RU2706564C1 - Набор олигонуклеотидных праймеров Ft 182 и способ определения бактерий Francisella tularensis (Варианты) - Google Patents

Набор олигонуклеотидных праймеров Ft 182 и способ определения бактерий Francisella tularensis (Варианты) Download PDF

Info

Publication number
RU2706564C1
RU2706564C1 RU2019104132A RU2019104132A RU2706564C1 RU 2706564 C1 RU2706564 C1 RU 2706564C1 RU 2019104132 A RU2019104132 A RU 2019104132A RU 2019104132 A RU2019104132 A RU 2019104132A RU 2706564 C1 RU2706564 C1 RU 2706564C1
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
seq
dna
tularensis
amplification
target gene
Prior art date
Application number
RU2019104132A
Other languages
English (en)
Inventor
Ирина Юрьевна Щит
Сергей Федорович Бикетов
Елена Станиславовна Куликалова
Original Assignee
Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ) filed Critical Федеральное бюджетное учреждение науки "Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУН ГНЦ ПМБ)
Priority to RU2019104132A priority Critical patent/RU2706564C1/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2706564C1 publication Critical patent/RU2706564C1/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к областям биотехнологии, молекулярной биологии и медицинской микробиологии. Описан набор олигонуклеотидных праймеров для реакции петлевой изотермической амплификации (LAMP), который позволяет амплифицировать специфические для бактерий вида Francisella tularensis фрагменты ДНК из целевого гена, имеющего нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 1. Описанный набор олигонуклеотидных праймеров включает: праймер FIP - «fopFt182-F3», имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 2, праймер BIP - «fopFt182-B3», имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 3, праймер F3 - «fopFt182-FIP», имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 4, праймер В3 - «fopFt182-BIP», имеющий нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 5. Изобретение позволяет в течение 1-2 часов с высокой специфичностью детектировать наличие возбудителя туляремии - Francisella tularensis в пробах чистых культур в концентрациях от 10-1000 мк в мл (в зависимости от штаммов). 3 н.п. ф-лы, 4 ил., 1 табл., 3 пр.

Description

Изобретение относится к области медицины, биотехнологии, молекулярной биологии и может быть использовано для лабораторной диагностики туляремии, как в практическом здравоохранении, так и для научных исследований в области микробиологии, эпидемиологии и патогенеза туляремии.
Туляремия - зоонозная природно-очаговая инфекция, этиологическим агентом которой является Francisella tularensis, грамотрицательная внутриклеточная бактерия, регулярно вызывающая эпидемические вспышки, как среди животных, так и людей.
Вид F. tularensis имеет четыре подвида: holarctica, mediasiatica, novicida и tularensis. Особую опасность представляет F. tularensis subsp. tularensis. Установлено, что вдыхание 10 бактерий способно вызвать заболевание у человека (McCrumb F.R. 1961. Aerosol infection of man with Pasteurella tularensis. Bacteriological Reviews 25:262-267). Из-за высокой инфекционности при аэрогенном пути заражения F. tularensis классифицируется как биоагент 1 уровня опасности (категория А).
Несмотря на то, что «золотым» стандартом» для диагностирования туляремии все еще является культивирование микроорганизма, обычно оно не проводится из-за невысокой чувствительности и требовательности к условиям работы. Для обнаружения и идентификации F. tularensis испробованы такие методы, как биосенсоры, культивирование, иммунохроматографический анализ, ПЦР, биочипы на жидкой или твердой основе, методы аналитической химии (газовая хроматография, масс-спектрометрия и т.д.). Среди этих методов для обнаружения F. tularensis доминирующим является ПЦР. При мониторинге природных очагов туляремии и лабораторном исследовании материала на наличие F. tularensis только с использованием ПЦР возможно выявление единичных бактерий возбудителя туляремии (высокочувствительный и высокоспецифичный nested-вариант) (Татарников С.А., Мазепа А.В., Балахонов С.В. Оптимизация Nested-варианта полимеразной цепной реакции для мониторинга природных очагов туляремии. Инфекция и иммунитет. 2013. Т. 3. №2. С. 175).
Существующие коммерческие тест-системы и экспериментальные образцы диагностических препаратов позволяют охарактеризовать штаммы на наличие генетических детерминант, специфичных для вида F. tularensis, различных подвидов (гены chi1f, RD1 и др.), штаммов разной вирулентности (pdpA, pdpD) и т.д. (Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней: Практическое руководство. Под редакцией Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева. - М.: ЗАО «Шико», 2013. - 560 с., Татарников С.А., Мазепа А.В., Дубровина В.И., Войткова В.В. Идентификация геномных областей pdpD и pdpA у туляремийного микроба разных подвидов. В книге «Биологическая безопасность в современном мире». 2009. С. 69-71).
Исследования молекулярно-генетической амплификационной технологии - loop-mediated isothermal amplification (LAMP) - показали высокую специфичность и амплификационную эффективность, которая достигается при изотермальных условиях реакции (Kaneko H., Kawana Т., Fukushima Е., Suzutani Т. Tolerance of loop-mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances. J. Biochem. Biophys. Methods. 2007. 70(3):499-501; Soto E., Hawke J.P., Fernandez D., Morales J.A. Francisella sp., an emerging pathogen of tilapia, Oreochromis niloticus (L.), in Costa Rica. J Fish Dis. 2009; 32(8):713-22). В LAMP используется 4 праймера, которые гомологичны шести участкам гена-мишени. Реакция протекает при постоянной температуре с использованием фермента, который катализирует реакцию синтеза новых цепей со смещением старых. Амплификацию и детектирование гена можно осуществить за одну стадию путем инкубации смеси образцов, праймеров, ДНК-полимеразы с функцией вытеснения цепей и субстратов при постоянной температуре (около 65°С). Эффективность амплификации очень высока, в течение 15-60 минут ДНК амплифицируется 109-1010 раз. Из-за высокой специфичности присутствие амплифицированного продукта однозначно указывает на присутствие гена-мишени.
Известно об использовании подобного метода для выявления присутствия Francisella piscicida, этиологического агента франциселлеза атлантической трески (Gadus morhua) (Caipang С.М., Kulkarni A., Brinchmann M.F., Korsnes K., Kiron V. Detection of Francisella piscicida in Atlantic cod (Gadus morhua L) by the loop-mediated isothermal amplification (LAMP) reaction. Vet J 2010; 184(3): 357-61). Для детекции гена GroEL возбудителя был разработан набор праймеров (два внешних и два внутренних). Подбор условий LAMP показал оптимальную температуру реакции 63°С в течение 1 ч с использованием бактериальной геномной ДНК в качестве матрицы. Продукты реакции визуализировали в ультрафиолетовом свете и анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. Метод оказался высоко специфичен для обнаружения F. piscicida и в 100 раз более чувствителен, чем обычная ПЦР. Применение LAMP-анализа возможно не только для ДНК штаммов, но и для суспензий органов атлантической трески. Однако для патогенных для человека видов F. tularensis информации о разработанных праймерах и (или) диагностических LAMP-тестах в открытых источниках не обнаружено.
Известен фермент для проведения петлевой изотермической амплификации - Bst-полимераза, выделенная из Bacillus stearothermophilus (Nagamine K., Watanabe K., Ohtsuka K., Hase Т., Notomi Т., 2001. Loop-mediated isothermal amplification reaction using a non-denatured template. Clin. Chem., 47: 1742-1743). Bst-полимераза активна при температуре до 66°С, но оптимальной для нее является температура 60°С. Успех изотермической амплификации зависит от активности ферментов по вытеснению цепи и от их способности проходить такие сложные области ДНК, как шпильки.
Однако, в научных публикациях есть сообщения о появлении ложно-положительных сигналов при работе с Bst-полимеразой.
Проведенный поиск по патентным базам и научно-техническим источникам информации показал отсутствие сведений об отечественных наборах, предназначенных для выявления F. tularensis методом петлевой изотермической амплификации. Поэтому, существует необходимость создания такого диагностикума для быстрой, чувствительной и специфичной детекции ДНК туляремийного микроба.
Раскрытие сущности изобретения.
Техническим результатом предлагаемого изобретения является разработка высокоспецифичных олигонуклеотидных праймеров для быстрого, специфичного и чувствительного способа выявлении бактерий вида F. tularensis в биологических образцах, основанного на петлевой изотермической амплификации фрагмента гена-мишени.
Технический результат достигается тем, что предложен набор оригинальных праймеров SEQ ID NO: 2 (прямой внешний праймер fopFt182-F3 F. tularensis);
SEQ ID NO: 3 (обратный внешний праймер fopFt182-B3 F. tularensis);
SEQ ID NO: 4 (прямой внутренний праймер fopFt182-FIP F. tularensis);
SEQ ID NO: 5 (обратный внутренний праймер fopFt182-BIP F. tularensis) для способа детекции туляремийного микроба, при котором используется фермент SD-полимераза (Ignatov K.В., Barsova E.V., Fradkov A.F., Blagodatskich K.A., Kramarova T.V., Kramarov V.M. A strong strand displacement activity of thermostable DNA polymerase markedly improves the results of DNA amplification. BioTechniques. 2014; 57:81-7) в реакции петлевой изотермической амплификации в следующих условиях: предварительный прогрев смеси 92°С - 2 мин, амплификация 60°С - 60 мин, детекция продукта амплификации осуществляется при помощи электрофореза в агарозном геле по характерной электрофореграмме (вариант 1) или окрашивания продуктов реакции амплификации с помощью интеркалирующего красителя SYBR Green I (вариант 2).
Технический результат также достигается благодаря использованию в качестве целевой мишени гена ген fopA, кодирующего внешний белок мембраны, который является уникальным белком F. tularensis.
Обоснование выбора олигонуклеотидных праймеров и ДНК-мишени.
Белки наружной мембраны часто являются стратегически важными для облегчения инвазии клетки-хозяина, выживания внутри клетки, а также факторами вирулентности и уклонения от иммунного ответа клетки-хозяина. Кроме того, они обладают протективными свойствами. Выбранный ген fopA кодирует внешний белок мембраны, который является уникальным белком F. tularensis. Последовательность SEQ ID NO: 1 (ген-мишень fopA) для подбора праймеров с целью детекции ДНК возбудителя туляремии методом петлевой изотермической амплификации была получена из базы GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information, США).
В качестве положительного контроля в экспериментах использовали штамм F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ, используя для выделения ДНК обеззараженные суспензии микроорганизма в концентрациях от 1×106 м.к./мл до 1×101 м.к./мл. Апробация праймеров была осуществлена на наборе штаммов возбудителей туляремии Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск».
Чувствительность реакции амплификации с праймерами оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений штамма F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ.
Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами (табл. 1, фиг. 1-4) и примерами (1-3).
Таблица 1. Характеристика подобранных олигонуклеотидных праймеров для детекции возбудителя туляремии.
Фиг. 1. Последовательность SEQ ID NO: 1 - нуклеотидная последовательность гена fopA из генома штамма Francisella tularensis subsp. tularensis SCHU S4. Серыми прямоугольниками выделены участки отжига праймеров и комплементарные им последовательности.
Фиг. 2. Определение специфичности LAMP-праймеров SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 для детекции F. tularensis с помощью SD-полимеразы.
Обозначения: 1 - ДНК F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ; 2 - ДНК F. tularensis subsp.holarctica 503; 3 - ДНК F. tularensis subsp. tularensis Schu S4; 4 - ДНК F. tularensis subsp. mediasiatica 120; 5 - ДНК F. tularensis subsp. mediasiatica A678; 6 - F. tularensis subsp. mediasiatica A198; 7 - ДНК В. anthracis СТИ-1; 8 - ДНК Y. pestis subsp. pestis bv. antiqua И3449; 9 - ДНК Y. pseudotuberculosis C79; 10 - ДНК V. cholerae Eltor M878; 11 - ДНК Escherichia coli JM83; 12 - ДНК В. suis 1330; 13 - ДНК В. abortus 19, 14 - ДНК В. melitensis 16-М, 15 - ДНК L. pneumophila subsp. pneumophila, серогруппа 1, АТСС 33152; 16 - ДНК L. pneumophila subsp. pneumophila, серогруппа 6, АТСС 33215; 17 - отрицательный контроль LAMP (вода); 18 - маркер молекулярного веса (100-1000 п.н.).
Фиг. 3 Результаты определения чувствительности набора LAMP-праймеров SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 с помощью SD-полимеразы. Использована ДНК из вакцинного штамма F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ.
Обозначения: 1 - маркер молекулярного веса (100-1000 п.н.); 2 - ДНК из 1×106 м.к.; 3 - ДНК из 1×105 м.к.; 4 - ДНК из 1×104 м.к.; 5 - ДНК из 1×103 м.к.; 6 - ДНК из 1×102 м.к.; 7 - ДНК из 1×101 м.к.; 8 - отрицательный контроль ПЦР (вода).
Фиг. 4. Результаты определения чувствительности набора LAMP-праймеров SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5 с помощью SD-полимеразы и окрашивания продуктов реакции SYBR Green I. Использована ДНК из вакцинного штамма F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ.
Обозначения: 1 - ДНК из 1×106 м.к.; 2 - ДНК из 1×105 м.к.; 3 - ДНК из 1×104 м.к.; 4 - ДНК из 1×103 м.к.; 5 - ДНК из 1×102 м.к.; 6 - ДНК из 1×101 м.к.; 7 - отрицательный контроль ПЦР (вода).
Примеры конкретного выполнения.
Пример 1. Методика конструирования олигонуклеотидных праймеров для детекции ДНК возбудителей туляремии методом петлевой изотермической амплификации.
На основе анализа in silico нуклеотидных последовательностей возбудителя туляремии, присутствующих в базе данных Genbank, для конструирования прямого и обратного внешних праймеров F3 и В3, прямого и обратного внутренних праймеров FIP и BIP был выбран участок генома F. tularensis размером 1882 п.н. (GenBank: AJ749949.2), кодирующий белок внешней мембраны F. tularensis. К участку гена SEQ ID NO: 1 (фиг. 1) подобраны праймеры SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5. Расчетная длина предполагаемого ампликона, фланкируемого праймерами SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5, составила 150 п.н. (табл. 1). На Фиг. 1 показаны участки отжига праймеров и комплементарные им последовательности, которые выделены прямоугольниками серого цвета.
При выборе олигонуклеотидных праймеров использовали программу для расчета праймеров он-лайн Primer Explorer 5 (http://primerexplorer.jp/lampv5e/index.html). При подборе праймеров руководствовались требованиями к олигонуклеотидам, используемым в LAMP. Анализ формирования вторичных структур (димеров, шпилек) выбранными праймерами проводили с помощью компьютерной программы mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/DNA-Folding-Form). Структуры всех олигонуклеотидов сравнивались с помощью информационного ресурса NCBI BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) с последовательностями ДНК, размещенными в базе данных GenBank. При проведении этого анализа олигонуклеотиды с существенной гомологией с ДНК каких-либо других организмов исключали. Для определения специфичности праймеров моделировали ПЦР in silico в отношении секвенированных геномов микроорганизмов с помощью In silico PCR amplification (http://insilico.ehu.es/PCR/). Показана теоретическая пригодность праймеров для успешной инициации реакции амплификации и гибридизации.
Пример 2. Амплификация специфических фрагментов ДНК с помощью разработанных праймеров для детекции возбудителя туляремии методом петлевой изотермической амплификации.
Реакционная смесь объемом 50 мкл содержала 1х SD-буфер (РусЭнзим, Россия), 40 ед. SD-полимеразы (РусЭнзим, Россия), 3,5 мМ MgCl2, 0,5 мМ каждого дНТФ, 4 праймера: 0,2 мкМ SEQ ID NO: 2 (fopFt182F3), 0,2 мкМ SEQ ID NO: 3 (fopFt182B3), 0,8 мкМ SEQ ID NO: 4 (fopFt182BIP), 0,8 мкМ SEQ ID NO: 5 (fopFt182FIP), 5 мкл матрицы. Реакцию проводили при температуре 60°С в течение 60 мин с предварительным прогревом при температуре 92°С в течение 2 мин на амплификаторе Терцик (ДНК-Технология). Детекцию продуктов LAMP проводили с помощью электрофореза в 1,2% агарозном геле в ТАЕ-буфере. (Вариант 1.) Или детекцию продуктов LAMP проводили с помощью окрашивания амплификатов интеркалирующим красителем SYBR Green I. Покраска образцов проводилась непосредственно после проведения реакции путем добавления красителя в реакцию до конечной концентрации 10х. (Вариант 2). В обоих вариантах детекции визуализацию осуществляли на УФ-трансиллюминаторе при длине волны 312 нм.
Результат амплификации каждого штамма F. tularensis считался положительным в случае появления полос в виде лестницы (вариант 1) или по появлению ярко-зеленого окрашивания после добавления SYBR Green I к амплификатам (вариант 2). Фиг. 2 отображает электрофореграмму, полученную при амплификации ДНК штаммов возбудителя туляремии с набором праймеров, подобранных к последовательности SEQ ID NO: 1.
Пример 3. Определение чувствительности и специфичности реакции амплификации с помощью разработанных олигонуклеотидных праймеров к последовательности SEQ ID NO: 1 для идентификации ДНК возбудителя туляремии.
Чувствительность реакции амплификации с разработанными специфичными праймерами SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 оценивалась при исследовании проб ДНК, выделенных из бактериальных взвесей клеток F. tularensis. Штаммы франциселл выращивали на чашках Петри с «FT-агаром» с добавлением полимиксина В (100 мкг/мл) в течение 48 ч при температуре (37+1)°С. Готовили бактериальные взвеси клеток в 2 мл 0,9% стерильного раствора натрия хлорида по отраслевому стандартному образцу мутности 10 единиц ГИСК им. Л.А. Тарасевича (ОСО 42-28-59-85 П), что соответствует 5×109 м.к./мл для туляремийного микроба. Затем разводили в 0,9% стерильном растворе натрия хлорида таким образом, чтобы концентрация возбудителей туляремии составляла от 1×106 до 1×101 м.к./мл. Выделение ДНК из чистых культур туляремии и гетерологичных микроорганизмов проводили путем нуклеосорбции и лизиса клеток гуанидинтиоцианатом с помощью набора «ДНК-сорб-В» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией по применению.
Учитывая, что возбудитель туляремии относится к агентам I группы патогенности, пробоподготовку и обеззараживание материала для проведения ПЦР осуществляли согласно МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности» и МУ 3.1.2007-05 «Эпидемиологический надзор за туляремией».
Специфичность разработанных праймеров оценена на коллекции из 18 штаммов, из которых 6 штаммов Francisella tularensis и 12 штаммов гетерологичных микроорганизмов (4 штамма L. pneumophila и по 1 штамму Yersinia pestis, Y. pseudotuberculosis, Bacillus anthracis, V. cholerae, Escherichia coli, B. suis, B. abortus, B. melitensis). Оценка специфичности показала отсутствие продуктов амплификации с ДНК гетерологичных штаммов.
Чувствительность праймеров оценивали с помощью проб ДНК, выделенных из десятикратных разведений штамма F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ. Анализ результатов показал, что чувствительность разработанных праймеров составила 1×103 м.к в пробе (фиг. 3, фиг. 4).
Таким образом, разработанные праймеры могут быть использованы для обнаружения ДНК возбудителя туляремии и позволяют в короткий срок с высокой чувствительностью и специфичностью детектировать возбудителя туляремии в пробах чистых культур. В результате проведенной оценки установлено, что выбранные праймеры для детекции возбудителей туляремии методом петлевой изотермической реакции обладают 100% специфичностью и чувствительностью - 1×103 м.к. в пробе.
Figure 00000001

Claims (3)

1. Набор олигонуклеотидных праймеров Ft182 для реакции петлевой изотермической амплификации, содержащий олигонуклеотиды SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; SEQ ID NO: 5, комплементарные к гену-мишени fopA бактерий вида Francisella tularensis, кодируемому нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1.
2. Способ определения бактерий Francisella tularensis методом петлевой изотермической амплификации (LAMP), отличающийся тем, что в реакции амплификации участка последовательности целевого гена-мишени fopA бактерий вида Francisella tularensis используют набор олигонуклеотидных праймеров по п. 1, причем синтез и накопление в одной пробирке фрагментов гена-мишени происходит при 60°С в течение максимум 60 мин, а определение целевого гена-мишени проводят с помощью электрофореза в агарозном геле по характерной электрофореграмме.
3. Способ определения бактерий Francisella tularensis методом петлевой изотермической амплификации (LAMP), отличающийся тем, что в реакции амплификации участка последовательности целевого гена-мишени fopA бактерий вида Francisella tularensis используют набор олигонуклеотидных праймеров по п. 1, причем синтез и накопление в одной пробирке фрагментов гена-мишени происходит при 60°С в течение максимум 60 мин, а определение целевого гена-мишени проводят с помощью окрашивания продуктов реакции амплификации интеркалирующим красителем SYBRGreenI, а результат амплификации каждого штамма F. tularensis считают положительным в случае появления ярко-зеленого окрашивания.
RU2019104132A 2019-02-14 2019-02-14 Набор олигонуклеотидных праймеров Ft 182 и способ определения бактерий Francisella tularensis (Варианты) RU2706564C1 (ru)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019104132A RU2706564C1 (ru) 2019-02-14 2019-02-14 Набор олигонуклеотидных праймеров Ft 182 и способ определения бактерий Francisella tularensis (Варианты)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2019104132A RU2706564C1 (ru) 2019-02-14 2019-02-14 Набор олигонуклеотидных праймеров Ft 182 и способ определения бактерий Francisella tularensis (Варианты)

Publications (1)

Publication Number Publication Date
RU2706564C1 true RU2706564C1 (ru) 2019-11-19

Family

ID=68579773

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2019104132A RU2706564C1 (ru) 2019-02-14 2019-02-14 Набор олигонуклеотидных праймеров Ft 182 и способ определения бактерий Francisella tularensis (Варианты)

Country Status (1)

Country Link
RU (1) RU2706564C1 (ru)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006136639A1 (es) * 2005-06-17 2006-12-28 Instituto De Salud Carlos Iii Método y kit de detección de especies bacterianas mediante análisis de adn
RU2451752C1 (ru) * 2010-12-13 2012-05-27 Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт "Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" Способ дифференциации бактерий francisella tularensis subsp. mediasiatica
RU2612137C1 (ru) * 2015-12-01 2017-03-02 Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский - на - Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Способ идентификации подвидов возбудителя туляремии Francisella tularensis subsp. tularensis, Francisella tularensis subsp. mediasiatica и Francisella tularensis subsp. holarctica

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006136639A1 (es) * 2005-06-17 2006-12-28 Instituto De Salud Carlos Iii Método y kit de detección de especies bacterianas mediante análisis de adn
RU2451752C1 (ru) * 2010-12-13 2012-05-27 Федеральное государственное учреждение здравоохранения "Ростовский-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт "Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека" Способ дифференциации бактерий francisella tularensis subsp. mediasiatica
RU2612137C1 (ru) * 2015-12-01 2017-03-02 Федеральное казенное учреждение здравоохранения "Ростовский - на - Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский противочумный институт" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Способ идентификации подвидов возбудителя туляремии Francisella tularensis subsp. tularensis, Francisella tularensis subsp. mediasiatica и Francisella tularensis subsp. holarctica

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
КУЛИКАЛОВА Е.С. и др. Использование реакций петлевой изотермической амплификации (lamp) для выявления ДНК вирулентных штаммов FRANCISELLA TULARENSIS, Инфекция и иммунитет, 2016, том 6, номер 3, стр.54. *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kulesh et al. Smallpox and pan-orthopox virus detection by real-time 3′-minor groove binder TaqMan assays on the roche LightCycler and the Cepheid smart Cycler platforms
Zhu et al. Use of visual loop-mediated isotheral amplification of rimM sequence for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium bovis
US20220098645A1 (en) Fast and portable microfluidic detection system as an alternative to salmonella's classical culture method
Mota et al. Recombinase polymerase amplification in the molecular diagnosis of microbiological targets and its applications
Derzelle et al. Use of high-resolution melting and melting temperature-shift assays for specific detection and identification of Bacillus anthracis based on single nucleotide discrimination
Zhang et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the mpb70 gene for rapid differential detection of Mycobacterium bovis
EP3303623A1 (en) Molecular detection of rna
RU2612137C1 (ru) Способ идентификации подвидов возбудителя туляремии Francisella tularensis subsp. tularensis, Francisella tularensis subsp. mediasiatica и Francisella tularensis subsp. holarctica
EP2753629B1 (en) Methods for detecting lyme disease
CA2816060C (en) Rapid salmonella serotyping assay
JP6117775B2 (ja) スタフィロコッカス・アウレウスの検出のための組成物及び方法
RU2551208C1 (ru) НАБОР ОЛИГОНУКЛЕОТИДНЫХ ПРАЙМЕРОВ И ФЛУОРЕСЦЕНТНО-МЕЧЕНОГО ЗОНДА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ Burkholderia mallei И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ЕГО ОТ Burkholderia pseudomallei
RU2706564C1 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров Ft 182 и способ определения бактерий Francisella tularensis (Варианты)
RU2703803C1 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров Ft 101 и способ определения бактерий Francisella tularensis (варианты)
Krawczyk et al. ADSRRS-fingerprinting and PCR MP techniques for studies of intraspecies genetic relatedness in Staphylococcus aureus
RU2706570C1 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров Ft 40 и способ определения бактерий Francisella tularensis (Варианты)
EP3438280B1 (en) Haemoplasma detection method
CZ2001542A3 (en) Genes for bacterial detection and detection method of bacteria by making use of these genes
JP2008072951A (ja) Ｌａｍｐ法を用いたサルモネラｏ４群の血清型迅速検出法
RU2819101C1 (ru) Способ выявления гена холодового шока csh1 у штаммов Vibrio cholerae O1 и неО1/неО139 методом петлевой изотермической амплификации (LAMP)
RU2795987C1 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов и способ выявления ДНК возбудителя бруцеллеза
KR20200048082A (ko) 쯔쯔가무시균 감염 질환 진단용 키트
RU2796820C1 (ru) Способ детекции чумного микроба и набор реагентов для его осуществления
RU2738358C1 (ru) Набор олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентно-меченых зондов и способ выявления ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР с детекцией продукта в режиме реального времени
US7749696B2 (en) Method and kit for the specific detection of M. tuberculosis