CN1197962C - 用于测序的改变的热稳定dna聚合酶 - Google Patents
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Abstract
提供了掺入非常规核苷酸例如用荧光素族染料标记的核苷酸的效率增强的修饰的热稳定的DNA聚合酶。这种修饰的热稳定的DNA聚合酶是采用重组DNA技术制备的。所述聚合酶特别适用于链终止核酸测序方法。还提供了编码本发明重组热稳定聚合酶的核酸以及含有所述核酸的载体和宿主细胞。也提供了含有本发明重组热稳定聚合酶的试剂盒。本发明的聚合酶和方法在对DNA测序具有成本显著降低和效率提高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及热稳定DNA聚合酶，该酶提高了用荧光素族染料标记的三磷酸核苷的掺入效力。本发明提供了用于分离和生产所述改变的聚合酶的方法。本发明的酶可在分子生物学方面有多种应用并且特别优选地用于核酸的测序。
背景技术
用荧光染料标记的三磷酸核苷(dNTPs)的掺入对于许多体外DNA合成应用是重要的。例如，染料终止子DNA测序反应需要掺入荧光二脱氧核苷酸类似物以终止(反应)和进行标记。另外，体外合成标记的产物可涉及荧光核苷酸或核苷酸类似物的掺入。例如，利用固定了探针的微平盘已经将荧光标记的DNA用于杂交测试(Cornin等人，1996，人类突变7：244)。
为了确保DNA复制的保真性，DNA聚合酶掺入其正常的底物，(本文是指常规的三磷酸脱氧核苷(dNTPs))时具有非常强的偏性，并且抵抗荧光染料标记的非常规dNTPs包括dNTPs和dNTP类似物的掺入。在该细胞中，这种特性减弱了在DNA链生长时异常碱基例如dUTP的掺入。在体外存在有常规和非常规的荧光标记的三磷酸核苷时，尤其证实了这种特性，例如在利用染料终止子的二脱氧链终止方法的一种模型进行的DNA测序反应中，(Lee等人，1992，核酸研究20：2471，引入本文作为参考)。
用于染料终止子方法的商品DNA循环测序试剂盒使用了用碱性蕊香红族的荧光染料标记的链终止子ddNTPs。但是，碱性蕊香红族染料的电荷是中性的并且用这些染料标记的三磷酸核苷在用于分离测序的产物以便检测的电泳的凝胶上不规则地迁移。碱性蕊香红族染料的这一特性必须对标准的测序方案进行修饰，所述方案包括使用dITP和在电泳之前有外加的处理步骤。
相反，带负电荷的荧光染料例如荧光素族染料允许：1)在标记的三磷酸核苷和标记的引物延伸产物之间更好地分离，和2)标记的测序产物比中性或带正电荷的荧光染料能更好地迁移。因此，荧光素族染料的使用避免了对外加的处理步骤的需求，而该步骤需要使用碱性蕊香红族染料。但是，可获得的荧光素族染料对于在现有的商业途径可获得的DNA循环测序方案中使用是不理想的，因为利用这些方案不能有效地将这些染料标记的ddNTPs插入到测序产物中。因此，需要商业途径可获得的热稳定DNA聚合酶，该酶能够有效地将常规的和荧光素标记的核苷酸掺入。本发明满足了这一需求。此外，本发明的突变酶的预想不到的特性相对于相应的野生型酶而言引物延伸的速率增加。另一个预想不到的特性是在自动的DNA测序分析中各种终止子核苷酸掺入的均匀性提高了。
发明内容
本发明提供了模板依赖性的热稳定DNA聚合酶，与以前定性的酶相比，所述酶对荧光素族染料标记的核苷酸的掺入的辨别力降低了。这些酶与常规热稳定酶相比能更有效地将荧光素族染料标记的核苷酸(包括脱氧核苷酸(dNTPs)和碱基类似物例如二脱氧核苷酸(ddNTPs))掺入。本发明也提供了编码这些酶的基因，这些基因是重组表达载体用于提供大量的纯化的酶。
通过本发明，对热稳定DNA聚合酶内的关键区域进行了鉴定，该区域影响了聚合酶将荧光素族染料标记的核苷酸掺入的能力，而保留了精确地掺入天然核苷酸的能力。通过重组DNA的方法例如位点特异性诱变将关键区域或关键的基序引入到编码热稳定DNA聚合酶的基因中，提供了本发明的优点。
因此，一方面，本发明提供了重组的热稳定DNA聚合酶，与相应的野生型酶相比，其特征在于该酶已经进行突变产生关键基序并且该酶对掺入荧光素族染料标记的核苷酸的辨别力降低了。
在该方面，本发明提供了重组的热稳定DNA聚合酶，其特征在于a)其所述聚合酶的天然形式包括氨基酸序列(以一字母密码子形式表示)LSXXLX(V/I)PXXE(SEQ ID NO：1)，其中X是任何氨基酸；b)与所述天然序列相比，在所述序列的第4位的X被突变了，只是X不突变为E；和c)与所述酶的天然形式相比，所述热稳定DNA聚合酶降低了对掺入荧光素族染料标记的核苷酸的辨别力。该氨基酸序列用三字母密码子表示为LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu(SEQ ID NO：1)，其中在该序列的第3，4，6，9和10位的“Xaa”是任何的氨基酸残基，和在该序列的第7位的“Xaa”是Val或Ile。
在另一个实施方案中，重组的热稳定DNA聚合酶的特征在于a)天然形式的所述聚合酶包括氨基酸序列LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE(SEQ ID NO：2)，其中X是任何氨基酸；b)与所述天然序列相比，在所述序列的第4位的X被突变了，只是X不突变为E；和c)与所述酶的天然形式相比，所述热稳定的DNA聚合酶降低了对掺入荧光素族染料标记的核苷酸的辨别力。该氨基酸序列用三字母密码子表示为LeuSerXaaXaaLeuXaaIleProTyrGluGlu(SEQID NO：2)，由此在第3位的“Xaa”是Gln或Gly，第4位的“Xaa”是任何氨基酸，以及第6位的“Xaa”是Ser或Ala。在一个优选的实施方案中，该氨基酸序列是LSQXLAIPYEE(SEQ ID NO：3)，其中X是任何氨基酸。该氨基酸序列用三字母密码子表示为LeuSerGlnXaaLeuAlaIleProTyrGluGlu(SEQ ID NO：3)，其中在第4位的“Xaa”是任何氨基酸。在一个更优选的实施方案中，第4位的“Xaa”和Lys。
在又一个实施方案中，重组的热稳定DNA聚合酶的特征在于a)所述聚合酶的天然形式包括氨基酸序列LSVXLG(V/I)PVDE(SEQ ID NO：4)；b)与所述天然序列相比，在该序列的第4位的X被突变了，只是X不突变为E；和c)与所述酶的天然形式相比，所述热稳定聚合酶降低了对掺入荧光素族染料标记的核苷酸的辨别力。该氨基酸序列用三字母密码子表示为LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu(SEQ ID NO：4)，其中在该序列的第4位的“Xaa”是任何氨基酸，和在该序列的第7位的“Xaa”是Val或Ile。在一个优选的实施方案中，氨基酸序列是LSVXLGVPVKE(SEQ ID NO：5)，其中第4位的X是任何氨基酸。该氨基酸序列用三字母密码子表示为LeuSerValXaaLeuGlyValProValLysGlu(SEQ ID NO：5)，其中在第4位的“Xaa”是任何氨基酸。在一个更优选的实施方案中，在第4位的“Xaa”是Arg。在另一个优选的实施方案中，氨基酸序列是LSVXLGIPVKE(SEQ ID NO：6)，其中第4位的X是任何氨基酸。该氨基酸序列用三字母密码子表示为LeuSerValXaaLeuGlyIleProVallysGlu(SEQ ID NO：6)，其中在第4位的“Xaa”是任何氨基酸。在一个更优选的实施方案中，在第4位的“Xaa”是Arg。
在本发明的另一方面，本发明的关键性的特定区域可以与聚合酶基因的其它区域中的基序结合，提供具有对非常规的核苷酸例如rNTPs和ddNTPs的掺入辨别力降低的热稳定DNA聚合酶。正如本文列举的，构建了含有两个突变的重组的水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶。第一个突变是在本发明的关键基序的第4位的X残基的E突变为K。第二个突变是允许ddNTPs更有效地掺入的突变，已知称作为F667Y突变。该突变是在Taq DNA聚合酶的667位的苯丙氨酸突变为酪氨酸(描述于美国专利号5,614,365和美国专利申请系列号8/488,223，引入本文参考文献)。当荧光素染料族标记的ddNTPs用于测序反应时，发现E681K F667Y双突变酶产生可读的测序序列梯。因此，在一个实施方案中，将对二脱氧核苷酸的识别性低的基序与本发明的关键基序结合得到的酶，其对标记和未标记的ddNTPs掺入的效力均有了提高。
另外，未曾预料到的是发现相对于仅有F667Y突变的酶而言，E681KF667K突变酶显示其延伸速率显著增加。因此，在本发明的另一个实施方案中，将单独的或与其它基序结合的关键基序导入到热稳定DNA聚合酶产生高延伸速率的酶。未曾预料到的是还发现利用碱性蕊香红标记的终止子在染料终止子二脱氧测序反应中双突变酶也产生了更均匀的峰高度。因此，在又一个实施方案中，利用碱性蕊香红族还染料标记的终止子在DNA测序方法中，将关键基序导入到热稳定DNA聚合酶产生了更均匀的峰高度的酶。
在另一个实施方案中，使rNTPs能更有效地掺入的突变例如在TaqDNA聚合酶的第615位的谷氨酸到甘氨酸突变或E615G突变(描述于欧洲专利申请，公开号EP-A-823479，引入本文参考文献)与本发明的关键基序结合，提供了能高效掺入荧光素族染料标记的核糖核苷酸的酶。
在本发明的另一个方面，还提供了编码本发明的聚合酶的基因。特别是，提供了编码包括本发明的关键基序的重组热稳定聚合酶基因。这一方面还包括编码包括产生本发明的关键基序的突变的两个或多个突变结合的基因。
还在另一个方面，本发明也提供了DNA测序的改进的方法，所述方法允许使用较低浓度的荧光素染料族标记的ddNTPs，从而降低了反应所需要的成本。本发明的改进的方法也允许使用荧光素染料族标记的ddNTPs与dNTPs的较低比例。使用这些方法产生许多优点，包括更有效地聚合，模板核酸所需的浓度较低，将抑制剂导入到反应混合物中的可能性较低。这些优点也有助于对长模板进行测序。本发明也提供了改进的测序方法，其中将测序反应直接加样到测序凝胶上随后进行电泳，不需要中间纯化步骤。
因此，在本发明的一个实施方案中，本发明提供了利用重组酶测定靶核酸序列的改进方法，其中所述酶a)在第4位具有一个突变产生本发明的关键基序和b)与相应的野生型酶相比，降低了对掺入荧光素族染料标记的核苷酸的辨别力。利用来源于嗜热菌种的热稳定DNA聚合酶的改进的测序方法也是在本发明的范围内，其中该酶含有天然存在的序列变异，所述变异产生本发明的关键基序。这些天然的酶也可以降低对非常规的核苷酸掺入的辨别力。在一个实施方案中，本发明提出了改进的测序方法是利用天然热稳定DNA聚合酶，所述酶a)具有本发明的关键基序，其中第4位的氨基酸不是Glu’和b)降低了对荧光素族染料标记的核苷酸掺入的辨别力。
产生用荧光素族染料标记的DNA的改进方法也在本发明的范围内。本发明的酶在聚合酶链反应方法中有效地掺入了荧光素标记的dNTPs，产生了在不同位点用荧光素族染料标记的扩增产物。因此，在一个实施方案中，标记DNA的改进方法包括a)提供了用荧光素族染料标记的dNTPs和本发明的酶的反应混合物和b)进行核酸扩增反应。
本发明的酶和编码这些酶的基因提供了本发明的另外一些方面，这些方面是用于DNA测序的试剂盒，该试剂盒包括本发明的重组酶，另外可包括带负电荷的荧光终止子化合物。用于DNA测序的其它试剂盒，包括a)带负电荷的荧光终止子化合物和b)本发明的天然酶。
本发明也提供了用于产生的标记DNA的试剂盒包括本发明的重组酶。用于产生标记的DNA的其它试剂盒包括a)带负电荷的荧光三磷酸核苷化合物和b)本发明的天然酶。
附图说明
附图1是Taq DNA聚合酶基因的图解描述。指明的限制性位点涉及实施例I和本说明书中用于制备本文提供的其它的突变体和表达载体的方法。
具体实施方式
为了有助于理解该发明，许多术语的定义如下。
术语“基因”是指一种DNA序列，包括生产可回收的生物活性多肽或前体所必需的控制和编码序列。该多肽能用全长基因序列或由该编码序列的一部分来编码，但必须保留该酶活性。
术语“天然的”是指从天然存在的来源中分离的基因或基因产物。该术语也是指由分子生物学技术产生的天然的蛋白质的重组形式，该重组形式具有相同于天然形式的氨基酸序列。
术语“突变体”是指其核酸序列已经被改变的基因或其氨基酸序列已经被改变的基因产物，该基因产物与天然的或野生型基因或基因产物相比其功能特性已经被改变。这样的改变包括点突变、缺失和插入。
术语“宿主细胞”是指单细胞的原核生物和真核生物体，例如细菌、酵母和放线菌，和在细胞培养物中生长的来自于较高级植物或动物的单细胞。
术语“表达系统”是指DNA序列，含有以可操作方式连接的所需的编码序列和控制序列，以致于用这些序列转化的宿主细胞能够产生编码的蛋白质。为了实现转化，表达系统可以包含于载体上；但是，也可以将相关的DNA整合到宿主染色体。
本文使用的术语“寡核苷酸”定义为含有两个或更多个的脱氧核苷酸或核苷酸，优选的是多于三个和通常是多于10个。寡核苷酸的精确的大小将取决于许多因素，包括寡核苷酸的最终功能或用途。
制备寡核苷酸可采用任何合适的方法，例如包括合适序列的克隆和限制性裂解以及采用例如Narang等人(1979，酶解方法，68：90-99)的磷酸三酯方法；Brown等人(1979，酶解方法，68：109-151)的磷酸二酯方法；Beaucage等人(1981，Tetrahedron Lett.22：1895-1862)的二乙基亚磷酰胺方法；Matteucci等人(1981，J.Am.Chem.Soc.103：3185-3191)的磷酸三酯方法的直接化学合成或自动合成方法；和美国专利No.4,458,066的固体载体方法，所有上述文献引入本文参考。
本文使用的术语“引物”是指天然的或合成的寡核苷酸，当置于启动引物延伸的条件下它能够作为合成的起始点。优选的引物是单链寡脱氧核糖核苷酸。引物的合适的长度取决于预期要使用的引物，但是通常是15-35个核苷酸的范围内。通常短引物分子需要较冷的温度以与模板充分形成稳定的杂交复合物。引物不需要反映模板的精确的序列，但是必须充分地互补以便与引物延伸的模板杂交。
如果需要，通过掺入一种由光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可检测的标记物可以对引物进行标记。例如，有用的标记物包括32P、荧光染料、电子密度试剂、酶(如通常用于ELISA的检测)、生物素或半抗原和蛋白质(可获得其抗血清或单克隆抗体)。
术语“热稳定聚合酶”是指对热稳定的酶，该酶具有热抗性，并且保留了足够的活性以实现随后的引物延伸反应，并且当用双链核酸变性所必需的时间接触较高的温度时不会发生不可逆的变性(失活)。核酸变性所必需的加热条件是本领域内技术人员已知的并且列举于美国专利Nos.4,683,202和4,683,195，这些文献引入本文参考。如本文使用的热稳定聚合酶适用于温度循环反应例如聚合酶链反应(“PCR”)。本文目的使用的不可逆的变性是指酶促活性的持久的和完全的损失。对于热稳定的聚合酶，酶促活性是指催化核苷酸以合适的方式结合以形成引物延伸产物，所述产物与模板核酸链互补。
术语“常规的”或“天然的”，当指核酸碱基、三磷酸核苷、或核苷酸时，是指那些在所描述的聚核苷酸中天然存在的物质(即，对于DNA，这些是dATP，dGTP，dCTP和dTTP)。另外，在体外DNA合成反应例如测序反应中，dITP，并且7-脱氮杂-dGTP经常可用于替代dGTP和7-脱氮杂-dATP经常可用于替代dATP。这些核酸的集合名词称为dNTPs。
术语“非常规的”或“修饰的”当指核酸碱基、核苷、或核苷酸时，包括在特定的聚核苷酸中天然存在的常规的碱基、核苷、或核苷酸的修饰物、衍生物或类似物。在DNA中尿嘧啶的脱氧核糖核苷酸形式是DNA中非常规的或修饰的碱基(dUTP)，而在RNA中尿嘧啶的核糖核苷酸形式是常规碱基(UMP)。如本文使用的，非常规的核苷酸包括但不限于用作核酸测序终止子的化合物。终止子化合物包括但不限于具有2′，3′二脱氧结构的那些化合物，并且称作为双脱氧三磷酸核苷。双脱氧三磷酸核苷ddATP，ddTTP，ddCTP和ddGTP集合名词称作为ddNTPs。其它的非常规核苷酸包括硫代磷酸酯dNTPs((α-S)dNTPs)，5′-α-borano-dNTPs，α-甲基-磷酸dNTPs，和三磷酸核糖核苷(rNTPs)。可以将非常规的碱基用放射性同位素例如32P，33P，或35S；荧光标记物；化学发光标记物；生物发光标记物；半抗原标记物例如生物素；或酶标记物例如抗生蛋白链菌素或抗生物素蛋白进行标记。荧光标记物可以包括带负电的染料例如荧光素族的染料，或带中性电荷的染料例如碱性蕊香红族染料，或带正电的染料例如花菁族的染料。荧光素族的染料包括例如，FAM，HEX，TET，JOE，NAN和ZOE。碱性蕊香红族染料包括Texas Red，ROX，R110，R6G，和TAMRA。FAM，HEX，TET，JOE，NAN，ZOE，ROX，R110，R6G和TAMRA是由Perkin-Elmer(Foster City，CA)销售的，和Texas Red是由Molecular Probe销售的。花菁族的染料包括Cy2，Cy3，Cy5，和Cy7并且是由Amersham(Amersham Place，Little Chalfont，Buckinghamshire，England)。
术语“DNA合成反应”是指生产DNA拷贝的方法，包括但不限于PCR，链替代扩增，转录介导的扩增，引物延伸和逆转录。
为了进一步有助于理解本发明，在整个说明书中所说的特定的热稳定DNA聚合酶和荧光染料是为了列举该发明，这些参照不是为了限制本发明的范围。
本发明提供了新的和改进的热稳定DNA聚合酶的组合物。本发明的酶包括重组聚合酶，与相应的野生型酶相比，该酶更高效地掺入荧光素族染料标记的核苷三磷酸。本发明的热稳定DNA聚合酶能够比现有技术的聚合酶更合适地和令人满意地用于例如DNA测序和标记的产物的体外合成的过程中。本发明的改进的DNA测序方法包括使用这些重组聚合酶以及使用天然的聚合酶，所述天然的酶比以前鉴定的酶更有效地掺入用荧光素染料标记的三磷酸核苷。还提供了编码这些酶的DNA序列和表达蛋白质的载体。
本发明的热稳定DNA聚合酶在该酶的聚合酶活性区域的氨基酸序列内具有关键性区域。下面利用常规的单字母氨基酸密码子显示了本发明提供的热稳定DNA聚合酶的氨基酸序列内的关键区域(Lehninger，生物化学，纽约，Worth Publishers Inc.，1970，第67页，引入本文作为参考)。SEQ ID NO：7 LSXXLX(V/I)PXXE，其中第4位的“X”表示除E以外的任何氨基酸。在表示氨基酸的三字母密码子中，该序列表示为LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu(SEQ ID NO：7)，其中第3，6，9和10位的“Xaa”是任何氨基酸，该序列的第4位的“Xaa”是任何氨基酸但不是谷氨酸残基(Glu)和第7位的“Xaa”是Val或Ile。该关键性的区域提供了特征在于能够有效地掺入荧光素族染料标记的核苷酸的热稳定DNA聚合酶。
例如，对于水生栖热菌(Taq)DNA聚合酶基因的衍生物，其中在第46位(G46D)已经含有甘氨酸到天冬氨酸的突变和F667Y的突变，在编码全长Taq DNA聚合酶序列的第681位残基的谷氨酸的密码子的第一位的G突变为A(对应于关键基元的第4位置)导致产生具有关键基元的酶。该酶显示1)其掺入荧光素族染料标记的核苷酸的效力增加了约2到10倍，而不损害该酶在常规核苷酸存在下介导PCR的能力和2)延伸速率增加3到4.3倍。对于Taq DNA聚合酶，该特定的突变产生了E(谷氨酸)到K(赖氨酸)的氨基酸的变化。
虽然该特定的氨基酸变化产生了关键基元和显著地改变了该酶掺入非常规核苷酸的能力，预期E到K的特异性变化对本发明而言不如在关键性区域内现在鉴别的位置那样关键。因此，在优选的实施发明方案中，本发明提供了重组的热稳定DNA聚合酶，其特征在于a)其天然形式的所述聚合酶包括氨基酸序列LSXXLX(V/I)PXXE(SEQ ID NO：1)，其中X是任何氨基酸；b)与所述天然序列相比，在所述序列的第4位的X被突变了，X不被突变为E；和c)与所述酶的天然形式相比，所述热稳定的聚合酶降低了对掺入荧光素族染料标记的核苷酸的辨别力。在一个更优选的实施方案中，第4位的X被具有正电荷的氨基酸替代，例如K，R或H，或被极性氨基酸例如Q或N替代。在一个最优选的实施方案中，第4位的X被K替代。
在另一个优选的实施方案中，本发明的酶的特征在于a)降低了对掺入荧光素族染料标记的核苷酸的辨别力和b)包括氨基酸序列LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE(SEQ ID NO：2)，其中X是任何氨基酸。该氨基酸序列用三字母密码子表示如下：LeuSerXaaXaaLeuXaaIleProTyfGluGlu，其中在该序列的第3位的“Xaa”是Gln或Gly，在该序列的第4位的“Xaa”是任何氨基酸，第6位的“Xaa”是Ser或Ala。
在一个更优选的实施方案中，具有降低了对掺入荧光素族染料标记的核苷酸的辨别力的酶包括氨基酸序列是LSQXLAIPYEE，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO：3)。该氨基酸序列用三字母密码子表示为LeuSerGlnXaaLeuAlaIleProTyrGluGlu，其中在第4位的“Xaa”是任何氨基酸。在一个更优选的实施方案中，X是K残基。
在另一个实施方案中，具有降低了对掺入荧光素族染料标记的核苷酸的辨别力的酶包括氨基酸序列LSVXLG(V/I)PYKE其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO：4)。该氨基酸序列用三字母密码子表示为LeuSerValXaaLeuGlyXaaDroValLysGlu其中在第4位的“Xaa”是任何氨基酸。其中在第7位的“Xaa”是Val或Ile。
在本发明的一个更优选的实施方案中，对掺入荧光素族染料标记的核苷酸的辨别力降低的酶包括氨基酸序列是LSVXLGVPVKE，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO：5)。该氨基酸序列用三字母密码子表示为LeuSerValXaaLeuGlyValProValLysGlu，其中在第4位的“Xaa”是任何氨基酸。在一个最优选的实施方案中，其中X是R残基。
在另一个更优选的实施方案中，对掺入荧光素族染料标记的核苷酸的辨别力降低的酶包括氨基酸序列是LSVXLGIPVKE，其中X是任何氨基酸(SEQ ID NO：6)。该氨基酸序列用三字母密码子表示为LeuSerValXaaLeuGlyIleProValLysGlu，其中在第4位的“Xaa”是任何氨基酸。在一个最优选的实施方案中，其中X是R残基。
本文中描述的E681K突变的特征鉴别了DNA聚合酶基因的一个区域，它影响了该聚合酶与带负电的荧光核苷酸的相互作用的能力。O螺旋远端的位点是在聚合酶的Oa螺旋的末端，并且在该聚合酶Ob螺旋的起始点(Kim等人，1995，自然，376：612)。基于本领域内技术人员已知的分子成型原理，也预期除了第681位E到K的突变以外Oa-Ob螺旋的结构的变化导致聚合酶对掺入荧光素族染料标记的核苷酸的辨别能力的变化。因此，除了在第4位的X残基的变化以外关键基元的位置的突变也在本发明的范围内。在该实施方案中，本发明提供了重组的热稳定的DNA聚合酶，该酶的特征在于(a)聚合酶的天然形式包括氨基酸序列LSXXLX(V/I)PXXE(SEQID NO：1)，其中X是任何氨基酸；b)在所述氨基酸序列内该重组聚合酶至少包括一个突变，但第4位的X不被突变为E；和c)与相应的天然酶相比，所述酶降低了对掺入荧光素族染料标记的核苷酸的辨别力。
类似地，包括类似于但不同于氨基酸LSXXLX(V/I)PXXE(SEQ ID NO：7)的关键基元的热稳定DNA聚合酶是在本发明的范围内，其中第4位的X是除了E的任何氨基酸。特别是，在一个实施方案中，关键基元是氨基酸序列LXXXXXXXXXE(SEQ ID NO：8)，其中第4位的X是除了E的任何氨基酸。该氨基酸序列用三字母密码子表示为LeuXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGlu(SEQ ID NO：8)，其中在第2，3，5，6，7，8，9和10位的“Xaa”是任何氨基酸，第4位的“Xaa”是除了Glu以外的任何氨基酸。
在另一个实施方案中，关键基元是氨基酸序列L(S/A)XX(L/I)XXXXXE(SEQ ID NO：9)，其中第4位的X是除了E以外的任何氨基酸。该氨基酸序列用三字母密码子表示为LeuXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGlu(SEQ ID NO：9)，其中在第3，6，7，8，9和10位的“Xaa”是任何氨基酸，第2位的“Xaa”是Ser或Ala，第4位的“Xaa”是除了Glu以外的任何氨基酸和第5位的“Xaa”是Leu或Ile。
还在另一个实施方案中，关键基元是氨基酸序列LSXXLXXXXXE(SEQID NO：10)，其中第4位的X是除了E以外的任何氨基酸。该氨基酸序列用三字母密码子表示为LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaXaaXaaXaaGlu(SEQ IDNO：10)，其中在第3，6，7，8，9和10位的“Xaa”是任何氨基酸，第4位的“Xaa”是除了Glu以外的任何氨基酸。
由ddNTP掺入测试测出能够有效地掺入荧光素族染料标记的核苷酸的本发明的酶。所述检测分析之一是在有限的模板条件下进行的引物延伸竞争性检测法。在该检测法中，在(α-33P)dCTP和具有各种各样水平的荧光标记的ddNTP、Zowie-ddCTP的过量酶的存在下将结合到M13mp18模板(Innis等人，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：9436)的引物DG 48(5′-GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGC)，(SEQ ID NO：11)延伸。因为ddCTP残基的掺入终止了延伸反应，所以DNA聚合酶越易于将ddCTP掺入到经过延伸的引物，(α-33P)dCTP能掺入的越少。因此，由于荧光标记的ddCTP掺入的效力增加，所以抑制DNA合成的程度增加。也可以用各种水平的未标记的ddCTP进行反应。计算出抑制50％需要的ddCTP和Zowie-ddCTP的浓度，相当于获得了该酶对掺入荧光标记的核苷酸的能力的相对测量值。在实施例II中提供了详细的ddNTP掺入检测分析法。
因此，在本发明的一个实施方案中，采用实施例II描述的荧光ddNTP掺入分析法检测其对荧光素族染料标记的核苷酸的掺入的辨别降低的特性。在一个优选的实施方案中，相对于野生型酶而言，对于本发明的突变酶将DNA合成抑制50％所需要的用荧光素染料标记的ddNTP和Zowie-ddCTP的浓度被降低至少3倍。在一个更优选的实施方案中，浓度被降低了至少5倍。在一个最优选的实施方案中，浓度被降低了至少10倍。在另一个实施方案中，通过测量荧光dNTP的掺入检测到辨别降低的特性。
在本发明的另一个方面，热稳定DNA聚合酶基因序列和酶来源于各种各样的嗜热菌种。在一个实施方案中，聚合酶基因序列和酶来自于栖热菌属的种类。在本发明的其它实施方案中，基因序列和酶来自除栖热菌属以外的嗜热菌种。编码许多热稳定DNA聚合酶的全长核酸和其氨基酸序列是可获得的。在PCT国际专利申请No.PCT/US 91/07035中公开了Taq、嗜热栖热菌(Tth)、栖热菌种Z05、栖热菌种sps17、海栖热袍菌(Tma)、和非洲栖热腔菌(Taf)的各个聚合酶的序列，所述申请于1992年4月16日公开为PCT专利公开号No.WO92/06200，并且引入本文作为参考。来自于黄栖热菌、热坚芽孢杆菌、和嗜热脂肪芽孢杆菌的DNA聚合酶的序列已经分别公开于Akhmetzjanov和Vakhitov，1992，核酸研究20(21)：5839，Uemori等人，1993，生物化学杂志113：401-410，和来自于NG：Mew GenBank数据库的登记号BSU 23149.ng，引入本文作为参考。来自于Thermus caldophilus的热稳定的DNA聚合酶的序列存在于EMBL/GenBank数据库的登记号U62584。利用美国专利No.4,889,818提供的方法以及表1提供的序列资料可以从ATCC保藏号No.42380收集来自于丝状栖热菌的热稳定的DNA聚合酶的序列。那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶的序列来自于GensSeq专利数据库登记号No.R98144(也公开于PCT WO97/09451)。
表1
生物体 关键基元 关键的
↓ 氨基酸位置
共有区 LS/a--L/i----E
水生栖热菌 LSQELAIPYEE 681
黄栖热菌 LSQELSIPYEE 679
嗜热栖热菌 LSQELAIPYEE 683
栖热菌种Z05 LSQELAIPYEE 683
栖热菌种sps17 LSQELSIPYEE 679
Thermus caldophilus LSQELAIPYEE 683
丝状栖热菌 LSQELSIPYEE 679
海栖热袍菌 LSVRLGVPVKE 744
那不勒斯栖热袍菌 LSVRLGIPVKE 744
非洲栖热腔菌 LSKRIGLSVSE 743
热坚芽孢杆菌1 LAQNLNISRKE 725，724
嗜热脂肪芽孢杆菌2 LAQNLNITRKE 724，727，802
1.登记号No.D12892的蛋白质序列，Uemori T.，Ishino Y，Fujita K.，Asada K.，Kato I.“热坚芽孢杆菌的DNA聚合酶基因的克隆和基因产物的定性”生物化学杂志113：401(1993)。该序列中的关键残基是725。提供了几乎相同于登记号为R45155和WPI93-408323/51的推测的“嗜热脂肪芽孢杆菌”DNA聚合酶的蛋白质序列。该序列中关键残基是724。
2.在GenBank，或SwissProt/PIR数据库中对嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶建议有几个序列。虽然这些序列是高度相关的，但是相互之间有一些不同，各含有相同的L(S/A)XX(L/I)XXXXXE(SEQ ID NO：9)基元，其中X是除E以外的任何氨基酸。该氨基酸序列的三字母密码子表示为LeuXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGlu(SEQ ID NO：9)，其中在第3，6，7，8，9和10位的“Xaa”是任何氨基酸，第2位的“Xaa”是Ser或Ala，第4位的“Xaa”是除了Glu的任何氨基酸和第5位的“Xaa”是Leu或Ile。
在上面的表中，包括由日本专利公开J 05304964A，EP No.699,760，和登记号No.U33536提供了在关键基元的第724位的关键残基的蛋白质序列。另一个高度相关的，但是有一些不同的蛋白质序列公开于基因163：65-68(1995)，该序列在关键基元的第727位含有关键残基。另一个高度相关的但是有一些不同的BstDNA聚合酶的登记号为U23149的蛋白质序列在关键基元的第802位含有关键残基。
由于各嗜热种类的DNA聚合酶是独特的，所以关键性区域的氨基酸位点对于各酶是不同的。氨基酸和核酸序列的校正程序是易于获得的，并且如果给出了本文识别的特定区域，可用于帮助鉴定本发明的精确的序列区域。所述序列校正程序可以从Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin获得。如果给出了本文鉴定的特定的基元，包括“GAP”，“BESTFIT”，和“PILEUP”的程序可用于帮助关键基元的定位。对于来自于列举的嗜热种类的热稳定DNA聚合酶，其关键性区域的位置显示于表1。
不论热稳定DNA聚合酶的聚合酶区域内的关键基元LSXXLX(V/I)PXXE(SEQ ID NO：7)(其中第4位的X是除E以外的任何氨基酸)的精确位置如何，基元的存在用于提供了具有有效地掺入用荧光素族染料标记的核苷酸的能力的热稳定DNA聚合酶。因此，用于产生关键基序的黄栖热菌(Glu 679)、嗜热栖热菌(Glu 683)、栖热菌种Z05(Glu 683)、栖热菌种sps 17(Glu 679)、Thermus caldophilus(Glu 683)、丝状栖热菌(Glu 679)的热稳定的DNA聚合酶的保守的谷氨酸的突变，对该聚合酶有效地掺入用荧光素族染料标记的核苷酸的能力提供增效的作用。
另外，基于现在鉴定的关键基元的高度保守的特性，根据其与例如TaqDNA聚合酶或表I的其它DNA聚合酶的序列的同源性可以鉴定新的热稳定的DNA聚合酶(参见例如美国专利Nos.5,618,711和5,624,833，引入本文作为参考)。只要根据本文描述的方法测定的，这样的聚合酶的肽序列与Taq聚合酸氨基酸序列有至少45％和最优选的是大于80％的同源性，所述聚合酶是在本发明的范围内。因此，本发明涉及也包括例如来自于Thermusoshimai(Williams RA，等人，1996，Int.J Syst Bacteriol 46(2)：403-408)；Thermus silvanus和Thermus chliarophilus(Tenreiro S，等人，1995，Int.J SystBacteriol 45(4)：633-639)；Thermus scotoductus(Tenreiro S，等人，1995，微生物研究146(4)：315-324)；Thermus ruber ATCC 35948，(L.G.Loginova，1984，Int.J Syst Bacteriol 34：498-499)；和Thermus brockianus(Munster，M.J.，1986，微生物遗传杂志132：1677)的热稳定DNA聚合酶的酶种类，和相应的基因以及表达载体，所有这些出版物引入本文作为参考。
本领域内技术人员将会认识到采用重组DNA技术例如位点特异性诱变技术最易于构建具有增强的用于掺入荧光素标记的核苷酸的效力的上述热稳定的DNA聚合酶。参见例如Sambrook等人，分子克隆，实验室手册，ColdSpring Harbor，1989，第二版，chapter 15.51，“寡核苷酸介导的诱变”，引入本文作为参考。现在该技术在本领域内是标准技术，并且可以用于在基因的任何测定的位点制备所有可能种类的碱基对变化。利用与除了有限的错配以外的待诱变的单链噬菌体或质粒DNA互补的合成的寡聚核苷酸引物完成所述方法，这样的诱变代表所需的突变。简单地说，利用合成的寡聚核苷酸作为引物以指导与噬菌体或质粒互补的链的合成，将获得的双链DNA转化到支撑噬菌体或质粒的宿主细胞。通过例如DNA序列分析或探针杂交可以分析获得的细菌以识别那些携带所需突变的基因序列的噬菌斑或菌落。
在本发明的PCR之后，引物指导的诱变(在美国专利No.4,683,195中描述，引入本文作为参考)和“重叠PCR”(Higuchi，1989，在PCR技术，ed.Erlich，Stockton Press，纽约，NY，第61-70页描述)已经成为在基因的任何位置导入任何突变的常规方法。
采用常规手段可以从质粒，噬菌粒，噬菌体或扩增反应回收突变的DNA并且连接到表达载体以进行随后的培养和最后的酶的纯化。许多克隆和表达载体适用于实施本发明，包括哺乳动物和细菌系统，如在Sambrook等人，1989，见上文，描述的。为了方便，本发明以利用λ衍生的PL启动子作为例子(Shimatake等人，1981，自然292：128)。该启动子的使用特异性地描述于美国专利号4,711,845和5,079,352，引入本文作为参考。
质粒pCS1已经于1997年8月28日保藏于ATCC，并且获得保藏号No.98521。该质粒含有编码热稳定DNA聚合酶的基因，在该基因的第681位被突变了，以致于在获得的多肽中谷氨酸被赖氨酸替代，并且提供了用于得到热稳定DNA聚合酶的手段，所述酶能增强掺入荧光素族染料标记的核苷酸的效力。实施例I描述了适用于亚克隆E681K突变以产生其它热稳定DNA聚合酶旁侧限制性位点的应用。另一种可选的方法，由于编码许多热稳定DNA聚合酶的整个基因序列是已知的，因而用于将E681K突变导入的其它手段例如限制性消化和片段替代是本领域内技术人员是容易获得的，并且具有ATCC保藏号和本文提供的序列信息。
如果期望产生本发明的突变或天然酶或那些酶的衍生物或同系物之一，通常该酶的产生包括用表达载体转化宿主细胞，和在实现表达的条件下培养转化的宿主细胞。用于转化和培养转化的宿主细胞的手段是本领域内技术人员熟知的并且详细地描述于例如Sambrook等人，1989，参见上文。
本发明的热稳定DNA聚合酶通常从大肠杆菌菌株DG 116(于1987年4月7日保藏于ATCC 53606)纯化，该菌株已经用可操作连接到编码野生型或修饰的热稳定DNA聚合酶的基因的表达载体进行转化。用于纯化热稳定的DNA聚合酶的方法描述于例如实施例I和Lawyer等人，1993，PCR方法和应用2：275-87，引入本文作为参考。
本发明的热稳定DNA聚合酶可用于这种酶的活性所必须的或要求的任何目的。这些应用的例子包括DNA测序、DNA标记、和引物延伸产物的标记。本发明特别是改进了由Sanger二脱氧核苷酸方法进行的DNA测序(Sanger等人，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.74：5463)。在Sanger等人的方法基础上已经发展了新的载体(Yanish-Perron等人，1985基因33：103-119)和碱基类似物(Mills等人，Proc.Natl.Acad.Sci.76：2232-2235，和Barr等人，1986，生物技术4：428-432)。总的来说，DNA测序需要在链终止碱基类似物存在下依赖于模板的引物延伸，导致将部分片段分类分布，随后按大小将这些片段分离。基本的二脱氧测序程序涉及(i)将非强制性地标记的寡聚核苷酸引物退火到模板；(ii)在四个单独的反应中用DNA聚合酶延伸引物，各反应含有未标记的dNTPs和有限量的非强制性标记的一种链终止剂例如ddNTP的混合物；和(iii)将四组反应产物在高分辨的变性聚丙烯酰胺/脲凝胶上进行分辨。根据所使用的标记物，通过放射性自显影或通过荧光检测在凝胶上可以检测这些反应产物，并且可以检查图像以推测核苷酸序列。这些方法使用了DNA聚合酶例如大肠杆菌PolI的Klenow片段或修饰的T7DNA聚合酶。
抗热性聚合酶(例如Taq DNA聚合酶)的有效利用改进了用热稳定的DNA聚合酶的测序方法(参见Innis等人，1988，见上文)和其称作为“循环测序”的修饰方法(Murray，1989，核酸研究17：8889)。作为基本的双脱氧测序的替换方法，循环测序是在链终止子存在下与模板序列互补的靶序列的线性的、不对称的扩增。单个循环产生了所有可能长度的一族延伸产物。在DNA模板的延伸反应产物变性之后，在终止子例如ddNTPs存在下出现了引物退火和引物延伸的多个循环。循环测序需要的DNA模板少于常规的链终止测序。热稳定的DNA聚合酶在循环测序中有几个优点：它们能耐严格的退火温度，所述退火温度是引物与核酸靶特异性杂交所要求的，同样也能耐受高温变性反应的多个循环，所述高温变性反应在90-95℃出现在各个循环。因此，现已将Ampli Taq @ DNA聚合酶和其衍生物和后代包括在Taq循环测序试剂盒中，所述试剂盒可以从Perkin-Elmer，Norwalk，CT等公司购买。
现有的两种不同的链终止测序方法是染料-引物测序和染料-终止测序。在染料-引物测序中，ddNTP终止子未被标记，并且利用标记的引物检测延伸产物(Smith等人，1986，自然，32：674-679)。在染料-终止子DNA测序中，利用DNA聚合酶将dNTPs和荧光素标记的ddNTPs掺入到DNA引物的末端(Lee等人，见上文)。该方法的优点是不必合成染料标记的引物。再者，染料终止子反应较方便的是它可以将所有四种反应在相同的试管中进行。
利用由Applied Biosystems，Foster Ciry，CA生产的自动测序仪器可以使染料-引物和染料-终止子这两种方法自动进行(美国专利5,171,534，引入本文作为参考)。当利用该仪器时，装在该仪器中的变性的聚丙烯酰胺凝胶上能将整个测序反应混合物分级。在仪器的底部的激光检测到荧光产物，电泳使它们根据大小穿过凝胶。
通常将两种类型的荧光染料用于标记在染料-终止子测序反应中使用的终止子，即带负电荷的和两性离子的荧光染料。带负电荷的荧光染料包括荧光素和BODIPY族的染料。BODIPY染料(4，4-二氟-4-溴-3a，4a-二氮杂-s-indacene)描述于国际专利申请，公开号WO97/00967，该文献引入本文作为参考。两性离子的荧光染料包括碱性蕊香红族的荧光素染料。商品循环测序试剂盒使用用碱性蕊香红衍生物标记的终止子。但是碱性蕊香红染料费用相当高并且必须在上样到凝胶之前将其产物与未掺入的染料ddNTPs分离，因为它们与测序反应产物共迁移。碱性蕊香红族的荧光素染料终止子似乎使富含GC的区域的发夹结构稳定，引起该产物异常迁移。这要求使用使次级结构松弛但也影响终止子掺入效率的dITP。
相反，荧光素标记的终止子取消了在凝胶上样之前的分离步骤，因为，它们具有更大的纯负电荷，并且比测序反应产物迁移更快。另外，荧光素标记的测序反应产物比用碱性蕊香红标记的测序反应产物具有更好的电泳迁移率。虽然野生型Taq DNA聚合酶不能有效地掺入用荧光素族染料标记的终止子，但是现在可以通过使用本文提供的修饰的酶有效地完成。
因此，本发明的范围包括使用具有关键基元的酶来进行二脱氧测序的新方法，以及进行该方法所用的试剂盒。在一个实施方案中，本发明的测序方法包括：
a)提供重组的热稳定的DNA聚合酶，其特征在于
i)所述聚合酶其天然形式包括氨基酸序列LSXXLX(V/I)PXXE(SEQ IDNO：1)，其中X是任何氨基酸；
ii)与所述天然序列相比，在所述序列的第4位的X被突变了，只是X不被突变为E；
iii)与所述酶的天然形式相比，所述热稳定的聚合酶降低了对掺入荧光素族染料标记的核苷酸的辨别。
b)进行染料终止子测序反应。
在上述方法的优选实施方案中，天然形式的酶具有氨基酸序列LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE(SEQ ID NO：2)，其中X是任何氨基酸。该氨基酸序列用三字母密码子表示为LeuSerXaaXaaLeuXaaIleProTyrGluGlu(SEQ IDNO：2)，其中第3位的“Xaa”是Gln或Gly，和第4位的“Xaa”是任何氨基酸，第6位的“Xaa”是Ser或Ala。在一个更优选的实施方案中，天然形式的氨基酸序列是LXQXLAIPYEE(SEQ ID NO：3)，其中X是任何氨基酸。该氨基酸序列用三字母密码子表示为LeuSerGlnXaaLeuAlaIleProTyrGluGlu(SEQ ID NO：3)，其中在第4位的“Xaa”是任何氨基酸。在一个最优选的实施方案中，在第4位的“Xaa”是Lys。
如上所述，用热稳定的DNA聚合酶的DNA测序反应需要一种作为链终止子的非常规碱基类似物和常规核苷酸以特定的浓度比例的混合物，以确保产生的延伸产物的群体在几百个碱基的距离内具有所有可能的片段长度。以前用于测序的某些热稳定的DNA聚合酶例如野生型Taq聚合酶的特征在于在常规和非常规核苷酸混合物存在下它们优选地掺入常规核苷酸。但是，某些最近所述的热稳定DNA聚合酶可以使非常规碱基类似物与常规碱基的比例从减少一百到几百倍或高达一千倍以上。
这样的一种聚合酶是Taq DNA聚合酶的F667Y突变体。另一个这样的突变体是具有F667Y突变和第46位具有将甘氨酸残基改变为天冬氨酸残基(G46D)突变的Taq DNA聚合酶。这种突变体聚合酶称作为是Ampli Taq，FS由Hoffmann-La Roche制造的并且由Perkin-Elmer销售的。F730YRma 30DNA聚合酶是另一种这样的聚合酶。该突变体聚合酶是以下1)和2)的组合：
1)被修饰为编码G46D突变的Taq DNA聚合酶的1-570核苷酸和2)编码第323位的天冬氨酸到丙氨酸突变、第325位谷氨酸到丙氨酸突变、以及第730位苯丙氨酸到酪氨酸突变的修饰的Tma DNA聚合酶的571-2679位核苷酸(美国专利申请系列号60/052065和欧洲专利申请号98112327/6，两文献引入本文作为参考)。另一种掺入非常规碱基类似物的聚合酶是来自于那不勒斯栖热袍菌的F730Y突变体DNA聚合酶(国际专利申请，公开号WO96/10640，WP96/41014，和WO97/09451，所有文献引入本文作为参考)。利用这些酶，对于给定的dNTP浓度，与以前使用的热稳定的DNA聚合酶相比可以将碱性蕊香红-ddNTP浓度降低约50到几百倍。
利用重组DNA的方法将本发明的E681K突变与F667Y突变结合以产生用于实施例IV中描述的测序反应的双重突变体Taq DNA聚合酶。该双重突变体可用于使用荧光素标记的染料终止子的染料-终止子测序反应。如实施例IV所述，其结果显示该酶在测序反应中能够掺入荧光素标记的染料终止子并且产生测序梯，在自动测序仪器中可以精确地读出该测序梯。出乎预料的是，还发现E681K和F667Y突变的结合所产生的一种热稳定DNA聚合酶由实施例III的检测试验测定，其与单独的F667Y突变相比具有增加3到4倍的延伸率
因此，在本发明的另一个方面，在本发明鉴定的关键基元能与那些对ddNTPs辨别降低的基元结合，产生的聚合酶提高了掺入标记的和未标记的ddNTPs的效率。这些聚合酶可用于DNA测序方法。在本发明的一个实施方案中，具有本文定义的关键基元的热稳定的DNA聚合酶也包括含有描述于美国专利申请系列号08/448,223的F667Y突变的关键基元。在该实施方案中，热稳定的DNA聚合酶的特征在于：
i)其天然形式的所述聚合酶包括第一氨基酸序列LSXXLX(V/I)PXXE(SEQ ID NO：1)，其中X是任何氨基酸；
ii)与所述天然序列相比，在所述第一氨基酸序列的第4位的X被突变了，但是X不被突变为E；
iii)与所述酶的天然形式相比，所述热稳定的聚合酶对掺入荧光素族染料标记的核苷酸的辨别降低了；和
iv)所述聚合酶包括第二氨基酸序列MRRXXKXXNYXXXYG(SEQ IDNO：12)，其中X是任何氨基酸；
v)与所述酶的天然形式相比，所述热稳定的聚合酶降低了对掺入的非常规核苷酸的辨别。该第二氨基酸序列的三字母密码子表示为MetArgArgXaaXaaLysXaaXaaAsnTyrXaaXaaXaaTyrGly(SEQ ID NO：12)，其中在第4，5，7，8，11，12和13位的“Xaa”是任何氨基酸。在一个优选的实施方案中，在第一氨基酸序列的第4位的“Xaa”被突变为Lys。在一个更优选的实施方案中，该酶是TaqDNA聚合酶并且包括E681K和F667Y突变。利用上面所述聚合酶的测序方法也是在本发明的范围内。
利用具有不是由突变衍生的但是以天然变异体形式存在的关键基元的热稳定的DNA聚合酶进行的改进的本发明测序方法也是在本发明的范围内。在该方面，嗜热细菌的DNA聚合酶具有一种关键基元在其第4位的残基不是Glu的。例如，对于来自于那不勒斯栖热袍菌的热稳定聚合酶，在基元LSXXLX(V/I)PXXE(SEQ ID NO：7)，其中第4位的“X”是除E以外的氨基酸时，该第4位的X是精氨酸残基。因此，本发明提供了利用天然的热稳定DNA聚合酶的改进的DNA测序方法，该酶包括氨基酸序列LSXXLX(V/I)PXXE(SEQ ID NO：7)，其中X是除E以外的氨基酸。在表示氨基酸的三字母密码子中，该序列表示为LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu(SEQ ID NO：7)，其中第3，5，9和10位的“Xaa”是任何氨基酸，该序列的第4位的“Xaa”是除Glu以外的任何氨基酸和第7位的“Xaa”是Val或Ile。在该实施方案中，本发明的测序方法包括：
a)提供热稳定的DNA聚合酶，其特征在于
i)所述聚合酶包括氨基酸序列LSXXLX(V/I)PXXE(SEQ ID NO：7)，其中X是除E以外的任何氨基酸；
ii)所述热稳定的聚合酶降低了对掺入荧光素族染料标记的核苷酸的辨别；和
b)提供用荧光素族染料标记的染料终止子，和
c)进行染料终止子测序反应。
在更优选的实施方案中，本发明的测序方法包括：
a)提供热稳定的DNA聚合酶，其特征在于
i)所述聚合酶包括第一氨基酸序列LSXXLX(V/I)PXXE(SEQ ID NO：7)，其中第4位X是除E以外的任何氨基酸；
ii)所述热稳定的聚合酶降低了对掺入荧光素族染料标记的核苷酸的辨别；
iii)所述聚合酶包括第二氨基酸序列MRRXXKXXNYXXXYG(SEQ IDNO：12)，其中X是任何氨基酸；
iv)所述热稳定的聚合酶降低了对掺入非常规核苷酸的辨别；和
b)提供用荧光素族染料标记的染料终止子，和
c)进行染料终止子测序反应。
在另一个优选的实施方案中，该酶包括氨基酸序列LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE(SEQ ID NO：13)，其中第4位的X是除E以外的任何氨基酸，在表示氨基酸的三字母密码子中，该氨基酸序列表示为LeuSerXaaXaaLeuXaaIleProTyrGluGlu(SEQ ID NO：13)，其中第3位的“Xaa”是Glu或Gly，第4位的“Xaa”是除Glu以外的任何氨基酸，和第6位的“Xaa”是Ser或Ala。在更优选的实施方案中，该氨基酸序列是LSQXLAIPYEE(SEQ ID NO：14)，其中X是除E以外的任何氨基酸，在表示氨基酸的三字母密码子中，该氨基酸序列表示为LeuSerGlnXaaLeuAlaIleProTyrGluGlu(SEQ ID NO：14)，其中第4位的“Xaa”是除Glu以外的任何氨基酸。
在另一个优选的实施方案中，该酶具有氨基酸序列LSVXLG(V/I)PVKE(SEQ ID NO：15)，其中X是除E以外的任何氨基酸。在表示氨基酸的三字母密码子中，该氨基酸序列表示为LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu(SEQ ID NO：15)其中第4位的“Xaa”是除Glu以外的任何氨基酸，和第7位的“Xaa”是Val或Ile。在更优选的实施方案中，该氨基酸序列是LSVXLGVPVKE(SEQ ID NO：16)，其中X是除E以外的任何氨基酸。在表示氨基酸的三字母密码子中，该氨基酸序列表示为LeuSerValXaaLeuGlyValProValLysGlu(SEQ ID NO：16)，其中第4位的“Xaa”是除Glu以外的任何氨基酸。在最优选的实施方案中，第4位的“Xaa”是Arg。在另一个更优选的实施方案中，该氨基酸序列是LSVXLGIPVKE(SEQ ID NO：17)，其中X是除E以外的任何氨基酸。在表示氨基酸的三字母密码子中，该氨基酸序列表示为LeuSerValXaaLeuGlyIleProValLysGlu(SEQ ID NO：17)，其中第4位的“Xaa”是除Glu以外的任何氨基酸，在一个最优选的实施方案中，第4位的“Xaa”是Arg。
在本发明的另一个实施方案中，这些测序方法是利用其对荧光素族染料标记的核苷酸的辨别水平降低的天然酶来完成的，所述水平降低是用例如实施例II中所述的ddNTP掺入试验来测定的。测定使DNA合成抑制50％所需要的ddCTP的浓度，以及测定抑制50％所必须的Zowie-ddCTP的浓度。计算出Zowie-ddCTP的浓度与ddCTP的浓度比例。在一个优选的实施方案中，该比例是10或更低。在一个更优选的实施方案中，该比例是4或更低。在一个最优选的实施方案中，该比例是1.2或更低。
虽然本文提供的实施例使用了用荧光素族染料标记的二脱氧核苷酸，但是其它非常规核苷酸和荧光染料的使用也是在本发明的范围内。其它非常规核苷酸包括荧光标记的dNTPs(它可用于标记DNA合成的产物)和荧光标记的rNTPs(它可用于标记引物延伸的产物)。其它染料包括其它带负电的荧光染料，例如BODIPY，其结构和化学特性类似于荧光素。其它染料也包括花菁染料。将花菁标记的dNTPs加入到标准的PCR反应，该反应包括具有E681K突变(和G46D突变)的Taq聚合酶。令人预料不到的是该花菁标记的dNTPs以高于野生型酶的水平掺入到扩增产物。因此，在该方面，本发明的标记DNA的方法将本发明的天然的或突变的聚合酶与用带负电的荧光染料或花菁染料标记的核苷酸结合使用。在一个实施方案中，本发明的DNA标记方法包括：
a)提供热稳定的DNA聚合酶，其特征在于
i)所述聚合酶包括氨基酸序列LSXXLX(V/I)PXXE(SEQ ID NO：7)，其中第4位的X是除E以外的任何氨基酸；
ii)所述聚合酶降低了对掺入非常规核苷酸的辨别；和
b)提供用带负电的荧光染料标记的核苷酸，和
c)进行DNA合成反应。
在另一个实施方案中，本发明的DNA标记方法包括：
a)提供了DNA聚合酶，其特征在于
i)所述聚合酶包括氨基酸序列LSXXLX(V/I)PXXE(SEQ ID NO：7)，其中第4位X是除E以外的任何氨基酸；
ii)所述聚合酶降低了对掺入非常规核苷酸的辨别；
b)提供用花菁染料标记的核苷酸，和
c)进行DNA合成反应。
在本发明的另一个方面，提供了这样一种热稳定DNA聚合酶，它是将能更有效地掺入rNTPs的突变，例如Taq DNA聚合酶第615位的谷氨酸突变为甘氨酸的突变，与本发明的关键基元结合。获得的酶能高效掺入荧光素族染料标记的核糖核苷酸。因此，在一个实施方案中，本发明提供了重组的热稳定的DNA聚合酶，该酶(1)其天然形式包括氨基酸序列LSXXLX(V/I)PXXE(SEQ ID NO：1)，其中X是任何氨基酸，(2)第4位的X被突变了，但是X不被突变为E，和(3)还包括氨基酸序列为LQIXLR(V/I)(SEQ ID NO：18)的关键区域，其中“X”是除E以外的任何氨基酸，和(4)能够有效地掺入用荧光素族染料标记的核糖核苷酸。后一序列的三字母密码子表示为SerGlnIleXaaLeuArgXaa，其中第4位的“Xaa”是除Glu以外的任何氨基酸，和第7位的“Xaa”是Val或Ile。
含有E615G和E681K突变的突变体聚合酶区域例如Taq的区域可在生产荧光素族染料标记的引物延伸产物的改进方法中使用。例如，在引物延伸反应例如PCR中，用荧光素族染料标记的rNTPs至少部分被4个标准的dNTPs之一替代并且包括双重突变体聚合酶例如E681K E615G Taq DNA聚合酶。该突变体聚合酶合成了引物延伸产物，该产物在沿其长度的各个位置上具有荧光素标记的核糖核苷酸残基。在热或碱处理之后，在各个核糖核苷酸残基处引物延伸的产物裂解，产生了末端被标记的片段群体。这种均一标记的片段群体代表了荧光标记物沿着引物延伸产物的长度的分布。标记的片段的这些特性可用于基于硅片的核酸检测反应方式中例如Cronin等人，见上文。因此，在一个实施方案中，本发明提供标记引物延伸产物的方法，该方法包括(1)提供热稳定的DNA聚合酶，其中(a)该酶的天然形式包括氨基酸序列LSXXLX(V/I)PXXE(SEQ ID NO：1)，其中X是任何氨基酸，(b)第4位的X被突变了，但是X不被突变为E，(c)还包括氨基酸序列为SQIXLR(V/I)(SEQ ID NO：18)的关键区域，其中“X”是除E以外的任何氨基酸，和(d)能够有效地掺入用荧光素和/或花菁族染料标记的核糖核苷酸和(2)进行引物延伸的反应。
还在另一个方面，具有本发明的关键基元的酶相对于野生型酶而言显示延伸率增加，如实施例IV的E681K F667Y突变体。在一个实施发明方案中，该酶的特征在于(1)该酶的天然形式包括氨基酸序列LSXXLX(V/I)PXXE(SEQ ID NO：1)，其中X是任何氨基酸，(2)在所述氨基酸序列的第4位的X被突变了，但是X不被突变为E，和(3)相对于野生型酶而言延伸率增加。在一个优选的实施方案中，该酶的特征在于(1)该酶的天然形式包括氨基酸序列LSXXLX(V/I)I)PXXE(SEQ ID NO：1)，其中X是任何氨基酸，(2)在所述氨基酸序列的第4位的X被突变了，但是X不被突变为E和(3)它还包括氨基酸序列MRRXXKXXNYXXXYG(SEQ ID NO：12)，其中X是任何氨基酸和(4)具有增加的延伸率。在一个更优选的实施方案中，该酶的特征在于(1)该酶的天然形式包括氨基酸序列LSXXLX(V/I)PXXE(SEQ ID NO：1)，其中X是任何氨基酸和(2)在所述氨基酸序列的第4位的X被突变了，但是X不被突变为K。在一个最优选的实施方案中。该酶是Taq DNA聚合酶并且含有E681K突变和F667Y突变。利用具有高延伸率的聚合酶进行的DNA测序和标记的方法以及完成所述方法的试剂盒也包括在本发明的范围内。
在本发明的DNA测序的优选的方法中，热稳定的焦磷酸酶包括在反应混合物中。已经证明利用嗜中温的以及突变的热稳定的DNA聚合酶(欧洲专利申请，公开号EP-A-763599和美国专利号5,665,551)使焦磷酸酶的测序数据提高。
在一个列举的实施方案中，本发明的热稳定的DNA聚合酶在5′核酸酶区域含有一个突变，其作用是大大地减弱该核酸酶活性。PCT专利公开号WO92/06200。(1992年4月16日公开)和美国专利号5,466,591中描述了修饰形式的Taq聚合酶。在本发明的一个实施方案中，编码第46位氨基酸的甘氨酸残基的密码子已经被编码天冬氨酸的密码子替代(G46D突变)。获得的酶由于5′-核酸酶的活性降低而提高了在循环测序反应中的用途。与野生型的酶相比，在G46D突变中聚合酶区域的氨基酸序列和聚合酶活性两者都没有改变。
在本发明的商业化实施方案中，用于实施由使用本发明而改进的方法的试剂盒是作为本发明的其它方面。用于DNA测序的这种试剂盒含有
a)热稳定的DNA聚合酶，其特征在于
i)所述聚合酶包括氨基酸序列LSXXLX(V/I)PXXE(SEQ ID NO：7)，其中第4位的X是除E以外的任何氨基酸；
ii)所述聚合酶降低了对掺入荧光素族染料标记的核苷酸的辨别；和
b)用带负电的荧光染料标记的染料-终止子，并且可以另外包括用于DNA测序的其它试剂例如dNTPs、热稳定的焦磷酸酶和合适的缓冲液。在另一个实施方案中，试剂盒的酶具有氨基酸序列LSVXLG(V/I)PVKE(SEQ IDNO：15)，其中X是除E以外的任何氨基酸。在表示氨基酸的三字母密码子中，该氨基酸序列表示为LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu(SEQ IDNO：15)其中第4位的“Xaa”是除Glu以外的任何氨基酸，和第7位的“Xaa”是Val或Ile。在一个优选的实施方案中，该氨基酸序列是LSVXIGVPVKE(SEQ ID NO：16)，其中X是除E以外的任何氨基酸。在表示氨基酸的三字母密码子中，该氨基酸序列表示为LeuSerValXaaLeuGlyValProValLysGlu(SEQ ID NO：16)，其中第4位的“Xaa”是除E以外的任何氨基酸。在一个更优选的实施方案中，第4位的“Xaa”是Arg。在另一个优选的实施方案中，该氨基酸序列是LSVXLGIPVKE(SEQ ID NO：17)，其中X是除E以外的任何氨基酸。在表示氨基酸的三字母密码子中，该氨基酸序列表示为LeuSerValXaaLeuGlyIleProValLysGlu(SEQ ID NO：17)，其中第4位的“Xaa”是除Glu以外的任何氨基酸，在一个更优选的实施方案中，第4位的“Xaa”是Arg。
用于DNA测序的其他试剂盒包括突变体热稳定的DNA聚合酶，其特征在于
a)其天然形式的所述聚合酶包括氨基酸序列LSXXLX(V/I)PXXE(SEQID NO：1)，其中X是任何氨基酸。
b)在所述氨基酸序列的第4位的X被突变了，但是X不被突变为E；
c)与所述酶的天然形式相比，所述热稳定的聚合酶降低了对掺入荧光素族染料标记的核苷酸的辨别，另外可以包括用于DNA测序反应的试剂例如链终止化合物、dNTPs、热稳定的焦磷酸酶和合适的缓冲液。当终止子被标记时，优选的标记物是荧光染料，更优选的标记物是带负电的荧光染料或花菁染料，最优选的标记物是荧光素族染料。在一个优选的实施方案中，试剂盒的酶具有氨基酸序列LS(Q/G)XI(S/A)IPYEE(SEQ ID NO：2)，其中X是任何氨基酸。该氨基酸序列用三字母密码子表示为LeuSerXaaXaaLeuXaaIleProTyrGlu(SEQ ID NO：2)，其中第3位的“Xaa”是Gln或Gly，和第4位的“Xaa”是任何氨基酸，第6位的“Xaa”是Ser或Ala。在一个更优选的实施方案中，氨基酸序列是LSQXLAIPYEE(SEQ IDNO：3)，其中X是任何氨基酸。该氨基酸序列用三字母密码子表示为LeuSerGlnXaaLeuAlaIleProTyrGluGlu(SEQ ID NO：3)，其中第4位的“Xaa”是任何氨基酸。在一个最优选的实施方案中，在第4位的“Xaa”是Lys。
用于标记DNA的试剂盒包括热稳定的DNA聚合酶，其特征在于
(a)其天然形式的所述聚合酶包括氨基酸序列LSXXLX(V/I)PXXE(SEQID NO：1)，其中X是任何氨基酸；(b)与所述天然形式相比，在所述氨基酸序列的第4位的X被突变了，但是X不被突变为E；(c)与相应的野生型酶相比，所述酶具有降低了的对掺入荧光素族染料标记的核苷酸的辨别，另外可以包括dNTPs和合适的缓冲液。在一个优选的实施方案中，第4位的X被突变为K。用于生产标记的DNA的其它试剂盒包括a)用带负电的荧光化合物标记的核苷酸或核苷酸类似物和b)具有下列关键基元的天然的热稳定的DNA聚合酶：
LSXXLX(V/I)PXXE(SEQ ID NO：7)
其中第4位的X可以是除E以外的任何氨基酸，并且所述聚合酶降低了对掺入荧光素标记的核苷酸的辨别；另外可以包括dNTPs和合适的缓冲液。在一个优选的实施方案中，第4位的X是K。在另一个优选的实施方案中，第4位的X是R。
用于标记引物延伸产物的试剂盒包括热稳定的DNA聚合酶，其特征在于a)其天然形式的所述聚合酶包括氨基酸序列LSXXLX(V/I)PXXE(SEQ IDNO：1)，其中X是任何氨基酸。(b)与所述天然序列相比，在所述氨基酸序列的第4位的X被突变了，但是X不被突变为E，(c)该聚合酶还包括第二氨基酸序列SQIXLR(V/I)(SEQ ID NO：18)，其中“X”是除E以外的任何氨基酸，(d)与相应的野生型酶相比，该酶具有降低了的对掺入荧光素族染料标记的核苷酸的辨别，另外可以包括用带负电的荧光化合物或花菁化合物标记的核糖核苷酸或核糖核苷酸类似物、dNTPs和合适的缓冲液。在一个优选的实施方案中，该聚合酶含有E681K突变和E615G突变。用于产生标记的引物延伸产物的其它试剂盒包括a)用带负电的荧光化合物或花菁化合物标记的核糖核苷酸或核糖核苷酸类似物和b)天然的热稳定DNA聚合酶其特征在于(i)包括氨基酸序列为LSXXLX(V/I)PXXE(SEQ ID NO：7)的关键基元，其中第4位的X是除E以外的任何氨基酸，(ii)降低了对掺入荧光素标记的核糖核苷酸的辨别力，另外可以包括dNTPs和合适的缓冲液。在一个优选的实施方案中，在第一氨基酸序列中，第4位的X是K和在第二氨基酸序列中，X是G。在另一个优选的实施方案中，在第一氨基酸序列中，第4位的X是R和在第二氨基酸序列中，X是G。
下面的实施例仅为了说明的目的并且决不限制权利要求限定的发明范围。
实施例I
对掺入荧光素族染料标记的核苷酸具有低辨别力
的修饰的Taq聚合酶基因的表达
Taq DNA聚合酶C-末端的氨基酸部分编码聚合酶的活性位点区域(Lawyer等人，1993，PCR方法和应用2：275-287，Freemont等人，1986，蛋白质：结构，功能和遗传学1：66-73，引入本文作为参考)。从全长Taq基因分离含有该区域的DNA片段，并且在锰存在下通过PCR扩增进行诱变(Leung等人，1989，Technique 1(1)：11-15)。对于该实施例，所有限制性酶是从New England Biolabs，Beverly MA购买。用Pst I和Bgl II消化被诱变的片段，并且克隆到Taq表达质粒，pLK 102，该质粒已经用PstI和Bgl II消化。质粒pLK 102是pLK 101的衍生物，其中900碱基对的Pst I-Bgl II片段被短的Pst I-Bgl II接头替代。质粒pLK 101是pSYC 1578的修饰形式(Lawyer等人，1993，见上文和美国专利号5,079,352)，其中缺失了将3’定位于聚合酶编码区域的的小的Hinc II/EcoRV片段。
将获得的表达质粒转化到大肠杆菌菌珠N 1624(从Yale大学的大肠杆菌Genetic Stock Center菌株号CGSC # 5066获得)并将获得的转化体筛选为使其与野生型酶相比能够更有效地掺入(α-32P)Tet-dCTP。利用该程序，鉴别突变体CS1为具有更有效地掺入(α-32P)Tet-dCTP的能力。用HindIII/NheI消化突变体CS1的经突变的Taq表达质粒和将获得的限制性片段亚克隆到pLK 101的野生型基因，替代未诱变的HindIII/NheI片段，以测定经诱变的Taq聚合酶基因的哪一部分是对于改变的表型起作用。含有HindIII/NheI限制性片段的亚克隆使野生型酶具有改变的表型，表明该突变是在该片段内。随后的亚克隆分析测定了该突变是定位于265碱基对的BamHI-NheI片段。
利用来自于Applied Biosystems Foster City，CA的Taq FS DyeDeoxyTM终止子循环测序试剂盒和Applied Biosystems Prism型377DNA测序系统在pCS1上进行265 NheI-BamHI片段的DNA测序分析。该序列分析鉴定了在Taq聚合酶基因的第681位的氨基酸发生的错义突变，这导致谷氨酸残基被赖氨酸(K)残基替代。在编码成熟蛋白质的第一甲硫氨酸残基的密码子处开始编号，如在美国专利号5,079,352，引入本文作为参考。E681K突变是特异性地由密码子序列的GAG改变为AAG引起的。质粒pCS1于1997年8月28日保藏于ATCC，保藏号为No.98521。
质粒pCS1在Taq聚合酶的编码序列可以含有另外的突变；但是，通过进一步的亚克隆试验，测定E681K突变仅对掺入荧光素染料标记的三磷酸核苷酸的效率增加起作用。该点突变定位于附图1显示的265碱基对BamHI-NheI DNA片段。在265碱基对DNA片段内，E681K突变是从野生型Taq聚合酶基因序列发生的唯一变化。
为了对掺入核苷酸类似物的效率进行进一步的分析和定量测定，将质粒pCS1的265碱基对BamHI-NheI的DNA片段克隆到Taq表达载体pRDA3-2，该载体在聚合酶区域内含有野生型序列。称作为克隆3-2的质粒pRDA3-2全部描述于PCT专利公开号WO 92/06200，引入本文作为参考。通过引物指导的诱变和随后将含有两突变的PCR产物克隆到质粒pRDA3-2的BamHI-NheI位点制备编码E691K突变和F667Y突变的第二克隆。
表达载体pRDA3-2含有可操作连接到噬菌体λPL启动子的全长TaqDNA聚合酶基因。在载体pRDA3-2中，Taq DNA聚合酶基因的5′-核酸酶区域在第46位的编码甘氨酸的密码子处含有降低了5′-核酸酶活性的点突变(G46D突变)。但是表达载体pRDA3-2的聚合酶区域内的基因序列相同于野生型的Taq DNA聚合酶基因序列。用BamHI和NheI消化质粒pRDA3-2，pCS1和E681KF667YPCR产物，采用常规方法将来自于质粒pCS1的265碱基对的DNA片段或PCR产物连接到载体pRDA3-2。获得的质粒pLK 112和pLK 113分别转化成大肠杆菌株DG 116(ATCC No.53606)。本文将这些质粒编码热稳定的DNA聚合酶分别称作为G46D E681K Taq和G46D E681KF667Y Taq。根据Lawyer等人(1993，见上文)描述的方法纯化所表达的热稳定的DNA聚合酶蛋白质G46D E681K F667Y Taq。
利用类似于，但是较小规模的制备方法纯化G46D E681K Taq酶如下：除非另有说明，所有步骤在4℃进行。将来自于475毫升培养物的细胞悬浮于30毫升的缓冲液(50mM Tris-HCL，pH 7.5，10mM EDTA，pH8.0，0.5mMPefabloc SC，0.5微克/毫升亮抑蛋白酶肽，0.1mMN α-p-甲苯磺酰基-L-赖氨酸氯甲基酮，1mMDTT)中。以50％反复使用对细胞超声处理，调整5次，每次1分钟，在冰上冷却1分钟。该步骤重复2次以上。然后加入1.5毫升的4.0M硫铵，在75℃的水浴中加热该混合物15分钟，随后置于冰上冷却。加入聚乙烯亚胺至0.6％并且在冰上将混合物保温10分钟。将混合物以16,000×g离心30分钟。将上清液上样于用50mMTris-HCL，pH 7.5，10mM EDTA，pH8.0 1mM DTT，0.2M硫酸铵的溶液平衡过的1.8毫升体积的苯基-琼脂糖柱(Bio-rad Polyprep层析柱)。三种溶液：1)25mM Tris-HCL，pH 7.5，1mM EDTA，1mM DTT，0.2M硫酸铵，2)25mM Tris-HCL，pH 7.5，1mM EDTA，1mM DTT，3)25mM Tris-HCL，pH 7.5，1mM EDTA，1mM DTT，20％聚乙二醇，各取6毫升洗涤该柱。用6毫升的25mM Tris-HCL，pH 7.5，1mM EDTA，1mM DTT，20％聚乙二醇，2.5M脲洗脱该聚合酶。在用3M氯化钾将该聚合酶制剂调整到100mM氯化钾之后，将该混合物上样到用25mM Tris-HCL，pH 7.5，1mM EDTA，1mM DTT，10mM氯化钾平衡过的肝素-琼脂糖柱(1.8毫升，Bio-rad Polyprep层析柱)。在用相同的缓冲液洗涤之后，在25mM Tris-HCL，pH 7.5，1mME DTA，1mM DTT，400mM氯化钾的缓冲液中洗脱样品。
在纯化之后，采用描述于Lawyer等人，1989，生物化学杂志264：6427-6437的活性测定方法测定经修饰的酶的活性，该文献引入本文作为参考。按如下所述计算纯化的酶的活性：1单位的酶相当于在30分钟内合成10纳摩尔的产物。所掺入的dCMP高达80-100皮摩尔时DNA聚合酶活性与酶浓度(为0.024-0.03单位/升的经稀释的酶)成线性正比。在描述于实施例II-IV的掺入和测序反应中利用了纯化的酶。
实施例II
比较ddNTPs掺入效率的分析试验
通过使用有限的模板，引物延伸竞争分析试验对G46D F667Y Taq，G46D F667Y E682K和Taq和F730Y Tma 30 DNA聚合酶掺入荧光素染料族标记的ddCTP的相对能力进行比较。在1997年7月9日递交的美国专利申请号60/052065和欧洲专利申请号98112327.6的实施例I中描述了F730Y Tma30DNA聚合酶，两文献引入本文作为参考。在该竞争性测试中，由于ddCTP的掺入终止了反应的延伸，所以聚合酶越易于将ddCTP掺入到经延伸的引物，被掺入的(α-33P)dCTP越少。因此，随着ddCTP掺入效率的增加，对DNA合成的抑制的程度增加。然后将ddCTP掺入的效率与掺入荧光素标记的ddCTP的效率进行比较以获得对于给定酶的掺入荧光标记的ddNTPs的效率的相对测量值。
按照前面的描述进行测试(Lawyer等人，1989，生物化学杂志264：6427)，包括下面的修饰。组建该检测混合物的最后浓度为60mM N-二甘氨酸pH 8.3，25℃，2.5mM氯化镁，1mM β-巯基乙醇，各20μM的dATP，dGTP，和dTTP(Perkin-Elmer)，20μM的dCTP(Perkin-Elmer)和(α-33P)dCTP(New England Nuclear，Boston，MA)。将M13mp 18(Perkin-Elmer)退火到引物DG 48，(SEQ ID NO：10)和向各反应的测试混合物中加入0.085pmole的退火模板的等同物。向38个0.5毫升的微量试管中各加入35微升的具有模板DNA的检测混合物。制备Zowie-ddCTP溶于25mMCAPSO缓冲液，pH 9.6中的稀释液以便当向反应试管中加入各10微升时，最后的Zowie-ddCTP浓度将是3，1，0.5，0.25，0.125或0.0625μM。对于G46D F667Y Taq DNA聚合酶，在两个试管中各制备3，1，0.5，0.25，0.125μM的Zowie-ddCTP。对于G46D F667Y E681K Taq和F740Y Tma 30 DNA聚合酶，在两个试管中各制备1，0.5，0.25，0.125或0.0625μM的Zowie-ddCTP。其余的8个反应试管接受10微升的25mM CAPSO缓冲液。pH 9.6。因此，38个试管中各含有35微升的测试混合物和10微升的25mM CAPSO缓冲液，pH 9.6或Zowie-ddCTP稀释液之一。
对于待测试的每一个酶，利用5微升的酶在各个Zowie-ddCTP稀释液的一个试管和仅含有CAPSO缓冲液的两个试管中开始聚合反应。使用下面浓度的酶，预定在该测试中对于底物的量而言各酶是过量的：如实施例I制备的2.5单位的F667Y G46D Taq聚合酶；如实施例I制备的1.25单位的G46D，F667Y E681K Taq DNA聚合酶；或2单位的F730Y Tma 30 DNA聚合酶。作为背景水平的对照，用酶稀释缓冲液而不是聚合酶起始其余的阴性对照。所有反应试管立即发生短暂的涡旋并且在75℃保温10分钟。通过加入10微升60mM EDTA而终止反应并且存贮于0℃。
在类似的试验中，在25mM CAPSO缓冲液，pH 9.6中稀释ddCTP，以便于当向反应试管中加入各10微升的稀释液时，最后的浓度是0.5，0.25，0.125，0.0625，或0.0312μM。将10微升的各个稀释液吸移到三个0.5毫升的微量试管中，所述试管含有如上所述的35微升的测试混合物。还准备含有35微升测试混合物和10微升的25mM CAPSO缓冲液，pH 9.6的四个试管。因此，19个试管各含有35微升的测试混合物和各10微升的25mMCAPSO缓冲液，pH9.6或ddCTP稀释液之一。
用2.5单位的G46D F667Y Taq DNA聚合酶；1.25单位的G46D F667YE681K Taq DNA聚合酶或2单位的F730Y Tma 30 DNA聚合酶在各ddCTP稀释液试管之一和CAPSO缓冲液之一中引发聚合反应。用酶稀释液缓冲液而不是含有聚合酶的缓冲液引发含有CAPSO的其余试管作为阴性对照。所有反应试管立即发生涡旋并且在75℃保温10分钟。通过加入10微升60mMEDTA而终止反应并且存贮于0℃。
对于各个反应，用1毫升2mMEDTA，50微克/毫升经剪切的鲑精DNA作为载体稀释60微升反应物的50微升试样。利用标准的程序用TCA沉淀该DNA并且收集于GF/C滤纸盘(Whatman)。测定每个样品的掺入的(α-33P)dCMP的量并且以没有ddNTP的CAPOS样品(0％抑制率)作为标准校正。计算各个样品的抑制50％所需要的ddCTP或Zowie-ddCTP的浓度并且显示于表2。对于特定的酶将抑制合成50％所需要的ddCTP的量与对合成抑制50％所需要的Zowie-ddCTP的量进行比较反映出各个酶掺入荧光标记的类似物的相对能力。这些资料证明G46D F667Y Taq DNA聚合酶掺入Zowie-ddCTP的效率低于所测试的三种酶(抑制50％时的Zowie-ddCTP与ddCTp的浓度比例＝25)。F730Y Tma 30 DNA聚合酶掺入该标记的类似物的效率高于G46D F667Y Taq DNA聚合酶(抑制50％时的Zowie-ddCTP与ddCTP的浓度比例＝4)，而G46D F667Y E681K Taq DNA聚合酶掺入标记的和未标记的ddCTP具有几乎相等的效率(抑制50％时的Zowie-ddCTP与ddCTP的浓度比例＝1.2)。
表2
抑制50％所需要的Zowie-ddCTP与ddCTP的浓度(μM)
DNA聚合酶 Zowie-
ddCTP Zowie-
ddCTP
ddCTP/d
dCTP
G46D F667Y Taq 1.4 0.056 25
G46DF667Y E681K Taq 0.14 0.116 1.2
F730Y Tma30 0.236 0.057 4
实施例III
延伸率测试
利用延伸率测试测定G46D F667Y Taq和G46D F667Y E681K Taq的延伸率。在该试验中，在(α-33P)dCTP存在下利用该酶延伸退火到M13模板的引物。使延伸反应变性并且通过变性琼脂糖凝胶电泳分析该产物。
按照前面的描述进行测试(Lawyer等人，1989，生物化学杂志264：6427)，包括下面的修饰。组建该检测混合物的最后浓度为50mM N-二甘氨酸pH 8.3，25℃，25mM氯化镁，1mM β-巯基乙醇，各200μM的dATP，dGTP，和dTTP(Perkin-Elmer)，含有(α-33P)dCTP(New EnglandNuclear，Boston，MA)100μM的dCTP(Perkin-Elmer)。将M13mp 18(Perkin-Elmer)退火到引物DG48，(SEQ ID NO：11)，和向各反应的测试混合物中加入0.085pmole的退化的模板的等同物。向14个0.5毫升的微量试管中加入35微升的具有模板DNA的检测混合物。在开始聚合反应之前在75℃将各个试管预沉淀至少30秒。
利用5微升的G36D F667Y Taq DNA聚合酶(2.5单位)或G46D F667YE681K Taq DNA聚合酶(1.25单位)在14个测试试管的6个中引发聚合反应，两种酶按照实施例I所述制备并且所使用的浓度代表了在该测试中对于底物的量而言预定过量的酶。作为背景水平的对照，用酶稀释缓冲液而不是聚合酶引发其余的阴性对照。立即短暂地涡旋所有反应试管并且在75℃保温。将含有G46D F667Y Taq DNA聚合酶的6个试管的2个保温3分钟，2个保温6分钟，和2个保温10分钟。类似地，用G46D F667Y E681K Taq DNA聚合酶起始两个试管并且保温30秒，两个保温1分钟和两个保温2分钟。对照试管保温3分钟。通过加入10微升60mMEDTA而终止反应并且存贮于0℃。
对于各个反应，用1毫升2mM EDTA，50微克/毫升经剪切的鲑精DNA作为载体稀释60微升反应物的25微升试样。利用标准的程序用TCA沉淀该DNA并且收集于GF/C滤纸盘(Whatman)。测定每个样品的掺入的(α-33P)dCMP的量。
将各个重复设置的剩余的35微升合并用乙醇沉淀70微升样品，干燥和重新悬浮于50mM氢氧化钠，1mM EDTA中。从这些样品移出试样以便从各个样品获得相等量的(α-33P)计数。如前所述将这些试样上样到0.9％的碱性琼脂糖凝胶上，电泳，干燥和自动自显影(Maniatis等人，1982，分子克隆：实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。用限制性酶HindIII(BRL)切割噬菌体λDNA并且将用(33P)标记的5′末端用作为分子量标准。
通过将各个样品的迁移距离与λDNA大小分子量标准的迁移距离进行比较确定各个样品中延伸产物的碱基对长度。将各个产物的碱基对数目除以各个延伸反应保温的秒数获得如下所述的延伸速率。
DNA聚合酶 时间 碱基对/秒
G46D F667Y Taq 3分钟 12.5
G46D F667Y Taq 6分钟 12.2
G46D F667Y Taq 10分钟 11.8
G46D F667Y E681K Taq 30秒 36.7
G46D F667Y E681K Taq 1分钟 41.7
G46D F667Y E681K Taq 2分钟 52.9
这些结果表明E681K突变的存在使G46D F667Y酶的延伸速率增加了3到4.3倍。
实施例IV
用G46D F667Y E681K Taq DNA聚合酶和
荧光素标记的ddNTPs进行的循环测序
本实施例证明将本发明的经修饰的聚合酶应用到荧光素染料标记的二脱氧终止子循环测序反应，利用了1μM或更少的ddNTP并且ddNTP∶dNTP的比例至少为1∶110。荧光素染料标记的二脱氧终止子是来自于Applied Biosystems PRISM Sequenase终止子测序试剂盒的试剂(Perkin-Elmer，Norwalk，CT)和与测序酶DNA聚合酶和α-巯基dNTPs一起使用最合适。在含有50mM Tris-HCL，(pH8.8)，2.0mM氯化镁，各100μM的dATP，dCTP，和dTTP(Perkin-Elmer，Norwalk，CT)，500μM的dITP(Pharmacia Biotech，Piscataw，NJ)，0.2微克的M13mp 18单链DNA模板(Perkin-Elmer)，0.15μM LacZ正向引物(Perkin-Elmer)，5单位的G46DF667Y E681K Taq聚合酶，20单位的rTth热稳定焦磷酸酶(欧洲专利申请，公开号EP-A-763599和美国专利号5665551)，0.05μM测序酶A染料终止子，0.80μM测序酶C染料终止子，0.80μM测序酶G染料终止子，和1.0μM测序酶T染料终止子的20微升体积中进行循环测序反应。所有4种测序酶染料终止子是从Perkin-Elmer购买的。将反应物置于预加热(75℃)的Perkin-Elmer GeneAmp PCR系统9600热循环仪并且按照如下所述进行25个循环：96℃进行10秒，50℃进行5秒，和60℃进行4分钟。按照制造商的说明用Centri-SepTM柱(Princeton Separations，Adelphia，NJ)纯化染料标记的片段并且真空离心干燥。将颗粒重新悬浮于6微升的去离子的甲酰胺：50毫克/毫升蓝葡聚糖(溶于25mM EDTA，pH8.0)5∶1(V/V)，在90℃加热3分钟，直接上样到预电泳的4％聚丙烯酰胺/6M脲凝胶并且在Perkin-Elmer ABI PRISM ‘377 DNA测序仪上按照制造商的说明进行电泳和分析(ABI PRISM 377 DNA测序仪使用者手册)。对于450碱基采用Perkin-Elmer ABI PRISM 377 DNA测序仪分析软件进行的自动化碱基呼叫产生大于98.5％的精确性(从引物的碱基+10到+460有6个错误)。
序列表
(1)一般信息：
(i)申请人：
(A)姓名：F.Hoffmann-La Roche Ltd
(B)街道：Grenzacherstrasse 124
(C)城市：Basel
(D)州：BS
(E)国家：瑞士
(F)邮政编码(ZIP)：CH-4070
(G)电话：(0)61 688 24 03
(H)传真：(0)61 688 13 95
(I)电传：962292/9655 12 hlr ch
(ii)发明名称：用于测序的改变了的热稳定DNA聚合酶
(iii)序列数目：18
(iv)计算机可读形式：
(A)媒介类型：Ploppy盘
(B)计算机：IBM PC兼容
(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
(D)软件：PatentIn Release # 1.0，版本# 1.30(EPO)
(vi)先前的申请信息：
(A)申请号：US 60/052,065
(B)申请日：1997年7月9日
(2)SEQ ID NO：1的信息
(i)序列特征
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名词/关键：区域
(B)位置：7
(D)其它信息：/标记＝Xaa
/注释＝“第7位的Xaa是Val或Ile”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：
LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu
1 5 10
(2)SEQ ID NO：2的信息
(i)序列特征
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名词/关键：区域
(B)位置：3.6
(D)其它信息：/标记＝Xaa
/注释＝“第3位的Xaa是Gln或Gly。第6位的Xaa是Ser或Ala”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：
LeuSerXaaXaaLeuXaaIleProTyrGluGlu
1 5 10
(2)SEQ ID NO：3的信息
(i)序列特征
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：
LeuSerXaaXaaLeuAlaIleProTyrGluGlu
1 5 10
(2)SEQ ID NO：4的信息
(i)序列特征
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名词/关键：区域
(B)位置：7
(D)其它信息：/标记＝Xaa
/注释＝“第7位的Xaa是Val或Ile”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：
LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu
1 5 10
(2)SEQ ID NO：5的信息
(i)序列特征
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：
LeuSerValXaaLeuGlyValProValLysGlu
1 5 10
(2)SEQ ID NO：6的信息
(i)序列特征
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：
LeuSerValXaaLeuGlyIleProValLysGlu
1 5 10
(2)SEQ ID NO：7的信息
(i)序列特征
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名词/关键：区域
(B)位置：4.7
(D)其它信息：/标记＝Xaa
/注释＝“第4位的Xaa是除谷氨酸残基以外的任何氨基酸。第7位的Xaa是Val或Ile”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：
LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu
1 5 10
(2)SEQ ID NO：8的信息
(i)序列特征
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名词/关键：区域
(B)位置：4
(D)其它信息：/标记＝Xaa
/注释＝“第4位的Xaa是除Glu以外的任何氨基酸。”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：
LeuXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGlu
1 5 10
(2)SEQ ID NO：9的信息
(i)序列特征
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名词/关键：区域
(B)位置：2.5
(D)其它信息：/标记＝Xaa
/注释＝“第2位的Xaa是Ser或Ala，第4位的Xaa是除Glu以外的任何氨基酸，第5位的Xaa是Val或Ile”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：
LeuXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGlu
1 5 10
(2)SEQ ID NO：10的信息
(i)序列特征
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名词/关键：区域
(B)位置：4
(D)其它信息：/标记＝Xaa
/注释＝“第4位的Xaa是除Glu以外的任何氨基酸。”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：
LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaXaaXaaXaaGlu
1 5 10
(2)SEQ ID NO：11的信息
(i)序列特征
(A)长度：30个碱基对
(B)类型：核酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：DNA(基因组)
(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：
GGGAAGGGCG ATCGGTGCGG GCCTCTTCGC
(2)SEQ ID NO：12的信息
(i)序列特征
(A)长度：15个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：
MetArgArgXaaXaaLysXaaXaaAsnTyrXaaXaaXaaTyrGly
1 5 10 15
(2)SEQ ID NO：13的信息
(i)序列特征
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名词/关键：区域
(B)位置：3.6
(D)其它信息：/标记＝Xaa
/注释＝“第3位的Xaa是Gln或Gly，第4位的Xaa是除Glu以外的任何氨基酸，第6位的Xaa是Ser或Ala。”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：
LeuSerXaaXaaLeuXaaIleProTyrGluGlu
1 5 10
(2)SEQ ID NO：14的信息
(i)序列特征
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名词/关键：区域
(B)位置：4
(D)其它信息：/标记＝Xaa
/注释＝“第4位的Xaa是除Glu以外的任何氨基酸”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：
LeuSerGlnXaaLeuAlaIleProTyrGluGlu
1 5 10
(2)SEQ ID NO：15的信息
(i)序列特征
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名词/关键：区域
(B)位置：4.7
(D)其它信息：/标记＝Xaa
/注释＝“第4位的Xaa是除Glu以外的任何氨基酸，第7位的Xaa是Val或Ile。”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：
LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu
1 5 10
(2)SEQ ID NO：16的信息
(i)序列特征
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名词/关键：区域
(B)位置：4
(D)其它信息：/标记＝Xaa
/注释＝“第4位的Xaa是除Glu以外的任何氨基酸”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：
LeuSerValXaaLeuGlyValProValLysGlu
1 5 10
(2)SEQ ID NO：17的信息
(i)序列特征
(A)长度：11个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名词/关键：区域
(B)位置：4
(D)其它信息：/标记＝Xaa
/注释＝“第4位的Xaa是除Glu以外的任何氨基酸”
(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：
LeuSerValXaaLeuGlyIleProValLysGlu
1 5 10
(2)SEQ ID NO：18的信息
(i)序列特征
(A)长度：7个氨基酸
(B)类型：氨基酸
(C)链数：单链
(D)拓扑结构：线性
(ii)分子类型：肽
(ix)特征：
(A)名词/关键：区域
(B)位置：4.7
(D)其它信息：/标记＝Xaa
/注释＝“第4位的Xaa是除G1u以外的任何氨基酸，第7位的Xaa是Val或Ile”
(xxi)序列描述：SEQ ID NO：18：
SerGlnIleXaaLeuArgXaa
1 5
Claims (33)
1.重组的热稳定DNA聚合酶，其特征在于
a)所述聚合酶的天然形式包括SEQ ID NO：1所示氨基酸序列LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu，其中在该序列的3，6，9和10位的“Xaa”是任何的氨基酸序列，在所述序列第4位的“Xaa”是极性氨基酸，并且在该序列的第7位的“Xaa”是Val或Ile；
b)与所述天然序列相比，第4位所述的“Xaa”被突变为Lys，Arg或His；和
c)与所述聚合酶的天然形式相比，所述热稳定DNA聚合酶降低了对掺入带有荧光素族染料标记的核苷酸的辨别力大小。
2.根据权利要求1所述的重组的热稳定DNA聚合酶，其中所述的极性氨基酸是正电荷氨基酸。
3.根据权利要求1或2所述的重组的热稳定DNA聚合酶，其中所述的核苷酸是二脱氧核苷酸，并且所述的辨别力比所述聚合酶天然形式的辨别力降低至少3倍。
4.根据权利要求3所述的重组的热稳定DNA聚合酶，其中所述的辨别力大小是通过确定二脱氧核苷酸的浓度来测定的，其中所述浓度是对DNA合成抑制50％所需要的。
5.根据权利要求3所述的重组的热稳定DNA聚合酶，其中所述的聚合酶来自选自下组的嗜热菌种：非洲栖热腔菌、热坚芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌。
6.根据权利要求3所述的重组的热稳定DNA聚合酶，其中所述的聚合酶是来自栖热菌菌种。
7.根据权利要求6所述的重组的热稳定DNA聚合酶，其特征在于
a)所述聚合酶的天然形式包括SEQ ID NO：2所示氨基酸序列LeuSerXaaXaaLeuXaaIleProTyrGluGlu，其中第3位的“Xaa”是Gln或Gly，并且第4位的“Xaa”是极性氨基酸，第6位的“Xaa”是Ser或Ala
b)与所述天然序列相比，第4位的“Xaa”被突变为Lys，Arg或His；和
c)与所述聚合酶的天然形式相比，所述热稳定的DNA聚合酶降低了对掺入带有荧光素族染料标记的核苷酸的辨别力。
8.根据权利要求7所述的重组的热稳定DNA聚合酶，其中所述极性氨基酸是正电荷氨基酸。
9.根据权利要求7或8所述的重组的热稳定DNA聚合酶，其特征在于
a)所述聚合酶的天然形式包括SEQ ID NO：3所示氨基酸序列LeuSerGlnXaaLeuAlaIleProTyrGluGlu，其中在第4位的“Xaa”是极性氨基酸
b)与所述天然序列相比，第4位的“Xaa”被突变为Lys，Arg或His；和
c)与所述聚合酶的天然形式相比，所述热稳定DNA聚合酶降低了对掺入带有荧光素族染料标记的核苷酸的辨别力。
10.根据权利要求9所述的重组的热稳定DNA聚合酶，其中所述极性氨基酸是正电荷氨基酸。
11.根据权利要求9或10所述的重组的热稳定DNA聚合酶，其特征在于第4位的“Xaa”被突变为Lys。
12.根据权利要求3所述的重组的热稳定的DNA聚合酶，其中所述的聚合酶是来自栖热袍菌种。
13.根据权利要求12所述的重组的热稳定的DNA聚合酶，其特征在于
a)所述聚合酶的天然形式包括SEQ ID NO：4所示氨基酸序列LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu，其中第4位的“Xaa”是极性氨基酸，并且第7位的“Xaa”是Val或Ile
b)与所述天然序列相比，第4位的“Xaa”被突变为Lys，Arg或His；和
c)与所述聚合酶的天然形式相比，所述热稳定DNA聚合酶降低了对掺入带有荧光素族染料标记的核苷酸的辨别力。
14.根据权利要求13所述的重组的热稳定DNA聚合酶，其中所述极性氨基酸是正电荷氨基酸。
15.根据权利要求13或14所述的重组的热稳定的DNA聚合酶，其特征在于
a)所述聚合酶的天然形式包括SEQ ID NO：4所示氨基酸序列LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu，其中第4位的“Xaa”是Arg，并且第7位的“Xaa”是Val或Ile
b)与所述天然序列相比，第4位的“Xaa”被突变为Lys或His；和
c)与所述聚合酶的天然形式相比，所述热稳定DNA聚合酶降低了对掺入带有荧光素族染料标记的核苷酸的辨别力。
16.编码权利要求1-15任一项所述的重组热稳定DNA聚合酶的核酸序列。
17.含有编码权利要求1-15任一项所述的重组热稳定DNA聚合酶的核酸序列的载体。
18.含有编码权利要求1-15任一项所述的重组热稳定DNA聚合酶的核酸序列的宿主细胞。
19.用于制备权利要求1-15任一项所述的重组热稳定DNA聚合酶的方法，所述方法包括：
(a)将含有编码权利要求1-15任一项所述的重组热稳定DNA聚合酶的核酸序列的宿主细胞在驱动重组热稳定DNA聚合酶表达的条件下进行培养；和
(b)从宿主细胞或从培养基分离重组热稳定DNA聚合酶。
20.由权利要求19的方法制备的重组热稳定DNA聚合酶。
21.DNA测序的方法，该方法包括：
a)提供如权利要求1-15任一项所述的重组热稳定DNA聚合酶；
b)提供用带负电的荧光染料标记的染料终止子；和
c)进行染料终止子测序反应。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述重组热稳定的聚合酶降低了对掺入带有荧光素族染料标记的核苷酸的辨别力，其中所述的核苷酸是二脱氧核苷酸，并且其中所述的辨别力大小是通过测定对DNA合成抑制50％所需要的荧光素族染料标记的二脱氧核苷酸的浓度与抑制50％所需要的未标记的二脱氧核苷酸的浓度的比例来测定的。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述比例是1.2-10。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述比例是4。
25.生产标记的DNA的方法，所述方法包括：
a)提供如权利要求1-15任一项所述的重组热稳定DNA聚合酶；
b)提供用荧光素族染料标记的核苷酸；和
c)进行DNA合成反应。
26.产生标记的引物延伸产物的方法，该方法包括：
a)提供如权利要求1-15任一项所述的重组热稳定DNA聚合酶，所述聚合酶还包括SEQ ID NO：18所示第二氨基酸序列SQIXLR(V/I)，其中“X”是除E以外的任何氨基酸，
b)提供用荧光素族染料标记的核糖核苷酸，和
c)进行引物延伸反应。
27.权利要求1-15任一项所述的重组热稳定DNA聚合酶在体外DNA合成中的应用。
28.用于DNA测序的试剂盒，该试剂盒包括权利要求1-15任一项所述的热稳定DNA聚合酶和用带负电的荧光染料标记的终止子。
29.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述的重组热稳定的DNA聚合酶降低了对掺入带有荧光素族染料标记的核苷酸的辨别力，其中降低的辨别力大小是通过测定对DNA合成抑制50％所需要的荧光素族染料标记的ddNTP的浓度与抑制50％所需要的未标记的ddNTP的浓度的比例来测定的，并且所述的比例是1.2-10。
30.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述的比例是4。
31.根据权利要求29所述的试剂盒，其中所述的辨别力大小比所述聚合酶的天然形式至少降低了5倍。
32.用于生产标记的DNA的试剂盒，该试剂盒包括权利要求1-15任一项所述的重组热稳定DNA聚合酶和用带负电的荧光染料标记的核苷酸。
33.产生标记的引物延伸产物的试剂盒，该试剂盒包括权利要求1-15任一项所述的重组热稳定DNA聚合酶和用带负电的荧光素染料标记的核糖核苷酸。
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| US7875440B2 (en) | 1998-05-01 | 2011-01-25 | Arizona Board Of Regents | Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules |
| US6780591B2 (en) * | 1998-05-01 | 2004-08-24 | Arizona Board Of Regents | Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules |
| US20030138834A1 (en) * | 1998-08-19 | 2003-07-24 | Dawson Elliott P. | Method for determining polynucleotide sequence variations |
| US20040121394A1 (en) * | 1998-08-19 | 2004-06-24 | Dawson Elliott P. | Method for determining polynucleotide sequence variations |
| US7501245B2 (en) * | 1999-06-28 | 2009-03-10 | Helicos Biosciences Corp. | Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences |
| US6818395B1 (en) * | 1999-06-28 | 2004-11-16 | California Institute Of Technology | Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences |
| JP2003507072A (ja) * | 1999-08-21 | 2003-02-25 | アマシャム・バイオサイエンス・コーポレイション | 耐塩性を改善した、Ｅ６８１にアミノ酸置換を有するＴａｑＤＮＡポリメラーゼおよびその同族体 |
| US7179590B2 (en) * | 2000-04-18 | 2007-02-20 | Roche Molecular Systems, Inc | High temperature reverse transcription using mutant DNA polymerases |
| US6214557B1 (en) * | 2000-06-06 | 2001-04-10 | Washington University | Cold sensitive mutant DNA polymerases |
| EP1370690B1 (en) | 2001-03-16 | 2012-03-14 | Kalim Mir | Arrays and methods of use |
| AU2002316586A1 (en) * | 2001-07-06 | 2003-01-21 | Amersham Biosciences Corp | Novel dna polymerases having amino acid substitutions and homologs thereof |
| WO2003068991A1 (en) * | 2002-02-12 | 2003-08-21 | Applera Corporation | Polymerase compositions |
| DE10315640A1 (de) * | 2003-04-04 | 2004-10-14 | Ignatov, Konstantin | Verfahren zur kontrollierten Freisetzung von Komponenten in eine Lösung |
| KR100571808B1 (ko) * | 2003-04-16 | 2006-04-17 | 삼성전자주식회사 | 다층 박막 구조를 가진 ｄｎａ 칩 |
| US7820030B2 (en) * | 2003-04-16 | 2010-10-26 | Handylab, Inc. | System and method for electrochemical detection of biological compounds |
| US20050170367A1 (en) * | 2003-06-10 | 2005-08-04 | Quake Stephen R. | Fluorescently labeled nucleoside triphosphates and analogs thereof for sequencing nucleic acids |
| US7572581B2 (en) * | 2003-06-30 | 2009-08-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | 2′-terminator nucleotide-related methods and systems |
| US7169560B2 (en) | 2003-11-12 | 2007-01-30 | Helicos Biosciences Corporation | Short cycle methods for sequencing polynucleotides |
| WO2005054441A2 (en) * | 2003-12-01 | 2005-06-16 | California Institute Of Technology | Device for immobilizing chemical and biomedical species and methods of using same |
| US7981604B2 (en) | 2004-02-19 | 2011-07-19 | California Institute Of Technology | Methods and kits for analyzing polynucleotide sequences |
| US20060046258A1 (en) * | 2004-02-27 | 2006-03-02 | Lapidus Stanley N | Applications of single molecule sequencing |
| US20050239085A1 (en) * | 2004-04-23 | 2005-10-27 | Buzby Philip R | Methods for nucleic acid sequence determination |
| US20070117103A1 (en) * | 2005-11-22 | 2007-05-24 | Buzby Philip R | Nucleotide analogs |
| US7476734B2 (en) * | 2005-12-06 | 2009-01-13 | Helicos Biosciences Corporation | Nucleotide analogs |
| JP2008512084A (ja) * | 2004-05-25 | 2008-04-24 | ヘリコス バイオサイエンシーズ コーポレイション | 核酸の配列決定のための方法およびデバイス |
| US20070117104A1 (en) * | 2005-11-22 | 2007-05-24 | Buzby Philip R | Nucleotide analogs |
| US20060024678A1 (en) * | 2004-07-28 | 2006-02-02 | Helicos Biosciences Corporation | Use of single-stranded nucleic acid binding proteins in sequencing |
| US20060118754A1 (en) * | 2004-12-08 | 2006-06-08 | Lapen Daniel C | Stabilizing a polyelectrolyte multilayer |
| US7220549B2 (en) * | 2004-12-30 | 2007-05-22 | Helicos Biosciences Corporation | Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing |
| US20060172328A1 (en) * | 2005-01-05 | 2006-08-03 | Buzby Philip R | Methods and compositions for correcting misincorporation in a nucleic acid synthesis reaction |
| US7482120B2 (en) * | 2005-01-28 | 2009-01-27 | Helicos Biosciences Corporation | Methods and compositions for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction |
| US7524831B2 (en) * | 2005-03-02 | 2009-04-28 | Schering Corporation | Treatments for Flaviviridae virus infection |
| US20060263790A1 (en) * | 2005-05-20 | 2006-11-23 | Timothy Harris | Methods for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction |
| US7666593B2 (en) | 2005-08-26 | 2010-02-23 | Helicos Biosciences Corporation | Single molecule sequencing of captured nucleic acids |
| GB0518867D0 (en) * | 2005-09-15 | 2005-10-26 | Secretary Trade Ind Brit | Microscopy tip |
| US20070117102A1 (en) * | 2005-11-22 | 2007-05-24 | Buzby Philip R | Nucleotide analogs |
| US20070128610A1 (en) * | 2005-12-02 | 2007-06-07 | Buzby Philip R | Sample preparation method and apparatus for nucleic acid sequencing |
| AU2006330947B2 (en) | 2005-12-22 | 2012-04-12 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Polymerases for nucleotide analogue incorporation |
| AU2006331677A1 (en) * | 2005-12-22 | 2007-07-05 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Protein engineering strategies to optimize activity of surface attached proteins |
| CA2633476C (en) * | 2005-12-22 | 2015-04-21 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Active surface coupled polymerases |
| US8962293B2 (en) | 2006-10-18 | 2015-02-24 | Roche Molecular Systems, Inc. | DNA polymerases and related methods |
| WO2008051530A2 (en) * | 2006-10-23 | 2008-05-02 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing |
| US20100081924A1 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Histological facilitation systems and methods |
| US20100081926A1 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Histological facilitation systems and methods |
| US20100081915A1 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Searete Llc, Alimited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Histological facilitation systems and methods |
| US20100081916A1 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware. | Histological facilitation systems and methods |
| US20100081928A1 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Histological Facilitation systems and methods |
| US20100081927A1 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Histological facilitation systems and methods |
| FR2940125B1 (fr) * | 2008-12-23 | 2013-03-22 | Isp Investments Inc | Composition cosmetique ou pharmaceutique apaisante comprenant un peptide activateur de la hmg-coa reductase |
| FR2940291B1 (fr) | 2008-12-23 | 2012-12-21 | Isp Investments Inc | Peptide derive d'hmg-coa reductase et composition cosmetique ou pharmaceutique le contenant |
| US8933036B2 (en) | 2009-04-15 | 2015-01-13 | Isp Investments Inc. | Cosmetic and/or pharmaceutical composition comprising a yeast peptide hydrolysate and use of the yeast peptide hydrolysate as an active agent for strengthening hair |
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| FR2944445B1 (fr) | 2009-04-15 | 2013-08-16 | Isp Investments Inc | Composition cosmetique et/ou pharmaceutique comprenant un hydrolysat peptidique apaisant |
| CN103025870B (zh) | 2010-06-18 | 2015-07-01 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 具有增强的3’-错配辨别力的dna聚合酶 |
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| AU2011267421B2 (en) | 2010-06-18 | 2014-04-24 | F. Hoffmann-La Roche Ag | DNA polymerases with increased 3'-mismatch discrimination |
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| EP2675897B1 (en) | 2011-02-15 | 2016-05-11 | Roche Diagnostics GmbH | Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination |
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| ES2553400T3 (es) | 2011-07-28 | 2015-12-09 | F. Hoffmann-La Roche Ag | ADN polimerasas con actividad mejorada |
| EP2788479B1 (en) | 2011-12-08 | 2016-02-10 | Roche Diagnostics GmbH | Dna polymerases with improved activity |
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| US10308918B2 (en) | 2015-02-02 | 2019-06-04 | Roche Molecular Systems, Inc. | Polymerase variants |
| US11739371B2 (en) | 2015-02-18 | 2023-08-29 | Invitae Corporation | Arrays for single molecule detection and use thereof |
| US10526588B2 (en) * | 2015-05-14 | 2020-01-07 | Roche Sequencing Solutions, Inc. | Polymerase variants and uses thereof |
| JP6963238B2 (ja) | 2015-11-27 | 2021-11-05 | 国立大学法人九州大学 | Ｄｎａポリメラーゼ変異体 |
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| CN117083392A (zh) * | 2021-03-19 | 2023-11-17 | 深圳华大智造科技股份有限公司 | 用于有效掺入核苷酸与3’-磷酸酯和其他3’-终止子的聚合酶 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CA2018273C (en) * | 1989-06-09 | 1999-04-06 | Peter D. Senter | Thermally stable cytosine deaminase |
| US5338678A (en) * | 1989-06-09 | 1994-08-16 | Oncogen, A Limited Partnership | Expression of DNA sequences encoding a thermally stable cytosine deaminase from saccharomyces |
| US5292658A (en) * | 1989-12-29 | 1994-03-08 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. Boyd Graduate Studies Research Center | Cloning and expressions of Renilla luciferase |
| US6083686A (en) | 1990-10-26 | 2000-07-04 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostic Systems, Inc. | Increased production of Thermus aquaticus DNA polymerase in E. coli |
| US5446591A (en) * | 1993-02-08 | 1995-08-29 | Lockheed Missiles & Space Co., Inc. | Lens mounting for use with liquid lens elements |
| US5571706A (en) * | 1994-06-17 | 1996-11-05 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Plant virus resistance gene and methods |
| US6015668A (en) * | 1994-09-30 | 2000-01-18 | Life Technologies, Inc. | Cloned DNA polymerases from thermotoga and mutants thereof |
| ATE143057T1 (de) * | 1994-10-17 | 1996-10-15 | Harvard College | Dns polymerase mit veränderter nukleotid- bindungstelle |
| US5614365A (en) | 1994-10-17 | 1997-03-25 | President & Fellow Of Harvard College | DNA polymerase having modified nucleotide binding site for DNA sequencing |
| US5852191A (en) * | 1995-06-07 | 1998-12-22 | Carnegie Mellon University | Rigidized monomethine cyanines |
| US6107029A (en) * | 1996-07-31 | 2000-08-22 | Message Pharmaceticals, Inc. | Universal method for detecting interactions between RNA molecules and RNA binding proteins |
| CZ293215B6 (cs) * | 1996-08-06 | 2004-03-17 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Rekombinantní tepelně stálá DNA polymeráza, způsob její přípravy a prostředek, který ji obsahuje |
| US5723298A (en) * | 1996-09-16 | 1998-03-03 | Li-Cor, Inc. | Cycle labeling and sequencing with thermostable polymerases |
| WO1998040496A1 (en) * | 1997-03-12 | 1998-09-17 | The Perkin-Elmer Corporation | Dna polymerases having improved labeled nucleotide incorporation properties |
-
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