CN101333557B - 一种环境水体样品中多种肠道病原菌的同时定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种环境水体样品中多种肠道病原细菌同时快速定量检测方法，运用肠道病原细菌PCR通用引物，建立实时荧光定量聚合酶链式反应体系，定量测定环境水体中大肠杆菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌的细菌细胞密度，该方法可使水体样品分析从取样到出报告的时间缩短到几个小时，测定结果稳定，重现性好。本发明测定结果的标准偏差均低于MF检测结果，检测结果稳定，检测的重现性有了大幅度提高。

Description

一种环境水体样品中多种肠道病原菌的同时定量检测方法

技术领域

本发明涉及环境水体的检测方法，特别涉及一种环境水体样品中多种肠道病原菌的同时定量检测方法，该方法用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，QPCR)方法检测水体中的肠道病原细菌，适合于水体中大肠杆菌(Escherichia coli)、霍乱弧菌(Vibrio cholerae)、痢疾杆菌(Shigella dysenteriae)、伤寒杆菌(Salmonella typhrmurium)的定量检测。

背景技术

城市污染的加重，使更多未经处理的污水直接排放到地表环境，从而引发人类多种疾病甚至死亡，这在发展中国家尤为严重。尤其是通过水域传播的疾病，如痢疾、伤寒、霍乱，以及旅行中常见的腹泻等，都是由致病细菌引起的。由此，水域性病原菌的常规监测，对于公共健康来说是非常重要的。但由于缺乏精确和费用低廉的检测方法，使得预防和控制水域传染病暴发受到阻碍。

对于水体中病原菌的检测主要基于选择性培养和标准的生物化学方法。但这些方法存在一系列的缺陷。首先，水体中的病原细菌通常含量很少，取样和计数过程可能导致较大误差。其次，细菌培养方法通常费时、费力，检测单一。第三，环境中的病原微生物，有些很难培养甚至不能培养，却仍然能致病。很明显，发展新的病原细菌检测方法势在必行。近年来发展起来一系列免疫学方法，用于检测沙门氏菌、霍乱弧菌等病原菌。遗憾的是这些方法的灵敏度不稳定，并且影响因素很多。越来越多的人开始研究分子生物学方法的可行性，以求缩短检测和报告时间。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种环境水体样品中多种肠道病原细菌同时快速定量检测方法，该方法运用肠道病原细菌PCR通用引物，建立实时荧光定量聚合酶链式反应(QPCR)体系，定量测定环境水体中包括大肠杆菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌在内的细菌细胞密度，该方法能够同时检测多种肠道病原细菌，测试时间短，测定结果准确、稳定、重现性好。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种环境水体样品中多种肠道病原细菌同时快速定量检测方法，其特征在于，该方法运用肠道病原细菌PCR通用引物，建立实时荧光定量聚合酶链式反应体系，定量测定环境水体中大肠杆菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌的细菌细胞密度，具体包括下列步骤：

步骤一，设计并合成肠道病原细菌PCR通用引物：

该肠道病原细菌的PCR通用引物包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别为：

上游引物：5’-aaggcgacgatccctagctggtctgagaggatga/c-3’，

下游引物：5’-gcttgccagtatcagatgcagttcccaggttgagc-3’；

步骤二，制作定量PCR标准曲线：

标准曲线的纵坐标是已知细胞浓度的埃希氏大肠杆菌梯度稀释DNA提取物QPCR检测的C_T值，横坐标是相应的埃希氏大肠杆菌细胞密度；

步骤三，细菌浓缩回收及细菌DNA提取：

地表水水样通过离心收集细菌细胞，细菌DNA的提取采用细菌裂解缓冲液及苯酚-氯仿法提取；

步骤四，定量PCR反应体系及相关参数的确定：

QPCR扩增反应体系总体积25μL，内含1×realMastrMix/1×SYBRsolution，dNTP 0.2mmol/L，Taq DNA聚合酶1.0U，1×PCR缓冲液，2.0mmol/LMgCl₂，上、下游引物分别为0.1mmol/L，DNA模板2μL；

PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃链延伸5min。阴性对照中，用灭菌双蒸水代替DNA模板，每隔0.2s自动读数一次，阈值设定为最初的3～7个循环荧光值标准偏差的10倍；

步骤五，结果计算：

通过已知细胞数量的埃希氏大肠杆菌QPCR标准曲线，即可确定环境水样中目标细菌细胞的数量。

本发明与现有检测方法的比较，具有下列特点：

(1)能够同时检测水体中常见的4种病原细菌(大肠杆菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌)，检测结果更能反映水体的真实污染情况。

(2)检测迅速，耗时短。本发明方法从取样到出结果可以在5个小时内完成，而常规MF方法需要1-3天才能出结果。

(3)检测灵敏度高，结果准确。可检出250ng/L的大肠杆菌标准菌株DNA，其PCR检测的灵敏度可达2.75 CFU/mL，检测的可信度为94％。

(4)测定结果稳定，重现性好。本发明测定结果的标准偏差均低于常规MF检测结果，检测结果稳定，检测的重现性有了大幅度提高。

具体实施方式

本发明通过对定量聚合酶链式反应方法的研究，为环境水体病原性污染分析提供一种新方法，该方法以通用引物荧光定量PCR方法快速检测地表水中的多种病原细菌，可使水体样品病原菌污染分析从取样到出报告的时间缩短到几个小时。

目前，环境水体中病原细菌的检测是用MF方法，检测的指标有：细菌总数、总大肠菌群和粪大肠菌群。通过对5个不同地表水体水样分别用MF方法与QPCR方法进行连续6个月的检测(共18次)，对2种方法的检测结果进行比较分析，结果如表1所示。

表1  不同地表水体中病原细菌检测结果分析(连续6个月，共18次)

注：*用传统MF方法确定，用CFU表示；**用QPCR方法确定，用CCE表示。

本发明的环境水体样品中多种肠道病原细菌同时快速定量检测方法，运用肠道病原细菌PCR通用引物，建立实时荧光定量聚合酶链式反应体系，定量测定环境水体中包括大肠杆菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌在内的细菌细胞密度，具体包括下列步骤：

(1)通用引物的设计与合成：

以细菌16S rRNA基因为靶序列，根据细菌16S rRNA基因的高度保守性，设计志贺氏痢疾杆菌(Shigella dysenteriae)，霍乱弧菌(Vibriocholerae)，沙门氏菌(Salmonella typhrmurium)和埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)的通用引物，设计的通用引物的核苷酸序列如下：

上游引物：5’-aaggcgacgatccctagctggtctgagaggatga/c-3’(246-280bp，E.coli.16S rRNA)

下游引物：5’-gcttgccagtatcagatgcagttcccaggttgagc-3’(521-556bp，E.coli.16S rRNA)。引物由专业生物工程公司合成。

(2)标准曲线的制定：

用LB固体培养基(1L水中：10g蛋白胨，5g NaCl，5g酵母浸膏，1.5g琼脂粉)经平板计数，测得埃希氏大肠杆菌(E.coli)培养液中细菌的浓度。将培养液用灭菌蒸馏水10倍梯度稀释，稀释后的菌液离心后(7000r/min，10min)，回收菌体，并用灭菌蒸馏水洗涤3次，用苯酚-氯仿法提取细菌总DNA，以此为QPCR标准曲线制作的DNA摸板进行QPCR反应，以已知细胞浓度的埃希氏大肠杆菌(E.coli)梯度稀释DNA提取物QPCR检测的C_T值为纵坐标，相应的埃希氏大肠杆菌(E.coli)细胞密度为横坐标制作QPCR标准曲线。大肠杆菌每个稀释浓度，平行操作3组，以3组细菌细胞数的平均来确定悬浮液中的细胞浓度。

(3)取样及细菌浓缩：

选取不同的地表水体进行采样，采样位点为水深1/2处，每个水样100mL，样品至少平行3组。地表水水样通过离心收集细菌细胞(7000r/min，10min)。

(4)细菌基因组DNA提取：

地表水水样离心(7000r/min，10min)后，弃去上清液；沉淀物加入567μL的裂解缓冲液(40mmoL/L Tris-HCl，pH8.0，20mmol/L乙酸钠，1mmol/L EDTA，1％SDS)，反复吹打使之重新悬浮，接着加入66μL 5mol/LNaCl，充分混匀后，10000r/min离心10min后将上清转入一只新管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1体积比)，振荡混匀，离心(10000r/min，4~5min)；取上清后，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来；离心后(10000r/min，10min)，沉淀用1mL的70％乙醇洗涤2次，DNA样品用20μL灭菌双蒸水溶解。

(5)QPCR反应体系及参数确定：

QPCR扩增反应体系总体积25μL，内含1×realMastrMix/1×SYBRsolution，dNTP 0.2mmol/L，Taq DNA聚合酶1.0U，1×PCR缓冲液，2.0mmol/LMgCl₂，上下游引物分别为0.1mmol/L，DNA模板2μL。PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃链延伸5min。阴性对照中，用灭菌双蒸水代替DNA模板，每隔0.2s自动读数一次，阈值设定为最初的3～7个循环荧光值标准偏差的10倍。

(6)结果计算：

利用埃希氏大肠杆菌(E.coli)梯度稀释DNA提取物QPCR检测的C_T值与相应的埃希氏大肠杆菌(E.coli)细胞密度对数值的离散与回归分析，建立QPCR检测的标准曲线。环境水样中目标细胞数量的确定是通过已知细胞数量的埃希氏大肠杆菌(E.coli)QPCR标准曲线推断出的相对数量。

以下是发明人给出的一个具体的实施例：

·设备和试剂

设备：

定量PCR仪(BIO-RAD MJ，美国)；

离心机(Eppendorf 3.0，德国)；

分子生物学试剂：

Taq DNA聚合酶(上海生物工程公司)；

Syber Green I试剂盒(天根生化科技有限公司，北京)；

PCR试剂盒(上海生物工程公司)；

普通化学试剂：

Tris-HCl，乙酸钠，EDTA，SDS，NaCl，酚，氯仿，异戊醇，异丙醇，乙醇(均为上海化学试剂厂产品，分析纯)。

·检测程序

(1)取样及细菌浓缩：

选取不同的地表水体进行采样，采样位点为水深1/2处，每个水样100mL，样品至少平行3组。地表水水样通过离心收集细菌细胞(7000r/min，10min)。

(2)DNA提取：

细菌沉淀物加入567μL的裂解缓冲液(40mmoL/L Tris-HCl，pH8.0，20mmol/L乙酸钠，1mmol/L EDTA，1％SDS)，反复吹打使之重新悬浮，接着加入66μL 5mol/L NaCl，充分混匀后，10000r/min离心10min后将上清转入一只新管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1体积比)，振荡混匀，离心(10000r/min，4~5min)；取上清后，加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来；离心后(10000r/min，10min)，沉淀用1mL的70％乙醇洗涤2次，DNA样品用20μL灭菌双蒸水溶解。

(3)QPCR反应：

QPCR扩增反应体系总体积25μL，内含1×realMastrMix/1×SYBRsolution，dNTP 0.2mmol/L，Taq DNA聚合酶1.0U，1×PCR缓冲液，2.0mmol/LMgCl₂，上下游引物分别为0.1mmol/L，DNA模板2μL。PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃链延伸5min。阴性对照中，用灭菌双蒸水代替DNA模板，每隔0.2s自动读数一次，阈值设定为最初的3～7个循环荧光值标准偏差的10倍。

(4)结果计算：

通过已知细胞数量的埃希氏大肠杆菌(E.coli)QPCR标准曲线，即可确定环境水样中目标细菌细胞的数量。

Claims (1)

1.一种环境水体样品中多种肠道病原细菌同时快速定量检测方法，其特征在于，该方法运用肠道病原细菌PCR通用引物，建立实时荧光定量聚合酶链式反应体系，定量测定环境水体中大肠杆菌、霍乱弧菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌的细菌细胞密度，具体包括下列步骤：

步骤一，设计并合成肠道病原细菌PCR通用引物：

该肠道病原细菌PCR通用引物的分为上游引物和下游引物，其核苷酸序列分别为：

上游引物：5’-aaggcgacgatccctagctggtctgagaggatga/c-3’，

下游引物：5’-gcttgccagtatcagatgcagttcccaggttgagc-3’；

步骤二，制作定量PCR标准曲线：

标准曲线的纵坐标是已知细胞浓度的埃希氏大肠杆菌梯度稀释DNA提取物QPCR检测的C_T值，横坐标是相应的埃希氏大肠杆菌细胞密度；

步骤三，细菌浓缩回收及细菌DNA提取：

地表水水样通过离心收集细菌细胞，细菌DNA的提取采用细菌裂解缓冲液及苯酚-氯仿法提取；

步骤四，定量PCR反应体系及相关参数的确定：

QPCR扩增反应体系总体积25μL，内含1×realMastrMix/1×SYBRsolution，dNTP 0.2mmol/L，Taq DNA聚合酶1.0U，1×PCR缓冲液，2.0mmol/LMgCl₂，上下游引物分别为0.1mmol/L，DNA模板2μＬ；

PCR扩增条件：94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃链延伸5min；阴性对照中，用灭菌双蒸水代替DNA模板，每隔0.2s自动读数一次，阈值设定为最初的3～7个循环荧光值标准偏差的10倍；

步骤五，结果计算： 

通过已知细胞数量的埃希氏大肠杆菌QPCR标准曲线，即可确定环境水样中目标细菌细胞的数量。