CZ287498A3 - Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza, způsob její přípravy a kit, který ji obsahuje - Google Patents
Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza, způsob její přípravy a kit, který ji obsahuje Download PDFInfo
- Publication number
- CZ287498A3 CZ287498A3 CZ982874A CZ287498A CZ287498A3 CZ 287498 A3 CZ287498 A3 CZ 287498A3 CZ 982874 A CZ982874 A CZ 982874A CZ 287498 A CZ287498 A CZ 287498A CZ 287498 A3 CZ287498 A3 CZ 287498A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- amino acid
- xaa
- dna polymerase
- recombinant
- thermostable dna
- Prior art date
Links
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 title claims abstract description 158
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 title claims abstract description 155
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 69
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 86
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 84
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 83
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims abstract description 71
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 claims abstract description 30
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 23
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 9
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims abstract description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 108
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 107
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims description 54
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 45
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 41
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 26
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 claims description 16
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 13
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 13
- 241000589596 Thermus Species 0.000 claims description 12
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 claims description 11
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 claims description 11
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 claims description 10
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 8
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 6
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 claims description 5
- 241000193758 [Bacillus] caldotenax Species 0.000 claims description 4
- 241000206213 Thermosipho africanus Species 0.000 claims description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 abstract description 129
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 abstract description 129
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 abstract description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 abstract description 16
- 230000008901 benefit Effects 0.000 abstract description 7
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 abstract description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000003203 nucleic acid sequencing method Methods 0.000 abstract 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 106
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 65
- 239000000047 product Substances 0.000 description 50
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 46
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 45
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 43
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 38
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N [[(2s,5r)-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 ARLKCWCREKRROD-POYBYMJQSA-N 0.000 description 28
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 24
- 239000002585 base Substances 0.000 description 22
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 21
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 17
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 16
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 14
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 14
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 13
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 13
- -1 nucleoside triphosphates Chemical class 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 11
- INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 3-(cyclohexylamino)-2-hydroxy-1-propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CNC1CCCCC1 INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 8
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 8
- 239000001022 rhodamine dye Substances 0.000 description 8
- ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M thionine Chemical compound [Cl-].C1=CC(N)=CC2=[S+]C3=CC(N)=CC=C3N=C21 ANRHNWWPFJCPAZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 101100028900 Caenorhabditis elegans pcs-1 gene Proteins 0.000 description 7
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 7
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 6
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 102000009609 Pyrophosphatases Human genes 0.000 description 5
- 108010009413 Pyrophosphatases Proteins 0.000 description 5
- 241000589499 Thermus thermophilus Species 0.000 description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 5
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 5
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 5
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 4
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 4
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 4
- NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxycytosine 5'-monophosphate Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NCMVOABPESMRCP-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical group CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 241000204664 Thermotoga neapolitana Species 0.000 description 3
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 3
- 241000589501 Thermus caldophilus Species 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N aspartic acid group Chemical group N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 3
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 3
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 3
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 3
- UFJPAQSLHAGEBL-RRKCRQDMSA-N dITP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 UFJPAQSLHAGEBL-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 125000003630 glycyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 241000204666 Thermotoga maritima Species 0.000 description 2
- 241000589498 Thermus filiformis Species 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 2
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 2',3'-Dideoxyadenosine-5-triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](CO[P@@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N AEBSF hydrochloride Chemical compound Cl.NCCC1=CC=C(S(F)(=O)=O)C=C1 WRDABNWSWOHGMS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 241000585703 Adelphia <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010011469 Crying Diseases 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N Deoxyuridine 5'-triphosphate Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 AHCYMLUZIRLXAA-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N Manganese Chemical compound [Mn] PWHULOQIROXLJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000508310 Meiothermus chliarophilus Species 0.000 description 1
- 241000589496 Meiothermus ruber Species 0.000 description 1
- 241000508289 Meiothermus silvanus Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000215040 Neso Species 0.000 description 1
- 108020004485 Nonsense Codon Proteins 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010035148 Plague Diseases 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 108091028733 RNTP Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- YPUSXTWURJANKF-KBIXCLLPSA-N Ser-Gln-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O YPUSXTWURJANKF-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 241000557720 Thermus brockianus Species 0.000 description 1
- 241000557726 Thermus oshimai Species 0.000 description 1
- 241001522143 Thermus scotoductus Species 0.000 description 1
- 241000607479 Yersinia pestis Species 0.000 description 1
- AZJLCKAEZFNJDI-DJLDLDEBSA-N [[(2r,3s,5r)-5-(4-aminopyrrolo[2,3-d]pyrimidin-7-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=CC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 AZJLCKAEZFNJDI-DJLDLDEBSA-N 0.000 description 1
- HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N [[(2s,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] phosphono hydrogen phosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1CC[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HDRRAMINWIWTNU-NTSWFWBYSA-N 0.000 description 1
- SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N [amino(ethoxy)phosphanyl]oxyethane Chemical compound CCOP(N)OCC SWPYNTWPIAZGLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000005082 bioluminescent agent Substances 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000005081 chemiluminescent agent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004040 coloring Methods 0.000 description 1
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N ddTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)CC1 URGJWIFLBWJRMF-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- 230000009849 deactivation Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 230000001050 lubricating effect Effects 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 229910052748 manganese Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011572 manganese Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- AJAZMOFONMJGNP-WMZOPIPTSA-N n-[(2s)-4-methyl-1-oxo-1-[[(2s)-3-oxo-4-(pyridin-2-ylsulfonylamino)butan-2-yl]amino]pentan-2-yl]-1-benzofuran-2-carboxamide Chemical compound O=C([C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C=1OC2=CC=CC=C2C=1)CC(C)C)CNS(=O)(=O)C1=CC=CC=N1 AJAZMOFONMJGNP-WMZOPIPTSA-N 0.000 description 1
- 230000037434 nonsense mutation Effects 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 230000010287 polarization Effects 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 1
- 101150065190 term gene Proteins 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 150000005691 triesters Chemical class 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
- C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
(57) Anotace:
Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymerá* za se zvýšenou účiností pro začleňování nekonvenčních, například fluorosceinovými barvami značených nukleotidů se může připravovat rekombinantní DNA technologií a má výrazné cenové a účinnostní přednosti pro
DNA sekvencování. Modifikovaná DNA polymeráza je výhodná pro in vitro DNA syntézy, například pro DNA sekvencování, pro syntézu značené DNA a pro produkci značených primerních extenzních produktů. Polymerázový enzym je zvláště vhodný pro ukončování řetězce nukleové kyseliny sekvenčními způsoby. Nukleové kyseliny kódující rekombinantní, tepelně stálá DNA polymerázy a vektory a hostující buňky, které je obsahují. Kity obsahující rekombinantní, tepelně stálá DNA polymerázy.
PLX101 (21) Číslo dokumentu:
2874-98 (13) Druh dokumentu: A3 (51) Int. Cl.6:
C12N 9/12 C 12 N 15/54 p!»c
-r — X řfl
AHnc IVEeoR V
Taq DNA Potymsraee
1-r~
G46 FB67
CZ 2874-98 A3 • · • ·
01-1930-98-Ho
Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza, způsob její přípravy a kit, který ji obsahuje
Oblast techniky
Vynález se týká rekombinantní, tepelně stálé DNA polymerázy, která podporuje účinnost začleňování nuk 1eosidtrifosfátů značených barvivém fluoresceinové skupiny a způsobu její přípravy a izolace. Enzymy podle vynálezu jsou vhodné pro četné obory molekulární biologie a zvláště jsou výhodné pro sekvencování nukleové kyseliny. Vynález se také týká kitu, který rekombinantní, tepelně stálou polymerázu obsahuje.
Dosavadní stav techniky
Začleňování nuk 1eosidtrifosfátů (dNTP) značených barvivém fluoresceinové skupiny je důležité v četných in vitro DNA syntetzních aplikacích. Například barevné terminátorové DNA sekvenční reakce vyžadují začlenění fluorescentních dideoxynukleotidových analogů pro ukončení a značení. Kromě toho in vitro příprava značených produktů může zahrnovat začlenění fluorescentních nukleotidů nebo nukleotidových analogů. Například se fluorescenčně značená DNA používá při hybridizačních zkouškách za použití mikroseskupení imobi1izovaných sond (Cronin a kol., Human Mutation 7, str. 244, 1996).
K zajištění věrnosti DNA replikace mají DNA polymerázy velmi silný sklon pro začlenění svých normálních substrátů, označovaných zde jako konvenční deoxynukleosidové trifosfáty (dNTP) a proti začlenění nekonvenčních dNTP včetně dNTP a dNTP analogů značených fluorescentním barvivém. V buňkách tato vlastnost zeslabuje začlenění abnormálních bází, například dUTP pro rostoucí DNA řetězce. In vitro je tato charakteristika obzvláště zřejmá v přítomnosti jak konvenčních tak nekon- 2 venčních fluorescenčně značených nuk 1eosidových trifosfátů, například v DNA sekvenčních reakcích za použití verse způsobu dideoxy řetězového zakončení za použití barevných terminátorů (Lee a kol., Nuc. Acids. Res. 20, str. 2471, 1992).
Obchodně dostupné DNA cyklické sekvenční kity pro způsob barevného terminátoru používají řetězového terminátoru ddNTP značených fluorescentním barvivém rhodaminového typu. Avšak rhodaminová barviva jsou iontově obojetná a nuk 1eosidtrifosfáty, značené těmito barvivý, migrují anomálně v elektroforetickém gelu, použitém pro oddělení produktů sekvence pro identifikaci. Tato vlastnost rhodaminových barviv nutí modifikovat standardní sekvenční protokol, který zahrnuje použití dITP a přídavný stupeň před e1ektroforézou.
Na rozdíl od toho f1uorescentní barviva se záporným nábojem, jako fluoresceinová barviva umožňují 1) lepší oddělování značených nuk 1eosidtrifosfátů a značených primerních extenzních produktů a 2) lepší e1ektrofořetickou migraci značených sekvenčních produktů než f1uorescentní barviva s neutrálním nebo s kladným nábojem.Proto při použití f1uoresceinových barviv odpadají přídavné zpracovatelské stupně, potřebné při použití rhodaminových barviv. Avšak dostupná fluoresceinová barviva nejsou ideální pro použití v současných, obchodně dostupných DNA cyklických sekvencujících formátech, jelikož se ddNTP značené těmito barvivý, nezačleňují účinně do sekvenčních produktů za použití těchto formátů. Proto je potřeba vyvinout obchodně dostupné tepelně stálé DNA polymerázy, které by se účinně začleňovaly do konvenčních a fluorescenčně značených nukleotidů. Vynález řeší tuto potřebu. Kromě toho neočekávatelnou vlastností mutantních enzymů podle vynálezu je zvýšená míra primérní extenze ve srovnání s odpovídajícím enzymem standardního typu. Jinou neočekávate1nou vlastností je zvýšená rovnoměrnost začlenění různých terminátorových nukleotidů v automatizované DNA sekvenční analýze.
Podstata vynálezu
Na matrici závislá rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza spočívá podle vynálezu v tom, že
a) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu, SEQ ID NO:1, přičemž Xaa v poloze 3, 4, 6, 9 a 10 sekvence znamená jakýkoliv aminokyseinový zbytek a Xaa v poloze 7 znamená Val nebo Ile,
b) Xaa v poloze 4 je mutovaný ve srovnání s nativní sekvencí s výjimkou, že Xaa v poloze 4 není mutován na Glu a
c) tepelně stálá DNA polymeráza má rozlišovací schopnost proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovým barvivém, která je snížena ve srovnání s nativní formou této polymerázy.
V jednopísměnovém kódu se SEQ ID NO:1, označovaná ve trípí směnovém kódu jako LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu, označuje jako LSXXLX(V/I)PXXE.
Vynález se tedy týká na matrici závislých rekombinantních, tepelně stálých DNA po 1ymerázových enzymů se sníženým rozlišováním proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý ve srovnání s dříve charakterizovanými enzymy. Tyto enzymy začleňují nukleotidy, včetně deoxynukleotidů (dNTP) a bázových analogů , jako jsou dideoxynukleotidy (ddNTP), které jsou značeny f1uoresceinovými barvivý účinněji než běžné tepelně stálé enzymy. Vynález se rovněž týká genů, kódující tyto enzymy, jakožto rekombinantních expresních vektorů pro získání velkého množství Čištěných enzymů.
Podle vynálezu je identifikována kritická oblast tepelně stálé DNA polymerázy, která ovlivňuje schopnost polymerázy začleňovat nukleotidy, značené fluoresceinovými barvivý, za zachování schopnosti začleňovat svědomitě přírodní nukleotidy.
Tato kritická oblast, kritický motiv, se může zavádět do genů
- 4 ·pro tepelně stálé DNA polymerázy rekombinantními DNA způsoby, například místně specifickou mutagenezí k realizaci vynálezu.
Vynález se tedy týká rekombinantních tepelně stálých DNA polymerázových enzymů, které jsou mutovány k produkování kritického motivu a snižují rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý ve srovnání s odpovídajícími enzymmy standardního typu.
Podle jiného provedení rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza spočívá podle vynálezu v tom, že
a) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci
LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE, SEQ ID NO:2, přičemž X znamená jakýkoliv aminokyseinový zbytek,
b) X v poloze 4 je mutovaný ve srovnání s nativní sekvencí s výjimkou, že X není mutován na E a
c) tepelně stálá DNA polymeráza má rozlišovací schopnost proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovým barvivém, která je snížena ve srovnání s nativní formou této polymerázy .
Ve trípí směnovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako jako LeuSerXaaXaaLeuXaalleProTyrGluGlu (SEQ ID N0:2), přičemž Xaa v poloze 3 znamená Gin nebo Gly, Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu a Xaa v poloze 6 Ser nebo Ala. Podle výhodného provedení aminokyselinová sekvence je LSQXLAIPYEE (SEQ ID NO:3), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu. V trípí směnovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerGlnXaaLeuAlalleProTyrGluGlu (SEQ ID NO:3), přičemž znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu. Podle nejvýhodnějšího provedení znamená Xaa v poloze 4 Lys.
Podle dalšího provedení rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza spočívá podle vynálezu v tom, že
a) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci
LSVXLG(V/I)PVKE, SEQ ID NO:4,
b) X v poloze 4 je mutovaný ve srovnání s nativní sekvencí s výjimkou, že X není mutován na E a
c) tepelně stálá DNA polymeráza má rozlišovací schopnost proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovým barvivém, která je snížena ve srovnání s nativní formou této polymerázy.
Ve trípí směnovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako jako LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu (SEQ ID N0:4), přičemž Xaa v poloze 4 znamená jakoukoliv aminokyselinu a Xaa v poloze 7 Val nebo Ile. Podle výhodného provedení aminokyselinová sekvence je LSVXLGVPVKE, (SEQ ID NO:5), kde znamená X v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu. V třípí směnovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerValXaaLeuGlyValProValLysGlu (SEQ ID NO:5), přičemž znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu. Podle nejvýhodnějšího provedení znamená Xaa v poloze 4 Arg. Podle dalšího výhodného provedení aminokyselinová sekvence je LSVXLGIPVKE (SEQ ID NO:6), kde znamená X v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu. V třípí směnovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerValXaaLeuGlylleProValLysGlu (SEQ ID NO:6), přičemž znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu. Podle nejvýhodnějšího provedení znamená Xaa v poloze 4 Arg.
Zvláštní kritická oblast podle vynálezu se může kombinovat s motivy jiných oblastí polymerázového genu, o němž je známo, že poskytuje tepelně stálé DNA polymerázy se sníženým rozlišováním proti začlenění nekonvenčních nukleotidů jako například rNTP a ddNTP. Příkladně byl konstruován rekombinantní Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerázový enzym obsahující dvě mutace. První mutací je E až K mutace ve zbytku X v poloze 4 kritického motivu podle vynálezu. Druhou mutací je mutace umož-ňující účinné začlenění ddNTP, známá jako F667Y mutace. Touto mutací je mutace fenylalaninu na tyrosin v poloze 667
Taq DNA polymerázy (popsané v americkém patentovém spise číslo 5 614365 a v americkém patentovém spise číslo přihlášky 8/ 448223). Při použití v sekvenční reakci s fluoresceinovým barvivém značeného ddNTP se zjistilo, že E681K F667Y dvojitý mutantní enzym produkuje čitelný sekvenční žebřík. Podle takového provedení se motiv přinášející snížené rozlišení se zřetelem na dideoxynukleotidy kombinuje s kritickým motivem podle vynálezu za vytvoření enzymu majícího zvýšenou účinnost začlenění jak značeného tak neznačeného ddNTP.
Kromě toho se zjistilo, že E681K F667Y mutantní enzym vyvíjí výrazně zvýšenou míru extenze se zřetelem na enzym se samotnou F667Y mutací. Proto podle dalšího provedení vynálezu zavedení kritického motivu do tepelně stálého DNA polymerázového enzymu, samotného nebo v kombinaci s jinými motivy, produkuje enzymy se zvýšenou mírou extenze. Také se neočekávate1že dvojí mutantní enzym produkuje rovnoměrnější v barevně terminátorovém dideoxysekvancování za použití rhodaminovým barvivém značených terminátorů. Proto ještě podle dalšího provedení vynálezu zavádění kritického motivu do tepelně stálého DNA polymerázového enzymu produkuje enzymy s rovnoměrnějšími výškami píků při DNA sekvenčních způsobech za použití rhodaminovým barvivém značených terminátorů.
ně zjistilo, píkové výšky
Vynález umožňuje také mutace účinnějící účinnější začleňování rNTP, jako glutaminová kyselina, do glycinové mutace v poloze 615 Taq DNA polymerázy, nebo E615G mutace (evropská zveřejněná přihláška vynálezu číslo EP-A-823479) se kombinuje s kritickým motivem podle vynálezu za získání enzymu majícího zvýšenou účinnost při začlenění ribonuk1eosidů značených fluoresceinovým barvivém.
Podle vynálezu se také produkují geny kódující polymerázy podle vynálezu. Zvláště se produkují geny kódující rekombinantní tepelně stálé polymerázy obsahující kritický motiv • · • · · · · ·
• · fc podle vynálezu. Zahrnuty jsou také geny kódující kombinace alespoň dvou mutací, které zahrnují mutace produkující kritický motiv podle vynálezu.
Vynález se také týká zlepšeného způsobu DNA sekvencování, který umožňuje použití nižších koncentrací f luoresceinovým barvivém značených ddNTP, čímž se snižují náklady pro provádění takových reakcí. Zlepšený způsob podle vynálezu také umožňuje použití nižších množství f1uorescei novým barvivém značených ddNTP a dNTP. Použití takových způsobů má četné přednosti, včetně účinnější polymerace, nižších koncentrací matricových žádaných nukleových kyselin a snižuje pravděpodobnost zavedení inhibitorů do reakční směsi. Tyto výhody také usnadňují sekvencování dlouhých mat ric. Vynález se také týká zlepšených způsobů sekvencování, přičemž se sekvencovaná reakční směs může přímo vnášet do sekvencovacích gelů pro následnou elektroforézu bez čištění meziproduktů.
Podle jednoho provedení je vynálezem zlepšený způsob stanovení sekvence štítové nukleové kyseliny za použití rekombinantního enzymu, který má a) mutaci v poloze 4, která produkuje kritický motiv podle vynálezu a b) snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý ve srovnání s odpovídajícím standardním enzymem. Vynález tedy zahrnuje zlepšený způsob sekvencování za použití tepelně stálých DNA polymerázových enzymů odvozených od termofilního druhu, přičemž enzymy obsahují přírodně se vyskytující sekvenční variace, které produkují kritický motiv podle vynálezu. Nativní enzymy mohou také poskytovat snížené rozlišování proti začlenění nekonvenčních nukleotidů. Podle tohoto provedení poskytuje vynález zlepšený způsob sekvencování za použití nativní tepelně stálé DNA polymerázy, která má a) kritický motiv podle vynálezu, přičemž aminokyselinou v poloze 4 je Glu a b) snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý.
• A **··
A A AAAA
AAA A A
A A A A A A
AAA ·
A
A
A
A A A • A »A
Vynález zahrnuje také zlepšené způsoby produkce DNA značených fluoresceinovými barvivý. Enzymy podle vynálezu účinně začleňují fluoresceinovými barvivý značené dNTP do polymerázových řetězových reakčních způsobů za produkce zesílených produktů, které jsou značeny na různých místech fluoresceinovými barviy. Podle takového provedení zlepšený způsob značení DNA zahrnuje a) poskytnutí reakční směsi obsahující dNTP značený fluoresceinovými barvivý a enzym podle vynálezu a b) provedení reakce zesílení nukleové kyseliny.
Enzymy podle vynálezu a geny, kódující tyto enzymy, jsou dalším oborem vynálezu, kterým jsou kity pro DNA sekvencování, které zahrnují rekombinantní enzym podle vynálezu a mohou přídavně zahrnovat fluorescetní terminátorovou sloučeninu s negativním nábojem. Jiné kity pro DNA sekvencování zahrnují a) fluorescetní terminátorovou sloučeninu s negativním nábojem a b) nativní enzym podle vynálezu.
Vynález se také týká kitů pro způsob přípravy značené DNA, který obsahuje rekombinantní enzym podle vynálezu. Jiné kity pro způsob přípravy značené DNA zahrnují a) fluorescetní nuk1eosidtrifosfátovou sloučeninu s negativním nábojem a b) nativní enzym podle vynálezu.
Vynález blíže objasňuje následující podrobný popis a připojený obrázek.
Přehled obrázků
Na obr. 1 je schéma Taq DNA polymerázového genu. Jsou uvedena restrikční místa, která mají vztah k příkladu 1 a popis způsobů přípravy přídavných mutantů a expresních vektorů.
Pro usnadnění pochopení vynálezu se uvádí význam jednotlivých používaných výrazů:
• · • · · • · · • ·
- í> -.
Výrazem gen se vždy míní DNA sekvence, která obsahuje řídicí a kódující sekvence, nutné pro reprodukovatelnou produkci bioaktivního polypeptidů nebo prekursoru. Polypeptid se může kodovat plnou délkou genové sekvence nebo jakýmkoliv podílem kódující sekvence, pokud se udrží enzymatická aktivita.
Výrazem nativní se vždy míní gen nebo genový produkt, který se izoluje z přírodně se vyskytujícího zdroje. Tento výraz se také týká rekombinantní formy nativního proteinu, produkovaného technikami molekulární biologie, které mají identickou aminokyselinovou sekvenci jako nativní forma.
Výrazem mutant se vždy míní gen, který byl změněn v sekvenci jeho nukleových kyselin, nebo znamená genový produkt, který byl žměněn v jeho sekvenci aminokyselin, čímž se získá genový produkt, který může mít změněné funkční vlastnosti ve srovnání s nativním nebo standardním genen nebo genovým produktem. Takové změny zahrnují místo mutace, vypuštění a začlenění .
Výrazem hostitelská buňka nebo buňky se vždy míní jednobuněčný prokaryotový a eukaryotový organismus, jako jsou bakterie, kvasinky a aktinomycety a jednotlivé buňky vyšších řádů rostlin nebo živočichů rostoucí v buněčné kultuře.
Výrazem expresní systém” se vždy míní DNA sekvence obsahující žádanou kódující sekvenci a řídící sekvence ve funkční vazbě, takže hostitelské buňky, transformované těmito sekvencemi, jsou schopny produkovat zakódované proteiny. Pro transformaci může být expresní systém na vektoru; avšak příslušná DNA může být také začleněna do hostitelského chromosomu.
Výrazem oligonukleotid se vždy míní molekula obsahující alespoň dva, s výhodou více než tři a zpravidla více než deset deoxyribonukleotidů nebo ribonukleotidů. Přesný rozměr oligo• » • · ·· · · · · · · • · · · · · · _ 1«Λ _··· · ····
.......
• · · · ·· ·· ·· nukleotidu závisí na četných faktorech, včetně konečné funkce nebo na účelu použití oligonukleotidů.
Oligonukleotidy se mohou připravovat jakýmkoliv vhodným způsobem včetně například klonování a restrikce vhodných sekvencí a přímého chemického způsobu například fosfotri esterovým způsobem (Narang a kol., Meth. Enzymol 68, str. 90 až 99, 1979), fosfodiesterovým způsobem (Brown a kol., Meth. Enzymol 68, str. 109 až 151, 1979), diethylfosforamiditovým způsobem (Beaucage a kol., Tetrahedron Lett. 22, str. 1859 až 1862, 1981), triesterovým způsobem (Matteucci a kol., J. Am. Chem. Soc. 103, str. 3185 až 3191, 1981), automatizovaných způsobů přípravy a způsobů přípravy na pevném nosiči (americký patentový spis číslo 4 458066).
Výrazem primer se vždy míní oiigonukleotid, at přírodního nebo syntetického původu, který je schopen působit jako bod iniciace syntézy při použití za podmínek, ve kterých se iniciuje extenze primerů. Primerem je s výhodou jednořetězcový o 1 igodeoxyribonukleotid. Vhodná délka primerů závisí na záměru použití příměru, zpravidla však je 15 až 35 nukleotidů. Krátké příměrové molekuly zpravidla vyžadují chladnější teploty k vytvoření dostatečně stálých hybridních komplexů s matricí. Primer nemusí reflektovat přesně sekvenci matrice, musí však být dostatečně komplementární pro hybridizaci s matricí, aby došlo k prodlužování příměru.
Primer může být popřípadě značen začleněním značení zjistitelného spektroskopickým, fotochemickým, biochemickým, imunochemickým nebo chemickým způsobem. Jakožto užitelné značení se příkladně uvádí 32P, fluorescentní barviva, elektronově husté reagencie, enzymy (jako běžně používané při testech ELISA), biotin nebo hapteny a proteiny, pro které jsou dostupné antisera nebo monoklonální protilátky.
• · • · · ·
- J-1 ·· · ·
Výrazem tepelně stálá polymeráza se vždy míní enzym, který je stálý proti působení tepla, je tepelně odolný a podržuje si dostatečnou účinnost ke způsobení následných příměrových extenzních reakcí a nedochází u něho k nevratné denaturaci (desaktivaci) při působení zvýšených teplot po dobu potřebnou k denaturaci dvouřetězcových nukleových kyselin. Podmínky zahřívání, nutné pro denaturaci nukleových kyselin, jsou v oboru dobře známy a jsou v literatuře příkladně doloženy (americký patentový spis číslo 4 683202 a 4 683195)). Tepelně stálá polymeráza podle vynálezu je vhodná pro použití při tepelných cyklizačních reakcích, jako je polymerázová řetězová reakce (PCR). Nevratnou denaturaci se míní trvalá a dokonalá ztráta enzymatické účinnosti. V případě tepelně stálé polymerázy se enzymatická účinnost týká katalýzy kombinace nukleotidů vhodným způsobem pro extenzi příměrových produktů, které jsou komplementární k matricovému řetězci nukleové kyseliny.
Výrazem konvenční nebo přírodní se vždy míní se zřetelem na báze nukleových kyselin, na nuk 1eosidtrifosfáty nebo nukleotidy produkty, které se přírodně vyskytují v popisovaných polynukleotidech (například pro DNA to jsou dATP, dGTP, dCTP a dTTP). Přídavně se dITP a 7-deaza-dGTP často používají místo dGTP a 7-deaza-dATP se používá místo dATP v syntezních reakcích DNA in vitro, jako je například sekvencování. Společně se mohou označovat jako dNTP.
Výrazem nekonvenční nebo modifikovaný se vždy míní se zřetelem na báze nukleových kyselin, na nukleosidy nebo nukleotidy modifikace, derivace nebo analogy konvenčních bází, nukleosidů nebo nukleotidů přírodně se vyskytujících, zvláště polynukleot idu . Deoxyribonukleotidová forma uracilu je nekonvenční nebo modifikovaná báze v DNA (dUMP), přičemž ribonukleotidová forma uracilu je konvenční báze RNA (UMP). Nekonvenční nukleotidy zahrnují, bez záměru na jakémkoliv omezení, sloučeniny používané jako terminátory pro sekvencování nukleových • · · · • · • · · · · · · • ··· · ···· · · · · · · · ···· ·· ·· ·· ·· ·· kyselin. Terminátorové sloučeniny zahrnují, bez záměru na jakémkoliv omezení, sloučeniny, které mají 2’,3’ dideoxystrukturu a jsou označovány jako dideoxynuk1eosidtrifosfáty. Dideoxynuk1eosidtrifosfáty ddATP, ddTTP, ddCTP a ddGTP se společně mohou označovat jako ddNTP. Jakožto jiné nekonvenční nukleotidy se příkladně uvádějí fosforothioát dNTP ([a-S]dNTP), 5’-aboran-dNTP, α-methy1fosfonát-dNTP a rubonuk1eosidtrifosfáty (rNTP). Nekonvenční báze mohou být značeny radioaktivními izotopy například 32P, 33P, 35S, fluorescentními činidly, chemiluminescenčními činidly, bioluminescenčními činidly, haptenovými činidly, jako je biotin nebo enzymovými činidly, jako jsou streptavidin nebo avidin. Jakožto fluorescentní činidla se příkladně uvádějí barviva, která mají negativní náboj, jako jsou fluoresceinová barviva, nebo barviva, která mají neutrální náboj, jako jsou rhodaminová barviva nebo barviva, která mají pozitivní náboj, jako jsou cianinová barviva. Jakožto barviva fluoresceinová se příkladně uvádějí FAM, HEX, TET, JOE, NAN a ZOE. Jakožto barviva rhodaminová se příkladně uvádějí texaská červeň, ROX, R11O, R6G a TAMRA. FAM, HEX, TET, JOE, NAN a ZOE, ROX, R11O, R6G, a TAMRA jsou obchodní produkty společnosti Perkin-Elmer (Foster City, CA) a texaská červeň je obchodním produktem společnosti Molecular Probes. Jakožto barviva cyaninová se příkladně uvádějí Cy2, Cy3, Cy5 a Cy7, přičemž jde o obchodní produkty společnosti Amersham (Amersham Plače, Little Chalfont, Buckinghamshire, Anglie).
Výrazem DNA syntetzní reakce se vždy míní způsoby produkce kopií DNA včetně, nikoliv však se záměrem na jakémkoliv omezení na PCR, zesílení přenosu řetězců, transkripcí zprostředkované zesílení, extenze příměru a reverzní transkripce.
K dalšímu usnadnění porozumnění vynálezu se v popise a v příkladech uvádějí specifické tepelně stálé DNA polymerázové enzymy a fluorescentní barviva, přičemž však vynález na ně omezen není.
Ιό Vynález poskytuje nové a zlepšené sloučeniny, kterými jsou tepelně stálé DNA poiymerázy. Enzymy podle vynálezu zahrnují rekombinantní poiymerázy, které jsou mnohem účinnější při začlenění f1uoresceinovými barvivý značených nuk 1eosidtri fosfátů ve srovnání s odpovídajícími standardními typy enzymů. Tepelně stálé DNA poiymerázy podle vynálezu jsou mnohem vhodnější a žádanější pro procesy, jako je sekvencování DNA a in vitro příprava značených produktů než poiymerázy, známé ze stavu techniky. Zlepšené DNA sekvenční způsoby podle vynálezu zahrnují použití těchto rekombinantních polymeráz, jakož také použití nativních enzymů, které mnohem účinněji začleňují fluorescentními barvivý značené nuk 1eosidtrifosfáty než enzymy charakterizované ve stavu techniky. DNA sekvence, kódující tyto enzymy, a vektory pro expresování proteinů vynález rovněž zahrnuje.
Tepelně stálé DNA poiymerázy podle vynálezu mají oblast kritičnosti v aminokyselinové sekvenci domény polymerázové aktivity enzymu. Kritická oblast v aminokyselinové sekvenci tepelně stálé DNA poiymerázy podle vynálezu je dále doložena za použití běžného jednopísměnového aminokyselinového kódu (Lehninger, Biochemistry, New York, New York, Worth Publishers lne., str. 67, 1970).
SEQ ID NO:7 LSXXLX(V/I)PXXE, kde X v poloze 4 znamená jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu (SEQ ID N0:7), přičemž Xaa v poloze 3, 6, 9 a 10 znamená jakoukoliv aminokyselinu, Xaa v poloze 4 znamená jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou zbytku glutamové kyseliny (Glu) a Xaa v poloze 7 znamená Val nebo Ile. Tato kritická oblast poskytuje tepelně stálé DNA polymerázové enzymy schopné účinně začleňovat nukleotidy značené fluoresceinovými barvivý.
• ·· · • * • · ·
·· ·· • · · • · · • · · ·
Příkladně derivovaný Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerázový gen, který již obsahuje mutaci glycinu a aspragové kyseliny v poloze 46 (G46D) a F667Y mutaci, mutaci G na A v první poloze kodonu pro glutamovou kyselinu na zbytku 681 sekvence plné délky Taq DNA polymerázové sekvence (odpovídající poloze 4 kritického mofivu) vede k enzymu majícímu kritický motiv. Tento enzym vykazuje 1) přibližně dva až deseti násobný vzrůst účinnosti začleňování nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý bez poškození enzymatické schopnosti zprostředkovávat PCR v přítomnosti konvenčních nukleotidů a 2) tří až 4,3 násobný vzrůst míry extenze. V Taq DNA polymeráze vede tato zvláštní mutace v aminokyselině k změně E (glutamová kyse1ina) na K (lysin).
Jakkoliv tato zvláštní aminokyselinová změna produkuje kritický motiv a výrazně mění schopnopst enzymu začleňovat nekonvenční nukleotidy, očekává se, že specifická změna E na K není tak kritická pro vynález, jako je nyní identifikovaná poloha uvnitř oblasti kritičnosti. Podle výhodného provedení poskytuje vynález rekombinantní tepelně stálé DNA polymerázové enzymy, které a) v nativní formě polymerázy obsahují aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)ΡΧΧΕ (SEQ ID NO:1), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu, b) X v poloze 4 sekvence je mutován ve srovnání s nativní sekvencí s výjimkou, že X v poloze 4 není mutován na E a c) tepelně stálá DNA polymeráza má snížení rozlišování proti začlenění fluoresceinovými barvivý značených nukleotidů ve srovnání s nativní formou tohoto enzymu. Podle ještě výhodnějšího provedení vynálezu je X v poloze 4 nahrazen aminokyselinou mající pozitivní náboj, jako je K, R nebo H nebo polární aminokyselinou, jako je Q nebo N. Podle nejvýhodnějšího provedení vynálezu je X v poloze 4 nahrazen K.
Podle jiného výhodného provedení vynálezu má enzym a) snížené rozlišování se zřetelem na fluoresceinovými barvivý značené nukleotidy a b) obsahuje aminokyselinovou sekvenci
LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE, kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu (SEQ ID NO:2). Ve trípí směnovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerXaaXaaLeuXaal1eProTyrGluGlu, kde
Xaa v poloze 3 znamená Gin nebo Gly, Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu a Xaa v poloze 6 Ser nebo Ala.
Podle ještě výhodnějšího provedení obsahuje enzym mající snížené rozlišování se zřetelem na fluoresceinovými barvivý značené nukleotidy aminokyselinovou sekvenci LSQXLAIPYEE, kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu (SEQ ID N0:3). Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerGlnXaaLeuAlal1eProTyrG1uG1u, kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu. Podle nejvýhodnějšího provedení X znamená K.
Podle jiného výhodného provedení obsahuje enzym mající snížené rozlišování se zřetelem na f luoresceinovými barvivý značené nukleotidy aminokyselinovou sekvenci LSVXLG(V/I)PVKE, kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu (SEQ ID NO:4). Ve tří— písmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerValXaaLeuGlyXaaProVa1LysGlu, kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu a XAA v poloze 7 znamená Val nebo Ile
Podle ještě výhodnějšího provedení obsahuje enzym mající snížené rozlišování se zřetelem na fluoresceinovými barvivý značené nukleotidy aminokyselinovou sekvenci LSVXLGVPVKE, kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu (SEQ ID NO:5). Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerValXaaLeuGlyValProValLysGlu, kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu. Podle nejvýhodnějšího provedení X znamená R.
Podle jiného výhodného provedení obsahuje enzym mající snížené rozlišování se zřetelem na fluoresceinovými barvivý značené nukleotidy aminokyselinovou sekvenci LSVXLGIPVKE, kde • · ··· · • ·
znamená X jakoukoliv aminokyselinu (SEQ ID NO:6). Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako
LeuSerValXaaLeuG1yI1eProVa1LysGlu, kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu. Podle nejvýhodnějšího provedení X znamená R.
Charakterizace popsané E681K nutace identifikuje oblast v DNA polymerázovém genu, která ovlivňuje schopnost polymerázy vzájemně působit s fluorescentními nukleotidy s negativním nábojem. Toto místo vzdálené ke šroubovici 0, je na konci šroubovice 0a a na začátku šroubovice Ob polymerázy (Kim a kol., Nátuře 376, str. 612, 1995). Na základě molekulárních modelovacích principů, v oboru dobře známých, se také očekává, že změny struktury 0a-Ob šroubovice, jiné než E na K v poloze 681 povedou ke změně schopnosti polymerázy rozlišovat proti začlenění fluoresceinovými barvivý značených nukleotidů. Proto mutace v polohách v kritickém motivu jiných než ve zbytcích X v poloze 4 spadá také do rozsahu vynálezu. Podle takového provedení se vynález týká rekombinantního tepelně stálého DNA po 1ymerázového enzymu, který a) má ve své mativní formě polymerázu obsahující aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID N0:l), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu, b) rekombinantní polymeráza obsahuje alespoň jednu mutaci v aminokyselinové sekvenci s tou výjimkou, že X v poloze 4 není mutován na E a c) enzym má snížené rozlišování proti začlenění f luoresceinovými barvivý značených nukleotidů ve srovnání s nativním enzymem.
Podobně tepelně stálé DNA polymerázy, které obsahují kritické motivy, které jsou podobné nikoliv však stejné jako kritický motiv, kterým je aminokyselinová sekvence LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:7), kde znamená X v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E, spadá do rozsahu vynálezu. Podle zvlášt výhodného provedení je kritickým motivem aminokyselinová sekvence LXXXXXXXXXE (SEQ ID N0:8), kde znamená X v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve tří pí směnovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGlu (SEQ ID NO:8), kde znamená Xaa v poloze 2, 3, 5, 6, 7, 8, 9 a 10 jakoukoliv aminokyselinu a kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu.
Podle jiného provedení je kritickým motivem aminokyselinová sekvence L(S/A)XX(L/I)XXXXXE (SEQ ID N0:9), kde znamená X v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaGlu (SEQ ID NO:9), kde znamená Xaa v poloze 3, 6, 7, 8, 9 a 10 jakoukoliv aminokyselinu a kde znamená Xaa v poloze 2 Ser nebo Ala, Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu a Xaa v poloze 5 Leu nebo Ile.
Podle jiného provedení je kritickým motivem aminokyselinová sekvence LSXXLXXXXXE (SEQ ID NO:10), kde znamená X v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípí směnovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaXaaXaaXaaGlu (SEQ ID NO:10), kde znamená Xaa v poloze 3, 6, 7, 8, 9 a 10 jakoukoliv aminokyselinu a kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu
Schopnost enzymů podle vynálezu účinně začleňovat fluoresceinovými barvivý značené nukleotidy se měří ddNTP zkouškami. Jednou takovou zkouškou je konkurenční zkouška extenze primeru prováděná za podmínek omezující matrice. Při této zkoušce přiměř DG48 (5’-GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGC (SEQ ID NO:11) vázaný na M13mpl8 matrici (Innis a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, str. 9436, 1988) se prodlužuje v přítomnosti [ot-33P]dCTP a nadbytku enzymu s různými hladinami fluorescenčně značeného ddNTP, Zowie-ddCTP. Jelikož začlenění ddCTP zbytku extenzní reakci ukončí, čím ochotněji DNA polymeráza začlení ddCTP do extendovaného primeru, tím méně se může začle• · ·· nit [a-33P]dCTP. Proto čím vzrůstá účinnost začlenění fluorescenčně značeného ddCTP, tím vzrůstá míra inhibice DNA syntézy. Reakce se provádějí tedy s různými úrovněmi neznačeného ddCTP. Koncentrace ddCTP a Zowie-ddCTP, potřebná pro 50% inhibici se vypočítá a porovnává k získání relativní míry schopnosti enzymu začleňovat fluorescenčně značený nukleotid. Podrobnosti zkoušky začlenění ddNTP objasňuje příklad 2.
Vynález se týká měření sníženého rozlišování proti začlenění fluoresceinovými barvivý značeného nukleotidu zkouškou začlenění fluorescenčního ddNTP, popsanou v příkladu 2. Podle výhodného provedení koncentrace fluoresceinovým barvivém Zowie ddCTP značeného ddNTP, potřebná pro 50% inhibici syntézy DNA, se snižuje alespoň trojnásobně pro mutantní enzym podle vynálezu se zřetelem na standardní typ enzymu. Podle ještě výhodnějšího provedení se koncentrace snižuje alespoň pět krát a podle nejvýhodnějšího provedení se snižuje alespoň deset krát. Podle jiného provedení se charakteristika sníženého rozlišení zkouší měřením začlenění f1uorescentního dNTP.
Podle jiného hlediska vynálezu se tepelně stálá DNA polymerázová genová sekvence a enzym odvozují z různých termofilních druhů. Podle jehoho provedení vynálezu jsou polymerázová genová sekvence a enzym odvozeny od genus Thermus. Podle jiného provedení vynálezu jsou polymerázová genová sekvence a enzym odvozeny od jiného zdroje než je genus Thermus. Je dostupná plně nukleová kyselina a aminokyselinová sekvence pro četné termostabilni DNA polymerázy. Všechny sekvence ze souboru zahrnujícího Taq. Thermus thermopilus(Tth), Thermus species Z05, Thermus species spsl7, Thermotoga maritima (Tma) a Thermosipho africanus (Taf) byly zveřejněny v mezinárodní přihlášce vynálezu číslo PCT/U.S.91/ 07035, která byla zveřejněna jako PCT přihláška vynálezu číslo WO 92/06200 16. dubna 1992. Sekvence DNA polymerázy z Thermus flavus, Bacillus caldotenax a Bacillus stearothermophilus jsou rovněž z literatury známy • · ·♦· · • ·
(Akhmetzjanov a Vakhiitov, Nucleic Acids Research 20 (21), str. 5839, 1992; Uemori a kol. J. Biochem 113, str. 401 až
410, 1993; a objednací číslo BSU23149.ng od NG:New GenBank database). Sekvence tepelně stálé DNA polymerázy z Thermus caldophilus je uložena v organizaci EMBL/GenBank pod objednacím číslem U62584. Sekvence tepelně stálé DNA polymerázy z Thermus dosažitelná pod objednacím číslem 42380 od orpřičemž se využívá skutečností známých z patentového spisu číslo U.S. 4 889818, přičemž je informace o sekvenci v tabulce I. Sekvence tepelně stálé DNA polymerázy z Thermatoga neapolitana je dosažitelná pod objednacím číslem R98144 od GeneSeq Patent Data Base (je popsána v mezinárodním patentovém spise PCT WO 97/094451).
filiformis je ganizace ATCC,
Tabulka I
Organismus Kritický motiv Poloha kritické aminokyseliny u
| Konsensus | L | S/a | - | - | L/i | - | - | - | - | - | E | |
| Thermus aquaticus | L | S | Q | E | L | A | I | P | Y | E | E | 681 |
| Thermus flavus | L | S | G | E | L | S | I | P | Y | E | E | 679 |
| Thermus thermophilus | L | S | Q | E | L | A | I | P | Y | E | E | 683 |
| Thermus specie Z05 | L | S | Q | E | L | A | I | P | Y | E | E | 683 |
| Thermus specie spsl 7 | L | S | Q | E | L | S | I | P | Y | E | E | 679 |
| Thermus caldophilus | L | S | Q | E | L | A | I | P | Y | E | E | 683 |
| Thermus filiformis | L | S | Q | E | L | S | I | P | Y | E | E | 679 |
| Thermotoga maritima | L | S | V | R | L | G | v | P | v | K | E | 744 |
| Thermotoga neapolitana | L | S | v | R | L | G | I | P | v | K | E | 744 |
| Thermosipho africanus | L | S | K | R | I | G | L | s | v | S | E | 743 |
| Bacillus caldotenax^ | L | A | Q | N | L | N | I | s | R | K | E | 725, 724 |
| Bacillus stearothermophilus^ L | A | Q | N | L | N | I | T | R | K | E | 724, 727, 8 | |
| 1. Proteinová | sekvence | objednací | číslo D12982, | |||||||||
| Uemori, Y. Ishino, | K. | Fuj ita | 1 | K. | Asada, | I | Kato Cloning |
• · · · • 9 ···· • ·
- 3(5 • ·· · ·· • · >
· · • · 9 · · • · · ·· ·· the DNA polymerase gene of Bacillus caldotenax and characterization of gene product (J. Biochem. 113, str. 401, 1993). Kritický zbytek v této sekvenci je 725. Téměř stejná proteinová sekvence je dostupná jako údajná Bacillus stearothermophilus DNA polymeráza pod objednacím číslem R45155 a WPI 93408323/51. Kritický zbytek v této sekvenci je 724.
2. Několik sekvenčních submisí pro Bacillus stearothermophi 1us DNA polymerázu je v organizaci GeneBank nebo ve SwissProt/PIR databázích. Jakkoliv jsou tyto sekvence vysoce příbuzné, navzájem se poněkud liší, přičemž každá obsahuje identický motiv L(S/A)XX(L/I)XXXXXE (SEQ ID N0:9), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípí směnovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaXaaG1u (SEQ ID N0:9), přičemž Xaa v poloze 3, 6, 7,8, 9a 10 znamená jakoukoliv aminokyselinu, Xaa v poloze 2 znaená Ser nebo Ala, Xaa v poloze 4 znamená jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu a XAA v poloze 5 znamená Leu nebo Ile.
Podle shora uvedené tabulky proteinová sekvence obsahující kritický zbytek v kritickém motivu v poloze 724, jak popisuje japonská zveřejněná přihláška vynálezu číslo J 05 3O4964A a evropský patentový spis číslo EP 699760, je dostupná pod objednacím číslem U33536. Jiná, vysoce příbuzná avšak poněkud odlišná proteinová sekvence, popsaná v literatuře (Gene 163, str. 65 až 68, 1995), obsahuje kritický zbytek v kritickém motivu v poloze 727. Jiná, vysoce příbuzná avšak poněkud odlišná proteinová sekvence, dostupná pod objednacím číslem U23149 pro Bst DNA polymerázu, obsahuje kritický zbytek v kritickém motivu v poloze 802.
Jelikož DNA polymerázy každého termofilního druhu jsou jedinečné, je aminokyselinová poloha oblasti kritičnosti odlišná pro každý enzym. Programy řazení aminokyseliny a sekven00 000·
00 0 0 0 0 00
000 0 0
00 ce nukleové kyseliny jsou snadno dostupné a při dané identifikované zvláštní oblasti pomáhá k identifikaci přesné oblasti sekvence podle vynálezu. Takové programy řazení sekvence jsou dostupné v organizaci Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wiskonsin. Za určení zvláštního, zde identifikovaného motivu tyto programy zahrnující GAP, BESTFIT a PILEUP pomáhají lokalizovat kritický motiv. Poloha oblasti kritičnosti je v tabulce I pro tepelně stálé DNA polymerázy příkladných termofilních druhů.
Bez zřetele na oblast kritického motivu LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID N0:7), kde znamená X v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E, v polymerázové doméně tepelně stálé DNA polymerázy, slouží přítomnost motivu k poskytnutí tepelně stálé DNA polymerázy mající schopnost účinně začlenit fluorescelnovými barvivý značených nukleotidů. Proto mutace konzervované glutámové kyseliny tepelně stálé DNA polymerázy Thermus flavus (Glu 679), Thermus thermophilus (Glu 683), Thermus species ZO5 (Glu 683), Thermus druh sps!7 (Glu (Glu 683), Thermus filiformis
679), Thermus caldophilus ^Glu 679) k produkci kritického motivu bude mít podpůrný vliv na schopnost polymerázy účinně začleňovat fluoresceinovými barvivý značené nukleotidy.
Kromě toho se zřetelem na vysoce zachovanou povahu nově identifikovaného kritického motivu se mohou idetifikovat nové tepelně stálé DNA polymerázy na základě jejich homologie například k Taq DNA polymeráze nebo sekvencí jiných DNA polymeráz podle tabulky I (například americký patentový spis číslo 5 618711 a 5 624833). Takové polymerázy, pokud je jejich peptidová sekvence alespoň ze 45 % a výhodněji z více než 80 % homologická s s minokyse1 i novou sekvencí Taq polymerázy, podle zde popsaných identifikačních metod, spadá do rozsahu vynálese vynález týká třídy enzymů, která zahrnuje také tepelně stálou DNA polymerázu a odpovídající zu. Proto napři klad gen a expresní vektory Thermus oshimai (R.A. Williams a kol., Int.
·· ··♦· • · · ♦ · · · • · · · · ·· • ··· · ··· · · • · · · · ·· ·· ··
J. Syst. Bacteriol. 46 (2), str. 403 až 408, 1996); Thermus silvanus a Thermus chliarophilus (S. Tenreiro a kol., Int. J. Syst. Bacteriol. 45 (4), str. 633 až 639, 1995); Thermus scotoductus (S. Tenreiro a kol., Res. Microbiol. 146(4), str. 315 až 324, 1995); Thermus ruber ATCC 35948 (L.G. Loginova, Int. J. Syst. Bacteriol 34, str. 498 až 499, 1986); a Thermus brockianus (M.J. Munster, J. Gen. Microbiol. 132, str. 1677, 1986)
1989, druhé vydání, mutagenesis). Tento se ho používat pro
Pracovníkům v oboru je zřejmé, že se shora charakterizované tepelně stálé DNA polymerázy se zvýšenou účinností k začleňování f1uoresceinem značených nukleotidů jsou nejsnáze konstruovány technikou rekombinace DNA, jako je na místo zaměřená mutageneze (například Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, kapitola 15.51 01igonucleotide-mediated způsob je nyní v oboru standardní a může vytvoření všech možných tříd změn páru bází v každém stanoveném místě genu. Tento způsob se provádí za použití syntetického o 1 igonuk1eotidového primeru komplementárního s jednořetězcovým fágem nebo mutagenizovaného plasmidu DNA kromě omezeného chybného párování, které představuje žádanou mutaci. Syntetický o 1igonuk1eotid se tedy používá jako primer k přímé syntéze řetězce komplementárního k fágu nebo k plasmidu a získaná dvouřetězcová DNA se transformuje na fág nebo plasmid nesoucí hostilelské bakterium. Získaná bakterie se může zkoušet například analýzou DNA sekvence nebo hybridizační sondou k identifikaci takových fágů nebo kolonií nesoucích žádanou mutovanou genovou sekvenci.
Následně k vynálezu PCR, primerem řízená mutageneze (popsaná v americkém patentovém spise číslo 4 683195) a overlap
PCR (Higuchi, PCR Technology, 1989, vyd. Erlich, Stoctom
Press, New York, NY, str. 61 až 70) se stala rutinní cestou zavádění jakékoliv mutace na kterékoliv poloze genu.
• · ··»· ·♦ • · · · · 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 9 o 1 9 9 9 9 9 99 9 999 9 9
9999 9 999
9999 99 99 99 ·· ··
Mutovaná DNA se může získat z plasmidu, z phasmidu, z fágu nebo zesílovací reakcí běžnými prostředky a může se vázat na expresní vektor pro následnou kultivaci a čištění vzniklého enzymu. četné klonovací a expresní vektory jsou vhodné pro provádění vynálezu, včetně savčích a bakteriálních systémů (například shora uvedená publikace Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989, druhé vydání). Pro jednoduchost je vynález objasněn na příkladu použití lambda odvozeného Pl promotoru (Shimatake a kol., Nátuře 292, str. 128, 1981). Použití tohoto promotoru je zvláště popsáno v americkém patentovém spise číslo 4 711845 a 5 079352).
Plasmid pCSl byl uložen s ATCC 28. srpna 1997 pod objednacím číslem 98521. Tento plasmid obsahuje gen kódující tepelně stálou DNA polymerázu, přičemž je tento gen mutován na kodonu v poloze 681 náhradou glutámové kyseliny lysinem v resultujícím peptidu a poskytuje prostředek pro zí skáni tepelně stálých DNA polymeráz, majících podpořenou účinnost začleňování fluoresceinovými barvivý značených nukleotidů. Příklad 1 objasňuje použití lemovacích restrikčních míst vhodných pro subklonování E681K mutace pro vytvoření jiných tepelně stálých DNA po 1ymerázových enzymů. Nebo jelikož je známa kompletní genová sekvence pro četné tepelně stálé DNA polymerázy, jsou jiné prostředky zavádění E681K mutace, jako je restrikční digesce a nahrazování fragmentu, snadno dostupné pracovníkům v oboru, kteří mají k dispozici ATCC depozity a příslušné informace o sekvencích.
Pokud je záměr produkovat mutant nebo nativní enzymy podle vynálezu nebo deriváty nebo homology takových enzymů, zahrnuje produkce enzymu zpravidla transformaci hostitelské buňky expresním vektorem a kultivaci transformované hostitelské buňky za podmínek, při kterých dochází k expresi. Prostředky pro transformaci a kultivaci tranformované hostitelské buňky jsou v oboru dobře známy a jsou podborbně v litratuře ·· ···· ·· ·· » · 4 · • · · · 4 • · « ·« ·· popsány (například shora uvedená publikace Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989, druhé vydání).
Tepelně stálé DNA poiymerázy podle vynálezu se obecně čistí k odstranění kmene DG116 E. coli (uloženého jako ATCC 53606 7. dubna 1987), za transformace expresním vektorem operativně vázaným na gen kódující standardní typ nebo modifikovanou tepelně stálou DNA polymerázu. Způsoby čištění tepelně stálé DNA poiymerázy jsou popsány příkladně v příkladu 1 a v litetratuře (například Lawyer a kol., PCR Methods and Applications 2, str. 275 až 287, 1993).
Tepelně stálé enzymy podle vynálezu se mohou používat k jakémukoliv účelu, kde je taková enzymatická účinnost potřebná nebo žádoucí. Příkladně se uvádí sekvencování DNA, DNA značení a značení příměrových extenzních produktů. Způsobem podle vynálezu se obzvláště zlepšuje DNA sekvencování Sangerovým dideoxynukleotidovým způsobem (Sanger a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. 74, str. 5463, 1977). Pokroky základního způsobu, který vyvinul Sanger a kol. vedly k novým vektorům (Yanisch-Perron a kol., Gene 33, str. 103 až 119, 1985) a k bázovým analogům (Mills a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. 76, str. 2232 až 2235, 1979 a Barr a kol., Biotechniques 4, str. 428 až 432, 1986). Obecně vyžaduje sekvencování DNA na matrici závislé prodlužování příměru v přítomnosti bázových analogů ukončujících řetězec za rozdělení parciálních fragmentů, které se následně oddělují podle velikosti. Bázické dideoxysekvencování zahrnuje i) kopulaci oligonukleotidového příměru popřípadě značeného na matrici, ii) extenzi primeru s DNA polymerázou ve čtyřech oddělených reakcích, přičemž každá reakční směs obsahuje směs neznačených dNTP a omezující množství jednořetězcového terminačního činidla, například ddNTP, popřípadě značeného a iii) oddělení čtyř řad reakčních produktů na vysoce oddělujícím denaturačním gelu polyakrylamid/močovina. Reakční pro·· ···* _··· · ···· ··*· · 9 9 « · · 9 9 9
9999 ·· ·· ·· ·* ·· dukty se mohou zjištovat v gelu autoradiografií nebo fluorescenční detekcí v závislsti na použitém značícím činidle a může se zkoušet obraz k odvození nukleotidové sekvence. Tyto způsoby využívají DNA polymerázy, například Klenowa fragmentu E.coli Pol I nebo modifikované T7 DNA polymerázy.
Dostupnost tepelně odolných polymeráz, například Taq DNA polymerázy vede ke zlepšeným způsobům sekvencování s tepelně stálou DNA polymerázou (Innis a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, str. 9436, 1988) a k jejich modifikacím, označovaným jako cyklické sekvencování) (Murray, Nuc. Acids Res. 17, str. 8889, 1989). Jako alternativa k basickému dideoxysekvencování je cyklické sekvencování lineární asymetrické zesílení štítových sekvencí komp1ementrárních k sekvenci matrice v přítomnosti terminátoru řetězce. Jeden cyklus produkuje rodinu extenzních produktů všech možných délek. Po denaturaci extenzního reakčního produktu z DNA matrice probíhají četné cykly kopulace primeru a extenze příměru v přítomnosti terminátorů, jako jsou například ddNTP. Cyklické sekvencování vyžaduje méně matricové DNA než konvenční řetězec ukončující sekvencování. Tepelně stálé DNA polymerázy mají při cyklickém sekvencování některé přednosti: snášejí ostré kopulační teploty, kterých je zapotřebí pro specifickou hybridaci primeru na štíty nukleové kyseliny, jakož také četné cykly vysokoteplotní denaturace, ke které dochází v každém cyklu, to je 90 až 95 °C. Z tohoto důvodu AmpliTaqR DNA polymeráza a její deriváty a produkty odbourání se začleňují do kitů pro Taq cyklické sekvencování, které jsou obchodním produktem společnosti Perkin-Elmer, Norwalk, CT.
Existují dvě obměny způsobu řetězového terminačního sekvencování, sekvencování s barevným primerem a sekvencování s barevným terminátorem. Při sekvencování s barevným primerem jsou ddNTP terminátory neznačené a značeného primeru se používá k detekci extenzních produktů (Smith a kol., Nátuře «· ·*··
32, str. 674 až 679, 1986). Při sekvencování s barevným terminátorem se používá DNA polymerázy k začlenění dNTP a fluorescenčně značených ddNTP na konec DNA primerů (Lee a kol., Nuc. Acids. Res. 20, str. 2471, 1992). Tento způsob má výhodu, kterou nemá způsob přípravy s barevně značenými primery. Kromě toho jsou reakce s barevným terminátorem mnohem běžnější, jelikož se všechny čtyři reakce mohou provádět ve stejné nádobě.
Jak způsoby s barevným primerem tak s barevným terminátorem se mohou automatizovat za použití automatizovaného sekvenčního zařízení společnosti Applied Biosystems, Foster City, CA (americký patentový spis číslo 5 171534). Při použití zařízení se hotová sekvenční reakční směs frakcionuje na denaturačním polyakrylamidovém gelu, namontovaném v zařízení. Laser na dně zařízení zjištuje fluorescenční produkty po elektroforéze podle velikosti gelem.
Dvou typů fluorescentních barviv se obvykle používá ke značení terminátorů, které se používají pro sekvencování s barevným terminátorem - barviv s negativním nábojem a fluorescentních barviv s obojetným nábojem. Fluorescentní barviva s negativním nábojem zahrnují fluoresceinová barviva a barviva BODIPY. Barviva BODIPY (4,4-dif1uor-4-bor-3a,4a-diaza-s-indacen) jsou popsána ve zveřejněné mezinárodní přihlášce vynálezu číslo WO 97/00967. Fluorescentní barviva s obojetným iontem zahrnují rhodaminová barviva. Obchodně dostupné kity pro cyklické sekvencování používají terminátorů značených deriváty rhodaminu. Avšak rhodaminem značené terminátory jsou spíše drahé a produkt musí být oddělován od nezačleněných barevných ddNTP před vnesením na gel, jelikož současně migrují se produkty sekvencování. Zdá se, že terminátory s rhodaminovými barvivý stabilizují vlásenkovou strukturu v GC-bohatých oblastech, což způsobuje anomální migraci produktů. To vyžaduje použití dNTP, které uvolňují sekundární strukturu avšak také ovlivňují účinnost začlenění terminátoru.
• 4 ····
- Ύ ·· ·* ·» ·· φ · · · · · · · φ · · Φ · * ·· _ t · · · ··· · ···· · • · · · · · ···· ·· ·· ·· ·· *r
Na rozdíl od toho f1uoresceinem značené terminátory eliminují oddělovací stupeň před vnášením na gel, protože mají větší čistý náboj a migrují rychleji než produkty sekvence. Kromě toho fluoresceinem značené produkty sekvence vykazují lepší elektroforetickou migraci než sekvenční produkty značené rhodaminem. Jakkoliv standardní typ Taq DNA polymerázy nezačleňuje účinně terminátory značené fluoresceinovými barvivý, je možno účinného začlenění nyní dosáhnout použitím modifikovaných enzymů podle vynálezu.
Vynález zahrnuje nové způsoby pro dideoxysekvencování za použití enzymů, které mají kritický motiv, jakož také kity pro provádění tohoto způsobu. Podle jednoho provedení sekvenčního způsobu podle vynálezu se
a) připravuje rekombinantní tepelně stálý DNA polymerázový enzym, který je charakterizován tím, že
i) ve své nativní formě polymeráza obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:1), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu, ii) X v poloze 4 této sekvence je mutován ve srovnání s na tivní sekvencí, přičemž však neznamená E, iii) tepelně stálá DNA polymeráza má snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý ve srovnání s nativní formou tohoto enzymu a
b) provádí se sekvenční reakce s berevným terminátorem.
Podle výhodného provedení tohoto způsobu má nativní forma enzymu aminokyselinovou sekvenci LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE (SEQ ID N0:2), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu. Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerXaaXaaLeuXaal1eProTyrGluG1u (SEQ ID NO:2), kde znamená Xaa v poloze 3 Gin nebo Gly, Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu a Xaa v poloze 6 Ser nebo Ala. Podle ještě výhodnějšího provedení je nativní forma aminokyselinové sekvence LSQXLAIPYEE (SEQ ID NO:3), kde znamená X jakoukoliv aminokyse• · • · · · linu. V třípí směnovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerGlnXaaLeuAlalleProTyrGluGlu (SEQ ID N0:3), přičemž znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu. Podle nejvýhodnějšího provedení znamená Xaa v poloze 4 Lys.
Jak shora uvedeno, DNA sekvencování s tepelně stálými DNA polymerázami vyžaduje směs nekonvenčních bázových analogů, které působí jako terminátory řetězce a konvenčních nukleotidů ve specifických koncentračních poměrech, které zajištují, že se získá populace extenzních produktů všech možných délek fragmentů v oboru několika stovek bází. Některé tepelně stálé DNA polymerázy dříve používané pro sekvencování, například standardní Taq polymeráza, se charakterizují tím, že přednostně začleňují konvenční nukleotidy v přítomnosti směsi konvenčních a nekonvenčních nukleotidů. Avšak nověji bylo popsáno, že tepelně stálé DNA polymerázy umožňují snížit poměr nekonvenčních bázových analogů ke konvenčním bázím stokrát až několik setkrát až více než tisíckrát.
Jednou takovou polymerázou je F667Y mutant Taq DNA polymerázy. Jiným takovým mutantem je Taq DNA polymeráza mající F667Y mutaci a mutaci v poloze 46, která mění glycinový zbytek na zbytek kyseliny asparagové (G46D) mutace. Tato mutantová polymeráza, známá jako AmpliTaq, FS, je výrobkem společnosti Hoffmann-La Roche a je obchodním produktem společenosti Perkin-Elmer. Jinou takovou polymerázou je DNA polymeráza F73OYTma30. Tato mutantní polymeráza je kombinací 1) nukleotidů 1-570 Taq DNA polymerázy, modifikované ke kódování G46D mutace a 2) nukleotidů 571-2679 Tma DNA polymerázy modifikované ke kódování asparagové kyseliny na alaninovou mutaci v poloze 323, glutamové kyseliny na alaninovou mutaci v poloze 325 a fenylalaninu na tyrosinovou mutaci v poloze 730 (americký patentový spis číslo přihlášky vynálezu 60/052065 a evrospká přihláška vynálezu číslo 98112327.6). Jinou polymerázou, která začleňuje nekonvenční bázové analogy je F73OY mutantní DNA po• · ·«·· ·· ··
lymeráza z Thermotoga neapolitana (mezinárodní přihláška vynálezu číslo WO 96/10640, WO 96/41014 a WO 97/09451). Za použití těchto enzymů pro danou koncentraci dNTP se může snížit koncentrace rhodamiη-ddNTP přibližně 50 krát až několik set krát ve srování s tepelně stálými DNA polymerázami dosud dosažitelnými .
Mutace E681K podle vynálezu se kombinuje za použití rekombinantní ch DNA způsobů s F667Y mutací za produkce dvojného mutantu Taq DNA po 1ymerázového enzymu, používaného pro sekvenční reakce popsané v příkladu 4. Dvojného mutantu se používá při sekvenční reakci s barevným teminátorem za použití fluoresceinovým barvivém značených terminátorů. Výsledky, popsané v příkladu 4, dokládají, že enzym je schopen začleňovat fluoresceinovým barvivém značené terminátory do sekvenční reakce a produkovat sekvenční žebříky, které se mohou přesně číst v automatickém sekvenčním zařízení. Neočekávate1 ně se zjistilo, že kombinace E681K a F667Y mutací produkuje tepelně stálý DNA polymerázový enzym se 3 až 4 násobnou extenzí se zřetelem na enzym se samotnou mutací F667Y podle měření, popsaného v příkladu 3 .
Kritický motiv, identifikovaný podle vynálezu, se může kombinovat s motivy přispívajícími ke snížení rozlišování proti ddNTP k produkci polymeráz, majících zvýšenou účinnost začleňování jak značených tak neznačených ddNTP. Tyto poiymerázy jsou užitečné při DNA sekvenčních způsobech. Podle jednoho provedení vynálezu tepelně stálá polymeráza, mající kritický motiv definovaný podle vynálezu, obsahuje také kritický motiv, který zahrnuje F667Y mutaci, popsnou v americkém patentovém spise číslo přihlášky 08/448223. Podle tohoto provedení tepelně stálá DNA polymeráza je charakterizována tím, že
i) ve své nativní formě polymeráza obsahuje první aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:1), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu, • · • · · · • · • · ii) X v poloze 4 této sekvence je mutován ve srovnání s nativní sekvencí, přičemž však X není mutován na E, iii) tepelně stálá DNA polymeráza má snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý ve srovnání s nativní formou tohoto enzymu, iv) polymeráza obsahuje druhou aminokyselinovou sekvenci MRRXXKXXNYXXXYG (SEQ ID NO:12), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu,
v) tepelně stálá DNA polymeráza má také snížené rozlišování proti začleňování nekonvenčních nukleotidů ve srovnání s nativní formou enzymu. Ve tří pí směnovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako
MetArgArgXaaXaaLysXaaXaaAsnTyrXaaXaaXaaTyrGly (SEQ ID NO: 12), kde znamená Xaa v poloze 4, 5, 7, 8, 11, 12 a 13 jakoukoliv aminokyselinu. Podle výhodného provedení Xaa v poloze 4 v první aminokyselinové sekvenci je mutován na Lys. Podle ještě výhodnějšího provedení je enzym Taq DNA polymeráza a obsahuje E681K a F667Y mutace.
Vynález se také týká způsobu sekvencování za použití této polymerázy.
Vynález také zahrnuje zlepšený způsob sekvencování prováděný za použití tepelně stálého DNA po 1ymerázového enzymu, majícího kritický motiv, který není odvozen mutací nýbrž existuje jako přírodní varianta. Z tohoto hlediska DNA polymeráza termofilních bakterií má kritický motiv, ve kterém zbytek v poloze 4 není Glu. Například v tepelně stálé DNA polymeráze od Thermotoga neapolitana je X v poloze 4 v motivu LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:7), kde znamená X v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E, argininový zbytek. Proto se vynález také týká zlepšeného způsobu sekvencování DNA za použití nativní tepelně stálé DNA polymerázy, která obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:7), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípísměnovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako • · · · • · * r·« · ··
LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu (SEQ ID NO:7), kde znamená Xaa v poloze 3, 6, 9 a 10 jakoukoliv aminokyselinu a Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu a Xaa v poloze 7 Val nebo Ile. Vynález se také týká způsobu sekvencování, při kterém se
a) vytváří tepelně stálá DNA polymeráza charakterizovaná tím, že
i) ve své nativní formě polymeráza obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID N0:7), kde X v poloze 4 znamená jakoukoliv aminokyselinu kromě E, ii) tepelně stálá DNA polymeráza má snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý ve srovnání s nativní formou tohoto enzymu,
b) vytváří se barevný terminátor značený f1uoresceinovým barvivém a
c) provádí se sekvenční reakce s barevným terminátorem.
Podle výhodnějšího provedení vynálezu se provádí sekvencování, při kterém se
a) vytváří tepelně stálá DNA polymeráza charakterizovaná tím, že
i) polymeráza obsahuje první aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:7), kde X v poloze 4 znamená jakoukoliv aminokyselinu kromě E, ii) tepelně stálá DNA polymeráza má snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý ve srovnání s nativní formou tohoto enzymu a iii) tato DNA polymeráza obsahuje druhou aminokyselinovou sekvenci MRRXXKXXNYXXXYG (SEQ ID NO:12), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu.
iv) tato tepelně stálá DNA polymeráza má snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý ve srovnání s nativní formou tohoto enzymu a
b) vytváří se barevný terminátor značený fluoresceinovým bar• · • · · · • · • · ·« · · vivem a
c) provádí se sekvenční reakce s barevným terminátorem.
Podle jiného výhodného provedení obsahuje enzym aminokyselinovou sekvenci LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE (SEQ ID NO:13), kde znamená X v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve trípí směnovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerXaaXaaLeuXaal1eProTyrGluGlu (SEQ ID NO:13), kde znamená Xaa v poloze 3 Gin nebo Gly, Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu a Xaa v poloze 6 Ser nebo Ala. Podle výhodnějšího provedení
LSQXLAIPYEE (SEQ ID NO:14), kde liv aminokyselinu s výjimkou E.
aminokyselinová sekvence přepsána jako
LeuSerGlnXaaLeuAlalleProTyrGluGlu (SEQ ID NO:14), kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu.
je aminokyselinovou sekvencí znamená X v poloze 4 jakoukoVe třípísměnovém kódu je tato
Podle ještě jiného dále výhodného provedení obsahuje enzym aminokyselinovou sekvenci LSVXLG(V/I)PVKE (SEQ ID NO:15), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípísmenovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu (SEQ ID NO:15), kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu a Xaa v poloze 7 Val nebo Ile. Podle výhodnějšího provedení je aminokyselinovou sekvencí LSVXLGVPVKE (SEQ ID NO:16), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípí směnovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako
LeuSerValXaaLeuGlyValProValLysGlu (SEQ ID NO:16), kde znamená XAA v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu. Podle nejvýhodnějšího provedení je Xaa v poloze 4 arg. Podle ještě dalšího výhodného provedení je aminokyselinovou sekvencí LSVXLGIPVKE (SEQ ID NO:17), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípí směnovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerValXaaLeuGlyIleProValLysGlu (SEQ ID NO:17), kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu. Především znamená Xaa v poloze 4 Arg.
ňování hladina nukleotidů značených se měří za použití
Podle jiného provedení se sekvencování provádí za použití nativního enzymu, který má snížené rozlišování proti začlefluoresceinovými barvivý, jehož zkoušek začlenění ddNTP, jak je popsáno v příkladu 2. Koncentrace ddCTP, potřebná pro 50% inhibici DNA syntézy se zjistí jako koncentrace Zowie-ddCTP potřebná pro 50% inhibici. Poměr koncentrace pro Zowie-ddCTP ke koncentraci pro ddCTP se vypočte. Podle výhodného provedení je poměr menší než 10. Podle ještě výhodněj š í ho provedení j e poměr 4 nebo menší. Podle nejvýhodnějŠího provedení je poměr 1,2 nebo menší.
Jakkoliv se podle příkladů používá dideoxynuk1eotidů značených fluoresceinovými barvivý, spadá použití jiných nekonvenčních nukleotidů a fluorescentních barviv do rozsahu vynálezu. Jakožto jiné nekonvenční nukleotidy se příkladně uvádějí fluorescenčně značené dNTP, kterých se může použít pro značení produktů DNA syntézy, a fluorescenčně značené rNTP, kterých se může použít pro značení příměrových extenzních produktů. Jakožto jiná barviva se příkladně uvádějí jiná fluorescenční barviva s negativním nábojem, například barviva BODIPY, která jsou strukturně a chemicky podobná fluoresceinu. Taková jiná barviva zahrnují rovněž cyaninová barviva. Cyaninem značená dNTP se přidávají do standardní PCR reakční směsi, která obsahuje Taq DNA polymerázu s E681K mutací (aG46D mutací). Neočekávatelně se zjistilo, že cyaninem značené dNTP se začleňují do zesílených produktů ve vyšší míře než standardní typ enzymu. Z tohoto hlediska způsob značení DNA podle vynálezu využívá nativní nebo mutované polymerázy podle vynálezu v kombinaci s nukleotidem značeným bud fluorescentním barvivém s negativním nábojem nebo cyaninovým barvivém. Podle jednoho provedení vynález zahrnuje způsob značení DNA, při kterém se
a) vytváří tepelně stálá DNA polymeráza charakterizovaná tím, že
i) polymeráza obsahuje aminokyselinovou sekvenci • · • ·
LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:7), kde X v poloze 4 znamená jakoukoliv aminokyselinu kromě E, ii) tepelně stálá DNA polymeráza má snížené rozlišování proti začlenění nekonvenčních nukleotidů a
b) vytváří se nukleotid značený fluoresceinovým barvivém s negativním nábojem a
c) provádí se DNA syntézní reakce.
Podle jiného provedení vynález zahrnuje způsob značení DNA, při kterém se
a) vytváří tepelně stálá DNA polymeráza charakterizovaná tím, že
i) polymeráza obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:7), kde X v poloze 4 znamená jakoukoliv aminokyselinu kromě E, ii) tepelně stálá DNA polymeráza má snížené rozlišování proti začlenění nekonvenčních nukleotidů a
b) vytváří se nukleotid značený cyaninovým barvivém a
c) provádí se DNA syntézní reakce.
Podle jiného provedení vynálezu se vytváří tepelně stálá DNA polymeráza, která kombinuje mutaci umožňující účelnější začleňování rNTP, například glutamové kyseliny, do glycinové mutace v poloze 615 Taq DNA polymerázy a kritický motiv podle vynálezu. Očekává se, že výsledný enzym bude mít zvýšenou účinnost začleňování ribonuk1eotidů značených fluoresceinovými barvivý. Vynález se proto týká rekombinantní tepelně stálé DNA polymerázovy, která 1) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:1), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu a 2) X v poloze 4 je mutován tak, že X v poloze 4 neznamená E a 3) obsahuje také oblast kritičnosti, kterou je aminokyselinová sekvence SQIXLR(V/I) (SEQ ID NO:18), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E, a 4) je schopná začleňovat ribonukleotidy značené f1uoresceinovými barvivý. Ve trípí směnovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako SerG1 η11eXaaLeuArgXaa (SEQ ID NO:18), • · · · ·· • · · · · • · · · · • · · · ··· • · · · ·· ·· ·· • · • · « • · · • · · · « • · <
• · · · kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu a Xaa v poloze 7 Val nebo Ile.
Oblasti mutantní polymerázy například pro Taq obsahující E614G a E681K jsou užitečné ve zlepšených způsobech produkce primerních extenzních produktů značených fluoresceinovými barviy. Například ve primerní extenzní reakci jako PCR, rNTP značený f1uoresceinovými barvivý nahrazuje alespoň částečně jeden ze čtyř standardních dNTP a je zahrnuta dvojná mutantní polymeráza jako E681K E615G Taq DNA polymeráza. Mutantní polymeráza syntetizuje primerní extenzní produkty, které mají fluoresceinen značené ribonukleotidové zbytky v různých polohách svých délek. Po zahřátí nebo po alkalickém zpracování se primerní extenzní produkty fragmentují na každém ribonuk1eoti dovém zbytku za produkce populace koncově značených fragmentů. Tato polulace rovnoměrně značených fragmentů představuje rozdělené fluorescentní značení po celé délce primerního extanzního produktu. Značené fragmenty s touto charakteristikou jsou užitečné v detekci formátů nukleové kyseliny na základě silikonových čipů (Cronin a kol., Human Mutation 7, str. 244, 1996). Vynález se tedy také týká způsobu značení primerních extenzních produktů, při kterém se
1) připravuje tepelně stálá DNA polymeráza, která je charakterizována tím, že
a) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci
LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:1), kde znamená X jakoukoliv aminokyse1 inu,
b) X v poloze 4 této sekvence je mutován, přičemž však neznamená E,
c) obsahuje také oblast kritičnosti s aminokyselinovou sekvencí SQIXLR(V/I) (SEQ ID NO:18), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E,
d) je chopná účinně začleňovat ribonukleotidy značené fluoresceinovými nebo cyaninovými barvivý a
2) provádí se primerní extenzní reakce.
• · · · ·· • · · · » · · 4
Β · ·· • · · · « • · ·· ··
Enzymy, mající kritický motiv podle vynálezu, mají zvýšenou míru extenze se zřetelem na standardní typ enzymu, jak je doloženo v příkladu 4 pro mutant E681K F667Y. Podle jednoho provedení je enzym charakterizován tím, že 1) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:1), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu, 2) aminokyselinová sekvence je mutována v poloze 4 tak, že X v poloze 4 není mutován na E a 3) má zvýšenou míru extenze ve srovnání s enzymem standardního typu.Podle výhodného provedení je enzym charakterizován tím, že 1) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:1), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu, 2) aminokyselinová sekvence je mutována v poloze 4 tak, že X v poloze 4 není mutován na E,
3) obsahuje také aminokyselinovou sekvenci MRRXXKXXNYXXXYG (SEQ ID NO:12), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu, a 4) má zvýšenou míru extenze ve srovnání s enzymem standardního typu. Podle výhodnějšího provedení je enzym charakterizován tím, že 1) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:1), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu, 2) aminokyselinová sekvence je mutována v poloze 4 tak, že X v poloze 4 je mutován na K.Podle nejvýhodnějši ho provedení je enzym charakterizován tím, že enzymem je Taq DNA polymeráze a obsahuje E681K mutaci a F667Y mutaci. Vynález zároveň zahrnuje způsoby sekvencování a značení DNA za použití polymeráz se zvýšenou mírou extenze a kity pro provádění takových způsobů.
Při výhodném provedení sekvencování podle vynálezu se tepelně stálá pyrofosfatáza začleňuje do reakční směsi. Zjistilo se, že pyrofosfatáza podporuje sekvencování za použití jak mesofilní tak mutantní tepelně stálé DNA polymerázy (evropská zveřejněná přihláška vynálezu číslo EP-A-763599 a americký patentový spis číslo 5 665551).
Podle příkladného provedení tepelně stálá DNA polymeráza • 8
podle vynálezu obsahuje také mutaci v 5’-nuk 1eázové oblasti, která značně přispívá ztenčení nukleázové aktivity. Modifikovaná Taq polymeráza je popsaná v literatuře (PCT přihláška vynálezu číslo WO 92/06200, zveřejněná 16. dubna 1992 a americký patentový spis číslo 5 466591). Podle jednoho provedení vynálezu kodon pro glycinový zbytek v aminokyselinové poloze 46 se nahrazuje kodonem pro kyselinu asparagovou (G46D mutace). Získaný enzym má zvýšenou užitečnost v cyklických sekvenčních reakcích v důsledku snížené 5’-nuk 1eázové aktivity. Jak polymerázová oblast aminokyselinové sekvence tak polymerázová aktivita jsou nezměněny v případě G46D mutantu ve srovnání se standardním enzymem.
Obchodním provedením vynálezu jsou zlepšené kity pro provádění způsobu podle vynálezu a které vynález zahrnuje. Kit pro DNA sekvencování obsahuje
a) tepelně stálou DNA polymerázu charakterizovanou tím, že
i) polymeráza obsahuje aminokyselinovou sekvenci
LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:7), kde X v poloze 4 znamená jakoukoliv aminokyselinu kromě E, ii) tepelně stálá DNA polymeráza má snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý a
b) barevný teriminátor značený fluorescentním barvivém s negativním nábojem a obsahuje popřípadě přídavně jiné reagencie pro DNA sekvencování, například dNTP, tepelně stálou pyrofosfatázu a vhodné pufry.
Podle jiného provedení má enzym v kitu aminokyselinovou sekvenci LSVXLG(V/I)PVKE (SEQ ID NO:15), kde znamená X jakoukoiv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípí směnovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako
LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu (SEQ ID NO:15), kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu a Xaa v poloze 7 Val nebo Ile. Podle výhodného provedení je aminoky- 38 selinová sekvence LSVXLGVPVKE (SEQ ID NO:16), kde znamená X jakoukoiv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípí směnovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako
LeuSerValXaaLeuGlyValProValLysGlu (SEQ ID NO:16), kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E. Podle ještě výhodnějšího provedení znamená Xaa v poloze 4 Arg. Podle jiného výhodného provedení je aminokyselinová sekvence LSVXLGIPVKE (SEQ ID NO:17), kde znamená X jakoukoiv aminokyselinu s výjimkou E. Ve třípí směnovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerValXaaLeuGlyl1eProValLysGlu (SEQ ID NO:17), kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu. Podle ještě výhodnějšího provedení znamená Xaa v poloze 4 Arg.
Jiné kity pro DNA sekvencování obsahují mutantní tepelně stálou DNA polymerázu charakterizovanou tím, že
a) ve své nativní formě tato polymeráza obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:1), kde X znamená jakoukoliv aminokyselinu,
b) tato aminokyselinová sekvence je mutována v poloze 4, přičemž však X v poloze 4 neznamená E,
c) tepelně stálá DNA polymeráza má snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý ve srovnání s nativní formou enzymu a obsahuje popřípadě činidla pro sekvencování DNA, jako jsou sloučeniny ukončující řetězec, dNTP, tepelně stálá pyrofosfatáza a vhodné puf ry.
V případě, kdy jsou terminátory značeny, jsou vhodným značením fluorescentní barviva, ještě výhodnějším značením jsou fluorescentní barviva s negativním nábojem nebo cyaninová barviva a nejvýhodnějším značním jsou fluoresceinová barviva. Podle výhodného provedení má enzym v kitu minokyse1inovou sekvenci LS(Q/G)XL(S/A)IPYEE (SEQ ID NO:2), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu. Ve třípí směnovém kódu je tato aminokyse• · • · ···· linová sekvence přepsána jako LeuSerXaaXaaLeuXaalleProTyrGluGlu (SEQ ID N0:2), kde znamená Xaa v poloze 3 Gin nebo Gly, Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu a Xaa v poloze 6 Ser nebo Ala. Podle výhodnějšího provedení má enzym v kitu minokyselinovou sekvenci LSQXLAIPYEE (SEQ ID NO:3), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu. Ve tří pí směnovém kódu je tato aminokyselinová sekvence přepsána jako LeuSerGlnXaaLeuAlalleProTyrGluGlu (SEQ ID NO:3), kde znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu. Nejvýhodněji znamená Xaa v poloze 4 Lys.
Kity pro značení DNA obsahují tepelně stálou DNA polymerázu charakterizovanou tím, že
a) ve své nativní formě polymeráza obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:1), kde X znamená jakoukoliv aminokyselinu,
b) X v poloze 4 je mutován ve srovnání s nativní formou, není však mutován na E,
c) enzym má snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý ve srovnání s odpovídajícím standardním enzymem a popřípadě obsahuje přídavně dNTP a vhodné pufry.
Podle výhodného provedení je X v poloze 4 mutován na K.
Jiné kity pro produkci značené DNA obsahují
a) nukleotid nebo nukleotidový analog značený fluorescentní sloučeninou s negativním nábojem,
b) nativní tepelně stálé DNA poiymerázy mající kritický motiv LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:7), kde X v poloze 4 znamená jakoukoliv aminokyselinu kromě E,
c) polymeráza má snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý a popřípadě obsahuje přídavně dNTP a vhodné pufry.
Podle výhodného provedení je X v poloze 4 mutován na K.
• · · · • · · · ··
Podle jiného výhodného provedení je X v poloze 4 mutován na R.
Kit pro značení primerních extenzních produktů obsahuje obsahuje tepelně stélou DNA polymerázu charakterizovanou tím, že
a) ve své nativní formě polymeráza obsahuje aminokyselinovou sekvenci LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:1), kde X znamená jakoukoliv aminokyselinu,
b) X v poloze 4 je mutován ve srovnání s nativní formou, není však mutován na E,
c) tepelně stálá DNA polymeráza obsahuje druhou aminokyselinovou sekvenci SQIXLR(V/I) (SEQ ID NO:18), kde znamená X jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E,
d) enzym má snížené rozlišování proti začlenění ribonuk1eotidů značených f1uoresceinovými barvivý ve srovnání s odpovídajícím standardním enzymem a obsahuje popřípadě přídavně rinonukleotid nebo rinonuk1eotidový analog značený fluoresceinovou sloučeninou s negativním nábojem nebo cyaninovou sloučeninou, dNTP a vhodné pufry.
Podle výhodného provedení obsahuje polymeráza E681K mutaci a E615G mutaci. Jiné kity pro výrobu značených primerních extenzních produktů obsahují a) ribonuk1eotid nebo ribonukleotidový analog značený fluorescentní sloučeninou s negativním nábojem nebo cyaninovou sloučeninou a b) netivní tepelně stálou DNA polymerázu charakterizovanou tím, že
i) polymeráza obsahuje kritický motiv, kterým je aminokyselinová sekvence LSXXLX(V/I)PXXE (SEQ ID NO:7), kde X v poloze 4 znamená jakoukoliv aminokyselinu kromě E, ii) obsahuje druhou aminokyselinovou sekvenci SQIXLR(V/I) (SEQ ID NO:18), kde X znamená jakoukoliv aminokyselinu kromě E, iii) tepelně stálá DNA polymeráza má snížené rozlišování proti začlenění ribonukleotidů značených fluoresceinovými barvivý a popřípadě obsahuje přídavně dNTP a vhodné pufry.
fc · fcfc · fcfc · • fc fc· ·· • fcfcfc · · · · • ·· · · ··· • · fcfcfc · ···· ·
Podle výhodného provedení v první aminokyselinové sekvenci je X v poloze 4 mutován na K a ve druhé aminokyselinové sekvenci je X v poloze 4 mutován na G. Podle jiného výhodného provedení v první aminokyselinové sekvenci je X v poloze 4 mutován na R a ve druhé aminokyselinové sekvenci je X v poloze 4 mutován na G.
Vynález objasňují, nijak však neomezují následující příklady praktického provedení. Procenta a díly jsou míněny vždy hmotnostně, pokud není uvedeno jinak.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Exprese modifikovaného Taq polymerázového genu majícího snížené rozlišování proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý
C-Koncový aminokyselinový podíl Taq DNA polymerázy kóduje po 1ymerázovou aktivní oblast (Lawyer a kol., PCR Methods and Applications 2, str. 275 až 287, 1993; Freemont a kol., Proteins: Structure, Function and Genetics 1, str. 66 až 73, 1986). Fragment DNA, obsahující tuto oblast, se izoluje z plné délky Taq genu a mutuje se PCR zesílením v přítomnosti manganu (Leung a kol., Technique 1(1), str. 11 až 15, 1989). Například všechny restrikční enzymy jsou obchodními produkty společnosti New England Biolabs, Beverly MA. Mutagenizované fragmenty se digerují s Pstl a Bglll a klonují se do Taq expresního plasmidu, pLK102, který se má digerovat s Pstl a Bglll. Plasmid pLK102 je derivátem pLKlOl, ve kterém je 900 bp Pstl-Bglll fragment nahrazen krátkým Pstl-Bglll linkerem. Plasmid pLKlOl je modifikovaná forma pSYC1578 (Lawyer a kol., PCR Methods and Applications 2, str. 275 až 287, 1993 a americký patentový spis číslo 5 079352), ze kterého je malý fragment HincII/EcoRV
fragment v poloze 3’ k polymerázové kódující oblasti vypuštěn.
j i ci váný
Výsledné expresní plasmidy se transformují do E. coli kmenu N1624 (dostupný v organizaci E. coli Genetic Stock Center na univerzitě Yale University, kmen No. CGSC#5O66) a získané tranformanty se skrínují se zřetelem na schopnost účinněji začleňovat [a32P]Tet-dCTP ve srovnání se standardním enzymem. Za použití tohoto způsobu se identifikuje Mutant CS1, mazačleňovat [a32P]Tet-dCTP. Mutagenizoplasmid mutantu CS1 se digeruje fragment se subklonuje do náhrady mutagenizovaného shopnost účinněji Taq expresní s Hindi 11/Nhel a získaný restrikční standardního typu genu pLKlOl za
Hindlll/Nhel fragmentu ke stanovení, který podíl mutagenizované Taq polymerázy je zodpovědný za změněný fenotyp. Subkolny, obsahující Hindi 11/Nhel restrikční fragment, poskytují změněný fenotyp na standardní enzym, což naznačuje, že je mutace v tomto fragmentu. Následná analýza subklonu stanovuje, že mutace je lokalizována ve fragmentu 265 bp BamHl-Nhel .
DNA sekvenční analýza 265 Nhel-BamHl fragmentu se provádí na pCSl za použití TaqFS DyeDeoxy™ terminátorového cyklického sekvencovacího kitu společenosti Applied Biosystems, Foster City, CA a DNA sekvenčního systému Applied Biosystems Model Prism 377. Sekvenční analáza identifikuje nesmyslnou mutaci v Taq po 1ymerázovém genu na aminokyselině v poloze 681, která způsobuje náhradu zbytku glutamové kyseliny (E) zbytkem lysinu (K). číslování se začíná na kodonu kódujícím první methioninový zbytek zralého proteinu (americký patentový spis číslo 5 079352). Tato mutace, E681K, je speciálně způsobená náhradou GAG za AAG v kodonové sekvenci. Plasmid pCSl je uložen s ATCC 28. srpna 1997 pod objednacím číslem 98521.
Plasmid pCSl může obsahovat přídavné mutace v kódovací sekvenci pro Taq polymerázu; avšak dalšími subklonovacími pokusy se zjistilo, že E681K mutace je jediná zodpovědná za zvýšenou účinnost začleňování nuk 1eosidtrifosfátů, značených f1uoresceinovými barvivý. Tato bodová mutace je umístěna v 265 párů bází BamBl-Nhel DNA fragmentu, jak je ukázáno na obr. 1.
V 265 bp DNA fragmentu E681K mutace je pouze změněna se zřetelem na standardní typ Taq polymerázové genové sekvence.
·· ·· • · · · • · ··
Pro další analýzu a kvantifikaci účinnosti začleňování nukleotidových analogů se 265 bp Bamftl-Nhel fragment plasmidu pCSl klonuje do Taq extresního vektoru, který obsahuje standardní sekvenci v polymerázové pRDA3-2, označovaný zde jako klon doméně, pRDA3-2. Plasmid 3-2, je plně popsán v mezinárodním patentovém spise číslo WO 92/06200. Druhý klon, kódující jak E681K mutaci tak F667Y mutaci, se vytvořil na primer řízenou mutagenezí a následným klonováním PCR produktu obsahujícího obě mutace do BamRl-Nhel míst plasmidu pRDA3-2.
Expresní vektor pRDA3-2 obsahuje plnou délku Taq DNA polymerázového genu, funkčně napojeného na fág lambda Pl promotor. Ve vektoru pRDA3-2 5’-nuk 1eázová doména Taq DNA polymerázového genu obsahuje bod mutace na kodonu kódujícím glycin v poloze 46, což snižuje aktivitu 5’-nukleázy (G46D mutace). Avšak genová sekvence v polymerázové doméně expresního vektoru PRDA3-2 je identická jako standardního typu Taq DNA polymerázové genové sekvence. Plasmid, pRDA3-2, pCSl a E681K F667Y PCR produkt se digerují s Bairiňí a s Nhel a 265 bp DNA fragment z plasmidu pCSl nebo PCR produkt se ligatuje do vektoru pRDA32 o sobě známými způsoby. Výsledné plasmidy, pLK112 a pLK113, se transformují do E. coli kmen DG116 (ATCC No. 53606). Tyto plasmidy kódují tepelně stálé DNA polymerázy, označované zde jako G46D E681K Taq a G46D E681K F667Y Taq. Expresovaný tepelně stálý DNA polymerázý protein G46D E681K F667Y Taq se čistí způsobem popsaným v literatuře (Lawyer a kol., PCR Methods and Applications 2, str. 275 až 287, 1993).
Enzym G46D E681K Taq se čistí způsobem podobným způsobu ·· ···· ··
- 44 ·· » · • · • · · přípravy, prováděným však v menším měřítku, jak následuje: všechny stupně se provádějí při teplotě 4 °C, pokud není uvedeno jinak. Buňky z 475 ml kultury se resuspendují ve 30 ml pufru (50 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5, 10 mM EDTA, hodnota pH 8,0, 0,5 mM Pefabloc°SC, 0,5 gg/ml leupeptinu, 0,1 mM Na-p-tobuňky se působí jedné minuty a syl-L-lysinchlormethylketonu, 1 mM DTT). Na se 5 po dobu
Tento stupeň se dvazvukem při 50% cyklu, usazují chladí se na ledu po dobu jedné minuty, krát opakuje. Přidá se 1,5 ml 4,0 M síranu amonného a směs se zahřívá na vodní lázni o teplotě 75 “C po dobu 15 minut a ochladí se na ledu. Přidá se po 1yethy1enimin do 0,6 % a směs se inkubuje na ledu po dobu 10 minut. Směs se odstředuje při 16000xg po dobu 30 minut. Supernatant se vnese na sloupec 1,8 ml feny1-sefarose (Bio-Rad Polyprep chromatografický sloupec) vyvážený roztokem 50 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5, 10 mM EDTA, hodnota pH 8,0, 1 mM DTT, 0,2 M síranu amonného. Sloupec se promyje 6 ml každého z následujících tří roztoků: 1) 25 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,2 M síranu amonného, 2) 25 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM
DTT, 3) 25 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, % ethy1eng1yko1u. Polymeráza se eluuje 6 ml systému 25 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 20 % ethylenglykolu, 2,5M močoviny. Po adjustaci polymerázové preparace na 100 mM KCL 3M KCl se směs vnese na sloupec heparinu a sepharosy (1,8 ml, Bio-rad Polyprep sloupec) vyvážený 25 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 100 mM KCl. Po promytí tímtéž pufrem se vzorek eluuje za použití pufru 25 mM Tris-HCl, hodnota pH 7,5, 1 mM EDTA, 400 mM KCl.
Po čištění se aktivita modifikovaných enzymů stanovuje za použití zkoušky kol., J. Biol. Chem vyčištěných enzymů v literatuře (Lawyer a až 6437, 1989). Aktivita způsobem: jedna jednotka aktivity popsané 264, str. 6427 se vypočte tímto enzymu odpovídá 10 nmol produktu syntetizovaného v průběhu 30 minut. DNA polymerázová aktivita je přímo úměrná koncentraci ·« ····
• · · · ·» · · enzymu až do 80-100 pmol začleněného dCMP (zředěný enzym při 0,024 až 0,03 jednotek/μΐ). Vyčištěných enzymů se používá pro začleňovací a sekvenční reakce podle příkladu 2 až 4.
Příklad 2
Zkouška porovnávající účinnost začleňování ddNTP
Relativní schopnost G46D F667Y Taq, G46D F667Y E681K Taq a F73OY Tma 30 DNA polymeráz začleňovat fluoresceinovými barvivý značeného ddCTP se porovnává za použití omezující matrice, příměrové extenzní konkurenční zkoušky. Polymeráza F73OY Tma 30 DNA je popsána v příkladu 1 amerického patentového spisu číslo přihlášky vynálezu 60/052065, podané 9. června 1997 a v evropské přihlášce vynálezu číslo 98112327.6). Při této konkurenční zkoušce v důsledku toho, že začlenění ddCTP ukončuje extenzní reakci, čím ochotněji polymeráza začleňuje ddCTP do extendovaného příměru, tím méně se může začlenit [a-33P]dCTP. Proto se vzrůstající účinností ddCTP začleňování vzrůstá míra inhibice DNA syntézy. Účinnost začleňování ddCTP se pak porovnává s účinností začleňování fluorescentně značené ddCTP, Čímž se získá relativní míra účinnosti začlenění fluorescentně značeného ddNTP pro daný enzym.
Zkouška se provádí způsobem popsaným v literatuře (Lawyer a kol., J. Biol. Chem. 264, str. 6427, 1989), včetně následujících modifikací. Zkoušená směs má takové složení, aby konečná koncentrace byla 50 mM Bicinu pH 8,3, 25 °C, 2,5 mM MgCl2 , 1 mM β-merkaptoethanolu, 20 μΜ vždy dATP, dGTP a dTTP (Perkin-Elmer), 20 μΜ dCTP (Perkin-Elmer) a [a-33P]dCTP (New England Nuclear, Boston, MA). M13mpl8 (Perkin-Elmer) se kopuluje na primer DG48 (SEQ ID NO:10) a ekvivalent 0,085 pmol kopulované matrice se přidá do zkušební směsi pro každou reakci. Přidá se 35 μΐ zkoušené směsi s matricí DNA do každé z 38 Eppendorfových zkumavek o obsahu 0,5 ml. Připraví se zředění • ·
Zowie-ddCTP v 25 mM CAPSO pufru, hodnota pH 9,6, tak, aby vždy 10 μΐ každého se přidalo do reakční zkumavky, aby konečná koncentrace Zowie-ddCTP byla 3, 1, 0,5, 0,25, 0,125 nebo 0,0625 μΜ. Pro G46D F667Y Taq DNA polymerázu se připraví dvě zkumavky 3, 1, 0,5, 0,25, 0,125 a 0,0625 μΜ Zowie-ddCTP. Osm zbylých reakčních zkumavek obsahuje 10 μΐ 25 mM pufru CAPSO, hodnota pH 9,6. Tak každá z 36 zkumavek obsahuje 35 μΐ zkoušené směsi a 10 μΐ bud 25 mM pufru CAPSO, hodnota pH 9,6, nebo ZowieddCTP v příslušném zředění.
Pro každý zkoušený enzym se iniciuje polymerace ve zkumavce s každým Zowie-ddCTP v příslušném zředění a ve dvou zkumavkách obsahujících samotný pufru CAPSO za použití 5 μΐ enzymu. Používá se následujících koncentrací enzymu, přičemž se vždy dbá na nadbytek enzymu pro množství zkoušeného substrátu: 2,5 jednotek F667Y G46D Taq DNA polymerázy, připravené způsobem podle příkladu 1; 1,25 jednotek G46D,F667Y,E681K Taq DNA polymerázy, připravené způsobem podle příkladu 1; nebo 2 jednotky F73OY Tma30 DNA polymerázy. Jako kontrola pro základní koncentraci se iniciuje zbylá negativní kontrola enzymem zředěným pufrem spíše než polymerázou. Všechny zkušební zkumavky se bezprostředně krátce intenzivně províří a inukubí se po dobu 10 minut při teplotě 75 °C. Reakce se ukončí přidáním 10 μΐ 60 mM EDTA a uloží se při teplotě 0 °C.
V analogickém testu se ddCTP zředí ve 25 mM pufru CAPSO, hodnota pH 9,6, tak, aby 10 μΐ každého zředění po přidání do reakční zkumavky vytvořilo konečnou koncentraci 0,5, 0,25, 0,125, 0,0625 nebo 0,0312 μΜ. Pipetuje se 10 μΐ každého zředění do tří Eppendorfových zkumavek, obsahujících vždy 35 μΐ shora popsané testovací směsi. Také se připraví 4 zkumavky obsahující 35 μΐ testované směsi plus 10 μΐ 25 mM CAPSO pufru, hodnota pH 9,6. Každá z 19 zkumavek obsahuje 35 μΐ testované směsi a 10 μΐ bud 25 mM pufru CAPSO, hodnota pH 9,6, nebo jednoho ze zředění ddCTP.
··· · ··· · zkumavce z každého ddCTP
CAPSO se 2.5 jednotkami
Polymerace se inidiuje v jedné zředění a v jedné zkumavce s pufrem G46D F667Y E681K Taq DNA polymerázy, s 1,25 jednotkami G46DF667Y E681K Taq DNA polymerázy nebo se 2 jednotkami F73OY Tma 30 DNA polymerázy. Zbývající zkumavka obsahující CAPSO se iniciuje enzymem zředěným pufrem místo pufrem obsahujícím polymerázu jakožto jako negativní kontrola. Všechny reakční směsi se bezprostředně intenzivně províří a inkubují se po dobu 10 minut při teplotě 75 °C. Reakce se ukončí přidáním 10 μΐ 60 mM EDTA a uloží se při teplotě 0 °C.
Pro každou reakci 50 μΐ podíl 60 μΐ reakční směsi se zředí 1 ml 2 mM EDTA, 50 μΐ /ml stříhaného losového sperma DNA jako nosičem. Vysráží se DNA použitím TCA o sobě známým způsobem a shromáždí se na GF/C filtračním kotoučku (Whatman). Stanoví se množství začleněné [ct-33P]dCMP pro každý vzorek a normalizuje se na CAPSO vzorky bez ddNTP (0% inhibice). Koncentrace ddCTP nebo Zowie-ddCTP, potřebná k 50% inhibici, se vypočte pro každý vzorek a je uvedena v tabulce II. Porovnání množství ddCTP, potřebného k inhibici syntézy 50%, se množstvím Zowie-ddCTP, potřebným pro inhibici syntézy 50% pro určitý enzym, odpovídá relativní schopnosti každého enzymu začleňovat fluorescenčně značený analog. Tyto hodnoty dokládají, že G46D F667Y Taq DNA polymeráza začleňuje Zowie-ddCTP nejméně účinně ze tří zkoušených enzymů (koncentrační poměry pro 50% inhibici Zowie-ddCTP versus ddCTP = 25). F73OY Tma30 DNA polymeráza začleňuje tento značený analog účinněji než G46D F667Y Taq DNA polymeráza (koncentrační poměry pro 50% inhibici Zowie-ddCTP versus ddCTP = 4), zatímco G46D F667Y E681K Taq
DNA polymeráza začleňuje značený a neznačený analog ddCTP téměř stejně účinně (koncentrační poměry pro 50% inhibici ZowieddCTP versus ddCTP = 1,2).
·· • · ·
9 9 • 999 • 9 ···· ··
99
9 9 9
9 99
9 9 9
9 9
99
Tabulka II
Koncentrace (μΜ) Zowie-ddCTP nebo ddCTP potřebné k 50% inhibici
| DNA polymeráza | Zowie-ddCTP | ddCTP | Zowie-ddCTP/ddCTP |
| G46D F667Y Taq | 1,4 | 0,056 | 25,0 |
| G46D F667Y E681K Taq | 0,14 | 0,116 | 1,2 |
| F730Y Tma30 | 0,236 | 0,057 | 4,0 |
Příklad 3
Zkouška míry extenze
Míra extenze G46D F667Y Taq a G46D F667Y E681K Taq se stanoví zkouškou míry extenze. Při této zkoušce se používá enzymu k extenzi primeru kopulovaného na M13 mařici v přítomnosti [a-33P]dCTP. Extenzní reakce se denaturuje a produkty se analyzují denaturační agarozovou gelovou e1ektroforézou.
Zkouška se provádí jak shora popsáno (Lawyer a kol., J. Biol. Chem. 264, str. 6427, 1989) včeně následujících modifikací. Zkoušená směs je složená tak, aby konečná koncentrace byla 50 mM Bicinu, hodnota pH 8,3, 25 °C, 2,5 mM chloridu hořečnatého, 1 mM β-merkaptoethanolu, 200 μΜ vždy dATP, dGTP a dTTP (Perkin-Elmer), 100 μΜ dCTP (Perkin-Elmer) obsahujícího [a-33p]dCTP (New England Nuclear, Boston, MA). M13mpl8 (Perkin-Elmer) se kopuluje na primer DG48 (SEQ ID NO: 11) a přidá se ekvivalent 0,085 pmol kopulované matrice ke zkoušené směsi pro každou reakci. Přidá se 55 μΐ zkušební směsi s matricovou DNA do každé ze 14 Eppendorfových zkumavek o obsahu 0,5 ml. Každá zkumavka se preinkubuje při teplotě 75 ’C po dobu alespoň 30 sekund před startem polymerázové reakce.
Polymerace se iniciuje v šesti ze čtrnácti testovacích zkumavek 5 μΐ G46D F667Y Taq DNA polymerázy (2,5 jednotek) nebo G46D F667Y E681K Taq DNA polymerázy (1,25 jednotek) Oba en- 49 ·· ···· ·· ·· • · · · • · · · • · ··· ·· ·· «· ··
9 · ·· ··· · · • · · »· ·· zymy se připraví způsobem podle příkladu 1, a použité koncentrace představují předem stanovený nadbytek enzymu pro množství testovaného substrátu. Jako kontrola pro základ se iniciuje zbylá negativní kontrola enzymem zředěným pufrem spíše než polymerázou. Všechny reakční zkumavky se krátce víří a inkubují se při teplotě 75 °C. Dvě z šesti zkumavek obsahující G46D F667Y Taq DNA polymerázu se inkubují tři minuty, dvě šest minut a dvě 10 minut. Podobně dvě zkumavky startující s G46D F667Y E681K Taq DNA polymerázou se inkubují 30 sekund, dvě jednu minutu a dvě dvě minuty. Kontrolní zkumavky se inkubují tři minuty. Reakce se ukončí přidáním 10 μΐ 60 mM EDTA a uloží se při teplotě 0 °C.
Pro každou reakci 25 μΐ podíl 60 μΐ reakční směsi se zředí 1 ml 2 mM EDTA, 50 pg/ml stříhaného losového sperma DNA jako nosiče. Vysráží se DNA použitím TCA o sobě známým způsobem a shromáždí se na GF/C filtračním kotoučku (Whatman). Stanoví se množství začleněné [a-33P]dCMP pro každý vzorek.
Zbylých 35 μΐ každého duplikátu se zkombinuje a 70 μΐ vzorku se vysráží ethanolem, vysuší se a resuspenduje se v 50 mM NaOH, 1 mM EDTA. Z těchto vzorků se odstraní podíly takže se odejme z každého stejný počet [a—33P2. Tyto podíly se vnesou na 0,9% alkalický agarosový gel, podrobí se e1ektroforéze , vysuší se a autoradiografují se způsobem popsaným v literatuře (Maniatis a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982). Jako standard molekulové hmotnosti se použije bakteriofág lambda DNA řez s restrikčním enzymem HindlII (BRL) a 5’zakončení s [32P] .
Délka páru bází extenzního produktu v každém vzorku se určí porovnáním migrační vzdálenosti každého vzorku se vzdáleností migrovaného lambda DNA standardu velikosti. Počet páru bází v každém produktu se dělí počtem sekund každé extenzní ·· ···· • * reakce inkubuované, čímnž se získá extenzní rychlost, jak dále uvedeno.
DNA polymeráza Doba Pár bází/sekunda
| G46D | F667Y | Taq | 3 | min | 12,5 | |
| G46D | F667Y | Taq | 6 | min | 12,2 | |
| G46D | F667Y | Taq | 10 | min | 11,8 | |
| G46D | F667Y | E681K | Taq | 30 | s | 36,7 |
| G46D | F667Y | E681K | Taq | 1 | min | 41,7 |
| G46D | F667Y | E681K | Taq | 2 | min | 52,9 |
Výsledky zkoušek dokládají, že přítonost E681K mutace zvyšuje rychlost extenze G46D F667Y enzymu 3 až 4,3 krát.
Příklad 4
Cyklické sekvencování s G46D F667Y E681K Taq DNA polymerázou a s f1uoresceinem značeným ddNTP
Tento příklad dokládá použití modifikované polymerázy podle vynálezu k cyklickému sekvencování fluoresceinovým barvivém značeného dideoxyterminátorů za použití 1 μΜ nebo méně ddNTP a poměru ddNTPidNTP alespoň 1:100. Fluoresceinovým barvivém značené dideoxyterminátory jsou reagencie sekvenčního kitu společnosti Applied Biosystems PRISM SequenaseR Terminátor (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) a je optimalizován pro použití polymerázou Sequenasa DNA a s alfa-thio dNTP. Reakce cyklického sekvencování se provádějí v 20 μΐ objemu obsahujícím 50 mM Tris-HCl (hodnota pH 8,8), 2,0 mM MgCl2 , 100 μΜ vždy dATP, dCTP a dTTP (Perkin-Elmer, Norwalk, CT), 500 μΜ dITP (Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ), 0,2 μg M13mpl8 jednořetězcové DNA matrice (Perkin-Elmer), 0,15 μΜ LacZ Forward Primer (Perkin-Elmer), 5 jednotek G46D F667Y E681K Taq DNA polymerázy, 20 jednotek rTth tepelně stálé pyrofosfatázy (evropská zveřejněná přihláška vynálezu EP-A-763599 a americký patentový spis • · • ·
• · 0 0 0 ·· • 0 0 · 0 0 • · 0·0· 0·0 0 • · 0 0 0
0 · 0 0 ·
665551), 0,05 μΜ terminátoru Sequenase A Dye Terminátor, 0,8 μΜ terminátoru Sequenase C Dye Terminátor, 0,08 μΜ terminátoru Sequenase G Dye Terminátor a 1,0 μΜ terminátoru Sequenase T Dye Terminátor. Všechny čtyři terminátory Sequenase Dye Terminátor jsou obchodními produkty společnosti Perkin-Elmer. Reakční směsi se vnesou do předehřátého (75 °C) tepelného cyklizátoru Perkin-Elmer GeneAmpRPCR System 9600 a podrobí se 25 cyklům při 96 °C po dobu 10 sekund, 50 °C po dobu 5 sekund a 60 °C po dobu 4 minut. Barvivém značené fragmenty se čistí za použití sloupců Centri-Sep™ (Princeton Separations, Adelphia, NJ) podle výrobcovova návodu a suší se ve vakuové odstředivce. Pelety se resuspendují v systému 6 μΐ deionizovaný formamid:50 mg/ml dextranová modř (ve 25 mM EDTA, hodnota pH 8,0) 5:1 (objem/objem), zahřátém na teplotu 90 °C po dobu tří minut a přímo se vnesou na pree1ektroforezovaný gel 4 % po 1yakry1amidu/6 M močovina, e1ektrofořezuji se a analyzují se na sekvenceru Perkin-Elmer ABI PRISM’377 DNA podle návodu výrobce (ABI PRISM 377 DNA Sequencer User’s Manual). Automatizovaný analytický softwar společnosti Perkin-Elmer ABI PRISM 377 DNA Sequencer poskytuje více než 98,5% přesnost pro 450 bází (6 chyb pro báze +10 až +460 z primeru).
Průmyslová využitelnost
Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza se zvýšenou účinností pro začleňování nekonvenčních, například fluorescelnovými barvivý značených nukleotidů s výraznými cenovými a účinnostními přednostmi pro DNA sekvencování. Je výhodná pro in vitro DNA syntézy, například pro DNA sekvencování, pro syntézu značené DNA a pro produkci značených primerních extenzních produktů.
• · · · · · · • ···· ···· · • · _ ς · _· · · · · ··
Ί<·· ·· ·· ·· ·· ·
Seznam sekvencí (1) Obecné informace (i) Př i h1ašovat e1 (A) Jméno: F. Hoffmann-La Roche Ltd (B) Ulice: Grenzacherstrasse 124 (C) Město: Basel (D) Stát: BS (E) Země: švýcarsko (F) Poštovní kód (ZIP): CH-4O7O (G) Telefon: (0)61 688 24 03 (H) Telefax: (0)61 688 13 95 (I) Telex: 962292/965512 hlr ch (ii) Název vynálezu: Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza, způsob její přípravy a kit, který ji obsahuje (iii) Počet sekvenc:18 (iv) Forma pro počítač (A) Typ média: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release # 1,0, Version # 1,30 (EPO) (vi) Platné přihlašovací údaje (A) Číslo přihlášky: US 60/052065 (B) Datum podání: 09-červenec-1997
2. Informace o SEQ ID. Č.l:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovítost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky ·· ·· ·· • · · · · ·
9 9 · · · · • ··· · ···· • · · · ·· 9· ·· (A) jméno/klíč: region (B) lokace: 7
| (D) Jiné informace: poznámka Xaa v | /značení = Xaa/ | ||||
| poloze 7 | je | Val | nebo | ||
| (xi ) | Popis sekvence: SEQ | ID NO:1 | |||
| Leu | Ser Xaa Xaa Leu Xaa | Xaa Pro | Xaa | Xaa | Glu |
| 1 | 5 | 10 |
Ile
2. Informace o SEQ ID. č.2:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovítost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace: 3..6 (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka Xaa v poloze 3 je Gin nebo Gly. Xaa v poloze 6 je Ser nebo Ala (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:2 Leu Ser Xaa Xaa Leu Xaa Ile Pro Tyr Glu Glu 1 5 10
2. Informace o SEQ ID. č.3:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovítost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID N0:3
Leu Ser Gin Xaa Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu
5 10 • · · · • · • ·
2. Informace o SEQ ID. Č.4:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovítost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace: 7 (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka Xaa v poloze 7 je Val nebo Ile.
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:4
Leu Ser Val Xaa Leu Gly Xaa Pro Val Lys Glu 1 5 10
2. Informace o SEQ ID. Č.5:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovítost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID N0:5 Leu Ser Val Xaa Leu Gly Val Pro Val Lys Glu 1 5 10
2. Informace o SEQ ID. Č.6:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovítost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid • · • · · · • · • · ·· ··
(xi) Popis sekvence: SEQ ID N0:6
Leu Ser Val Xaa Leu Gly Ile Pro Val Lys Glu 1 5 10
2. Informace o SEQ ID. č.7:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovítost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (Β) 1okace: 4..7 (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka Xaa v poloze 4 je jakákoliv aminokyselina nikoliv všqak zbytek glutamové kyseliny, Xaa v polze 7 je Val nebo Ile.
(xi) Popis sekvence: SEQ ID N0:7 Leu Ser Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Pro Xaa Xaa Glu 1 5 10
2. Informace o SEQ ID. č.8:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovítost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace: 4 (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka Xaa v poloze 4 je jakákoliv aminokyseli• · · · · ·
- 56 -. · • · · · · · • ·· · · · · · • · ···· · · · · · • · · · · · ·· ·· · · ·· na nikoliv však Glu.
(xi) Popis sekvence: SEQ ID N0:8
Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu 1 5 10
2. Informace o SEQ ID. Č.9:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace : 2..5 (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka Xaa v poloze 2 je Ser nebo Ala, Xaa v poloze 4 je jakákoliv aminokyselina nikoliv však Glu a Xaa v poloze 5 je Leu nebo Ile.
(xi) Popis sekvence: SEQ ID N0:9 Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu 1 5 10
2. Informace o SEQ ID. Č.10:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovítost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace: 4 (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka Xaa v poloze 4 je jakákoliv aminokyselina nikoliv však Glu.
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:10 Leu Ser Xaa Xaa Leu Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Glu 1 5 10
2. Informace o SEQ ID. Č.ll:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 30 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) řetězcovítost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: DNA (genomická) (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:11
GGGAAGGGCG ATCGGTGCGG GCCTCTTCGC
2. Informace o SEQ ID. Č.12:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 15 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovítost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID N0:12
Met Arg Arg Xaa Xaa Lys Xaa Xaa Asn Tyr Xaa Xaa Xaa Tyr Gly 15 10 15
2. Informace o SEQ ID. Č.13:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovítost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid
- ξ?..· • · · ·· · · · (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (Β) 1okace: 3..6 (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka Xaa v poloze 3 je Gin nebo Gly, Xaa v po 4 je jakákoliv aminokyselina nikoliv však Glu, Xaa v poloze 6 je Ser nebo Ala.
(xi) Popis sekvence: SEQ ID N0:13 Leu Ser Xaa Xaa Leu Xaa Ile Pro Tyr Glu Glu 1 5 10
2. Informace o SEQ ID. Č.14:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) retězcovitost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace: 4 (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka Xaa v poloze 4 je jakákoliv aminokyselina nikoliv však Glu.
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:14 Leu Ser Gin Xaa Leu Ala Ile Pro Tyr Glu Glu 1 5 10
2. Informace o SEQ ID. č.15:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovítost: jeden ς Π · · · · ·
5»—·· · · • · · · · · • · · · · ··· · ··· · · • · · « ·· ·· (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace: 4..7 (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka Xaa v poloze 4 je jakákoliv aminokyselina nikoliv však Glu, Xaa v poloze 7 je Val nebo Ile.
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:15 Leu Ser Val Xaa Leu Gly Xaa Pro Val Lys Glu 1 5 10
2. Informace o SEQ ID. č.16:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovítost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace: 4
| (D) Jiné informace: /značení poznámka Xaa v poloze 4 | = Xaa/ | |||
| je | jakákoliv aminokyseli- | |||
| na nikoliv však | Glu . | |||
| (xi ) | Popis sekvence: SEQ | ID NO:16 | ||
| Leu | Ser Val Xaa Leu Gly | Val Pro | Val | Lys Glu |
| 1 | 5 | 10 |
2. Informace o SEQ ID. Č.17:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 11 aminokyselin
- 6£„(B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovítost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace: 4 (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka Xaa v poloze 4 je jakákoliv aminokyselina nikoliv však Glu.
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:17 Leu Ser Val Xaa Leu Gly Ile Pro Val Lys Glu 1 5 10
Informace o SEQ ID. č.18:
(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 7 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) řetězcovítost: jeden (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (ix) Charakteristiky (A) jméno/klíč: region (B) lokace: 4..7 (D) Jiné informace: /značení = Xaa/ poznámka Xaa v poloze 4 je jakákoliv aminokyselina nikoliv však Glu, Xaa v poloze 7 je Val nebo Ile .
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:18 Ser Gin Ile Xaa Leu Arg Xaa
Claims (25)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza vyznačující se tím, žea) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci LeuSerXaaXaaLeuXaaXaaProXaaXaaGlu, SEQ ID NO:1, přičemž Xaa v poloze 3, 4, 6, 9 a 10 sekvence znamená jakýkoliv aminokyseinový zbytek a Xaa v poloze 7 znamená Val nebo Ile,b) Xaa v poloze 4 je mutovaný ve srovnání s nativní sekvencí s výjimkou, že Xaa v poloze 4 není mutován na Glu ac) tepelně stálá DNA polymeráza má rozlišovací schopnost proti začlenění nukleotidů značených f1uoresceinovým barvivém, která je snížena ve srovnání s nativní formou této polymerázy.
- 2. Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku1, vyznačuj ící se tím, že nukleotidem je dideoxynuk1eotid a úroveň rozlišování je alespoň třínásobně nižší než nativní formy polymerázy.
- 3. Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku2, vyznačující se tím, že se úroveň rozlišování měří stanovením koncentrace dideoxynuk1eotidu značeného fluoresceinovým barvivém, které je zapotřebí pro 50% inhibici DNA syntézy.
- 4. Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 2, vyznačující se tím, že polymeráza je z termofilních druhů ze souboru zahrnujícího Thermosipho africanus, Bacillus caldotenax a Bacillus stearothermophilus.
- 5. Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku2, vyznačující se tím, že polymeráza je z druhu Thermus.• · · · · ·- 63 ···· ·· ·· • · · · • · · · • · · · · • · · ·· ·· ·· • · · • ·· ··· · · • · · ·· ··
- 6. Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 5, vyznačující se tím, žea) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci LeuSerXaaXaaLeuXaal1eProTyrG1uG1u, SEQ ID NO:2, přičemž znamená Xaa v poloze 3 Gin nebo Gly, Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu a Xaa v poloze 6 Ser nebo Ala,b) Xaa v poloze 4 je mutovaný ve srovnání s nativní sekvencí s výjimkou, že Xaa v poloze 4 není mutován na Glu ac) tepelně stálá DNA polymeráza má rozlišovací schopnost proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovým barvivém,
která je snížena rázy. ve srovnání s nativní formou této polyme- 7. Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 6, vyznačuj í c í s e t í m, že a) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci LeuSerGlnXaaLeuAlalleProTyrGluGlu, SEQ ID NO:3, přičemž znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu,b) Xaa v poloze 4 je mutovaný ve srovnání s nativní sekvencí s výjimkou, že Xaa v poloze 4 není mutován na Glu ac) tepelně stálá DNA polymeráza má rozlišovací schopnost proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovým barvivém, která je snížena ve srovnání s nativní formou této polymerázy . - 8. Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 7, vyznačující se tím, že Xaa v poloze 4 je mutován na Lys.
- 9. Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku2, vyznačující se tím, že polymeráza je z druhu Thermogota.
- 10. Rekombinantní, 9, vyznačuj í tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku c í se t í m, že • * · · · · • · · ·· ·· ·· ·· • · · · · · · • · · · · ·· • ···· ···· ·a) ve své nativní formě obsahuje aminokyselinovou sekvenci LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu, SEQ ID N0:4, přičemž znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výhodou Arg a Xaa v poloze 7 Val nebo Ile,b) Xaa v poloze 4 je mutovaný ve srovnání s nativní sekvencí s výjimkou, že Xaa v poloze 4 není mutován na Glu ac) tepelně stálá DNA polymeráza má rozlišovací schopnost proti začlenění nukleotidů značených fluoresceinovým barvivém, která je snížena ve srovnání s nativní formou této polymerázy .
- 11. Nukleová kyselinová sekvence kódující rekombinantní, tepelně stálou DNA polymerázu podle nároku 1 až 10.
- 12. Vektor obsahující nukleovou kyselinovou sekvenci kódující rekombinantní tepelně stálou DNA polymerázu podle nároku 1 až 10.
- 13. Hostitelská buňka obsahující nukleovou kyselinovou sekvenci kódující rekombinantní tepelně stálou DNA polymerázu podle nároku 1 až 10.
- 14. Způsob přípravy rekombinantní tepelně stálé DNA polymerázy podle nároku 1 až 10,vyznačující se t í m, žea) se kultivuje hostitelská buňka obsahující nukleovou kyselinovou sekvenci kódující rekombinantní tepelně stálou DNA polymerázu podle nároku 1 až 10 za podmínek promotujících expresi rekombinantní tepelně stálé DNA polymerázy ab) izoluje se rekombinantní tepelně stálá DNA polymeráza z hostitelské buňky nebo z prostředí.
- 15. Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza připravená způsobem podle nároku 14.
- 16.Způsob DNA sekvencování, vyznačuj í cí • · ·- 64·-.• · · · · · • ·· · ·· · • · ·· ·· t í m, žea) pořídí se rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 1 až 10,b) pořídí se barevný terminátor značený fluoresceinovým barvivém s negativním nábojem,c) provádí se sekvenční reakce s barevným terminártorem.
- 17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se t í m, že rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza má sníženou úroveň rozlišování se zřetelem na začleňování nukleotidů značených fluoresceinovými barvivý, přičemž nukleotidem je ribonukleotid a úroveň rozlišování se měří poměrem koncentrace dideoxynukleotidu značeného fluoresceinovým barvivém, které je zapotřebí pro 50% inhibici DNA syntézy versus koncentrace neznačeného dideoxynuk1eotidu potřebého pro 50% inhibici
- 18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se t í m, že poměr je 4 nebo menší.
- 19. Způsob produkce značené DNA, vyznačující se t í m, žea) pořídí se rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 1 až 10,b) pořídí se nuklleotid značený fluoresceinovým barvivém ac) provádí se DNA syntézní reakce.
- 20. Způsob produkce značených příměrových extenzních produktů, vyznačující se tím, žea) pořídí se rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza podle nároku 1 až 10,i) polymeráza obsahuje aminokyselinovou sekvenci LeuSerValXaaLeuGlyXaaProValLysGlu, SEQ ID N0:4, přičemž znamená Xaa v poloze 4 jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou Glu a Xaa v poloze 7 sekvence Val nebo Ile, ii) polymeráza má sníženou rozlišovací schopnost se zřete• · · »- 6$· -.·· · • · lem na začlenění nukleotidů značených fluoresceinovým barvivém, iii) polymeráza také obsahuje druhou aminokyselinovou sekvenci SQIXLR(V/I), SEQ ID NO:18, přičemž znamená X jakoukoliv aminokyselinu s výjimkou E, iv) polymeráza má sníženou rozlišovací schopnost se zřetelem na začlenění ribonuk1eotidů značených fluoresceinovým barvivém,b) pořídí se nukleotid značený fluoresceinovým barvivém ac) provádí se příměrová extenzní reakce.
- 21. Použití rekombinantní, tepelně stálá DNA polymerázy podle nároku 1 až 10 pro in vitro syntézní účely DNA, například pro DNA sekvencování, pro syntézu značené DNA a pro produkci značených primerních extenzních produktů.
- 22. Kit pro DNA sekvencování,vyznačující se t í m, že obsahuje rekombinantní, tepelně stálou DNA polymerázu podle nároku 1 až 10 a terminátor značený fluorescentním barvivém s negativním nábojem.
- 23. Kit pro DNA sekvencování podle nároku 22, vyznačující se tím, že rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza má sníženou rozlišovací schopnost se zřetelem na začlenění ribonuk1eotidů značených fluoresceinovým barvivém, přičemž úroveň rozlišování se měří stanovením poměru koncentrace dideoxynukleotidu ddNTP značeného fluoresceinovým barvivém, kterého je zapotřebí pro 50% inhibici DNA syntézy ve srovnání s koncentrací neznačeného ddNTP a tento poměr je 4 nebo menší.
- 24. Kit pro DNA sekvencování podle nároku 23, vyznačující se tím, že úroveň rozlišování je alespoň pětkrát nižší než nativní formy příslušné polymerázy.
- 25. Kit pro produkci značené DNA, vyznačujícíΦΦ 949· • · · · · •··· ·· ·· φφ • · · · φ φ · φ φ φ ·« φ φ φ φ · • φ ·φ • · φ φ φφφ φ φφ se t ί m, že obsahuje rekombinantní, tepelně stálou DNA polymerázu podle nároku 1 až 10 a nukleotid značený fluorescentním barvivém s negativním nábojem.
- 26. Kit pro produkci značených primerních extenzních produktů, vyznačující se tím, že obsahuje rekombinantní, tepelně stálou DNA polymerázu podle nároku 1 až 10 a ribonuk1eotid značený fluorescentním barvivém.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US5852597P | 1997-09-11 | 1997-09-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ287498A3 true CZ287498A3 (cs) | 1999-03-17 |
| CZ293217B6 CZ293217B6 (cs) | 2004-03-17 |
Family
ID=22017355
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19982874A CZ293217B6 (cs) | 1997-09-11 | 1998-09-09 | Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza, způsob její přípravy a kit, který ji obsahuje |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (3) | US6346379B1 (cs) |
| EP (1) | EP0902035B1 (cs) |
| JP (1) | JP4417452B2 (cs) |
| KR (1) | KR100561122B1 (cs) |
| CN (1) | CN1197962C (cs) |
| AT (1) | ATE530567T1 (cs) |
| AU (1) | AU741366B2 (cs) |
| BR (1) | BR9803419B1 (cs) |
| CA (1) | CA2243985C (cs) |
| CZ (1) | CZ293217B6 (cs) |
| ES (1) | ES2374910T3 (cs) |
| HK (1) | HK1018796A1 (cs) |
| HU (1) | HUP9802024A3 (cs) |
| IL (1) | IL126100A (cs) |
| NO (1) | NO327476B1 (cs) |
| PL (1) | PL328525A1 (cs) |
| RU (1) | RU2238978C2 (cs) |
| TW (1) | TW513439B (cs) |
Families Citing this family (76)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000516468A (ja) | 1996-08-14 | 2000-12-12 | ライフ テクノロジーズ，インコーポレイテッド | 核酸増幅および配列決定のための安定な組成物 |
| US6780591B2 (en) * | 1998-05-01 | 2004-08-24 | Arizona Board Of Regents | Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules |
| US7875440B2 (en) | 1998-05-01 | 2011-01-25 | Arizona Board Of Regents | Method of determining the nucleotide sequence of oligonucleotides and DNA molecules |
| US20030138834A1 (en) * | 1998-08-19 | 2003-07-24 | Dawson Elliott P. | Method for determining polynucleotide sequence variations |
| US20040121394A1 (en) * | 1998-08-19 | 2004-06-24 | Dawson Elliott P. | Method for determining polynucleotide sequence variations |
| US6818395B1 (en) * | 1999-06-28 | 2004-11-16 | California Institute Of Technology | Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences |
| US7501245B2 (en) * | 1999-06-28 | 2009-03-10 | Helicos Biosciences Corp. | Methods and apparatuses for analyzing polynucleotide sequences |
| WO2001014568A1 (en) * | 1999-08-21 | 2001-03-01 | Amersham Pharmacia Biotech Inc. | Taq dna polymerases having an amino acid substitution at e681 and homologs thereof exhibiting improved salt tolerance |
| US7179590B2 (en) * | 2000-04-18 | 2007-02-20 | Roche Molecular Systems, Inc | High temperature reverse transcription using mutant DNA polymerases |
| US6214557B1 (en) * | 2000-06-06 | 2001-04-10 | Washington University | Cold sensitive mutant DNA polymerases |
| EP2801624B1 (en) | 2001-03-16 | 2019-03-06 | Singular Bio, Inc | Arrays and methods of use |
| EP1404824A2 (en) * | 2001-07-06 | 2004-04-07 | Amersham Biosciences Corp. | Novel dna polymerases having amino acid substitutions and homologs thereof |
| WO2003068991A1 (en) * | 2002-02-12 | 2003-08-21 | Applera Corporation | Polymerase compositions |
| DE10315640A1 (de) * | 2003-04-04 | 2004-10-14 | Ignatov, Konstantin | Verfahren zur kontrollierten Freisetzung von Komponenten in eine Lösung |
| KR100571808B1 (ko) * | 2003-04-16 | 2006-04-17 | 삼성전자주식회사 | 다층 박막 구조를 가진 ｄｎａ 칩 |
| US7820030B2 (en) * | 2003-04-16 | 2010-10-26 | Handylab, Inc. | System and method for electrochemical detection of biological compounds |
| US20050170367A1 (en) * | 2003-06-10 | 2005-08-04 | Quake Stephen R. | Fluorescently labeled nucleoside triphosphates and analogs thereof for sequencing nucleic acids |
| US7572581B2 (en) * | 2003-06-30 | 2009-08-11 | Roche Molecular Systems, Inc. | 2′-terminator nucleotide-related methods and systems |
| US7169560B2 (en) | 2003-11-12 | 2007-01-30 | Helicos Biosciences Corporation | Short cycle methods for sequencing polynucleotides |
| US20060172408A1 (en) * | 2003-12-01 | 2006-08-03 | Quake Steven R | Device for immobilizing chemical and biochemical species and methods of using same |
| EP1716254B1 (en) | 2004-02-19 | 2010-04-07 | Helicos Biosciences Corporation | Methods for analyzing polynucleotide sequences |
| US20060046258A1 (en) * | 2004-02-27 | 2006-03-02 | Lapidus Stanley N | Applications of single molecule sequencing |
| US20050239085A1 (en) * | 2004-04-23 | 2005-10-27 | Buzby Philip R | Methods for nucleic acid sequence determination |
| US20070117103A1 (en) * | 2005-11-22 | 2007-05-24 | Buzby Philip R | Nucleotide analogs |
| WO2006007207A2 (en) * | 2004-05-25 | 2006-01-19 | Helicos Biosciences Corporation | Methods and devices for nucleic acid sequence determination |
| US7476734B2 (en) * | 2005-12-06 | 2009-01-13 | Helicos Biosciences Corporation | Nucleotide analogs |
| US20070117104A1 (en) * | 2005-11-22 | 2007-05-24 | Buzby Philip R | Nucleotide analogs |
| US20060024678A1 (en) * | 2004-07-28 | 2006-02-02 | Helicos Biosciences Corporation | Use of single-stranded nucleic acid binding proteins in sequencing |
| US20060118754A1 (en) * | 2004-12-08 | 2006-06-08 | Lapen Daniel C | Stabilizing a polyelectrolyte multilayer |
| US7220549B2 (en) * | 2004-12-30 | 2007-05-22 | Helicos Biosciences Corporation | Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing |
| US20060172328A1 (en) * | 2005-01-05 | 2006-08-03 | Buzby Philip R | Methods and compositions for correcting misincorporation in a nucleic acid synthesis reaction |
| US7482120B2 (en) * | 2005-01-28 | 2009-01-27 | Helicos Biosciences Corporation | Methods and compositions for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction |
| US7524831B2 (en) * | 2005-03-02 | 2009-04-28 | Schering Corporation | Treatments for Flaviviridae virus infection |
| US20060263790A1 (en) * | 2005-05-20 | 2006-11-23 | Timothy Harris | Methods for improving fidelity in a nucleic acid synthesis reaction |
| US7666593B2 (en) | 2005-08-26 | 2010-02-23 | Helicos Biosciences Corporation | Single molecule sequencing of captured nucleic acids |
| GB0518867D0 (en) * | 2005-09-15 | 2005-10-26 | Secretary Trade Ind Brit | Microscopy tip |
| US20070117102A1 (en) * | 2005-11-22 | 2007-05-24 | Buzby Philip R | Nucleotide analogs |
| US20070128610A1 (en) * | 2005-12-02 | 2007-06-07 | Buzby Philip R | Sample preparation method and apparatus for nucleic acid sequencing |
| CA2633520A1 (en) * | 2005-12-22 | 2007-07-05 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Protein engineering strategies to optimize activity of surface attached proteins |
| AU2006331512B2 (en) * | 2005-12-22 | 2012-02-23 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Active surface coupled polymerases |
| CN101365807A (zh) | 2005-12-22 | 2009-02-11 | 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司 | 用于掺入核苷酸类似物的聚合酶 |
| US8962293B2 (en) | 2006-10-18 | 2015-02-24 | Roche Molecular Systems, Inc. | DNA polymerases and related methods |
| WO2008051530A2 (en) * | 2006-10-23 | 2008-05-02 | Pacific Biosciences Of California, Inc. | Polymerase enzymes and reagents for enhanced nucleic acid sequencing |
| US20100081926A1 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Histological facilitation systems and methods |
| US20100081928A1 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Histological Facilitation systems and methods |
| US20100081927A1 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Histological facilitation systems and methods |
| US20100081915A1 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Searete Llc, Alimited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Histological facilitation systems and methods |
| US20100081916A1 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware. | Histological facilitation systems and methods |
| US20100081924A1 (en) * | 2008-09-29 | 2010-04-01 | Searete Llc, A Limited Liability Corporation Of The State Of Delaware | Histological facilitation systems and methods |
| FR2940125B1 (fr) * | 2008-12-23 | 2013-03-22 | Isp Investments Inc | Composition cosmetique ou pharmaceutique apaisante comprenant un peptide activateur de la hmg-coa reductase |
| FR2940291B1 (fr) | 2008-12-23 | 2012-12-21 | Isp Investments Inc | Peptide derive d'hmg-coa reductase et composition cosmetique ou pharmaceutique le contenant |
| US8933036B2 (en) | 2009-04-15 | 2015-01-13 | Isp Investments Inc. | Cosmetic and/or pharmaceutical composition comprising a yeast peptide hydrolysate and use of the yeast peptide hydrolysate as an active agent for strengthening hair |
| FR2944526B1 (fr) | 2009-04-15 | 2013-05-10 | Isp Investments Inc | Composition cosmetique et/ou pharmaceutique comprenant un hydrolysat peptidique capable de renforcer la fonction barriere |
| FR2944445B1 (fr) | 2009-04-15 | 2013-08-16 | Isp Investments Inc | Composition cosmetique et/ou pharmaceutique comprenant un hydrolysat peptidique apaisant |
| JP5876477B2 (ja) | 2010-06-18 | 2016-03-02 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 増大した３’末端ミスマッチ識別能を有するｄｎａポリメラーゼ |
| US8722379B2 (en) | 2010-06-18 | 2014-05-13 | Roche Medical Systems, Inc. | DNA polymerases with increased 3′-mismatch discrimination |
| US8722378B2 (en) | 2010-06-18 | 2014-05-13 | Roche Molecular Systems, Inc. | DNA polymerases with increased 3′-mismatch discrimination |
| CA2802302C (en) | 2010-06-18 | 2016-04-26 | F. Hoffman-La Roche Ag | Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination |
| WO2011157436A1 (en) | 2010-06-18 | 2011-12-22 | Roche Diagnostics Gmbh | Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination |
| CA2802000C (en) | 2010-06-18 | 2016-08-16 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination |
| WO2011157438A1 (en) | 2010-06-18 | 2011-12-22 | Roche Diagnostics Gmbh | Dna polymerases with increasesed 3'-mismatch discrimination |
| KR101622442B1 (ko) | 2010-06-18 | 2016-05-19 | 에프. 호프만-라 로슈 아게 | ３’―미스매치 구별이 증가된 ｄｎａ 중합효소 |
| JP5847201B2 (ja) | 2011-02-15 | 2016-01-20 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 増大した３’末端ミスマッチ識別能を有するｄｎａポリメラーゼ |
| CN103492559B (zh) | 2011-04-11 | 2016-07-06 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 具有改进活性的dna聚合酶 |
| CA2839964C (en) | 2011-07-28 | 2019-03-12 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Dna polymerases with improved activity |
| CN103987844B (zh) | 2011-12-08 | 2016-01-20 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 具有改进活性的dna聚合酶 |
| WO2013083264A1 (en) | 2011-12-08 | 2013-06-13 | Roche Diagnostics Gmbh | Dna polymerases with improved activity |
| JP6224613B2 (ja) | 2011-12-08 | 2017-11-01 | エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ | 改善された活性を有するｄｎａポリメラーゼ |
| WO2015026873A1 (en) | 2013-08-19 | 2015-02-26 | Singular Bio, Inc. | Assays for single molecule detection and use thereof |
| EP3218471A1 (en) | 2014-11-14 | 2017-09-20 | Illumina, Inc. | Polymerases |
| ES2804843T3 (es) | 2015-02-02 | 2021-02-09 | Hoffmann La Roche | Variantes de polimerasa |
| CN107735497B (zh) | 2015-02-18 | 2021-08-20 | 卓异生物公司 | 用于单分子检测的测定及其应用 |
| US10526588B2 (en) * | 2015-05-14 | 2020-01-07 | Roche Sequencing Solutions, Inc. | Polymerase variants and uses thereof |
| WO2017090684A1 (ja) * | 2015-11-27 | 2017-06-01 | 国立大学法人九州大学 | Ｄｎａポリメラーゼ変異体 |
| CN112703248A (zh) | 2018-09-13 | 2021-04-23 | 豪夫迈·罗氏有限公司 | 具有改良链置换能力的突变型dna聚合酶 |
| EP4308718A1 (en) * | 2021-03-19 | 2024-01-24 | MGI Tech Co., Ltd. | Polymerases for efficient incorporation of nucleotides with 3'-phosphate and other 3'-terminators |
Family Cites Families (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5466591A (en) | 1986-08-22 | 1995-11-14 | Hoffmann-La Roche Inc. | 5' to 3' exonuclease mutations of thermostable DNA polymerases |
| US4889818A (en) | 1986-08-22 | 1989-12-26 | Cetus Corporation | Purified thermostable enzyme |
| US5338678A (en) * | 1989-06-09 | 1994-08-16 | Oncogen, A Limited Partnership | Expression of DNA sequences encoding a thermally stable cytosine deaminase from saccharomyces |
| CA2018273C (en) * | 1989-06-09 | 1999-04-06 | Peter D. Senter | Thermally stable cytosine deaminase |
| US5292658A (en) * | 1989-12-29 | 1994-03-08 | University Of Georgia Research Foundation, Inc. Boyd Graduate Studies Research Center | Cloning and expressions of Renilla luciferase |
| US6083686A (en) * | 1990-10-26 | 2000-07-04 | Johnson & Johnson Clinical Diagnostic Systems, Inc. | Increased production of Thermus aquaticus DNA polymerase in E. coli |
| US5446591A (en) * | 1993-02-08 | 1995-08-29 | Lockheed Missiles & Space Co., Inc. | Lens mounting for use with liquid lens elements |
| US5571706A (en) * | 1994-06-17 | 1996-11-05 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Plant virus resistance gene and methods |
| US6015668A (en) * | 1994-09-30 | 2000-01-18 | Life Technologies, Inc. | Cloned DNA polymerases from thermotoga and mutants thereof |
| US5614365A (en) | 1994-10-17 | 1997-03-25 | President & Fellow Of Harvard College | DNA polymerase having modified nucleotide binding site for DNA sequencing |
| DE69400567T2 (de) * | 1994-10-17 | 1997-02-06 | Harvard College | DNS Polymerase mit veränderter Nukleotid-Bindungstelle |
| US5852191A (en) * | 1995-06-07 | 1998-12-22 | Carnegie Mellon University | Rigidized monomethine cyanines |
| US6107029A (en) * | 1996-07-31 | 2000-08-22 | Message Pharmaceticals, Inc. | Universal method for detecting interactions between RNA molecules and RNA binding proteins |
| CZ293215B6 (cs) * | 1996-08-06 | 2004-03-17 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Rekombinantní tepelně stálá DNA polymeráza, způsob její přípravy a prostředek, který ji obsahuje |
| US5723298A (en) * | 1996-09-16 | 1998-03-03 | Li-Cor, Inc. | Cycle labeling and sequencing with thermostable polymerases |
| AU743025B2 (en) * | 1997-03-12 | 2002-01-17 | Applera Corporation | DNA polymerases having improved labeled nucleotide incorporation properties |
-
1998
- 1998-09-03 US US09/146,631 patent/US6346379B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-03 CA CA002243985A patent/CA2243985C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-05 EP EP98116786A patent/EP0902035B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-05 ES ES98116786T patent/ES2374910T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-05 AT AT98116786T patent/ATE530567T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-09-07 TW TW087114826A patent/TW513439B/zh not_active IP Right Cessation
- 1998-09-07 HU HU9802024A patent/HUP9802024A3/hu unknown
- 1998-09-07 IL IL12610098A patent/IL126100A/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-09-09 CZ CZ19982874A patent/CZ293217B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-09-10 BR BRPI9803419-7A patent/BR9803419B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1998-09-10 KR KR1019980037299A patent/KR100561122B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-09-10 AU AU84161/98A patent/AU741366B2/en not_active Ceased
- 1998-09-10 NO NO19984157A patent/NO327476B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-09-11 PL PL98328525A patent/PL328525A1/xx not_active Application Discontinuation
- 1998-09-11 RU RU98117244A patent/RU2238978C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1998-09-11 CN CNB981245269A patent/CN1197962C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-09-11 JP JP25841498A patent/JP4417452B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-09-07 HK HK99103880A patent/HK1018796A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2002
- 2002-01-17 US US10/052,417 patent/US20020142333A1/en not_active Abandoned
-
2003
- 2003-01-30 US US10/355,532 patent/US7598032B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU8416198A (en) | 1999-03-25 |
| US6346379B1 (en) | 2002-02-12 |
| HUP9802024A3 (en) | 2001-02-28 |
| CA2243985C (en) | 2004-08-10 |
| TW513439B (en) | 2002-12-11 |
| EP0902035B1 (en) | 2011-10-26 |
| KR19990029676A (ko) | 1999-04-26 |
| HUP9802024A2 (hu) | 1999-05-28 |
| KR100561122B1 (ko) | 2006-07-25 |
| CZ293217B6 (cs) | 2004-03-17 |
| NO984157L (no) | 1999-03-12 |
| CA2243985A1 (en) | 1999-03-11 |
| CN1197962C (zh) | 2005-04-20 |
| IL126100A0 (en) | 1999-05-09 |
| HU9802024D0 (en) | 1998-12-28 |
| ATE530567T1 (de) | 2011-11-15 |
| PL328525A1 (en) | 1999-03-15 |
| NO327476B1 (no) | 2009-07-13 |
| BR9803419A (pt) | 2000-02-08 |
| CN1218832A (zh) | 1999-06-09 |
| ES2374910T3 (es) | 2012-02-23 |
| NO984157D0 (no) | 1998-09-10 |
| AU741366B2 (en) | 2001-11-29 |
| JPH11137284A (ja) | 1999-05-25 |
| EP0902035A2 (en) | 1999-03-17 |
| US7598032B2 (en) | 2009-10-06 |
| JP4417452B2 (ja) | 2010-02-17 |
| US20030152988A1 (en) | 2003-08-14 |
| IL126100A (en) | 2005-12-18 |
| HK1018796A1 (en) | 2000-01-07 |
| BR9803419B1 (pt) | 2010-09-21 |
| EP0902035A3 (en) | 1999-06-23 |
| RU2238978C2 (ru) | 2004-10-27 |
| US20020142333A1 (en) | 2002-10-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ287498A3 (cs) | Rekombinantní, tepelně stálá DNA polymeráza, způsob její přípravy a kit, který ji obsahuje | |
| KR100510619B1 (ko) | 변형된 열안정성 디엔에이 폴리머라아제 | |
| CA2240334C (en) | Thermostable dna polymerase from thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus and mutant enzymes thereof with exonuclease activity removed | |
| JP2003526378A (ja) | 高忠実度逆転写酵素およびその使用 | |
| JP3112148B2 (ja) | 核酸の増幅方法およびその試薬 | |
| CA2802000C (en) | Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination | |
| EP2582802B1 (en) | Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination | |
| CA2802239A1 (en) | Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination | |
| JPH11151087A (ja) | Ｄｎａポリメラーゼ遺伝子 | |
| JP2000354496A (ja) | 核酸の増幅方法およびその試薬 | |
| JP2000023687A (ja) | 熱安定性ｄｎａポリメラ―ゼ | |
| EP2582806A1 (en) | Dna polymerases with increased 3'-mismatch discrimination |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20140909 |