CN1209546A - 利用空间定域的靶分析物复制检测和量化在样品中核苷酸序列靶分析物 - Google Patents

利用空间定域的靶分析物复制检测和量化在样品中核苷酸序列靶分析物 Download PDF

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Abstract

通过用物质(如生物学或环境物质)样品接种培养基测定可在该物质中发现的靶分析物。靶分析物是可疑有机体的RNA或DNA的单一核苷酸序列或任何核苷酸靶或其核苷酸序列的组合,该有机体可在该物质中发现。培养基含有选择的靶分析物扩增物,该扩增物导致存在于该物质中的任何靶分析物的扩增。

Description

利用空间定域的靶分析物复制 检测和量化在样品中核苷酸序列靶分析物
本发明涉及用于检测在物质样品中靶分析物存在或缺乏的方法与随身用具；本发明还涉及当发现分析物存在于样品中时量化它的方法。所分析的样品可以是生物学物质；环境物质；食品物质；或某些可以携带靶分析物的其它物质。靶分析物是怀疑存在于所试验的物质中的特异性核苷酸序列。可疑有机体或靶序列的存在或缺乏可以通过用链置换扩增(SDA)或聚合酶链反应(PCR)试剂扩增靶分析物确定。如果RNA的核苷酸序列是靶分析物，同时使用了SDA或PCR试剂，在扩增步骤之前必须通过逆转录把RNA转变成DNA。另外，在某些情况下，靶分析物RNA扩增方法(如Qβ复制酶或RNA-X扩增)可以不转录而利用。分析可在凝胶或半固体培养基中进行(这种培养基使得靶分析物可以扩增，但是限制扩增的靶分析物的迁移以便扩增产物在培养基中形成静止的可检测的靶分析物菌落。菌落可通过各种技术检测和计算，包括可检测的SDA或PCR引物的利用；或靶分析物-互补特异性核苷酸序列；或可检测的插层探针(如溴化乙锭、吖啶橙、SYBR绿以及相关产品)的利用。这样的探针可由Eugene分子探针公司(俄勒冈)提供。
样品中靶细菌分析物存在或缺乏的分析(其中所说的样品置于无菌生长培养基上)是熟知的。各种细菌可以以这种方式在水、食物、生物样品(如尿、脑脊髓液、肋膜液、腹水、关节液、粪等)中检测到。这一试验方法依赖于靶分析物在生长培养基中复制到可以观察到靶分析物的可见菌落的程度的能力。可以有差别地标记细菌的各种类型以帮助区别在培养基中生长的不同细菌菌落。当使用这一分析方法时，可以形成可检测的菌落所必需的时间可以短至一天而长至几周。
J.L.Burg等描述了通过Qβ复制酶扩增的RNA的快速荧光检测方法，分析生物化学，vol.230(pp263-272)1995，学院出版公司。前述的检测方法是非特异性的并需要大量的样品制剂以适当地起作用。另外，Burg等人的方法不能用于检测在样品中的DNA，并且不能在一次检测一个以上的RNA靶。任何扩增的RNA的量化是方法开端和样品容器中可检测的荧光存在之间的时间延迟的函数。
能够在一次试验中检测一种或多种可复制的靶核苷酸序列分析物的存在或缺乏并在短时间内量化靶分析物是十分需要的。能够检测不能在非细胞系统中复制的有机体并检测DNA基因组(认为以多生命形式存在)也是十分需要的。
本发明涉及用于检测在物质样品中靶分析物存在或缺乏的方法与随身用具。核苷酸靶的检测通过在合适的粘性培养基中扩增DNA或RNA序列的一个独特的部分以在培养基中形成扩增的核苷酸序列的相对静止的菌落，然后检测并计数可在培养基中形成的任何形成的核苷酸序列菌落来完成。这样，所检测的靶分析物是扩增的核苷酸序列或可疑生命形式的序列。在培养基中散布所形成的靶分析物菌落相对于标记或探针试剂的散布是有限的。
培养基含有或结合靶分析物特异性引物和合适的酶与试剂，这些酶与试剂引起在靶分析物DNA或RNA中特定的核苷酸序列的扩增，使用的方法是链置换扩增(SDA)或聚合酶链反应(PCR)或任何其它扩增的方法如单一引物或无引物3SR，在某些情况下是Qβ复制酶RNA扩增。在某些情况下，可以在实施本发明时利用在PCR技术(用于DNA扩增的原理和扩增，Ehrlich,H.A.ed.1989,Stockton出版社，纽约)中描述的其它扩增方法。结果是在培养基中创造了特定核苷酸序列的局部高密度群体菌落。在样品中包含并被引入培养基、并且不通过扩增步骤复制的非靶基因组片段不成倍增加，它们也不能检测。分析可在含有或结合一种或多种标记的分析物特异性物质(LASMs)的培养基中完成。LASMs包括这样的合成核苷酸序列，它互补于形成靶分析物的特异性核苷酸序列的部分，这样就扩增了特异性核苷酸序列。标记可以是游离染料或荧光团，或连接到互补的合成核苷酸序列上的物质。LASMs最初均匀地分布在整个培养基中。LASMs，遵循在培养基中的散布规律，通过培养基向扩增的核苷酸序列菌落迁移，并结合到这些核苷酸序列上，由此有差别地突出相对于培养基其余部分的菌落。由于LASMs朝着菌落的局部迁移，会在每个菌落的周围形成低强度标记的晕轮，并且在每个晕轮的中心将是相应于标记的菌落的高强度的峰。存在于培养基中的DNA或RNA的未扩增分子由于其低浓度是不可检测的(即使在用吖啶橙、溴化乙锭或其它染料染色后)。在某些情况下，标记可以连接到用于PCR或SDA扩增的一个或两个寡核苷酸引物上。在这些情况下，引物起LASMs的作用。信号强度的动力学研究的利用可以使非特异性背景信号无效，如可以由细胞碎片引起，因为这样的非特异性背景信号不随扩增显著地增加。
当样品进行仅一种靶分析物的存在或缺乏的测定时，菌落可以通过DNA或RNA的非特异性染色(如吖啶橙或溴化乙锭)检测。这样的原因是这些荧光团可以非特异性地插入任何扩增的核苷酸序列，当这样产生时，特异性通过扩增引物的特异性达到而无须把荧光团与互补核苷酸序列连接。在测定一个以上靶分析物的样品的情况下，则一个以上互补核苷酸序列可以连接到一种或多种不同的荧光团上以突出任何扩增的在培养基中形成的核苷酸序列菌落并确定它们的类型。多达二十一种不同的靶分析物可以通过使用携带多达三个有差别的可检测的荧光团的LASM在单一测定或分析中检测。
在进行本发明的分析中，重要的是所选择的靶分析物DNA或RNA的扩增的核苷酸序列具有这样的大小，即大约150mer至大约500mer，以便这样的拷贝不能在培养基之内迅速迁移，这样在分析过程期间在培养基之内将保持相对静止。同样重要的是，所选择的LASMs具有这样的大小，即大约18mer至大约40mer，以便足够地小以使它们在培养基之内能够比扩增的靶分析物序列更迅速地扩散，并足够地长以具有对扩增的核苷酸序列的必要的特异性。理想地是，可以利用大约18mer的LASM。另外，针对扩增的靶分析物中的不同核酸序列的适当大小的两个或多个LASMs可用于提高的特异性。当然，培养基也必须具有这样的类型以使包括探针的扩增试剂可在培养基内足够快地扩散以使得扩增比这样扩增的产物更迅速地从菌落扩散开。
样品通过首先溶解其所有细胞和有机体组分以把所有样品的细胞和有机体组分的基因物质释放进溶液制备用于分析，参见：Maniatis,T.,Fritsch,E.F.和Sambrook,J.(1987)分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港出版社。然后把溶解的样品的富含核苷酸的已知体积的等分试样引入培养基并均匀分布在培养基上。如果必要，靶分析物扩散进培养基可由垂直电泳和/或在分析之前通过限制消化或机械剪切减少其大小扩大。这样，样品的靶组分的遗传物质DNA和/或RNA在培养基中接触扩增物质。这样，在接触的基因物质上的靶核苷酸序列扩增到靶分析物的拷贝的菌落在培养基上形成的程度。因为靶分析物的大小以及拷贝的大小比较大，扩增的靶分析物菌落将相对静止地保持在培养基上。LASMs(如果在培养基中不预先掺入)在扩增步骤之后添加至培养基中，并且比较均匀地分布。测定了LASMs的大小以能够迁移入或通过培养基。因此，LASMs迁移至靶分析物菌落并结合至靶分析物菌落中的拷贝上。这一结合将使菌落发射比培养基周围区更高水平的标记信号，事实上，接触菌落的就近围绕区发射削弱标记的信号。净结果是在培养基中由“模糊”晕轮围绕的“亮点”。最后，在样品中没有任何靶分析物存在，培养基保持标记信号发射的比较平坦的水平，并将看来均匀“着色”。包含荧光团的互补核苷酸结合到它们各自的靶分析物的检测也可以通过时间分辨荧光完成(如美国专利5,485,530,Lokowicz等所述)。如果需要，样品在细胞裂解前可施用于培养基以确定相对于细胞核苷酸的靶的定域，即确定靶是在胞内还是在胞外。如果需要，LASMs以及其它扩增需要的试剂可浸渗在固相支持体上，如尼龙膜或纸带，并允许通过把膜放置于培养基的顶端而扩散进培养基。
测定可以在通过在培养基中产生靶分析物的拷贝用样品接种培养基之后在几个小时之内完成。在任何细胞类型或样品中存在的病毒、细菌、真菌、支原体、原生动物或特异性核苷酸可以通过利用特异性核苷酸序列扩增和本发明的检测方法测定，并且，由于人们知道添加至培养基的样品体积，通过计算在培养基中的突出的菌落的数量，人们可检测每单位体积样品的靶分析物的量，这样使靶分析物的样品能够获得定量分析。
培养基的一部分用不包含已知的靶核苷酸的对照样品接种，但完全如已知样品那样进行处理和制备。培养基的这一部分可作为阴性对照。最后，扩增标记的菌落在培养基的阴性对照区中形成，人们可以推测培养基或扩增或溶解试剂或所有部分的沾染，测定的结果无效。培养基的另一部分通过在进行试验时施用包含已知量的靶分析物的样品也可以隔离并作为阳性对照。如果培养基的阳性对照区不能具有菌落的适当数量与类型，测定的扩增和/或检测步骤不能正确起作用，测定无效。
因此，提供可以用来测定样品中靶分析物存在或缺乏的方法与仪器是本发明的目的。
本发明的另一个目的是提供描述的特性的方法与仪器，其中所说的样品放置在与靶分析物特异性标记物质(可以在培养基之内迁移)结合的培养基上。
本发明的另一个目的是提供描述的特性的方法与仪器，其中所说的靶分析物是特性核苷酸序列或来自生命形式的RNA或DNA的序列。
本发明的另一个目的是提供描述的特性的方法与仪器，其中所说的靶分析物通过形成其扩增菌落并有区别地标记任何扩增的菌落(在培养基中形成)检测。
本发明的这些和其它目的及优点在结合附图时从下列本发明的详细描述更容易看出，其中：
图1是按照本发明形成的标记的靶分析物特异性与生长培养基混合物的平面图观；
图2和3是类似于图1的平面图观，但是显示了由于在测定的样品中靶分析物的存在在混合物中形成不同程度的局部强度标记区；
图4是从样品发出的信号强度水平的图象扫迹，样品通过自动信号检测仪器扫描。
实施本发明的详尽的实施例
现在参考图1，显示的是培养基矩形部分的平面图观，通常由数字2表示，这适合于进行本发明的方法。当在样品中没有任何靶分析物存在时，如在图1中显示的培养基区域阴暗均匀以表明均匀分布的标记信号发射，该发射在培养基用样品接种之前或在样品引入和温育之后由人眼或扫描仪检测。在培养基2中的区3是不接触测定样品的区，但是该区含有所有用于试验的试剂并因此作为阴性对照区。在图1中的区5是也含有所有用于试验的试剂的区。区5不接触样品，但是接触含有已知浓度的靶分析物的阳性对照溶液。当靶分析物在样品中存在时，图2和3是在培养基2中的发射方式变化的说明。图2显示了在产生许多更高度标记的菌落4(在培养基2中由低水平标记的晕轮6围绕)的样品中比较低水平的靶分析物的结果。图3显示了在样品中存在比较高水平的靶分析物的结果。从图2和3注意到：人们可以对菌落4计数，并且由于样品接种物的体积和培养基2的区域大小已知，人们可以通过本发明的方法得出每单位体积靶分析物的浓度。从图2和3还可注意到：阳性对照区5具有相同数量的菌落，而与在培养基2的其余部分中形成的菌落的数量无关。
图4是标记的发射强度的图形，该标记可由自动分析仪器检测(当它进行培养基的线形扫描时)。扫迹8代表培养基本身的发射水平；下沉10代表在晕轮6中低水平的发射；峰12代表菌落4中的高水平发射。
下列是可以利用本发明的技术检测的可疑有机体特异性的靶分析物的实施例以及用于检测每个靶分析物的试剂。
实施例1
可以利用本发明的技术检测和量化的一个有机体是HIV-1病毒。用于检测HIV-1的靶分析物基因是病毒聚合酶，其功能是病毒基因组的复制。(可以注意到：聚合酶基因仅是可以以这一方法检测的几个HIV-1基因之一。事实上，同时量化两个HIV-1基因(例如，聚合酶和蛋白酶)的浓度的方案对极少数假阳性结果是敏感的，因为聚合酶对蛋白酶的比是相对恒定的。)可以利用PCR来扩增病毒聚合酶基因的正向引物是：
GCACTTTAAATTTTCCCATTAGTCC；
反向引物是：
CCTGCGGGATGTGGTATTCC。
如果利用独立的LASM，它互补于上述正向引物或反向引物之间的某一区。互补核苷酸序列可以共价连接到提供必要的发射信号的荧光团上。在这种情况下，LASM应该在寡核苷酸3＇末端的核苷酸的3＇位置缺乏羟基基团以阻止一个LASM与另一个杂交形成的产物的扩增。如果不利用单个LASM，那么荧光团将连接到用于PCR的寡核苷酸引物的一个或两个的5＇端或一个或多个核苷酸间键上。所有引物和LASMs应该在寡核苷酸3＇末端的核苷酸的3＇位置缺乏羟基基团以阻止一个LASM与另一个杂交形成的产物的扩增。合适的培养基包括包含2.5至5.0％丙烯酰胺和0.025至2.5％双丙烯酰胺的丙烯酰胺凝胶；或0.5％琼脂糖；以及包含0.75至1.5％琼脂糖的标准的低熔点琼脂糖凝胶。如上所述，本发明的技术通过利用具有低凝胶百分比的培养基组合物优化，例如大约4至5％丙烯酰胺凝胶与2％或更少的琼脂糖。
以适当的PCR试剂浸渗的培养基可以制备如下。制备由20mM Tris，大约8.0的pH(在50mM EDTA中)组成的100ml洗涤溶液；由2mM Tris，大约8.0的pH(在0.5mM EDTA中)组成的10ml母液。在室温下把凝胶浸没在5ml的洗涤溶液中大约15分钟。这一步骤在新鲜的洗涤溶液中重复5次。然后把凝胶浸没在包含PCR引物、酶以及dNTPs等的5ml母液中。
对于用SDA方法的扩增，使用包含适当的限制酶切位点的相关引物。例如，可以通过SDA用来扩增病毒的聚合酶基因的正向引物是：
TTGAATAGTCGGTTACTTGTTGACACTCGGCACTTTAAAT；
反向引物是：
ACCGACTATTGTTGACACTGCCTGCGGGATGTGGTATTCC。
如果利用独立的LASM，它互补于前述正向或反向引物之间的某一区。基于寡核苷酸的LASM不应互补于前述正向或反向引物，但是互补于靶分子的一部分。这一作用特异地集中可检测试剂于分子菌落上，而不是集中于可游离地分布于整个培养基中的引物上。互补核苷酸序列可以共价地连接到一种或多种荧光团上，该荧光团提供了必要的发射信号。如果不利用独立的LASM，那么荧光团将连接到用于SDA的寡核苷酸引物的一个或两个的3＇端或一个或多个核苷酸间键上。
用适当的SDA试剂浸渗的培养基可以制备如下。制备由50mM磷酸钾(具有大约7.4的pH)和6mM MgCl2组成的100ml洗涤溶液；由洗涤溶液加SDA引物、适当的限制酶、外源Klenow聚合酶以及dNTPs组成的10ml母液。将凝胶浸没在5ml洗涤溶液中，在室温下保持大约15分钟。这一步骤在新鲜的洗涤溶液中重复5次。然后将凝胶浸没在5ml母液中。
LASM可以制备如下。对于染料异硫氰酸盐标记，互补核苷酸序列链含有携带附加的伯胺的一种或多种修饰碱基。将要标记的链溶解在pH9.0的0.1M碳酸氢钠中，将染料异硫氰酸盐以10mg/ml的浓度溶解在干DMF中。然后将染料溶液随搅拌滴加至互补核苷酸序列溶液中，反应在室温下温育12小时。然后通过凝胶过滤除去游离染料，通过凝胶电泳或HPLC纯化染料互补的核苷酸序列缀合物。对于染料琥珀酰亚胺酯标记，将要标记的互补核苷酸序列溶解在0.1M磷酸钠(pH8.0)中。互补核苷酸序列-标记缀合反应在4℃下进行以最小化琥珀酰亚胺酯标记的水解。各种染料标记的DNA可以由化学合成直接制备并广泛地用于DNA测序。
靶分析物可以以下列方式嵌入培养基中。大约2.5×107细胞的悬浮液从组织匀浆或培养物中制备，并在组织培养培养基(无胎牛血清)或等渗盐水中彻底洗涤。然后混合物在2,000g 4℃下离心20分钟，取出上清液，将包含核酸的沉淀完全排水。将细胞重新悬浮在5ml 50mM Tris(pH8.0)和50mM EDTA中并在-20℃下冻结。向冻结的溶液添加0.5ml溶菌酶溶液(在0.25M Tris(pH8.0)中的10mg/mL溶菌酶)，混合物在4℃下温育45分钟。添加1ml STEP溶液(0.5％十二烷基硫酸钠、50mM Tris(pH7.5)、0.4MEDTA、1mg/mL蛋白酶K(在利用之前添加)，溶液在50℃下温育一小时。添加6ml的缓冲酚，将乳状液在1,000g下离心15分钟。将上面的包含核酸的层转移到单独的试管中，添加0.1体积3M乙酸钠和2体积无水乙醇。包含DNA和RNA的沉淀重新溶解在5mL 50mM Tris(pH7.5)和1mM EDTA中。如果仅需要细胞DNA，可以添加200μg RNase。核酸可以直接施用于培养基，或它可以首先利用限制酶处理或用针剪切以减少它的平均大小。
靶分析物扩增PCR反应可以进行如下。将凝胶、样品、PCR和LASM混合物加热至95℃保持3分钟，然后加热至95℃30个循环保持45秒，在55℃下退火90秒并在72℃下每750个核苷酸延长1分钟。例如，如果扩增750个核苷酸长的靶，使得延长反应进行1分钟；另一方面，如果靶长375个核苷酸，使得延长进行30秒。反应在72℃下延长10分钟结束。然后检查培养基以确定在培养基中靶分析物菌落的存在或缺乏。
靶分析物扩增SDA反应可以进行如下。将凝胶、样品、SDA以及LASM混合物在37℃温育三十分钟至四小时。然后检查培养基以确定在培养基中靶分析物菌落的存在或缺乏。
实施例2
利用本发明的技术可以检测和量化的另一个靶分析物是M.tuberculosis。检测M.tuberculosis的靶基因是inhA，其功能是脂肪酸生物合成。用于通过PCR扩增的inhA的正向引物是：
ACCCAATCGAATTGCCACACCCCG；
反向引物是：
GGCGCGCGAGGCCGGCAAGTACGG。
这些引物扩增M.tuberculosis的inhA基因的279碱基对区。如果利用独立的LASM，它互补于前述正向或反向引物之间的某一区。基于寡核苷酸的LASM不应互补于前述正向或反向引物，但是互补于靶分子的一部分。这一作用特异地集中可检测试剂于分子菌落上，而不是集中于可游离地分布于整个培养基中的引物上。培养基与LASM制备过程基本上与实施例1提出的相同，引入方法也是这样。
对于通过SDA的inhA基因的扩增，正向引物是：
AGTCGGTTACTTGTTGACACTCGACCCAATCGAATTGCCA；
反向引物是：
ACCGACTATTGTTGACACTGCGCGAGGCCG GCAAGTACGG。
如果利用独立的LASM，它互补于前述正向或反向引物之间的某一区。培养基与LASM制备过程基本上与实施例1提出的相同，引入方法也是这样。
实施例3
可以通过利用本发明的技术检测和量化的另一个有机体是INH-抗性M.tuberculosis。用于检测INH-抗性M.tuberculosis的靶分析物基因是突变的inhA，其功能是脂肪酸生物合成。用于通过PCR扩增突变的inhA基因的正向引物是：
ACCCAATCGAATTGCCACACCCCG；
反向引物是：
GCCGATCGATGAACCCCGGAGGTTCC。
这些引物扩增在INH-抗性M.tuberculosis中的突变的inhA基因的159个碱基对区。如果利用独立的LASM，它互补于前述正向或反向引物之间的某一区。基于寡核苷酸的LASM不应互补于前述正向或反向引物，但是互补于靶分子的一部分。这一作用特异地集中可检测试剂于分子菌落上，而不是集中于可游离地分布于整个培养基中的引物上。培养基与LASM制备过程基本上与实施例1提出的相同，引入方法也是这样。
对于通过SDA的突变inhA基因的扩增，正向引物是：
AGTCGGTTACTTGTTGACACACCCAATCGAATTGCCACAC；
反向引物是：
ACCGACTATTGTTGACACTGCGATGAACCCCGGAGGTTCC。
如果利用独立的LASM，它互补于前述正向或反向引物之间的某一区。培养基与LASM制备过程基本上与实施例1提出的相同，引入方法也是这样。
实施例4
可以通过利用本发明的技术检测和量化的另一个有机体是HBV。用于检测HBV的靶分析物基因是pX基因，其功能是转录。用于通过PCR扩增pX基因的正向引物是：
GGTGAAGCGAAGTGCACACGGACCGGC；
反向引物是：
GCTGGGGGAGGAGATTAGGTTAAAGG。
这些引物扩增在HBV中的pX基因的196碱基对区。如果利用独立的LASM，它互补于前述正向或反向引物之间的某一区。基于寡核苷酸的LASM不应互补于前述正向或反向引物，但是互补于靶分子的一部分。这一作用特异地集中可检测试剂于分子菌落上，而不是集中于可游离地分布于整个培养基中的引物上。培养基与LASM制备过程基本上与实施例1提出的相同，引入方法也是这样。
对于通过SDA的HBV pX基因的扩增，正向引物是：
AGTCGGTTACTTGTTGACACGGTGAAGCGAAGTGCACACG；
反向引物是：
ACCGACTATTGTTGACACTGGCTGGGGGAGGAGATTAG。
如果利用独立的LASM，它互补于前述正向或反向引物之间的某一区。培养基与LASM制备过程基本上与实施例1提出的相同，引入方法也是这样。
实施例5
可以利用本发明的技术检测和量化的另一个有机体是Pneumocystiscarinii。用于检测Pneumocystis carinii的靶分析物基因是线粒体rRNA，其功能是蛋白质合成。用于Pneumocystis carinii线粒体rRNA基因扩增的正向引物是：
GATGGCTGTTTCCAAGCCCA；
反向引物是：
GTGTACGTTGCAAAGTACTC。
这些引物扩增在Pneumocystis carinii中的线粒体rRNA基因的344个碱基对区。如果利用独立的LASM，它互补于前述正向或反向引物之间的某一区。基于寡核苷酸的LASM不应互补于前述正向或反向引物，但是互补于靶分子的一部分。这一作用特异地集中可检测试剂于分子菌落上，而不是集中于可游离地分布于整个培养基中的引物上。培养基与LASM制备过程基本上与实施例1提出的相同，引入方法也是这样。
对于通过SDA的Pneumocystis carinii线粒体rRNA基因的扩增，正向引物是：
AGTCGGTTACTTGTTGACACGATGGCTGTTTCCAAGCCCA；
反向引物是：
ACGTGTACGTTGCAAAGTACGTGTACGTTGCAAAGTACTC。
如果利用独立的LASM，它互补于前述正向或反向引物之间的某一区。培养基与LASM制备过程基本上与实施例1提出的相同，引入方法也是这样。
实施例6
可以利用本发明的技术检测和量化的另一个有机体是甲氧西林抗性的S.aureus。用于检测甲氧西林抗性的S.aureus的靶分析物基因是青霉素结合蛋白。通过PCR扩增mecA基因的正向引物是：
AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC；
反向引物是：
AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC。
这些引物扩增mecA基因的533碱基对区。如果利用独立的LASM，它互补于前述正向或反向引物之间的某一区。基于寡核苷酸的LASM不应互补于前述正向或反向引物，但是互补于靶分子的一部分。这一作用特异地集中可检测试剂于分子菌落上，而不是集中于可游离地分布于整个培养基中的引物上。培养基与LASM制备过程基本上与实施例1提出的相同，引入方法也是这样。
对于通过SDA的mecA基因的扩增，正向引物是：
AGTCGGTTACTTGTTGACACAAAATCGATGGTAAAGGTTG；
反向引物是：
GCTGGGGGAGGAGATTAGACAGTTCTGCAGTACCGGATTT。
如果利用独立的LASM，它互补于前述正向或反向引物之间的某一区。培养基与LASM制备过程基本上与实施例1提出的相同，引入方法也是这样。
应该认识到：如果利用独立的LASM，它互补于前述正向或反向引物之间的某一区。可以借助于本发明分析的样品包括组织、血液、生物体液(如用于呼吸靶分析物的痰，用于肠靶分析物的粪便。实质上任何生命形式的存在或缺乏以及量化(包括但不限于原生动物、细菌、病毒、真菌等)可以通过利用本发明的技术在基本上任何样品中进行检测。同样，不同的生命形式(如病毒和细菌)可以在一个试验中检测和量化，该试验可通过按照本发明的方案在普通样品上进行。呼吸疾病、腹泻、生殖疾病以及许多其它疾病的完全不同的原因可以利用本发明的方法在单一试验中弄清楚。
核苷酸序列表(1)一般信息：
(ⅰ)申请人：
   (A)Levine,Robert A.；
   (B)Wardlaw,Stephen C.：
(ⅱ)发明名称：利用空间定域的靶分析物复制检测和量化在样品中核苷酸序列靶分析物
(ⅲ)序列数：24
(ⅳ)通信地址：
   (A)收信人：William W.Jones
   (B)街道：6 Juniper Lane
   (C)城市：Madison
   (D)州：CT
   (E)国家：美国
   (F)邮区代码：06443
(ⅴ)计算机可读形式
   (A)介质类型：软盘
   (B)计算机：Macintosh Performa 637CD
   (C)操作系统：Macintosh7.5
   (D)软件：ClarisWorks 2.1
(ⅵ)当前申请数据：
   (A)申请号：08/841,267
   (B)申请日期：1997年4月29日
   (C)分类号：435类
(ⅶ)现有申请数据：N/A
(ⅷ)律师/代理人信息：
   (A)姓名：William W.Jones
   (B)注册号：24,607
   (C)参考/档案号：UFB-001
(ⅸ)电讯信息：
   (A)电话：(203)2452418
   (B)传真：(203)2459294(2)关于SEQ ID No.1的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：25个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：病毒
   (B)菌株：HIV-1
   (C)个体分离物：聚合酶基因
(ⅷ)在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：正向引物
(ⅹⅰ)序列描述：
GCACTTTAAA TTTTCCCATT AGT CC(3)关于SEQ ID No.2的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：20个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：
   (A)描述：基因组DNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：病毒
   (B)菌株：HIV-1
   (C)个体分离物：聚合酶基因
(ⅷ)在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：正向引物
(ⅹⅰ)序列描述：
   CCTGCGGGAT GTGGTATTCC(4)关于SEQ ID No.3的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：40个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：病毒
   (B)菌株：HIV-1
   (C)个体分离物：聚合酶基因
(ⅷ)在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：正向引物
(ⅹⅰ)序列描述：
TTGAATAGTC GGTTACTTGT TGACACTCGG CACTTTAAAT(5)关于SEQ ID No.4的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：40个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：病毒
   (B)菌株：HIV-1
   (C)个体分离物：聚合酶基因
(ⅷ)在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：正向引物
(ⅹⅰ)序列描述：
ACCGACTATT GTTGACACTG CCTGCGGGAT GTGGTATTCC(6)关于SEQ ID No.5的信息：
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度： 24个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：细菌
   (B)菌株：M.tubercle bacilus
   (C)个体分离物：inhA基因
(ⅷ)在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：正向引物
(ⅹⅰ)序列描述：
ACCCAATCGA ATTGCCACAC CCC G(7)关于SEQ ID No.6的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：24个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：细菌
   (B)菌株：M.tubercle bacilus
   (C)个体分离物：inhA基因
(ⅷ)在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：反向引物
(ⅹⅰ)序列描述：
GGCGCGCGAG GCCGGCAAGT ACG G(8)关于SEQ ID No.7的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：40个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：细菌
   (B)菌株：M.tubercle bacilus
   (C)个体分离物：inhA基因
(ⅷ)在基因组中的位置：
(A)染色体节段：正向引物
(ⅹⅰ)序列描述：
AGTCGGTTAC TTGTTGACAC TCGACCCAAT CGAATTGCCA(9)关于SEQ ID No.8的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：40个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：细菌
   (B)菌株：M.tubercle bacilus
   (C)个体分离物：inhA基因
(ⅷ)在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：反向引物
(ⅹⅰ)序列描述：
ACCGACTATT GTTGACACTG CGCGAGGCCG GCAAGTACGG(10)关于SEQ ID No.9的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：24个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：细菌
   (B)菌株：M.tubercle bacilus
   (C)个体分离物：inhA基因
(ⅷ)在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：正向引物
(ⅹⅰ)序列描述：
ACCCAATCGA ATTGCCACAC CCC G；(11)关于SEQ ID No.10的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：26个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：细菌
   (B)菌株：INH-抗性M.tubercle bacilus
   (C)个体分离物：突变的inhA基因
(ⅷ)在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：反向引物
(ⅹⅰ)序列描述：
GCCGATCGAT GAACCCCGGA GGT TCC(12)关于SEQ ID No.11的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：40个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：细菌
   (B)菌株：INH-抗性M.tubercle bacilus
   (C)个体分离物：突变的inhA基因
(ⅷ)在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：正向引物
(ⅹⅰ)序列描述：
AGTCGGTTAC TTGTTGACAC ACCCAATCGA ATTGCCACAC(13)关于SEQ ID No.12的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：40个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：细菌
   (B)菌株：INH-抗性M.tubercle bacilus
   (C)个体分离物：突变的inhA基因
(ⅷ)在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：反向引物
(ⅹⅰ)序列描述：
ACCGACTATT GTTGACACTG CGATGAACCC CGGAGGTTCC(14)关于SEQ ID No.13的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：27个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：病毒
   (B)菌株：HBV
   (C)个体分离物：pX基因
(ⅷ)在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：正向引物
(ⅹⅰ)序列描述：
GGTGAAGCGA AGTGCACACG GAC CGG C(15)关于SEQ ID No.14的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：26个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：病毒
   (B)菌株：HBV
   (C)个体分离物：pX基因
(ⅷ)在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：反向引物
(ⅹⅰ)序列描述：
GCTGGGGGAG GAGATTAGGT TAA AGG(16)关于SEQ ID No.15的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：40个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：病毒
   (B)菌株：HBV
   (C)个体分离物：pX基因
(ⅷ)在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：正向引物
(ⅹⅰ)序列描述：
AGTCGGTTAC TTGTTGACAC GGTGAAGCGA AGTGCACACG(17)关于SEQ ID No.16的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：38个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：病毒
   (B)菌株：HBV
   (C)个体分离物：pX基因
(ⅷ)在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：反向引物
(ⅹⅰ)序列描述：
ACCGACTATT GTTGACACTG GCTGGGGGAG GAG ATT AG(18)关于SEQ ID No.17的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：20个碱基
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组RNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：原生动物
   (B)菌株：Pneumocystis carinii
   (C)个体分离物：线粒体rRNA
(ⅷ)在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：正向引物
(ⅹⅰ)序列描述：
GATGGCTGTT TCCAAGCCCA(19)关于SEQ ID No.18的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：20个碱基
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组RNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：原生动物
   (B)菌株：Pneumocystis carinii
   (C)个体分离物：线粒体rRNA
(ⅷ)在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：反向引物
(ⅹⅰ)序列描述：
GTGTACGTTG CAAAGTACTC(20)关于SEQ ID No.19的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：40个碱基
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组RNA
(ⅲ )假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：原生动物
   (B)菌株：Pneumocystis carinii
   (C)个体分离物：线粒体rRNA
(ⅷ)在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：正向引物
(ⅹⅰ)序列描述：AGTCGGTTAC TTGTTGACAC GATGGCTGTT TCCAAGCCCA(21)关于SEQ ID No.20的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：40个碱基
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组RNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：原生动物
   (B)菌株：Pneumocystis carinii
   (C)个体分离物：线粒体rRNA
(ⅷ)在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：反向引物
(ⅹⅰ)序列描述：
ACGTGTACGT TGCAAAGTAC GTGTACGTTG CAAAGTACTC(22)关于SEQ ID No.21的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：22个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：细菌
   (B)菌株：甲氧西林-抗性S.aureus
   (C)个体分离物：mecA基因
(ⅷ)在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：正向引物
(ⅹⅰ)序列描述：
AAAATCGATG GTAAAGGTTG GC(23)关于SEQ ID No.22的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：22个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：细菌
   (B)菌株：甲氧西林-抗性S.aureus
   (C)个体分离物：mecA基因
(ⅷ )在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：反向引物
(ⅹⅰ)序列描述：
AGTTCTGCAG TACCGGATTT GC(24)关于SEQ ID No.23的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：40个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：细菌
   (B)菌株：甲氧西林-抗性S.aureus
   (C)个体分离物：mecA基因
(ⅷ)在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：正向引物
(ⅹⅰ)序列描述：
AGTCGGTTAC TTGTTGACAC AAAATCGATG GTAAAGGTTG(25)关于SEQ ID No.24的信息；
(ⅰ)序列特征：
   (A)长度：40个碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：单链
   (D)拓扑结构：线型
(ⅱ)分子类型：基因组DNA
(ⅲ)假设：无
(ⅳ)反义：无
(ⅵ)原始来源：
   (A)有机体：细菌
   (B)菌株：甲氧西林-抗性S.aureus
   (C)个体分离物：mecA基因
(ⅷ)在基因组中的位置：
   (A)染色体节段：反向引物
(ⅹⅰ)序列描述：GCTGGGGGAG GAGATTAGAC AGTTCTGCAG TACCGGATTT
因为本发明的公开的实施方案的许多变化与改变可以在不背离本发明构思的情况下进行，不打算以其它方式限制所附的权利要求要求的本发明。

Claims (24)

1．用于确定在样品中靶核苷酸序列分析物(靶分析物)的存在或缺乏的装配，所说的装配包含：
a)样品可以引入的培养基，该培养基可操作地支持把靶分析物扩增至需要由此产生其菌落的程度，而同时限制在培养基之内形成的任何扩增的靶分析物菌落的迁移；
b)在所说的培养基中的靶分析物特异性扩增试剂，所说的扩增试剂可操作地有选择扩增并形成可在样品中存在的任何靶分析物的菌落；和
c)标记的分析物特异性的物质(LASM)，该物质结合所说的靶分析物，所说的LASM能够通过所说的培养基迁移至有差别地突出可在所说的培养基中形成的任何扩增的靶分析物菌落必要的程度。
2．权利要求1的装配，其中所说的LASM本质上均质地分布在整个所说的培养基中，并且在所说的培养基中是充分可动的以便能够在所说的培养基中形成高强度标记的靶分析物菌落区，该区由在所说的培养基中的较低强度标记的区围绕。
3．权利要求1的装配，其中所说的LASM是与所说的靶分析物互补的人工靶分析物特异性核苷酸序列。
4．权利要求1的装配，其中所说的LASM是插层剂，该插层剂可以插入所说的靶分析物。
5．权利要求1的装配，其中所说的扩增试剂是聚合酶链反应试剂。
6．权利要求1的装配，其中所说的扩增试剂是链置换扩增试剂。
7．用于确定在样品中两个或多个不同靶核苷酸序列分析物(靶分析物)的存在或缺乏的装配，所说的装配包含：
a)样品可以引入的培养基，该培养基可操作地支持把靶分析物扩增至需要由此产生其菌落的程度，而同时限制在培养基之内形成的任何扩增的靶分析物菌落的迁移；
b)在所说的培养基中的靶分析物特异性扩增试剂，所说的试剂可操作地有选择扩增并形成可包含在样品中的任何靶分析物的菌落；和
c)标记的分析物特异性的物质(LASMs)，该物质有选择地结合所说的靶分析物，所说的LASMs能够有差别地标记并能够通过所说的培养基迁移至突出可在所说的培养基中形成的任何扩增的靶分析物菌落必要的程度，由此形成的靶分析物之一的任何菌落与在所说的培养基中形成的另一个靶分析物的任何菌落区别开。
8．权利要求7的装配，其中所说的LASMs本质上均质地分布在整个所说的培养基中，并且在所说的培养基中是充分可动的以便能够在所说的培养基中形成高强度标记的靶分析物菌落区，该区由在所说的培养基中的较低强度标记的区围绕。
9．权利要求7的装配，其中所说的LASMs分别包含与所说的靶分析物之一各自互补的标记的人工核苷酸序列。
10．权利要求7的装配，其中所说的扩增试剂是聚合酶链反应试剂。
11．权利要求7的装配，其中所说的扩增试剂是链置换扩增试剂。
12．用于确定在样品中靶核苷酸序列分析物(靶分析物)的存在或缺乏的方法，所说的方法包括以下步骤：
a)提供将要分析的样品；
b)提供适于样品引入的试验培养基，所说的试验培养基包含靶分析物特异性扩增物质；
c)从靶有机体释放任何所说的靶分析物，所说的靶有机体可包含在样品中；
d)使任何释放的靶分析物在所说的培养基中与所说的靶分析物扩增物质反应以便在所说的培养基中形成所说的靶分析物的本质上稳定的扩增菌落；和
e)使任何释放的靶分析物与标记的分析物特异性物质(LASM)反应(该物质结合在所说的培养基中任何形成的靶分析物菌落中的扩增靶分析物单位)以从所说的培养基的其余部分有差别地突出所说的靶分析物菌落。
13．权利要求12的方法，其中所说的LASM在与所说的扩增靶分析物单位反应之前本质上均质地分布在所说的培养基中。
14．用于确定在样品中两个或多个不同靶核苷酸序列分析物(靶分析物)的存在或缺乏的方法，所说的方法包括以下步骤：
a)提供将要分析的样品；
b)提供适于样品引入的试验培养基，所说的试验培养基包含靶分析物特异性扩增物质，该物质对每个所说的靶分析物是选择性地特异的；
c)从靶有机体释放任何所说的靶分析物，所说的靶有机体可包含在样品中；
d)使任何释放的靶分析物在所说的培养基中与所说的靶分析物扩增物质反应以便在所说的培养基中形成所说的靶分析物的本质上稳定的扩增菌落；和
e)使在所说的菌落中的任何扩增靶分析物与标记的分析物特异性物质(LASMs)反应(该物质有选择地与在所说的培养基中形成的菌落中的任何靶分析物结合)以从所说的培养基的其余部分有差别地突出所说的形成的靶分析物菌落，由此，由所说的靶分析物之一组成的任何扩增靶分析物菌落将从由另一个靶分析物组成的扩增靶分析物菌落有差别地突出。
15．权利要求14的方法，其中所说的LASMs包含分别有差别地标记的人工核苷酸序列，该人工核苷酸序列与所说的各自的靶分析物之一互补。
16．用于量化在样品中的靶核苷酸序列(靶分析物)的方法，所说的方法包含以下步骤：
a)提供固定体积的将要分析的样品；
b)提供适于样品引入的试验培养基，所说的试验培养基包含靶分析物特异性扩增物质；
c)从靶生命形式释放任何所说的靶分析物，所说的生命形式可包含在所说的固定体积样品中；
d)使任何释放的靶分析物在所说的培养基中与所说的靶分析物扩增物质反应以便在所说的培养基中形成所说的靶分析物的本质上稳定的扩增菌落；
e)使任何扩增靶分析物单位与标记的分析物特异性物质(LASMs)反应(该物质与在所说的培养基中形成的菌落中的任何靶分析物结合)以在所说的培养基中形成有差别地突出的靶分析物菌落；和
f)计算在培养基中突出的扩增靶分析物菌落区的数量以获得每单位体积样品浓度的靶分析物。
17．权利要求16的方法，该方法包括以下步骤：确定在样品中的核酸序列的扩增的菌落的百分比和/或在含有所说的靶分析物的样品中原位溶解的有机体或细胞的百分比。
18．用于量化在样品中的两个或多个靶核苷酸序列(靶分析物)的方法，所说的方法包含以下步骤：
a)提供固定体积的将要分析的样品；
b)提供适于样品引入的试验培养基，所说的试验培养基包含靶分析物特异性扩增物质；
c)从靶生命形式释放任何所说的靶分析物，所说的生命形式可包含在所说的固定体积样品中；
d)使任何释放的靶分析物在所说的培养基中与所说的靶分析物扩增物质反应以便在所说的培养基中形成所说的靶分析物的本质上稳定的扩增菌落；
e)使在所说的菌落中的任何扩增靶分析物单位与标记的分析物特异性物质(LASMs)反应(该物质与在所说的培养基中形成的菌落中的任何靶分析物有选择地结合)以从所说的培养基的其余部分有差别地突出所说的靶分析物菌落，由此，由所说的靶分析物之一组成的任何扩增靶分析物菌落将从由另一个靶分析物组成的扩增靶分析物菌落有差别地突出；和
f)计算在培养基中每个有差别地突出的扩增靶分析物菌落区的数量以获得在培养基中出现的每种靶分析物的每单位体积样品浓度的靶分析物。
19．用于确定在样品中靶核苷酸序列(靶分析物)的存在或缺乏的方法，所说的方法包括以下步骤：
a)提供将要分析的样品，所说的样品可能包含游离的靶分析物；
b)提供适于样品引入的试验培养基，所说的试验培养基包含靶分析物特异性扩增物质；
c)使任何游离的靶分析物在所说的培养基中与所说的靶分析物扩增物质反应以便在所说的培养基中形成所说的靶分析物的本质上稳定的扩增菌落；和
e)使任何靶分析物与标记的分析物特异性物质(LASM)反应(该物质与在所说的培养基中任何形成的靶分析物菌落中的扩增靶分析物单位结合)以从所说的培养基的其余部分有差别地突出所说的靶分析物菌落。
20．用于确定在样品中两个或多个不同靶核苷酸序列分析物(靶分析物)的存在或缺乏的方法，所说的方法包括以下步骤：
a)提供将要分析的样品，所说的样品可能包含游离的靶分析物；
b)提供适于样品引入的试验培养基，所说的试验培养基包含靶分析物特异性扩增物质，该物质对每个所说的靶分析物是选择性地特异的；
c)使任何游离的靶分析物在所说的培养基中与所说的靶分析物扩增物质反应以便在所说的培养基中形成所说的靶分析物的本质上稳定的扩增菌落；和
d)使在所说的菌落中的任何扩增靶分析物与标记的分析物特异性物质(LASMs)反应(该物质有选择地与在所说的培养基中形成的菌落中的任何靶分析物结合)以从所说的培养基的其余部分有差别地突出所说的形成的靶分析物菌落，由此，由所说的靶分析物之一组成的任何扩增靶分析物菌落将从由另一个靶分析物组成的扩增靶分析物菌落有差别地突出。
21．用于量化在样品中的靶核苷酸序列(靶分析物)的方法，所说的方法包含以下步骤：
a)提供将要分析的样品，所说的样品可能包含游离的靶分析物；
b)提供适于样品引入的试验培养基，所说的试验培养基包含靶分析物特异性扩增物质；
c)使任何游离的靶分析物在所说的培养基中与所说的靶分析物扩增物质反应以便在所说的培养基中形成所说的靶分析物的本质上稳定的扩增菌落；
e)使任何扩增靶分析物单位与标记的分析物特异性物质(LASM)反应(该物质与在所说的培养基中形成的菌落中的任何靶分析物结合)以在所说的培养基中形成有差别地突出的靶分析物菌落；和
f)计算在培养基中突出的扩增靶分析物菌落区的数量以获得每单位体积样品浓度的靶分析物。
22．用于确定在样品中靶核苷酸序列分析物(靶分析物)的存在或缺乏的装配，所说的装配包含：
a)样品可以引入的培养基，该培养基可操作地支持把靶分析物扩增至需要由此产生其菌落的程度，而同时限制在培养基之内形成的任何扩增的靶分析物菌落的迁移；
b)在所说的培养基中的靶分析物特异性扩增试剂，所说的扩增试剂可操作地有选择扩增并形成可在样品中存在的任何靶分析物的菌落；和
c)可检测的物质，该物质能够通过所说的培养基迁移至有差别地突出在所说的培养基中形成的任何扩增的靶分析物菌落必要的程度。
23．用于确定在样品中靶核苷酸序列分析物(靶分析物)的存在或缺乏的方法，所说的方法包括以下步骤：
a)提供将要分析的样品；
b)提供适于样品引入的试验培养基，所说的试验培养基包含靶分析物特异性扩增物质；
c)从靶有机体释放任何所说的靶分析物，所说的靶有机体可包含在样品中；
d)使任何释放的靶分析物在所说的培养基中与所说的靶分析物扩增物质反应以便在所说的培养基中形成所说的靶分析物的本质上稳定的扩增菌落；和
e)使任何释放的靶分析物与可检测物质反应(该物质与在所说的培养基中任何形成的靶分析物菌落中的扩增靶分析物单位结合)以从所说的培养基的其余部分有差别地突出所说的靶分析物菌落。
24．用于确定在样品中靶核苷酸序列分析物(靶分析物)的存在或缺乏的方法，所说的方法包括以下步骤：
a)提供将要分析的样品，所说的样品可能包含游离的靶分析物；
b)提供适于样品引入的试验培养基，所说的试验培养基包含靶分析物特异性扩增物质；
c)使任何游离的靶分析物在所说的培养基中与所说的靶分析物扩增物质反应以便在所说的培养基中形成所说的靶分析物的本质上稳定的扩增菌落；和
e)使任何释放的靶分析物与可检测物质反应(该物质与在所说的培养基中任何形成的靶分析物菌落中的扩增靶分析物单位结合)以从所说的培养基的其余部分有差别地突出所说的靶分析物菌落。
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