23</INSDFeature_location>
<INSDFeature_quals>
<INSDQualifier>
<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>genomic DNA</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
<INSDQualifier id="q12">
<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>
<INSDQualifier_value>Vibrio cholerae</INSDQualifier_value>
</INSDQualifier>
</INSDFeature_quals>
</INSDFeature>
</INSDSeq_feature-table>
<INSDSeq_sequence>ctttatttgaagatcaaaaagtc</INSDSeq_sequence>
</INSDSeq>
</SequenceData>
</ST26SequenceListing>
<---
Claims (10)
1. Способ выявления гена холодового шока cshl у штаммов V.cholerae О1 и неО1/неО139 методом петлевой изотермической амплификации (LAMP), включающий выделение ДНК из исследуемого материала, проведение петлевой изометрической амплификации и учет результатов, отличающийся тем, что амплификацию проводят с помощью набора из шести праймеров к гену cshl следующего состава:
L7F3 CAGGTTCGGTTAAGTGGTT
L7B3 ACATTCACAGCCTGTAGG
L7FIP TGAACAAATACATCAGAGCCGCTTTTAATGAAAGTAAAGGCTTTGGC
L7BIP TTCAATTCGATCGCTTCAGGTGTTTTCCTTACTTCCCTGTTCGATAC
L7LoopFCCACTATCAGGAGTAATGAAG
L7LoopBCTTTATTTGAAGATCAAAAAGTC
при этом реакцию петлевой изометрической амплификации проводят с помощью амплификатора по схеме двух ступеней - первая: 64,5°С, 30 сек; вторая: 65°С, 30 сек с учетом по каналу FAM, всего 50 циклов, а детекцию результатов амплификации осуществляют по каналу флуорофора FAM по геометрическому показателю Ср, выводимому в окне результатов амплификатора.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что для проведения LAMP предварительно готовят 10-кратную смесь праймеров для каждого из генов, которая включает: 16 мкМ каждого FIP- и BIP-праймеров, 2 мкМ каждого F3- и В3-праймеров, 4 мкМ каждого LoopF- и Loop В-праймеров, вода без нуклеаз до конечного объема 100 мкл, при этом положительный контроль включает в себя все компоненты реакции и препарат ДНК cshl+ V.cholerae, а в случае отрицательного контроля в реакционную смесь вместо исследуемого препарата ДНК вносят 5 мкл деионизованной воды, не содержащей исследуемой ДНК.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что амплификацию проводят в объеме 25 мкл и инкубационная смесь содержит: 12,5 мкл буфера БиоМастер LAMP SYBR 2х, 2,5 мкл 10-кратной смеси праймеров, 5 мкл ДНК матрицы, оставшийся объем - вода.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2819101C1 true RU2819101C1 (ru) | 2024-05-14 |
Family
ID=
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2665542C1 (ru) * | 2017-08-01 | 2018-08-30 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ идентификации нетоксигенных штаммов холерных вибрионов О1 серогруппы с помощью ПЦР для выделения генетических детерминант |
| WO2022095921A1 (en) * | 2020-11-05 | 2022-05-12 | Becton, Dickinson And Company | Multiplex detection and typing of vibrio cholerae |
| RU2792156C1 (ru) * | 2022-05-18 | 2023-03-17 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ молекулярного типирования типичных (O1) и атипичных (RO) нетоксигенных штаммов V. cholerae El Tor с помощью ПЦР в режиме реального времени |
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2665542C1 (ru) * | 2017-08-01 | 2018-08-30 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ идентификации нетоксигенных штаммов холерных вибрионов О1 серогруппы с помощью ПЦР для выделения генетических детерминант |
| WO2022095921A1 (en) * | 2020-11-05 | 2022-05-12 | Becton, Dickinson And Company | Multiplex detection and typing of vibrio cholerae |
| RU2792156C1 (ru) * | 2022-05-18 | 2023-03-17 | Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека | Способ молекулярного типирования типичных (O1) и атипичных (RO) нетоксигенных штаммов V. cholerae El Tor с помощью ПЦР в режиме реального времени |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Е.В. Монахова, И.В. Архангельская. Холерные вибрионы неO1/неO139 серогрупп в этиологии острых кишечных инфекций: современная ситуация в России и в мире, Проблемы особо опасных инфекций. 2016, вып. 2, стр.14-23. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP2419527B1 (en) | Method for the detection and characterization of a toxinogenic clostridium difficile strain | |
| Kumar et al. | Rapid multiplex PCR assay for the simultaneous detection of the Brucella Genus, B. abortus, B. melitensis, and B. suis | |
| RU2625006C1 (ru) | Способ таргетной амплификации геномов возбудителей инфекций органов репродукции человека с целью одновременной идентификации возбудителей с набором праймеров | |
| US20220098645A1 (en) | Fast and portable microfluidic detection system as an alternative to salmonella's classical culture method | |
| Grudlewska-Buda et al. | Comparison of the intensity of biofilm formation by Listeria monocytogenes using classical culture-based method and digital droplet PCR | |
| Dreier et al. | Real-time polymerase chain reaction in transfusion medicine: applications for detection of bacterial contamination in blood products | |
| WO2014003583A2 (en) | Detection of pathogens | |
| Ramezani et al. | Rapid and simple detection of Escherichia coli by loop-mediated isothermal amplification assay in urine specimens | |
| Yang et al. | Direct detection of Shigella flexneri and Salmonella typhimurium in human feces by real-time PCR | |
| Whiley et al. | A real-time PCR assay for the detection of Neisseria gonorrhoeae by LightCycler | |
| CA2816060C (en) | Rapid salmonella serotyping assay | |
| ZA200605546B (en) | Methods for detection of Mycobacterium tuberculosis | |
| RU2435853C1 (ru) | ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ Streptococcus agalactiae В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ | |
| CN105695584B (zh) | 检测实验动物金黄色葡萄球菌的gyrB引物组合 | |
| RU2819101C1 (ru) | Способ выявления гена холодового шока csh1 у штаммов Vibrio cholerae O1 и неО1/неО139 методом петлевой изотермической амплификации (LAMP) | |
| KR101752274B1 (ko) | 장출혈성 대장균의 시가독소 유전자형 stx1 및 stx2를 동시에 판별하기 위한 고감도 실시간 다중 등온증폭반응용 프라이머 세트 및 이를 이용한 장출혈성 대장균의 시가독소 유전자형의 판별 방법 | |
| Ismail et al. | Routine Use of 16S rRNA Gene Sequencing for Diagnosis of Culture-Negative Bacterial Infections in Body Fluids Other than Blood: Benefits in a Limited Resource Hospital | |
| Nagdev et al. | Comparison of real-time PCR and conventional PCR assay using IS6110 region of Mycobacterium tuberculosis for efficient diagnosis of tuberculous meningitis and pulmonary tuberculosis | |
| JP7153358B2 (ja) | 改良Ｔｍマッピング法 | |
| Al-Talib et al. | A quadriplex PCR assay for rapid detection of diarrhoea-causing parasitic protozoa from spiked stool samples. | |
| Kwiatkowska et al. | Clinical utility of a commercial ligase chain reaction kit for the diagnosis of smear-negative pulmonary tuberculosis | |
| JP2006061134A (ja) | 結核菌検出のためのプライマーおよび検出同定法 | |
| RU2795987C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов и способ выявления ДНК возбудителя бруцеллеза | |
| RU2706570C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров Ft 40 и способ определения бактерий Francisella tularensis (Варианты) | |
| RU2706564C1 (ru) | Набор олигонуклеотидных праймеров Ft 182 и способ определения бактерий Francisella tularensis (Варианты) |