CN102605069B - 肠出血性大肠杆菌o104︰h4检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒，包含PCR反应液，所述PCR反应液包含第一反应液、第二反应液及稳定剂，所述第一反应液包含以wzy(O104)、fliC(H4)和aggR基因为靶基因，并用于荧光定量PCR的wzy(O104)基因的引物探针、fliC(H4)基因的引物探针和aggR基因的引物探针。本发明还提供一种肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒的使用方法，所述方法具有快速准确、特异性强、操作简便且不会出现假阳性的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测试剂盒，具体涉及一种肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒和及其使用方法。
背景技术
2011年5月德国暴发了大规模肠出血性大肠杆菌O104:H4疫情，波及部分欧洲国家以及美国、加拿大等国家，短时间内感染人数超过4000，少数病例继发溶血性尿毒综合征(HUS)，导致多器官受损，甚至有30多人死亡。
肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhage E.Coli，EHEC)是大肠杆菌的一个亚型，其可引起严重的食源性疾病。常见的肠出血性大肠杆菌(EHEC)血清型有3个：O157、O26、O111，不常见的血清型有40多种，而O104:H4是EHEC家族中的一种罕见的血清型，其含有志贺毒素2(vtx2a)的基因和肠积聚性黏附大肠杆菌毒力质粒上的3个基因：aatA，aggR和aap。
鉴于肠出血性大肠杆菌O104:H4危害的严重性以及其影响的广泛性，快速准确地对其进行检测将具有十分重要的意义。培养法是国际上通用的鉴定细菌的方法，参照肠出血性大肠杆菌O157:H4检测方法《SN/T 0973-2010进出口肉、肉制品及其他食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7检测方法》，肠出血性大肠杆菌O104:H4采用培养法检测步骤如下：
(1)增菌
无菌操作将待检样品放入增菌肉汤中，培养18小时-24小时。
(2)分离
对(1)增菌肉汤进行10倍递增梯度稀释，从10-4、10-5、10-6稀释液中各取0.1mL增菌肉汤滴加于SMAC平板或(和)科玛嘉大肠杆菌显色琼脂平板上， 以灭菌L棒进行涂布并置于36℃±1℃培养18小时-24小时。在SMAC平板上可疑肠出血性大肠杆菌菌落呈淡褐色中心，扁平透明，边缘光滑，直径约2mm。在科玛嘉大肠杆菌显色琼脂平板上可疑肠出血性大肠杆菌菌落呈紫红色。
(3)生化试验和血清学鉴定
从SMAC平板或科玛嘉大肠杆菌显色琼脂平板上挑选不少于5个-8个可疑菌落，进行生化鉴定和血清凝集试验。
(4)结果报告
根据选择性分离平板、生化试验和血清学鉴定结果，报告样品中检出或未检出肠出血性大肠杆菌O104:H4。
传统的针对肠出血性大肠杆菌O104:H4的培养检测法存在操作周期长、工序繁琐、易污染及所需试剂繁多等缺点，传统培养法已无法满足快速检测肠出血性大肠杆菌O104:H4的需要。
因此需要开发一种能快速准确地检测肠出血性大肠杆菌O104:H4的检测试剂盒来满足当前需要。
发明内容
针对现有技术中的检测周期长、工序繁琐、灵敏度低等缺点，本发明提供一种能快速准确地检测肠出血性大肠杆菌O104:H4的检测试剂盒。
本发明的目的通过以下技术手段得以实现：
一种肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒，包含PCR反应液，所述PCR反应液包含第一反应液、第二反应液及石蜡，所述第一反应液包含以wzy(O104)、fliC(H4)和aggR基因为靶基因，并用于荧光定量PCR的wzy(O104)基因的引物探针、fliC(H4)基因的引物探针和aggR基因的引物探针。
本发明还提供一种肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒的使用方法，所述方法包括以下步骤：
提供待检测样品；
进行荧光定量PCR检测，所述荧光定量PCR检测使用本发明的肠出血性 大肠杆菌O104:H4检测试剂盒进行，所述荧光定量PCR检测包含阴性对照检测和阳性对照检测。
本发明提供的肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒及其使用方法，利用荧光定量PCR技术针对肠出血性大肠杆菌O104:H4的特异基因wzy(O104)、fliC(H4)和aggR基因进行检测，避免了传统培养检测法中的操作周期长、所需试剂繁多、对操作者主观性依赖等缺点，本发明将检测时间由传统培养检测法的36小时以上缩短为5小时左右，且只需短时间接触病菌而增加了操作者安全性，并具有操作简便且不会出现假阳性等优点。
附图说明
图1为本发明使用的Ct值的示意性说明，其中所述的阈值线对应于特定探针；
图2为使用本发明的肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒进行检测的流程图；
图3为使用本发明的肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒进行检测的阳性对照的结果，其中三条阈值线分别对应于三种探针，由上至下依次对应FAM、HEX、ROX；
图4为使用本发明的肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒进行检测的阴性对照的结果，其中三条阈值线分别对应于三种探针，由上至下依次对应FAM、HEX、ROX；
图5为使用本发明的肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒进行检测得到的荧光定量PCR结果，其中三条阈值线分别对应于三种探针，由上至下依次对应FAM、HEX、ROX。
具体实施方式
以下缩略语适用于本发明：
PCR：Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应
Tris：三异丙基乙磺酰
EDTA：ethylenediamine tetraacetic acid，乙二胺四乙酸
dNTP：deoxy-ribonucleoside triphosphate，脱氧核糖核苷三磷酸
FAM：Carboxyfluorescein，羧基荧光素
HEX：hexachloro-fluorescein，六氯荧光素
ROX：Carboxy-X-rhodamine，羧基-X-罗丹明
DABCYL：4，4-Dimethylamino-azobenzene-4′carboxylic acid，4-二甲胺偶氮苯-4’-羧酸
Ct：cycle threshold，每个PCR反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数，参见图1。
本说明书中使用的术语“浓度”，如非特别说明，均指初始浓度，即与其它液体混合之前的浓度。
荧光定量PCR技术在基础科学研究、临床诊断、疾病研究及药物研发等领域都有广泛应用。其基本原理为：在PCR反应体系中引入一种荧光化学物质，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断积累，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光信号强度，这样就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图，见图1，在曲线指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可进行定量分析。
基于以上技术，本发明的肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒针对EHEC O104:H4三个基因wzy(O104)、fliC(H4)和aggR设计特异性引物和探针，在反应体系中含有wzy(O104)、fliC(H4)和aggR基因DNA模板的情况下，PCR反应得以进行并释放荧光信号。利用荧光定量PCR仪对PCR过程中相应的信号强度进行实时监测和输出，实现检测结果的定性分析。
本发明实施例提供一种肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒，包含PCR反应液，所述PCR反应液包含第一反应液、第二反应液及稳定剂，所述 第一反应液包含以wzy(O104)、fliC(H4)和aggR基因为靶基因，并用于荧光定量PCR的wzy(O104)基因的引物探针、fliC(H4)基因的引物探针和aggR基因的引物探针。
优选地，本发明实施例肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒中，
上述wzy(O104)基因的引物探针为：
wzy(O104)基因的引物：
49F：5’-TTAGTTCATTAGATCGAGGT-3’(SEQ ID NO：1)，
49R：5’-TCCAAAATAACTTTGAACACA-3’(SEQ ID NO：2)，
wzy(O104)基因的探针：
49A：5’-(FAM)CTTGTCTTTGCAGTCTACT(DABCYL)-3’(SEQ ID NO：3)；
上述fliC(H4)基因的引物探针为：
fliC(H4)基因的引物：
50F：5’-GTCTGCGTATTAACAGCGCTA-3’(SEQ ID NO：4)，
50R：5’-GCCTGAGTCAGACCTTTGATGT-3’(SEQ ID NO：5)，
fliC(H4)基因的探针：
50H：5’-(HEX)GCCAGGCGATTGCTAACCG(DABCYL)-3’(SEQ ID NO：6)；
上述aggR基因的引物探针为：
aggR基因的引物：
51F：5’-GCAATACATATCTTAGAAATG-3’(SEQ ID NO：7)，
51R：5’-CGTCTTAATGTATCGCTGC-3’(SEQ ID NO：8)，
aggR基因的探针：
51X：5’-(ROX)AATATATCAGTAAGATTGC-3’(SEQ ID NO：9)。
优选地，本发明实施例肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒中，上述第一反应液还包括不含镁离子的10×buffer、MgCl2、dNTPs、灭菌超纯水，各 组分体积份数为：
该第一反应液总体积份数优选但不仅仅为18体积份数。
优选地，本发明实施例肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒中，上述第二反应液由DNA聚合酶、显色液和灭菌超纯水组成。其中，DNA聚合酶为Taq酶，所述显色液为溴酚蓝，且该第二反应液各组分体积份数优选为：
Taq酶(浓度为5-10U/μl) 0.15-0.3体积份数
溴酚蓝 0.01-0.02体积份数
灭菌超纯水 1.68-1.84体积份数。
该第二反应液总体积份数优选但不仅仅2体积份数。
优选地，本发明实施例肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒中，上述稳定剂优选为石蜡，且第一反应液与第二反应液被该石蜡分隔开；其中，第一反应液位于石蜡下方，第二反应液在石蜡上方。
优选地，本发明实施例肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒中，还包含DNA提取液，阴性对照液和阳性对照液。其中，DNA提取液优选为0.01M-0.02M的pH7.98-8.02的Tris-EDTA缓冲液，Tris-EDTA缓冲液含0.01％-0.02％NP-40(体积百分比)；阴性对照液优选为不含肠出血性大肠杆菌O104:H4的基因组DNA的0.01-0.02M pH7.98-8.02的Tris-EDTA缓冲液；阳性对照液优选为含有肠出血性大肠杆菌O104:H4的基因组DNA的0.01-0.02M pH7.98-8.02的Tris-EDTA缓冲液。
上述实施例中肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒用于检测肠出血性大肠杆菌O104:H4时能有效利用荧光定量PCR技术针对肠出血性大肠杆菌O104:H4的特异基因wzy(O104)、fliC(H4)和aggR基因进行快速检测，将检测时间由传统培养检测法的36小时以上缩短为5小时左右，且只需短时间接触病菌而增加了操作者安全性，并具有操作简便且不会出现假阳性等优点。从而有效避免了传统培养检测法中的操作周期长、所需试剂繁多、对操作者主观性依赖等缺点。
本发明还提供一种肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒的使用方法，所述使用方法包括以下步骤：
提供待检测样品；
进行荧光定量PCR检测，所述荧光定量PCR检测使用上述实施例肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒进行。
优选地，本发明的肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒的使用方法中，所述荧光定量PCR检测反应条件为：
50-55℃：2-5min；
94-95℃：2-3min；
94-95℃：5-10S，55-60℃：40-80S，35-40个循环。
以下结合具体实施例对上述致病性大肠杆菌检测方法进行详细说明。
实施例一
肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒的制备：
(1)按以下序列合成引物探针：
wzy(O104)基因的引物：
49F：5’-TTAGTTCATT AGATCGAGGT-3’(SEQ ID NO：1)，
49R：5’-TCCAAAATAACTTTGAACACA-3’(SEQ ID NO：2)，
wzy(O104)基因的探针：
49A：5’-(FAM)CTTG TCTTTGCAGTCTACT(DABCYL)-3’(SEQ ID NO：3)；
fliC(H4)基因的引物：
50F：5’-GTCTGCGTATTAACAGCGCTA-3’(SEQ ID NO：4)，
50R：5’-GCCTGAGTCAGACCTTTGATGT-3’(SEQ ID NO：5)，
fliC(H4)基因的探针：
50H：5’-(HEX)GCCAGGCGATTGCTAACCG(DABCYL)-3’(SEQ ID NO：6)；
aggR基因的引物：
51F：5’-GCAATACATATCTTAGAAATG-3’(SEQ ID NO：7)，
51R：5’-CGTCTTAATGTATCGCTGC-3’(SEQ ID NO：8)，
aggR基因的探针：
51X：5’-(ROX)AATATATCAGTAAGATTGC-3’(SEQ ID NO：9)。
(2)配制第一反应液：
在容器内加入含有2.5体积份数不含镁离子的10×buffer、3.5体积份数25mM的MgCl2、2.5体积份数的dNTPs，然后再加入引物49F(50μM)0.15体积份数、引物49R(50μM)0.15体积份数、探针49A(50μM)0.1体积份数、引物50F(50μM)0.15体积份数、引物50R(50μM)0.15体积份数、探针50H(50μM)0.1体积份数、引物51F(50μM)0.08体积份数、引物51R(50μM)0.08体积份数、探针51X(50μM)0.1体积份数，再加入灭菌超纯水使第一反应液总体积份数为18，混合均匀，置于容器内；
(3)配制稳定液：取石蜡，置于容器内；
(4)配制第二反应液；取0.2体积份数的Taq酶(5U/μl)、0.02体积份数的溴酚蓝并加入灭菌超纯水使第二反应液总体积份数为2，混合均匀，置于容器内；
(5)配制DNA提取液：0.01M Tris-EDTA缓冲液，pH8.0，含0.01％NP-40，置于容器内；
(6)配制阴性对照液：0.01M Tris-EDTA缓冲液，pH8.0；
(7)配制阳性对照液：由DNA序列合成供应商(宝生物工程(大连)有限公司)合成出血性大肠杆菌O104:H4基因wzy(O104)、fliC(H4)和aggR的部分序列DNA(SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：12)，溶于0.01M Tris-EDTA缓冲液(阳性对照DNA浓度：5ng/μl)，pH8.0，置于容器内冷冻保存。
该检测试剂盒制备工艺简述如下：
1.将上述步骤(2)制备的第一反应液分装至用于荧光定量PCR的0.2ml八联管中，每管加18μl；
2.将上述步骤(3)制备的石蜡加热融化，加入至步骤1得到的八联管中的第一反应液上，每管加20μl；
3.待步骤2的石蜡冷却凝固后，向该八联管中加入步骤(4)配制的第二反应液，每管加2μl，制备成含PCR反应液的八联管；
4.将步骤(5)配制的DNA提取液无菌分装至5ml普通离心管，5ml/管，该离心管配有蓝色盖；
5.将上述步骤(6)制备的阴性对照液无菌分装至0.6ml普通带盖离心管，40μl/管，该离心管为紫色透明；
6.将上述步骤(7)制备的阳性对照液融化后无菌分装至0.6ml普通带盖离心管，40μl/管，该离心管为橙红色透明；
7.组装试剂盒，其中每个试剂盒规格为：含PCR反应液的0.2ml八联管×6条；含DNA提取液的5ml蓝盖离心管×1支；含阴性对照液的0.6ml紫色透明离心管；含阳性对照液的0.6ml橙红色透明离心管。
实施例二
肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒的应用：
本发明以培养法作为检测肠出血性大肠杆菌O104:H4的参照，本发明的肠出血性大肠杆菌O104:H4检测试剂盒的检测流程如图2所示。
培养法步骤如下：
将待测样品置于LB培养基中，于37℃培养18小时，然后对增菌液进行10倍梯度稀释，从其中的10-4、10-5、10-6稀释液中各取0.1mL增菌液滴加于科玛嘉大肠杆菌显色琼脂平板上，以灭菌L涂布棒进行涂布并置于37℃±1℃培养18小时-24小时。在科玛嘉大肠杆菌显色琼脂平板上培养后选取蓝色菌落作为可疑肠出血性大肠杆菌。从该琼脂平板上挑选该可疑菌落，进行生化鉴定和血清凝集试验，根据所得结果做出判断。
本发明的检测试剂盒检测步骤如下：
(1)增菌培养：将待测样品置于LB培养基中，于37℃培养3小时，取1ml增菌液，加入DNA提取液50μl，混合均匀；
(2)加样：取步骤(1)所得的混合液，加入至实施例一中制备的含PCR反应液的八联管中，每管5μl；
(3)阴性对照组：取实施例一中制备的阴性对照液，加入至实施例一中制备的含PCR反应液的八联管中，每管5μl；
(4)阳性对照组：取实施例一中制备的阳性对照液，加入至实施例一中制备的含PCR反应液的八联管中，每管5μl；
(5)将步骤(2)-(5)所得的八联管放入荧光定量PCR仪(型号：Stratagene Mx3005P)中进行反应，荧光定量PCR反应条件为：
50℃：2min；
95℃：3min；
95℃：5S，55℃：60S，40个循环；
(6)根据扩增图谱判定结果，参考阳性对照结果(图3)，阴性对照结果(图4)，其中：
阳性结果：扩增曲线图Ct值≤35，并有明显指数增长。
阴性结果：扩增曲线图Ct值＞35或无Ct值。
结果：
使用本发明的检测试剂盒进行检测得到的荧光定量PCR结果见图5。
培养法检测结果及本发明的检测试剂盒的结果的比较参见表1。
表1
传统培养法检测肠出血性大肠杆菌O104:H4需要36h以上，而采用本发明的检测试剂盒进行检测只需要约5h，且本发明的检测试剂盒的检测结果与传统培养法检测结果一致。因此，从以上结果可以看出，本发明的肠出血性大 肠杆菌O104:H4检测试剂盒与传统的培养法相比，在检测肠出血性大肠杆菌O104:H4方面具有快速、灵敏、安全等优点，可应用于肠出血性大肠杆菌O104:H4的检测。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种肠出血性大肠杆菌O104︰H4检测试剂盒，包含PCR反应液，所述PCR反应液包含第一反应液、第二反应液及稳定剂，所述第一反应液包含以wzy(O104)、fliC(H4)和aggR基因为靶基因，并用于荧光定量PCR的wzy(O104)基因的引物探针、fliC(H4)基因的引物探针和aggR基因的引物探针，其中，
所述wzy(O104)基因的引物探针为：
wzy(O104)基因的引物:
49F:5’-TTAGTTCATTAGATCGAGGT-3’(SEQ ID NO:1)，
49R:5’-TCCAAAATAACTTTGAACACA-3’(SEQ ID NO:2)，
wzy(O104)基因的探针：
49A:5’-(FAM)CTTGTCTTTGCAGTCTACT(DABCYL)-3’(SEQ ID NO:3);
所述fliC(H4)基因的引物探针为：
fliC(H4)基因的引物：
50F:5’-GTCTGCGTATTAACAGCGCTA-3’(SEQ ID NO:4)，
50R:5’-GCCTGAGTCAGACCTTTGATGT-3’(SEQ ID NO:5)，
fliC(H4)基因的探针：
50H:5’-(HEX)GCCAGGCGATTGCTAACCG(DABCYL)-3’(SEQ ID NO:6);
所述aggR基因的引物探针为：
aggR基因的引物：
51F:5’-GCAATACATATCTTAGAAATG-3’(SEQ ID NO:7)，
51R:5’-CGTCTTAATGTATCGCTGC-3’(SEQ ID NO:8)，
aggR基因的探针：
51X:5’-(ROX)AATATATCAGTAAGATTGC-3’(SEQ ID NO:9)。
2.根据权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌O104︰H4检测试剂盒，其特征在于，所述第一反应液还包括不含镁离子的10×buffer、MgCl2、dNTPs、灭菌超纯水，所述第一反应液各组分体积份数为：
wzy(O104)基因的引物:
25-50μM的49F 0.1-0.2体积份数
25-50μM的49R 0.1-0.2体积份数；
wzy(O104)基因的探针：
25-50μM的49A 0.05-0.15体积份数；
fliC(H4)基因的引物：
25-50μM的50F 0.1-0.2体积份数
25-50μM的50R 0.1-0.2体积份数；
fliC(H4)基因的探针：
25-50μM的50H 0.05-0.15体积份数；
aggR基因的引物：
25-50μM的51F 0.1-0.2体积份数
25-50μM的51R 0.1-0.2体积份数；
aggR基因的探针：
3.根据权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌O104︰H4检测试剂盒，其特征在于，所述第二反应液由DNA聚合酶、显色液和灭菌超纯水组成。
4.根据权利要求3所述的肠出血性大肠杆菌O104︰H4检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Taq酶，其浓度为5-10U/μl，所述显色液为溴酚蓝，且所述第二反应液各组分体积份数为：
所述Taq酶 0.15-0.3体积份数
溴酚蓝 0.01-0.02体积份数，
灭菌超纯水 1.68-1.84体积份数。
5.根据权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌O104︰H4检测试剂盒，其特征在于，所述稳定剂为石蜡，且所述第一反应液与所述第二反应液被所述石蜡分隔开，所述第一反应液位于所述石蜡下方，所述第二反应液在所述石蜡上方。
6.根据权利要求1所述的肠出血性大肠杆菌O104︰H4检测试剂盒，其特征在于，所述肠出血性大肠杆菌O104︰H4检测试剂盒还包含DNA提取液、阴性对照液和阳性对照液。
7.根据权利要求6所述的肠出血性大肠杆菌O104︰H4检测试剂盒，其特征在于，所述DNA提取液为0.01M-0.02M的pH7.98-8.02的Tris-EDTA缓冲液，所述Tris-EDTA缓冲液含体积百分比为0.01%-0.02%的NP-40；所述阴性对照液为不含肠出血性大肠杆菌O104︰H4的基因组DNA的0.01-0.02MpH7.98-8.02的Tris-EDTA缓冲液；所述阳性对照液为含有肠出血性大肠杆菌O104︰H4的基因组DNA的0.01-0.02M pH7.98-8.02的Tris-EDTA缓冲液。
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| 王庆忠 等.肠出血性大肠埃希菌O104：H4检测技术.《检验医学》.2011,第26卷(第7期), * |
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