CN105671197A - 一种食源性致病菌单增李斯特菌的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种食源性致病菌单增李斯特菌的检测方法，以实现对单增李斯特菌进行安全、特异、快速、灵敏、简单的现场快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于现场检测，能够及时、有效的抑制单增李斯特菌病疫情的发生，完善食品安全保障体系。其使用的正向引物的序列为SEQ？ID？NO:1、反向引物的序列为SEQ？ID？NO:2，探针的序列为SEQ？ID？NO:3。

Description

一种食源性致病菌单增李斯特菌的检测方法

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种食源性致病菌单增李斯特菌的检测方法。

背景技术

单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)属细菌界(Bacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、芽孢杆菌纲(Bacilli)、芽孢杆菌目(Bacillales)、李斯特菌属(Listeria)，为革兰氏阳性短杆菌，是人畜共患病的病原菌，被世界卫生组织(WHO)称为“四大食源性致病菌”之一。其在自然界中分布广泛，如肉类、蔬菜、奶制品、水产品中都能检测得到，而且由于能形成生物被膜其适应能力极强，在食品生产加工及储存期间都能造成污染，免疫力低下者及孕妇、新生儿、老人误食这些被污染的食品后，可能会引起胃肠炎、流产、脑膜炎、败血症等，致死率高达20％～30％。自1929年丹麦首次报道单增李斯特病以后其在全世界范围内不断有爆发。在美国每年约引起2500份病例、500人死亡，其中单增李斯特菌症是导致死亡的主要病因，其致死率甚至高过沙门氏菌及肉毒杆菌。近年来，我国许多地区的食源性致病菌监测报告中也多涉及单增李斯特菌。

我国国家标准中采用微生物学方法进行鉴定、检测，通过增菌、分离培养、生化反应、溶血试验、协同溶血试验、动物试验等进行分离鉴定。这种方法对实验设备要求不高，但检验周期长，不能得到广泛应用和市场中的普及。因此，需要寻找一种简便、快速、准确的适用于单增李斯特菌现场的有效检测方法，第一时间检测到致病菌，能及时采取措施来去除和减少以降低消费者食用这些被微生物污染产品的风险，为最前线的食品安全提供坚固的保障。

发明内容

本发明提供一种食源性致病菌单增李斯特菌的检测方法，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种检测单增李斯特菌的引物对，其引物序列信息如下：

正向引物F-RPA:5′-CTTTTGACGCTGCCGTAAGTGGGAAATCTGT-3′(SEQIDNO:1)

反向引物R-RPA:5′-TTGTCTTTTAAGAAGTTTGTTGTATAGGCAATGGG-3′(SEQIDNO:2)

其中反向引物R的5′端进行生物素Biotin标记；

本发明还提供检测单增李斯特菌的探针，探针的信息如下：

P:5′-TGACAAATATCATCAAAAATTCTTCCTTCAAAGCGTAATTTACGGTGGTTC-3′(SEQIDNO:3)

探针P的5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行C3Spacer标记。

上述的引物和探针用于检测单增李斯特菌；

本发明还提供一种检测单增李斯特菌的方法，其步骤如下：

1)配制RPA反应体系：

各引物的终浓度为：正向引物和反向引物各420nmol/μL；探针P120nmol/μL；缓冲液组成及浓度为：Tris-HCl50mmol/μL、KAc100mmol/μL,DTT2mmol/μL,5％PEG20mol/μL，dNTPs200umol/μL,ATP3mmol/μL，pcr50mmol/μL，CK100ng/μL，DNA聚合酶Bsu30ng/uL、单链绑定蛋白Gp32300ng/uL、重组酶UvsX240ng/uL、辅助酶UvsY60ng/uL、核酸内切酶Nfo200ng/uL；样品DNA模板10ng，加双蒸水使未反应的混合体系体积为47.5μL；280mmol/μLMgAc2.5μL，使反应体系总体积为50μL；

2)RPA反应体系扩增：

无菌PCR管中依次加入除醋酸镁和待检测样品DNA以外的所有反应组分，振荡后离心；加入10ng模板DNA，振荡后离心；向reactionmix中加入280mmol/μLMgAc2.5μL于无菌PCR管的盖子上，盖上盖子，离心；摇晃10次，离心；37℃，孵育4min；取出反应管，摇晃10次，离心；37℃，继续孵育16min；

3)LFD检测：取2μL核酸扩增产物将产物加入到98μLBuffer中混匀，然后将LFD试纸条垂直浸入混合溶液中显色检测，通过试纸条判断扩增结果。试纸条的检测线和控制线都呈红色，说明结果阳性；只有控制线呈现红色，检测线位置无颜色，说明结果阴性；控制线未显色，结果无效。

本发明提供一种快速检测食源性致病菌单增李斯特菌的检测方法，以实现对单增李斯特菌进行安全、特异、快速、灵敏、简单的现场快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于现场检测，能够及时、有效的抑制单增李斯特菌病疫情的发生，完善食品安全保障体系。

附图说明

图1：灵敏度检测图，其中：M为1000bpmarker；泳道1：空白对照，以双蒸水替代DNA模板；泳道2-8：不同的单增李斯特菌DNA，反应体系中DNA含量分别为100fg,1pg,10pg,100pg,1ng,10ng,100ng；

图2：特异性检测结果图，其中：条带1:单增李斯特菌、条带2:副溶血性弧菌、条带3:哈维氏弧菌、条带4:霍乱弧菌、条带5:沙门氏菌、条带6:鳗弧菌、条带7:创伤弧菌、条带8:金黄色葡萄球菌、条带9:水。

具体实施方式

申请人在对单增李斯特菌的编码溶血素O的hly(hlyA)基因进行充分分析的基础上，设计了高灵敏性和特异性的引物和探针，并结合R重组酶聚合酶扩增技术(recombinasepolymeraseamplification，RPA)与横向流动试纸条(Lateralflowdipstick)技术来检测单增李斯特菌。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述

实施例1：引物和探针的设计及优化

步骤1)根据单增李斯特菌的编码溶血素O(listeriolysinO)的hly基因(hlyA)进行引物设计：

通过NCBI查找到公开的listeriolysinO编码基因hly，其保守区域的位点为hly基因的1657-3060位置，经同源性分析后，以位于1645-3069的基因为目的片段进行RPA引物设计。

设计4组引物对进行最佳引物筛选，引物组及序列如下：

第1组:

正向引物F1-RPA:5′-CCGTAAGTGGGAAATCTGTCTCAGGTGATGTAG-3′(33bp)

反向引物R1-RPA:5′-TTGTCTTTTAAGAAGTTTGTTGTATAGGCAATGGG-3′(35bp)

产物长度：220bp

第2组:

正向引物F2-RPA:5′-CTTTTGACGCTGCCGTAAGTGGGAAATCTGT-3′(31bp)

反向引物R1-RPA:5′-TTGTCTTTTAAGAAGTTTGTTGTATAGGCAATGGG-3′(35bp)

产物长度：230bp

第3组:

正向引物F3-PRA:5′-TAAATAATAGCTTGAATGTAAACTTCGGCGCA-3′(32bp)

反向引物R3-RPA:5′-TTCTACATCACCTGAGACAGATTTCCCACTT-3′(31bp)

产物长度：317bp

第4组:

正向引物F4-RPA:5′-ATTGATTATGATGACGAAATGGCTTACAGTGAA-3′(33bp)

反向引物R4-RPA:5′-GACTTCTTCTTGCATTTTCCCTTCACTGATT-3′(31bp)

产物长度：135bp

步骤2)引物筛选：采用实施例2中建立的“重组酶聚合酶等温扩增方法”，分别以设计的4组引物对进行“步骤1)”和“步骤2)”，扩增产物以2％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

预实验结果表明，相同反应条件，第2组引物的扩增效率、产物纯度优于其他3组引物，因此将第2组引物作为优选，并对反向引物R2-RPA的5′端进行生物素Biotin标记。RPA引物的序列如下：

正向引物F-RPA:5′-CTTTTGACGCTGCCGTAAGTGGGAAATCTGT-3′(31bp)

反向引物R-RPA:5′-biotin-TTGTCTTTTAAGAAGTTTGTTGTATAGGCAATGGG-3′(35bp)

步骤3)探针设计：以优选引物组对应目的条带区间为模板设计2条探针，在探针的合适位置插入四氢呋喃(tetrahydrofuran,THF)作为脱碱基位点类似物替代原序列中的碱基，并对探针的5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行C3-Spacer标记。修饰后探针序列如下：

RPA-P1:5′-FAM-TGACAAATATCATCAAAAATTCTTCCTTCAAAG[THF]CGTAATTTACGGTGGTTC-C3-Spacer-3′

RPA-P2:5′-FAM-TGTCTCAGGTGATGTAGAACTGACAAATATC[THF]TCAAAAATTCTTCCTTC-C3-Spacer-3′

步骤4)探针筛选：采用实施例2中建立的“重组酶聚合酶等温扩增方法”，分别以2条探针和优选引物对(正向引物F-RPA和反向引物R-RPA)进行“步骤1)”、“步骤2)”和“步骤3)”。

预实验结果表明，相同反应条件，探针RPA-P1效果优于探针RPA-P2，因此将探针RPA-P1作为优选。

实施例2：引物和探针效果的检测

重组酶聚合酶等温扩增方法的建立

包括如下的步骤

1)配制RPA反应体系：

各引物的终浓度为：引物F-RPA和引物R-RPA各420nmol/μL；探针P120nmol/μL；缓冲液组成及浓度为：Tris-HCl(pH7.9)50mmol/μL、KAc(醋酸钾)100mmol/μL,DTT(二硫苏糖醇)2mmol/μL,5％PEG20mol/μL，dNTPs200umol/μL,ATP3mmol/μL，pcr(磷酸肌酸激酶)50mmol/μL，CK(肌酸激酶)100ng/μL，DNA聚合酶Bsu30ng/uL、单链绑定蛋白Gp32300ng/uL、重组酶UvsX240ng/uL、辅助酶UvsY60ng/uL、核酸内切酶Nfo200ng/uL；样品DNA模板10ng，加双蒸水使未反应的混合体系(reactionmix)体积为47.5μL；280mmol/μLMgAc(醋酸镁)2.5μL，使反应体系总体积为50μL。醋酸镁能使反应迅速开始，因此需要最后加入。

2)RPA反应体系扩增：

无菌PCR管中依次加入除醋酸镁和模板DNA以外的所有反应组分，振荡后离心；加入10ng模板DNA，振荡后离心；向reactionmix中加入280mmol/μLMgAc(醋酸镁)2.5μL于无菌PCR管的盖子上，盖上盖子，离心；摇晃10次，离心；37℃，孵育4min；取出反应管，摇晃10次，离心；37℃，继续孵育16min。

3)LFD检测：取2μL核酸扩增产物将产物加入到98μLBuffer中混匀，然后将LFD试纸条垂直浸入混合溶液中显色检测，通过试纸条判断扩增结果。试纸条的检测线和控制线都呈红色，说明结果阳性；只有控制线呈现红色，检测线位置无颜色，说明结果阴性；控制线未显色，结果无效。

检测灵敏度

设置8组不同浓度的单增李斯特菌DNA模板(DNA浓度为100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、0)，进行RPA核酸扩增。

参照DNA提取试剂盒说明书提取的单增李斯特菌DNA，将所提取的DNA模板原始浓度(83.3ng/μL)按10倍梯度稀释，分别做为反应模板。按照前述加样方法进行核酸扩增，扩增产物分别用2％琼脂糖凝胶电泳(AGE)和LFD进行检测：

AGE和LFD分别进行核酸扩增产物检测，结果见图1。结果表明，单增李斯特菌基因组DNA模板10倍梯度稀释实验证明，RPA扩增产物AGE和LFD检测的最低稀释浓度分别为10^-4和10^-1，模板浓度为83.3ng/μL，AGE最低检测10ngDNA为模板得到的核酸扩增产物；而LFD可检测到10fgDNA为模板得到的核酸扩增产物。LFD检测的灵敏度比和常规AGE方法高3个数量级，上述结果表明本发明的引物组能够保证检测时的灵敏性。

检测特异性

选择副溶血性弧菌、哈维氏弧菌、霍乱弧菌、沙门氏菌、鳗弧菌、创伤弧菌、金黄色葡萄球菌作为特异性判定实验菌株，以上菌株的DNA均由宁波市出入境检验检疫局提供。按照前述加样方法，各种实验菌的DNA模板量为10ng。核酸扩增产物用LFD进行检测。

结果如图2，只有DNA模板为单增李斯特菌组的检测线和控制线都显示条带，而非单增李斯特菌组的检测线空白，只有控制线处出现了条带。结果表明，此方法可以实现对单增李斯特菌的特异性检测，不与其他相关致病菌发生交叉反应。

实施例3：RPA-LFD对人工污染样品的检测应用

3.1材料：猪肉(P)、鸡肉(C)、鱼肉(B)、牛肉(F)；蒙牛纯牛奶(M)。材料均购自超市。

3.2试剂：脑心浸液(BrainHeartInfusion,BHI)无菌液体培养基，无菌水(无核酸酶)

3.3样品处理：

3.3.1肉类

经去皮、去骨，无菌水洗净，切成微块，称取50～100mg，加入400uL预冷无菌双蒸水，用组织研磨器手动进行研磨，制成匀浆。4000rpm，离心15min，弃上层脂肪层、下层沉淀，取中间层，0.22um过膜，除菌。

3.3.2牛奶

取适量牛奶，以无菌双蒸水50倍稀释，直接裂解，0.22um过膜，除菌。

3.4样品准备

3.4.1阴性对照组

以BHI培养基10倍稀释样品无菌匀浆液，作为无菌组织液阴性对照组；

3.4.2人工污染样品

在无菌组织液培养基中，以2％接种单增李斯特菌，37℃，过夜静置培养；菌液以无菌双蒸水稀释50倍作为PCR和RPA模板。

3.5DNA提取

用组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒提取无菌样品总DNA；

3.6结果鉴定

对人工污染的样品进行普通PCR，设置三个平行，以PCR结果作为鉴定依据；并进行RPA-LFD。

人工污染样品接种单增李斯特菌，经37℃，8小时增菌培养后，用普通PCR引物进行PCR。

根据单增李斯特菌的编码溶血素O的hly(hlyA)基因进行PCR引物设计，

正向引物F-PCR:5′-CGAGCCTAACCTATCCAG-3′(19bp)

反向引物R-PCR:5′-ACCATTCCCAGCTAAAC-3′(18bp)

目的片段长度：1110bp

PCR反应体系：

表1：PCR反应体系

PCR反应体系：94℃，预变性4min，94℃变性30s，55.2℃退火30s，72℃延伸30s，经35个循环；最后72℃延伸10min。获得的PCR产物进行1％AGE，每种样品设置3个平行，并对阳性结果进行测序鉴定。

PCR和RPA-LFD对人工污染单增李斯特菌的猪肉、鸡肉、牛肉、鱼肉、牛奶样品的检测结果：

表2：PCR检测的结果表

注：+.阳性；—.阴性

上述结果表明该方法设计的RPA引物组及检测方法所获得的结果与PCR的结果一致，证明了该方法的可靠性。

综上，本发明所提供的单增李斯特菌的RPA-LFD检测方法具有如下优点：

一、高灵敏度，对单增李斯特菌的检测最低线可至10pg/μL，其检测灵敏度比传统的琼脂糖凝胶电泳检测核酸扩增产物的灵敏度高1000倍。

二、强特异性，根据单增李斯特菌编码溶血素O的hly基因中的保守区域进行设计特异性引物，检测特异性强。

三、检测时间较短，20分钟左右可获得检测结果，与常规检测方法相比具有相当大的优势。

四、仪器设备要求低，不需要温度循环器、PCR仪、电泳仪或凝胶成像系统，只需一个恒温加热器即可完成检测，甚至可以进行利用体温进行人工加热。

五、操作简便、结果呈现明显，整个检测过程不涉及复杂昂贵仪器和设备，样品前处理简单，无需进行DNA纯化，只需加无菌双蒸水进行裂解，稍具有分子生物学基础的人员即可完成整个操作；检测结果清晰明显，直接通过肉眼观察即可判别。

六、对实验人员和环境更安全，检测过程不需要进行凝胶电泳故不使用EB等有毒试剂。

综上所述，本方法具有比现有传统技术PCR检测等具有较强仪器依赖性的分子生物学检测方法，食源性致病菌单增李斯特菌的方法更高的特异性、灵敏度、实用性及便捷性，可以在实际野外现场应用，有利防止和控制单增李斯特菌疫情的发生，提前做好预防。运用本方法对食源性致病菌单增李斯特菌的现场检测，可以在及时阻止致病菌危害食品及人体健康，保障食品安全，建立更加完备的食品安全监管体系。

Claims (6)

1.一种检测单增李斯特菌的引物对，其引物序列信息如下：

正向引物，其序列为SEQIDNO:1、

反向引物，其序列为SEQIDNO:2。

2.如权利要求1所述的引物对，其特征在于，所述的反向引物R的5′端进行生物素Biotin标记。

3.一种检测单增李斯特菌的探针，其特征在于，所述的探针的序列为SEQIDNO:3。

4.如权利要求3所述的探针，其特征在于，所述的探针的5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行C3Spacer标记。

5.权利要求1所述的引物对和权利要求3所述的探针在非疾病治疗目的的检测单增李斯特菌中的应用。

6.一种检测单增李斯特菌的方法，其特征在于，所述方法包括如下的步骤：

1)配制RPA反应体系：

各引物的终浓度为：权利要求1所述的正向引物和反向引物各420nmol/μL；权利要求3所述的探针120nmol/μL；缓冲液组成及浓度为：Tris-HCl50mmol/μL、KAc100mmol/μL,DTT2mmol/μL,5％PEG20mol/μL，dNTPs200umol/μL,ATP3mmol/μL，pcr50mmol/μL，CK100ng/μL，DNA聚合酶Bsu30ng/uL、单链绑定蛋白Gp32300ng/uL、重组酶UvsX240ng/uL、辅助酶UvsY60ng/uL、核酸内切酶Nfo200ng/uL；样品DNA模板10ng，加双蒸水使未反应的混合体系体积为47.5μL；280mmol/μLMgAc2.5μL，使反应体系总体积为50μL；

2)RPA反应体系扩增：

无菌PCR管中依次加入除醋酸镁和待检测样品DNA以外的所有反应组分，振荡后离心；加入10ng模板DNA，振荡后离心；向reactionmix中加入280mmol/μLMgAc2.5μL于无菌PCR管的盖子上，盖上盖子，离心；摇晃10次，离心；37℃，孵育4min；取出反应管，摇晃10次，离心；37℃，继续孵育16min；

3)LFD检测：取2μL核酸扩增产物将产物加入到98μLBuffer中混匀，然后将LFD试纸条垂直浸入混合溶液中显色检测，通过试纸条判断扩增结果；试纸条的检测线和控制线都呈红色，说明结果阳性；只有控制线呈现红色，检测线位置无颜色，说明结果阴性；控制线未显色，结果无效。