JPH10304898A - ヌクレオチド配列標的アナライトの検出用集合体並びに検出及び定量方法 - Google Patents
ヌクレオチド配列標的アナライトの検出用集合体並びに検出及び定量方法Info
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- JPH10304898A JPH10304898A JP10072379A JP7237998A JPH10304898A JP H10304898 A JPH10304898 A JP H10304898A JP 10072379 A JP10072379 A JP 10072379A JP 7237998 A JP7237998 A JP 7237998A JP H10304898 A JPH10304898 A JP H10304898A
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】 試料中の塩基配列被検体の検出又は定量法の
提供。 【解決手段】 生体、環境物質等の被検体は試料を媒体
と加温して測定する。被検体は試料中に有り得るＲＮ
Ａ、ＤＮＡの特異配列又は任意の塩基配列、又はこれら
の組合せである。媒体は被検体を増幅させる増幅物質を
含有、更に媒体内を移動できる標識被検体特異的物質
（ＬＡＳＭ）を含むこともある。媒体は被検体の増幅は
支持するが、被検体の広範囲な移動はさせない。試料を
媒体に加え、任意の被検体を増幅後、ＬＡＳＭは拡散に
より媒体中の被検体又はコロニーに移動し、強く標識さ
れた局在化領域を媒体中に形成、目視又は機械検出が可
能となる。媒体中の高強度標識領域の各々は低強度標識
のハローにより囲まれる。媒体中の高強度標識部位の数
は試料中の被検体濃度に比例すると思われる。
提供。 【解決手段】 生体、環境物質等の被検体は試料を媒体
と加温して測定する。被検体は試料中に有り得るＲＮ
Ａ、ＤＮＡの特異配列又は任意の塩基配列、又はこれら
の組合せである。媒体は被検体を増幅させる増幅物質を
含有、更に媒体内を移動できる標識被検体特異的物質
（ＬＡＳＭ）を含むこともある。媒体は被検体の増幅は
支持するが、被検体の広範囲な移動はさせない。試料を
媒体に加え、任意の被検体を増幅後、ＬＡＳＭは拡散に
より媒体中の被検体又はコロニーに移動し、強く標識さ
れた局在化領域を媒体中に形成、目視又は機械検出が可
能となる。媒体中の高強度標識領域の各々は低強度標識
のハローにより囲まれる。媒体中の高強度標識部位の数
は試料中の被検体濃度に比例すると思われる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、物質試料中の標的
アナライトの有無を検出するための、および試料中に存
在することがわかった場合にそのアナライトを定量する
ための、方法と用具に関する。分析される検体は、生物
的物質、環境物質、食物、または標的アナライトを有す
るその他の物質でもよい。標的アナライトは、試験され
る物質中に存在することが疑われる特異的ヌクレオチド
配列である。疑わしい生物または標的配列の有無は、鎖
置換増幅法（ＳＤＡ）またはポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）試薬を用いて標的アナライトを増幅することによ
り測定することができる。もしＲＮＡのヌクレオチド配
列が標的アナライトであって、ＳＤＡまたはＰＣＲ試薬
が使用されるなら、増幅工程の前に逆転写によりＲＮＡ
をＤＮＡに変換することが必要であろう。あるいは、標
的アナライトＲＮＡ増幅法（例えば、Ｑβレプリカーゼ
またはＲＮＡ−Ｘ増幅）は、ある場合には転写をするこ
と無しで使用される。分析は、標的アナライトの増幅を
可能にするが増幅された標的アナライトの移動を制限す
るゲルまたは半固体媒体中で行われ、その結果増幅産物
は、媒体中で検出可能な静止した標的アナライトコロニ
ーを形成するであろう。コロニーは、検出可能なＳＤＡ
もしくはＰＣＲプライマー、または標的アナライト相補
的特異的ヌクレオチド配列の使用、または臭化エチジウ
ム、アクリジンオレンジ、ＳＹＢＲグリーンおよび関連
化合物のような検出可能な挿入(intercalating）プロー
ブの使用を含む、種々の方法により検出され計測され
る。このようなプローブは、モレキュラープローブ社
（Molecular Probes, Inc.）（ユージーン（Eugene）、
オレゴン州）から入手できる。
アナライトの有無を検出するための、および試料中に存
在することがわかった場合にそのアナライトを定量する
ための、方法と用具に関する。分析される検体は、生物
的物質、環境物質、食物、または標的アナライトを有す
るその他の物質でもよい。標的アナライトは、試験され
る物質中に存在することが疑われる特異的ヌクレオチド
配列である。疑わしい生物または標的配列の有無は、鎖
置換増幅法（ＳＤＡ）またはポリメラーゼ連鎖反応（Ｐ
ＣＲ）試薬を用いて標的アナライトを増幅することによ
り測定することができる。もしＲＮＡのヌクレオチド配
列が標的アナライトであって、ＳＤＡまたはＰＣＲ試薬
が使用されるなら、増幅工程の前に逆転写によりＲＮＡ
をＤＮＡに変換することが必要であろう。あるいは、標
的アナライトＲＮＡ増幅法（例えば、Ｑβレプリカーゼ
またはＲＮＡ−Ｘ増幅）は、ある場合には転写をするこ
と無しで使用される。分析は、標的アナライトの増幅を
可能にするが増幅された標的アナライトの移動を制限す
るゲルまたは半固体媒体中で行われ、その結果増幅産物
は、媒体中で検出可能な静止した標的アナライトコロニ
ーを形成するであろう。コロニーは、検出可能なＳＤＡ
もしくはＰＣＲプライマー、または標的アナライト相補
的特異的ヌクレオチド配列の使用、または臭化エチジウ
ム、アクリジンオレンジ、ＳＹＢＲグリーンおよび関連
化合物のような検出可能な挿入(intercalating）プロー
ブの使用を含む、種々の方法により検出され計測され
る。このようなプローブは、モレキュラープローブ社
（Molecular Probes, Inc.）（ユージーン（Eugene）、
オレゴン州）から入手できる。
【０００２】
【従来の技術】試料を無菌増殖培地上に置いて、標的細
菌アナライトの有無について分析することは、よく知ら
れている。この方法で、水、食物中、および尿、髄液、
胸水、腹水、関節液、便などの生物的試料中の、種々の
細菌を検出することができる。この試験法は、標的アナ
ライトのコロニーが目に見えるようになるまで、標的ア
ナライトが増殖培地中で複製できる能力に依存する。培
地中で増殖する異なる細菌コロニーの鑑別を助けるため
に、種々のタイプの細菌に異なる標識を施すことができ
る。この分析法が使用される場合、検出可能なコロニー
を形成するのに必要な時間は、短い場合は１日で長い場
合は数週間である。
菌アナライトの有無について分析することは、よく知ら
れている。この方法で、水、食物中、および尿、髄液、
胸水、腹水、関節液、便などの生物的試料中の、種々の
細菌を検出することができる。この試験法は、標的アナ
ライトのコロニーが目に見えるようになるまで、標的ア
ナライトが増殖培地中で複製できる能力に依存する。培
地中で増殖する異なる細菌コロニーの鑑別を助けるため
に、種々のタイプの細菌に異なる標識を施すことができ
る。この分析法が使用される場合、検出可能なコロニー
を形成するのに必要な時間は、短い場合は１日で長い場
合は数週間である。
【０００３】ジェイ・エル・バーグ（J.L.Burg）らは、
Analytical Chemistry 第２３０巻、２６３−２７２
頁、１９９５、アカデミックプレス社（Academic Press
Inc.)中で、Ｑβレプリカーゼにより増幅したＲＮＡの
リアルタイム蛍光検出法を記載している。前述の検出法
は非特異的であり、正しく機能するには多量の試料調製
が必要である。さらにバーグ（Burg）らの方法は、試料
中のＤＮＡの検出に使用することはできず、１回に２つ
以上のＲＮＡ標的を検出することができない。増幅した
ＲＮＡの定量は、操作の開始と試料容器中の検出可能な
蛍光の出現の間の時間の遅れの関数である。
Analytical Chemistry 第２３０巻、２６３−２７２
頁、１９９５、アカデミックプレス社（Academic Press
Inc.)中で、Ｑβレプリカーゼにより増幅したＲＮＡの
リアルタイム蛍光検出法を記載している。前述の検出法
は非特異的であり、正しく機能するには多量の試料調製
が必要である。さらにバーグ（Burg）らの方法は、試料
中のＤＮＡの検出に使用することはできず、１回に２つ
以上のＲＮＡ標的を検出することができない。増幅した
ＲＮＡの定量は、操作の開始と試料容器中の検出可能な
蛍光の出現の間の時間の遅れの関数である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】１回の試験で１つまた
はそれ以上の複製可能な標的ヌクレオチド配列アナライ
トの有無が検出でき、短時間でこの標的アナライトを定
量できれば、非常に好ましいであろう。無細胞系で複製
することができない生物を検出でき、ほとんどの生命体
中に存在すると考えられるＤＮＡゲノムを検出できれ
ば、同様に好ましいであろう。
はそれ以上の複製可能な標的ヌクレオチド配列アナライ
トの有無が検出でき、短時間でこの標的アナライトを定
量できれば、非常に好ましいであろう。無細胞系で複製
することができない生物を検出でき、ほとんどの生命体
中に存在すると考えられるＤＮＡゲノムを検出できれ
ば、同様に好ましいであろう。
【０００５】従って本発明の目的は、標的アナライトの
有無について検体試料を測定するために使用することが
できる方法と装置を提供することである。本発明の別の
目的は、媒体内を移動できる標的アナライト特異的標識
物質と一緒にされる媒体上に試料を置くことを特徴とす
る、方法と装置を提供することである。本発明のさらな
る目的は、標的アナライトは、ある生命体のＲＮＡまた
はＤＮＡ由来の特性ヌクレオチド配列であることを特徴
とする、方法と装置を提供することである。本発明のさ
らなる目的は、標的アナライトは、その増幅コロニーを
形成し、媒体中で形成される任意の増幅コロニーを区別
できるように標識することを特徴とする、方法と装置を
提供することである。本発明のこれらおよび他の目的お
よび利点は、以下の説明および添付の図面からより一層
明らかであろう。
有無について検体試料を測定するために使用することが
できる方法と装置を提供することである。本発明の別の
目的は、媒体内を移動できる標的アナライト特異的標識
物質と一緒にされる媒体上に試料を置くことを特徴とす
る、方法と装置を提供することである。本発明のさらな
る目的は、標的アナライトは、ある生命体のＲＮＡまた
はＤＮＡ由来の特性ヌクレオチド配列であることを特徴
とする、方法と装置を提供することである。本発明のさ
らなる目的は、標的アナライトは、その増幅コロニーを
形成し、媒体中で形成される任意の増幅コロニーを区別
できるように標識することを特徴とする、方法と装置を
提供することである。本発明のこれらおよび他の目的お
よび利点は、以下の説明および添付の図面からより一層
明らかであろう。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、以下の集合体
及び方法に関する。検体試料中の標的ヌクレオチド配列
アナライト（標的アナライト）の有無を測定するための
集合体であって、 ａ）検体試料を導入することができ、コロニーを産生す
るのに必要な程度までの標的アナライトの増幅を支持す
るが、媒体内に形成される増幅された任意の標的アナラ
イトのコロニーの移動を制限するように機能する、媒
体、 ｂ）検体試料中に存在するかも知れない任意の標的アナ
ライトのコロニーを選択的に増幅しかつ形成するように
機能する、媒体中の標的アナライト特異的増幅試薬、お
よび ｃ）媒体中に形成されるかも知れない任意の増幅された
標的アナライトのコロニーを区別できるように強調する
のに必要な程度に、媒体中を移動することができる、標
的アナライトに結合する標識されたアナライト特異的物
質（ＬＡＳＭ）、を含む、上記集合体。
及び方法に関する。検体試料中の標的ヌクレオチド配列
アナライト（標的アナライト）の有無を測定するための
集合体であって、 ａ）検体試料を導入することができ、コロニーを産生す
るのに必要な程度までの標的アナライトの増幅を支持す
るが、媒体内に形成される増幅された任意の標的アナラ
イトのコロニーの移動を制限するように機能する、媒
体、 ｂ）検体試料中に存在するかも知れない任意の標的アナ
ライトのコロニーを選択的に増幅しかつ形成するように
機能する、媒体中の標的アナライト特異的増幅試薬、お
よび ｃ）媒体中に形成されるかも知れない任意の増幅された
標的アナライトのコロニーを区別できるように強調する
のに必要な程度に、媒体中を移動することができる、標
的アナライトに結合する標識されたアナライト特異的物
質（ＬＡＳＭ）、を含む、上記集合体。
【０００７】検体試料中の２つまたはそれ以上の異なる
標的ヌクレオチド配列アナライト（標的アナライト）の
有無を測定するための集合体であって、 ａ）検体試料を導入することができ、コロニーを産生す
るのに必要な程度までの標的アナライトの増幅を支持す
るが、媒体内に形成される任意の増幅された標的アナラ
イトのコロニーの移動を制限するように機能する、媒
体、 ｂ）検体試料中に含有されるかも知れない任意の標的ア
ナライトのコロニーを選択的に増幅しかつ形成するよう
に機能する、媒体中の標的アナライト特異的増幅試薬、
および ｃ）媒体中に形成されるかも知れない任意の増幅された
標的アナライトのコロニーを区別できるように強調する
のに必要な程度に、区別できるように標識されており媒
体中を移動することができ、そのため媒体中で形成され
る１つの標的アナライトの任意のコロニーが、媒体中で
形成される別の標的アナライトの任意のコロニーから区
別される、標的アナライトに選択的に結合する標識され
たアナライト特異的物質（ＬＡＳＭ）、を含む、上記集
合体。
標的ヌクレオチド配列アナライト（標的アナライト）の
有無を測定するための集合体であって、 ａ）検体試料を導入することができ、コロニーを産生す
るのに必要な程度までの標的アナライトの増幅を支持す
るが、媒体内に形成される任意の増幅された標的アナラ
イトのコロニーの移動を制限するように機能する、媒
体、 ｂ）検体試料中に含有されるかも知れない任意の標的ア
ナライトのコロニーを選択的に増幅しかつ形成するよう
に機能する、媒体中の標的アナライト特異的増幅試薬、
および ｃ）媒体中に形成されるかも知れない任意の増幅された
標的アナライトのコロニーを区別できるように強調する
のに必要な程度に、区別できるように標識されており媒
体中を移動することができ、そのため媒体中で形成され
る１つの標的アナライトの任意のコロニーが、媒体中で
形成される別の標的アナライトの任意のコロニーから区
別される、標的アナライトに選択的に結合する標識され
たアナライト特異的物質（ＬＡＳＭ）、を含む、上記集
合体。
【０００８】検体試料中の標的ヌクレオチド配列（標的
アナライト）の有無を測定するための方法であって、 ａ）分析される検体試料を提供し、 ｂ）標的アナライト特異的増幅物質を含有する、検体試
料の導入に適した試験媒体を提供し、 ｃ）検体試料中に含有されているかも知れない標的生物
から任意の標的アナライトを放出させ、 ｄ）放出された任意の標的アナライトを媒体中で標的ア
ナライト増幅物質と反応させて、標的アナライトの本質
的に非運動性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、そし
て ｅ）媒体中で形成された任意の標的アナライトのコロニ
ー中で、増幅された標的アナライト単位と結合する標識
されたアナライト特異的物質（ＬＡＳＭ）に、放出され
た標的アナライトを反応させることにより、残りの媒体
から標的アナライトのコロニーを区別できるように強調
させる、ことを含む、上記方法。
アナライト）の有無を測定するための方法であって、 ａ）分析される検体試料を提供し、 ｂ）標的アナライト特異的増幅物質を含有する、検体試
料の導入に適した試験媒体を提供し、 ｃ）検体試料中に含有されているかも知れない標的生物
から任意の標的アナライトを放出させ、 ｄ）放出された任意の標的アナライトを媒体中で標的ア
ナライト増幅物質と反応させて、標的アナライトの本質
的に非運動性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、そし
て ｅ）媒体中で形成された任意の標的アナライトのコロニ
ー中で、増幅された標的アナライト単位と結合する標識
されたアナライト特異的物質（ＬＡＳＭ）に、放出され
た標的アナライトを反応させることにより、残りの媒体
から標的アナライトのコロニーを区別できるように強調
させる、ことを含む、上記方法。
【０００９】検体試料中の２つまたはそれ以上の標的ヌ
クレオチド配列（標的アナライト）の有無を測定するた
めの方法であって、 ａ）分析される検体試料を提供し、 ｂ）各標的アナライトに対して選択的に特異的な標的ア
ナライト増幅物質を含有する、検体試料の導入に適した
試験媒体を提供し、 ｃ）検体試料中に含有されているかも知れない標的生物
から任意の標的アナライトを放出させ、 ｄ）放出された任意の標的アナライトを媒体中で標的ア
ナライト増幅物質と反応させて、標的アナライトの本質
的に非運動性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、そし
て ｅ）媒体中で形成されたコロニー中の任意の標的アナラ
イトと選択的に結合する標識されたアナライト特異的物
質（ＬＡＳＭ）に、コロニー中の増幅された標的アナラ
イト単位を反応させることにより、残りの媒体から形成
された標的アナライトのコロニーを区別できるように強
調させ、こうして標的アナライトの１つから構成される
任意の増幅された標的アナライトのコロニーは、標的ア
ナライトの別の１つから構成される増幅された標的アナ
ライトのコロニーから区別できるように強調する、こと
を含む、上記方法。
クレオチド配列（標的アナライト）の有無を測定するた
めの方法であって、 ａ）分析される検体試料を提供し、 ｂ）各標的アナライトに対して選択的に特異的な標的ア
ナライト増幅物質を含有する、検体試料の導入に適した
試験媒体を提供し、 ｃ）検体試料中に含有されているかも知れない標的生物
から任意の標的アナライトを放出させ、 ｄ）放出された任意の標的アナライトを媒体中で標的ア
ナライト増幅物質と反応させて、標的アナライトの本質
的に非運動性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、そし
て ｅ）媒体中で形成されたコロニー中の任意の標的アナラ
イトと選択的に結合する標識されたアナライト特異的物
質（ＬＡＳＭ）に、コロニー中の増幅された標的アナラ
イト単位を反応させることにより、残りの媒体から形成
された標的アナライトのコロニーを区別できるように強
調させ、こうして標的アナライトの１つから構成される
任意の増幅された標的アナライトのコロニーは、標的ア
ナライトの別の１つから構成される増幅された標的アナ
ライトのコロニーから区別できるように強調する、こと
を含む、上記方法。
【００１０】検体試料中の標的ヌクレオチド配列（標的
アナライト）を定量するための方法であって、 ａ）一定量の分析される検体試料を提供し、 ｂ）標的アナライト特異的増幅物質を含有する、検体試
料の導入に適した試験媒体を提供し、 ｃ）一定量の検体試料中に含有されているかも知れない
標的生命体から任意の標的アナライトを放出させ、 ｄ）放出された任意の標的アナライトを媒体中で標的ア
ナライト特異的増幅物質と反応させて、標的アナライト
の本質的に非運動性の増幅コロニーを媒体中で形成さ
せ、 ｅ）媒体中で形成された標的アナライトコロニー中の標
的アナライト単位と結合する標識されたアナライト特異
的物質（ＬＡＳＭ）に、任意の増幅された標的アナライ
ト単位を反応させることにより、媒体中で区別できるよ
うに強調された標的アナライトのコロニー領域を形成さ
せ、そして ｆ）媒体中の強調された増幅された標的アナライトのコ
ロニー領域の数を計測して、単位量の試料当たりの標的
アナライトの濃度を得ることを含む、上記方法。
アナライト）を定量するための方法であって、 ａ）一定量の分析される検体試料を提供し、 ｂ）標的アナライト特異的増幅物質を含有する、検体試
料の導入に適した試験媒体を提供し、 ｃ）一定量の検体試料中に含有されているかも知れない
標的生命体から任意の標的アナライトを放出させ、 ｄ）放出された任意の標的アナライトを媒体中で標的ア
ナライト特異的増幅物質と反応させて、標的アナライト
の本質的に非運動性の増幅コロニーを媒体中で形成さ
せ、 ｅ）媒体中で形成された標的アナライトコロニー中の標
的アナライト単位と結合する標識されたアナライト特異
的物質（ＬＡＳＭ）に、任意の増幅された標的アナライ
ト単位を反応させることにより、媒体中で区別できるよ
うに強調された標的アナライトのコロニー領域を形成さ
せ、そして ｆ）媒体中の強調された増幅された標的アナライトのコ
ロニー領域の数を計測して、単位量の試料当たりの標的
アナライトの濃度を得ることを含む、上記方法。
【００１１】検体試料中の２つまたはそれ以上の標的ヌ
クレオチド配列（標的アナライト）を定量するための方
法であって、 ａ）一定量の分析される検体試料を提供し、 ｂ）標的アナライト特異的増幅物質を含有する、検体試
料の導入に適した試験媒体を提供し、 ｃ）一定量の検体試料中に含有されているかも知れない
標的生命体から任意の標的アナライトを放出させ、 ｄ）放出された任意の標的アナライトを媒体中で配列増
幅物質と反応させて、標的アナライトの本質的に非運動
性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、そして ｅ）媒体中で形成された増幅された標的アナライト単位
と選択的に結合する標識されたアナライト特異的物質
（ＬＡＳＭ）に、コロニー中の増幅された標的アナライ
ト単位を反応させることにより、増幅された標的アナラ
イトコロニーを残りの媒体から区別できるように強調さ
せ、こうして標的アナライトの１つから構成される増幅
された標的アナライトのコロニーは、標的アナライトの
別の１つから構成される増幅されたコロニーから区別で
きるように強調され、そして ｆ）媒体中の区別できるように強調された増幅された標
的アナライトのコロニー領域の各々の数を計測して、媒
体中で現れる各標的アナライトの単位量の試料当たりの
標的アナライトの濃度を得ることを含む、上記方法。
クレオチド配列（標的アナライト）を定量するための方
法であって、 ａ）一定量の分析される検体試料を提供し、 ｂ）標的アナライト特異的増幅物質を含有する、検体試
料の導入に適した試験媒体を提供し、 ｃ）一定量の検体試料中に含有されているかも知れない
標的生命体から任意の標的アナライトを放出させ、 ｄ）放出された任意の標的アナライトを媒体中で配列増
幅物質と反応させて、標的アナライトの本質的に非運動
性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、そして ｅ）媒体中で形成された増幅された標的アナライト単位
と選択的に結合する標識されたアナライト特異的物質
（ＬＡＳＭ）に、コロニー中の増幅された標的アナライ
ト単位を反応させることにより、増幅された標的アナラ
イトコロニーを残りの媒体から区別できるように強調さ
せ、こうして標的アナライトの１つから構成される増幅
された標的アナライトのコロニーは、標的アナライトの
別の１つから構成される増幅されたコロニーから区別で
きるように強調され、そして ｆ）媒体中の区別できるように強調された増幅された標
的アナライトのコロニー領域の各々の数を計測して、媒
体中で現れる各標的アナライトの単位量の試料当たりの
標的アナライトの濃度を得ることを含む、上記方法。
【００１２】検体試料中の標的ヌクレオチド配列（標的
アナライト）の有無を測定するための方法であって、 ａ）遊離の標的アナライトを含有することが疑われる、
分析される検体試料を提供し、 ｂ）標的アナライト特異的増幅物質を含有する、検体試
料の導入に適した試験媒体を提供し、 ｃ）遊離の標的アナライトを媒体中で標的アナライト特
異的増幅物質と反応させて、標的アナライトの本質的に
非運動性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、そして ｅ）媒体中で形成された標的アナライトのコロニー中の
増幅された標的アナライト単位と結合する標識されたア
ナライト特異的物質（ＬＡＳＭ）に、任意の標的アナラ
イトを反応させることにより、残りの媒体から標的アナ
ライトのコロニーを区別できるように強調させる、こと
を含む、上記方法。
アナライト）の有無を測定するための方法であって、 ａ）遊離の標的アナライトを含有することが疑われる、
分析される検体試料を提供し、 ｂ）標的アナライト特異的増幅物質を含有する、検体試
料の導入に適した試験媒体を提供し、 ｃ）遊離の標的アナライトを媒体中で標的アナライト特
異的増幅物質と反応させて、標的アナライトの本質的に
非運動性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、そして ｅ）媒体中で形成された標的アナライトのコロニー中の
増幅された標的アナライト単位と結合する標識されたア
ナライト特異的物質（ＬＡＳＭ）に、任意の標的アナラ
イトを反応させることにより、残りの媒体から標的アナ
ライトのコロニーを区別できるように強調させる、こと
を含む、上記方法。
【００１３】検体試料中の２つまたはそれ以上の標的ヌ
クレオチド配列（標的アナライト）の有無を測定するた
めの方法であって、 ａ）遊離の標的アナライトを含有することが疑われる、
分析される検体試料を提供し、 ｂ）各標的アナライトに対して選択的に特異的な標的ア
ナライト増幅物質を含有する、検体試料の導入に適した
試験媒体を提供し、 ｃ）遊離の標的アナライトを媒体中で標的アナライト増
幅物質と反応させて、標的アナライトの本質的に非運動
性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、そして ｄ）媒体中で形成されたコロニー中の任意の標的アナラ
イトと選択的に結合する標識されたアナライト特異的物
質（ＬＡＳＭ）に、コロニー中の任意の増幅された標的
アナライト単位を反応させて、残りの媒体から形成され
た標的アナライトのコロニーを区別できるように強調さ
せることにより、標的アナライトの１つから構成される
任意の増幅された標的アナライトのコロニーは、標的ア
ナライトの別の１つから構成される増幅された標的アナ
ライトのコロニーから区別できるように強調される、こ
とを含む、上記方法。
クレオチド配列（標的アナライト）の有無を測定するた
めの方法であって、 ａ）遊離の標的アナライトを含有することが疑われる、
分析される検体試料を提供し、 ｂ）各標的アナライトに対して選択的に特異的な標的ア
ナライト増幅物質を含有する、検体試料の導入に適した
試験媒体を提供し、 ｃ）遊離の標的アナライトを媒体中で標的アナライト増
幅物質と反応させて、標的アナライトの本質的に非運動
性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、そして ｄ）媒体中で形成されたコロニー中の任意の標的アナラ
イトと選択的に結合する標識されたアナライト特異的物
質（ＬＡＳＭ）に、コロニー中の任意の増幅された標的
アナライト単位を反応させて、残りの媒体から形成され
た標的アナライトのコロニーを区別できるように強調さ
せることにより、標的アナライトの１つから構成される
任意の増幅された標的アナライトのコロニーは、標的ア
ナライトの別の１つから構成される増幅された標的アナ
ライトのコロニーから区別できるように強調される、こ
とを含む、上記方法。
【００１４】検体試料中の標的ヌクレオチド配列（標的
アナライト）を定量するための方法であって、 ａ）遊離の標的アナライトを含有することが疑われる、
分析される検体試料を提供し、 ｂ）標的アナライト特異的増幅物質を含有する、検体試
料の導入に適した試験媒体を提供し、 ｃ）遊離の標的アナライトを媒体中で標的アナライト特
異的増幅物質と反応させて、標的アナライトの本質的に
非運動性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、 ｅ）媒体中で形成された任意の標的アナライトのコロニ
ー中の標的アナライト単位と結合する標識されたアナラ
イト特異的物質（ＬＡＳＭ）に、増幅された標的アナラ
イトを反応させることにより、残りの媒体から標的アナ
ライトのコロニーを区別できるように強調させ、そして ｆ）媒体中の強調された増幅された標的アナライトのコ
ロニー領域の数を計測して、単位量の試料当たりの標的
アナライトの濃度を得る、ことを含む、上記方法。
アナライト）を定量するための方法であって、 ａ）遊離の標的アナライトを含有することが疑われる、
分析される検体試料を提供し、 ｂ）標的アナライト特異的増幅物質を含有する、検体試
料の導入に適した試験媒体を提供し、 ｃ）遊離の標的アナライトを媒体中で標的アナライト特
異的増幅物質と反応させて、標的アナライトの本質的に
非運動性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、 ｅ）媒体中で形成された任意の標的アナライトのコロニ
ー中の標的アナライト単位と結合する標識されたアナラ
イト特異的物質（ＬＡＳＭ）に、増幅された標的アナラ
イトを反応させることにより、残りの媒体から標的アナ
ライトのコロニーを区別できるように強調させ、そして ｆ）媒体中の強調された増幅された標的アナライトのコ
ロニー領域の数を計測して、単位量の試料当たりの標的
アナライトの濃度を得る、ことを含む、上記方法。
【００１５】検体試料中の標的ヌクレオチド配列アナラ
イト（標的アナライト）の有無を測定するための集合体
であって、 ａ）検体試料を導入することができ、コロニーを産生す
るのに必要な程度まで標的アナライトの増幅を支持する
が、媒体内に形成される増幅された任意の標的アナライ
トのコロニーの移動を制限するように機能する、媒体、 ｂ）検体試料中に存在するかも知れない任意の標的アナ
ライトのコロニーを選択的に増幅しかつ形成するように
機能する、媒体中の標的アナライト特異的増幅試薬、お
よび ｃ）媒体中に形成されるかも知れない増幅された標的ア
ナライトのコロニーを区別できるように強調するのに必
要な程度に、媒体中を移動することができる、標的アナ
ライトに結合する検出可能な物質、を含む、上記集合
体。
イト（標的アナライト）の有無を測定するための集合体
であって、 ａ）検体試料を導入することができ、コロニーを産生す
るのに必要な程度まで標的アナライトの増幅を支持する
が、媒体内に形成される増幅された任意の標的アナライ
トのコロニーの移動を制限するように機能する、媒体、 ｂ）検体試料中に存在するかも知れない任意の標的アナ
ライトのコロニーを選択的に増幅しかつ形成するように
機能する、媒体中の標的アナライト特異的増幅試薬、お
よび ｃ）媒体中に形成されるかも知れない増幅された標的ア
ナライトのコロニーを区別できるように強調するのに必
要な程度に、媒体中を移動することができる、標的アナ
ライトに結合する検出可能な物質、を含む、上記集合
体。
【００１６】検体試料中の標的ヌクレオチド配列（標的
アナライト）の有無を測定するための方法であって、 ａ）分析される検体試料を提供し、 ｂ）標的アナライト特異的増幅物質を含有する、検体試
料の導入に適した試験媒体を提供し、 ｃ）検体試料中に含有されているかも知れない標的生物
から任意の標的アナライトを放出させ、 ｄ）放出された任意の標的アナライトを媒体中で標的ア
ナライト増幅物質と反応させて、標的アナライトの本質
的に非運動性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、そし
て ｅ）媒体中で形成された任意の標的アナライトのコロニ
ー中で、増幅された標的アナライト単位と結合する検出
可能な物質に、放出された標的アナライトを反応させる
ことにより、残りの媒体から標的アナライトのコロニー
を区別できるように強調させる、ことを含む、上記方
法。
アナライト）の有無を測定するための方法であって、 ａ）分析される検体試料を提供し、 ｂ）標的アナライト特異的増幅物質を含有する、検体試
料の導入に適した試験媒体を提供し、 ｃ）検体試料中に含有されているかも知れない標的生物
から任意の標的アナライトを放出させ、 ｄ）放出された任意の標的アナライトを媒体中で標的ア
ナライト増幅物質と反応させて、標的アナライトの本質
的に非運動性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、そし
て ｅ）媒体中で形成された任意の標的アナライトのコロニ
ー中で、増幅された標的アナライト単位と結合する検出
可能な物質に、放出された標的アナライトを反応させる
ことにより、残りの媒体から標的アナライトのコロニー
を区別できるように強調させる、ことを含む、上記方
法。
【００１７】検体試料中の標的ヌクレオチド配列（標的
アナライト）の有無を測定するための方法であって、 ａ）遊離の標的アナライトを含有することが疑われる、
分析される検体試料を提供し、 ｂ）標的アナライト特異的増幅物質を含有する、検体試
料の導入に適した試験媒体を提供し、 ｃ）遊離の標的アナライトを媒体中で標的アナライト特
異的増幅物質と反応させて、標的アナライトの本質的に
非運動性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、そして ｅ）媒体中で形成された任意の標的アナライトのコロニ
ー中の増幅された標的アナライト単位と結合する検出可
能な物質に、任意の標的アナライトを反応させることに
より、残りの媒体から標的アナライトのコロニーを区別
できるように強調させる、ことを含む、上記方法。
アナライト）の有無を測定するための方法であって、 ａ）遊離の標的アナライトを含有することが疑われる、
分析される検体試料を提供し、 ｂ）標的アナライト特異的増幅物質を含有する、検体試
料の導入に適した試験媒体を提供し、 ｃ）遊離の標的アナライトを媒体中で標的アナライト特
異的増幅物質と反応させて、標的アナライトの本質的に
非運動性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、そして ｅ）媒体中で形成された任意の標的アナライトのコロニ
ー中の増幅された標的アナライト単位と結合する検出可
能な物質に、任意の標的アナライトを反応させることに
より、残りの媒体から標的アナライトのコロニーを区別
できるように強調させる、ことを含む、上記方法。
【００１８】
【発明の実施の形態】本発明は、試料中の１つまたはそ
れ以上のヌクレオチド標的の有無を検出するための方法
と用具に関する。ヌクレオチド標的の検出は、適切な粘
性のある媒体中でＤＮＡまたはＲＮＡ配列のユニークな
部分を増幅して、増幅したヌクレオチド配列の比較的静
止しているコロニーを媒体中で形成し、次に媒体中で形
成された結果としてのヌクレオチド配列のコロニーを検
出し計測することにより行われる。従って検出される標
的アナライトは、増幅されたヌクレオチド配列または疑
われる生命体の配列である。形成された標的アナライト
のコロニーの拡散は、マーカーまたはプローブ試薬の拡
散に比較して限定されている。
れ以上のヌクレオチド標的の有無を検出するための方法
と用具に関する。ヌクレオチド標的の検出は、適切な粘
性のある媒体中でＤＮＡまたはＲＮＡ配列のユニークな
部分を増幅して、増幅したヌクレオチド配列の比較的静
止しているコロニーを媒体中で形成し、次に媒体中で形
成された結果としてのヌクレオチド配列のコロニーを検
出し計測することにより行われる。従って検出される標
的アナライトは、増幅されたヌクレオチド配列または疑
われる生命体の配列である。形成された標的アナライト
のコロニーの拡散は、マーカーまたはプローブ試薬の拡
散に比較して限定されている。
【００１９】媒体は、標的アナライト特異的プライマ
ー、ならびに鎖置換増幅法（ＳＤＡ）の使用、またはポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）や他の任意の増幅法（例
えば、単一のプライマーまたはプライマーのない３Ｓ
Ｒ）、そしてある場合にはＱβレプリカーゼＲＮＡ増幅
法の使用により、標的アナライトＤＮＡまたはＲＮＡ中
の特定のヌクレオチド配列の増幅を引き起こす適切な酵
素や試薬、を含有するか、またはこれらと組合せられ
る。ある場合には、PCR Technology: Principals andAm
plifications for DNA Amplification, エィチ・エー
・アーリッヒ（Ehrlich, H.A.)編、１９８９年、ストッ
クトンプレス（Stockton Press）、ニューヨーク州、に
記載の他の増幅法を、本発明の実施のために使用しても
よい。その結果、媒体中に特定のヌクレオチド配列の局
在化された高密度集団コロニーが作成される。試料中に
含まれ媒体に導入されそして増幅工程により複製されな
い非標的ゲノムのセグメントは、増殖せず、検出もでき
ないであろう。分析は、１つまたはそれ以上の標識され
たアナライト特異的物質（ＬＡＳＭ）も含有するかまた
はこれと組合わされる媒体中で行われる。ＬＡＳＭは、
標的アナライトを形成し増幅されている特異的ヌクレオ
チド配列の一部に相補的な合成ヌクレオチド配列を含
む。標識物は、遊離色素もしくは蛍光物質、または相補
的な合成ヌクレオチド配列に結合するものでもよい。Ｌ
ＡＳＭは、最初媒体中に均一に分散される。ＬＡＳＭ
は、媒体中で拡散の法則に従って媒体中を通過して、増
幅されたヌクレオチド配列のコロニーまで移動し、これ
らのヌクレオチド配列に結合することにより、残りの媒
体に対してコロニーを強調して区別できるようにする。
コロニーに向かうＬＡＳＭの局所的移動のために、低強
度の標識ハロー（halo）が各コロニーのまわりに形成さ
れ、各ハローの中心には、標識されたコロニーに対応す
る高強度ピークがあるであろう。媒体上に存在する増幅
されていないＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、アクリジンオ
レンジ、臭化エチジウムまたは他の染色物で染色して
も、濃度が低いため検出できないであろう。ある場合に
は、標識物は、ＰＣＲまたはＳＤＡ増幅に使用されるオ
リゴヌクレオチドプライマーの１つまたは両方に結合し
てもよい。これらの場合に、プライマーはＬＡＳＭとし
て機能するであろう。非特異的バックグランドシグナル
は増幅により大きくは増加しないため、シグナル強度の
速度論的検討を行うことにより、細胞破片により引き起
こされるような非特異的バックグランドはゼロになるで
あろう。
ー、ならびに鎖置換増幅法（ＳＤＡ）の使用、またはポ
リメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）や他の任意の増幅法（例
えば、単一のプライマーまたはプライマーのない３Ｓ
Ｒ）、そしてある場合にはＱβレプリカーゼＲＮＡ増幅
法の使用により、標的アナライトＤＮＡまたはＲＮＡ中
の特定のヌクレオチド配列の増幅を引き起こす適切な酵
素や試薬、を含有するか、またはこれらと組合せられ
る。ある場合には、PCR Technology: Principals andAm
plifications for DNA Amplification, エィチ・エー
・アーリッヒ（Ehrlich, H.A.)編、１９８９年、ストッ
クトンプレス（Stockton Press）、ニューヨーク州、に
記載の他の増幅法を、本発明の実施のために使用しても
よい。その結果、媒体中に特定のヌクレオチド配列の局
在化された高密度集団コロニーが作成される。試料中に
含まれ媒体に導入されそして増幅工程により複製されな
い非標的ゲノムのセグメントは、増殖せず、検出もでき
ないであろう。分析は、１つまたはそれ以上の標識され
たアナライト特異的物質（ＬＡＳＭ）も含有するかまた
はこれと組合わされる媒体中で行われる。ＬＡＳＭは、
標的アナライトを形成し増幅されている特異的ヌクレオ
チド配列の一部に相補的な合成ヌクレオチド配列を含
む。標識物は、遊離色素もしくは蛍光物質、または相補
的な合成ヌクレオチド配列に結合するものでもよい。Ｌ
ＡＳＭは、最初媒体中に均一に分散される。ＬＡＳＭ
は、媒体中で拡散の法則に従って媒体中を通過して、増
幅されたヌクレオチド配列のコロニーまで移動し、これ
らのヌクレオチド配列に結合することにより、残りの媒
体に対してコロニーを強調して区別できるようにする。
コロニーに向かうＬＡＳＭの局所的移動のために、低強
度の標識ハロー（halo）が各コロニーのまわりに形成さ
れ、各ハローの中心には、標識されたコロニーに対応す
る高強度ピークがあるであろう。媒体上に存在する増幅
されていないＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、アクリジンオ
レンジ、臭化エチジウムまたは他の染色物で染色して
も、濃度が低いため検出できないであろう。ある場合に
は、標識物は、ＰＣＲまたはＳＤＡ増幅に使用されるオ
リゴヌクレオチドプライマーの１つまたは両方に結合し
てもよい。これらの場合に、プライマーはＬＡＳＭとし
て機能するであろう。非特異的バックグランドシグナル
は増幅により大きくは増加しないため、シグナル強度の
速度論的検討を行うことにより、細胞破片により引き起
こされるような非特異的バックグランドはゼロになるで
あろう。
【００２０】検体試料が、１つだけの標的アナライトの
有無について測定されるなら、コロニーは、アクリジン
オレンジまたは臭化エチジウムのようにＤＮＡまたはＲ
ＮＡの非特異的染色により検出される。この理由は、こ
れらの蛍光物質は任意の増幅されたヌクレオチド配列中
に非特異的に挿入されることができ、これが産生される
と、蛍光物質を相補的ヌクレオチド配列に結合させる必
要無しで、増幅プライマーの特異性により特異性が達成
されるためである。２つ以上の標的アナライトについて
試料が測定される場合は、媒体中で形成される任意の増
幅されたヌクレオチド配列のコロニーを強調しこれらの
タイプを決定するために、２つ以上の相補的ヌクレオチ
ド配列が１つまたはそれ以上の異なる蛍光物質に結合さ
れる。区別して検出可能な３つまでの蛍光物質を有する
ＬＡＳＭを使用することにより、１回の測定または分析
で２０までの異なる標的アナライトが検出できるであろ
う。
有無について測定されるなら、コロニーは、アクリジン
オレンジまたは臭化エチジウムのようにＤＮＡまたはＲ
ＮＡの非特異的染色により検出される。この理由は、こ
れらの蛍光物質は任意の増幅されたヌクレオチド配列中
に非特異的に挿入されることができ、これが産生される
と、蛍光物質を相補的ヌクレオチド配列に結合させる必
要無しで、増幅プライマーの特異性により特異性が達成
されるためである。２つ以上の標的アナライトについて
試料が測定される場合は、媒体中で形成される任意の増
幅されたヌクレオチド配列のコロニーを強調しこれらの
タイプを決定するために、２つ以上の相補的ヌクレオチ
ド配列が１つまたはそれ以上の異なる蛍光物質に結合さ
れる。区別して検出可能な３つまでの蛍光物質を有する
ＬＡＳＭを使用することにより、１回の測定または分析
で２０までの異なる標的アナライトが検出できるであろ
う。
【００２１】本発明の分析を行う場合に、コピーが媒体
内を急速に移動できないようにするため、そして分析の
間中媒体内に比較的静止しているようにするため、選択
された標的アナライトＤＮＡまたはＲＮＡの増幅された
ヌクレオチド配列は、約１５０量体〜約５００量体のサ
イズであることが重要である。同様に選択されたＬＡＳ
Ｍは、媒体内を増幅された標的アナライト配列より迅速
に拡散するのに充分なだけ短いが、増幅されたヌクレオ
チド配列に対して必要な特異性を有するのに充分なだけ
長くするために、約１８量体〜約４０量体のサイズであ
ることが重要である。理想的には、約１８量体のＬＡＳ
Ｍが使用される。従って、特異性を向上させるために、
増幅された標的アナライト中の異なる核酸配列に対する
適切なサイズの２つまたはそれ以上のＬＡＳＭが使用さ
れる。媒体は、もちろんプローブを含む増幅試薬が媒体
内を迅速に移動して、この増幅の生成物がコロニーから
拡散するより速く増幅が起きるようにできるタイプであ
る。
内を急速に移動できないようにするため、そして分析の
間中媒体内に比較的静止しているようにするため、選択
された標的アナライトＤＮＡまたはＲＮＡの増幅された
ヌクレオチド配列は、約１５０量体〜約５００量体のサ
イズであることが重要である。同様に選択されたＬＡＳ
Ｍは、媒体内を増幅された標的アナライト配列より迅速
に拡散するのに充分なだけ短いが、増幅されたヌクレオ
チド配列に対して必要な特異性を有するのに充分なだけ
長くするために、約１８量体〜約４０量体のサイズであ
ることが重要である。理想的には、約１８量体のＬＡＳ
Ｍが使用される。従って、特異性を向上させるために、
増幅された標的アナライト中の異なる核酸配列に対する
適切なサイズの２つまたはそれ以上のＬＡＳＭが使用さ
れる。媒体は、もちろんプローブを含む増幅試薬が媒体
内を迅速に移動して、この増幅の生成物がコロニーから
拡散するより速く増幅が起きるようにできるタイプであ
る。
【００２２】試料の細胞成分および生物成分の遺伝物質
のすべてを溶液中に放出するために、試料はまずその細
胞成分および生物成分のすべてを溶解して、分析のため
に調製される。ティー・マニアティス(Maniatis T.）、
イー・エフ・フリッチ(Fritsch, E.F.）およびジェイ・
サムブルーク（Sambrook, J.）、１９８７、モレキュラ
ークローニング：実験室マニュアル（Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual）、第２版、コールドスプリン
グハーバーラボラトリープレス(Cold Spring Harbor La
boratory Press）を参照されたい。次に、溶解した試料
の既知量のヌクレオチドリッチなアリコートを媒体に導
入し、媒体上に均等に広げる。必要であれば、垂直電気
泳動により、および／または分析前に制限消化または機
械的剪断によりそのサイズを小さくして、媒体への標的
アナライトの拡散を増強することができる。こうして、
遺伝物質である試料の標的成分のＤＮＡおよび／または
ＲＮＡは、媒体中の増幅物質に暴露される。こうして、
暴露された遺伝物質上の標的ヌクレオチド配列は、標的
アナライトのコピーのコロニーが媒体上に形成される程
度まで増幅される。標的アナライトのサイズおよび従っ
てコピーのサイズは比較的大きいため、増幅された標的
アナライトのコロニーは媒体上に比較的静止して維持さ
れる。ＬＡＳＭは媒体中にあらかじめ取り込まれなくて
も、増幅工程後に媒体に添加され、そこに比較的均一に
分散されるであろう。ＬＡＳＭは、媒体中またはこれを
通過して移動できるようなサイズにされる。従って、次
にＬＡＳＭは標的アナライトのコロニーに移動し、標的
アナライトのコロニー中のコピーに結合するであろう。
この結合は、媒体中の周囲の領域より高レベルの標識シ
グナルを放出させ、実際コロニーに接するすぐ周りの領
域は、弱くなった標識シグナルを放出するであろう。そ
の結果は、媒体中で「暗い」ハローに囲まれた「明る
い」スポットの形成であろう。試料中に標的アナライト
が存在しない場合は、媒体は比較的等しいレベルのシグ
ナル放出を保持し、均等に「着色」されて現れるであろ
う。それぞれ標的アナライトへの蛍光物質を含有する相
補的なヌクレオチドの結合は、米国特許第５，４８５，
５３０号（ロコウィッツ（Lokowicz）ら）に記載のよう
な時間分解蛍光法により検出される。必要であれば、細
胞性ヌクレオチドに関して標的の局在化が確保されるよ
うに（すなわち、標的が細胞内であるかまたは細胞外で
あるかを測定するために）、試料は細胞溶解の前に媒体
に適用される。必要であれば、ＬＡＳＭならびに増幅に
必要な他の試薬は、ナイロン膜またはペーペーストリッ
プのような固体支持体に含浸させ、膜を媒体の上に置い
て媒体中に拡散させることができる。
のすべてを溶液中に放出するために、試料はまずその細
胞成分および生物成分のすべてを溶解して、分析のため
に調製される。ティー・マニアティス(Maniatis T.）、
イー・エフ・フリッチ(Fritsch, E.F.）およびジェイ・
サムブルーク（Sambrook, J.）、１９８７、モレキュラ
ークローニング：実験室マニュアル（Molecular Clonin
g: A Laboratory Manual）、第２版、コールドスプリン
グハーバーラボラトリープレス(Cold Spring Harbor La
boratory Press）を参照されたい。次に、溶解した試料
の既知量のヌクレオチドリッチなアリコートを媒体に導
入し、媒体上に均等に広げる。必要であれば、垂直電気
泳動により、および／または分析前に制限消化または機
械的剪断によりそのサイズを小さくして、媒体への標的
アナライトの拡散を増強することができる。こうして、
遺伝物質である試料の標的成分のＤＮＡおよび／または
ＲＮＡは、媒体中の増幅物質に暴露される。こうして、
暴露された遺伝物質上の標的ヌクレオチド配列は、標的
アナライトのコピーのコロニーが媒体上に形成される程
度まで増幅される。標的アナライトのサイズおよび従っ
てコピーのサイズは比較的大きいため、増幅された標的
アナライトのコロニーは媒体上に比較的静止して維持さ
れる。ＬＡＳＭは媒体中にあらかじめ取り込まれなくて
も、増幅工程後に媒体に添加され、そこに比較的均一に
分散されるであろう。ＬＡＳＭは、媒体中またはこれを
通過して移動できるようなサイズにされる。従って、次
にＬＡＳＭは標的アナライトのコロニーに移動し、標的
アナライトのコロニー中のコピーに結合するであろう。
この結合は、媒体中の周囲の領域より高レベルの標識シ
グナルを放出させ、実際コロニーに接するすぐ周りの領
域は、弱くなった標識シグナルを放出するであろう。そ
の結果は、媒体中で「暗い」ハローに囲まれた「明る
い」スポットの形成であろう。試料中に標的アナライト
が存在しない場合は、媒体は比較的等しいレベルのシグ
ナル放出を保持し、均等に「着色」されて現れるであろ
う。それぞれ標的アナライトへの蛍光物質を含有する相
補的なヌクレオチドの結合は、米国特許第５，４８５，
５３０号（ロコウィッツ（Lokowicz）ら）に記載のよう
な時間分解蛍光法により検出される。必要であれば、細
胞性ヌクレオチドに関して標的の局在化が確保されるよ
うに（すなわち、標的が細胞内であるかまたは細胞外で
あるかを測定するために）、試料は細胞溶解の前に媒体
に適用される。必要であれば、ＬＡＳＭならびに増幅に
必要な他の試薬は、ナイロン膜またはペーペーストリッ
プのような固体支持体に含浸させ、膜を媒体の上に置い
て媒体中に拡散させることができる。
【００２３】媒体中で標的アナライトのコピーを産生す
ることにより、媒体に試料を接種後数時間以内に測定を
完了することができる。ウイルス、細菌、真菌、マイコ
プラズマ、原生動物、または任意のタイプの細胞もしく
は試料中に存在する特異的ヌクレオチドは、本発明の特
異的ヌクレオチド配列増幅法または検出法を使用して測
定することができ、媒体に加えられた検体試料の量はわ
かっているため、媒体中の強調されたコロニーの数を計
測することにより、単位量の検体試料当たりの標的アナ
ライトの量を検出し、こうして標的アナライトについて
試料の定量分析が保証される。
ることにより、媒体に試料を接種後数時間以内に測定を
完了することができる。ウイルス、細菌、真菌、マイコ
プラズマ、原生動物、または任意のタイプの細胞もしく
は試料中に存在する特異的ヌクレオチドは、本発明の特
異的ヌクレオチド配列増幅法または検出法を使用して測
定することができ、媒体に加えられた検体試料の量はわ
かっているため、媒体中の強調されたコロニーの数を計
測することにより、単位量の検体試料当たりの標的アナ
ライトの量を検出し、こうして標的アナライトについて
試料の定量分析が保証される。
【００２４】既知の標的ヌクレオチドを含有しない対照
試料を媒体の一部に接種して、既知試料と全く同様に処
理し調製する。この媒体の部分は、陰性対照となる。媒
体の陰性対照の部分に増幅された標識コロニーが形成す
る場合は、媒体または増幅試薬もしくは溶解試薬、また
はすべてが汚染されたと推定され、測定の結果は無効で
ある。また媒体の一部を別に取って、試験を行う時にそ
の中に既知量の標的アナライトを含有する試料を添加す
ることにより、陽性対照として使用することができる。
媒体の陽性対照の部分に適切な数およびタイプのコロニ
ーがない場合は、測定法の増幅および／または検出工程
は正しく機能しておらず、測定は無効である。
試料を媒体の一部に接種して、既知試料と全く同様に処
理し調製する。この媒体の部分は、陰性対照となる。媒
体の陰性対照の部分に増幅された標識コロニーが形成す
る場合は、媒体または増幅試薬もしくは溶解試薬、また
はすべてが汚染されたと推定され、測定の結果は無効で
ある。また媒体の一部を別に取って、試験を行う時にそ
の中に既知量の標的アナライトを含有する試料を添加す
ることにより、陽性対照として使用することができる。
媒体の陽性対照の部分に適切な数およびタイプのコロニ
ーがない場合は、測定法の増幅および／または検出工程
は正しく機能しておらず、測定は無効である。
【００２５】図１において、本発明の方法を実施するよ
うに適合させた、全体に数字２で表示された媒体の長方
形部分の平面図である。図１に示す媒体領域は、均等に
影をつけて、媒体に試料を接種する前または試料を導入
しインキュベートした後の試料中に標的アナライトが存
在しない時の、人の肉眼または走査装置により検出され
る、均一に分布した標識シグナルの放出を示してある。
媒体２の領域３は、測定される試料に暴露されないが、
試験に使用されるすべての試薬を含有する領域であり、
従って陰性対照領域として作用する。図１の領域５は、
これも試験に使用されるすべての試薬を含有する領域で
ある。領域５は試料に暴露されないが、既知濃度の標的
アナライトを含有する陽性対照溶液に暴露される。図２
と３は、試料中に標的アナライトが存在する時の、媒体
２中の得られる発光パターンの変化を示す。図２は、試
料中の比較的低レベルの標的アナライトの結果を示し、
この試料は媒体２中の低レベル標識のハロー６に囲まれ
たより強く標識された複数のコロニー４を産生する。図
３は、試料中に比較的高レベルの標的アナライトがある
時の結果を示す。図２と３から、コロニー４の数を数え
ることができ、そして各々試料量はわかっているため、
本発明の方法に従って単位量当たりの標的アナライトの
濃度を得ることができる。また図２と３から、陽性対照
領域５は、媒体の残りの部分で形成されるコロニーの数
に無関係に同じ数のコロニーを有することがわかる。
うに適合させた、全体に数字２で表示された媒体の長方
形部分の平面図である。図１に示す媒体領域は、均等に
影をつけて、媒体に試料を接種する前または試料を導入
しインキュベートした後の試料中に標的アナライトが存
在しない時の、人の肉眼または走査装置により検出され
る、均一に分布した標識シグナルの放出を示してある。
媒体２の領域３は、測定される試料に暴露されないが、
試験に使用されるすべての試薬を含有する領域であり、
従って陰性対照領域として作用する。図１の領域５は、
これも試験に使用されるすべての試薬を含有する領域で
ある。領域５は試料に暴露されないが、既知濃度の標的
アナライトを含有する陽性対照溶液に暴露される。図２
と３は、試料中に標的アナライトが存在する時の、媒体
２中の得られる発光パターンの変化を示す。図２は、試
料中の比較的低レベルの標的アナライトの結果を示し、
この試料は媒体２中の低レベル標識のハロー６に囲まれ
たより強く標識された複数のコロニー４を産生する。図
３は、試料中に比較的高レベルの標的アナライトがある
時の結果を示す。図２と３から、コロニー４の数を数え
ることができ、そして各々試料量はわかっているため、
本発明の方法に従って単位量当たりの標的アナライトの
濃度を得ることができる。また図２と３から、陽性対照
領域５は、媒体の残りの部分で形成されるコロニーの数
に無関係に同じ数のコロニーを有することがわかる。
【００２６】図４は、媒体を線状に走査して標識物から
出る発光強度を自動分析装置で検出した絵グラフであ
る。トレース８は、媒体自身の発光レベルを示し、くぼ
み１０は、ハロー６中の低レベルの発光を示し、ピーク
１２は、コロニー４中の高レベルの発光を示す。
出る発光強度を自動分析装置で検出した絵グラフであ
る。トレース８は、媒体自身の発光レベルを示し、くぼ
み１０は、ハロー６中の低レベルの発光を示し、ピーク
１２は、コロニー４中の高レベルの発光を示す。
【００２７】以下は、本発明の技術を使用して検出され
る疑わしい生物に特異的な標的アナライト、および各標
的アナライトを検出するのに使用される試薬の例を示
す。
る疑わしい生物に特異的な標的アナライト、および各標
的アナライトを検出するのに使用される試薬の例を示
す。
【００２８】
【実施例】例１ 本発明の技術を使用して検出し定量できる１つの生物は
ＨＩＶ−１ウイルスである。ＨＩＶ−１を検出するため
の標的アナライト遺伝子は、ウイルスのゲノムを複製す
る機能を有するウイルスポリメラーゼである。（このポ
リメラーゼ遺伝子は、本方法で検出できるいくつかのＨ
ＩＶ−１遺伝子の１つであることに注意されたい。実
際、２つのＨＩＶ−１遺伝子（例えば、ポリメラーゼと
プロテアーゼの両方）の濃度を同時に定量するプロトコ
−ルは、ポリメラーゼ対プロテアーゼ比は比較的一定で
あるため、擬陽性結果は少ないであろう。）ＰＣＲを使
用してウイルスポリメラーゼ遺伝子を増幅するために使
用できる前進プライマーは GCACTTTAAATTTTCCCATTAGTCC; であり、逆プライマーは CCTGCGGGATGTGGTATTCC. である。
ＨＩＶ−１ウイルスである。ＨＩＶ−１を検出するため
の標的アナライト遺伝子は、ウイルスのゲノムを複製す
る機能を有するウイルスポリメラーゼである。（このポ
リメラーゼ遺伝子は、本方法で検出できるいくつかのＨ
ＩＶ−１遺伝子の１つであることに注意されたい。実
際、２つのＨＩＶ−１遺伝子（例えば、ポリメラーゼと
プロテアーゼの両方）の濃度を同時に定量するプロトコ
−ルは、ポリメラーゼ対プロテアーゼ比は比較的一定で
あるため、擬陽性結果は少ないであろう。）ＰＣＲを使
用してウイルスポリメラーゼ遺伝子を増幅するために使
用できる前進プライマーは GCACTTTAAATTTTCCCATTAGTCC; であり、逆プライマーは CCTGCGGGATGTGGTATTCC. である。
【００２９】もし別のＬＡＳＭが使用される場合は、そ
れは上記前進プライマーまたは逆プライマーの間のある
領域に対して相補的である。相補的ヌクレオチド配列
は、必要な発光シグナルを与える蛍光物質に共有結合す
ることができる。この場合ＬＡＳＭは、１つのＬＡＳＭ
と別のＬＡＳＭの間のハイブリダイゼーションにより生
じる生成物の増幅を避けるために、オリゴヌクレオチド
の３’末端のヌクレオチドの３’位のヒドロキシル基が
欠如している。別のＬＡＳＭを使用しない場合は、蛍光
物質は、ＰＣＲに使用されるオリゴヌクレオチドプライ
マーの１つまたは両方の５’末端に結合するか、または
１つまたはそれ以上のヌクレオシド間の結合に結合して
いる。すべてのプライマーおよびＬＡＳＭは、１つのＬ
ＡＳＭと別のＬＡＳＭの間のハイブリダイゼーションに
より生じる生成物の増幅を避けるために、ヌクレオチド
の３’末端のヌクレオチドの３’位のヒドロキシル基が
欠如している。適切な媒体には、２．５〜５．０％のア
クリルアミド、および０．０２５〜２．５％のビスアク
リルアミドを含有するアクリルアミドゲル、または０．
５％アガロース、および０．７５〜１．５％アガロース
を含有する標準的かつ低温融解アガロースゲルがある。
前述のように、本発明の技術は、例えばアクリルアミド
ゲルについては約４〜５％、そしてアガロースについて
は２％以下の、ゲルの割合の低い媒体組成を使用して最
適化される。
れは上記前進プライマーまたは逆プライマーの間のある
領域に対して相補的である。相補的ヌクレオチド配列
は、必要な発光シグナルを与える蛍光物質に共有結合す
ることができる。この場合ＬＡＳＭは、１つのＬＡＳＭ
と別のＬＡＳＭの間のハイブリダイゼーションにより生
じる生成物の増幅を避けるために、オリゴヌクレオチド
の３’末端のヌクレオチドの３’位のヒドロキシル基が
欠如している。別のＬＡＳＭを使用しない場合は、蛍光
物質は、ＰＣＲに使用されるオリゴヌクレオチドプライ
マーの１つまたは両方の５’末端に結合するか、または
１つまたはそれ以上のヌクレオシド間の結合に結合して
いる。すべてのプライマーおよびＬＡＳＭは、１つのＬ
ＡＳＭと別のＬＡＳＭの間のハイブリダイゼーションに
より生じる生成物の増幅を避けるために、ヌクレオチド
の３’末端のヌクレオチドの３’位のヒドロキシル基が
欠如している。適切な媒体には、２．５〜５．０％のア
クリルアミド、および０．０２５〜２．５％のビスアク
リルアミドを含有するアクリルアミドゲル、または０．
５％アガロース、および０．７５〜１．５％アガロース
を含有する標準的かつ低温融解アガロースゲルがある。
前述のように、本発明の技術は、例えばアクリルアミド
ゲルについては約４〜５％、そしてアガロースについて
は２％以下の、ゲルの割合の低い媒体組成を使用して最
適化される。
【００３０】適切なＰＣＲ試薬を含浸させた媒体は、以
下のように調製される。５０mM ＥＤＴＡ中２０mMトリ
ス（ｐＨ約８．０）から構成される１００mlの洗浄溶
液；および０．５mMのＥＤＴＡ中２mMトリス（ｐＨ約
８．０）から構成される１０mlの保存溶液が調製され
る。ゲルは、５mlの洗浄溶液に室温で約１５分間浸漬さ
れる。この工程を、新鮮な洗浄溶液で５回繰り返す。次
にゲルを、ＰＣＲプライマー、酵素およびｄＮＴＰなど
を含有する５mlの保存溶液に浸す。
下のように調製される。５０mM ＥＤＴＡ中２０mMトリ
ス（ｐＨ約８．０）から構成される１００mlの洗浄溶
液；および０．５mMのＥＤＴＡ中２mMトリス（ｐＨ約
８．０）から構成される１０mlの保存溶液が調製され
る。ゲルは、５mlの洗浄溶液に室温で約１５分間浸漬さ
れる。この工程を、新鮮な洗浄溶液で５回繰り返す。次
にゲルを、ＰＣＲプライマー、酵素およびｄＮＴＰなど
を含有する５mlの保存溶液に浸す。
【００３１】ＳＤＡ法による増幅のために、適切な制限
部位を含有する関連プライマーが使用される。例えば、
ＳＤＡによりウイルスポリメラーゼ遺伝子を増幅するの
に使用できる前進プライマーは TTGAATAGTCGGTTACTTGTTGACACTCGGCACTTTAAAT; であり、逆プライマーは ACCGACTATTGTTGACACTGCCTGCGGGATGTGGTATTCC. である。
部位を含有する関連プライマーが使用される。例えば、
ＳＤＡによりウイルスポリメラーゼ遺伝子を増幅するの
に使用できる前進プライマーは TTGAATAGTCGGTTACTTGTTGACACTCGGCACTTTAAAT; であり、逆プライマーは ACCGACTATTGTTGACACTGCCTGCGGGATGTGGTATTCC. である。
【００３２】もし別のＬＡＳＭが使用される場合は、そ
れは上記前進プライマーまたは逆プライマーの間のある
領域に対して相補的である。このオリゴヌクレオチドに
基づくＬＡＳＭは、前進プライマーまたは逆プライマー
に対して相補的ではないが、標的分子の一部に対して相
補的である。この作用により、検出される物質を分子的
コロニーに特異的に集中させ、媒体内に自由に分散して
いるプライマーには集中させない。相補的ヌクレオチド
配列は、必要な発光シグナルを与える１つまたはそれ以
上の蛍光物質に共有結合することができる。別のＬＡＳ
Ｍを使用しない場合は、蛍光物質は、ＳＤＡに使用され
るオリゴヌクレオチドプライマーの１つまたは両方の
３’末端に結合するか、または１つまたはそれ以上のヌ
クレオシド間の結合に結合するであろう。
れは上記前進プライマーまたは逆プライマーの間のある
領域に対して相補的である。このオリゴヌクレオチドに
基づくＬＡＳＭは、前進プライマーまたは逆プライマー
に対して相補的ではないが、標的分子の一部に対して相
補的である。この作用により、検出される物質を分子的
コロニーに特異的に集中させ、媒体内に自由に分散して
いるプライマーには集中させない。相補的ヌクレオチド
配列は、必要な発光シグナルを与える１つまたはそれ以
上の蛍光物質に共有結合することができる。別のＬＡＳ
Ｍを使用しない場合は、蛍光物質は、ＳＤＡに使用され
るオリゴヌクレオチドプライマーの１つまたは両方の
３’末端に結合するか、または１つまたはそれ以上のヌ
クレオシド間の結合に結合するであろう。
【００３３】適切なＳＤＡ試薬を含浸させた媒体は、以
下のように調製される。ｐＨが約７．４で６mMのＭｇＣ
ｌ2 を有する５０mMリン酸ナトリウムから構成される１
００mlの洗浄溶液；ならびに洗浄溶液とＳＤＡプライマ
ー、適切な制限酵素、エキソクレノウポリメラーゼおよ
びｄＮＴＰから構成される１０mlの保存溶液が調製され
る。ゲルは、５mlの洗浄溶液に室温で約１５分間浸漬さ
れる。この工程を、新鮮な洗浄溶液で５回繰り返す。次
にゲルを５mlの保存溶液に浸す。
下のように調製される。ｐＨが約７．４で６mMのＭｇＣ
ｌ2 を有する５０mMリン酸ナトリウムから構成される１
００mlの洗浄溶液；ならびに洗浄溶液とＳＤＡプライマ
ー、適切な制限酵素、エキソクレノウポリメラーゼおよ
びｄＮＴＰから構成される１０mlの保存溶液が調製され
る。ゲルは、５mlの洗浄溶液に室温で約１５分間浸漬さ
れる。この工程を、新鮮な洗浄溶液で５回繰り返す。次
にゲルを５mlの保存溶液に浸す。
【００３４】ＬＡＳＭは以下のように調製できる。色素
−イソチオシアネート標識物については、相補的ヌクレ
オチド配列鎖は、付属の一次アミンを有する１つまたは
それ以上の修飾塩基を含有する。標識すべき鎖を、ｐＨ
９．０を有する０．１Ｍの重炭酸ナトリウムに溶解し、
色素−イソチオシアネート標識物は１０mg/ml の濃度で
無水ＤＭＦに溶解する。次に色素溶液を滴下して、相補
的ヌクレオチド配列溶液に攪拌しながら加え、反応物を
室温で１２時間インキュベートする。次に遊離色素をゲ
ル濾過により除去し、色素−相補的ヌクレオチド配列結
合体をゲル電気泳動またはＨＰＬＣで精製する。色素−
スクシニミジルエステル標識物については、標識すべき
相補的ヌクレオチド配列を、ｐＨ８．０を有する０．１
Ｍのリン酸ナトリウムに溶解し、相補的ヌクレオチド配
列−標識物の結合反応は、スクシニミジルエステル標識
物の加水分解を最小にするために、４℃で行う。種々の
色素標識ＤＮＡが、化学合成により直接調製でき、ＤＮ
Ａ配列決定のために広く使用される。
−イソチオシアネート標識物については、相補的ヌクレ
オチド配列鎖は、付属の一次アミンを有する１つまたは
それ以上の修飾塩基を含有する。標識すべき鎖を、ｐＨ
９．０を有する０．１Ｍの重炭酸ナトリウムに溶解し、
色素−イソチオシアネート標識物は１０mg/ml の濃度で
無水ＤＭＦに溶解する。次に色素溶液を滴下して、相補
的ヌクレオチド配列溶液に攪拌しながら加え、反応物を
室温で１２時間インキュベートする。次に遊離色素をゲ
ル濾過により除去し、色素−相補的ヌクレオチド配列結
合体をゲル電気泳動またはＨＰＬＣで精製する。色素−
スクシニミジルエステル標識物については、標識すべき
相補的ヌクレオチド配列を、ｐＨ８．０を有する０．１
Ｍのリン酸ナトリウムに溶解し、相補的ヌクレオチド配
列−標識物の結合反応は、スクシニミジルエステル標識
物の加水分解を最小にするために、４℃で行う。種々の
色素標識ＤＮＡが、化学合成により直接調製でき、ＤＮ
Ａ配列決定のために広く使用される。
【００３５】標的アナライトは、以下の方法で媒体中に
埋め込むことができる。組織のホモジネートまたは培養
物から約２．５×１０7 細胞の懸濁物を調製し、組織培
養媒体（胎児牛血清を含まない）または等張食塩水で完
全に洗浄する。次に混合物を２，０００ｇで４℃で２０
分間遠心分離し、上清を除去し、核酸含有ペレットから
完全に水を切る。細胞を、５mlの５０mMトリス（ｐＨ
８．０）と５０mM ＥＤＴＡに再懸濁し、−２０℃で凍
結する。凍結溶液に、０．５mlのリゾチーム溶液（０．
２５Ｍトリス（ｐＨ８．０）中の１０mg/ml リゾチー
ム）を加え、混合物を４℃で４５分間インキュベートす
る。１mlのＳＴＥＰ溶液（０．５％ドデシル硫酸ナトリ
ウム、５０mMトリス（ｐＨ７．５）、０．４Ｍ ＥＤＴ
Ａ、１mg/mlプロティナーゼＫ（使用直前に加える））
を加え、溶液を５０℃で１時間インキュベートする。緩
衝化したフェノール６mlを加え、エマルジョンを１，０
００ｇで１５分間遠心分離する。核酸を含有する上層を
別の試験管に移し、３Ｍ酢酸ナトリウム０．１部と無水
エタノール２部を加える。ＤＮＡとＲＮＡを含有する沈
殿物を、５mlの５０mMトリス（ｐＨ７．５）および１mM
ＥＤＴＡに再溶解する。細胞性ＤＮＡのみが必要な場
合は、２００μg のＲＮａｓｅを加えてもよい。核酸は
直接媒体に加えるか、またはまず制限酵素で処理するか
もしくは針で剪断してその平均サイズを小さくする。
埋め込むことができる。組織のホモジネートまたは培養
物から約２．５×１０7 細胞の懸濁物を調製し、組織培
養媒体（胎児牛血清を含まない）または等張食塩水で完
全に洗浄する。次に混合物を２，０００ｇで４℃で２０
分間遠心分離し、上清を除去し、核酸含有ペレットから
完全に水を切る。細胞を、５mlの５０mMトリス（ｐＨ
８．０）と５０mM ＥＤＴＡに再懸濁し、−２０℃で凍
結する。凍結溶液に、０．５mlのリゾチーム溶液（０．
２５Ｍトリス（ｐＨ８．０）中の１０mg/ml リゾチー
ム）を加え、混合物を４℃で４５分間インキュベートす
る。１mlのＳＴＥＰ溶液（０．５％ドデシル硫酸ナトリ
ウム、５０mMトリス（ｐＨ７．５）、０．４Ｍ ＥＤＴ
Ａ、１mg/mlプロティナーゼＫ（使用直前に加える））
を加え、溶液を５０℃で１時間インキュベートする。緩
衝化したフェノール６mlを加え、エマルジョンを１，０
００ｇで１５分間遠心分離する。核酸を含有する上層を
別の試験管に移し、３Ｍ酢酸ナトリウム０．１部と無水
エタノール２部を加える。ＤＮＡとＲＮＡを含有する沈
殿物を、５mlの５０mMトリス（ｐＨ７．５）および１mM
ＥＤＴＡに再溶解する。細胞性ＤＮＡのみが必要な場
合は、２００μg のＲＮａｓｅを加えてもよい。核酸は
直接媒体に加えるか、またはまず制限酵素で処理するか
もしくは針で剪断してその平均サイズを小さくする。
【００３６】標的アナライトを増幅するＰＣＲ反応は、
以下のように行われる。ゲル、検体試料、ＰＣＲおよび
ＬＡＳＭ混合物を、９５℃で３分間加熱し、次に９５℃
で４５秒間の加熱、５５℃で９０秒間のアニーリング、
および各７５０ヌクレオチドについて７２℃で１分間の
伸長、を３０サイクル行う。例えば、もし７５０ヌクレ
オチドの長さの標的を増幅する時は、伸長反応を１分間
行い、一方もし標的が３７５ヌクレオチドの長さなら、
伸長は３０秒間行う。反応は７２℃で１０分間の伸長で
終了する。次に媒体を試験して、媒体中の標的アナライ
トのコロニーの有無を決定する。
以下のように行われる。ゲル、検体試料、ＰＣＲおよび
ＬＡＳＭ混合物を、９５℃で３分間加熱し、次に９５℃
で４５秒間の加熱、５５℃で９０秒間のアニーリング、
および各７５０ヌクレオチドについて７２℃で１分間の
伸長、を３０サイクル行う。例えば、もし７５０ヌクレ
オチドの長さの標的を増幅する時は、伸長反応を１分間
行い、一方もし標的が３７５ヌクレオチドの長さなら、
伸長は３０秒間行う。反応は７２℃で１０分間の伸長で
終了する。次に媒体を試験して、媒体中の標的アナライ
トのコロニーの有無を決定する。
【００３７】標的アナライトを増幅するＳＤＡ反応は、
以下のように行われる。ゲル、検体試料、ＳＤＡおよび
ＬＡＳＭ混合物を、３７℃で３０分〜４時間インキュベ
ートする。次に媒体を試験して、媒体中の標的アナライ
トのコロニーの有無を決定する。
以下のように行われる。ゲル、検体試料、ＳＤＡおよび
ＬＡＳＭ混合物を、３７℃で３０分〜４時間インキュベ
ートする。次に媒体を試験して、媒体中の標的アナライ
トのコロニーの有無を決定する。
【００３８】例２ 本発明の技術を用いて検出し定量できる別の標的アナラ
イトは、結核菌(M. tuberculosis）である。結核菌(M.
tuberculosis）を検出するための標的遺伝子はｉｎｈＡ
であり、その機能は脂肪酸生合成である。ＰＣＲによる
ｉｎｈＡ増幅のための前進プライマーは、 ACCCAATCGAATTGCCACACCCCG; であり、逆プライマーは、 GGCGCGCGAGGCCGGCAAGTACGG. である。
イトは、結核菌(M. tuberculosis）である。結核菌(M.
tuberculosis）を検出するための標的遺伝子はｉｎｈＡ
であり、その機能は脂肪酸生合成である。ＰＣＲによる
ｉｎｈＡ増幅のための前進プライマーは、 ACCCAATCGAATTGCCACACCCCG; であり、逆プライマーは、 GGCGCGCGAGGCCGGCAAGTACGG. である。
【００３９】これらのプライマーは、結核菌(M. tuberc
ulosis）のｉｎｈＡ遺伝子の２７０塩基対領域を増幅す
るであろう。もし別のＬＡＳＭが使用される場合は、そ
れは上記前進プライマーまたは逆プライマーの間のある
領域に対して相補的であろう。このオリゴヌクレオチド
に基づくＬＡＳＭは、前進プライマーまたは逆プライマ
ーに対して相補的ではないが、標的分子の一部に対して
相補的である。この作用により、検出される物質を分子
的コロニーに特異的に集中させ、媒体内に自由に分散し
ているプライマーには集中させない。媒体とＬＡＳＭ調
製法は、基本的に例１の導入法と同じである。
ulosis）のｉｎｈＡ遺伝子の２７０塩基対領域を増幅す
るであろう。もし別のＬＡＳＭが使用される場合は、そ
れは上記前進プライマーまたは逆プライマーの間のある
領域に対して相補的であろう。このオリゴヌクレオチド
に基づくＬＡＳＭは、前進プライマーまたは逆プライマ
ーに対して相補的ではないが、標的分子の一部に対して
相補的である。この作用により、検出される物質を分子
的コロニーに特異的に集中させ、媒体内に自由に分散し
ているプライマーには集中させない。媒体とＬＡＳＭ調
製法は、基本的に例１の導入法と同じである。
【００４０】ＳＤＡによるｉｎｈＡ遺伝子の増幅のため
の前進プライマーは、 AGTCGGTTACTTGTTGACACTCGACCCAATCGAATTGCCA; であり、逆プライマーは、 ACCGACTATTGTTGACACTGCGCGAGGCCGGCAAGTACGG. である。
の前進プライマーは、 AGTCGGTTACTTGTTGACACTCGACCCAATCGAATTGCCA; であり、逆プライマーは、 ACCGACTATTGTTGACACTGCGCGAGGCCGGCAAGTACGG. である。
【００４１】もし別のＬＡＳＭが使用される場合は、そ
れは上記前進プライマーまたは逆プライマーの間のある
領域に対して相補的であろう。媒体とＬＡＳＭ調製法
は、基本的に例１の導入法と同じである。
れは上記前進プライマーまたは逆プライマーの間のある
領域に対して相補的であろう。媒体とＬＡＳＭ調製法
は、基本的に例１の導入法と同じである。
【００４２】例３ 本発明の技術を用いて検出し定量できるさらなる生物
は、ＩＮＨ耐性結核菌(M. tuberculosis）である。ＩＮ
Ｈ耐性結核菌(M. tuberculosis）を検出するための標的
アナライト遺伝子は突然変異ｉｎｈＡであり、その機能
は脂肪酸生合成である。
は、ＩＮＨ耐性結核菌(M. tuberculosis）である。ＩＮ
Ｈ耐性結核菌(M. tuberculosis）を検出するための標的
アナライト遺伝子は突然変異ｉｎｈＡであり、その機能
は脂肪酸生合成である。
【００４３】ＰＣＲによる突然変異ｉｎｈＡ遺伝子の増
幅のための前進プライマーは、 ACCCAATCGAATTGCCACACCCCG; であり、逆プライマーは、 GCCGATCGATGAACCCCGGAGGTTCC. である。
幅のための前進プライマーは、 ACCCAATCGAATTGCCACACCCCG; であり、逆プライマーは、 GCCGATCGATGAACCCCGGAGGTTCC. である。
【００４４】これらのプライマーは、ＩＮＨ耐性結核菌
(M. tuberculosis）の突然変異ｉｎｈＡ遺伝子の１５９
塩基対領域を増幅するであろう。もし別のＬＡＳＭが使
用される場合は、それは上記前進プライマーまたは逆プ
ライマーの間のある領域に対して相補的であろう。この
オリゴヌクレオチドに基づくＬＡＳＭは、前進プライマ
ーまたは逆プライマーに対して相補的ではないが、標的
分子の一部に対して相補的である。この作用により、検
出可能な物質を分子的コロニーに特異的に集中させ、媒
体内に自由に分散しているプライマーには集中させな
い。媒体とＬＡＳＭ調製法は、基本的に例１の導入法と
同じである。
(M. tuberculosis）の突然変異ｉｎｈＡ遺伝子の１５９
塩基対領域を増幅するであろう。もし別のＬＡＳＭが使
用される場合は、それは上記前進プライマーまたは逆プ
ライマーの間のある領域に対して相補的であろう。この
オリゴヌクレオチドに基づくＬＡＳＭは、前進プライマ
ーまたは逆プライマーに対して相補的ではないが、標的
分子の一部に対して相補的である。この作用により、検
出可能な物質を分子的コロニーに特異的に集中させ、媒
体内に自由に分散しているプライマーには集中させな
い。媒体とＬＡＳＭ調製法は、基本的に例１の導入法と
同じである。
【００４５】ＳＤＡによる突然変異ｉｎｈＡ遺伝子の増
幅のための前進プライマーは、 AGTCGGTTACTTGTTGACACACCCAATCGAATTGCCACAC; であり、逆プライマーは、 ACCGACTATTGTTGACACTGCGATGAACCCCGGAGGTTCC. である。
幅のための前進プライマーは、 AGTCGGTTACTTGTTGACACACCCAATCGAATTGCCACAC; であり、逆プライマーは、 ACCGACTATTGTTGACACTGCGATGAACCCCGGAGGTTCC. である。
【００４６】もし別のＬＡＳＭが使用される場合は、そ
れは上記前進プライマーまたは逆プライマーの間のある
領域に対して相補的であろう。媒体とＬＡＳＭ調製法
は、基本的に例１の導入法と同じである。
れは上記前進プライマーまたは逆プライマーの間のある
領域に対して相補的であろう。媒体とＬＡＳＭ調製法
は、基本的に例１の導入法と同じである。
【００４７】例４ 本発明の技術を用いて検出し定量できる別の生物は、Ｈ
ＢＶである。ＨＢＶを検出するための標的遺伝子はｐＸ
遺伝子であり、その機能は転写である。ＰＣＲによるｐ
Ｘ遺伝子の増幅のための前進プライマーは、 GGTGAAGCGAAGTGCACACGGACCGGC; であり、逆プライマーは、 GCTGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGG である。
ＢＶである。ＨＢＶを検出するための標的遺伝子はｐＸ
遺伝子であり、その機能は転写である。ＰＣＲによるｐ
Ｘ遺伝子の増幅のための前進プライマーは、 GGTGAAGCGAAGTGCACACGGACCGGC; であり、逆プライマーは、 GCTGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGG である。
【００４８】これらのプライマーは、ＨＢＶのｐＸ遺伝
子の１９６塩基対領域を増幅するであろう。もし別のＬ
ＡＳＭが使用される場合は、それは上記前進プライマー
または逆プライマーの間のある領域に対して相補的であ
ろう。このオリゴヌクレオチドに基づくＬＡＳＭは、前
進プライマーまたは逆プライマーに対して相補的ではな
いが、標的分子の一部に対して相補的である。この作用
により、検出される物質を分子的コロニーに特異的に集
中させ、媒体内に自由に分散しているプライマーには集
中させない。媒体とＬＡＳＭ調製法は、基本的に例１の
導入法と同じである。
子の１９６塩基対領域を増幅するであろう。もし別のＬ
ＡＳＭが使用される場合は、それは上記前進プライマー
または逆プライマーの間のある領域に対して相補的であ
ろう。このオリゴヌクレオチドに基づくＬＡＳＭは、前
進プライマーまたは逆プライマーに対して相補的ではな
いが、標的分子の一部に対して相補的である。この作用
により、検出される物質を分子的コロニーに特異的に集
中させ、媒体内に自由に分散しているプライマーには集
中させない。媒体とＬＡＳＭ調製法は、基本的に例１の
導入法と同じである。
【００４９】ＳＤＡによるＨＢＶ ｐＸ遺伝子の増幅の
ための前進プライマーは、 AGTCGGTTACTTGTTGACACGGTGAAGCGAAGTGCACACG; であり、逆プライマーは、 ACCGACTATTGTTGACACTGGCTGGGGGAGGAGATTAG. である。
ための前進プライマーは、 AGTCGGTTACTTGTTGACACGGTGAAGCGAAGTGCACACG; であり、逆プライマーは、 ACCGACTATTGTTGACACTGGCTGGGGGAGGAGATTAG. である。
【００５０】もし別のＬＡＳＭが使用される場合は、そ
れは上記前進プライマーまたは逆プライマーの間のある
領域に対して相補的であろう。媒体とＬＡＳＭ調製法
は、基本的に例１の導入法と同じである。
れは上記前進プライマーまたは逆プライマーの間のある
領域に対して相補的であろう。媒体とＬＡＳＭ調製法
は、基本的に例１の導入法と同じである。
【００５１】例５ 本発明の技術を用いて検出し定量できる別の生物は、ニ
ューモシスチス・カリニー（Pneumocystis carinii）で
ある。ニューモシスチス・カリニー（Pneumocystis car
inii）を検出するための標的アナライト遺伝子はミトコ
ンドリアｒＲＮＡ遺伝子であり、その機能はタンパク質
合成である。ニューモシスチス・カリニー（Pneumocyst
is carinii）のミトコンドリアｒＲＮＡ遺伝子の増幅の
ための前進プライマーは、 GATGGCTGTTTCCAAGCCCA; であり、逆プライマーは、 GTGTACGTTGCAAAGTACTC. である。
ューモシスチス・カリニー（Pneumocystis carinii）で
ある。ニューモシスチス・カリニー（Pneumocystis car
inii）を検出するための標的アナライト遺伝子はミトコ
ンドリアｒＲＮＡ遺伝子であり、その機能はタンパク質
合成である。ニューモシスチス・カリニー（Pneumocyst
is carinii）のミトコンドリアｒＲＮＡ遺伝子の増幅の
ための前進プライマーは、 GATGGCTGTTTCCAAGCCCA; であり、逆プライマーは、 GTGTACGTTGCAAAGTACTC. である。
【００５２】これらのプライマーは、ニューモシスチス
・カリニー（Pneumocystis carinii）のミトコンドリア
ｒＲＮＡ遺伝子の３４４塩基対領域を増幅するであろ
う。もし別のＬＡＳＭが使用される場合は、それは上記
前進プライマーまたは逆プライマーの間のある領域に対
して相補的である。このオリゴヌクレオチドに基づくＬ
ＡＳＭは、前進プライマーまたは逆プライマーに対して
相補的ではないが、標的分子の一部に対して相補的であ
る。この作用により、検出される物質を分子的コロニー
に特異的に集中させ、媒体内に自由に分散しているプラ
イマーには集中させない。媒体とＬＡＳＭ調製法は、基
本的に例１の導入法と同じである。
・カリニー（Pneumocystis carinii）のミトコンドリア
ｒＲＮＡ遺伝子の３４４塩基対領域を増幅するであろ
う。もし別のＬＡＳＭが使用される場合は、それは上記
前進プライマーまたは逆プライマーの間のある領域に対
して相補的である。このオリゴヌクレオチドに基づくＬ
ＡＳＭは、前進プライマーまたは逆プライマーに対して
相補的ではないが、標的分子の一部に対して相補的であ
る。この作用により、検出される物質を分子的コロニー
に特異的に集中させ、媒体内に自由に分散しているプラ
イマーには集中させない。媒体とＬＡＳＭ調製法は、基
本的に例１の導入法と同じである。
【００５３】ＳＤＡによるニューモシスチス・カリニー
（Pneumocystis carinii）ミトコンドリアｒＲＮＡ遺伝
子の増幅のための前進プライマーは、 AGTCGGTTACTTGTTGACACGATGGCTGTTTCCAAGCCCA; であり、逆プライマーは、 ACGTGTACGTTGCAAAGTACGTGTACGTTGCAAAGTACTC. である。
（Pneumocystis carinii）ミトコンドリアｒＲＮＡ遺伝
子の増幅のための前進プライマーは、 AGTCGGTTACTTGTTGACACGATGGCTGTTTCCAAGCCCA; であり、逆プライマーは、 ACGTGTACGTTGCAAAGTACGTGTACGTTGCAAAGTACTC. である。
【００５４】もし別のＬＡＳＭが使用される場合は、そ
れは上記前進プライマーまたは逆プライマーの間のある
領域に対して相補的であろう。媒体とＬＡＳＭ調製法
は、基本的に例１の導入法と同じである。例６ 本発明の技術を用いて検出し定量できる別の生物は、メ
チシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicillin-resistant
S. aureus）である。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(me
thicillin-resistant S. aureus）を検出するための標
的遺伝子はｍｅｃＡであり、これはペニシリン結合タン
パク質である。ＰＣＲによるｍｅｃＡ遺伝子の増幅のた
めの前進プライマーは、 AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC; であり、逆プライマーは、 AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC. である。
れは上記前進プライマーまたは逆プライマーの間のある
領域に対して相補的であろう。媒体とＬＡＳＭ調製法
は、基本的に例１の導入法と同じである。例６ 本発明の技術を用いて検出し定量できる別の生物は、メ
チシリン耐性黄色ブドウ球菌(methicillin-resistant
S. aureus）である。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(me
thicillin-resistant S. aureus）を検出するための標
的遺伝子はｍｅｃＡであり、これはペニシリン結合タン
パク質である。ＰＣＲによるｍｅｃＡ遺伝子の増幅のた
めの前進プライマーは、 AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC; であり、逆プライマーは、 AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC. である。
【００５５】これらのプライマーは、ｍｅｃＡ遺伝子の
５３３塩基対領域を増幅するであろう。もし別のＬＡＳ
Ｍが使用される場合は、それは上記前進プライマーまた
は逆プライマーの間のある領域に対して相補的であろ
う。このオリゴヌクレオチドに基づくＬＡＳＭは、前進
プライマーまたは逆プライマーに対して相補的ではない
が、標的分子の一部に対して相補的である。この作用に
より、検出される物質を分子的コロニーに特異的に集中
させ、媒体内に自由に分散しているプライマーには集中
させない。媒体とＬＡＳＭ調製法は、基本的に例１の導
入法と同じである。
５３３塩基対領域を増幅するであろう。もし別のＬＡＳ
Ｍが使用される場合は、それは上記前進プライマーまた
は逆プライマーの間のある領域に対して相補的であろ
う。このオリゴヌクレオチドに基づくＬＡＳＭは、前進
プライマーまたは逆プライマーに対して相補的ではない
が、標的分子の一部に対して相補的である。この作用に
より、検出される物質を分子的コロニーに特異的に集中
させ、媒体内に自由に分散しているプライマーには集中
させない。媒体とＬＡＳＭ調製法は、基本的に例１の導
入法と同じである。
【００５６】ＳＤＡによるｍｅｃＡ遺伝子の増幅のため
の前進プライマーは、 AGTCGGTTACTTGTTGACACAAAATCGATGGTAAAGGTTG; であり、逆プライマーは、 GCTGGGGGAGGAGATTAGACAGTTCTGCAGTACCGGATTT. である。
の前進プライマーは、 AGTCGGTTACTTGTTGACACAAAATCGATGGTAAAGGTTG; であり、逆プライマーは、 GCTGGGGGAGGAGATTAGACAGTTCTGCAGTACCGGATTT. である。
【００５７】もし別のＬＡＳＭが使用される場合は、そ
れは上記前進プライマーまたは逆プライマーの間のある
領域に対して相補的であろう。媒体とＬＡＳＭ調製法
は、基本的に例１の導入法と同じである。
れは上記前進プライマーまたは逆プライマーの間のある
領域に対して相補的であろう。媒体とＬＡＳＭ調製法
は、基本的に例１の導入法と同じである。
【００５８】もし別のＬＡＳＭが使用される場合は、そ
れは前進プライマーと逆プライマーの間の任意の領域に
対して相補的であることができることは理解されるであ
ろう。本発明により分析できる検体試料には、組織、血
液、呼吸に関する標的アナライトのために喀痰のような
生物的液体、腸標的アナライトのための便がある。基本
的に、原生動物、細菌、ウイルス、真菌など（ただし、
これらに限定されない）を含む任意の生命体の有無およ
び定量は、本発明の技術を用いて基本的に任意の検体試
料で検出することができる。同様に本発明の概念に従っ
て共通の試料について１回の試験を行って、複数の異な
る生命他（例えば、２つを上げるとウイルスと細菌）が
検出し定量できる。すなわち本発明の方法を使用して１
回の試験で、呼吸器疾患、下痢、性器疾患、および他の
多くの疾患の完全に異なる原因が確認できる。本発明の
概念から逸脱することなく本発明の開示した実施態様の
多くの改変および変更が可能であり、これらは請求の範
囲に記載の本発明を限定するものではない。
れは前進プライマーと逆プライマーの間の任意の領域に
対して相補的であることができることは理解されるであ
ろう。本発明により分析できる検体試料には、組織、血
液、呼吸に関する標的アナライトのために喀痰のような
生物的液体、腸標的アナライトのための便がある。基本
的に、原生動物、細菌、ウイルス、真菌など（ただし、
これらに限定されない）を含む任意の生命体の有無およ
び定量は、本発明の技術を用いて基本的に任意の検体試
料で検出することができる。同様に本発明の概念に従っ
て共通の試料について１回の試験を行って、複数の異な
る生命他（例えば、２つを上げるとウイルスと細菌）が
検出し定量できる。すなわち本発明の方法を使用して１
回の試験で、呼吸器疾患、下痢、性器疾患、および他の
多くの疾患の完全に異なる原因が確認できる。本発明の
概念から逸脱することなく本発明の開示した実施態様の
多くの改変および変更が可能であり、これらは請求の範
囲に記載の本発明を限定するものではない。
【００５９】
（１）一般情報： （ｉ）出願人： （Ａ) レビン，ロバート・エー(Levine, Robert A.）： （Ｂ）ワードロー，ステファン・シー(Wardlaw, Stephe
n C.）； （ii）発明の名称：空間的に局在化された標的アナライ
ト複製を用いる試料中のヌクレオチド配列標的アナライ
トの検出と定量 （iii) 配列の数：２４ （iv）連絡住所： （Ａ）宛名：ウィリアム・ダブリュー・ジョーンズ(Wil
liam W. Jones) （Ｂ）通り：６ ジュニパーレーン（Juniper Lane） （Ｃ）市：マジソン （Ｄ）州：コネチカット （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号：０６４４３ （ｖ）コンピューターで読める形式： （Ａ）媒体の型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：マッキントッシュ・パーフォー
マ６３７ＣＤ （Ｃ）オペレーティング・システム：マッキントッシュ
７．５ （Ｄ）ソフトウェア：クラリスワークス２．１ （vi）現行出願のデータ： （Ａ）出願番号：０８／８４１，２６７ （Ｂ）出願日：１９９７年４月２９日 （Ｃ）分類：クラス４３５ （vii) 先行出願のデータ：該当せず （viii）弁理士／代理人情報： （Ａ）氏名：ウィリアム・ダブリュー・ジョーンズ(Wil
liam W. Jones) （Ｂ）登録番号：２４，６０７ （Ｃ）参照／整理番号：ＵＦＢ−００１ （ix）電話連絡先情報： （Ａ）電話：（２０３）２４５−２４１８ （Ｂ）ファックス：（２０３）２４５−９２９４
n C.）； （ii）発明の名称：空間的に局在化された標的アナライ
ト複製を用いる試料中のヌクレオチド配列標的アナライ
トの検出と定量 （iii) 配列の数：２４ （iv）連絡住所： （Ａ）宛名：ウィリアム・ダブリュー・ジョーンズ(Wil
liam W. Jones) （Ｂ）通り：６ ジュニパーレーン（Juniper Lane） （Ｃ）市：マジソン （Ｄ）州：コネチカット （Ｅ）国：米国 （Ｆ）郵便番号：０６４４３ （ｖ）コンピューターで読める形式： （Ａ）媒体の型：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター：マッキントッシュ・パーフォー
マ６３７ＣＤ （Ｃ）オペレーティング・システム：マッキントッシュ
７．５ （Ｄ）ソフトウェア：クラリスワークス２．１ （vi）現行出願のデータ： （Ａ）出願番号：０８／８４１，２６７ （Ｂ）出願日：１９９７年４月２９日 （Ｃ）分類：クラス４３５ （vii) 先行出願のデータ：該当せず （viii）弁理士／代理人情報： （Ａ）氏名：ウィリアム・ダブリュー・ジョーンズ(Wil
liam W. Jones) （Ｂ）登録番号：２４，６０７ （Ｃ）参照／整理番号：ＵＦＢ−００１ （ix）電話連絡先情報： （Ａ）電話：（２０３）２４５−２４１８ （Ｂ）ファックス：（２０３）２４５−９２９４
【００６０】（２）配列番号：１の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２５塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：ウイルス （Ｂ）株：ＨＩＶ−１ （Ｃ）個体単離コロニー名：ポリメラーゼ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：前進プライマー （xi）配列： GCACTTTAAATTTTCCCATT AGT CC
【００６１】（３）配列番号：２の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：ウイルス （Ｂ）株：ＨＩＶ−１ （Ｃ）個体単離コロニー名：ポリメラーゼ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：逆プライマー （xi）配列： CCTGCGGGAT GTGGTATTCC
【００６２】（４）配列番号：３の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：４０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：ウイルス （Ｂ）株：ＨＩＶ−１ （Ｃ）個体単離コロニー名：ポリメラーゼ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：前進プライマー （xi）配列： TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACACTCGG CACTTTAAAT
【００６３】（５）配列番号：４の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：４０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：ウイルス （Ｂ）株：ＨＩＶ−１ （Ｃ）個体単離コロニー名：ポリメラーゼ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：逆プライマー （xi）配列： ACCGACTATT GTTGACACTG CCTGCGGGAT GTGGTATTCC
【００６４】（６）配列番号：５の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：細菌 （Ｂ）株：結核菌（M. tubercle bacilus) （Ｃ）個体単離コロニー名：ｉｎｈＡ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：前進プライマー （xi）配列： ACCCAATCGA ATTGCCACAC CCC G
【００６５】（７）配列番号：６の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：細菌 （Ｂ）株：結核菌（M. tubercle bacilus) （Ｃ）個体単離コロニー名：ｉｎｈＡ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：逆プライマー （xi）配列： GGCGCGCGAG GCCGGCAAGT ACG G
【００６６】（８）配列番号：７の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：４０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：細菌 （Ｂ）株：結核菌（M. tubercle bacilus) （Ｃ）個体単離コロニー名：ｉｎｈＡ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：前進プライマー （xi）配列： AGTCGGTTAC TTGTTGACAC TCGACCCAAT CGAATTGCCA
【００６７】（９）配列番号：８の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：４０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：細菌 （Ｂ）株：結核菌（M. tubercle bacilus) （Ｃ）個体単離コロニー名：ｉｎｈＡ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：逆プライマー （xi）配列： ACCGACTATT GTTGACACTG CGCGAGGCCG GCAAGTACGG
【００６８】（１０）配列番号：９の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２４塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：細菌 （Ｂ）株：ＩＮＨ−耐性結核菌（M. tubercle bacilus) （Ｃ）個体単離コロニー名：ｉｎｈＡ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：前進プライマー （xi）配列： ACCCAATCGA ATTGCCACAC CCC G;
【００６９】（１１）配列番号：１０の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：細菌 （Ｂ）株：ＩＮＨ−耐性結核菌（M. tubercle bacilus) （Ｃ）個体単離コロニー名：突然変異ｉｎｈＡ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：逆プライマー （xi）配列： GCCGATCGAT GAACCCCGGA GGT TCC
【００７０】（１２）配列番号：１１の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：４０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：細菌 （Ｂ）株：ＩＮＨ−耐性結核菌（M. tubercle bacilus) （Ｃ）個体単離コロニー名：突然変異ｉｎｈＡ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：前進プライマー （xi）配列： AGTCGGTTAC TTGTTGACAC ACCCAATCGA ATTGCCACAC
【００７１】（１３）配列番号：１２の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：４０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：細菌 （Ｂ）株：ＩＮＨ−耐性結核菌（M. tubercle bacilus) （Ｃ）個体単離コロニー名：突然変異ｉｎｈＡ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：逆プライマー （xi）配列： ACCGACTATT GTTGACACTG CGATGAACCC CGGAGGTTCC
【００７２】（１４）配列番号：１３の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２７塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：ウイルス （Ｂ）株：ＨＢＶ （Ｃ）個体単離コロニー名：ｐＸ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：前進プライマー （xi）配列： GGTGAAGCGA AGTGCACACG GAC CGG C
【００７３】（１５）配列番号：１４の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２６塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：ウイルス （Ｂ）株：ＨＢＶ （Ｃ）個体単離コロニー名：ｐＸ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：逆プライマー（xi）配列：GC
TGGGGGAG GAGATTAGGT TAA AGG.
TGGGGGAG GAGATTAGGT TAA AGG.
【００７４】（１６）配列番号：１５の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：４０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：ウイルス （Ｂ）株：ＨＢＶ （Ｃ）個体単離コロニー名：ｐＸ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：前進プライマー （xi）配列： AGTCGGTTAC TTGTTGACAC GGTGAAGCGA AGTGCACACG
【００７５】（１７）配列番号：１６の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：３８塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：ウイルス （Ｂ）株：ＨＢＶ （Ｃ）個体単離コロニー名：ｐＸ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：逆プライマー （xi）配列： ACCGACTATT GTTGACACTG GCTGGGGGAG GAG ATT AG
【００７６】（１８）配列番号：１７の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＲＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：原生動物 （Ｂ）株：ニューモシスチス・カリニー（Pneumocystis
carinii） （Ｃ）個体単離コロニー名：ミトコンドリアｒＲＮＡ （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：前進プライマー （xi）配列： GATGGCTGTT TCCAAGCCCA
carinii） （Ｃ）個体単離コロニー名：ミトコンドリアｒＲＮＡ （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：前進プライマー （xi）配列： GATGGCTGTT TCCAAGCCCA
【００７７】（１９）配列番号：１８の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＲＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：原生動物 （Ｂ）株：ニューモシスチス・カリニー（Pneumocystis
carinii） （Ｃ）個体単離コロニー名：ミトコンドリアｒＲＮＡ
（viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：逆プライマー （xi）配列： GTGTACGTTG CAAAGTACTC
carinii） （Ｃ）個体単離コロニー名：ミトコンドリアｒＲＮＡ
（viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：逆プライマー （xi）配列： GTGTACGTTG CAAAGTACTC
【００７８】（２０）配列番号：１９の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：４０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＲＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：原生動物 （Ｂ）株：ニューモシスチス・カリニー（Pneumocystis
carinii） （Ｃ）個体単離コロニー名：ミトコンドリアｒＲＮＡ （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：前進プライマー （xi）配列： AGTCGGTTAC TTGTTGACAC GATGGCTGTT TCCAAGCCCA
carinii） （Ｃ）個体単離コロニー名：ミトコンドリアｒＲＮＡ （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：前進プライマー （xi）配列： AGTCGGTTAC TTGTTGACAC GATGGCTGTT TCCAAGCCCA
【００７９】（２１）配列番号：２０の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：４０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＲＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：原生動物 （Ｂ）株：ニューモシスチス・カリニー（Pneumocystis
carinii） （Ｃ）個体単離コロニー名：ミトコンドリアｒＲＮＡ （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：逆プライマー （xi）配列： ACGTGTACGT TGCAAAGTAC GTGTACGTTG CAAAGTACTC
carinii） （Ｃ）個体単離コロニー名：ミトコンドリアｒＲＮＡ （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：逆プライマー （xi）配列： ACGTGTACGT TGCAAAGTAC GTGTACGTTG CAAAGTACTC
【００８０】（２２）配列番号：２１の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：細菌 （Ｂ）株：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicilli
n-resistant S.aureus) （Ｃ）個体単離コロニー名：ｍｅｃＡ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：前進プライマー （xi）配列： AAAATCGATG GTAAAGGTTG GC
n-resistant S.aureus) （Ｃ）個体単離コロニー名：ｍｅｃＡ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：前進プライマー （xi）配列： AAAATCGATG GTAAAGGTTG GC
【００８１】（２３）配列番号：２２の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：２２塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：細菌 （Ｂ）株：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicilli
n-resistant S.aureus) （Ｃ）個体単離コロニー名：ｍｅｃＡ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：逆プライマー （xi）配列： AGTTCTGCAG TACCGGATTT GC
n-resistant S.aureus) （Ｃ）個体単離コロニー名：ｍｅｃＡ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：逆プライマー （xi）配列： AGTTCTGCAG TACCGGATTT GC
【００８２】（２４）配列番号：２３の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：４０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：細菌 （Ｂ）株：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicilli
n-resistant S.aureus) （Ｃ）個体単離コロニー名：ｍｅｃＡ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：前進プライマー （xi）配列： AGTCGGTTAC TTGTTGACAC AAAATCGATG GTAAAGGTTG
n-resistant S.aureus) （Ｃ）個体単離コロニー名：ｍｅｃＡ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：前進プライマー （xi）配列： AGTCGGTTAC TTGTTGACAC AAAATCGATG GTAAAGGTTG
【００８３】（２５）配列番号：２４の情報： （ｉ）配列の特色： （Ａ）長さ：４０塩基対 （Ｂ）型：核酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖状 （ii）分子の型：ゲノムＤＮＡ （iii) ハイポセティカル：ＮＯ （iv）アンチセンス：ＮＯ （vi）起源： （Ａ）生物名：細菌 （Ｂ）株：メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（methicilli
n-resistant S.aureus) （Ｃ）個体単離コロニー名：ｍｅｃＡ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：逆プライマー （xi）配列： GCTGGGGGAG GAGATTAGAC AGTTCTGCAG TACCGGATTT
n-resistant S.aureus) （Ｃ）個体単離コロニー名：ｍｅｃＡ遺伝子 （viii）ゲノム中の位置： （Ａ）染色体セグメント：逆プライマー （xi）配列： GCTGGGGGAG GAGATTAGAC AGTTCTGCAG TACCGGATTT
【図１】本発明で形成される、標識された標的アナライ
ト特異的および増殖媒体混合物の平面図。
ト特異的および増殖媒体混合物の平面図。
【図２】図２は、図１と同様の平面図であるが、測定さ
れる試料中の標的アナライトの存在のために、混合物中
の種々の程度に局所的に強く標識された部分の形成を示
す。
れる試料中の標的アナライトの存在のために、混合物中
の種々の程度に局所的に強く標識された部分の形成を示
す。
【図３】図３は、図１と同様の平面図であるが、測定さ
れる試料中の標的アナライトの存在のために、混合物中
の種々の程度に局所的に強く標識された部分の形成を示
す。
れる試料中の標的アナライトの存在のために、混合物中
の種々の程度に局所的に強く標識された部分の形成を示
す。
【図４】試料から出るシグナル強度レベルを自動シグナ
ル検出装置で走査したもののトレースの絵グラフ。
ル検出装置で走査したもののトレースの絵グラフ。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:32） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:445） (72)発明者 スチーブン シー． ワードロウ アメリカ合衆国 コネチカット州，オール ド セイブルック，ノース コウブ ロー ド 191
Claims (24)
- 【請求項１】 検体試料中の標的ヌクレオチド配列アナ
ライト（標的アナライト）の有無を測定するための集合
体であって、 ａ）検体試料を導入することができ、コロニーを産生す
るのに必要な程度までの標的アナライトの増幅を支持す
るが、媒体内に形成される増幅された任意の標的アナラ
イトのコロニーの移動を制限するように機能する、媒
体、 ｂ）検体試料中に存在するかも知れない任意の標的アナ
ライトのコロニーを選択的に増幅しかつ形成するように
機能する、媒体中の標的アナライト特異的増幅試薬、お
よび ｃ）媒体中に形成されるかも知れない任意の増幅された
標的アナライトのコロニーを区別できるように強調する
のに必要な程度に、媒体中を移動することができる、標
的アナライトに結合する標識されたアナライト特異的物
質（ＬＡＳＭ）、を含む、上記集合体。 - 【請求項２】 ＬＡＳＭは、媒体中に本質的に均一に分
布し、媒体中に高強度標識された標的アナライトのコロ
ニー領域を形成できるように媒体中で充分に運動性であ
り、この領域は媒体中で低強度標識ゾーンにより囲まれ
る、請求項１に記載の集合体。 - 【請求項３】 ＬＡＳＭは、標的アナライトに相補的な
人工の標的アナライト特異的ヌクレオチド配列である、
請求項１に記載の集合体。 - 【請求項４】 ＬＡＳＭは、標的アナライト中に挿入さ
れることができる挿入物質である、請求項１に記載の集
合体。 - 【請求項５】 増幅試薬は、ポリメラーゼ連鎖反応試薬
である、請求項１に記載の集合体。 - 【請求項６】 増幅試薬は、鎖置換増幅法試薬である、
請求項１に記載の集合体。 - 【請求項７】 検体試料中の２つまたはそれ以上の異な
る標的ヌクレオチド配列アナライト（標的アナライト）
の有無を測定するための集合体であって、 ａ）検体試料を導入することができ、コロニーを産生す
るのに必要な程度までの標的アナライトの増幅を支持す
るが、媒体内に形成される任意の増幅された標的アナラ
イトのコロニーの移動を制限するように機能する、媒
体、 ｂ）検体試料中に含有されるかも知れない任意の標的ア
ナライトのコロニーを選択的に増幅しかつ形成するよう
に機能する、媒体中の標的アナライト特異的増幅試薬、
および ｃ）媒体中に形成されるかも知れない任意の増幅された
標的アナライトのコロニーを区別できるように強調する
のに必要な程度に、区別できるように標識されており媒
体中を移動することができ、そのため媒体中で形成され
る１つの標的アナライトの任意のコロニーが、媒体中で
形成される別の標的アナライトの任意のコロニーから区
別される、標的アナライトに選択的に結合する標識され
たアナライト特異的物質（ＬＡＳＭ）、を含む、上記集
合体。 - 【請求項８】 ＬＡＳＭは、媒体中に本質的に均一に分
布し、媒体中で高強度標識された標的アナライトのコロ
ニー領域を形成できるように媒体中で充分に運動性であ
り、この領域は媒体中で低強度標識ゾーンにより囲まれ
る、請求項７に記載の集合体。 - 【請求項９】 ＬＡＳＭは、各標的アナライトに相補的
なそれぞれ区別できるように標識された人工のヌクレオ
チド配列を含む、請求項７に記載の集合体。 - 【請求項１０】 増幅試薬は、ポリメラーゼ連鎖反応試
薬である、請求項７に記載の集合体。 - 【請求項１１】 増幅試薬は、鎖置換増幅法試薬であ
る、請求項７に記載の集合体。 - 【請求項１２】 検体試料中の標的ヌクレオチド配列
（標的アナライト）の有無を測定するための方法であっ
て、 ａ）分析される検体試料を提供し、 ｂ）標的アナライト特異的増幅物質を含有する、検体試
料の導入に適した試験媒体を提供し、 ｃ）検体試料中に含有されているかも知れない標的生物
から任意の標的アナライトを放出させ、 ｄ）放出された任意の標的アナライトを媒体中で標的ア
ナライト増幅物質と反応させて、標的アナライトの本質
的に非運動性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、そし
て ｅ）媒体中で形成された任意の標的アナライトのコロニ
ー中で、増幅された標的アナライト単位と結合する標識
されたアナライト特異的物質（ＬＡＳＭ）に、放出され
た標的アナライトを反応させることにより、残りの媒体
から標的アナライトのコロニーを区別できるように強調
させる、ことを含む、上記方法。 - 【請求項１３】 ＬＡＳＭは、増幅された標的アナライ
ト単位と反応する前に、媒体中に本質的に均一に分散さ
れる、請求項１２に記載の方法。 - 【請求項１４】 検体試料中の２つまたはそれ以上の標
的ヌクレオチド配列（標的アナライト）の有無を測定す
るための方法であって、 ａ）分析される検体試料を提供し、 ｂ）各標的アナライトに対して選択的に特異的な標的ア
ナライト増幅物質を含有する、検体試料の導入に適した
試験媒体を提供し、 ｃ）検体試料中に含有されているかも知れない標的生物
から任意の標的アナライトを放出させ、 ｄ）放出された任意の標的アナライトを媒体中で標的ア
ナライト増幅物質と反応させて、標的アナライトの本質
的に非運動性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、そし
て ｅ）媒体中で形成されたコロニー中の任意の標的アナラ
イトと選択的に結合する標識されたアナライト特異的物
質（ＬＡＳＭ）に、コロニー中の増幅された標的アナラ
イト単位を反応させることにより、残りの媒体から形成
された標的アナライトのコロニーを区別できるように強
調させ、こうして標的アナライトの１つから構成される
任意の増幅された標的アナライトのコロニーは、標的ア
ナライトの別の１つから構成される増幅された標的アナ
ライトのコロニーから区別できるように強調する、こと
を含む、上記方法。 - 【請求項１５】 ＬＡＳＭは、各１つの標的アナライト
に相補的な、それぞれ区別できるように標識された人工
ヌクレオチド配列を含む、請求項１４に記載の方法。 - 【請求項１６】 検体試料中の標的ヌクレオチド配列
（標的アナライト）を定量するための方法であって、 ａ）一定量の分析される検体試料を提供し、 ｂ）標的アナライト特異的増幅物質を含有する、検体試
料の導入に適した試験媒体を提供し、 ｃ）一定量の検体試料中に含有されているかも知れない
標的生命体から任意の標的アナライトを放出させ、 ｄ）放出された任意の標的アナライトを媒体中で標的ア
ナライト特異的増幅物質と反応させて、標的アナライト
の本質的に非運動性の増幅コロニーを媒体中で形成さ
せ、 ｅ）媒体中で形成された標的アナライトコロニー中の標
的アナライト単位と結合する標識されたアナライト特異
的物質（ＬＡＳＭ）に、任意の増幅された標的アナライ
ト単位を反応させることにより、媒体中で区別できるよ
うに強調された標的アナライトのコロニー領域を形成さ
せ、そして ｆ）媒体中の強調された増幅された標的アナライトのコ
ロニー領域の数を計測して、単位量の試料当たりの標的
アナライトの濃度を得ることを含む、上記方法。 - 【請求項１７】 試料中の核酸配列の増幅されたコロニ
ーのパーセント、および／または標的アナライトを含有
する試料中のその場で溶解された生物または細胞のパー
セントを測定することを含む、請求項１６に記載の方
法。 - 【請求項１８】 検体試料中の２つまたはそれ以上の標
的ヌクレオチド配列（標的アナライト）を定量するため
の方法であって、 ａ）一定量の分析される検体試料を提供し、 ｂ）標的アナライト特異的増幅物質を含有する、検体試
料の導入に適した試験媒体を提供し、 ｃ）一定量の検体試料中に含有されているかも知れない
標的生命体から任意の標的アナライトを放出させ、 ｄ）放出された任意の標的アナライトを媒体中で配列増
幅物質と反応させて、標的アナライトの本質的に非運動
性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、そして ｅ）媒体中で形成された増幅された標的アナライト単位
と選択的に結合する標識されたアナライト特異的物質
（ＬＡＳＭ）に、コロニー中の増幅された標的アナライ
ト単位を反応させることにより、増幅された標的アナラ
イトコロニーを残りの媒体から区別できるように強調さ
せ、こうして標的アナライトの１つから構成される増幅
された標的アナライトのコロニーは、標的アナライトの
別の１つから構成される増幅されたコロニーから区別で
きるように強調され、そして ｆ）媒体中の区別できるように強調された増幅された標
的アナライトのコロニー領域の各々の数を計測して、媒
体中で現れる各標的アナライトの単位量の試料当たりの
標的アナライトの濃度を得ることを含む、上記方法。 - 【請求項１９】 検体試料中の標的ヌクレオチド配列
（標的アナライト）の有無を測定するための方法であっ
て、 ａ）遊離の標的アナライトを含有することが疑われる、
分析される検体試料を提供し、 ｂ）標的アナライト特異的増幅物質を含有する、検体試
料の導入に適した試験媒体を提供し、 ｃ）遊離の標的アナライトを媒体中で標的アナライト特
異的増幅物質と反応させて、標的アナライトの本質的に
非運動性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、そして ｅ）媒体中で形成された標的アナライトのコロニー中の
増幅された標的アナライト単位と結合する標識されたア
ナライト特異的物質（ＬＡＳＭ）に、任意の標的アナラ
イトを反応させることにより、残りの媒体から標的アナ
ライトのコロニーを区別できるように強調させる、こと
を含む、上記方法。 - 【請求項２０】 検体試料中の２つまたはそれ以上の標
的ヌクレオチド配列（標的アナライト）の有無を測定す
るための方法であって、 ａ）遊離の標的アナライトを含有することが疑われる、
分析される検体試料を提供し、 ｂ）各標的アナライトに対して選択的に特異的な標的ア
ナライト増幅物質を含有する、検体試料の導入に適した
試験媒体を提供し、 ｃ）遊離の標的アナライトを媒体中で標的アナライト増
幅物質と反応させて、標的アナライトの本質的に非運動
性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、そして ｄ）媒体中で形成されたコロニー中の任意の標的アナラ
イトと選択的に結合する標識されたアナライト特異的物
質（ＬＡＳＭ）に、コロニー中の任意の増幅された標的
アナライト単位を反応させて、残りの媒体から形成され
た標的アナライトのコロニーを区別できるように強調さ
せることにより、標的アナライトの１つから構成される
任意の増幅された標的アナライトのコロニーは、標的ア
ナライトの別の１つから構成される増幅された標的アナ
ライトのコロニーから区別できるように強調される、こ
とを含む、上記方法。 - 【請求項２１】 検体試料中の標的ヌクレオチド配列
（標的アナライト）を定量するための方法であって、 ａ）遊離の標的アナライトを含有することが疑われる、
分析される検体試料を提供し、 ｂ）標的アナライト特異的増幅物質を含有する、検体試
料の導入に適した試験媒体を提供し、 ｃ）遊離の標的アナライトを媒体中で標的アナライト特
異的増幅物質と反応させて、標的アナライトの本質的に
非運動性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、 ｅ）媒体中で形成された任意の標的アナライトのコロニ
ー中の標的アナライト単位と結合する標識されたアナラ
イト特異的物質（ＬＡＳＭ）に、増幅された標的アナラ
イトを反応させることにより、残りの媒体から標的アナ
ライトのコロニーを区別できるように強調させ、そして ｆ）媒体中の強調された増幅された標的アナライトのコ
ロニー領域の数を計測して、単位量の試料当たりの標的
アナライトの濃度を得る、ことを含む、上記方法。 - 【請求項２２】 検体試料中の標的ヌクレオチド配列ア
ナライト（標的アナライト）の有無を測定するための集
合体であって、 ａ）検体試料を導入することができ、コロニーを産生す
るのに必要な程度まで標的アナライトの増幅を支持する
が、媒体内に形成される増幅された任意の標的アナライ
トのコロニーの移動を制限するように機能する、媒体、 ｂ）検体試料中に存在するかも知れない任意の標的アナ
ライトのコロニーを選択的に増幅しかつ形成するように
機能する、媒体中の標的アナライト特異的増幅試薬、お
よび ｃ）媒体中に形成されるかも知れない増幅された標的ア
ナライトのコロニーを区別できるように強調するのに必
要な程度に、媒体中を移動することができる、標的アナ
ライトに結合する検出可能な物質、を含む、上記集合
体。 - 【請求項２３】 検体試料中の標的ヌクレオチド配列
（標的アナライト）の有無を測定するための方法であっ
て、 ａ）分析される検体試料を提供し、 ｂ）標的アナライト特異的増幅物質を含有する、検体試
料の導入に適した試験媒体を提供し、 ｃ）検体試料中に含有されているかも知れない標的生物
から任意の標的アナライトを放出させ、 ｄ）放出された任意の標的アナライトを媒体中で標的ア
ナライト増幅物質と反応させて、標的アナライトの本質
的に非運動性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、そし
て ｅ）媒体中で形成された任意の標的アナライトのコロニ
ー中で、増幅された標的アナライト単位と結合する検出
可能な物質に、放出された標的アナライトを反応させる
ことにより、残りの媒体から標的アナライトのコロニー
を区別できるように強調させる、ことを含む、上記方
法。 - 【請求項２４】 検体試料中の標的ヌクレオチド配列
（標的アナライト）の有無を測定するための方法であっ
て、 ａ）遊離の標的アナライトを含有することが疑われる、
分析される検体試料を提供し、 ｂ）標的アナライト特異的増幅物質を含有する、検体試
料の導入に適した試験媒体を提供し、 ｃ）遊離の標的アナライトを媒体中で標的アナライト特
異的増幅物質と反応させて、標的アナライトの本質的に
非運動性の増幅コロニーを媒体中で形成させ、そして ｅ）媒体中で形成された任意の標的アナライトのコロニ
ー中の増幅された標的アナライト単位と結合する検出可
能な物質に、任意の標的アナライトを反応させることに
より、残りの媒体から標的アナライトのコロニーを区別
できるように強調させる、ことを含む、上記方法。
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