CN110669857B

CN110669857B - 水产品中拟态弧菌的微滴式数字pcr快速检测方法

Info

Publication number: CN110669857B
Application number: CN201911103336.XA
Authority: CN
Inventors: 刘云国; 韩庆典; 段家玉; 康大成; 彭善丽
Original assignee: Linyi University
Current assignee: Linyi University
Priority date: 2019-11-13
Filing date: 2019-11-13
Publication date: 2022-07-08
Anticipated expiration: 2039-11-13
Also published as: CN110669857A

Abstract

本发明公开了一种水产品中拟态弧菌的微滴式数字PCR快速检测方法，首先提取待测水产品样品增菌液的基因组DNA并稀释备用；再利用拟态弧菌基因组保守性DNA序列设计特异性引物和探针；然后使用该引物和探针对待测水产品样品增菌液的基因组DNA进行微滴式数字PCR扩增和检测。经PCR扩增后，采用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检靶分子的浓度或拷贝数。微滴式数字PCR可以直接得出DNA分子的个数，能对水产品中的拟态弧菌进行绝对定量。具有灵敏高、定量精确、检测的线性范围宽、特异性好、费用适中的优点。

Description

水产品中拟态弧菌的微滴式数字PCR快速检测方法

技术领域

本发明涉及一种水产品中拟态弧菌（Vibrio mimicus)的微滴式数字PCR快速检测方法。

背景技术

食源性疾病是受到全球普遍关注的公共卫生问题，也是目前中国最大的食品安全问题。食品致病因子主要有病原微生物、天然毒素、寄生虫和有毒化学物。现阶段食品不合格和食物中毒的主要原因是微生物污染，防控病原微生物的污染十分重要。拟态弧菌是我国微生物食物中毒事件中的一种重要致病菌，开发其快速检测方法很有意义。拟态弧菌系革兰阴性弧菌，具有单鞭毛，有动力，存在于河水、海水和水产品中。拟态弧菌广泛分布在我国福建、江苏、浙江、上海等沿海地区，拟态弧菌感染多呈散发或暴发，一年四季均有发病，以夏季为多。弧菌是水生环境的“土著”微生物，在海水、淡水环境及水产品中皆能增殖，尤其水温较高季节，水体和水产品中的弧菌污染率最高。研究发现，内陆地区水体和淡水产品中也存在致病性弧菌的高污染，尤其是非嗜盐微生物的拟态弧菌。当前，拟态弧菌的检测方法主要是传统的增菌培养——纯分离培养——生化鉴定，该方法的缺点是操作繁琐、检测时间长，而且生化鉴定的项目较多。随着人们生活水平的提高，对食品安全的需求越来越高，传统检测方法的低效率已经不能满足当前的检测任务。因而，开发拟态弧菌高效、快速检测方法很有必要。微滴式数字PCR技术是近年来发展起来的一种核酸定量技术，是一种核酸分子的绝对定量技术。相较于荧光定量PCR和普通PCR，微滴式数字PCR可以直接得出DNA分子的个数，能对水产品中的致病微生物进行绝对定量。其原理是通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元至少包含一个拷贝的目标分子( DNA 模板)，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR 扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度。同荧光定量PCR一样，在 PCR反应体系中也引入了荧光标记的探针，具有灵敏高、定量精确、检测的线性范围宽、特异性好的特点。微滴式数字PCR技术真正实现了PCR从定性到绝对定量的飞跃，有效解决了PCR污染和对模板定量不准确的问题。目前，该技术已初步应用于食源性微生物检测领域。然而，迄今国内还未见有利于微滴式数字PCR方法快速检测拟态弧菌的报道。

其特点是灵敏高、定量精确、检测的线性范围宽、特异性好、费用适中，是一种很有前途的分子定量检测手段。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的不足，提供一种检测速度快、灵敏度高、能够实现绝对定量的快速检测拟态弧菌的微滴式数字PCR方法。

本发明的技术解决方案是：一种水产品中拟态弧菌的微滴式数字PCR快速检测方法，其特征在于有如下步骤：

首先提取待测水产品样品增菌液的基因组DNA并稀释备用。

然后进行微滴式数字PCR 反应，每个微滴式数字PCR反应总体积为25μl，包括提取的基因组DNA 2μl；PCR预混液（2×ddPCR Master Mix）12.5μl；拟态弧菌上、下游引物各1μl(10 pmol/μl)，探针0.5μl (10 pmol/μl)；最后加ddH₂O至25μl。将充分混匀的PCR体系转移到微滴发生卡中，并向微滴发生卡中加入70μl微滴发生专用油，将微滴发生卡放到微滴发生器中进行反应。将生成的微滴全部转入到96 孔反应板，用封膜仪对96孔板封膜，进行PCR扩增。PCR反应程序参数为：95℃预变性10 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火50 s，40个循环；98℃固化微滴10 min。最后用微滴分析仪对扩增产物进行计数分析。

其中拟态弧菌特异性引物为：

V.mimi-1：5’-CGCTAGCTGGATGTCAGAGTCCT-3’；

V.mimi-2：5’- CTACTTAGGTTAGTAAATTCCTCACTC-3’。

特异性探针为：

V.mimi-3：5’-FAM-AAGTAGTAGATGCTGGATATACATATGTCCCCAAAC-3’。

经PCR扩增后，采用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出待检靶分子的浓度或拷贝数。

本发明提供了扩增拟态弧菌的特异引物V.mimi -1、V.mimi -2和探针V.mimi -3，从而提供一种水产品中拟态弧菌的微滴式数字PCR快速检测方法，同现有技术相比具有如下优点：

1．检测速度快，直接利用增菌液的基因组DNA进行检测，省去了革兰氏染色、分离纯化和生化鉴定步骤，而分离纯化和生化鉴定一般需要48～72h。

2．成本低，由于省略了革兰氏染色、分离纯化和生化鉴定步骤，节省了革兰氏染色、分离纯化培养基和生化试剂的费用，降低了检测成本。

3．灵敏度高，由于该技术在 PCR反应体系中引入了荧光标记的探针，提高了检测的灵敏度，数字PCR中荧光信号的产生过程基本与实时定量PCR相同。

4．能实现绝对定量，通过把一个样本的反应体系均匀分配到大量反应单元中，每个反应单元中不包含或包含一个到多个目的核酸序列，独立地进行PCR扩增，利用油包水原理完成微滴信号检测，最终根据泊松分布以及荧光信号阳性的反应单元数量占所有反应单元的比例来计算目的核酸序列的拷贝数。

具体实施方式

首先无菌操作取1g待测样品，加入盛有9ml 1%氯化钠碱性蛋白胨水的灭菌容器内，36℃±1℃，需氧条件下培养24h。取培养的菌液加入离心管中，以12000 rpm离心l min，弃上清液，利用菌体沉淀提取基因组DNA并稀释备用。

其中拟态弧菌特异性引物为：

V.mimi-1：5’-CGCTAGCTGGATGTCAGAGTCCT-3’；

V. mimi-2：5’- CTACTTAGGTTAGTAAATTCCTCACTC -3’。

特异性探针为：

V. mimi-3：5’- FAM-AAGTAGTAGATGCTGGATATACATATGTCCCCAAAC-3’。

序列表

<110> 临沂大学

<120> 水产品中拟态弧菌的微滴式数字PCR快速检测方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgctagctgg atgtcagagt cct 23

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctacttaggt tagtaaattc ctcactc 27

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aagtagtaga tgctggatat acatatgtcc ccaaac 36

Claims

1.一种微滴式数字PCR引物和探针在制备用于检测拟态弧菌产品中的应用，

所述引物为：V.mimi-1：5’-CGCTAGCTGGATGTCAGAGTCCT-3’；V.mimi-2：5’-CTACTTAGGTTAGTAAATTCCTCACTC-3’；

所述探针为：V.mimi-3：5’-FAM-AAGTAGTAGATGCTGGATATACATATGTCCCCAAAC-3’。