CN106434915A - 一种单核细胞增生李斯特氏菌的lamp引物组及检测试剂盒与使用方法 - Google Patents

一种单核细胞增生李斯特氏菌的lamp引物组及检测试剂盒与使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组及检测试剂盒与使用方法。包括一对外引物、一对内引物和一对环引物。本发明根据单增李斯特氏菌的溶血素基因（hlyA）保守区序列设计环介导等温扩增引物，应用PrimerExplorer V4在线设计特异引物组，利用LAMP技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平上实现单增李斯特菌的快速检测，为单增李斯特菌检测提供了有效且快速的核酸筛查检测方法。

Description

一种单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组及检测试剂盒与 使用方法
技术领域：
本发明属于食品安全的分子生物学检测方法领域，特别涉及一种单增李斯特菌的LAMP引物组及检测试剂盒的应用。
背景技术：
单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）简称单增李斯特菌，是一种能够引起人畜共患病的食源性致病菌，属李斯特菌属。在自然界中广泛分布，主要存在于土壤、动植物体和水产品中，食用了被单增李斯特污染的食物，可导致人和动物败血症、流产、脑膜炎等，病死率高达30%～70%，是人类最重要的食源性病原菌之一。单增李斯特菌对食品企业威胁最大，它能够存活在高盐分、冷藏以及低水分活度的食品生产环境中，由于巴氏杀菌能将其杀死，所以主要存在于后巴氏杀菌过程中。它可以附着在非生物质表面，形成生物膜，因此极易污染连续生产过程中的产品。
目前，单增李斯特菌的检测方法主要依赖于传统分离鉴定、免疫学检测和PCR方法等。传统培养法耗时大约5到7天，检测周期长，不适用于现场快速检测需求；免疫学检测如ELLSA法虽然快速灵敏，但特异性低，易出现假阳性，而且成本较高；PCR法具有特异性强、灵敏度高和速度快等优点，但对仪器设备要求高，需要专门的操作人员进行后续的电泳操作和紫外观察，限制了其在基层实验室的应用。因而，急需开发一种既简单快速，又灵敏特异的检测方法以满足对食品中单增李斯特菌的实时检测要求。
环介导恒温扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）是由Notomi等建立的一种体外核酸特异性扩增技术。LAMP法是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物，利用一种链置换DNA聚合酶（Bst DNA ploymerase）在恒温条件（65℃左右）保温几十分钟，即可完成核酸扩增反应。该方法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、检测快速等优点，适用于实验条件相对薄弱的基层地区开展食源性致病菌的快速检测。
发明内容：
本发明的一个目的是在于提供一种的LAMP引物。根据单增李斯特氏菌的溶血素基因（hlyA）保守区序列设计环介导等温扩增引物，应用PrimerExplorer V4（http://primerexplorer. jp/elamp4.0.0/index.html）在线设计特异引物组，利用LAMP技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平上实现单增李斯特菌的快速检测，为单增李斯特菌检测提供了有效且快速的核酸筛查检测方法。
本发明的另一目的在于提供一种单增李斯特菌的LAMP检测试剂盒的应用方法。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组，包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
hlyA-F3:CGCAATCAGTGAAGGGAA
hlyA-B3:GTAAGTCTCCGAGGTTGC
hlyA-FIP: GCCGTATGCCACACTTGAGAAACCTACAAGACCTTCCAGA
hlyA-BIP: TTGATGCTGCCGTAAGTGGACGGCTTTGAAGGAAGAATT
hlyA-LF:GCGCTTGCAACTGCTCTT
hlyA-LB:AATCTGTCTCAGGTGATGTAGA。
一种LAMP检测试剂盒，包括以下物质：（1）DNA聚合酶；（2）2×反应缓冲液；（3）荧光染料；（4）密封液；（5）标准阳性模板；（6）阴性对照；（7）上述的LAMP引物组。
在上述的LAMP检测试剂盒中，所述LAMP引物组的浓度比例如下：外引物、内引物、环引物的摩尔比为：1-2：4-8：2-4。
在上述的LAMP检测试剂盒中，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
在上述的LAMP检测试剂盒中，所述2×反应缓冲液包含buffer缓冲液、甜菜碱和dNTPs，三者体积比为10：8：7。
在上述的LAMP检测试剂盒中，所述荧光染料为浓度是0.02mM的SYTO-9。
在上述的LAMP检测试剂盒中，所述密封液为矿物油。
在上述的LAMP检测试剂盒中，所述的标准阳性模板为单增李斯特菌标准菌株基因组DNA；所述阴性对照为灭菌超纯水。
使用上述LAMP试剂盒检测单增李斯特菌的方法，包括以下步骤：
（1）待检样品的提取：采用水煮法从待检样品中提取DNA；
（2）恒温基因扩增检测反应体系及条件：25μl反应体系含有：SAnuc-F3 0.2μM，SAnuc-B3 0.2μM，SAnuc-FIP 0.8μM，SAnuc-BIP 0.8μM，SAnuc-LF 0.4μM，SAnuc-LB 0.4μM，2×反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，SYTO-9 0.5μl，待检样品2μl，用超纯水补齐至25μl；密封液加入体积为20μl；同时设置阳性对照和阴性对照；将配置好的PCR管混匀后离心，63℃反应45～60min，并在80℃持续2min；
（3）检测结果判断：将上述反应管置于荧光PCR仪（如ABI stepone、ZYD-S1）中，根据扩增曲线判断检测结果；如出现“S”形扩增曲线，检测结果为阳性，即检测样品中含有单增李斯特菌；如无“S”形扩增曲线出现，检测结果为阴性，即检测样品不含有单增李斯特菌。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）本发明采用的LAMP引物组在常规的LAMP检测4条引物的基础上增加了2条环引物，加快了扩增速度，并提高扩增效率。
（2）本发明采用STO-9染料作为荧光指示剂，可在配制反应体系中添加，避免了反应后打开盖子添加造成的气溶胶污染风险，并减少了反应步骤。
（3）本发明结果判断简单，可通过观察扩增曲线判断检测样品阴阳性，无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。
附图说明：
图1为LAMP灵敏性实验结果示意图；其中，从左至右依次为浓度1ng/μl、100pg/μl和10pg/μl单增李斯特菌基因组DNA模板LAMP反应结果。
图2为LAMP特异性实验结果示意图；
具体实施方式：
下面结合附图和实施例对本发明做详细的说明，但不应该当作对本发明的限制。
实施例1：一种单增李斯特菌的LAMP引物的设计合成和检测试剂盒的建立
（1）LAMP引物的设计合成
根据文献报道，以单增李斯特菌hlyA基因作为靶基因，采用引物设计软件PrimerExplorer 4.0设计包括环引物在内的6条LAMP引物。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，6条引物序列如下：
SEQ NO.1：hlyA-F3:CGCAATCAGTGAAGGGAA
SEQ NO.2：hlyA-B3:GTAAGTCTCCGAGGTTGC
SEQ NO.3：hlyA-FIP: GCCGTATGCCACACTTGAGAAACCTACAAGACCTTCCAGA
SEQ NO.4：hlyA-BIP: TTGATGCTGCCGTAAGTGGACGGCTTTGAAGGAAGAATT
SEQ NO.5：hlyA-LF:GCGCTTGCAACTGCTCTT
SEQ NO.6：hlyA-LB:AATCTGTCTCAGGTGATGTAGA
（2）阪崎肠杆菌LAMP检测试剂盒除包括上述LAMP引物组外，还包括DNA聚合酶、2×反应液、荧光染料、密封液、阳性对照和阴性对照。其中反应液包含buffer缓冲液、甜菜碱和dNTPs，各成分体积比为10：8：7。
（3）检测方法：
1）待检样品的提取：采用水煮法，将样品稀释液煮沸，上清液作为扩增反应DNA模板。
2）恒温基因扩增检测反应体系及条件：25μl反应体系含有：hlyA-F3 0.2μM，hlyA-B3 0.2μM，hlyA-FIP 0.8μM，hlyA-BIP 0.8μM，hlyA-LF 0.4μM，hlyA-LB 0.4μM，2×反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，SYTO-9 0.5μl，待检样品2μl，用超纯水补齐至25μl。密封液加入体积为20μl。同时设置阳性对照和阴性对照。
将配置好的PCR管混匀后离心，63℃反应45～60min，并在80℃持续2min。
3）检测结果判断：将上述反应管置于荧光PCR仪（如ABI stepone、ZYD-S1）中，根据扩增曲线来判断检测结果。扩增曲线呈“S”形，检测结果为阳性，即检测样品中含有单增李斯特菌；无“S”形扩增曲线出现，检测结果为阴性，即检测样品不含有单增李斯特菌。
实施例2： LAMP灵敏度实验
将单增李斯特氏菌标准菌株接种于营养肉汤，36℃±1℃培养18小时。应用Magen细菌基因DNA提取试剂盒提取培养产物中的细菌DNA。将单增李斯特氏菌标准菌株抽提的DNA进行10倍梯度稀释，分别以1ng/μl、100pg/μl、10pg/μl、1pg/μl、100fg/μl五个梯度浓度DNA作为模板和阴性对照（灭菌超纯水）按照实施例1的反应体系和条件建立检测方法，以确定试剂盒检测方法的灵敏性。
参见图1，结果表明：将单增李斯特氏菌基因组DNA进行10倍梯度稀释后，建立的单增李斯特氏菌LAMP检测试剂盒可检测样品中10pg/μl的单增李斯特氏菌DNA。
实施例3: LAMP特异性实验
应用实施例1的LAMP检测试剂盒对金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、阪崎肠杆菌、福氏志贺氏菌、大肠埃希氏菌及副溶血性弧菌进行检测，检测结果如图2所示。设置单增李斯特菌DNA为阳性对照，灭菌超纯水为阴性对照。从图2中可以看出，只有单增李斯特氏菌出现阳性结果，其他菌株为阴性结果直至反应时间延长至60min。说明实施例1的LAMP反应体系只对单增李斯特氏菌有特异性。
SEQUENCE LISTING
<110> 中华人民共和国广州机场出入境检验检疫局，暨南大学，广州双螺旋基因技术有限公司
<120> 一种单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组及检测试剂盒与使用方法
<130>
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列hlyA-F3
<400> 1
cgcaatcagt gaagggaa 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列hlyA-B3
<400> 2
gtaagtctcc gaggttgc 18
<210> 3
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列hlyA-FIP
<400> 3
gccgtatgcc acacttgaga aacctacaag accttccaga 40
<210> 4
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列hlyA-BIP
<400> 4
ttgatgctgc cgtaagtgga cggctttgaa ggaagaatt 39
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列hlyA-LF
<400> 5
gcgcttgcaa ctgctctt 18
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列hlyA-LB
<400> 6
aatctgtctc aggtgatgta ga 22

Claims (9)

1.一种单核细胞增生李斯特氏菌的LAMP引物组，其特征在于包括一对外引物、一对内引物和一对环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
hlyA-F3:CGCAATCAGTGAAGGGAA
hlyA-B3:GTAAGTCTCCGAGGTTGC
hlyA-FIP: GCCGTATGCCACACTTGAGAAACCTACAAGACCTTCCAGA
hlyA-BIP: TTGATGCTGCCGTAAGTGGACGGCTTTGAAGGAAGAATT
hlyA-LF:GCGCTTGCAACTGCTCTT
hlyA-LB:AATCTGTCTCAGGTGATGTAGA。
2.一种LAMP检测试剂盒，其特征在于包括以下物质：（1）DNA聚合酶；（2）2×反应缓冲液；（3）荧光染料；（4）密封液；（5）标准阳性模板；（6）阴性对照；（7）权利要求1所述的LAMP引物组。
3.如权利要求1所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述LAMP引物组的浓度比例如下：外引物、内引物、环引物的摩尔比为：1-2：4-8：2-4。
4.如权利要求1所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶。
5.如权利要求1所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述2×反应缓冲液包含buffer缓冲液、甜菜碱和dNTPs，三者体积比为10：8：7。
6.如权利要求1所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述荧光染料为浓度是0.02mM的SYTO-9。
7.如权利要求1所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述密封液为矿物油。
8.如权利要求1所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述的标准阳性模板为单增李斯特菌标准菌株基因组DNA；所述阴性对照为灭菌超纯水。
9.使用权利要求2所述LAMP试剂盒检测单增李斯特菌的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）待检样品的提取：采用水煮法从待检样品中提取DNA；
（2）恒温基因扩增检测反应体系及条件：25μl反应体系含有：SAnuc-F3 0.2μM，SAnuc-B3 0.2μM，SAnuc-FIP 0.8μM，SAnuc-BIP 0.8μM，SAnuc-LF 0.4μM，SAnuc-LB 0.4μM，2×反应液12.5μl，DNA聚合酶8U，SYTO-9 0.5μl，待检样品2μl，用超纯水补齐至25μl；密封液加入体积为20μl；同时设置阳性对照和阴性对照；将配置好的PCR管混匀后离心，63℃反应45～60min，并在80℃持续2min；
（3）检测结果判断：将上述反应管置于荧光PCR仪中，根据扩增曲线判断检测结果；如出现“S”形扩增曲线，检测结果为阳性，即检测样品中含有单增李斯特菌；如无“S”形扩增曲线出现，检测结果为阴性，即检测样品不含有单增李斯特菌。
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