CN102586438A - 基于lamp的微生物目视化荧光显色基因检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于LAMP的微生物目视化荧光显色基因检测方法，涉及一种微生物基因检测方法。本检测方法是①用缓冲蛋白胨水（BPW）按照国标法培养待检样品4h；②用水煮法从待测样品中提取DNA；③将DNA加入到LAMP反应体系中，65℃保温1h；④通过与对照组比较，肉眼观察待测样品结果，对样品进行定性分析。本发明与传统培养法相比，检测速度快，仅5h，加上样品DNA的提取制备，总共不超过6h；特异性好，灵敏度高；步骤简单，可重复性高；可同时进行多个样品检测。本发明可对微生物进行定性检测，并可替代一直沿用的传统的培养法和血清学检测方法。

Description

基于LAMP的微生物目视化荧光显色基因检测方法

技术领域

本发明涉及一种微生物基因检测方法，尤其涉及一种基于LAMP的微生物目视化荧光显色基因检测方法，适用于微生物定性检测。

背景技术

微生物是包括细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生动物和显微藻类等在内的一大类生物群体。微生物个体微小，却与人类生活关系密切，涵盖了有益有害的众多种类，广泛涉及健康、食品、医药、工农业和环保等诸多领域。微生物对人类最重要的影响之一是导致传染病的流行，在人类疾病中有50％是由病毒引起。食品污染严重威胁人类身体健康，食源性致病菌是引起细菌性食物中毒的病原体。因此，微生物检测在人类社会生活中具有极其重要的意义，开发一种快速灵敏的微生物基因检测方法十分必要。

传统检测微生物的培养方法，需要分离、筛选和生化鉴定，必要时还需要血清学鉴定，一般为4～6d，费时费力，具有灵敏度低、特异性差、假阳性和耗时费力等缺点。

各种常规PCR(Polymerase Chain Reaction聚合酶链式反应)方法具有敏感性强、特异性高、简便和快速等优点，有较多应用于微生物基因检测的报道，但由于存在PCR后处理产生污染导致的假阳性等问题以及需要特殊的仪器设备而限制了其在基层单位的应用。

近年来发展起来的LAMP(loop-mediated isothermal amplification，环介导等温扩增技术)以其灵敏度高、速度快和特异性强等优点在基因定性检测方面得到广泛应用，并且已经成为当前核酸定性检测的重要方法之一。

LAMP是一种新型的等温核酸扩增方法，该方法针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件(65℃左右)保温约60min，即可完成核酸扩增反应，产生肉眼可见的反应副产物——白色焦磷酸镁沉淀。该方法具有不需要PCR仪、肉眼可判断结果及反应时间短、特异性强和灵敏度高等优点。

因此焏待开发一种精确、灵敏、快速和无污染的临床检验方法。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有技术存在的缺点和不足，并针对LAMP出现的白色焦磷酸镁沉淀肉眼难以辨别问题做出改进，提供一种基于LAMP的微生物目视化荧光显色基因检测方法(简称检测方法)。

本发明的目的是这样实现的：

基本思路：

本检测方法先按照国标法用缓冲蛋白胨水增菌培养待检样品，然后利用水煮法提取样品DNA，接着将提取到的样品DNA进行恒温扩增，最后通过荧光显色法用肉眼直接判断检测结果。

具体地说，本检测方法包括下列步骤：

①用缓冲蛋白胨水(Buffer Peptone Water简称BPW)按照国标法培养待检样品4h；

②用水煮法从待测样品中提取DNA；

③将DNA加入到LAMP反应体系中，65℃保温1h；

④通过与对照组比较，肉眼观察待测样品结果，对样品进行定性分析；

所述LAMP反应体系包括LAMP反应液和荧光显色剂；

a)LAMP反应液

LAMP反应液由LAMP 10×buffer 2.5μl，20μmol/L内引物FIP、BIP各2.0μl，20μmol/L外引物F3、B3各1.0μl，25mmol/L dNTPs 3.0μl，50mmol/L MgSO₄3.0μl，1.0mol/L甜菜碱5μl，Bst DNA聚合酶大片段1.0μl，无菌双蒸水2.0μl组成，反应液总体积22.5μl；

b)荧光显色剂

荧光显色剂是由10μmol/L-20mmol/L的钙黄绿素1μl和60μmol/L-0.1mol/LMnCl₂ 0.5μl组成。

本发明的工作原理：

在本发明提供的LAMP反应体系中含有荧光显色剂(钙黄绿素和MnCl₂)，在等温扩增反应之初，钙黄绿素与荧光淬灭剂MnCl₂结合而不发荧光。由于反应生成的焦磷酸根离子更容易与锰离子结合从而释放了钙黄绿素，游离的钙黄绿素就可以自发荧光，在镁离子存在的条件下，这种荧光效果得到了加强。因此，当使用本发明检测样品时，在恒温条件(65℃左右)保温约1h后，在日光灯下阳性样本管呈绿色，阴性样本管呈橙色，在紫外灯下，阳性样本管显示强荧光，阴性样本管则不显示荧光。

在本发明中，针对微生物检测中的特殊性，对不同的靶片段进行反应体系，如引物、dNTPs、Mg2+浓度、甜菜碱、钙黄绿素及MnCl2浓度的优化，通过优化方案，反复实验，建立了本检测方法，其灵敏度可在每个反应体系中检出10拷贝，可以满足快速检测病源微生物的要求，并且通过荧光显色判断的结果与琼脂糖电泳的结果完全一致。

本发明与现有技术相比具有以下优点和效果：

1、与传统培养法相比，检测速度快，仅5h，加上样品DNA的提取制备，总共不超过6h；

2、特异性好，灵敏度高；

3、步骤简单，可重复性高；

4、可同时进行多个样品检测。

在本发明可对微生物进行定性检测，并可替代一直沿用的传统的培养法和血清学检测方法。

附图说明

图1为沙门氏菌紫外灯下观察结果图，图中：

1-标准阳性模板，    2-阴性对照，        3-沙门氏菌阳性样本，

4-沙门氏菌阳性样本，5-沙门氏菌阳性样本，6-沙门氏菌阴性样本，

7-沙门氏菌阴性样本，8-沙门氏菌阴性样本；

图2为沙门氏菌1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果图，图中：

1-DNA Marker，      2-标准阳性模板，    3-阴性对照，

4-沙门氏菌阳性样本，5-沙门氏菌阳性样本，6-沙门氏菌阳性样本，

7-沙门氏菌阴性样本，8-沙门氏菌阴性样本，9-沙门氏菌阴性样本；

图3为志贺氏菌紫外灯下观察结果图，图中：

1-标准阳性模板，    2-阴性对照，        3-志贺氏菌阳性样本，

4-志贺氏菌阳性样本，5-志贺氏菌阳性样本，6-志贺氏菌阴性样本，

7-志贺氏菌阴性样本，8-志贺氏菌阴性样本；

图4为志贺氏菌1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果图，图中：

1-DNA Marker，      2-标准阳性模板，    3-阴性对照，

4-志贺氏菌阳性样本，5-志贺氏菌阳性样本，6-志贺氏菌阳性样本，

7-志贺氏菌阴性样本，8-志贺氏菌阴性样本，9-志贺氏菌阴性样本；

图5为紫外灯下灵敏度实验观察图，图中：

1-稀释10^-1倍，2-稀释10^-2倍，3-稀释10^-3倍，

4-稀释10^-4倍，5-稀释10^-5倍，6-稀释10^-6倍，

7-稀释10^-7倍，8-稀释10^-8倍，9-稀释10^-9倍，

10-稀释10^-10倍；

图6为1.5％琼脂糖凝胶电泳检测灵敏度实验结果图，图中：

1-DNA Marker， 2-稀释10^-1倍，3-稀释10^-2倍，

4-稀释10^-3倍， 5-稀释10^-4倍，6-稀释10^-5倍，

7-稀释10^-6倍， 8-稀释10^-7倍，9-稀释10^-8倍，

10-稀释10^-9倍，11-稀释10^-10倍。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

应当理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。

下列实施例中未注明具体实验条件和方法，通常按照常规条件如：J.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，1992，分子克隆实验指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科学出版社，2001，细胞实验指南；吕鸿声，科学出版社，1982，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：反应体系组成

a)LAMP反应液

LAMP反应液由LAMP 10×buffer 2.5μl，20μmol/L内引物FIP、BIP各2.0μl，20μmol/L外引物F3、B3各1.0μl，25mmol/L dNTPs 3.0μl，50mmol/L MgSO43.0μl，1.0mol/L甜菜碱5μl，Bst DNA聚合酶大片段1.0μl，无菌双蒸水2.0μl组成，反应液总体积22.5μl。

b)荧光显色剂

荧光显色剂是由10μmol/L-20mmol/L的钙黄绿素1μl和60μmol/L-0.1mol/LMnCl₂ 0.5μl组成。

实施例2：利用本检测方法检测食品中沙门氏菌

a、食物样品预处理

取3种被沙门氏菌污染的食物样品和3种无污染食物样本分别称取25g(mL)放入6个盛有225mL BPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225mL BPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min；若样品为液态，不需要均质，振荡混匀即可；无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养4h；如为冷冻产品，应在45℃以下不超过15min解冻。

b、细菌模板DNA的制备

分别取100μL细菌培养物，12000r/min离心2min，去上清，加入50μL无菌水，充分混匀，100℃水浴10min，12000r/min离心2min，上清即为模板DNA。

c、等温扩增

取1μl步骤b中样本上清分别加入到22.5μl含有沙门氏菌内外引物的LAMP反应液中，再加入1.5μl荧光显色剂，65℃恒温扩增60min；同时用标准阳性模板pMD18-T-invA质粒和无菌双蒸水分别做阳性对照和阴性对照。

d、结果判定

在紫外灯下观察，阳性样本管显示强荧光，阴性样本管则不显示荧光，取5μlLAMP产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，阳性样本都有条带，阴性样本则无条带(见图1、图2)。图1为沙门氏菌紫外灯下观察结果，图2为沙门氏菌1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果。

e、结论

重复试验3次，所得检测结果相同，并且通过荧光显色判断的结果与琼脂糖电泳的结果完全一致。说明其不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性，而且依据荧光显色法判断结果的方法可靠。

①沙门氏菌外引物序列

Sal F3：5′-CGGCCCGATTTTCTCTGG-3′；

Sal B3：5′-CGGCAATAGCGTCACCTT-3′；

②沙门氏菌内引物序列

Sal FIP：5′-ATCCGCATCAATAATACCGGCCTTTGGTATGCCCGGTAAACAGA-3′；

Sal BIP：5′-GAACGGCGAAGCGTACTGGACATCGCACCGTCAAAGGAA-3′；

③标准阳性模板pMD18-T-invA质粒包含沙门氏菌invA基因

5′-CCAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGCGTCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGGTATGCCCGGTAAACAGATGAGTATTGATGCCGATTTGAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGCTGCGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTTTACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGCTATTGCCGGCATCATTATTATCTTTGTGAACTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGGATGACCCGCCATGGTAT-3′。

实施例3：利用本检测方法检测食品中志贺氏菌

a、食物样品预处理

取3种被志贺氏菌污染的食物样品和3种无污染食物样本分别称取25g(mL)样品放入6个盛有225mL BPW的无菌均质杯中，以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或置于盛有225mL BPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min；若样品为液态，不需要均质，振荡混匀即可；无菌操作将样品转至500mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36℃±1℃培养4h；如为冷冻产品，应在45℃以下不超过15min解冻。

b、细菌模板DNA的制备

分别取100μL细菌培养物，12000r/min离心2min，去上清，加入50μL无菌水，充分混匀，100℃水浴10min，12000r/min离心2min，上清即为模板DNA。

c、等温扩增

取1μl步骤b中样本上清分别加入到22.5μl含有志贺氏菌内外引物的LAMP反应液中，再加入1.5μl荧光显色剂，65℃恒温扩增60min；同时用标准阳性模板pMD18-T-ipaH质粒和无菌双蒸水分别做阳性对照和阴性对照。

d、结果判定

在紫外灯下观察，阳性样本管显示强荧光，阴性样本管则不显示荧光；取5μlLAMP产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，阳性样本都有条带，阴性样本则无条带(见图3、图4)。图3为志贺氏菌紫外灯下观察结果，图4为志贺氏菌1.5％琼脂糖凝胶电泳检测结果。

e、结论

重复试验3次，所得检测结果相同，并且通过荧光显色判断的结果与琼脂糖电泳的结果完全一致；说明其不同批次之间的检测结果具有可比性，具有良好的重复性，而且依据荧光显色法判断结果的方法可靠。

①志贺氏菌外引物序列

Shi F3：5′-TCTGGAGGACATTGCCCG-3′；

Shi B3：5′-GCTTCTGACCATGGCTTCG-3′；

②志贺氏菌内引物序列

Shi FIP：5′-GCATGGTCTGGAAGGCCAGGAAGTCAGAACTCTCCATTTTGTGG-3′；

Shi BIP：5′-TCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCCCGGAGGTCATTTGCTGTCAC-3′；

③标准阳性模板pMD18-T-ipaH质粒包含志贺氏菌ipaH基因：

5′-CCTGGGCAGGGAAATGTTCCGCCTCGAAATTCTGGAGGACATTGCCCGGGATAAAGTCAGAACTCTCCATTTTGTGGATGAGATAGAAGTCTACCTGGCCTTCCAGACCATGCTCGCAGAGAAACTTCAGCTCTCCACTGCCGTGAAGGAAATGCGTTTCTATGGCGTGTCGGGAGTGACAGCAAATGACCTCCGCACTGCCGAAGCCATGGTCAGAAGCCGTGAAGAGAATGA-3′。

实施例4：本检测方法的灵敏度实验

a、取1ml过夜培养的沙门氏菌培养液做10倍倍比稀释，稀释至10-9；取每个稀释度的菌液10μl，12000r/min离心2min，去上清，加入50μL无菌水，充分混匀，100℃水浴10min，12000r/min离心2min，上清即为模板DNA。

b、等温扩展：取1μl步骤a中样本上清加入到22.5μl含有沙门氏菌内外引物的LAMP反应液中，再加入1.5μl荧光显色剂，65℃恒温扩增60min；同时用标准阳性模板pMD18-T-invA质粒和无菌双蒸水分别做阳性对照和阴性对照；

c、结果判定：在紫外灯下观察，稀释倍数为10^-1-10^-8号的样本管显示强荧光，稀释倍数为10^-9-10^-10号的样本管则不显示荧光(见图5)；取5μl LAMP产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，稀释倍数为10-1-10-8号的样本管都有条带，稀释倍数为10-9-10-10号的样本管则无条带(见图6)。图5为紫外灯下灵敏度实验观察图，图6为1.5％琼脂糖凝胶电泳检测灵敏度实验结果图。

d、结论：结果显示当菌液稀释至10～8时仍能检测出，最低检测极限为50CFU/ml。

上述实验说明本发明具有良好的灵敏度。

总之，本检测方法特异性好，灵敏度高，重复性好，操作简便，结果肉眼可辨，而且对样品的检测仅需不到6个小时就能完成，而传统的培养法约需1周左右才能完成，因此，使用本检测方法可以大大缩短检测时间。

本检测方法的操作只需1人即可完成整个操作过程，一次可检测多个(由实际检测需要决定)样品，这样也减少了人力资源的浪费。

Claims (3)

1.一种基于LAMP的微生物目视化荧光显色基因检测方法，其特征在于包括下列步骤：

①用缓冲蛋白胨水(BPW)按照国标法培养待检样品4h；

②用水煮法从待测样品中提取DNA；

③将DNA加入到LAMP反应体系中，65℃保温1h；

④通过与对照组比较，肉眼观察待测样品结果，对样品进行定性分析。

所述LAMP反应体系包括LAMP反应液和荧光显色剂；

a)LAMP反应液

LAMP反应液由LAMP 10×buffer 2.5μl，20μmol/L内引物FIP、BIP各2.0μl，20μmol/L外引物F3、B3各1.0μl，25mmol/L dNTPs 3.0μl，50mmol/L MgSO₄3.0μl，1.0mol/L甜菜碱5μl，Bst DNA聚合酶大片段1.0μl，无菌双蒸水2.0μl组成，反应液总体积22.5μl；

b)荧光显色剂

荧光显色剂是由10μmol/L-20mmol/L的钙黄绿素1μl和60μmol/L-0.1mol/LMnCl₂0.5μl组成。

2.按权利要求1所述的一种基于LAMP的微生物目视化荧光显色基因检测方法，其特征在于：

沙门氏菌外引物序列Sal F3，如SEQ NO.1所示；

沙门氏菌外引物序列Sal B3，如SEQ NO.2所示；

沙门氏菌内引物序列Sal FIP，如SEQ NO.3所示；

沙门氏菌内引物序列Sal BIP，如SEQ NO.4所示；

标准阳性模板pMD18-T-invA质粒包含沙门氏菌invA基因，如SEQ NO.5所示。

3.按权利要求1所述的一种基于LAMP的微生物目视化荧光显色基因检测方法，其特征在于：

志贺氏菌外引物序列Shi F3，如SEQ NO.6所示；

志贺氏菌外引物序列Shi B3，如SEQ NO.7所示； 

志贺氏菌内引物序列Shi FIP，如SEQ NO.8所示；

志贺氏菌内引物序列Shi BIP，如SEQ NO.9所示；

标准阳性模板pMD18-T-ipaH质粒包含志贺氏菌ipaH基因，如SEQ NO.10所示。 

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