CN113265445A - 用于检测活微生物的方法和流体管道系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提出提供用于借助于待检测的微生物(1)的原位杂交(14)，特别是荧光原位杂交，和光学分析(26)来在样品(9)中检测活微生物(1)和/或区分活微生物(12)和死微生物(13)的方法(7)，其中在所述杂交(14)之前向所述样品(9)附加至少一种物质(10)，所述物质有助于在死细胞中和在活细胞中的RNA浓度的不同的变化。

Description

用于检测活微生物的方法和流体管道系统
本发明涉及用于借助于待检测的微生物的原位杂交，特别是荧光原位杂交，和光学分析来在样品中检测活微生物和/或区分活微生物和死微生物的方法，其中在所述杂交之前向所述样品附加至少一种物质，所述物质有助于在死细胞中和在活细胞中的核酸浓度，特别是RNA浓度和/或DNA浓度的不同的变化。
为了检测在单个细胞中的核酸，例如已知诸如原位杂交(ISH)以及荧光原位杂交(FISH)的方法。在这种情况下，使用短的合成核酸探针，其通过碱基配对与待检测的目标序列相结合。原位杂交和荧光原位杂交(其中对核酸探针进行了荧光标记)可以用于核酸(DNA和/或RNA分子)的特异性检测。
核酸的特异性检测例如应用于生产控制和/或质量控制中。对于许多来自不同的工业、卫生或餐饮业领域的物质、原料和产品，重要的是，可以保证微生物学安全。例如，可以在表面清洁方法中以这种方式检查清洁/消毒是否成功。
用分子生物学方法，例如PCR，可以在几个小时中检测微生物的核酸。然而，在这种情况下，查出的是活和死微生物的所有微生物的总DNA/RNA。然而，对于医疗卫生评价来说紧要的仅是能够引起感染的微生物，而不是不再能够导致疾病的已经死去的微生物。因此，对于检测方法来说重要的是，在活微生物和死微生物之间进行区分。
在这种背景下，本发明的任务是提供简单且快速的用于在样品中检测微生物的方法，其使得将活微生物与死微生物区别开成为可能，并且此外是在实验室环境之外可施行的。
根据本发明，该任务通过权利要求1的特征而得到解决。特别地，因此为了在具有开头所描述的类型的方法中解决所述及的任务，根据本发明提出，在杂交之前向待调查的样品附加至少一种物质，所述物质有助于在死细胞中和在活细胞中的核酸浓度，特别是RNA浓度和/或DNA浓度的不同的变化。
为此，本发明利用了下述事实：通过在杂交之前向样品附加至少一种有助于在死细胞中和在活细胞中的核酸浓度的不同的变化的物质，可以使得在活微生物和死微生物之间的区分成为可能。例如，可以降低在死细胞中的RNA浓度和/或DNA浓度，和/或提高在活细胞中的RNA浓度和/或DNA浓度。备选地或另外地，可以以不同速度降低在死细胞和活细胞中的RNA浓度和/或DNA浓度。备选地或另外地，可以更改检测试剂对于在死细胞或活细胞中的RNA和/或DNA的可接近性。备选地或另外地，可以将其他检测试剂作为“活”或“死”指示剂引入到细胞中，并且同样地作为信息读出。
根据本发明的一个有利的实施方案预先规定，所附加的物质包含至少一种降解RNA和/或DNA的化学物质。所述降解RNA和/或DNA的化学物质可以是酶。例如，其为DNA酶。所附加的物质也可以是RNA酶。在这种情况下有利的是，RNA酶可以侵入死细胞(其可渗透性比活细胞高得多，即常常以提高的渗透性而出众)中，并且在细胞空间中是有酶促活性的。由此可以去除死颗粒，这可以显著地改善活/死区分。所附加的物质也可以包含有助于RNA降解和/或DNA降解的化学物质。例如，该物质为乙二胺四乙酸盐(EDTA)，其也可以用作金属酶的保护物质。在一个有利的实施方案中，EDTA的浓度为0.1-2M，优选地0.1-1M，特别优选地0.5M。也可以使用其他物质，例如二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、RNA解旋酶、聚合酶、蛋白伴侣或siRNA。但是，备选地或另外地，所附加的物质也可以包含提高死细胞中的渗透性的化学物质。特别地，其为胞壁质水解酶、溶菌酶、变溶菌素、葡糖胺酶、肽酶或酰胺酶。作为肽酶(即裂解蛋白质或肽的酶)，可以使用外肽酶和/或内肽酶，取决于在待裂解的多肽链内的定位。备选地或另外地，在所附加的物质中也可以包含有助于活细胞中的RNA合成和/或DNA合成的选择性或非选择性营养介质。例如，其为蛋白胨水、CASO-肉汤、DEV乳糖-肉汤、MRS培养基、巯基乙酸盐肉汤、脑心浸液肉汤、酪蛋白蛋白胨-大豆粉蛋白胨-肉汤、GN-(革兰氏阴性)富集肉汤，例如Hajna和/或LB培养基。
此外，根据本发明的一个有利的实施方案预先规定，将所述微生物在至少附加了所述物质的情况下进行温育。特别地，在所述杂交之前进行所述微生物的温育。在这种情况下，可以如此地安排温育时间，从而使得细胞分裂还未发生。由此可以使死细胞作为假阳性信号被捕获的概率下降几个数量级，因为这些死颗粒通过在杂交之前的微生物的温育而大大减少了。
根据本发明的一个有利的实施方案预先规定，所述杂交包括固定步骤、渗透化步骤和变性步骤中的至少两个步骤。特别地，可以预先规定，所述固定通过变性物质来进行。这使得杂交缓冲液的有利组成成为可能，其中可以使用相同的工具用于固定和变性。
也可以预先规定，在所述杂交中包括固定步骤、渗透化步骤和变性步骤中的所有步骤。有利地，所述杂交在杂交缓冲液中进行。所述杂交缓冲液包含例如无毒物质，特别是氯化胍和/或尿素作为变性物质。备选地或另外地，作为变性物质，也可以使用硫氰酸胍和/或甲酰胺。但是，尿素的使用是优选的。
由此确保了，使用氯化胍和/或尿素(代替对水有害的物质或者代替有毒的甲酰胺)使得在没有实验室的情况下使用根据本发明的方法成为可能。在这种情况下，有利的是，所述试剂可以以干燥形式预先存放，和随后以生活垃圾被清除。在一个有利的实施方案中，氯化胍的浓度为0.1-2M，优选地0.1-1M，特别优选地0.5M。在这种情况下，有利的是，以超过0.25M的浓度的氯化胍可以提供随着浓度提高而增加的针对RNA酶的保护。备选地，可以使用由氯化胍和尿素组成的混合物，以5.3M尿素与0.5M氯化胍的优选的浓度。这使得经改善的针对RNA酶的保护成为可能。对于利斯特氏菌(Listeria)FISH不需要变性试剂。
根据本发明的一个有利的实施方案预先规定，在所述杂交，特别是固定步骤结束之前，向所述样品添加去污剂。在这种情况下，有利的是，通过向所述样品添加去污剂，可以使得检测探针有效地侵入细胞中成为可能。例如，所述去污剂为十二烷基硫酸钠(SDS)。对于利斯特氏菌FISH不需要变性试剂。
在一个有利的实施方案中，SDS的浓度为0.003％-0.05％。对于利斯特氏菌FISH，SDS的浓度为0.075％。通过在固定步骤结束之前添加去污剂，可实现的可以是，可以随后检测未裂解的独个微生物。特别地，不在固定开始之前添加去污剂。在固定开始之前添加去污剂(在该情况下阻止了微生物的构造的进一步变化)将会使得在单个微生物中通过杂交而产生的反应产物的检测变得困难。
备选地或另外地，可以预先规定，在所述杂交之前进行在所述样品中所包含的微生物的活/死区分。因此，可以使得检测仅仅活微生物成为可能。
根据本发明的一个有利的实施方案预先规定，所述杂交缓冲液包含至少一种变性剂和抑制RNA酶的物质。由此可以使核酸杂交体稳定化并且还保证针对RNA酶的保护。对于在利斯特氏菌FISH中的活/死区分，既不使用变性剂也不使用RNA酶抑制剂。
根据本发明的一个有利的实施方案预先规定，所述抑制RNA酶的物质选自氯化胍、硫氰酸胍、甲酰胺、二硫苏糖醇(DTT)、焦碳酸二乙酯(DEPC)、低聚乙烯基磺酸、多聚乙烯基磺酸、乙磺酸、肝素、谷胱甘肽、天然核苷和核苷酸。对于在利斯特氏菌FISH中的活/死区分，既不使用变性剂也不使用RNA酶抑制剂。
根据本发明的一个有利的实施方案预先规定，所述杂交缓冲液包含至少一种盐，优选地氯化钠。通过在杂交缓冲液中使用盐，可以提高双链核酸杂交体的复性速率和因此还提高杂交效率。另外，也可以包含其他盐，例如氯化镁和/或氯化钾。氯化镁的添加可以使得能够促进杂交体形成。在一个有利的实施方案中，氯化钠的浓度为25-1100mM，优选地750-1000mM，特别优选地800-900mM。对于利斯特氏菌FISH，使用以1250mM的浓度的氯化钠。氯化镁的优选浓度为0.01-50mM。
可以预先规定，所述杂交缓冲液包含三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐(TRIS-HCl)作为缓冲物质。在这种情况下，有利的是，所述缓冲物质将所述缓冲液的pH值稳定在5.5和8.7之间。在一个有利的实施方案中，所述缓冲物质的浓度为10-100mM。
另外，可以在所述杂交缓冲液中包含RNA寡核苷酸作为“牺牲底物”。由此可实现经改善的针对RNA酶活性的初始保护。在一个有利的实施方案中，RNA寡核苷酸的浓度为0.1-100μM。
根据本发明的一个有利的实施方案预先规定，所述光学分析包括用经杂交的核酸探针来检测，优选地定量微生物的步骤。备选地或另外地，所述光学分析可以借助于微生物的单独检测来进行。因此，可以使得基于颗粒测量的待检测的生物的绝对定量成为可能。
根据本发明的一个有利的实施方案预先规定，所述核酸探针与待检测的微生物的RNA互补。优选地，所述核酸探针可以选自线性寡核苷酸探针。例如，其为单探针(monoProbes)、双探针(dopeProbes)、四探针(tetraProbes)和多探针(multiProbes)。所述核酸探针也可以选自具有二级结构的核酸探针。例如，其为分子信标和蝎形探针。由此可实现更高的荧光强度以及更好的信噪比，这特别地对于自动化应用来说是有利的。
根据本发明的一个有利的实施方案预先规定，将所述核酸探针与可检测标记物相连接。所述可检测标记物可以是例如荧光标记物、化学发光标记物、亲和标记物和酶促活性基团。因此可实现光学检测。所述亲和标记物可以包括例如亲和结合对，生物素-链霉抗生物素蛋白或者抗原-抗体。所述酶标记物可以是例如过氧化物酶，优选地辣根过氧化物酶，或磷酸酶，优选地碱性磷酸酶。
特别有利的是，在本文中所描述的FISH方法中减少或消除所出现(如果可能)的背景荧光或非特异性荧光。由此，特别地，自动化检测方法可以更特异地或以更好的检测极限起作用。非特异性荧光可以由各种各样的情况引起。这还包括：
·所使用的猝灭剂分子的不完全的猝灭效率。特别是在高浓度的所使用的FISH探针的情况下，由此由于过量的(未与目标RNA/DNA结合的)FISH探针而出现高的非特异性背景荧光。
·FISH探针可以非特异性地结合至非靶序列，或者不完全地被关闭并且因此没有或不完全地被猝灭。
因此，作为对于上述背景荧光的对策并且为了显著地改善信噪比，可以使用下列方法(从下列中选择的一种或其组合)：
·荧光级联：按照/类似于
Figure BDA0002943547090000061
共振能量转移的方法，在所述方法中并入第二染料。用具有通过其不使FISH探针的染料/报道分子发荧光并因此不产生背景荧光的波长的光源照射所述样品。换言之，将第二染料(在此：具有供者荧光团的“荧光供者”)引入到所述测定法中，其通过所引入的激发波长而发出荧光，并且所发射出的光(通过向更长的波长范围中的荧光移动)则能够激发例如FISH探针/分子信标的染料(在此：具有受者荧光团的“荧光受者”)去发荧光。在这种情况下，所述供者荧光团发荧光所处的发射光谱位于检测器的检测光谱/检测波长之外或者仅以很小程度位于检测器的检测光谱/检测波长之内，并且因此不产生任何相关的背景荧光。只有当供者荧光团和受者荧光团处于足够的空间接近并且没有被猝灭剂分子猝灭时，该两步荧光的机制才起作用或者才充分地起作用。在该方法中，所使用的FISH探针可以承担荧光受者功能或荧光供者功能或者这两种功能。理想地，在此合适的是，由各自配备有供者荧光团和受者荧光团的Oligo(DNA/RNA分子)(其被带至彼此直接接近)组成的组合。为此，选择在目标生物内的毗邻的或者由于二级结构而接近地在一起的结合位点，在其上结合所述Oligo(荧光供者和荧光受者)。但是，所述受者荧光团或供者荧光团也可以为例如前荧光的染料并且通过在目标细胞内的酶而被转化为可用于检测的荧光团(例如，羧基荧光素)，或者可以在某些细胞结构(例如，RNA、DNA、蛋白质和脂质)中积聚(染料，例如SYBR绿、溴化乙锭、考马斯)，或者在目标生物内积累(例如，四甲基罗丹明甲酯)，并且因此同样地被带至处于供者荧光团或受者荧光团的足够的空间接近。在这种情况下，将供者荧光团或受者荧光团与非特异性靶标(所述靶标可以为例如RNA或DNA)带至彼此足够接近的方法可能是特别有利的，因为如此可以避免关于例如特异性FISH探针的特异性合成的成本。同时，所述方法因此能够以标准化方式用于改善其他FISH测定法，并且不依赖于其特异性目标序列。特别地，在这种情况下，使用经荧光团标记的“随机”Oligo，例如“随机六聚体”或其他随机Oligo序列是有利的，因为所有可能的(例如)寡聚六聚体序列选项的混合物(这是“随机六聚体”的意义)可以结合至核酸的所有单链序列选项。这些“随机”Oligo可以在3’-末端和/或5’-末端处用一种或多种染料进行标记。通过使用荧光供者和荧光受者的组合，此外通常还可能放弃在本文中所描述的FISH方法中使用猝灭剂，并且因此制造成本更低的FISH探针(无猝灭剂分子)并且以相同的特异性，因为所述特异性可以通过所结合的染料(例如，两个具有染料的特异性Oligo)的必要的空间接近来达到。对于使用非特异性荧光供者或荧光受者，需要注意，这些仅在与特异性试剂(特异性FISH探针)的退火步骤(“结合步骤”)之后才引入，因为否则这些可能会占据特异性FISH探针的结合位置并导致假阴性结果。如果使用前荧光性染料(其必须首先例如通过经着色的细胞的酶进行转化，或者仅在具有足够完整的细胞膜的细胞中积累)，那么由此另外能够得出关于待标记的目标生物的生存力的推论。
·在退火步骤后的猝灭探针：假结合的或不充分地关闭的FISH探针(“分子信标”)可以再次地或者以更好的效率被猝灭。为此，在FISH探针的退火步骤之后，引入与所使用的FISH探针互补的其他Oligo。这些Oligo(在此：“猝灭剂-Oligo”)在其末端处携带一个或多个猝灭剂分子，并且与FISH探针相结合。在这种情况下，所述互补序列比FISH探针的形成发夹的颈序列长，并且因此在它们与FISH探针退火(“结合”)后导致稳定的经线性化的(两链的)结构。在这种结构中，FISH探针的荧光团现在处于被“猝灭剂-Oligo”的猝灭剂猝灭，并且仅产生低的背景荧光。
·在测量之前游离的FISH探针的固定化：可以从样品批料中去除过量的FISH探针。为此，在测量之前和在FISH探针与待检测的目标分子的退火步骤之后，将样品混合物引导经过表面，其结合过量的(未与目标序列相结合的)FISH探针并且在样品测量之前从批料中去除。备选地，也可以向所述样品添加物体(例如，珠粒)，在其上结合过量的FISH探针。随后，将这些物体连同过量的FISH探针一起从反应批料中离析出来。在此，在这两种情况下，所述表面和物体均是经官能化的。在这种情况下，它们用与FISH探针互补的Oligo(例如，DNA片段或RNA片段)或者用其他助剂(例如，针对FISH探针的荧光团或猝灭剂的抗体)进行包覆/官能化。典型地，为此可以使用经生物素化的互补Oligo，其与包覆有链霉抗生物素蛋白的表面相结合。同样地，也可能的是，从一开始就已经将所使用的FISH探针与可能的结合助剂(例如，生物素或链霉抗生物素蛋白)相偶联，并且用互补的结合剂来使为了固定化而使用的表面/物体官能化(例如，偶联有生物素的FISH探针和包覆有链霉抗生物素蛋白的表面)。将所述样品冲洗经过经如此地官能化的表面/物体(几次)，并且随后再次取出。在这种情况下，很大一部分的以前未结合的FISH探针被固定化在该表面/物体上，并且因此从所述方法中去除由过量的FISH探针而出现的背景荧光。
·在测量之前过量的FISH探针的荧光破坏：可以使过量的(未与目标RNA/DNA相结合的)FISH探针的荧光团在物理、化学或生物学方面如此地进行改变，从而使得它们不具有对于测量来说相关的荧光。这可以例如通过添加试剂(例如，酶)(例如，P450单加氧酶)来实现，所述试剂例如修饰荧光团的芳族结构(例如，羟基化)并且因此改变或阻止相关的荧光特性。在这种情况下，仅在FISH探针的退火步骤之后添加此类试剂。在这种情况下，如此地选择该方法，从而使得不牵涉在目标生物内所结合的FISH探针的荧光团，因为它们例如受到目标生物的细胞膜的保护，并且因此抑制荧光的试剂不能到达他们附近或与他们相互作用。
·通过以大于1mM的浓度使用“游离”猝灭剂分子来减少发荧光的背景。该高浓度的游离猝灭剂分子引起在经标记的微生物外部的游离/过量的Oligo探针(例如，线性探针、分子信标、蝎形探针等)的荧光的优先的熄灭或降低。游离的猝灭剂分子对于在细胞内所结合的荧光探针的熄灭因下述事实而减少：游离的猝灭剂分子向细胞中的扩散以及在细胞内的分布通过细胞成分而变得困难或被阻止。猝灭剂分子的选择取决于待猝灭的染料。例如，甲基红的异构体(对甲基红，间甲基红，邻甲基红；4-或3-或2-{[4-(二甲氨基)苯基]二氮烯基}-苯甲酸)适合于染料FAM、Alexa488、Atto488等。
·目标生物的固定化：在测量系统(例如，“芯片上实验室(Lab ona Chip)系统)”的一个特别有利的布置中可以将目标生物挡住和/或集中在结构例如过滤器和特别是径迹蚀刻膜上。因此，可能的是，将目标生物从剩余的样品批料中离析出来，并且另外用冲洗物质使目标生物摆脱过量的FISH探针，而经标记的目标生物被挡住。在这种情况下，在本文中所描述的FISH方法也可以如此地进行布置，从而通过顺次添加所有所需要的试剂，直接在过滤器结构(例如，径迹蚀刻膜)上进行所描述的反应步骤。由此也可以在其物料量方面减少所使用的试剂，并且因此节省了制造成本。为此，必需在过滤器结构上单独地冲洗试剂(例如，通过气动和/或离心运送)。特别有利的是这样的布局形式，在其中目标生物可以首先被冲积到过滤器结构上并且随后再次被洗脱(在微流体系统内)，例如通过用液体逆着冲积方向/从背向目标生物的过滤器侧进行洗脱/冲洗掉。在这种情况下，应当在其特性(例如，固有荧光)方面如此地对过滤器结构进行布局，从而在过滤器结构上也可以进行测量结果的直接读出。
·在流体系统内进行计量：在本文中所描述的FISH方法允许对所引入的样品体积的宽的偏差进行补偿/缓冲。为此，必需以高过量添加确定的试剂和特别是FISH探针，以便在出乎意料地高的样品体积的情况下也具有足够高的浓度的FISH探针。然而，高过量的FISH探针也以高的背景荧光为特征。因此，目标应当是能够以最小且经精确地协调的FISH探针浓度来进行工作。为此，首先在流体平台上进行计量步骤，该计量步骤无损失地和经由例如离心力来标准化(“计量”)起始样品体积。通过现在已知的起始体积，可以在其浓度方面精确地调整FISH探针和其余的试剂并且在其性能最佳范围内使用它们。为此，首先例如经由离心力来引入待调查的样品，并且随后用过量的缓冲液体进行补满直至溢流管道。不需要的缓冲液体通过溢流管道被引开。在这种情况下，如此地选择溢流管道的位置，从而知晓直至该“计量室”溢流时的液体体积。在这种情况下，通过所述“计量室”的设计确保了，不丢失任何样本材料。
在本文中所描述的FISH方法允许根据其rRNA浓度来对待调查的生物的生存力做出陈述。目的是实现快速地和非常特异性地在“活”和“死”微生物之间进行区别。在本文中所描述的FISH方法通常基于死微生物的rRNA的分解或者活微生物的rRNA的合成，以区别微生物的生存力。然而，活生物和死生物的不同的膜渗透性同样地可以用于更快地相互区别活生物和死生物。在这种情况下，假设死细胞具有明显升高的细胞膜渗透性。用下列选项，降低关于“活”微生物的检测阈值是可能的，因为死微生物不再(足够地)被标记并且活微生物(因其信号增强或者在活微生物和死微生物之间的差异的提高)不必须合成另外的用于区别活/死的核酸(例如，rRNA)。因此，所述方法可以显著地被加快：
·靶标耗竭：可以在真正的方法之前在死微生物中降解目标核酸(例如，rRNA)。因此，可能的是，降低关于“活”微生物的检测阈值，并且等待很少的其rRNA合成(时间)，因为死微生物由于其缺乏目标序列而不再能够或几乎不能够通过所述方法进行标记。为此，可以添加单独的核糖核酸酶(例如，核糖核酸酶A)或者核糖核酸酶(例如，核糖核酸酶H)与核酸(例如，DNA-Oligo)的组合。在第一种情况下，核糖核酸酶A降解对于其来说可接近的总RNA。在第二种情况下，所引入的核酸与待降解的核酸(例如，rRNA)特异性地结合，并且核糖核酸酶H识别由所引入的DNA和目标rRNA所组成的异源双链体。现在，该异源双链体被核糖核酸酶H特异性地分解。在这种情况下，核糖核酸酶和核酸不可能穿透活微生物的膜-因此，只有具有足够地可渗透的细胞膜的死生物的核酸才被降解。为此，还可以在例如DNA-Oligo上合成其他结构(“锚结构”)，这进一步地使得穿透完整细胞膜变得困难。通常，在采取该行动时应当注意，在添加FISH探针之前，将所引入的核糖核酸酶灭活、抑制或从样品批料中去除(例如，通过在过滤器/径迹蚀刻膜上的冲洗步骤)。另外，该方法还可以与例如基于
Figure BDA0002943547090000111
共振能量转移或者使得能够读出在微生物中的多个标记的检测方法相组合。因此，例如，蛋白质或DNA可以用作荧光供者(或荧光受者)或者用作用于标记的第二目标结构，并且在真正的方法开始之前在死细胞中被降解(例如，通过蛋白酶或脱氧核糖核酸酶，其无法穿透活生物的完整膜)。因此，通过所述方法仅探测活微生物，因为死细胞不具有荧光供者(或荧光受者)并因此不具有例如在相关的发射范围内的荧光，或者只具有FISH探针的荧光，但不具有活/死指示剂(例如，不再存在的DNA或蛋白质)的荧光，并因此只是经简单标记的。
·靶标阻断：活微生物和死微生物的不同的膜渗透性可以用于将核酸(例如，DNA-Oligo)引入到死微生物中，并因此占据其与调查相关的结合位点(例如，在其rRNA中)。随后，例如FISH探针不再能够与这些位置结合，因为这些位点已被占据。需要注意，在引入FISH探针之前或在使活微生物渗透化之前，将所引入的用于占据相关结合位点的Oligo从样品批料中去除。这可以例如通过经过过滤器(例如，径迹蚀刻膜)的样品批料的冲洗来进行。
使用活/死染色：可能的是，在本文中所使用的FISH方法用相关微生物的另外的活/死区别来进行。为此，可以将目标生物固定在过滤器(例如，径迹蚀刻膜)上，并且用活/死染料(例如，碘化丙锭)进行处理。将所述膜通过传感器进行测绘，并且对于各个微生物记录“活”或“死”状态。随后或同时地进行所述FISH方法，并且另外在数据采集中给通过FISH探针被阳性标记的微生物配置以“活”或“死”状态。另外，也可以用在本文中所描述的FISH方法来标记微生物，并且另外给其配备活或死染料(例如，碘化丙锭)，如果所述染料具有与FISH探针的染料不同的光谱特性。随后，对于每个目标生物读出几种光谱特性(例如，在不同波长或光谱中的荧光)，并且同时记录关于例如生物类型及其生存力的信息。
根据本发明的一个有利的实施方案预先规定，所述方法用流体管道系统来施行。例如，流体管道系统可以包括圆盘形样品托架。在这种情况下，有利的是，可以使得在不同应用领域中微生物的特异性检测成为可能。例如，根据本发明的方法可以用于微生物学食品分析、卫生控制、临床和生物技术应用以及环境分析。
一个优选的应用预先规定了流体管道系统，其具有用于实施所述方法(特别是如上面所描述的和/或根据指向方法的权利要求之一的)的工具。例如，可以在用于实施根据本发明的方法的流体管道系统中制成检测区域和预备区域。特别地，可以预先规定，可以使所述流体管道系统的管道的横截面适应于所述微生物的大小。
所述流体管道系统可以例如以样品托架的形式来制成。所述样品托架可以特别地包含至少一个腔室，所述腔室具有至少一种核酸探针和至少一种物质，所述物质有助于在死细胞中和在活细胞中的核酸浓度，特别是RNA浓度和/或DNA浓度的不同的改变。备选地或另外地，可以预先规定具有用于经标记的微生物的光学计数的工具的样品托架。
所述样品托架可以作为圆盘形样品托架来制成。例如，所述样品托架可以作为平的样品托架来制成。在这种情况下，有利的是，通过所述样品托架的圆盘形状，离心力可以被利用用于流体输送。通过压力或以其他方式也可实现流体输送。备选地，所述样品托架可以具有三维的延展，例如以圆柱体形式或以比色皿状。
例如，所述圆盘形状可以以旋转对称方式来制成。这对于用离心机分离来说可以是有利的。备选地，也可形成矩形样品托架，如在芯片卡的情况下那样，或者扇形样品托架，如在披萨块的情况下那样。
现在，将借助实施例来更详细地描述本发明，但是本发明并不限于这些实施例。进一步的实施例通过单个或多个保护性权利要求的特征的相互的和/或与实施例的单个或多个特征的组合而得出。
展示了：
图1.以示意性图示的常规的基于荧光原位杂交(FISH)的方法；
图2.以示意性图示的根据本发明的FISH方法；
图3.以详细图示的根据图2的方法。
在图1至3中显示了以各种不同的实施方式的用于检测微生物的方法。
图1显示了用于特异性地检测在单个微生物(1)中的核酸的常规FISH方法，其包括下列步骤：在样品中所包含的微生物(1)的固定和渗透化(2)；洗涤(3)，以便去除为了渗透化而使用的试剂；经固定和经渗透化的微生物(1)与核酸探针一起的温育，以便导致杂交(4)；未杂交的核酸探针的去除或洗去(5)；和与核酸探针杂交的微生物(1)的随后分析(6)。
图2显示了用于特异性地检测微生物(1)的根据本发明的方法(7)，其在唯一的方法步骤(8)中综合了渗透化、固定和杂交的步骤。它不需要另外的洗涤步骤或缓冲液更换。在所述杂交之前将含微生物的样品(9)例如与酶(10)一起进行温育(11)。
图3显示了用于借助于待检测的微生物(1)的原位杂交(14)，特别是荧光原位杂交，和光学分析(26)来在样品(9)中检测活微生物(1)和/或区分活微生物(12)和死微生物(13)的根据本发明的方法(7)，其中在所述杂交(14)之前向所述样品(9)附加至少一种物质(15)，所述物质有助于在死细胞(13)中和在活细胞(12)中的核酸浓度，特别是RNA浓度和/或DNA浓度的不同的变化。
通过在所述杂交(14)之前将所述微生物(1)与酶(10)(其有助于在死细胞中和在活细胞中的RNA浓度的不同的变化)一起进行温育(11)，可以大大地减少死颗粒。例如，死微生物(13)(其可渗透性比活微生物高得多)的rRNA可以通过RNA酶(15)的作用而被酶促降解(16)，其中在活微生物(12)中未出现相同的效应(17)。死微生物(13)(其中通过作为对于大分子例如酶的扩散屏障的外膜的保护不再存在)可以通过与溶菌酶(18)一起进行温育(11)而作为颗粒被完全溶解(19)。对于具有强烈突显的外部表壳的微生物(利斯特氏菌、葡萄球菌等)，另外需要其他裂解酶例如变溶菌素、葡萄球菌溶血毒素等。由RNA和蛋白质组成的核糖体(20)可以从完全地或部分地溶解的微生物中扩散，并且随后不再能够通过光学方法而检测到。因此，可以使得区分活微生物(12)与死微生物(13)和检测仅仅活微生物成为可能。
在一个优选的应用中，为了特异性地检测活微生物，给含微生物的样品掺以杂交缓冲液(其例如由单一或所有的从下述列表中选择的成分组成：900mM NaCl，20mM Tris/HCl，0.01％SDS，5.3M尿素，1mM EDTA，0.13μM杂交探针，和pH 8.0)，并且在52℃的温度下温育15至90分钟的时间。对于利斯特氏菌FISH，在杂交缓冲液中需要1250mM NaCl和无尿素。对于具有强烈突显的外部表壳的微生物(利斯特氏菌、葡萄球菌等)，另外需要其他裂解酶例如变溶菌素、葡萄球菌溶血毒素等。在该温育时间结束后，通过流式细胞术或荧光显微术来分析完成了杂交的样品。
在所述杂交之前，在与微生物兼容的缓冲液(例如PBS缓冲液、蛋白胨水或Tris-HCl缓冲液)中，将所述样品与溶菌酶和DNA酶或RNA酶和/或蛋白酶一起以各自低于5mg/L的浓度进行温育，以便改善活/死区分。
因此，根据本发明提出提供用于借助于待检测的微生物(1)的原位杂交(14)，特别是荧光原位杂交，和光学分析(26)来在样品(9)中检测活微生物(1)和/或区分活微生物(12)和死微生物(13)的方法(7)，其中在所述杂交(14)之前向所述样品(9)附加至少一种物质(10)，所述物质有助于在死细胞中和在活细胞中的RNA浓度的不同的变化。
参考标号列表
1 待检测的微生物
2 按照常规FISH方法的固定和渗透化
3 按照常规FISH方法的洗涤
4 按照常规FISH方法的杂交
5 按照常规FISH方法的洗涤
6 分析
7 根据本发明的方法
8 渗透化、固定和杂交，优选地包括在一个方法步骤中
9 具有微生物的样品
10 酶
11 样品与酶一起进行温育
12 活微生物
13 死微生物
14 杂交
15 RNA酶
16 在死微生物中的RNA降解
17 在活微生物中没有RNA酶的效应
18 溶菌酶
19 死微生物通过与溶菌酶一起进行温育而作为颗粒被溶解
20 由RNA和蛋白质组成的核糖体
21 去污剂
22 特异性核酸探针的渗入
23 核酸探针
24 微生物的固定
25 标记物
26 光学分析
27 不待检测的其他微生物
28 具有经降解的RNA的核糖体

Claims (16)

1.用于借助于待检测的微生物(1)的原位杂交(14)，特别是荧光原位杂交，和光学分析(26)来在样品(9)中检测活微生物(1)和/或区分活微生物(12)和死微生物(13)的方法(7)，其特征在于，在所述杂交(14)之前向所述样品(9)附加至少一种物质(10)，所述物质有助于在死细胞中和在活细胞中的核酸浓度，特别是RNA浓度和/或DNA浓度的不同的变化。
2.根据权利要求1的方法(7)，其特征在于，所附加的物质(10)包含至少一种降解RNA和/或DNA的化学物质，特别是RNA酶(15)和/或DNA酶，和/或有助于RNA降解和/或DNA降解的化学物质，特别是乙二胺四乙酸盐(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、RNA解旋酶、聚合酶、蛋白伴侣、siRNA，和/或至少一种提高死细胞中的渗透性的化学物质，特别是胞壁质水解酶、溶菌酶、变溶菌素、葡糖胺酶、肽酶、酰胺酶，和/或有助于活细胞中的RNA合成的营养介质。
3.根据前述权利要求之一的方法(7)，其特征在于，将所述微生物(1)在至少附加了所述物质(10)的情况下进行温育(11)，特别是在所述杂交(14)之前，和/或其中如此地安排温育时间，从而使得细胞分裂还未发生。
4.根据前述权利要求之一的方法(7)，其特征在于，所述杂交(14)包括固定(24)步骤、渗透化步骤和变性步骤中的至少两个步骤，优选地所有步骤，优选地在杂交缓冲液中，和/或所述杂交缓冲液包含无毒物质，特别是氯化胍和/或尿素和/或硫氰酸胍和/或甲酰胺作为变性物质。
5.根据前述权利要求之一的方法(7)，其特征在于，在所述杂交(14)，特别是固定步骤结束之前，向所述样品(9)添加去污剂(21)，和/或在所述杂交(14)之前进行在所述样品(9)中所包含的微生物(1、12、13、27)的活-死区分。
6.根据前述权利要求之一的方法(7)，其特征在于，所述杂交缓冲液包含至少一种变性剂和抑制RNA酶的物质。
7.根据前述权利要求之一的方法(7)，其特征在于，所述抑制RNA酶的物质选自由下列各项组成的组：氯化胍、硫氰酸胍、甲酰胺、二硫苏糖醇(DTT)、焦碳酸二乙酯(DEPC)、低聚乙烯基磺酸、多聚乙烯基磺酸、乙磺酸、肝素、谷胱甘肽、天然核苷和核苷酸。
8.根据前述权利要求之一的方法(7)，其特征在于，所述杂交缓冲液包含至少一种盐，优选地氯化钠、氯化钾或氯化镁。
9.根据前述权利要求之一的方法(7)，其特征在于，所述光学分析(26)包括用经杂交的核酸探针(23)来检测，优选地定量和/或单独检测微生物的步骤。
10.根据前述权利要求之一的方法(7)，其特征在于，所述核酸探针(23)与待检测的微生物(1)的RNA互补。
11.根据前述权利要求之一的方法(7)，其特征在于，所述核酸探针(23)选自由下列各项组成的组：线性寡核苷酸探针，优选地单探针、双探针、四探针、多探针，和/或具有二级结构的核酸探针，优选地分子信标和蝎形探针。
12.根据前述权利要求之一的方法(7)，其特征在于，将所述核酸探针(23)与可检测标记物(25)相连接，和/或所述可检测标记物(25)选自由荧光标记物、化学发光标记物、亲和标记物和酶促活性基团组成的组。
13.根据前述权利要求之一的方法(7)，其特征在于，所述方法(7)用流体管道系统来施行。
14.根据前述权利要求之一的方法(7)，其特征在于，所述方法(7)包括用于下列操作的步骤：另外的背景降低，优选地通过使用按照/类似于
Figure FDA0002943547080000021
共振能量转移的第二染料；和/或在FISH探针的退火步骤后引入猝灭Oligo；和/或在测量之前将游离FISH探针固定化；和/或过量的FISH探针的荧光团的物理、化学或生物学改变；和/或以大于1mM的浓度使用“游离”猝灭剂分子；和/或将目标生物固定化在结构例如过滤器和特别是径迹蚀刻膜上；和/或以高过量(计量)添加确定的试剂和特别是FISH探针。
15.根据前述权利要求之一的方法(7)，其特征在于，所述方法(7)包括用于下列操作的步骤：经改善的活/死区别，优选地通过在真正的方法(7)之前降解在死微生物中的目标核酸(例如，rRNA)(靶标耗竭)；和/或将核酸(例如，DNA-Oligo)引入到死微生物中，以便用此占据与调查相关的结合位点(例如，在其rRNA中)(靶标阻断)；和/或使用活/死染色。
16.流体管道系统，特别是圆盘形样品托架，其具有用于实施根据权利要求1至13之一的方法(7)的工具，特别地包含至少一个腔室，所述腔室具有核酸探针(23)和至少一种物质(10)，所述物质有助于在死细胞(13)中和在活细胞(12)中的核酸浓度，特别是RNA浓度和/或DNA浓度的不同的变化；和/或具有用于经标记的微生物(1)的光学计数的工具。
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