NO327476B1

NO327476B1 - Rekombinant termostabil DNA-polymerase samt anvendelse og fremstilling derav; nukleinsyresekvens, vektor, vertscelle, fremgangsmate for DNA-sekvensering; fremgangsmate for fremstilling av merket DNA og primerekstensjonsprodukter; testsett for DNA-sekvensering, fremstilling av merket DNA og for fremstilling av merkede primerekstensjonsprodukter.

Info

Publication number: NO327476B1
Application number: NO19984157A
Authority: NO
Inventors: David Harrow Gelfand; Thomas W Myers; Fred Lawrence Relchert; Christopher Lim Sigua; Lisa Vivian Kalman
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1997-09-11
Filing date: 1998-09-10
Publication date: 2009-07-13
Also published as: NO984157L; EP0902035A2; KR19990029676A; HK1018796A1; US6346379B1; HU9802024D0; BR9803419A; CZ287498A3; TW513439B; CN1218832A; IL126100A; AU741366B2; HUP9802024A2; PL328525A1; JP4417452B2; CZ293217B6; AU8416198A; CN1197962C; JPH11137284A; US20030152988A1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører rekombinant termostabil DNA-polymerase samt anvendelse og fremstilling derav; nukleinsyresekvens, vektor, vertscelle, fremgangsmåte for DNA-sekvensering; fremgangsmåte for fremstilling av merket DNA og primerekstensjonsprodukter; testsett for DNA-sekvensering, fremstilling av merket DNA og for fremstilling av merkede

primerekstensjonsprodukter.

OMRADE FOR OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse vedrører termostabile DNA-polymeraser som har øket effektivitet for inkorporering av nukleosidtrifosfater merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien. Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer fremgangsmåter for isolering og fremstilling av slike forandrede polymeraser. Enzymene ifølge denne oppfinnelse er anvendelige for mange applikasjoner i molekylær biologi og er spesielt fordelaktige for sekvensbestemmelse av nukleinsyre.

NO 973595 beskriver termostabile DNA-polymeraser med øket effektivitet for inkorporering av ribonukleosid-trifosfater.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Inkorporering av nukleosidtrifosfater (dNTP'er) merket med fluorescerende fargestoffer er viktig for mange in vitro DNA-synteseanvendelser. F.eks. vil fargestoffterminator DNA-sekvenseringsreaksjoner kreve inkorporering av fluorescerende dideoksynukleotidanaloger for terminering og merking. Dessuten kan in vitro syntese av merkede produkter involvere inkorporering av fluorescerende nukleotider eller nukleotidanaloger. F.eks. er fluoresceinmerket DNA blitt anvendt i hybridiseringsanalyser ved anvendelse av mikro-rekker av immobiliserte prober (Cronin et al., 1996, Human Mutation 7:244).

For å sikre nøyaktighet av DNA-replikasjon har DNA-polymeraser en svært sterk tilbøyelighet for inkorporering av sine normale substrater, referert til heri som konvensjonelle deoksynukleosidtrifosfater (dNTP'er), og mot inkorporering av ukonvensjonelle dNTP'er innbefattet dNTP'er og dNTP-analoger merket med fluorescerende fargestoffer. I cellen vil denne egenskap svekke inkorporering av unormale baser så som dUTP i en voksende DNA-tråd. In vitro vil denne egenskap være spesielt åpenbar hvor både konvensjonelle og ukonvensjonelle fluoresceinmerkede nukleosidtrifosfater er tilstede, så som i DNA-sekvenseringsreaksjoner som anvender en versjon av dideoksykjedeterminerings-metoden som anvender fargestoffterminatorer (Lee et al., 1992, Nuc. Acids. Res. 20:2471.

Kommersielt tilgjengelige DNA-syklus-sekvenserings-«kits» for fargestoffterminatormetoder anvender kjedeterminator ddNTP'er merket med fluorescerende fargestoffer av rhodaminfamilien. Rhodaminfargestoffer er imidlertid zwitterioniske i ladning, og nukleosidtrifosfater merket med disse fargestoffer vil migrere uregelmessig i de elektroforetiske geler som anvendes til å separere sekvenseringsproduktene for påvisning. Denne egenskap ved rhodaminfamiliefargestoffene gjør det nødvendig å lage modifikasjoner i standardsekvenseringsprotokollen som inkluderer anvendelse av dITP og et ytterligere bearbeidingstrinn før elektroforesen.

I motsetning vil negativt ladede fluorescerende fargestoffer så som fargestoffer av fluoresceinfamilien tillate 1) bedre separasjon mellom de merkede nukleotidtrifosfater og merkede primerekstensjonsprodukter, og 2) bedre elektroforetisk migrering av de merkede sekvenseringsprodukter enn nøytrale eller positivt ladede fluorescerende fargestoffer. Anvendelse av fargestoffer av fluoresceinfamilien vil således unngå behovet for ytterligere bearbeidingstrinn som er nødvendige ved anvendelse av fargestoffer av rhodaminfamilien. Tilgjengelige fargestoffer av fluoresceinfamilien er imidlertid ikke ideelle for anvendelse i aktuelle kommersielt tilgjengelige DNA-syklus-sekvenserings-formater, fordi ddNTP'er merket med disse fargestoffer ikke effektivt blir inkorporert i sekvenseringsprodukter ved anvendelse av disse formater. Følgelig er det et behov for kommersielt tilgjengelige termostabile DNA-polymeraser som effektivt kan inkorporere både konvensjonelle og fluoresceinmerkede nukleotider. Den foreliggende oppfinnelse tjener til å fylle dette behov. Videre vil en uventet egenskap av de mutante enzymer ifølge denne oppfinnelse være den økede hastighet av primerekstensjon i forhold til det tilsvarende enzym av villtypen. En annen uventet egenskap er den økede uniformitet av inkorporering av de forskjellige terminatornukleotider i automatisert DNA-sekvensanalyse.

SAMMENDRAG AV OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer templatavhengige termostabile DNA-polymeraseenzymer som har redusert diskriminering mot inkorporering av nukleotider merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien sammenlignet med tidligere karakteriserte enzymer. Disse enzymer inkorporerer nukleotider, innbefattet deoksynukleotider (dNTP'er) og baseanaloger så som dideoksynukleotider (ddNTP'er) som er merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien mer effektivt enn konvensjonelle termostabile enzymer.

Ifølge den foreliggende oppfinnelse blir det identifisert en kritikalitetsregion i termostabile DNA-polymeraser, og som påvirker polymerasens evne til å inkorporere nukleotider merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien, samtidig som den beholder evnen til korrekt å inkorporere naturlige nukleotider. Denne kritikalitetsregion, eller kritiske motiv, kan innføres i gener for termo-stabile DNA-polymeraser ved rekombinante DNA-metoder så som setespesifikk mutagenese for å tilveiebringe fordelene ifølge denne oppfinnelse.

I ett aspekt skal denne oppfinnelse således tilveiebringe rekombinante termo-stabile DNA-polymeraseenzymer som karakteriseres ved at enzymene er blitt mutert til å fremskaffe det kritiske motiv og har redusert diskriminering mot inkorporering av nukleotider merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien, sammenlignet med det tilsvarende villtypeenzym.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig rekombinant termostabil DNA-polymerase, kjennetegnet ved at

a) i sin naturlige form omfatter nevnte polymerase aminosyresekvensen LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu (SEKV ID NR.1), hvor "Xaa" i

posisjon 3 av nevnte sekvens er Gin eller Gly, "Xaa" i posisjon 6 i nevnte sekvens er Ser eller Ala, "Xaa" i posisjon 7 av nevnte sekvens er Val

eller Ile, "Xaa" i posisjon 9 av nevnte sekvens er Tyr og "Xaa" i posisjon 10 av nevnte sekvens er Glu; b) nevnte "Xaa" i posisjon 4 er mutert til en polar aminosyre eller til en positivt ladet aminosyre; og c) nevnte termostabile DNA-polymerase har et nivå av diskriminering mot inkorporering av nukleotider merket med fluoresceinfamiliefargestoffer

som er redusert sammenlignet med den naturlige form av nevnte polymerase, hvor nevnte nukleotid er et dideoksynukleotid, og nevnte diskrimineringsnivå er minst tre ganger lavere enn nivået av nevnte naturlige form av nevnte polymerase, hvor nevnte diskrimineringsnivå blir målt ved å bestemme den konsentrasjon av et dideoksynukleotid merket med et fluoresceinfargestoff som er nødvendig for 50% inhibering av DNA-syntese.

I en annen utførelse vil de rekombinante termostabile DNA-polymeraser være karakterisert ved at a) nevnte polymerase i sin naturlige form omfatter aminosyresekvensen LeuSerXaaXaaLeuXaalleProTyrGluGlu (SEKV ID NR:. 2), hvor "Xaa" i posisjon 3 er Gin eller Gly, og "Xaa" i posisjon 6 er Ser eller Ala;

b) "Xaa" i posisjon 4 er mutert til en polar aminosyre eller til en positivt ladet aminosyre; og c) nevnte termostabile DNA-polymerase har et nivå av

diskriminering mot inkorporering av nukleotider merket med fargestoffer av fluorescein-familien og som er redusert sammenlignet med den naturlige form av nevnte polymerase, hvor nevnte nukleotid er et dideoksynukleotid, og nevnte diskrimineringsnivå er minst tre ganger lavere enn nivået av nevnte naturlige form av nevnte polymerase, hvor nevnte diskrimineringsnivå blir målt ved å bestemme den konsentrasjon av et dideoksynukleotid merket med et fluoresceinfargestoff som er nødvendig for 50% inhibering av DNA-syntese.

I ytterligere en annen utførelse vil de rekombinante termostabile DNA-polymeraser være karakterisert ved at a) nevnte polymerase i sin naturlige form omfatter aminosyresekvensen LeuSerGlnXaaLeuAlalleProTyrGluGlu (SEKV ID NR: 3) hvor b) "Xaa" i posisjon 4 er mutert til en polar aminosyre eller til en positivt ladet aminosyre; og c) nevnte termostabile DNA-polymerase har et nivå av diskriminering mot inkorporering av nukleotider merket med fargestoffer av fluorescein-familien og som er redusert sammenlignet med den naturlige form av nevnte polymerase, hvor nevnte nukleotid er et dideoksynukleotid, og nevnte diskrimineringsnivå er minst tre ganger lavere enn nivået av nevnte naturlige form av nevnte polymerase, hvor nevnte diskrimineringsnivå blir målt ved å bestemme den konsentrasjon av et dideoksynukleotid merket med et fluoresceinfargestoff som er nødvendig for 50% inhibering av DNA-syntese. I en foretrukket utførelse er nevnte "Xaa" i posisjon 4 mutert til Lys.

Den spesielle kritikalitetsregion ifølge denne oppfinnelse kan kombineres med motiver i andre regioner av polymerasegenet som er kjent for å tilveiebringe termostabile DNA-polymeraser med redusert diskriminering mot inkorporering av ukonvensjonelle nukleotider så som rNTP'er og ddNTP'er. Som vist ved eksempler heri ble det konstruert et rekombinant Thermus aquaticus ( Taq) DNA-polymeraseenzym inneholdende to mutasjoner. Den første mutasjon var en E til K mutasjon i X residuet i posisjon 4 av det kritiske motiv ifølge denne oppfinnelse. Den andre mutasjon var en mutasjon som tillater mer effektiv inkorporering av ddNTP'er kjent som F667Y mutasjonen. Denne mutasjon er en fenylalanin til tyrosin mutasjon i posisjon 667 av Taq DNA-polymerase (beskrevet i US patent nr. 5.614.365, US serie nr. 8/448.223 og EP 655506). Når det anvendes i en sekvenseringsreaksjon med ddNTP'er merket med fargestoff av fluoresceinfamilien, ble E681K F667Y dobbeltmutantenzymet funnet å gi en lesbar sekvenseringsstige. I en utførelse blir således et motiv som gir redusert diskriminering mot dideoksynukleotider kombinert med det kritiske motiv ifølge denne oppfinnelse for å tilveiebringe et enzym som har øket inkorporerings-effektivitet av både merkede og umerkede ddNTP'er.

I tillegg ble E681K F667Y mutantenzymet uventet funnet å ha en signifikant øket ekstensjonshastighet i forhold til et enzym med F667Y mutasjonen alene. Innføring av det kritiske motiv i et termostabilt DNA-polymeraseenzym, alene eller i kombinasjon med andre motiver vil således frembringe enzymer som har øket ekstensjonshastighet. Det dobbelte mutante enzym ble også uventet funnet å frembringe mer jevne topphøyder i fargestoffterminator dideoksysekvensering ved anvendelse av rhodaminmerkede terminatorer. Innføring av det kritiske motiv i et termostabilt DNA-polymeraseenzym vil således bringe enzymer som har mer jevne topphøyder i DNA-sekvenseringsmetoder ved anvendelse av terminatorer merket med fargestoff av rhodaminfamilien

En mutasjon som tillater mer effektiv inkorporering av rNTP'er, så som glutaminsyre til glycin mutasjon i posisjon 615 av Taq DNA-polymerase, eller E615G mutasjon (beskrevet i europeisk patentsøknad, publikasjon nr. EP-A-823 479) kan bli kombinert med det kritiske motiv ifølge denne oppfinnelse for å tilveiebringe et enzym som har en øket inkorporeringseffektivitet av ribonukleotider merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien.

I et annet aspekt av denne oppfinnelse tilveiebringes nukleinsyresekvens som koder for en rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7.

I ytterligere et annet aspekt vil denne oppfinnelse også tilveiebringe forbedrede fremgangsmåter for DNA-sekvensering som tillater anvendelse av lavere konsentrasjoner av ddNTP'er merket med fargestoff av fluoresceinfamilien, og derved redusere kostnadene ved gjennomføring av reaksjonen. De forbedrede fremgangsmåter ifølge denne oppfinnelse vil også tillate anvendelse av lavere forhold av fluoresceinfargestoff-familien merkede ddNTP'er til dNTP'er.

Anvendelse av disse fremgangsmåter vil resultere i flere fordeler, innbefattet mer effektiv polymerisering, at det kreves lavere konsentrasjoner av templat-nukleinsyre, og en nedsatt sannsynlighet for innføring av inhibitorer i reaksjonsblandingen. Disse fordeler vil også lette sekvenseringen av lange templater. Oppfinnelsen tilveiebringer også forbedrede fremgangsmåter for sekvensering hvori sekvenseringsreaksjoner kan påsettes direkte på sekvenseringsgeler for påfølgende elektroforese uten mellomliggende rensing.

I en utførelse av denne oppfinnelse tilveiebringer denne oppfinnelse således en forbedret fremgangsmåte for DNA-sekvensering, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter:

a) tilveiebringelse av en rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7; b) tilveiebringelse av en fargestoffterminator merket med et negativt ladet fluorescerende fargestoff; og

c) gjennomføring av en fargestoffterminatorsekvenseringsreaksjon.

Denne forebedrede fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter

videre at den rekombinante termostabile DNA-polymerase har et redusert nivå av diskriminering mot inkorporering av nukleotider merket med fargestoffer av

fluoresceinfamilien og hvori nevnte nukleotid er et dideoksynukleotid, og nevnte diskrimineringsnivå blir målt ved å bestemme forholdet av den konsentrasjon av et dideoksynukleotid merket med et fluoresceinfargestoff som er nødvendig for 50% inhibering av DNA-syntese versus den konsentrasjon av et umerket dideoksynukleotid som er nødvendig for 50% inhibering.

Også innenfor rammen av denne oppfinnelse er forbedrede fremgangsmåter for fremstilling av merket DNA kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter: a) tilveiebringelse av en rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7; b) tilveiebringelse av et nukleotid merket med et fargestoff av fluorescein-familien; og

c) gjennomføring av en DNA-syntesereaksjon.

Enzymene ifølge denne oppfinnelse vil effektivt inkorporere fluoresceinmerkede dNTP'er i en polymerasekjedereaksjonsmetode, og gi oppformerte produkter som er merket på forskjellige steder med fargestoffer av fluorescein-familien.

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig vektor kjennetegnet ved at den omfatter en nukleinsyre-sekvens som koder for en rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7.

Det er videre beskrevet vertscelle, kjennetegnet ved at den omfatter en nukleinsyre-sekvens som koder for en rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7.

Oppfinnelsen vedrører også fremgangsmåte for fremstilling av en rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter: a) dyrking av en vertscelle omfattende en nukleinsyresekvens som koder for en rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 8 under betingelser som befordrer ekspresjonen av den rekombinante termostabile DNA-polymerase; og b) isolering av den rekombinante termostabile DNA-polymerase fra verts-cellen eller fra mediet.

Det er også beskrevet rekombinant termostabil DNA-polymerase, kjennetegnet ved at den er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 11.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også fremgangsmåte for fremstilling av merkede primerekstensjonsprodukter, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter: a) tilveiebringelse av en rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7;

i) nevnte polymerase omfatter aminosyresekvensen LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu (SEKV ID NR.1);

LeuSerXaaXaaLeuXaalleProTyrGluGlu (SEKV ID NR:. 2) eller LeuSerGlnXaaLeuAlalleProTyrGluGlu (SEKV ID NR: 3);

ii) nevnte polymerase har et redusert nivå av diskriminering mot inkorporering av nukleotider merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien sammenlignet med den naturlige form av nevnte polymerase, hvor nevnte nukleotid er et dideoksynukleotid, og nevnte diskrimineringsnivå er minst tre ganger lavere enn nivået av nevnte naturlige form av nevnte polymerase, hvor

nevnte diskrimineringsnivå blir målt ved å bestemme den konsentrasjon av et dideoksynukleotid merket med et fluoresceinfargestoff som er nødvendig for 50% inhibering av DNA-syntese, (iii) nevnte polymerase også omfatter den andre aminosyresekvens SQIXLR(V/I) (SEKV ID NR. 18) hvor "X" er hvilken som helst aminosyre unntatt E; (iv) nevnte polymerase har redusert diskriminering mot inkorporering av ribonukleotider merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien; b) tilveiebringelse av et ribonukleotid merket med et fargestoff av fluoresceinfamilien, og

c) gjennomføring av en primerekstensjonsreaksjon.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av en rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7 i en in vitro DNA-synteseapplikasjon, så som DNA-sekvensering, syntese av merket DNA og fremstilling av merkede primerekstensjonsprodukter.

Foreliggende oppfinnelse beskriver videre testsett for DNA-sekvensering, kjennetegnet ved at den omfatter en termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7, og en terminator merket med negativt ladet fluorescerende fargestoff.

Det er videre omfattet testsett for fremstilling av merket DNA, kjennetegnet ved at den omfatter en rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7, og et nukleotid merket med et negativt ladet fluorescerende fargestoff.

Oppfinnelsen vedrører også testsett for fremstilling av merkede primerekstensjonsprodukter, kjennetegnet ved at den omfatter en rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7, og et ribonukleotid merket med et fargestoff av fluoresceinfamilien.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1 er en skjematisk fremstilling av Taq DNA-polymerasegenet. Restriksjonsseter er indikert som relaterer til eksempel 1 og beskrivelsen av fremgangsmåter for fremstilling av ytterligere mutanter og ekspresjonsvektorer som tilveiebringes heri.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

For å lette forståelsen av denne oppfinnelse blir flere uttrykk definert nedenfor.

Betegnelsen «gen» refererer til en DNA-sekvens som omfatter kontroll og kodesekvenser som er nødvendige for fremstilling av et gjenvinnbart bioaktivt polypeptid eller forløper. Polypeptidet kan være kodet av en gensekvens i full lengde eller av hvilken som helst del av den kodende sekvens så lenge som den enzymatiske aktivitet er beholdt.

Betegnelsen «naturlig» refererer til et gen eller genprodukt som er isolert fra en naturlig forekommende kilde. Denne betegnelse refererer også til en rekombinant form av det naturlige protein fremstilt ved molekylærbiologiske teknikker og som har en aminosyresekvens identisk med den i den naturlige form.

Betegnelsen «mutant» refererer til et gen som er blitt forandret i sin nukleinsyresekvens eller et genprodukt som er blitt forandret i sin aminosyresekvens, og som resulterer i et genprodukt som kan ha forandrede funksjonelle egenskaper sammenlignet med det naturlige eller villtypegen eller genprodukt. Slike forandringer inkluderer punktmutasjoner, delesjoner og innskudd.

Betegnelsen «vertscelle(r)» refererer til både enkeltcellulære prokaryote og eukaryote organismer så som bakterier, gjær, og aktinomyceter og enkeltceller fra høyere ordensplanter eller dyr når de blir dyrket i cellekultur.

Betegnelsen «ekspresjonssystem» refererer til DNA-sekvenser som inneholder en ønsket kodesekvens og kontrollsekvenser i operabel binding, slik at vertsceller transformert med disse sekvenser er i stand til å frembringe de proteiner som det er kodet for. For å gjennomføre transformasjon kan ekspresjons-systemet inkluderes på en vektor; det relevante DNA kan imidlertid også integreres i vertskromosomet.

Betegnelsen «oligonukleotid» som anvendt heri er definert som et molekyl som omfattes av to eller flere deoksyribonukleotider eller ribonukleotider, fortrinnsvis mer enn tre, og vanligvis mer enn ti. Den eksakte størrelse av et oligonukleotid vil avhenge av mange faktorer, innbefattet den endelige funksjon eller

anvendelse av oligonukleotidet.

Oligonukleotider kan fremstilles ved hvilken som helst egnet fremgangsmåte, innbefattet f.eks. kloning og restriksjon av hensiktsmessige sekvenser og direkte kjemisk syntese ved en fremgangsmåte så som fosfotriestermetoden til Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:90-99; fosfodiestermetoden til Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68:109-151; dietylfosforamiditmetoden til Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862; triestermetoden til Matteucci et al., 1981, J.Am.Chem.Soc. 103:3185:3191 eller automatiserte syntesemetoder; og fastbærermetoden i US patent nr. 4.458.066.

Betegnelsen «primer» som anvendt heri refererer til et oligonekleotid, enten naturlig eller syntetisk, som er i stand til å virke som et initieringspunkt for syntesen når det plasseres under betingelser hvori primerekstensjon blir initiert. En primer er fortrinnsvis et enkelttrådet oligodeoksyribonukleotid. Den hensiktsmessige lengde av en primer er avhengig av den tilsiktede anvendelse av primeren, men vil typisk være i området fra 15 til 35 nukleotider. Korte primer-molekyler krever vanligvis kjøligere temperaturer for å danne tilstrekkelig stabile hybridkomplekser med templatet. En primer behøver ikke reflektere den eksakte sekvens av templatet, men må være tilstrekkelig komplementær til å hybridisere med et templat for at primerforlengelsen skal foregå.

En primer kan merkes om ønsket ved inkorporering av en merkelapp som lar seg påvise på spektroskopisk, fotokjemisk, biokjemisk, immunokjemisk eller kjemisk måte. F.eks. vil anvendelige merkelapper inkludere <32>P fluorescerende fargestoffer, eller elektrontette reagenser, enzymer (som vanligvis anvendt i ELISA assays), biotin, eller haptener og proteiner som det er antisera eller monoklonale antistoffer tilgjengelige for.

Betegnelsen «termostabil polymerase» skal referere til et enzym som er stabilt overfor varme, er varmeresistent og beholder tilstrekkelig aktivitet til å gjennom-føre påfølgende primerekstensjonsreaksjoner og som ikke blir irreversibelt denaturert (inaktivert) når det underkastes de forhøyede temperaturer for den tid som er nødvendig for å gjennomføre denaturering av dobbelttrådede nukleinyrer. Oppvarmingsbetingelsene som er nødvendige for nukleinsyre-denaturering er vel kjent i teknologien, og det er vist eksempler på den i US patentene nr. 4.683.202 og 4.683.195. Som anvendt heri skal en termostabil polymerase være egnet for anvendelse i en temperatursyklusreaksjon så som polymerasekjedereaksjonen («PCR»). Irreversibel denaturering skal for formålene heri referere til permanent og fullstendig tap av enzymatisk aktivitet. For en termostabil polymerase skal enzymatisk aktivitet referere til katalysen av kombinasjonen av nukleotidene på den riktige måte for å danne primerekstensjonsprodukter som er komplemen-tære til en templatnukleinsyretråd.

Betegnelsen «konvensjonell» eller «naturlig» skal, når det refereres til nuklein-syrebaser, nukleosidtrifosfater eller nukleotider, referere til de som forekommer naturlig i det polynukleotid som beskrives (dvs. for DNA vil disse være dATP, dGTP, dCTP og dTTP). Dessuten blir dITP og 7-deaza-dGTP hyppig anvendt istedenfor dGTP, og 7-deaza-dATP kan anvendes istedenfor dATP i in vitro DNA syntesereaksjoner, så som sekvensering. Kollektivt kan disse refereres til som dNTP'er.

Betegnelsen «ukonvensjonell» eller «modifisert» skal, når det refereres til en nukleinsyrebase, et nukleosid eller nukleotid, inkludere modifikasjon, deriva-sjoner eller analoger av konvensjonelle baser, nukleosider, eller nukleotider som naturlig forekommer i et bestemt polynukleotid. Deoksyribonukleotid-formen av uracil er en ukonvensjonell eller modifisert base i DNA (dUMP), mens ribonukleotidformen av uracil er en konvensjonell base i RNA (UMP). Som anvendt heri skal ukonvensjonelle nukleotider inkludere, men er ikke begrenset til forbindelser som anvendes som terminatorer for nukleinsyre-sekvensering. Terminatorforbindelser inkluderer, men er ikke begrenset til de forbindelser som har en 2',3'-dideoksystruktur, og blir referert til som dideoksy-nukleosidtrifosfater. Dideoksynukleosidtrifosfatene ddATP, ddTTP, ddCTP og ddGTP blir referert til kollektivt som ddNTP'er. Andre ukonvensjonelle nukleotider inkluderer fosforotioat dNTP'er ([a-S]dNTP'er), 5'-oc-borano-dNTP'er, a-metylfosfonat-dNTP'er og ribonukleosidtrifosfater (rNTP'er). Ukonvensjonelle baser kan være merket med radioaktive isotoper så som 32P, <33>P eller <35>S; fluorescerende merkelapper; kjemiluminiscerende merkelapper; biolumini-scerende merkelapper, hapten merkelapper så som biotin; eller enzym merkelapper så som streptavidin eller avidin. Fluorescerende merkelapper kan inkludere fargestoffer som er negativt ladet, så som fargestoffer av fluorescein-familien, eller fargestoffer som er nøytrale i ladning, så som fargestoffer av rhodaminfamilien, eller fargestoffer som er positivt ladet, så som fargestoffer av cyaninfamilien. Fargestoffer av fluoresceinfamilien inkluderer f.eks. FAM, HEX, TET, JOE, NAN og ZOE. Fargestoffer av rhodaminfamilien inkluderer Texas-rødt, ROX, R110, R6G og TAMRA. FAM, HEX, TET, JOE, NAN, ZOE, ROX, R110, R6G og TAMRA markedsføres av Perkin-Elmer (Foster City, CA), og Texas-rødt markedsføres av Molecular Probes. Fargestoffer av cyanin-familien inkluderer Cy2, Cy3, Cy5 og Cy7 og markedsføres av Amersham (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, England).

Betegnelsen «DNA-syntesereaksjon» skal referere til fremgangsmåter for fremstilling av kopier av DNA innbefattet, men ikke begrenset til PCR, tråd-fortrengningsoppformering, transkripsjonsformidlet oppformering, primerekstensjon og reverstranskripsjon.

For ytterligere å lette forståelsen av denne oppfinnelse skal det refereres til spesifikke termostabile DNA-polymeraseenzymer og fluorescerende fargestoffer gjennom hele denne beskrivelse for å vise eksempler på denne oppfinnelse, og disse referanser er ikke ment å begrense rammen av denne oppfinnelse.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye og forbedrede blandinger som er termostabile DNA-polymeraser. Enzymene ifølge denne oppfinnelse inkluderer rekombinante polymeraser som mer effektivt inkorporerer nukleosidtrifosfater merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien, sammenlignet med de tilsvarende villtypeenzymer. De termostabile DNA-polymeraser ifølge denne oppfinnelse er mer egnet og ønskelige for anvendelse i fremgangsmåter så som DNA-sekvensering og in vitro syntese av merkede produkter enn polymeraser i tidligere teknologi. Forbedrede DNA-sekvenseringsmetoder ifølge denne oppfinnelse inkluderer anvendelse av disse rekombinante polymeraser. DNA-sekvenser som koder for disse enzymer, og vektorer for å uttrykke disse proteiner, tilveiebringes også.

De termostabile DNA-polymeraser ifølge denne oppfinnelse har en kritikalitetsregion inne i aminosyresekvensen av polymeraseaktivitetsdomenet i enzymet. Den kritiske region inne i aminosyresekvensen av en termostabil DNA-polymerase som tilveiebringes av den foreliggende oppfinnelse er vist nedenfor ved anvendelse av den konvensjonelle enkelt-bokstav aminosyrekode (Lehninger, Biochemistry, New York, New York, Worth Publishers Inc., 1970, side 67).

SEKV ID NR. 7 LSXXLX(V/I)PXXE hvor «X» i posisjon 4 indikerer hvilken som helst aminosyre unntatt E. I tre-bokstavkoden for aminosyrer representeres denne sekvens som LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu (SEKV ID NR. 7) hvor «Xaa» i posisjonene 3, 6, 9 og 10 er hvilken som helst aminosyre, «Xaa» i posisjon 4 av denne sekvens er hvilken som helst aminosyre, men ikke en glutaminsyrerest (Glu) og «Xaa» i posisjon 7 er Val eller Ile. Denne kritikalitetsregion tilveiebringer termostabile DNA-polymeraseenzymer som karakteriseres ved evnen til effektivt å inkorporere nukleotider merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien.

F.eks., i et derivat av Thermus aquaticus ( Taq) DNA-polymerasegenet som allerede inneholder en glycin til asparaginsyre mutasjon i posisjon 46 (G46D) og en F667Y mutasjon, en mutasjon av G til A i den første posisjon av kodonet for glutaminsyre i rest 681 sekvens av Taq DNA-polymerasesekvensen i full lengde (tilsvarende til posisjon 4 av det kritiske motiv) vil resultere i et enzym som har det kritiske motiv. Dette enzym viser 1) en ca. 2- til 10-gangers økning i effektiviteten av inkorporering av nukleotidet merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien, uten noen nedsettelse av enzymets evne til å formidle PCR i nærvær av konvensjonelle nukleotider og 2) en 3- til 4,3-gangers økning i ekstensjonshastigheten. I Taq DNA-polymerase vil denne spesielle mutasjon resultere i en aminosyreforandring av E (glutaminsyre) til K (lysin).

Selv om denne spesielle aminosyreforandring frembragte det kritiske motiv og signifikant forandrer enzymets evne til å inkorporere ukonvensjonelle nukleotider, er det ventet at den spesifikke forandring av E til K ikke vil være så kritisk for denne oppfinnelse som den nå identifiserte posisjon inne i kritikalitetsregionen vil være.

Karakteriseringen av E618K mutasjonen beskrevet heri identifiserte en region i DNA-polymerasegenet som påvirker polymerasens evne til å interagere med negativt ladede fluorescerende nukleotider. Dette sete, distalt til heliks O, er i

enden av Oa heliksen og begynnelsen av Ob heliksen av polymereasen (Kim et al., 1995, Nature, 376:612). Basert på molekylære modelleringsprinsipper som er vel kjent i teknologien, vil forandringer i strukturen av Oa-Ob heliksen forskjellige fra E til K i posisjon 681 også være ventet å frembringe forandringer i

polymerasens evne til å diskriminere mot nukleotider merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien.

Evnen til enzymene ifølge denne oppfinnelse til effektivt å inkorporere nukleotider merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien, blir målt ved ddNTP-inkorporeringsanalyser. En slik analyse er en primerekstensjonskonkurranseanalyse som gjennomføres under betingelser med begrensende templat. I denne analyse blir en primer DG48

bundet til M13mp18 templat (Innis et al., 1988, Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 85:9436) utvidet i nærvær av [<x-<33>P]dCTP og overskudd av enzym med forskjellige nivåer av et fluoresceinmerket ddNTP, Zowie-ddCTP. Fordi

inkorporering av en ddCTP-rest vil terminere ekstensjonsreaksjonen, jo lettere en DNA-polymerase inkorporerer et ddCTP i en utvidet primer, jo mindre [ct-<33>P]dCTP kan inkorporeres. Således, ettersom effektiviteten av fluoresceinmerket ddCTP-inkorporering øker, blir graden av inhibering av DNA-syntese også øket. Reaksjonene ble også gjennomført med forskjellige nivåer av et umerket ddCTP. De konsentrasjoner av ddCTP og Zowie-ddCTP som er nødvendige for 50% inhibering, ble beregnet og sammenlignet for å gi et relativt mål på enzymets evne til å inkorporere det fluoresceinmerkede nukleotid. Detaljene av ddNTP-inkorporeringsanalysen er gjengitt i eksempel II.

Egenskapen av redusert diskriminering mot inkorporering av nukleotider merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien, målt ved fluorescerende ddNTP-inkorporeringsanalysen er beskrevet i eksempel II. Den konsentrasjonen av en ddNTP merket med et fluoresceinfargestoff, Zowie-ddCTP, som er nødvendig for 50% inhibering av DNA-syntese, vil være redusert minst 3 ganger for et mutant enzym ifølge denne oppfinnelse, i forhold til villtypeenzymet. Konsentrasjonen er redusert minst 5 ganger eller minst 10 ganger. Egenskapen av redusert diskriminering blir analysert ved å måle fluorescerende dNTP-inkorporering.

Den termostabile DNA-polymerase-gensekvens og enzym kan være avledet fra forskjellige termofile arter. I en utførelse vil polymerasegensekvensen og enzymet være fra en art av slekter Thermus. I andre utførelser av oppfinnelsen vil gensekvensen og enzymet være fra termofile arter forskjellige fra Thermus. Den fullstendige nukleinsyre og amino-syresekvens for flere termostabile DNA-polymeraser er tilgjengelig. Sekvensene av hver av Taq, Thermus thermopilus ( Tth), Thermus arten Z05, Thermus arten sps17, Thermotoga maritima ( Tma), og Thermorsipho africanus ( Taf) polymerase er publisert i PCT internasjonal patentsøknad nr. PCT/ US91/07035, som er publisert som PCT patentpublikasjon nr. WO92/06200 den 16. april 1992. Sekvensene for DNA-polymerasen fra Thermus flavus, Bacillus caldotenax og Bacillus stearothermophilus er publisert i henholdsvis Akhmetzjanov og Vakhitov, 1992, Nucleic Acids Research 20 (21):5839, Uemori et al., 1993, J. Biochem. 113: 401-410, og som adgangsnummer BSU23149.ng fra NG:New GenBank data-base. Sekvensen for den termo-stabile DNA-polymerase fra Thermus caldophilus finnes i EMBL/GenBank, adgangsnummer U62584. Sekvensen for den termostabile DNA-polymerase fra Thermus filiformis kan gjenvinnes fra ATCC deposit nr. 42380 ved anvendelse av metodene som tilveiebringes i US patent nr. 4.889.818, så vel som sekvens-informasjonen som tilveiebringes i tabell 1. Sekvensen for Thermotoga neapolitana DNA-polymerase er GeneSeq patentdatabase adgangsnr. R98144 (også beskrevet i PCT WO97/09451).

1. Proteinsekvens fra adgangsnr. D12982, Uemori T., Ishino Y., Fujita K., Asada K., Kato I. «Cloning of the DNA polymerase gene of Bacillus caldotenax and characterization of the gene product» J. Biochem 113:401 (1993). Den kritiske rest i denne sekvens er 725. En nesten identisk proteinsekvens tilveiebringes som en antatt «Bacillus stearothermophilus» DNA-polymerase i adgangsnr. R45155 og WPI 93-408323/51. Den kritiske rest i denne sekvens er 724. 2. Det er flere sekvensanførsler for Bacillus stearothermophilus DNA-polymerase i GeneBank, eller SwissProt/PIR databasene. Selv om disse sekvenser er høyt relatert, men noe forskjellig fra hverandre, inneholder hver det identiske L(S/A)XX(L/I)XXXXXE (SEKV ID NR. 9) motiv, hvor X er hvilken som helst aminosyre bortsett fra E. I tre-bokstavkoden vil denne aminosyresekvens være representert som LeuXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGlu (SEKV ID NR. 9), hvor «Xaa» i posisjonene 3, 6, 7, 8, 9 og 10 er hvilken som helst aminosyre, «Xaa» i posisjon 2 er Ser eller Ala, «Xaa» i posisjon 4 er hvilken som helst aminosyre bortsett fra Glu, og «Xaa» i posisjon 5 er Leu eller Ile.

I tabellen ovenfor tilveiebringes proteinsekvenser omfattende den kritiske rest i det kritiske motiv i posisjon 724 av japansk patentpublikasjon J 05 304 964A, EP nr. 699.760, og adgangsnr. U33536. En annen høyt relatert, men noe forskjellig proteinsekvens ble publisert i Gene 163:65-68 (1995), inneholder den kritiske rest i det kritiske motiv i posisjon 727. En annen høyt relatert, men noe forskjellig proteinsekvens, adgangsnr. U23149, for Bst DNA-polymerase inneholder den kritiske rest i det kritiske motiv i posisjon 802.

Fordi DNA-polymerasene av hver termofil art er unike, vil aminosyreposisjonen til kritikalitetsregionen være forskjellig for hvert enzym. Aminosyre og nuklein-syresekvensinnretningsprogrammer er lett tilgjengelige og, gitt den spesielle region identifisert heri, tjener til å hjelpe til med identifikasjon av den eksakte sekvensregion ifølge denne oppfinnelse. Slike sekvensinnretningsprogrammer er tilgjengelige fra The Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin. Gitt det spesielle motiv identifisert heri vil disse programmer, innbefattet «GAP», «BESTFIT» og «PILEUP» tjene til å hjelpe med lokaliseringen av det kritiske motiv. Posisjonen for kritikalitetsregionene er vist i tabell I for termostabile DNA-polymeraser fra eksempelvis termofile arter.

Uansett den eksakte posisjon av det kritiske motiv LSXXLX(V/I)PXXE (SEKV ID NR. 7), hvor X i posisjon 4 er hvilken som helst aminosyre unntatt E, innenfor polymerasedomenet av en termostabil DNA-polymerase, vil tilstedeværelsen av motivet tjene til å gi termostabile DNA-polymeraser med evne til effektivt å inkorporere nukleotider merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien. Mutasjon av den konserverte glutaminsyre av de termostabile DNA-polymeraser av Thermus flavus (Glu 679), Thermus thermophilus (Glu 683), Thermus- arten Z05 (Glu 683), Thermus- arten sps17 (Glu 679), Thermus caldophilus (Glu 683), Thermus filiformis (Glu 679) for fremstilling av det kritiske motiv vil derfor gi en økende virkning på polymerasens evne til effektivt å inkorporere nukleotider merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien.

I betraktning av den høyt konserverte karakter av det nå identifiserte kritiske motiv kan det dessuten identifiseres nye termostabile DNA-polymeraser basert på deres homologi med f.eks. Taq DNA-polymerase eller sekvensene av andre DNA-polymeraser i tabell I (se f.eks. US patentene nr. 5.618.711 og 5.624.833). Så lenge som deres peptidsekvens er minst 45% og mest fortrinnsvis mer enn 80% homolog med Tag-polymerase aminosyresekvensen, som bestemt ved fremgangsmåtene beskrevet heri, vil slike polymeraser være innenfor rammen av den foreliggende oppfinnelse. Følgelig vil denne oppfinnelse vedrøre en klasse av enzymer som også inkluderer f.eks. den termostabile DNA-polymerase, og tilsvarende gen og ekspresjonsvektorer fra Thermus oshimai (Williams RA, et al., 1996, Int. J. Syst. Bacteriol 46 (2):403-408); Thermus silvanus og Thermus chilarophilus (Tenreiro S, et al., 1995, Int. J. Syst. Bacteriol 45 (4):633-639); Thermus scotoductus (Tenreiro S, et al., 1995, Res. Microbiol. 146 (4):315-324); Thermus ruber ATCC 35948, (L.G. Loginova, 1984, Int. J. Syst. Bacteriol 34:498-499); og Thermus brockianus (Munster, M.J., 1986, J. Gen. Microbiol. 132: 1677).

Fagfolk på dette område vil anerkjenne at de ovenfor nevnte termostabile DNA-polymeraser med øket effektivitet for inkorporering av fluoresceinmerkede nukleotider lettest blir konstruert ved rekombinante DNA-teknikker så som seterettet mutagenese. Se f.eks. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989, 2. utgave, kapittel 15.51, «Oligonucleotide-mediated mutagenesis». Denne teknikk er nå standard i teknologien, og kan anvendes til å danne alle mulige klasser av baseparforandringer på hvilket som helst bestemt sted i et gen. Denne fremgangsmåte gjennomføres ved anvendelse av en syntetisk oligonukleotid-primer komplementær til en enkelttrådet fag eller plasmid DNA som skal mutageniseres bortsett fra en begrenset mistilpasning, som representerer den ønskede mutasjon. I korthet anvendes det syntiske oligonukleotid som primer for å styre syntesen av en tråd komplementær til fagen eller plasmidet, og det resulterende dobbelttrådede DNA blir transformert til en fag- eller plasmidbærende vertsbakterie. Den resulterende bakterie kan bestemmes ved f.eks. DNA-sekvensanalyse eller probehybridisering for å identifisere de plakker eller kolonier som har den ønskede muterte gensekvens.

Etter oppfinnelsen av PCR er primerstyrt mutagenese (beskrevet i US patent nr. 4.683.195 som er inkorporert heri ved referanse) og «overlappende PCR»

(Higuchi, 1989, i PCR Technology, redaktør Erlich, Stockton Press, New York, NY, s. 61-70) blitt rutinemessige måter for innføring av hvilken som helst mutasjon i hvilken som helst posisjon av et gen.

Det muterte DNA kan gjenvinnes fra plasmid, fasmid, fag eller oppformerings-reaksjonen på konvensjonell måte og ligeres inn i en ekspresjonsvektor for påfølgende dyrking og rensing av det resulterende enzym. Flere klonings- og ekspresjonsvektorer er egnet for praktisering av denne oppfinnelse, innbefattet pattedyr og bakteriesystemer, som beskrevet i f.eks. Sambrook et al., 1989 supra. For letthets skyld vises den foreliggende oppfinnelse som eksempel ved anvendelse av den lambda-avledede PL-promotor (Shimatake et al., 1981, Nature 292:128). Anvendelse av denne promotor er spesifikt beskrevet i US patentene nr. 4.711.845 og 5.079.352, som er inkorporert heri ved referanse.

Plasmid pCS1 er blitt deponert i ATCC, den 28. august 1997, og gitt adgangsnr. 98521. Dette plasmid inneholder et gen som koder for en termostabil DNA-polymerase, og dette gen er mutert i kodonet i posisjon 681 slik at glutaminsyre er erstattet med lysin i det resulterende polypeptid, og gir en måte for å tilveiebringe termostabile DNA-polymeraser med øket effektivitet for inkorporering av nukleotider merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien. Eksempel I illustrerer anvendelse av flankerestriksjonsseter egnet for subkloning av E681K-mutasjonen for å danne andre termostabile DNA-polymeraseenzymer. Alternativt, fordi den fullstendige gensekvens for flere termostabile DNA-polymeraser er kjent vil andre måter for innføring av E681K-mutasjonen, så som restriksjonsspalting og fragmenterstatning, være lett tilgjengelige for fagfolk på dette område som har tilgjengeligheten av ATCC-deponeringene og den sekvensinformasjon som finnes heri.

Når man ønsker å fremstille et av de mutante eller naturlige enzymer ifølge den foreliggende oppfinnelse, eller et derivat eller en homolog av disse enzymer, vil fremstillingen av enzymet typisk involvere transformasjon av en vertscelle med ekspresjonsvektoren, og dyrking av den transformerte vertscelle under slike betingelser at ekspresjon vil foregå. Måter for transformering og dyrking av transformerte vertsceller er vel kjent i teknologien og er beskrevet i detalj i f.eks. Sambrook et al., 1989, supra.

De termostabile DNA-polymeraser ifølge den foreliggende oppfinnelse blir vanligvis renset fra E. co//-stammen DG116 (deponert som ATCC 53606 den 7. april 1987) som er blitt transformert med en ekspresjonsvektor operabelt bundet til et gen som koder for en villtype eller modifisert termostabil DNA-polymerase. Metoder for rensing av den termostabile DNA-polymerase er beskrevet i f.eks. eksempel I og Lawyer et al., 1993, PCR Methods and Applications 2:275-87, som er inkorporert heri ved referanse.

De termostabile enzymer ifølge denne oppfinnelse kan anvendes for hvilket som helst formål hvori slik enzymaktivitet er nødvendig eller ønsket. Eksempler på anvendelser inkluderer DNA-sekvensering, DNA-merking og merking av primerekstensjonsprodukter. DNA-sekvensering ved Sanger dideoksynukleotid-metoden (Sanger et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. 74: 5463) er spesielt forbedret ved den foreliggende oppfinnelse. Fremskritt i grunnformen av Sanger et al.-metoden har gitt nye vektorer (Yanisch-Perron et al, 1985 Gene 33:103-119) og baseanaloger (Mills et al., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. 76:2232-2235, og Barr et al., 1986, Biotechniques 4:428-432). Generelt vil DNA-sekvensering kreve templatavhengig primerekstensjon i nærvær av kjede-terminerende baseanaloger, hvilket resulterer i en fordeling av delfragmenter som deretter blir separert etter størrelse. Grunnformen av dideoksy-sekvenseringsfremgangsmåten involverer (i) annilering av en oligonukleotid-primer, eventuelt merket, til et templat; (ii) ekstensjon av primeren med DNA-polymerase i fire separate reaksjoner som hver inneholder en blanding av umerkede dNTP'er og en begrensende mengde av et kjedetermineringsmiddel så som et ddNTP, eventuelt merket; og (iii) oppløsning av de fire sett av reaksjonsprodukter på en denaturerende polyakrylamid/ureagel med høy opp-løsning. Reaksjonsproduktene kan påvises i gelen ved autoradiografi eller ved fluoresceinpåvisning, avhengig av den anvendte merking, og bildet kan under-søkes for å trekke slutninger om nukleotidsekvensen. Disse metoder anvender DNA-polymerase så som Klenow-fragmentet av E. coli Pol I eller en modifisert T7 DNA-polymerase.

Tilgjengeligheten av termoresistente polymerase så som Taq DNA-polymerase, resulterte i forbedrede metoder for sekvensering med termostabil DNA-polymerase (se Innis et al., 1988, supra) og modifikasjoner derav referert til som «syklus-sekvensering» (Murray, 1989, Nuc. Acids Res. 17:8889). Som et alternativ til grunnleggende dideoksysekvensering vil syklus-sekvensering være en lineær, assymetrisk oppformering av målsekvenser komplementære med templatsekvensen i nærvær av kjedeterminatorer. En enkel syklus gir en familie av ekstensjonsprodukter av alle mulige lengder. Etter denaturering av ekstensjonsreaksjonsproduktet fra DNA-templatet vil det foregå flere sykluser av primerannilering og primerekstensjon i nærvær av terminatorer så som ddNTP'er. Syklus-sekvensering krever mindre templat-DNA enn konvensjonell kjedetermineringssekvensering. Termostabile DNA-polymeraser har flere fordeler i syklus-sekvensering; de tåler de stringente annileringstemperaturer som er nødvendige for spesifikk hybridisering av primer til nukleinsyremål, så vel som de tåler de mange sykluser med høytemperaturdenaturering som foregår i hver syklus, dvs. 90-95°C. Av denne grunn er AmpliTaq® DNA-polymerase og dens derivater og etterkommere blitt inkludert i 7ag-syklus-sekvenserings-"kits" som kommersialiseres av selskaper så som Perkin-Elmer, Norwalk, CT.

Det finnes to variasjoner av sekvenseringsmetoder basert på kjedeterminering

- fargestoffprimersekvensering og fargestoffterminatorsekvensering. Ved fargestoffprimersekvensering er ddNTP-terminatorene umerket, og det anvendes en merket primer til å påvise ekstensjonsprodukter (Smith et al., 1986, Nature 32:674-679). I fargestoffterminator-DNA-sekvensering anvendes en DNA-polymerase til å inkorporere dNTPer og fluoresceinmerkede ddNTP'er på enden av en DNA-primer (Lee et al., supra.). Denne fremgangsmåte bygger på den fordel at det ikke er nødvendig å syntetisere fargestoffmerkede primere. Dessuten er fargestoffterminatorreaksjoner mer beleilige ved at alle fire reaksjoner gjennomføres i det samme rør.

Både fargestoffprimer- og fargestoffterminatormetoder kan automatiseres ved anvendelse av et automatisert sekvenseringsinstrument som produseres av Applied Biosystems, Foster City, Ca. (US patent nr. 5.171.534). Ved anvendelse av dette instrument blir den fullstendige sekvenseringsreaksjons-blanding fraksjonert på en denaturerende polyakrylamidgel montert i instrumentet. En laser i bunnen av instrumentet påviser de fluorescerende produkter ettersom de gjennomgår elektroforesen gjennom gelen etter størrelsen.

Det anvendes vanligvis to typer av fluorescerende fargestoffer for å merke terminatorene som anvendes for fargestoffterminatorsekvensering - negativt ladede og zwitterioniske fluorescerende fargestoffer. Negativt ladede fluorescerende fargestoffer inkluderer dem av fluorescein- og BODIPY-familiene. BODIPY-fargestoffer (4,4-difluor-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacen) er beskrevet i internasjonal patentsøknad, publikasjon nr. WO97/00967, som er inkorporert heri ved referanse. Zwitterionisk fluorescerende fargestoffer inkluderer dem av rhodaminfamilien. Kommersielt tilgjengelige syklus-sekvenseringskits anvender terminatorer merket med rhodaminderivater. De rhodaminmerkede terminatorer er imidlertid ganske kostbare, og produktet må skilles fra ikke-inkorporerte

fargestoff-ddNTP'er før påsetting på gelen siden de migrerer sammen med

sekvenseringsproduktene. Rhodaminfargestoff-familieterminatorer synes å stabilisere hårnålstrukturer i GC-rike regioner, hvilket forårsaker uregelmessig migrering av produktetene. Dette krever anvendelse av dITP som fører til avslapping av den sekundære struktur, men også påvirker effektiviteten av inkorporering av terminator.

Derimot vil fluoresceinmerkede terminatorer eliminere separasjonstrinnet før gelpåsettingen siden de har en større netto negativ ladning og migrerer raskere enn sekvenseringsproduktene. Dessuten vil fluoresceinmerkede sekvenseringsprodukter ha bedre elektroforetisk migrering enn sekvenseringsprodukter merket med rhodamin. Selv om villtype Taq DNA-polymerase ikke effektivt vil inkorporere terminatorer merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien, kan dette nå gjennomføres effektivt ved anvendelse av de modifiserte enzymer som tilveiebringes heri.

Som beskrevet ovenfor vil DNA-sekvensering med termostabile DNA-polymeraser kreve en blanding av ukonvensjonelle baseanaloger som virker som kjedeterminatorer og konvensjonelle nukleotider ved et spesifisert forhold av konsentrasjoner som sikrer at det ville bli generert en populasjon av ekstensjonsprodukter som representerer alle mulige fragmentlengder over en distanse på flere hundre baser. Noen termostabile DNA-polymeraser som tidligere ble anvendt for sekvensering, så som villtype Taq-polymerase, karakteriseres ved at de fortrinnsvis inkorporerer konvensjonelle nukleotider i nærvær av en blanding av konvensjonelle og ukonvensjonelle nukleotider. Noen nylig beskrevne termostabile DNA-polymeraser tillater imidlertid forholdet av ukonvensjonelle baseanaloger til konvensjonelle baser å bli redusert fra hundre til flere hundre ganger, eller opp til over ett tusen ganger.

En slik polymerase er F667Y-mutanten av Taq DNA-polymerase. En annen slik mutant er en Taq DNA-polymerase med en F667Y-mutasjon og en mutasjon i posisjon 46 som forandrer en glycinrest til en asparaginsyrerest (G46D) mutasjon. Denne mutante polymerase, kjent som AmpliTag, FS, fremstilles av Hoffmann-La Roche og markedsføres av Perkin-Elmer. F730Yrma30 DNA-polymerase er en annen slik polymerase. Denne mutante polymerase er en kombinasjon av 1) nukleotidene 1-570 av Taq DNA-polymerase modifisert til å kode for en G46D-mutasjon og 2) nukleotidene 571-2679 av Tma DNA-polymerase modifisert til å kode for en asparaginsyre til alaninmutasjon i posisjon 323, en glutaminsyre til alaninmutasjon i posisjon 325 og en fenylalanin til tyrosinmutasjon i posisjon 730 (US patentsøknad, serie nr. 60/052065 og europeisk patentsøknad nr. 98112327.6, begge herved inkorporert ved referanse). En annen polymerase som inkorporerer ukonvensjonelle baseanaloger er en F730Y-mutant DNA-polymerase fra Thermotoga neapolitana (internasjonal patentsøknad, publikasjon nr. WO 96/10640,

WO 96/41014 og WO 97/09451). Ved anvendelse av disse enzymer, for en gitt dNTP-konsentrasjon, kan rhodamin-ddNTP-konsentrasjonen nedsettes med ca. femti til flere hundre ganger sammenlignet med termostabile DNA-polymeraser tidligere tilgjengelige

E681K-mutasjonen ble kombinert ved anvendelse av rekombinante DNA-metoder med en F667Y-mutasjon for å frembringe det dobbeltmutante Taq DNA -polymeraseenzym som anvendes i sekvenserings-reaksjonene beskrevet i eksempel IV. Den dobbelte mutant ble anvendt i en fargestoffterminatorsekvenseringsreaksjon med fluoresceinmerkede fargestoffterminatorer. Resultatene, beskrevet i eksempel IV, viser at enzymet er i stand til å inkorporere fluoresceinmerkede fargestoffterminatorer i en sekvenseringsreaksjon, og frembringer sekvenseringsstiger som kan avleses nøyaktig i et automatisert sekvenseringsinstrument. Uventet ble kombinasjonen av E681K-og F667Y-mutasjonene også funnet å frembringe et termostabilt DNA-polymeraseenzym med en 3- til 4-ganger øket ekstensjonshastighet i forhold til et enzym med F667Y-mutasjonen alene, som målt ved analysen beskrevet i eksempel III.

Det kritiske motiv kan kombineres med motiver som gir redusert diskriminering mot ddNTP'er for fremstilling av polymeraser som har øket inkorporerings-effektivitet av både merkede og umerkede ddNTPer. Disse polymeraser er anvendelige i DNA-sekvenseringsmetoder. En termostabil DNA-polymerase som har det kritiske motiv definert heri, kan også omfatte det kritiske motiv som inkluderer F667Y-mutasjonen, beskrevet i US serie nr. 08/448.223.

Også innenfor rammen av denne oppfinnelse er den forbedrede sekvenserings-fremgangsmåte ifølge denne oppfinnelse gjennomført ved anvendelse av termostabile DNA-polymeraseenzymer med et kritisk motiv som ikke er avledet ved mutasjon, men hvilket kritiske motiv eksisterer som en naturlig variant. I dette aspekt vil DNA-polymerasen av en termofil bakterieart ha et kritisk motiv hvori resten i posisjon 4 ikke er Glu. I den termostabile DNA-polymerase fra Thermotoga neapolitana vil f.eks X i posisjon 4 i motivet LSXXLX(V/I)PXXE (SEKV ID NR. 7), hvor X er hvilken som helst aminosyre unntatt E, være en argininrest.

Selv om eksemplene som tilveiebringes heri anvender dideoksynukleotider merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien, vil anvendelse av andre ukonvensjonelle nukleotider og fluorescerende fargestoffer også være innenfor rammen av denne oppfinnelse. Andre ukonvensjonelle nukleotider inkluderer fluoresceinmerkede dNTP'er, som kan anvendes til å merke produktene av DNA-syntese, og fluoresceinmerkede rNTP'er som kan anvendes til å merke primerekstensjonsproduktene. Andre fargestoffer inkluderer andre negativt ladede fluorescerende fargestoffer, så som BODIPY, som strukturelt og kjemisk har likhet med fluorescein. Andre fargestoffer inkluderer også cyanin fargestoffer. Cyaninmerkede dNTP'er ble tilsatt til en standard PCR-reaksjon som inkluderte en Taq DNA-polymerase med E681K-mutasjonen (og en G46D-mutasjon). De cyaninmerkede dNTP'er ble uventet funnet å bli inkorporert i oppformeringsprodukter på et nivå som var høyere enn for villtype-enzym. I dette aspekt vil således en fremgangsmåte for merking av DNA ifølge denne oppfinnelse anvende en naturlig eller mutant polymerase ifølge denne oppfinnelse i kombinasjon med et nukleotid merket med enten et negativt ladet fluorescerende fargestoff eller et cyanin fargestoff.

Mutante polymerasedomener så som domenet for Taq inneholdende E615G-og E681K-mutasjonene er anvendelige i forbedrede fremgangsmåter for fremstilling av primerekstensjonsprodukter merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien. I en primerekstensjonsreaksjon så som PCR blir f.eks. rNTP'er merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien substitutert i det minste delvis for en av de fire standard dNTP'er, og en dobbelt mutantpolymerase så som E681K, E615G Taq DNA-polymerase blir inkludert. Mutantpolymerasen syntetiserer primerekstensjonsprodukter som har fluoresceinmerkede ribo-nukleotidrester i forskjellige posisjoner langs sin lengde. Ved varme- eller alkalibehandling blir primerekstensjonsproduktene fragmentert ved hver ribo-nukleotidrest og frembringer en populasjon av endemerkede fragmenter. Denne populasjon av ensartet merkede fragmenter representerer en fordeling av fluoresceinmerkelappen tvers over lengden av primerekstensjonsproduktet. Merkede fragmenter med disse egenskaper er anvendelige i nukleinsyre-påvisningsformater basert på silikonbrikker, så som det til Cronin et al., supra.

I ytterligere et annet aspekt vil enzymer med det kritiske motiv ifølge denne oppfinnelse ha en øket ekstensjonshastighet i forhold til villtype-enzymet som vist i eksempel IV for en E681K F667Y mutant.

I ovennevnte DNA-sekvensering ifølge denne oppfinnelse er termostabil pyrofosfatase inkludert i reaksjonsblandingen. Pyrofosfatase er blitt vist å forbedre sekvenseringsdata ved anvendelse av mesofile så vel som de mutante termostabile DNA-polymeraser beskrevet i europeisk patent nr.

EP-A-763 599 og US patent nr. 5.665.551.

I en utførelse vist som eksempel skal den termostabile DNA-polymerase ifølge denne oppfinnelse også inneholde en mutasjon i 5'-nuklease-domenet som tjener til i høy grad å svekke denne nukleaseaktivitet. Modifiserte former av Tag-polymerase er beskrevet i PCT patentpublikasjon nr. WO92/06200, publisert 16. april 1992 og i US patent nr. 5.466.591.

Følgende eksempler er gitt utelukkende som illustrasjon.

EKSEMPEL 1

Ekspresjon av et modifisert Taq polymerasegen

som har redusert diskriminering mot nukleotider

merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien

Den C-terminale aminosyredel av Taq DNA-polymerase koder for det polymeraseaktive setedomene (Lawyer et al., 1993, PCR Methods and Applications 2:275-287, Freemont et al., 1986, Proteins; Stucture, Function and Genetics 1:66-73). Et DNA-fragment inneholdende denne region ble isolert fra Taq genet i full lengde og mutage-nisert ved PCR-oppformering i nærvær av mangan (Leung et al., 1989, Technique 1(1):11-15). For dette eksempel ble alle restriksjonsenzymer inn-kjøpt fra New England Biolabs, Beverly MA. De mutageniserte fragmenter ble spaltet med Psfl og Bgli\ og klonet inn i et Taq ekspresjonsplasmid, pLK102, som var blitt spaltet med Psfl og BglU. Plasmid pLK102 er et derivat av pLK101 hvori 900 bp Ps1\- Bgl\\ fragmentet er erstattet med en kort Pst\- Bgl\\ linker. Plasmid pLK101 er en modifisert form av pSYC1578 (Lawyer et al., 1993, supra og US patent nr. 5.079.352), hvori det lille HincU/ EcoRV fragment lokalisert 3' til den polymerasekodende region var deletert.

De resulterende ekspresjonsplasmider ble transformert over i E. colistammen N1624 (tilgjengelig fra the E. coli Genetic Stock Center at Yale University, stamme nr. CGSC #5066) og de resulterende transformanter ble "screenet" for evnen til mer effektivt å inkorporere [cc-<32>P]Tet-dCTP sammenlignet med villtype-enzymet. Ved anvendelse av denne fremgangsmåte ble mutant CS1 identifisert til å ha evne til mer effektivt å inkorporere [oc-<32>P]Tet-dCTP. Det mutageniserte Taq ekspresjonsplasmid av mutant CS1 ble spaltet med Hind\\\ l Nhe\ og det resulterende restriksjonsfragment ble subklonet inn i villtypegenet av pLK101, og erstattet det ikke-mutageniserte Hind\\\/ Nhe\ fragment, for å bestemme hvilken del av det mutageniserte Taq polymerasegen som var ansvarlig for den forandrede fenotype. Subkloner inneholdende Hind\\\/ Nhe\ restriksjonsfragmentet overførte den forandrede fenotype til villtype-enzymet, hvilket indikerte at mutasjonen var innenfor dette fragment. Påfølgende subklonanalyse bestemte at mutasjonen var lokalisert i 265 bp BamH\- Nhe\ fragmentet.

DNA-sekvensanalyse av 265 bp Nhe\- BamH\ fragmentet ble gjennomført på pCS1 ved anvendelse av TaqFS DyeDeoxy™ Terminator Cycle Sequencing "kit" fra Applied Biosystems, Foster City, Ca, og the Applied Biosystems Model Prism 377 DNA Sequencing System. Sekvensanalysen identifiserte en misfor-stått mutasjon i Taq polymerasegenet i aminosyreposisjonen 681, som forårsaket at en glutaminsyre (E)-rest ble erstattet med en lysin (K)-rest. Nummere-ringen startes i det kodon som koder for den første metioninrest av det naturlige protein, som i US patent nr. 5.079.352. Denne mutasjon, E681K, ble forårsaket spesifikt ved en GAG- til AAG-forandring i kodonsekvensen. Plasmid pCS1 ble deponert hos ATCC den 28. august 1997 og gitt adgangsnummer 98521.

Plasmid pCS1 kan inneholde ytterligere mutasjoner i den kodende sekvens for Taq polymerase; ved ytterligere subkloningseksperimenter ble imidlertid E681K mutasjonen bestemt til å være utelukkende ansvarlig for den økede effektivitet i inkorporering av nukleosidtrifosfater merket med fluoresceinfargestoffer. Denne punktmutasjon er lokalisert i 265 bp BamH\- Nhe\ DNA-fragmentet vist i figur 1. I dette 265 bp DNA-fragment er E681 K-mutasjonen den eneste forandring fra villtype Taq polymerasegensekvensen.

For ytterligere analyse og kvantifisering av effektiviteten av inkorporering av nukleotidanaloger ble 265 bp BamH\- Nhe\ fragmentet av plasmid pCS1 klonet inn i en Taq ekspresjonsvektor som inneholdt villtypesekvensen i polymerasedomenet, pRDA3-2, Plasmid pRDA3-2 referert til som klon 3-2, er fullstendig beskrevet i PCT patentpublikasjon nr. WO92/06200. Et andre klon som koder for både E681 K-mutasjonen så vel som en F667Y-mutasjon ble dannen ved primerstyrt mutagenese og påfølgende kloning av et PCR-produkt inneholdende begge mutasjoner i BamH\- Nhe\ setene av plasmid pRDA3-2.

Ekspresjonsvektoren pRDA3-2 inneholder den fullstendige lengde av Taq DNA-polymerasegenet operabelt forbundet med fag lambda PL-promoteren. I vektor pRDA3-2 vil 5'-nukleasedomenet av Taq DNA-polymerasegenet inneholde en punktmutasjon i det kodon som koder for glycin i posisjon 46 som reduserer 5'-nukleaseaktiviteten (G46D-mutasjon). Denne gensekvens i polymerasedomenet av ekspresjonsvektoren pRDA3-2 er imidlertid identisk med villtype Taq DNA-polymerasegensekvensen. Plasmidene pRDA3-2, pCS1 og E681K F667Y PCR-produktet ble spaltet med BamH\ og /Mel, og 265 bp DNA-fragmentet fra plasmid pCS1 eller PCR-produktet ble ligert inn i vektor pRDA3-2 på konvensjonell måte. De resulterende plasmider, henholdsvis pLK112 og pLK113 ble transformert inn i E. coli stamme DG116 (ATCC nr.

53606). Disse plasmider koder for termostabile DNA-polymeraser heri referert til som henholdsvis G46D E681K Taq og G46D E681K F667Y Taq. Det uttrykte termostabile DNA-polymeraseprotein G46D E681K F667Y Taq ble renset ifølge fremgangsmåten beskrevet av Lawyer et al., 1993, supra.

G46D E681K Taq enzymet ble renset ved anvendelse av en lignende frem-stillingsfremgangsmåte, men i mindre skala, som følger: Alle trinn ble gjennomført ved 4°C dersom intet annet var angitt. Celler fra en 475 ml kultur ble slemmet opp igjen på nytt i 30 ml buffer (50 mM tris-HCI, pH 7,5,10 mM EDTA, pH 8,0, 0,5 mM Pefabloc<c>SC, 0,5 ug/ml leupeptin, 0,1 mM Ncc-p-tosyl-L-lysin-klormetylketon, 1 mM DTT). Cellene ble ultralydbehandlet ved 50% driftssyklus, setting 5 i 1 minutt og avkjølt på is i 1 minutt. Dette trinn ble gjentatt ytterligere to ganger. Deretter ble tilsatt 1,5 ml av 4,0 M ammonium-sulfat, og blandingen oppvarmet i et 75°C vannbad i 15 minutter, etterfulgt av avkjøling på is. Polyetylenimin ble tilsatt til 0,6%, og blandingen ble inkubert på is i 10 minutter. Blandingen ble sentrifugert ved 16000xg i 30 minutter. Supernatanten ble påsatt på en fenylsefarosekolonne med et volum på 1,8 ml (Bio-rad Polyprep kromatografikolonne) ekvilibrert med en løsning av 50 mM tris-HCI, pH 7,5, 10 mM EDTA, pH 8,0, 1 mM DTT, 0,2 M (NH4)2S04. Kolonnen ble vasket med 6 ml hver av tre løsninger: 1) 25 mM tris-HCI, pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM DDT, 0,2 M (NH4)2S04> 2) 25 mM tris-HCL, pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT og 3) 25 mM tris-HCI, pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 20% etylenglykol. Polymerasen ble eluert med 6 ml av 25 mM tris-HCI, pH 7,5,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 20% etylenglykol, 2,5 M urea. Etter justering av polymerasepreparatet til 100 mM KCI med 3 M KCI, ble blandingen påsatt på en heparinsefarosekolonne (1,8 ml volum, Bio-rad Polyprep-kolonne) ekvilibrert i 25 mM tris-HCI, pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 100 mM KCI. Etter en vasking med den samme buffer ble prøven eluert i en buffer av 25 mM tris-HCI, pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 400 mM KCI.

Etter rensing ble aktiviteten av de modifiserte enzymer bestemt ved aktivitets-analysen beskrevet hos Lawyer et al., 1998, J. Biol. Chem. 264:6427-6437. Aktiviteten av de rensede enzymer ble beregnet som følger: En enhet av enzym tilsvarer 10 nmol av produkt syntetisert i 30 minutter. DNA-polymeraseaktiviteten er lineært proporsjonal med enzymkonsentrasjonen opp til 80-100 pmol dCMP inkorporert (fortynnet enzym ved 0,024-0,03 enheter/pl). De rensede enzymer ble anvendt i inkorporerings- og

sekvenseringsreaksjonene beskrevet i eksemplene ll-IV.

EKSEMPEL II

Analyse for å sammenligne effektivitet av inkorporering av ddNTP'er

De relative evner av G46D F667Y Taq, G46D F667Y E681K Taq og F730Y 7?77a30 DNA-polymeraser til å inkorporere et fluoresceinfargestoff familie-merket ddCTP ble sammenlignet ved anvendelse av et begrensende templat, primerekstensjonskonkurranseanalyse. F730Y Tma30 DNA-polymerase er beskrevet i eksempel I av US serie nr. 60/052065, innlevert 9. juli 1997 og i europeisk patentsøknad nr. 98112327.6, begge inkorporert heri ved referanse.

I denne konkurranseanalyse, fordi inkorporeringen av et ddCTP vil terminere ekstensjonsreaksjonen, jo letter polymerasen inkorporerer et ddCTP i en utvidet primer, jo mindre [oc-<33>P]dCTP kan inkorporeres. Ettersom effektiviteten av ddCTP-inkorporeringen øker, vil således graden av inhibering av DNA-syntese bli øket. Effektiviteten av inkorporering av ddCTP blir deretter sammenlignet med effektiviteten av inkorporering av fluoresceinmerket ddCTP for å gi en relativ måling av effektiviteten av inkorporering av fluoresceinmerkede ddNTP'er for et gitt enzym.

Analysen ble gjennomført som tidligere beskrevet (Lawyer et al., 1989, J. Biol. Chem. 264:6427) innbefattet følgende modifikasjoner. Analyseblandingen var sammensatt slik at den endelige konsentrasjon var 50 mM bicin pH 8,3, 25°C, 2.5 mM MgCI2, 1 mM p-merkaptoetanol, 20 uM hver av dATP, dGTP og dTTP (Perkin-Elmer), 20 uM dCTP (Perkin-Elmer) og [a-<33>P]dCTP (New England Nuclear, Boston, MA). M13mp18 (Perkin-Elmer) ble annilert til primer DG48 (SEKV ID NR. 10) og ekvivalenten av 0,085 pmol av det annilerte templat ble tilsatt til analyseblandingen for hver reaksjon. 35 pl av analyseblandingen med templat DNA ble tilsatt til hvert av 38 Eppendorf rør på 0,5 ml. Fortynninger av Zowie-ddCTP i 25 mM CAPSO buffer, pH 9,6 ble fremstilt slik at når 10 pl av hver ble tilsatt til reaksjonsrøret, ville den endelige konsentrasjon av Zowie-ddCTP være 3, 1, 0,5, 0,25, 0,125 eller 0,0625 pM. For G46D F667Y Taq DNA-polymerase ble det fremstilt to rør hver av 3,1, 0,5, 0,25, 0,125 pM Zowie-ddCTP. For G46D F667Y E681K 7agog F730Y 7ma30 DNA-polymeraser ble det fremstilt to rør hver av 1, 0,5, 0,25, 0,125 og 0,0625 uM Zowie-ddCTP.

De åtte gjenværende reaksjonsrør fikk 10 pl av 25 mM CAPSO buffer, pH 9,6. Hvert av de trettiåtte rør inneholdt således 35 pl av analyseblanding og 10 pl av enten 25 mM CAPSO buffer, pH 9,6, eller en av Zowie-ddCTP fortynningene.

For hvert enzym som skulle testes ble polymeriseringen initiert i ett rør av hver Zowie-ddCTP fortynning og to rør inneholdende CAPSO-bufferen alene ved anvendelse av 5 pl av enzymet. De følgende konsentrasjoner av enzymene ble anvendt, hver på forhånd bestemt til å være en overskuddsmengde av enzym for mengden av substrat i analysen: 2,5 enheter av F667Y G46D Taq DNA-polymerase fremstilt som i eksempel I; 1,25 enheter av G46D, F667Y, E681K Taq DNA-polymerase, fremstilt som i eksempel I; eller 2 enheter av F730Y Tma30 DNA-polymerase. Som kontroll for bakgrunnsnivået ble den gjenværende negative kontroll initiert med enzymfortynningsbuffer istedenfor polymerase. Alle reaksjonsrør ble umiddelbart kort "vortexed" og inkubert i 10 minutter ved 75°C. Reaksjonene ble stanset ved tilsetning av 10 pl 60 mM EDTA og lagret ved 0°C.

I et tilsvarende eksperiment ble ddCTP fortynnet i 25 mM CAPSO buffer, pH 9.6 slik at når 10 pl av hver fortynning ble tilsatt til reaksjonsrørene, ville den endelige konsentrasjon være 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625 eller 0,0312 pM. 10 pl av hver fortynning ble pipettert over i hver av tre 0,5 ml Eppendorf rør inneholdende 35 ul av analyseblandingen som beskrevet ovenfor. Fire rør inneholdende 35 ul av analyseblandingen pluss 10 pl av 25 mM CAPSO buffer, pH 9,6 ble også fremstilt. Hvert av de 19 rørene inneholdt således 35 pl av analyseblanding og 10 pl hver av enten 25 mM CAPSO, pH 9,6, eller en av ddCTP fortynningene.

Polymerisering ble initiert i et rør av hver ddCTP fortynning og et rør av CAPSO buffer med 2,5 enheter av G46D F667Y Taq DNA-polymerase, 1,25 enheter av G46D F667Y E681K Taq DNA-polymerase eller 2 enheter av F730Y 7ma30 DNA-polymerase. Det gjenværende rør inneholdende CAPSO ble initiert med enzymfortynningsbuffer istedenfor den polymeraseholdige buffer som en negativ kontroll. Alle reaksjoner ble umiddelbart "vortexed" og inkubert i 10 minutter ved 75°C. Reaksjonenen ble stanset ved tilsetning av 10 pl av

60 mM EDTA og lagret ved 0°C.

For hver reaksjon ble en 50 pl alikvot av 60 pl reaksjonen fortynnet med 1 ml

2 mM EDTA, 50 pg/ml skjærbehandlet laksesed DNA som bærer. DNA ble utfelt med TCA ved anvendelse av standardfremgangsmåter og oppsamlet på GF/C filterskiver (Whatman). Mengden av inkorporert [a-<33>P]dCMP ble bestemt for hver prøve og normalisert til CAPSO-prøvene uten ddNTP (0% inhibering). Konsentrasjonen av ddCTP eller Zowie-ddCTP nødvendig for 50% inhibering ble beregnet for hver prøve, og er vist i tabell 2. Sammenligning av den mengde av ddCTP som er nødvendig for å inhibere syntesen 50%, med den mengde av Zowie-ddCTP som er nødvendig for å inhibere syntesen med 50% for et spesielt enzym, vil reflektere den relative evne av hvert enzym til å inkorporere fluoresceinmerket analog. Disse data viser at G46D F667Y Taq DNA-polymerase vil inkorporere Zowie-ddCTP minst effektivt av de tre testede enzymer (forhold av konsentrasjoner for 50% inhibering med Zowie-ddCTP versus ddCTP = 25). F730T 7ma30 DNA-polymerase vil inkorporere denne merkede analog mer effektivt enn G46D F667Y Taq DNA-polymerase (forhold av konsentrasjoner for 50% inhibering med Zowie-ddCTP versus ddCTP = 4), mens G46D F667Y E681K Taq DNA-polymerase vil inkorporere merket og umerket ddCTP med nesten lik effektivitet (forhold av konsentrasjoner for 50% inhibering med Zowie-ddCTP versus ddCTP = 1,2).

Eksempel III

Ekstensjonshastighetsanalyse

Ekstensjonshastigheten av G46D F667Y Taq og G46D F667 E681K Taq ble bestemt ved anvendelse av en ekstensjonshastighetsanalyse. I dette eksperiment ble enzymene anvendt til å utvide en primer annilert til et M13 templat i nærvær av [a-<33>P]dCTP. Ekstensjonsreaksjonene ble denaturert, og produktene analysert ved denaturerende agarosegel-elektroforese.

Analysen ble gjennomført som tidligere beskrevet (Lawyer et al., 1989, J. Biol.

Chem. 264:6427) innbefattet følgende modifikasjoner. Analyseblandingen var sammensatt slik at sluttkonsentrasjonen var 50 mM bicin pH 8,3, 25°C, 2,5 mM MgCI2,1 mM p-merkaptoetanol, 200 pM hver av dATP, dGTP og dTTP (Perkin-Elmer), 100 pM dCTP (Perkin-Elmer) inneholdende [a-<33>P]dCTP (New England Nuclear, Boston, Ma). M13mp18 (Perkin-Elmer) ble annilert til primer DG48

(SEKV ID NR. 11), og ekvivalenten av 0,085 pmol av det annilerte templat ble

tilsatt til analyseblandingen for hver reaksjon. 45 pl av analyseblandingen med templat DNA ble tilsatt til hver av fjorten Eppendorf rør på 0,5 ml. Hvert rør ble preinkubert ved 75°C i minst 30 sekunder før starten av polymerasereaksjonen.

Polymerisering ble initiert i seks av de fjorten analyserør med 5 pl av G46D F667Y Taq DNA-polymerase (2,5 enheter) eller G46D F667Y E681K Taq DNA-polymerase (1,25 enheter). Begge enzymer ble fremstilt som i eksempel I, og den anvendte konsentrasjon respresenterer en på forhånd bestemt overskuddsmengde av enzym for mengden av substrat i analysen. Som kontroll for bakgrunnsnivået ble den gjenværende negative kontroll initiert med enzymfortynningsbuffer istedenfor polymerase. Alle reaksjonsrør ble umiddelbart kort "vortexed" og inkubert ved 75°C. To av de seks rør inneholdene G46D F667Y Taq DNA-polymerase ble inkubert i 3 minutter, to i 6 minutter og to i 10 minutter Samtidig ble to av rørene startet med G46D F667Y E681K Taq DNA-polymerase inkubert i 30 sekunder, to i 1 minutt og to i 2 minutter. Kontroll-rørene ble inkubert i 3 minutter. Reaksjonene ble stanset ved tilsetning av 10 pl 60 mM EDTA og lagret ved 0°C.

For hver reaksjon ble en 25 pl alikvot av 60 pl reaksjonen fortynnet med 1 ml 2mM EDTA, 50 pg/ml skjærkraftbehandlet laksesed DNA som bærer. DNA ble utfylt med TCA ved anvendelse av standardfremgangsmåter og oppsamlet på GF/C filterskiver (Whatman). Mengden av inkorporert [a-<33>P]dCMP ble bestemt for hver prøve.

De gjenværende 35 I av hvert duplikat ble slått sammen, og prøven på 70 pl ble etanol-utfelt, tørket og slemmet opp igjen på nytt i 50 mM NaOH, 1 mM EDTA. Alikvoter ble uttatt fra disse prøver slik at et like stort antall av [a-<33>P] tellinger ble tatt fra hver. Disse alikvoter ble påsatt på en 0,9% alkalisk agarosegel, underkastet elektroforese, tørket og autoradiograftert som tidligere beskrevet (Maniatis et al., 1982, In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Bakteriofag lambda DNA kuttet med restriksjonsenzym HindlW (BRL) og 5' endemerket med [<32>P] ble anvendt som molekylvektstandard.

Lengden i basebar av ekstensjonsproduktet i hver prøve ble bestemt ved sammenligning av migreringsavstanden av hver prøve med distansen migrert av lambda DNA-størrelsestandarden. Antallet av basepar i hvert produkt ble dividert med antallet sekunder som hver ekstensjonsreaksjon var inkubert for å gi ekstensjonshastigheten som vist nedenfor.

Disse resultater indikerer at tilstedeværelsen av E681 K-mutasjonen vil øke ekstensjonshastigheten av et G46D F667Y enzym med 3 til 4,3 ganger.

EKSEMPEL IV

Syklus-sekvensering med G46D F667Y E681K Taq DNA-polymerase og fluoresceinmerkede ddNTP'er

Dette eksempel demonstrerer anvendelsen av den modifiserte polymerase ifølge denne oppfinnelse på fluoresceinfargestoffmerket dideoksyterminator-syklussekvensering, ved anvendelse av 1 pM eller mindre ddNTP og et forhold av ddNTP:dNTP på minst 1:100. De fluoresceinfargestoffmerkede dideoksy-terminatorer er reagenser fra the Applied Biosystems PRISM Sequenase® Terminator Sequencing Kits (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) og ble optimalisert for anvendelse med Sequenase DNA-polymerase og alfa-tio-dNTP'er. Syklus-sekvenseringsreaksjoner ble gjennomført i et 20 pl volum inneholdende 50 mM tris-HCI (pH 8,8), 2,0 mM MgCI2, 100 pM hver av dATP, dCTP og dTTP (Perkin-Elmer, Norwalk, CT), 500 pM dITP (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), 0,2 pg M13mp18 enkelttrådet DNA templat (Perkin-Elmer), 0,15 pM LacZ Forward Primer (Perkin-Elmer),5 enheter av G46D F667Y E681K Taq DNA-polymerase, 20 enheter av rTfftThermostable Pyrophosphatase (europeisk patensøknad, publikasjon nr. EP-A-763 599 og US patent nr. 5.665.551), 0,05 pM Sequenase A Dye Terminator, 0,80 pM Sequenase C Dye Terminator, 0,08 pM Sequenase G Dye Terminator og 1,0 pM Sequenase T Dye Terminator.Alle fire Sequenase Dye Terminators ble kjøpt fra Perkin-Elmer. Reaksjonene ble plassert i en på forhånd oppvarmet (75°C) Perkin-Elmer GeneAmp® PCR System 9600 thermal cycler og underkastet 25 cykler av 96°C i 10 sekunder, 50°C i 5 sekunder og 60°C i 4 minutter. Fargestoffmerkede fragmenter ble renset med Centri-Sep™ kolonner (Princeton Separations, Adelphia, NJ) ifølge produsentens instruksjoner og tørket i en vakuumsentrifuge. Pelletene ble slemmet opp igjen på nytt i 6 pl av avionisert formamid:50 mg/ml Blue dextran (i 25 mM EDTA, pH 8,0) 5:1 (v/v), oppvarmet ved 90°C i 3 minutter, og direkte påsatt på en pre-elektroforesert 4% polyakrylamid/6 M ureagel og underkastet elektroforese og analysert på en Perkin-Elmer ABI PRISM' 377 DNA Sequencer ifølge produsentens instruksjoner (ABI PRISM 377 DNA Sequencer User's Manual). Automatisert basebenevnelse med Perkin-Elmer ABI PRISM 377 DNA Sequencer analyseprogramvaren resulterte i høyere enn 98,5% nøyaktighet for 450 baser (6 feil for basene +10 til +460 fra primer).

Claims

1. Rekombinant termostabil DNA-polymerase, karakterisert ved at a) i sin naturlige form omfatter nevnte polymerase aminosyresekvensen LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu (SEKV ID NR.1), hvor "Xaa" i posisjon 3 av nevnte sekvens er Gin eller Gly, "Xaa" i posisjon 6 i nevnte sekvens er Ser eller Ala, "Xaa" i posisjon 7 av nevnte sekvens er Val eller Ile, "Xaa" i posisjon 9 av nevnte sekvens er Tyr og "Xaa" i posisjon 10 av nevnte sekvens er Glu; b) nevnte "Xaa" i posisjon 4 er mutert til en polar aminosyre eller til en positivt ladet aminosyre; og c) nevnte termostabile DNA-polymerase har et nivå av diskriminering mot inkorporering av nukleotider merket med fluoresceinfamiliefargestoffer som er redusert sammenlignet med den naturlige form av nevnte polymerase, hvor nevnte nukleotid er et dideoksynukleotid, og nevnte diskrimineringsnivå er minst tre ganger lavere enn nivået av nevnte naturlige form av nevnte polymerase, hvor nevnte diskrimineringsnivå blir målt ved å bestemme den konsentrasjon av et dideoksynukleotid merket med et fluoresceinfargestoff som er nødvendig for 50% inhibering av DNA-syntese.

2. Rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte polymerase er fra en termofil art valgt fra gruppen bestående av Thermosipho africanus, Bacillus caldotenax og Bacillus stearothermophilus.

3. Rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte polymerase er fra en Thermus art.

4. Rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge krav 3, karakterisert ved at a) nevnte polymerase i sin naturlige form omfatter aminosyresekvensen LeuSerXaaXaaLeuXaalleProTyrGluGlu (SEKV ID NR:. 2), hvor "Xaa" i posisjon 3 er Gin eller Gly, og "Xaa" i posisjon 6 er Ser eller Ala; b) "Xaa" i posisjon 4 er mutert til en polar aminosyre eller til en positivt ladet aminosyre; og c) nevnte termostabile DNA-polymerase har et nivå av diskriminering mot inkorporering av nukleotider merket med fargestoffer av fluorescein-familien og som er redusert sammenlignet med den naturlige form av nevnte polymerase, hvor nevnte nukleotid er et dideoksynukleotid, og nevnte diskrimineringsnivå er minst tre ganger lavere enn nivået av nevnte naturlige form av nevnte polymerase, hvor nevnte diskrimineringsnivå blir målt ved å bestemme den konsentrasjon av et dideoksynukleotid merket med et fluoresceinfargestoff som er nødvendig for 50% inhibering av DNA-syntese.

5. Rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge krav 4, karakterisert ved at a) nevnte polymerase i sin naturlige form omfatter aminosyresekvensen LeuSerGlnXaaLeuAlalleProTyrGluGlu (SEKV ID NR: 3) hvor b) "Xaa" i posisjon 4 er mutert til en polar aminosyre eller til en positivt ladet aminosyre; og c) nevnte termostabile DNA-polymerase har et nivå av diskriminering mot inkorporering av nukleotider merket med fargestoffer av fluorescein-familien og som er redusert sammenlignet med den naturlige form av nevnte polymerase, hvor nevnte nukleotid er et dideoksynukleotid, og nevnte diskrimineringsnivå er minst tre ganger lavere enn nivået av nevnte naturlige form av nevnte polymerase, hvor nevnte diskrimineringsnivå blir målt ved å bestemme den konsentrasjon av et dideoksynukleotid merket med et fluoresceinfargestoff som er nødvendig for 50% inhibering av DNA-syntese.

6. Rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge krav 5, karakterisert ved at nevnte "Xaa" i posisjon 4 er mutert til Lys.

7. Rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte polymerase er fra en Thermotoga art.

8. Nukleinsyresekvens, karakterisert ved at den koder for en rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7.

9. Vektor, karakterisert ved at den omfatter en nukleinsyre-sekvens som koder for en rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7.

10. Vertscelle, karakterisert ved at den omfatter en nukleinsyre-sekvens som koder for en rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7.

11. Fremgangsmåte for fremstilling av en rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter: a) dyrking av en vertscelle omfattende en nukleinsyresekvens som koder for en rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 8 under betingelser som befordrer ekspresjonen av den rekombinante termostabile DNA-polymerase; og b) isolering av den rekombinante termostabile DNA-polymerase fra verts-cellen eller fra mediet.

12. Rekombinant termostabil DNA-polymerase, karakterisert ved at den er fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 11.

13. Fremgangsmåte for DNA-sekvensering, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter: a) tilveiebringelse av en rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7; b) tilveiebringelse av en fargestoffterminator merket med et negativt ladet fluorescerende fargestoff; og c) gjennomføring av en fargestoffterminatorsekvenseringsreaksjon.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at den rekombinante termostabile DNA-polymerase har et redusert nivå av diskriminering mot inkorporering av nukleotider merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien og hvori nevnte nukleotid er et dideoksynukleotid, og nevnte diskrimineringsnivå blir målt ved å bestemme forholdet av den konsentrasjon av et dideoksynukleotid merket med et fluoresceinfargestoff som er nødvendig for 50% inhibering av DNA-syntese versus den konsentrasjon av et umerket dideoksynukleotid som er nødvendig for 50% inhibering.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at nevnte forhold er 4 eller mindre.

16. Fremgangsmåte for fremstilling av merket DNA, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter: a) tilveiebringelse av en rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7; b) tilveiebringelse av et nukleotid merket med et fargestoff av fluorescein-familien; og c) gjennomføring av en DNA-syntesereaksjon.

17. Fremgangsmåte for fremstilling av merkede primerekstensjonsprodukter, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter: a) tilveiebringelse av en rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7; i) nevnte polymerase omfatter aminosyresekvensen LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu (SEKV ID NR.1); LeuSerXaaXaaLeuXaalleProTyrGluGlu (SEKV ID NR:. 2) eller LeuSerGlnXaaLeuAlalleProTyrGluGlu (SEKV ID NR: 3); ii) nevnte polymerase har et redusert nivå av diskriminering mot inkorporering av nukleotider merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien sammenlignet med den naturlige form av nevnte polymerase, hvor nevnte nukleotid er et dideoksynukleotid, og nevnte diskrimineringsnivå er minst tre ganger lavere enn nivået av nevnte naturlige form av nevnte polymerase, hvor nevnte diskrimineringsnivå blir målt ved å bestemme den konsentrasjon av et dideoksynukleotid merket med et fluoresceinfargestoff som er nødvendig for 50% inhibering av DNA-syntese, (iii) nevnte polymerase også omfatter den andre aminosyresekvens SQIXLR(V/I) (SEKV ID NR. 18) hvor "X" er hvilken som helst aminosyre unntatt E; (iv) nevnte polymerase har redusert diskriminering mot inkorporering av ribonukleotider merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien; b) tilveiebringelse av et ribonukleotid merket med et fargestoff av fluoresceinfamilien, og c) gjennomføring av en primerekstensjonsreaksjon.

18. Anvendelse av en rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7 i en in vitro DNA-synteseapplikasjon, så som DNA-sekvensering, syntese av merket DNA og fremstilling av merkede primerekstensjonsprodukter.

19. Testsett for DNA-sekvensering, karakterisert ved at den omfatter en termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7, og en terminator merket med negativt ladet fluorescerende fargestoff.

20. Testsett ifølge krav 19, karakterisert ved at den nevnte rekombinante termostabile DNA-polymerase har redusert diskriminering mot inkorporering av nukleotider merket med fargestoffer av fluoresceinfamilien, og hvori nevnte reduserte diskrimineringsnivå blir målt ved å bestemme forholdet av den konsentrasjon av ddNTP merket med et fargestoff av fluorescein-familien som er nødvendig for 50% inhibering av DNA-syntese sammenlignet med konsentrasjonen av et umerket ddNTP og nevnte forhold er 4 eller mindre.

21. Testsett ifølge krav 20, karakterisert ved at nevnte diskrimineringsnivå er minst fem ganger lavere enn det for nevnte naturlige form av nevnte polymerase.

22. Testsett for fremstilling av merket DNA, karakterisert ved at den omfatter en rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7, og et nukleotid merket med et negativt ladet fluorescerende fargestoff.

23. Testsett for fremstilling av merkede primerekstensjonsprodukter, karakterisert ved at den omfatter en rekombinant termostabil DNA-polymerase ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 7, og et ribonukleotid merket med et fargestoff av fluoresceinfamilien.