CN107245525A - 仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法 - Google Patents

仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法，属于生物基因检测技术领域。所述方法包括样本收集、粪便样本大肠杆菌的分离及鉴定、血清型鉴定、毒力因子结果检测、含有多种毒力因子大肠杆菌的全基因组测序分析和全基因组序列分析的步骤。本发明通过全基因组测序的方法能够更为全面的了解大肠杆菌ST4214的基因组信息，分析其所包含的毒力因子情况；通过对仔猪腹泻源大肠杆菌ST4214的基因组分析，对于了解仔猪腹泻流行的血清型具有重要意义。针对于仔猪腹泻源大肠杆菌ST4214耐药基因的分析，对于了解其抗生素敏感及耐药情况可以指导抗生素的应用，减少抗生素的滥用。本发明对于未来地区仔猪腹泻疫苗的研发提供数据基础。

Description

仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法
技术领域
本发明属于生物基因检测技术领域，具体涉及一种仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法。
背景技术
大肠杆菌导致的仔猪腹泻给农业带来重大损失。导致猪腹泻的大肠杆菌依据其宿主的定植部位、毒力因子作用机制、临床症状及结局可分为肠集聚性大肠杆菌(EAEC)，可集合粘附于培养的HEp-2/HeLa细胞在肠黏膜形成生物膜；致病性大肠杆菌(EPEC)，依附于肠细胞造成肠细胞的损伤；肠出血性的大肠杆菌(EHEC/STEC)，能够产生不同形式的致贺毒素；肠毒素大肠杆菌(ETEC)，能够产生热稳定或热不稳定的毒素；肠侵略性的大肠杆菌(EIEC)，产生毒素质粒编码蛋白介导对肠上皮细胞的侵袭。每一种型别代表一类具有共同毒理因子的菌株。然而，目前分离的很多菌株具有多种型别的主要毒力因子，并且被认为具有更强的致病性。与猪腹泻相关的毒力因子包括黏附分子(F4,F5,F6,F18,F41,紧密黏附素)，毒素(STa,STb,LT,Stx2e,EAST1)，针对毒力因子的研究对于未来研究细菌的致病性具有重要意义。
大肠杆菌的血清型是其致病性的重要决定因素。导致猪腹泻的肠毒素性大肠杆菌的主要血清型包括O8,O9,O45,O101,O138,O139,O141,O149及O157。针对中国19个省肠外致病性的大肠杆菌的主要血清型研究显示O161,O8,O11,O138,O101及O26为主要流行的血清型。相对于人、牛、家禽而言，猪的流行血清型相对较少，流行的血清型在不同的地域不同的时间也是不尽相同，因此仍需要更多针对于猪流行血清型的研究。
抗生素的耐药是全球人类医学及动物医学面临的重要问题。致病性大肠杆菌的耐药是国际研究的一个焦点。在2011年5月德国爆发了产致贺毒素及肠黏附聚集的大肠杆菌O104:H4导致的溶血-尿毒症综合症。所有被分离出的菌株均对盘尼西林、头孢菌素耐药，对碳青霉烯类敏感。对耐药基因的分析对于控制致病性的菌及减少抗生素的耐药具有重要作用。相关的现有技术参数文献包括：
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发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法，从腹泻的仔猪粪便中分离出致病性的大肠杆菌，并对其血清型、毒力因子、耐药基因进行分析，对未来仔猪腹泻流行血清型、生物学特征的研究，以及未来大肠杆菌导致感染性疾病的预防奠定了基础。
本发明的所述的仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法，包括如下步骤：
第一步，样本收集。
第二步，粪便样本大肠杆菌的分离及鉴定。
第三步，血清型鉴定。
第四步，毒力因子结果检测。
第五步，含有多种毒力因子大肠杆菌的全基因组测序分析。
第六步，全基因组序列分析。
本发明的优点在于：
(1)本发明通过全基因组测序的方法能够更为全面的了解大肠杆菌ST4214的基因组信息，分析其所包含的毒力因子情况。
(2)通过对仔猪腹泻源大肠杆菌ST4214的基因组分析对于了解仔猪腹泻流行的血清型具有重要意义。
(3)针对于仔猪腹泻源大肠杆菌ST4214耐药基因的分析，对于了解其抗生素敏感及耐药情况可以指导抗生素的应用，减少抗生素的滥用。
(4)本发明对于未来地区仔猪腹泻疫苗的研发提供数据基础。
附图说明
图1是大肠杆菌ST4214的基因组功能分类。
图2是四种菌株毒力因子分析的维恩图。
图3是四种菌株抗性基因分析结果。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。
本发明提供一种仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法，所述方法包括如下步骤：
第一步，样本收集。
从北京地区8个猪场收集了400份仔猪腹泻粪便样本，每个猪场都有基础母猪500头以上。仔猪饲养在水泥带排孔的地面。仔猪水样便甚至便中带血或排便明显频繁可诊断为腹泻。
第二步，粪便样本大肠杆菌的分离及鉴定。
(1)粪便样本培养于含有5％(质量百分比浓度)血清的胰蛋白胨培养基中，37℃培养20h。
(2)从胰蛋白胨培养基中挑取细菌克隆进一步培养于麦康凯固体培养基，37℃培养20h。经过3代纯化，挑取细菌克隆进一步培养于LB固体培养基，37℃培养12h。
(3)为了进一步确定分离的细菌为大肠杆菌，将步骤(2)经过LB固体培养基得到的分离菌纯培养物分别作吲哚试验、甲基红试验、VP试验、构椽酸盐利用试验和三糖铁培养基培养试验，逐一鉴定筛选，以大肠杆菌参考菌株ATCC 25922作对照，筛选出的大肠杆菌菌株，再做葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、尿素发酵试验，观察记录结果。
第三步，血清型鉴定。
按中国兽药监察所提供的大肠杆菌O抗原定型血清使用说明书的方法进行血清型鉴定。将第二步(2)中经过LB固体培养基得到的大肠杆菌分离菌于121℃培养2h，提取菌体抗原。应用171种O抗血清进行玻片凝集试验检测O抗原，NaCl作为阴性对照。阳性结果应用试管凝集实验进一步确认实验结果。
第四步，毒力因子结果检测。
应用DNA提取试剂盒，提取DNA。应用PCR方法检测分离菌株的毒力因子sta,stb,astA,eaeA,stx2e,F4,F18,sepA。PCR产物应用0.8％(质量百分比浓度)的琼脂糖凝胶进行分离鉴定。测序分析进一步确定实验结果。
第五步，含有多种毒力因子大肠杆菌的全基因组测序分析。
对含有sta、F18、eae A、stx2e、sepA毒力因子的大肠杆菌进行测序分析。基因组序列采用Illumina公司的Hiseq2000测序系统进行全基因组测序。将大肠杆菌基因组DNA使用nanodrop2000和Aglent2100做质检，检测合格后进行文库制备和文库质检。PE100下机数据进行质检，得到合格数据(clean data)，将clean data分别做de novo拼接，使用Glimmer3.0程序对基因ORF序列进行预测，将ORF序列与NCBI nt数据库和大肠杆菌全基因数据库进行比对，对预测的基因进行校对；将ORF序列与KEGG和GO数据库进行比对，对预测的基因进行功能注释。
第六步，全基因组序列分析。
应用SRST2(Short Read Sequence Typing)软件进行多位点序列分型分析(MLST)。所有的等位基因及序列分型与MLST网站(http://www.mlst.net/)一致。血清型确定通过O抗原加工系统基因wzx,wzy,wzm，wzt，确定O抗原，鞭毛蛋白基因fliC,flkA,flmA,flnA及fllA确定H抗原。上述关于O,H抗原基因的这些数据库来源于NCBI核酸序列库。应用JSpecies确定大肠杆菌平均核酸同源性分析(ANIm)。应用BLASP软件分析毒力因子及耐药基因。以大肠杆菌O157:H7,O145:H28及O104:H4全基因组序列作为参考。应用Thevirulence factor database(VFDB)病原菌毒力因子数据库作为毒力因子分析的参考数据库。应用RGI软件及The Comprehensive Antibiotic Resistance Database(CARD)数据库对耐药基因进行注释。
下面结合附图和试验数据对上述实施例结果进行说明。
1、分离及鉴定大肠杆菌。
第一步和第二步从400份腹泻样本中共分离出64份可能为大肠杆菌，进一步应用三糖铁及生化实验，观察和记录结果表明，所分离菌株与大肠杆菌的特征一致。因此确认从腹泻样本实施例分离的64株菌株为大肠杆菌。
2、血清型鉴定。
根据第三步中的试验方法，64株大肠杆菌的血清型鉴定结果见表1。对64株仔猪源致病性大肠杆菌鉴定出血清型的有42株，占鉴定菌株的65％，22株未能定型，占鉴定菌株的35％。流行的主要血清型主要有8种，分别为O101(18.8％)、O8(11.0％)、O20(11.0％)、O64(12.5％)、O45(4.6％)、O149(4.6％)、O2(1.5％)、O89(1.5％)。其中，O101(18.8％)、O8(11.0％)、O20(11.0％)、O64(12.5％)是4种主要流行血清型，其余各血清型较为分散，相同来源的菌株有相同血清型分布，也有不同血清型分布，而不同来源的菌株也有部分具有相同血清型。
表1 64株仔猪源致病性大肠杆菌血清型分布表
3、毒力因子检测。
致病性的大肠杆菌通过毒素如(例如.,STa,STb,Stx2e,EAST1及SepA)，紧密黏附素(eae)及菌毛黏附(例如.,F4或F18)导致仔猪腹泻的发生。本实验对64株仔猪源致病性大肠杆菌毒力因子基因进行PCR检测见表2，其携带毒力因子基因情况见表3，携带毒力因子astA和eaeA的菌株超过50％，而30％以上的菌株分别拥有sta和Stx2e。另外，80％的细菌至少拥有2个毒力因子，其中毒力因子组合Stx2e+astA和Stx2e+eaeA较为流行，分别为20株和25株，而毒力因子组合sta+stb和stb+Stx2e较为少见，仅分别检测到3株和2株。5株细菌中没有检测到所调查的任何一个毒力因子。
表2 64株仔猪源致病性大肠杆菌毒力因子分布表
4、全基因组测序分析
对含有sta+F18+eaeA+stx2e+sep毒力因子的大肠杆菌进行全基因组测序分析。大肠杆菌分离株的全基因组大小为5.5Mb，GC含量为50.3％(表3)。蛋白编码序列的长度为5743，N50值为60564nt。开放式阅读框的结果见图1，大肠杆菌ST4214的基因组功能分类，多位点序列分型分析(MLST)的结果显示这株大肠杆菌为ST4214,平均核酸同源性分析(ANIm)的结果显示大肠杆菌ST4214与大肠杆菌K-12substr.MG1655的同源性最高，ANIm值为99.23。血清型分析的结果显示大肠杆菌ST4214的血清型为O3H45。
表3大肠杆菌分离株基因组信息表
5、大肠杆菌分离株毒力因子及耐药基因的分析
四种菌株毒力因子分析的维恩图见图2。大肠杆菌O145,O157及O104因含有较强毒力因子，在本研究中选作参考菌株。毒力因子的分析结果表明这四株菌共有354个毒力因子，可粗略的分为5大类：黏附、毒素、自身转运、分泌系统、铁转运系统。此外，本研究中分离的大肠杆菌ST4214还含有64个特异的毒力因子。这些毒力基因编码鞭毛蛋白(fliB,C,E,F,G,H,I,N,P,Q,R,flgA,B,C,D,E,F,G,H,I,J,K,L,M,fleR,flhB,motA,B)，IV型分泌系统(virB1,B5,B6,B8,B10,D4,trwD,trwK,ptlF,dotO/icmB,lpg2370)，II型分泌系统(xcp W,S),溶血素(hlyA,C),菌毛(pefA,C,D,pilR),肠毒素(eltA,B),夹膜多糖相关蛋白(kpsD,E,T,M,lipA,tviE,cps4H,N,wcbB,D,hscB,caf1A),定植相关蛋白acfB,非菌毛黏附物质afaB-VIII，III型分泌系统vtrA。大肠杆菌ST4214含有这些独特的毒力因子可能使其具有较强的致病性。
针对耐药基因分析的结果显示大肠杆菌ST4214含有氨基香豆素耐药基因cpxA，磺胺类耐药基因(sul1,sul2,sul3)，β-内酰胺耐药基因(TEM-1,marA,acre,evgA,mdtF)，流出泵相关耐药基因(cmlA1,mdtG,mdtH,mdtL,emrB)，多粘菌素耐药基因MCR-1及PmrF肽耐药基因bacA。大肠杆菌ST4214不含有氨基糖苷类抗生素耐药基因(图3)。
随着中国养猪业的发展，大肠杆菌感染导致的仔猪腹泻的发病率和死亡率越来越高。本发明中从400份腹泻仔猪的粪便样本中分离出64株大肠杆菌。对4株大肠杆菌的血清型分析结果表明，O101,O64,O8及O20是较为流行的血清型，这与之前关于中国大肠杆菌导致猪腹泻的流行血清型研究相一致。毒力因子分析的结果表明最为流行的毒力因子基因为astA及eaeA，检出率分别为57.8％及53.1％。astA基因编码EAST1，与F4菌毛的出现有密切联系，在猪腹泻性疾病的发病中是一个重要的毒力因子。eaeA基因编码紧密黏附素，介导细菌粘附于内皮细胞侵袭宿主肠壁。大部分的大肠杆菌分离株含有2种以上的毒素，stx2e+astA及stx2e+eaeA毒力因子组合最为常见。stx2e基因编码的志贺毒素2e是大肠杆菌损伤内皮细胞的重要毒素。
对含有毒力因子最多的大肠杆菌分离株进行了全基因组测序分析，多位点序列分型分析(MLST)分析结果表明大肠杆菌分离株为ST4214，ANIm分析的结果表明大肠杆菌分离株为ST4214与大肠杆菌K-12substr.MG1655的同源性最高。大肠杆菌ST4214的血清型为O3H45,大肠杆菌分离株ST4214与大肠杆菌O157:H7,O145:H28及O104:H4毒力因子的分析比较结果表明4株菌株共有354个毒力基因，这些毒力基因编码黏附、毒素、自动转运、分泌及铁转运相关蛋白。大肠杆菌ST4214还含有64种特异基因，编码鞭毛、分泌蛋白、溶血素、菌毛及肠毒素。鞭毛对于大肠杆菌的黏附、侵袭以及逃逸巨噬细胞吞噬具有重要作用。本发明中大肠杆菌ST4214含有特异的编码传统鞭毛的编码基因，对于细菌在液体培养基中的游动具有重要作用。分泌系统在细菌内广泛存在，为细菌提供细胞内外的物质转运。IV型分泌系统转运细菌膜内外的大分子，IV型分泌系统在病原菌内广泛存在，转运相应的效应分子进入宿主细胞。II型分泌系统在很多细菌内均有存在，在分泌毒素及酶的过程中发挥作用。大肠杆菌ST4214含有的特异的独立因子可能使其具有更强的致病性。但关于大肠杆菌ST4214的生物学可能的致病性仍需后续的研究进行分析。
长期应用抗生素导致了中国农场广泛耐药菌株的出现。本发明中大肠杆菌ST4214包含多种抗生素耐药基因，包括氨基香豆素耐药基因，磺胺类耐药基因，β-内酰胺耐药基因，流出泵相关耐药基因，多粘菌素耐药基因，肽耐药基因。这些结果表明临床上多重耐药大肠杆菌非常严重，应该引起相关部门的重视。
总之，本发明分离了64株大肠杆菌，并对这些菌株进行了血清学分型及毒力因子分析。并对含有多种毒力因子的大肠杆菌进行了全基因组测序分析，大肠杆菌O157:H7,O145:H28及O104:H4的全基因组序列被选作参考序列。结果表明大肠杆菌ST4214含有64种特异的毒力基因及多重耐药基因。本发明为未来关于大肠杆菌的致病性以及大肠杆菌导致的猪腹泻性疾病的预防及控制奠定基础。

Claims (7)

1.仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法，其特征在于：包括如下步骤，
第一步，样本收集；
第二步，粪便样本大肠杆菌的分离及鉴定；
第三步，血清型鉴定；
第四步，毒力因子结果检测；
第五步，含有多种毒力因子大肠杆菌的全基因组测序分析；
第六步，全基因组序列分析。
2.根据权利要求1所述的仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法，其特征在于：所述的样本收集从猪场收集了400份仔猪腹泻粪便样本，每个猪场都有基础母猪500头以上；仔猪饲养在水泥带排孔的地面。
3.根据权利要求1所述的仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法，其特征在于：第二步具体包括，
(1)粪便样本培养于含有5％血清的胰蛋白胨培养基中，37℃培养20h；
(2)从胰蛋白胨培养基中挑取细菌克隆进一步培养于麦康凯固体培养基，37℃培养20h；经过3代纯化，挑取细菌克隆进一步培养于LB固体培养基，37℃培养12h；
(3)将步骤(2)经过LB固体培养基得到的分离菌纯培养物分别作吲哚试验、甲基红试验、VP试验、构椽酸盐利用试验和三糖铁培养基培养试验，逐一鉴定筛选，以大肠杆菌参考菌株ATCC 25922作对照，筛选出的大肠杆菌菌株，再做葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、尿素发酵试验。
4.根据权利要求1所述的仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法，其特征在于：第三步具体为，将大肠杆菌分离菌于121℃培养2h，提取菌体抗原；应用171种O抗血清进行玻片凝集试验检测O抗原，NaCl作为阴性对照，阳性结果应用试管凝集实验进一步确认实验结果。
5.根据权利要求1所述的仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法，其特征在于：第四步具体为，
应用PCR方法检测分离菌株的毒力因子sta,stb,astA,eaeA,stx2e,F4,F18,sepA；PCR产物应用0.8％的琼脂糖凝胶进行分离鉴定。
6.根据权利要求1所述的仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法，其特征在于：第五步具体为，
对含有sta、F18、eae A、stx2e、sepA毒力因子的大肠杆菌进行测序分析；基因组序列采用Hiseq2000测序系统进行全基因组测序；将大肠杆菌基因组DNA使用nanodrop2000和Aglent2100做质检，检测合格后进行文库制备和文库质检；PE100下机数据进行质检，得到合格数据clean data，将clean data分别做de novo拼接，使用Glimmer3.0程序对基因ORF序列进行预测，将ORF序列与NCBI nt数据库和大肠杆菌全基因数据库进行比对，对预测的基因进行校对；将ORF序列与KEGG和GO数据库进行比对，对预测的基因进行功能注释。
7.根据权利要求1所述的仔猪腹泻大肠杆菌的全基因组测序分析方法，其特征在于：第六步具体为，
血清型确定通过O抗原加工系统基因wzx,wzy,wzm，wzt，确定O抗原，鞭毛蛋白基因fliC,flkA,flmA,flnA及fllA确定H抗原；关于O,H抗原基因的数据库来源于NCBI核酸序列库；应用JSpecies确定大肠杆菌平均核酸同源性分析；应用BLASP软件分析毒力因子及耐药基因；以大肠杆菌O157:H7,O145:H28及O104:H4全基因组序列作为参考；应用VFDB病原菌毒力因子数据库作为毒力因子分析的参考数据库；应用RGI软件及CARD数据库对耐药基因进行注释。
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