CN1982476A

CN1982476A - 活体单核细胞增生李斯特氏菌rt－pcr检测试剂盒及检测方法

Info

Publication number: CN1982476A
Application number: CN 200610034150
Authority: CN
Inventors: 吴清平; 李善志; 张菊梅; 郭伟鹏; 杨宁
Original assignee: Guangdong Institute of Microbiology; Guangdong Huankai Microbial Sci and Tech Co Ltd
Current assignee: Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology; Guangdong Huankai Microbial Sci and Tech Co Ltd
Priority date: 2006-03-07
Filing date: 2006-03-07
Publication date: 2007-06-20
Anticipated expiration: 2026-03-07
Also published as: CN100463972C

Abstract

本发明涉及一种活体单核细胞增生李斯特氏菌RT－PCR快速检测试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。本发明以单核细胞增生李斯特氏菌溶血素基因hlyA的mRNA为靶标，通过提取样品RNA，经RT－PCR扩增反应及电泳检测，结果如出现858bp扩增条带，证明该样品存在活体单核细胞增生李斯特氏菌。本发明还相应地建立了检测试剂盒，可产业化生产，具有检测灵敏度高、周期短、速度快、可操作性强的特点。整个检测过程最长可在23h内完成，其最低检测限可达5cfu/g(ml)样品，对食源性和临床出现的活体单核细胞增生李斯特氏菌可以进行全面、系统、准确的检测与鉴定，并可推广应用到环境检测、食品卫生领域、商品检验检疫等领域。

Description

活体单核细胞增生李斯特氏菌RT-PCR检测试剂盒及检测方法

[所属技术领域]

本发明涉及一种利用分子技术检测活体单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测试剂盒及检测方法，特别涉及基于mRNA的针对溶血素基因hlyA的活性单核细胞增生李斯特氏菌RT-PCR快速检测试剂盒及检测方法，属于生物技术领域。

[背景技术]

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)(以下简称“单增李斯特氏菌”)是一种重要的人畜共患病致病菌，能引起人和动物脑膜炎、败血症及孕妇流产，死亡率极高。单增李斯特氏菌广泛存在于土壤、动物、水产品等，主要通过奶及奶制品、蔬菜、水产品、肉制品等食物传播。该菌已被列为90年代4大食品致病菌之一，成为许多国家食品卫生的必检项目。

传统的单增李斯特氏菌生化检测方法全过程至少需要4-7d，检出限低(仅为10⁴cfu/ml(g)，费时费力，不能满足食品中致病菌及时、快速、灵敏的检测需要，不利于食物中毒突发事件的处理。免疫法比较快，但单克隆抗体制备困难，易产生交叉反应，特异性差；核酸杂交法快速特异，但灵敏度低，需要10³-10⁴cfu/g才能得到杂交信号；PCR方法快速特异，且灵敏度很高，但是PCR方法得到的结果包括活菌和死菌，易产生假阳性。国内至今没有在解决假阳性方面作过研究，国外虽有少量文献以RT-PCR方法检测活体单增李斯特氏菌的报道，但是以southern杂交显示结果，检测时间长，技术复杂，价格昂贵，不易推广应用，且在样品检测实际应用方面并没有作细致的研究。因此，建立一种简便、灵敏、快速、特异同时还能区分活菌和死菌的方法很有必要。

针对以上不足，本发明以hlyA基因为靶点，设计特异引物，优化体系，并对易受单增李斯特氏菌污染的样品作了活体检测应用研究，能从根本上弥补传统检测方法的不足，其所建立的RT-PCR检测技术及试剂盒，对食品中的活体单增李斯特氏菌可以进行全面、系统、准确的检测与鉴定，且操作简单、快速，具很高的特异性和敏感度，可为快速检测与鉴定食品及临床中单增李斯特氏菌提供有效的手段，可以推广应用于环境监测、食品卫生监督、商品检验检疫等领域，并能为其它活体食源性和临床致病菌检测提供技术模式。

[发明内容]

本发明针对传统检测方法的不足，以及普通PCR检测方法出现的假阳性问题，建立了一套基于mRNA为模板的针对hlyA基因的RT-PCR快速检测活体单增李斯特氏菌的方法，并构建了相应的RT-PCR检测活体单增李斯特氏菌检测试剂盒，可为快速检测与鉴定活体食源性和临床中的活体单增李斯特氏菌提供有效的手段。

本发明提供的RT-PCR试剂盒配置方法简便，易于产业化生产，检测灵敏度高、周期短、速度快、可操作性强、其最高检测限达5cfu/sample，对食源性和临床出现的活体单增李斯特氏菌可以进行全面、系统、准确的检测与鉴定。

本发明根据单增李斯特氏菌的特异性及毒力靶基因hlyA设计引物，根据Oligo6.0和Primer5.0软件程序对引物进行设计和理论分析。引物的退火温度为55℃，RT-PCR产物长度为858bp，大小易于通过电泳观察鉴别出来。

本发明的目的可经如下方案来实现：

本发明食源性活体单增李斯特氏菌RT-PCR快速检测试剂盒包括如下试剂：MLV逆转录酶、5×RT-PCR缓冲液、RNasin、DEPC水、10×PCR反应缓冲液(含Mg²⁺)、dNTP、引物、DNA聚合酶(Taq酶)。具体地说，本发明的活体单增李斯特氏菌RT-PCR快速检测试剂盒由RT体系及PCR体系试剂组成，RT体系包括5×RT-PCR缓冲液、Rnasin，dNTP，MLV逆转录酶，上游引物，下游引物；PCR体系包括dNTP，10×PCR反应缓冲液，Taq酶，上游引物及下游引物。其中上游引物P1为：5’-CCT AAG ACG CCA ATC GAA AAG AAA-3＇，下游引物P2为：5’-TAG TTC TAC ATC ACC TGA GAC AGA-3＇。MLV逆转录酶浓度为100U/μL、Rnasin浓度为10U/μL、dNTP浓度为10mmol/L、Taq酶浓度为2.5U/μL。

利用上述检测试剂盒进行快速检测的方法：

1.活体单增李斯特氏菌RNA的提取

1)取1ml培养8h的单增李斯特氏菌，离心后，加溶菌酶37℃作用1h，加0.5～3mLTRNzol试剂，用移液器反复混匀几次后静置5min；

2)加入200μL氯仿，用力振摇15S，再静置2-3min；

3)4℃，12000g，离心15min，弃去上层液体；

4)加入500μL异丙醇，充分混匀，室温放置10min；

5)4℃，12000g，离心10min，再次弃去上清；

6)加入75％的乙醇，振摇，充分洗涤沉淀；

7)4℃，7500g，离心5min，小心弃去乙醇；

8)充分干燥后，将RNA沉淀悬浮于100μL适量的无RNA酶的水中。

2.RT-PCR扩增

(1)逆转录反应：每次实验取试剂盒中RT体系试剂9～13μL，具体为：5×RT-PCR缓冲液2uL，Rnasin(10U/uL)1μL，dNTP(10mmol/L)1uL，MLV逆转录酶(100U/uL)1μL，上游引物(10umol/L)2～4μL，下游引物(10umol/L)2～4μL于PCR eppendorf管中，然后加提取的RNA模板8μL，最后加水至20μL，置PCR仪进行逆转录；逆转录反应条件：95℃变性5min，42℃反应1h；

(2)PCR体系扩增：每次实验取试剂盒中PCR体系试剂5～6μL，具体为：10mmol/LdNTP 1μL，10umol/L上游引物0.5～1μL，10umol/L下游引物0.5～1μL，10×PCR反应缓冲液2.5μL，2.5U/μLTaq酶0.5μL，于PCR eppendorf管中，然后加RT反应的模板3μL，最后加水至25μL，置PCR仪进行扩增。扩增反应条件：95℃变性5min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃反应7min，4℃保存。

3.扩增产物电泳检测。

扩增产物于10g/L琼脂糖凝胶电泳检测后，在紫外凝胶成像系统分析结果。

4.结果分析

与100bp标准分子量对照，如果扩增产物出现858bp扩增条带，说明该样品中含有单增李斯特氏菌，而阴性对照则无扩增条带出现，见附图1。

[附图说明]

附图1：不同李斯特氏菌及阴性对照RT-PCR扩增结果。1、2分别为单增李斯特氏菌标准株和野生分离株，经RT-PCR扩增后出现858bp扩增条带；3、4、5分别为默氏李斯特氏菌、英诺克李斯特菌、希尔李斯特菌，经RT-PCR扩增后无扩增条带出现；M为100bp标准Marker；6、7、8、9、10分别为1、2、3、4、5的RNA提取物直接进行PCR作为阴性对照验证无DNA污染，经RT-PCR扩增后同样无出现扩增条带。

附图2：猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌RT-PCR活体快速检测结果：1为阴性对照，为不含菌的猪肉样品；2、3、4分别为三个含菌猪肉的平行样品的检出结果；M为100bp marker；6、7、8、9分别为1、2、3、4的RNA提取物直接进行PCR作为阴性对照验证无DNA污染。含菌猪肉样品经RT-PCR扩增后，出现858bp扩增条带。

附图3：牛奶中单核细胞增生李斯特氏菌RT-PCR活体快速检测结果：1为阴性对照，为不含菌的牛奶样品；2、3、4分别为三个平行阳性样品的检出结果；M为100bpmarker；6、7、8、9分别为1、2、3、4的RNA提取物直接进行PCR作为阴性对照验证无DNA污染。含菌牛奶样品经RT-PCR扩增后，出现858bp扩增条带。

[具体实施方式]

实施例1：单核细胞增生李斯特氏菌RT-PCR活体快速检测试剂盒

该检测试剂盒由RT体系试剂及PCR体系试剂组成。

RT体系试剂包括以下试剂：5×RT-PCR缓冲液40μL、10U/uL Rnasin 20μL、10mmol/LdNTP 20μL、100U/μLMLV逆转录酶20μL、10umol/L上游引物40μL、10umol/L下游引物40μL。

PCR体系试剂包括以下试剂：10mmol/L dNTP 20μL、10×PCR反应缓冲液50μL、2.5U/μLTaq酶10μL、10umol/L上游引物10μL、10umol/L下游引物10μL。

本试剂盒所用的上游引物P1为：5’-CCT AAG ACG CCA ATC GAA AAG AAA-3＇，下游引物P2为：5’-TAG TTC TAC ATC ACC TGA GAC AGA-3＇。

实施例2：猪肉中单核细胞增生李斯特氏菌RT-PCR活体快速检测方法

1.样品前处理。取25g经过传统方法检测确认的阳性食品样品猪肉，采用无菌操作剪碎放于盛有225mL TSB三角瓶中，于37℃，200r/min振荡培养12h，用加有滤纸的漏斗初步过滤除掉残余食品。

2.RNA提取

1)取1mL培养后的过滤液，离心后，加溶菌酶37℃作用1h，加1mlTRNzol试剂，用移液器反复混匀几次后静置5min；

2)加入200uL氯仿，用力振摇15S，再静置2-3min；

3)4℃，12000g，离心15min，弃去上层液体；

4)加入500uL异丙醇，充分混匀，室温放置10min；

5)4℃，12000g，离心10min，再次弃去上清；

6)加入75％的乙醇，振摇，充分洗涤沉淀；

7)4℃，7500g，离心5min，小心弃去乙醇；

8)充分干燥后，将RNA沉淀悬浮于100uL适量的无RNA酶的水中。

3.扩增反应

(1)逆转录反应

用微量进样器分别吸取检测试剂盒中RT-PCR体系试剂9μL，具体为：5×RT-PCR缓冲液2μL，10U/uL Rnasin 1μL，10mmol/L dNTP 1μL，100U/uL MLV逆转录酶1μL，10umol/L上游引物2μL，10umol/L下游引物2μL，于PCR eppendorf管中，然后加提取的RNA模板5μL，最后加水至20μL，置PCR仪进行扩增。扩增反应条件：95℃变性5min，42℃反应1h。

(2)PCR体系扩增反应

用微量进样器分别吸取检测试剂盒中PCR体系试剂5μL，具体为10mmol/L dNTP 1μL，10umol/L上游引物0.5μL，10umol/L下游引物0.5μL，10×PCR反应缓冲液2.5μL，2.5U/μLTaq酶0.5uL于PCR eppendorf管中，然后加RT反应的模板3μL，最后加水至25μL，置PCR仪进行扩增。

扩增反应条件：95℃变性5min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃反应7min，4℃保存。

4.扩增产物进行电泳及结果分析。

(1)取5ul扩增产物，制备10g/L的琼脂糖凝胶，在电泳设备中电泳。

(2)在凝胶成像仪上观察并记录实验结果。

(3)电泳结果如图2所示，含菌猪肉样品经RT-PCR扩增后出现858bp扩增条带。

对猪肉阳性样品的检测，提取RNA需时2h，逆转录1.5h，PCR扩增3h，电泳0.5h，加上样品前处理12h，整个检测过程19h内可以完成。

实施例3：牛奶中单核细胞增生李斯特氏菌RT-PCR活体快速检测方法

1.样品前处理

取25ml经传统方法检测确认的阳性食品样品牛奶，采用无菌操作置于盛有225mLTSB三角瓶中，37℃，200r/min振荡培养16h，用加有滤纸的漏斗初步过滤除掉牛奶杂质。

2.RNA提取

2)加入200μL氯仿，用力振摇15S，再静置2-3min；

3)4℃，12000g，离心15min，弃去上层液体；

4)加入500uL异丙醇，充分混匀，室温放置10min；

5)4℃，12000g，离心10min，再次弃去上清；

6)加入75％的乙醇，振摇，充分洗涤沉淀；

7)4℃，7500g，离心5min，小心弃去乙醇；

8)充分干燥后，将RNA沉淀悬浮于100μL适量的无RNA酶的水中。

3.扩增反应

(1)逆转录反应

用微量进样器分别吸取检测试剂盒RT-PCR体系试剂13μL，具体为：5×RT-PCR缓冲液2μL，10U/uL Rnasin 1μL，10mmol/L dNTP 1μL，100U/uL MLV逆转录酶1μL，10umol/L上游引物4μL，10umol/L下游引物4μL，于PCR eppendorf管中，然后加提取的RNA模板5μL，最后加水至20μL，置PCR仪进行扩增。扩增反应条件：95℃变性5min，42℃反应1h。

(2)PCR体系扩增。

用微量进样器分别吸取检测试剂盒中PCR体系试剂6μL，具体为10mmol/L dNTP 1μL，10umol/L上游引物1μL，10umol/L下游引物1μL，10×PCR反应缓冲液2.5μL，2.5U/μLTaq酶0.5μL于PCR eppendorf管中，然后加RT反应的模板3μL，最后加水至25μL，置PCR仪进行扩增。

4.扩增产物进行电泳及结果分析。

(2)在凝胶成像仪上观察并记录实验结果。

(3)电泳结果如图3所示，含菌牛奶样品经RT-PCR扩增后出现858bp扩增条带。

对牛奶阳性样品检测，提取RNA需时2h，逆转录1.5h，PCR扩增3h，电泳0.5h，加上样品前处理16h，整个检测过程23h内可以完成。

SEQ ID NO：1

CCTAAGACGC CAATCGAAAA GAAA 24

SEQ ID NO：2

TAGTTCTACA TCACCTGAGA CAGA 24

Claims

1、一种活体单核细胞增生李斯特氏菌RT-PCR快速检测试剂盒，其特征是包括5×RT-PCR缓冲液、Rnasin、dNTP、MLV逆转录酶、上游引物及下游引物、10×PCR缓冲液、Taq酶试剂。

2、权利要求1所述的活体单核细胞增生李斯特氏菌的RT-PCR检测试剂盒，包括RT体系及PCR体系试剂，RT体系试剂包括5×RT-PCR缓冲液、Rnasin，dNTP，MLV逆转录酶，上游引物，下游引物；PCR体系试剂包括dNTP，10×PCR反应缓冲液，Taq酶，上游引物及下游引物。

3、权利要求1或2所述的活体单核细胞增生李斯特氏菌RT-PCR快速检测试剂盒，其上游引物为：5′-CCT AAG ACG CCA ATC GAA AAG AAA-3′，下游引物为：5′-TAG TTC TAC ATCACC TGA GAC AGA-3′。

4、权利要求1或2所述的活体单核细胞增生李斯特氏菌RT-PCR快速检测试剂盒，其Rnasin浓度为10U/μL、dNTP浓度为10mmol/L、MLV逆转录酶浓度为100U/μL、上游引物及下游引物浓度均为10umol/L、Taq酶浓度为2.5U/μL。

5、一种利用权利要求1或2所述的活体单核细胞增生李斯特氏菌RT-PCR快速检测试剂盒进行快速检测的方法，包括以下步骤：

(1)提取RNA：①取1ml培养8h活体单核细胞增生李斯特氏菌，离心后，加溶菌酶37℃作用1h，加0.5～3mL TRNzol试剂，用移液器反复混匀几次后静置5min；②加入200uL氯仿，用力振摇15S，再静置2-3min；③4℃，12000g，离心15min，弃去上层液体；④加入500ul异丙醇，充分混匀，室温放置10min；⑤4℃，12000g，离心10min，再次弃去上清；⑥加入75％的乙醇，振摇，充分洗涤沉淀；⑦4℃，7500g，离心5min，小心弃去乙醇；充分干燥后，将RNA沉淀悬浮于100uL适量的无RNA酶的水中；

(2)RT-PCR扩增：①逆转录反应：总体积20μL，每次实验取试剂盒中RT体系试剂9～13μL，具体为：5×RT-PCR缓冲液2μL，10U/uL Rnasin 1μL，10mmol/L dNTP 1μL，100U/uL MLV逆转录酶1μL，上游引物2～4μL，下游引物2～4μL于PCR eppendorf管中，然后加提取的RNA模板8μL，最后加水至20μL，置PCR仪进行逆转录；逆转录反应条件：95℃变性5min，42℃反应1h；②PCR体系扩增反应：总体积25μL，每次实验取试剂盒中PCR体系试剂5～6μL，具体为：10mmol/L dNTP 1μL，10umol/L上游引物0.5～1μL，10umol/L下游引物0.5～1μL，10×PCR反应缓冲液2.5μL，2.5U/μL Taq酶0.5μL，于PCR eppendorf管中，然后加RT反应的模板3μL，最后加水至25μL，置PCR仪进行扩增。扩增反应条件：95℃变性5min，55℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃反应7min，4℃保存；

(3)扩增产物电泳检测：取5uL扩增产物，制备10g/L的琼脂糖凝胶，在电泳设备中电泳，然后在凝胶成像仪上观察并记录实验结果；

(4)结果分析：如果样品扩增产物出现858bp扩增条带，说明该样品存在活体单核细胞增生李斯特氏菌。