CN103492559B

CN103492559B - 具有改进活性的dna聚合酶

Info

Publication number: CN103492559B
Application number: CN201280017749.6A
Authority: CN
Inventors: K.鲍尔; J.桑菲利波; T.W.迈尔斯; F.赖克特; R.沙希尼安; S.苏科
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2011-04-11
Filing date: 2012-04-10
Publication date: 2016-07-06
Anticipated expiration: 2032-04-10
Also published as: CA2831180C; CA2831180A1; US9637726B2; US9017979B2; US20150191708A1; WO2012139748A1; US20120258501A1; US10597644B2; EP2697372A1; JP2014511701A; EP2697372B1; ES2561885T3; US20170191044A1; CN103492559A; JP6023173B2

Abstract

公开了相对于对应的未修饰的聚合酶具有增强的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率和/或RT和聚合酶抑制剂的耐受性的DNA聚合酶。该聚合酶可用于多种公开的引物延伸方法中。还公开了相关的组合物，包括可用于，例如，DNA聚合酶生产的重组核酸、载体以及宿主细胞。

Description

具有改进活性的DNA聚合酶

发明领域

本发明提供了具有改进活性(包括增强的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率和/或逆转录酶(RT)和聚合酶抑制剂的耐受性)的DNA聚合酶，，以及这种聚合酶在各种应用中的用途，包括核酸多核苷酸延伸和扩增中的用途。

发明背景

DNA聚合酶负责基因组的复制和维护，这是在世代间(from generation togeneration)精确传递遗传信息的中心职责。DNA聚合酶在细胞中的功能是作为负责DNA合成的酶。它们在有金属活化剂如Mg²⁺存在的情况下，以被复制的DNA模板或多核苷酸模板支配的顺序聚合脱氧核糖核苷三磷酸。在体内，DNA聚合酶参与一系列DNA合成过程，包括DNA复制、DNA修复、重组和基因扩增。在每一DNA合成过程期间，复制DNA模板一次或最多几次以产生相同的复制品。与此相反，在体外，DNA复制可以重复多次，例如在聚合酶链式反应期间(参见例如美国专利号 4,683,202)。

在聚合酶链式反应(PCR)的最初研究中，DNA聚合酶是在每一轮DNA复制的开始时添加的(参见上述美国专利号4,683,202)。

后来，确认了从在高温下生长的细菌中可获得热稳定DNA聚合酶，这些酶只需要添加一次(参见美国专利号4,889,818和美国专利号4,965,188)。在PCR期间使用的高温下，这些酶没有不可逆地失活。因此，可以进行聚合酶链式反应的重复循环而不需要在每一合成加成过程开始时添加新鲜的酶。DNA聚合酶特别是热稳定聚合酶，是重组DNA研究和疾病的医疗诊断中大量技术的关键。特别是对于诊断应用，目标核酸序列可能仅仅是所考察(inquestion)DNA或RNA的一小部分，因此在不扩增的情况下可能难以检测到目标核酸序列的存在。

DNA聚合酶的总体折叠模式类似人的右手，包含手掌、手指和拇指三个独特的亚结构域。(参见Beese等, Science 260:352-355, 1993)；Patel等, Biochemistry 34:5351-5363, 1995)。尽管在大小和细胞功能不同的聚合酶之间手指和拇指亚结构域的结构变化很大，但是催化性的手掌亚结构域全部都是重叠的(superimposable)。例如，在化学催化作用期间与引入的dNTP相互作用并稳定过渡态的基序A在哺乳动物polα和原核生物的pol I家族DNA聚合酶之间是重叠的，平均偏差约为1Å(Wang等, Cell 89:1087 -1099, 1997)。在结构上基序A以主要包含疏水性残基的反向平行β-折叠链起始，延续到α-螺旋。DNA聚合酶活性位点的主要氨基酸序列是特别保守的。在基序A的情况下，例如，序列DYSQIELR(SEQ IDNO:22)保留在从数百万年进化分离的生物体包括例如水生栖热菌(Thermus aquaticus)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)和大肠杆菌(Escherichia coli)的聚合酶中。

除了高度保守以外，DNA聚合酶的活性位点也被证明是相对易变的，能够容纳某些氨基酸取代而不显著降低DNA聚合酶活性。(参见例如，美国专利号6,602,695)。这种突变型DNA聚合酶可以在例如包括核酸合成反应的诊断和研究应用中提供各种选择优势。

在DNA聚合的酶促过程中存在至少两个步骤：1 )掺入进入的核苷酸和2)延伸新掺入的核苷酸。DNA聚合酶的整体忠诚度或“保真度”通常被看作这两种酶活性的聚结，但步骤是不同的。DNA聚合酶可能错误掺入进入的核苷酸，但如果其不能被有效地延伸，延伸速率将严重降低，且整体产物形成将是极小的。或者，也可能具有错误掺入进入的核苷酸且容易错误延伸新形成的错配的DNA聚合酶。在这种情况下，整体延伸速率将是高的，但整体保真度将是低的。当使用Mn²⁺作为二价金属离子活化剂时，这种类型的酶的一个实例是ES112DNA聚合酶(E683R Z05 DNA聚合酶；参见US 7,179,590)。该酶具有非常高的效率，因为不像当遇到错配时往往犹豫/停止的典型DNA聚合酶，ES112 DNA聚合酶容易延伸错配。ES112中显示的表型在逆转录(RT)步骤过程中更加明显，大概是因为RNA/DNA异源双链体相比于DNA/DNA同源双链体的结构影响。第二个实例是，如果DNA聚合酶不容易错误掺入(可能甚至不太可能错误掺入)，但确实具有增加的错误延伸错配的能力。在这种情况下，对于整体产物，保真度没有显著改变。通常，在Mn²⁺中，这种类型的酶比ES112的特征更有利于延伸反应，因为该产物的保真度得到了改进。然而，可以利用这种属性以允许错误延伸错配的寡核苷酸引物，诸如当单一序列的寡核苷酸引物杂交到具有序列异质性的目标(例如，病毒目标)，但正常或较低的错误掺入速率允许超越初始寡核苷酸引物完成DNA合成。这种类型的DNA聚合酶的一个实例是Z05 D580G DNA聚合酶(参见美国专利公开号2009/0148891)。这种类型的活性被称为“错配耐受的”，因为它对寡核苷酸引物中的错配更耐受。尽管上面的实例已经讨论了引物延伸型反应，但是在其中引物延伸频繁再次发生的反应诸如RT-PCR和PCR中该活性可以更加显著。数据表明，尽管酶诸如Z05 D580G对错配更加“耐受”，但是它们还具有增强的延伸含有经修饰的碱基(例如，叔丁基苄基修饰的碱基)或存在DNA结合染料诸如SYBR Green I(参见美国专利公开号2009/028053)的寡核苷酸引物的能力。

逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)是在许多应用中用于通过扩增检测和/或定量RNA目标的技术。为了通过PCR扩增RNA目标，有必要首先将RNA模板逆转录成cDNA。通常，RT-PCR测定依赖于源自嗜常温生物体、用于初始cDNA合成步骤(RT)的非热稳定的逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)。在PCR中，需要额外的热稳定DNA聚合酶用于扩增cDNA 以耐受对于核酸变性所需的温度升高。使用工程改造的热活性或热稳定DNA聚合酶以进行更有效的逆转录用于RT-PCR测定具有几个潜在的益处。增强的逆转录酶活性连同使用更高的逆转录孵育温度的能力(其允许RNA模板二级结构的松弛)可以导致整体较高的cDNA合成效率和检测灵敏度。较高温度孵育也可以通过降低逆转录步骤中的错误引发而增加特异性。具有改进的逆转录效率的酶可以通过使RT孵育时间和/或酶浓度降低而简化测定设计。当使用dUTP和UNG时，含有在非严谨设置条件过程中形成的dUMP的非特异性延伸产物被UNG所降解，且不能被用作引物或模板。当使用源自嗜常温生物体的非热稳定的逆转录酶(RNA依赖性DNA聚合酶)时，不可能利用dUTP和UNG方法。(Myers, T.W.等人, Amplification of RNA:High Temperature Reverse Transcription and DNA Amplification with Thermusthermophilus DNA Polymerase, 于PCR Strategies, Innis, M.A., Gelfand, D.H.,和Sninsky, J.J.,编, Academic Press, San Diego, CA, 58-68, (1995))。然而，使用本发明的热活性或热稳定DNA聚合酶用于逆转录步骤使反应与利用dUTP/尿嘧啶N-糖基化酶(UNG)遗留物预防系统完全相容(Longo等人, Use of Uracil DNA Glycosylase toControl Carry-over Contamination in Polymerase Chain Reactions. Gene 93:125-128, (1990))。除提供遗留物污染对照以外，dUTP和UNG的使用提供了“热启动”以减少非特异性扩增(Innis和Gelfand (1999)同上)。

发明概述

本文提供了相对于对应的未修饰的对照聚合酶具有改进的活性(包括增强的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率和/或RT和聚合酶抑制剂的耐受性)的DNA聚合酶以及制备和使用这种DNA聚合酶的方法。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的709位的DNA聚合酶的氨基酸是除I、L或M以外的任何氨基酸，除了对应于SEQ ID NO:1的709位的对照DNA聚合酶的氨基酸是I、L或M，对照DNA聚合酶具有与所述DNA聚合酶相同的氨基酸序列。例如，在一些实施方案中，改进的聚合酶的对应于SEQ ID NO:1的709位的位置处的氨基酸选自 G、A、V、R、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K或H。

在一些实施方案中，具有增强的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率和/或RT和聚合酶抑制剂的耐受性的DNA聚合酶在聚合酶结构域中包含基序，所述基序包含

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-G-Y-V-X₁₄-T-L，其中：

X₁是A、D、S、E、R或Q；

X₂是W或Y；

X₃是除 I、L或M以外的任何氨基酸；

X₄是E、A、Q、K、N或D；

X₅是K、G、R、Q、H或N；

X₆是T、V、M或I；

X₇是L、V或K；

X₈是E、S、A、D或Q；

X₉是E或F；

X₁₀是G或A；

X₁₁是R或K；

X₁₂是K、R、E、T或Q；

X₁₃是R、K或H；且

X₁₄是E、R或T (SEQ ID NO:8)。

在一些实施方案中，X₃选自G、A、W、P、S、T、F、Y、C、N、Q、D、E、K、V、R或H。

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-E-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-G-Y-V-X₁₄-T-L，其中：

X₁是A、D、或S；

X₂是W或Y；

X₃是除 I以外的任何氨基酸；

X₄是E、A、或Q；

X₅是K、G、R或Q；

X₆是T或V；

X₇是L或V；

X₈是E、S或A；

X₁₀是G或A；

X₁₁是R或K；

X₁₂是K、R或E；

X₁₃是R或K；且

X₁₄是E或R (SEQ ID NO:9)。

A-W-X₃-X₄-X₅-T-L-E-E-G-R-X₁₂-X₁₃-G-Y-V-E-T-L，其中：

X₃是除 I以外的任何氨基酸；

X₄是E或A；

X₅是K或G；

X₁₂是K或R；且

X₁₃是R或K (SEQ ID NO:10)。

A-W-X₃-X₄-X₅-T-L-E-E-G-R-X₁₂-X₁₃-G-Y-V-E-T-L，其中：

X₃是K、R、S、G、或A；

X₄是E或A；

X₅是K或G；

X₁₂是K或R；且

X₁₃是R或K (SEQ ID NO:11)。

在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的580位的DNA聚合酶的氨基酸是除D或E以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的580位的DNA聚合酶的氨基酸是除D以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的580位的DNA聚合酶的氨基酸选自L、G、T、Q、A、S、N、R和K。

在一些实施方案中，DNA聚合酶进一步包含在对应于选自SEQ ID NO:1的580和588的位置的一个或多个氨基酸处的突变。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的580位的DNA聚合酶的氨基酸是除D或E以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的580位的DNA聚合酶的氨基酸选自L、G、T、Q、A、S、N、R和K。在一些实施方案中，对应于SEQID NO:1的588位的DNA聚合酶的氨基酸是除I以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的588位的DNA聚合酶的氨基酸选自 L、V、G、A、S、M、F、W、P、R、K、T、C、Y、N、Q、D、E或H。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的588位的DNA聚合酶的氨基酸是T。

各种DNA聚合酶适于本发明的突变。尤其适合的是热稳定聚合酶，包括来自各种嗜热菌(thermophilic bacteria)的野生型或天然存在的热稳定聚合酶，以及通过氨基酸取代、插入或缺失或其他修饰而源自这种野生型或天然存在的酶的合成的热稳定聚合酶。示例性的聚合酶的未修饰形式包括例如CS5、CS6或Z05 DNA聚合酶，或与其具有至少80％、优选至少90%、更优选至少95%的氨基酸序列同一性的功能性DNA聚合酶。其他未修饰的聚合酶包括例如来自于下列嗜热菌中任一种的DNA聚合酶(或与这种聚合酶具有至少80%、优选至少90%、更优选至少95%的氨基酸序列同一性的功能性DNA聚合酶)：海栖热袍菌(Thermotogamaritima)(SEQ ID NO:34)；水生栖热菌(Thermus aquaticus)(SEQ ID NO:2)；嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)(SEQ ID NO:6)；黄栖热菌(Thermus flavus)(SEQ ID NO:4)；丝状栖热菌(Thermus filiformis)(SEQ ID NO:3)；栖热菌种Sps17(Thermus sp.sps17)(SEQID NO:5)；栖热菌种Z05(Thermus sp.Z05)(SEQ ID NO:1)；那不勒斯栖热袍菌(Thermotoganeopolitana)(SEQ ID NO:35)；非洲栖热腔菌(Thermosipho africanus)(SEQ ID NO:33)；Thermus caldophilus (SEQ ID NO:7)，耐放射异常球菌(Deinococcus radiodurans)(SEQ ID NO:32)，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus) (SEQ ID NO:36)或热坚芽孢杆菌(Bacillus caldotenax)(SEQ ID NO:37)。合适的聚合酶还包括具有逆转录酶(RT)活性和/或能够掺入非常规核苷酸如核糖核苷酸或其他2'-修饰的核苷酸的那些。

尽管具有有效的逆转录酶活性的热稳定性DNA聚合酶尤其适合用于进行RT-PCR，尤其适合单一酶RT-PCR，具有有效的逆转录酶活性的热活性的、但不是热稳定的DNA聚合酶也适于本发明的突变。例如，增强的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率、和/或RT抑制剂的耐受性的属性对于RT-PCR中的RT步骤是重要的，且该步骤不需要在失活热活性但非热稳定的DNA聚合酶的温度下进行。RT步骤后，热稳定的DNA聚合酶可以进行添加，或者它可以已经包括在反应混合物中以进行PCR扩增步骤。该第二种方法将特别有利的，其通过使用经化学修饰的热稳定DNA聚合酶(或其他的HotStart技术以失活热稳定DNA聚合酶)，从而使得它在RT步骤期间没有完全活性。具有高效逆转录活性的热活性但非热稳定的DNA聚合酶的一个实例是来自生氢氧化碳嗜热菌(Carboxydothermus hydrogenoformans)的DNA聚合酶(Chy；SEQ ID NO:48)。参见，例如，美国专利号6,468,775和6,399,320。

在一些实施方案中，DNA聚合酶与选自下列的聚合酶具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％的氨基酸序列同一性：

(a) 栖热菌种Z05DNA聚合酶(Z05) (SEQ ID NO:1)；

(b) 水生栖热菌DNA聚合酶(Taq) (SEQ ID NO:2)；

(c) 丝状栖热菌DNA聚合酶(Tfi) (SEQ ID NO:3)；

(d) 黄栖热菌DNA聚合酶(Tfl) (SEQ ID NO:4)；

(e) 栖热菌种sps17DNA聚合酶(Sps17) (SEQ ID NO:5)；

(f) 嗜热栖热菌DNA聚合酶(Tth) (SEQ ID NO:6)；

(g) Thermus caldophilus DNA聚合酶(Tca) (SEQ ID NO:7)；和

(h) 生氢氧化碳嗜热菌DNA聚合酶(Chy) (SEQ ID NO:48)。

在一些实施方案中，DNA聚合酶是栖热袍菌DNA聚合酶。例如，在一些实施方案中，DNA聚合酶与选自下列的聚合酶具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％的氨基酸序列同一性：

(a) 海栖热袍菌DNA聚合酶(Tma) (SEQ ID NO:34)；

(b) 那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶(Tne) (SEQ ID NO:35)。

在一些实施方案中，DNA聚合酶与SEQ ID NO:1具有至少80％，优选至少90％，更优选至少95％的氨基酸序列同一性。在一些实施方案中，DNA聚合酶是栖热菌种Z05 DNA聚合酶(Z05)DNA聚合酶，且709位的氨基酸是除 I以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶(即, SEQ ID NO:1)，且709位的氨基酸是除I、L或M以外的任何氨基酸。例如，在一些实施方案中，709位的氨基酸选自G、A、V、R、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K或H。在一些实施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，且709位的氨基酸是K、R、S、G或A。在一些实施方案中，DNA聚合酶是进一步包含580位的取代的Z05 DNA聚合酶，且580位的氨基酸是除D或E以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，且580位的氨基酸是除D以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，DNA聚合酶是Z05 DNA聚合酶，且580位的氨基酸选自L、G、T、Q、A、S、N、R和K。

在一些实施方案中，与对照DNA聚合酶相比较，突变型聚合酶具有增强的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率和/或RT和聚合酶抑制剂的耐受性，其中所述对应于SEQ IDNO:1的588位的热稳定性DNA聚合酶的氨基酸是除I或V以外的任何氨基酸，且其中所述对照DNA聚合酶与热稳定性DNA聚合酶具有相同序列，除了对应于SEQ ID NO:1的588位的对照DNA聚合酶的氨基酸是I或V。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:1的588位的热稳定性DNA聚合酶的氨基酸选自G、A、W、P、S、T、F、Y、C、N、Q、D、E、K、R、L、M、或H。在一些实施方案中，聚合酶在聚合酶结构域中包含基序，所述基序包含

Pro-Asn-Leu-Gln-Asn-X₁-Pro-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-Gly，其中：

X₁是Ile (I)、或Leu (L)；

X₂是除Ile (I)或Val (V)外的任何氨基酸；

X₃是Arg (R)或Lys (K)；

X₄是Thr (T)、Ser (S)或Leu (L)；

X₅是Pro (P)或Glu (E)；且

X₆是Leu (L)或Glu (E) (SEQ ID NO:29)。

突变的或改进的聚合酶可以包括其他非取代的修饰。一种这种修饰是热可逆的共价修饰，其使酶失活，但是在高温，如通常用于多核苷酸延伸的温度下孵育后其被逆转而激活酶。美国专利号5,773, 258和5,677,152中描述了这种热可逆的修饰的示例性试剂。

在一些实施方案中，通过进行实时RT-PCR扩增且检测从pSP64 poly(A)(Promega)的HCV基因型Ib 5’NTR的前800个碱基生成的丙型肝炎病毒(HCV)转录物而确定逆转录酶活性。两个或更多的反应混合物可以具有滴定的拷贝数的丙型肝炎病毒(HCV)转录物(例如，在数个反应混合物中，1:5滴定，1:10滴定，例如，10,000拷贝, 1000拷贝, 100拷贝, 10拷贝, 1拷贝, 0拷贝)。如本文中所述，可以在预先选择的单位时间，将本发明的聚合酶的逆转录酶活性与参照聚合酶(例如，天然存在的或未修饰的聚合酶)的逆转录酶活性相比较。与天然存在的或未修饰的聚合酶相比，具有增强的逆转录酶活性的聚合酶将以更高的效率扩增转录物，或者，将需要更小的PCR循环数来扩增转录物(即，如本文计算，表现出更低的Cp值)。此外，在一些实施方案中，具有改进的RT功能的聚合酶也具有长链RNA(例如，至少500或1000或2000或5000或更多个核苷酸长)模板的改进的复制。

在各种其他方面，本发明提供了编码本文所述的突变的或改进的DNA聚合酶的重组核酸，包含该重组核酸的载体，和用所述载体转化的宿主细胞。在某些实施方案中，所述载体是表达载体。包含这种表达载体的宿主细胞可用于本发明的生产突变的或改进的聚合酶的方法，所述方法通过在适于表达重组核酸的条件下培养宿主细胞。反应混合物和/或试剂盒中可以包含本发明的聚合酶。重组核酸，宿主细胞，载体，表达载体，反应混合物和试剂盒的实施方案如上面和本文中所述。

在另一方面，提供了实施多核苷酸延伸的方法。该方法总体包括在适于引物延伸的条件下将本文所述的具有增强的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率和/或RT和聚合酶抑制剂的耐受性的DNA聚合酶与引物、多核苷酸模板以及三磷酸核苷接触，从而产生延伸的引物。多核苷酸模板可以是例如RNA或DNA模板。在某些实施方案中，多核苷酸模板是RNA。三磷酸核苷可以包括非常规核苷酸如核糖核苷酸和/或标记的核苷酸。此外，引物和/或模板可以包括一个或更多个核苷酸类似物。在一些变型中，多核苷酸延伸方法是用于多核苷酸扩增的方法，包括在适于多核苷酸扩增的条件下将突变的或改进的DNA聚合酶与引物对、多核苷酸模板以及三磷酸核苷接触。多核苷酸延伸反应可以是，例如，PCR，等温延伸，或测序(例如，454测序反应)。在某些实施方案中，引物延伸方法包含聚合酶链式反应(PCR)。多核苷酸模板可以是来自生物样品的任何类型。

任选地，引物延伸反应包含参考或未修饰的聚合酶的实际的或潜在的抑制剂。抑制剂可以抑制参考或未修饰(对照)聚合酶的核酸延伸速率和/或逆转录效率。在一些实施方案中，抑制剂是血红蛋白或其降解产物。例如，在一些实施方案中，血红蛋白降解产物是血红素分解产物，如氯高铁血红素、血卟啉、或胆红素。在一些实施方案中，抑制剂是铁螯合剂或紫色素。在其他实施方案中，抑制剂是肝素或黑色素。在某些实施方案中，抑制剂是嵌入染料。在一些实施方案中，嵌入染料是[2-[N-双-(3-二甲基氨基丙基)-氨基]-4-[2,3-二氢-3-甲基-(苯并-1,3-噻唑-2-基)-亚甲基]-1-苯基-喹啉鎓]+。在一些实施方案中，嵌入染料是[2-[N-(3-二甲基氨基丙基)-N-丙基氨基]-4-[2,3-二氢-3-甲基-(苯并-1,3-噻唑-2-基)-亚甲基]-1-苯基-喹啉鎓]+。在一些实施方案中，嵌入染料不是[2-[N-(3-二甲基氨基丙基)-N-丙基氨基]-4-[2,3-二氢-3-甲基-(苯并-1,3-噻唑-2-基)-亚甲基]-1-苯基-喹啉鎓]+。在一些实施方案中，适用于延伸的条件包含Mg⁺⁺。在一些实施方案中，适用于延伸的条件包含Mn⁺⁺。

本发明还提供了用于这种多核苷酸延伸方法中的试剂盒。通常，试剂盒包括至少一个提供本文所述的突变的或改进的DNA聚合酶的容器。在某些实施方案中，试剂盒进一步包括提供一种或更多种额外试剂的一个或更多个额外的容器。例如，在特定的变型中，一个或更多个额外的容器提供三磷酸核苷；适于多核苷酸延伸的缓冲剂；和/或在多核苷酸延伸条件下与预定的多核苷酸模板杂交的一种或多种引物或探针多核苷酸。多核苷酸模板可以是来自生物样品的任何类型。

进一步提供了包含本发明的聚合酶的反应混合物。反应混合物也可以包含模板核酸(DNA和/或RNA)，一种或多种引物或探针多核苷酸，三磷酸核苷(包括，例如，脱氧核糖核苷三磷酸，核糖核苷三磷酸，标记的三磷酸核苷，非常规的三磷酸核苷)，缓冲剂，盐，标记(例如，荧光团)。在一些实施方案中，多核苷酸模板是RNA。在一些实施方案中，反应混合物包含铁螯合剂或紫色染料。在某些实施方案中，反应混合物包含血红蛋白、或血红蛋白的降解产物。例如，在某些实施方案中，血红蛋白的降解产物包括血红素分解产物(如氯高铁血红素、高铁血红素、hematophoryn和胆红素)。在其他实施方案中，反应混合物包含肝素或其盐。任选地，反应混合物包含嵌入染料(包括但不限于上述那些或本文其他地方描述的那些)。在某些实施方案中，反应混合物含有从血液分离的模板核酸。在其他实施方案中，模板核酸是RNA，且反应混合物包含肝素或其盐。

本文描述了本发明的进一步的实施方案。

定义

除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同的意义。尽管基本上与本文所述的那些相似的任何方法和材料都可用于本发明的实践或试验，但是仅仅描述了示例性的方法和材料。对于本发明的目的，下列术语定义如下。

术语 “一(a)，”“一(an)，”和“该(the)”包括复数对象，除非上下文清楚地指出别的含义。

“氨基酸”是指可以并入肽、多肽或蛋白的任何单体单位。如本文所用，术语“氨基酸”包括下列20种天然或遗传编码的α-氨基酸：丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷胺酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、甲硫氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)和缬氨酸(Val或V)。在其中“X”残基没有定义的情况下，这些应该定义为“任何氨基酸”。这20种天然氨基酸的结构见例如Stryer 等,BioChemistry, 5^th ed., Freeman and Company(2002)。额外的氨基酸如硒代半胱氨酸和吡咯赖氨酸也能够被遗传编码(Stadtman (1996) “Selenocysteine,”Annu Rev Biochem. 65:83-100和Ibba等(2002) “Genetic code: introducing pyrrolysine,”Curr Biol. 12(13):R464-R466)。术语“氨基酸”还包括非天然氨基酸、修饰的氨基酸(例如，具有修饰的侧链和/或骨架)和氨基酸类似物。参见，例如Zhang等(2004) “Selectiveincorporation of 5-hydroxytryptophan into proteins in mammalian cells,”Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24):8882-8887, Anderson等(2004) “An expandedgenetic code with a functional quadruplet codon”Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(20):7566-7571, Ikeda等(2003) “Synthesis of a novel histidineanalogue and its efficient incorporation into a protein in vivo,”Protein Eng. Des. Sel. 16(9):699-706, Chin等(2003) “An Expanded Eukaryotic GeneticCode,”Science 301(5635):964-967, James等(2001) “Kinetic characterization ofribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanineresidues,”Protein Eng. Des. Sel. 14(12):983-991, Kohrer等(2001) “Import ofamber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells: A general approach tosite-specific insertion of amino acid analogues into proteins,”Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25):14310-14315, Bacher等(2001) “Selection andCharacterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on anOtherwise Toxic Tryptophan Analogue,”J. Bacteriol. 183(18):5414-5425,Hamano-Takaku等(2000) “A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA SynthetaseUtilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently thanTyrosine,”J. Biol. Chem. 275(51):40324-40328, 和Budisa等(2001) “Proteinswith {beta}-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophores andpharmaceutically active amino acids,”Protein Sci. 10(7):1281-1292。

为了进一步说明，氨基酸典型地为包括取代的或未取代的氨基、取代的或未取代的羧基和一种或多种侧链或基团，或这些基团的任一种的类似物的有机酸。示例性的侧链包括，例如巯基、硒基、磺酰基、烷基、芳基、酰基、酮基、叠氮基、羟基、肼、氰基、卤素、酰肼、链烯基、炔基、醚基、硼酸酯(borate)、硼酸盐(boronate)、二氧磷基、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺或这些基团的任何组合。其他代表性的氨基酸包括但不限于，包含光敏交联剂的氨基酸、金属结合氨基酸、自旋标记的氨基酸、发荧光的氨基酸、包含金属的氨基酸、含新官能团的氨基酸、与其他分子共价或非共价相互作用的氨基酸、对光不稳(photocaged)和/或可光异构化的氨基酸、放射性氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化的氨基酸、其他碳水化合物修饰的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、重原子取代的氨基酸、化学可裂的和/或光可裂的氨基酸、包含碳连接糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、包含氨基硫代酸的氨基酸和包含一个或多个毒性部分的氨基酸。

术语“生物样品”涵盖从生物体获得的各种各样的样品类型，且可以用于诊断或监测测定中。该术语涵盖尿液、尿液沉渣、血液、唾液、和其他生物来源的液体样品、实体组织样品，如活检样本或组织培养物或由其衍生的细胞和其后代。该术语涵盖在其获得后以任何方式操作，如通过用试剂处理、溶解、沉降、或针对某些成分进行富集的样品。该术语涵盖临床样品，还包括细胞培养物中的细胞、细胞上清液、细胞裂解液、血清、血浆、生物体液和组织样品。

在本发明的DNA聚合酶上下文中的术语“突变体”是指相对于对应的功能性的DNA聚合酶包含一个或多个氨基酸取代的多肽，典型为重组的。

在突变型聚合酶上下文中的术语“未修饰的形式”在本文中是用来定义本发明的突变型DNA聚合酶的术语：术语“未修饰的形式”是指具有除指定为表征突变型聚合酶的一个或多个氨基酸位置以外的突变型聚合酶的氨基酸序列的功能性DNA聚合酶。因此，在(a)其未修饰的形式和(b)一个或多个特定氨基酸取代的方面提到突变型DNA聚合酶是指除特定的氨基酸取代以外，突变型聚合酶在特定的基序中另外具有与未修饰的形式相同的氨基酸序列。“未修饰的聚合酶”(和因此还有具有增强的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率和/或RT和聚合酶抑制剂的耐受性的修饰的形式)可以包含额外的突变以提供期望的功能性，例如双脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、核糖核苷酸类似物、染料标记的核苷酸的改进的掺入，调节5'-核酸酶活性，调节3'-核酸酶(或校正)活性等。因此，在实施本文所述的本发明时，DNA聚合酶的未修饰的形式是预先确定的。DNA聚合酶的未修饰的形式可以是，例如野生型和/或天然存在的DNA聚合酶，或已经有意识地修饰过的DNA聚合酶。聚合酶的未修饰的形式优选热稳定DNA聚合酶，如来自各种嗜热菌的DNA聚合酶以及与野生型或天然存在的热稳定聚合酶具有基本上序列同一性的其功能性变体。这种变体可以包括，例如，嵌合DNA聚合酶，如美国专利号6,228,628和7,148,049中所述的嵌合DNA聚合酶。在某些实施方案中，聚合酶的未修饰的形式具有逆转录酶(RT)活性。

术语“热稳定聚合酶”是指对热稳定的酶，其是耐热的，当经受高温并持续影响双链核酸变性所必需的时间时，其保留足够的活性以影响随后的多核苷酸延伸反应，并且没有变得不可逆变性的(失活的)。核酸变性所需的加热条件是本领域公知的，在例如美国专利号4,683,202、4,683,195和4,965,188中举例说明。如本文所述，热稳定聚合酶适于在温度循环变化的反应如聚合酶链式反应(“PCR”)中使用。用于本文目的的不可逆变性指酶活性的永久且完全的损失。对于热稳定聚合酶，酶活性是指以适当的方式催化核苷酸的组合以形成与模板核酸链互补的多核苷酸延伸产物。来自嗜热菌的热稳定DNA聚合酶包括，例如来自海栖热袍菌，水生栖热菌，嗜热栖热菌，黄栖热菌，丝状栖热菌，栖热菌种sps17，栖热菌种Z05，Thermus caldophilus，热坚芽孢杆菌，那不勒斯栖热袍菌和非洲栖热腔菌的DNA聚合酶。

术语“热活性的”是指在通常用于RT-PCR和/或PCR反应中逆转录或退火/延伸步骤的温度(即，45-80℃)保持催化性能的酶。热稳定酶是当经受对于核酸变性所必需的高温时不会被不可逆地失活或变性的那些酶。热活性的酶可以是或可以不是热稳定的。热活性的DNA聚合酶可以是DNA或RNA依赖于嗜热种或依赖于嗜常温种，包括但不限于，大肠杆菌，莫洛尼小鼠白血病病毒(Moloneymurine leukemia viruses)和禽成髓细胞瘤病毒(Avianmyoblastosis virus)。

如本文使用的，“嵌合”蛋白是指氨基酸序列代表来自至少两种不同蛋白的氨基酸序列的子序列的融合产物的蛋白。嵌合蛋白典型地不是通过氨基酸序列的直接操作产生，而是从编码该嵌合氨基酸序列的“嵌合”基因表达的。在某些实施方案中，例如，本发明的突变型DNA聚合酶的未修饰形式是由来源于栖热菌种DNA聚合酶的氨基末端(N-末端)区域和来源于Tma DNA聚合酶的羧基末端(C-末端)区域组成的嵌合蛋白。N-末端区域是指从N-末端(氨基酸位置1)延伸到内部氨基酸的区域。类似地，C-末端区域是指从内部氨基酸延伸到C-末端的区域。

术语“适配子”是指识别并结合DNA聚合酶并有效抑制聚合酶活性的单链DNA，如美国专利号5,693,502中所述。还讨论了适配子和dUTP/UNG在RT-PCR中的用途，例如在Smith,E.S.等人(Amplification of RNA: High-temperature Reverse Transcription and DNAAmplification with a Magnesium-activated Thermostable DNA Polymerase, in PCRPrimer: A Laboratory Manual, 第2版, Dieffenbach, C.W.和Dveksler, G.S.,编辑,Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 211-219,(2003))。

在突变型DNA聚合酶的上下文中，与另一条序列(例如区域、片段、核苷酸或氨基酸位置等)的“对应”是基于根据核苷酸或氨基酸位置数编号并且然后以最大化序列同一性百分比的方式比对序列的规则。“对应于[特定序列]的[X]位”的氨基酸是指与指定的序列的等同氨基酸比对目的多肽的氨基酸。通常，如本文中所述，对应于聚合酶的位置的氨基酸可以使用比对算法诸如如下所述的BLAST来确定。因为不是给定的“对应区域”内的所有位置都需要是相同的，所以对应区域内的非匹配位置可以被认为是“对应位置”。因此，如本文使用的，特定DNA聚合酶的“对应于氨基酸位置[X]的氨基酸位置”是指，基于比对，在其他DNA聚合酶和结构同源物和家族中的等效位置。在本发明的一些实施方案中，氨基酸位置的“对应”是根据包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、32、33、34、35、36、37或48的一个或多个基序的聚合酶区域来确定的。当聚合酶多肽序列不同于SEQ ID NOS:1、2、3、4、5、6、7、32、33、34、35、36、37或48(例如，通过氨基酸的变化或氨基酸的增加或缺失)时，可能与本文所讨论的改进的活性相关的特定突变将不是在与它在SEQ ID NOS:1、2、3、4、5、6、7、32、33、34、35、36、37或48中相同的位置数。例如，在表1中说明了这一点。

如本文使用的，“重组体”是指已经通过重组方法有意识地修饰过的氨基酸序列或核苷酸序列。本文中的术语“重组核酸”是指通常通过限制性内切核酸酶的核酸操作，最初在体外形成的以自然中通常不存在的形式的核酸。因此，线性形式的分离的突变型DNA聚合酶核酸或通过连接通常不结合的DNA分子体外形成的表达载体都被认为是用于本发明的目的的重组体。可以理解的是，一旦重组核酸被制备并重新引入宿主细胞，它将非重组地复制，即，使用宿主细胞的体内细胞机制而不是体外操作；然而，这种核酸一旦重组产生，尽管随后非重组复制，仍然被认为是用于本发明的目的的重组体。“重组蛋白”是使用重组技术，即通过上述重组核酸的表达制备的蛋白。

当被置于与另一种核酸序列的功能性关系时核酸是“可操作连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么它是与编码序列可操作连接的；或者如果核糖体结合位点被定位以促进翻译，那么它是与编码序列可操作连接的。

术语“宿主细胞”是指单细胞的原核生物和真核生物有机体(例如细菌、酵母和放线菌)以及细胞培养物中生长的来自高等植物或者动物的单个细胞。

术语“载体”指一条DNA，典型是双链的，它可以是其中已经插入了一条外源DNA的。载体可以是例如质粒来源的。载体包含在宿主细胞中促进载体的自主复制的“复制子”多核苷酸序列。外源DNA定义为异源的DNA，其是在宿主细胞中天然不存在的DNA，例如，其复制载体分子，编码可选择或可筛选的标记，或者编码转基因。载体用于转运外源的或异源的DNA进入合适的宿主细胞。一旦在宿主细胞中，载体可以独立于宿主染色体DNA复制或与宿主染色体DNA同时复制，可以产生数个拷贝的载体及其插入的DNA。另外，载体还可以包含容许插入的DNA转录为mRNA分子或者使插入的DNA复制为多拷贝的RNA的必要元件。一些表达载体还包括插入的DNA附近的序列元件，其增加表达的mRNA的半衰期，和/或允许所述mRNA翻译为蛋白分子。因此，可以迅速地合成插入的DNA编码的mRNA和多肽的许多分子。

术语“核苷酸”，除了是指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体以外，本文中还应当理解为是指其相关的结构变体，包括衍生物和类似物，其对于使用该核苷酸的特定上下文(例如，与互补碱基杂交)在功能上是等效的，除非上下文明确另外指明。

术语“核酸”或“多核苷酸”是指聚合物，其可以对应于核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)聚合物或其类似物。这包括核苷酸的聚合物如RNA和DNA，以及其合成形式、修饰(例如化学或生物化学修饰的)形式，和混合聚合物(例如包括RNA和DNA亚单位)。示例性的修饰包括甲基化，用类似物取代一个或更多个天然存在的核苷酸，核苷酸间的修饰如不带电的键(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酸酰胺化物、氨基甲酸盐等)，侧面部分(例如多肽)，嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)，螯合剂，烷化剂，和修饰的键(例如α异头核酸等)。还包括模拟多核苷酸通过氢键及其他化学相互作用与指定序列结合的能力的合成分子。虽然合成形式的核酸可以包括其他键(例如，Nielsen 等(Science 254:1497 - 1500, 1991)描述的肽核酸)，典型地核苷酸单体通过磷酸二酯键连接。核酸可以是或可以包括，例如，染色体或染色体区段、载体(例如表达载体)、表达盒、裸DNA或RNA聚合物、聚合酶链式反应(PCR)的产物、寡核苷酸、探针和引物。核酸可以是，例如，单链、双链、或三链的，并且不限于任何特定的长度。除非另外指出，除任何明确指出的序列以外，特定的核酸序列任选地包含或编码互补序列。

术语“寡核苷酸”是指包括至少2个核酸单体单位(例如核苷酸)的核酸。寡核苷酸典型地包括约6-约175个核酸单体单位，更典型地约8-约100个核酸单体单位，仍更典型地约10-约50个核酸单体单位(例如约15，约20，约25，约30，约35，或更多的核酸单体单位)。寡核苷酸的确切大小取决于许多因素，包括该寡核苷酸的最终功能或用途。寡核苷酸任选地通过任何合适的方法制备，包括但不限于现有或天然序列的分离，DNA复制或扩增，逆转录，适当序列的克隆和限制性消化，或通过例如，Narang等的磷酸三酯法 (Meth. Enzymol.68:90-99, 1979)；Brown等的磷酸二酯法(Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979)；Beaucage等的二乙基亚磷酰胺法(Tetrahedron Lett. 22:1859-1862, 1981)；Matteucci 等的三酯法(J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981)；自动合成法；或美国专利号4,458,066的固相支持法，或本领域技术人员已知的其他方法的方法直接化学合成。

本文中使用的术语“引物”是指当置于起始多核苷酸延伸的条件下(例如，在包括在适当的缓冲液中存在所需的三磷酸核苷(在要拷贝的模板支配下)和聚合酶以及在合适的温度或温度的循环(例如在聚合酶链式反应中)的条件下)能够作为模板引导的核酸合成的起始点的多核苷酸。为了进一步说明，引物还可以用于多种其他寡核苷酸介导的合成过程，包括作为RNA从头合成和体外转录相关的过程(例如基于核酸序列的扩增(NASBA)、转录介导的扩增(TMA)等)的引发剂。引物典型是单链寡核苷酸(例如寡脱氧核糖核苷酸)。引物的适当长度取决于该引物预期的用途，但是典型地为6-40个核苷酸，更典型地为15-35个核苷酸。短的引物分子通常需要更低的温度以与模板形成足够稳定的杂合复合物。引物不需要反映模板的精确序列，但是必须是足够互补的以便与模板杂交来发生引物延伸。在某些实施方案中，术语“引物对”表示一组引物，其包括与扩增的核酸序列的5'末端的互补序列杂交的5'有义引物(有时称为"正向")以及与扩增的序列的3'末端杂交的3'反义引物(有时称为"反向")(例如，如果目标序列作为RNA表达或者是RNA)。如果需要，可以通过掺入用光谱学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的或化学的方法可检测的标记来标记引物。例如，有用的标记包括³²P、荧光染料、电子致密试剂、酶(通常用于ELISA测定中)、生物素、或者存在抗血清或单克隆抗体的半抗原和蛋白。

当涉及核酸碱基、三磷酸核苷或核苷酸时，术语“常规的”或“天然的”是指描述的多核苷酸中天然存在的那些(即,对于DNA，这些是dATP、dGTP、dCTP和dTTP)。另外，在体外DNA合成反应如测序中，经常采用dITP和7-脱氮-dGTP来代替dGTP，经常采用7-脱氮-dATP来代替dATP。共同地，这些称为dNTPs。

当涉及核酸碱基、核苷或核苷酸时，术语“非常规的”或“修饰的”包括在特定的多核苷酸中天然存在的常规的碱基、核苷或核苷酸的修饰物、衍生物或类似物。与常规的dNTPs相比，某些非常规核苷酸在核糖的2'位置修饰。因此，尽管对于RNA，天然存在的核苷酸是核糖核苷酸(即ATP、GTP、CTP、UTP，共称rNTPs)，因为这些核苷酸具有在糖的2'位的羟基，与之相比，dNTPs中没有所述羟基，如本文使用的，作为DNA聚合酶的底物的核糖核苷酸可以是非常规的核苷酸。如本文使用的，非常规的核苷酸包括但不限于在核酸测序中用作终止剂的化合物。示例性的终止剂化合物包括但不限于具有2',3'双脱氧结构的称为双脱氧核苷三磷酸的那些化合物。双脱氧核苷三磷酸ddATP、ddTTP、ddCTP和ddGTP共同地称为ddNTPs。终止剂化合物的其他实例包括核糖核苷酸的2'-PO₄类似物(参见，例如美国申请公开号2005/0037991和2005/0037398)。其他非常规的核苷酸包括硫代磷酸酯dNTPs([[α]-S]dNTPs)、5'-[α-硼烷(borano)]-dNTPs、[α]-膦酸甲酯dNTPs和核糖核苷三磷酸(rNTPs)。可以用放射性同位素如³²P、³³P或³⁵S；荧光标记；化学发光标记；生物发光标记；半抗原标记如生物素；或者酶标记如链霉亲和素或亲和素来标记非常规的碱基。荧光标记可以包括带负电荷的染料，如荧光素家族的染料，或者电荷中性的染料，如罗丹明家族的染料，或者带正电荷的染料，如花菁家族的染料。荧光素家族的染料包括，例如FAM、HEX、TET、JOE、NAN和ZOE。罗丹明家族的染料包括Texas Red、ROX、R110、R6G和TAMRA。Perkin-Elmer(Boston,MA)、Applied Biosystems(Foster City, CA)或Invitrogen/Molecular Probes(Eugene,OR)销售各种染料或用FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G、Texas Red和TAMRA标记的核苷酸。花菁家族的染料包括Cy2、Cy3、Cy5和Cy7，由GE Healthcare UK Limited(Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, England)销售。

如本文使用的，通过在比较窗口比较两个最佳比对的序列来确定“序列同一性百分比”，其中对于两个序列的最佳比对，在比较窗口中的序列部分与参照序列(其不包括增加或缺失)相比可以包括增加或缺失(即缺口)。通过确定存在于两个序列中相同的核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量以得到匹配位置的数量，用匹配位置的数量除以比较窗口中的位置总数并用100乘以该结果以得到序列同一性百分比来计算百分比。

在两个或更多个核酸或多肽序列的上下文中的术语“相同的”或百分比“同一性”是指相同的两个或更多个序列或子序列(subsequences)。当如使用下列序列比较算法中的一种或通过手工比对并目视检查所测量而在比较窗口或者指定的区域比较并比对最大对应时，如果它们具有特定百分比的相同的核苷酸或氨基酸残基(例如，在特定区域，至少20％，至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％，至少55％，至少60％，至少65％，至少70％，至少75％，至少80％，至少85％，至少90％或至少95％同一性))，序列是彼此“基本上相同的”。如果序列是至少20%、至少25％，至少30％，至少35％，至少40％，至少45％，至少50％或至少55％相同，则该序列是彼此“基本上相同的”。这些定义也是指测试序列的互补序列。任选地，同一性存在于至少约50个核苷酸长度的区域中，或更典型地在100-500个或1000个或更多核苷酸长度的区域中。

在两个或更多多肽序列的上下文中，术语“相似性”或“百分比相似性”是指当如使用下列序列比较算法中的一种或通过手工比对并目视检查所测量而在比较窗口或者指定的区域比较并比对最大对应时，具有特定百分比相同的或通过保守氨基酸取代定义为相似的氨基酸残基(例如，在特定区域内60%相似性，任选地65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%相似的)的两个或更多个序列或子序列。如果序列至少20%，至少25%，至少30%，至少35%，至少40%，至少45%，至少50%，或者至少55%彼此相似，那么它们彼此是“基本上相似的”。任选地，这种相似性存在于至少约50个氨基酸长度的区域中，或更典型地在至少约100-500个或1000个或更多氨基酸长度的区域中。

对于序列比较，通常以一个序列作为参照序列，用测试序列与之比较。当使用序列比较算法时，将试验和参照序列输入电脑，指定子序列坐标(coordinate)，如果必要，指定序列算法程序参数。通常使用默认程序参数，或者可以指定另外的参数。然后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参照序列的百分比序列同一性或相似性。

如本文使用的，“比较窗口”包括涉及选自20-600，通常约50-约200，更通常约100-约150的任一数量的连续位置的区段，其中在两个序列最佳比对后可以将序列与相同数量的连续位置的参照序列比较。用于比较的序列比对方法是本领域公知的。可以，例如，通过Smith和Waterman的局部同源性算法(Adv. Appl. Math. 2:482, 1970)，通过Needleman和Wunsch的同源性比对算法(J. Mol. Biol. 48:443, 1970)，通过Pearson和Lipman的搜索相似性法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988)，通过这些算法的计算机化执行(例如，the Wisconsin Genetics Software Package中的GAP, BESTFIT, FASTA, 和TFASTA, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)，或者通过手工比对和目测检查(参见，例如，Ausubel 等, Current Protocols in Molecular Biology(1995 supplement))实施比较的最佳序列比对。

适合用于确定百分比序列同一性和序列相似性的算法的实例是BLAST和BLAST2.0算法，其分别由Altschul等(Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977)和Altschul等(J.Mol. Biol. 215:403-10, 1990)描述。用于执行BLAST分析的软件可通过国立生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开地获得。该算法涉及：首先通过在查询序列中鉴别长度W的短字段来鉴别高评分序列对(HSPs)，其在与数据库序列中相同长度字段比对时匹配或满足一些阳性值得阈值评分T。T被认为是邻近字段评分阈值(上述Altschul等)。这些最初的邻近字段命中作为起始搜索的种子以发现包含它们的更长HSPs。字段命中沿着各序列双向延伸，只要累计的比对评分增加。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖分；始终大于0)和N(错配残基的罚分；始终小于0)来计算累计评分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累计评分。字段命中在各方向的延伸停止于：累计比对评分从它最大获得值降低数量X时；由于一个或更多个负分残基比对的累积，累计分数达到或低于0时；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用字长(W)11，期望值(E)10，M=5，N=-4作为默认值，并比较两条链。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用字长3，期望值(E)10，和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915, 1989)比对(B)50，期望值(E)10，M=5，N=-4作为默认值，并比较两条链。

BLAST算法也执行两个序列之间相似性的统计分析(参见，例如，Karlin 和Altschul, ProC. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-87, 1993)。BLAST算法提供的一种相似性的量度是最小总和概率(P((N))，其提供两个核苷酸或氨基酸序列之间匹配偶然发生的概率的指标。例如，如果在测试核酸与参照核酸的比较中最小总和概率低于约0.2，典型地低于约0.01，以及更典型地低于约0.001，那么该核酸被认为与参照序列是相似的。

术语“逆转录效率”指的是在给定的逆转录反应中RNA分子逆转录为cDNA的分数。在特定的实施方案中，相对于这些DNA聚合酶未经修饰的形式，本发明的突变型DNA聚合酶具有改进的逆转录效率。也就是说，在一组特定的反应条件下，这些突变型DNA聚合酶比它们的未经修饰的形式逆转录更高分数的RNA模板。逆转录效率可以进行测量，例如，通过测量使用RNA模板的PCR反应的交叉点(Cp)且比较该Cp值与其中扩增相同序列的DNA模板(除U被T替换以外)的对照反应的Cp值，其中所述RNA和DNA扩增使用通用引物组和相同的聚合酶，例如，如实施例中所述。当测试聚合酶与使用RNA作为模板的对照聚合酶相比具有降低的Cp值、但相对于使用DNA作为模板的对照聚合酶具有基本不变的Cp值时，测试聚合物具有改进的RT效率。在一些实施方案中，本发明的聚合酶具有改进的RT效率，从而使得与相应对照聚合酶在RNA模板上相比，Cp值小至少一个、两个、三个、四个或五个单位。

术语“错配耐受性”是指当以模板依赖方式通过将一个或更多个核苷酸连接(例如共价地)于核酸而延伸核酸(例如，引物或其他寡核苷酸)时，聚合酶耐受包含错配的序列的能力。术语“3’错配耐受性”是指当被延伸的核酸(例如，引物或其他寡核苷酸)与其模板在引物的3’末端核酸处有错配时，聚合酶耐受包含错配(接近互补)的序列的能力。与模板的错配也可以位于引物的3’倒数第二个核苷酸处，或位于引物序列内的另一个位置处。

术语“错配辨别力”是指当通过将一个或更多个核苷酸连接(例如共价地)于核酸而以模板依赖方式延伸核酸(例如，引物或其他寡核苷酸)时，聚合酶区分完全互补的序列与包含错配的序列的能力。术语“3’-错配辨别力”是指当被延伸的核酸(例如，引物或其他寡核苷酸)与该核酸杂交的模板相比在核酸的3’末端处有错配时，聚合酶区分完全互补的序列与包含错配(接近互补)的序列的能力。术语“错配”是指在否则互补的形成双链体(或可能形成双链体)的一段序列内一个或多个碱基错配(或“不互补碱基反向”)的存在。

术语“Cp值”或“交叉点”值是指允许定量投入的目标核酸的值。可以根据二阶导数最大法(the second-derivative maximum method)确定Cp值(Van Luu-The,等,“Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements usingsecond derivative calculation and double correction,” BioTechniques, Vol. 38,No. 2, February 2005, pp. 287–293)。在二阶导数法中，Cp对应二阶导数曲线的第一峰。此峰对应对数线性相(log-linear phase)的开始。二阶导数法计算实时荧光强度曲线的二阶导数值，仅获得一个值。初始Cp方法基于强度值的局部定义的可区分的近似值，例如，通过多项式函数。然后计算三阶导数。Cp值是三阶导数的最小的根(root)。可以使用拟合点法确定Cp，其中通过在对数线性区域中平行线与阈值线的交叉确定Cp(Van Luu-The,等,BioTechniques, Vol. 38, No. 2, February 2005, pp.287–293)。Roche提供的LightCycler仪器通过根据二阶导数最大法计算而提供Cp值。

术语“PCR效率”是指循环至循环扩增效率的指标。使用公式：% PCR效率 = (10^(-斜率)-1) x 100计算每种条件的PCR效率，其中通过y-轴上绘制的对数拷贝数和x-轴上绘制的Cp的线性回归而计算斜率。可以使用完全匹配或错配的引物模板测量PCR效率。

术语“核酸延伸速率”指的是生物催化剂(例如酶，诸如聚合酶、连接酶等)以模板依赖或非模板依赖方式把一个或更多个核苷酸加到核酸上(例如共价地)来延伸该核酸(例如，引物或其他寡核苷酸)的速率。此处描述的特定的突变型DNA聚合酶相对于这些DNA聚合酶的未修饰形式具有改进的核酸延伸速率，使得在一组给定的反应条件下它们可以以比这些未经修饰的形式更高的速率延伸引物。

术语“RT和聚合酶抑制剂的耐受性”是指在一定量的抑制对照聚合酶的聚合酶活性或逆转录活性的抑制剂存在的情况下聚合酶维持活性(聚合酶或逆转录活性)的能力。在一些实施方案中，改进的聚合酶在一定量的基本上消除对照聚合酶活性的抑制剂存在的情况下能够具有聚合酶或逆转录活性。“对照聚合酶”是指包含对应于SEQ ID NO:1的709位的异亮氨酸(I)、但在其他方面与改进的聚合酶相同的聚合酶。

术语“5’-核酸酶探针”是指包含至少一个发光标记部分并用于5’-核酸酶反应中以影响目标核酸检测的寡核苷酸。在一些实施方案中，例如，5'-核酸酶探针仅包括单一的发光部分(例如，荧光染料等)。在某些实施方案中，5'-核酸酶探针包括自我互补的区域，使得该探针能够在选择的条件下形成发夹结构。为了进一步说明，在一些实施方案中，5'-核酸酶探针包括至少两个标记部分，在两个标记之一被裂解或者从寡核苷酸分离后发射增加强度的辐射。在某些实施方案中，用两种不同的荧光染料，例如，5'末端报告染料和3'末端猝灭染料或部分标记5'-核酸酶探针。在一些实施方案中，在不同于或除了末端位置以外的一个或多个位置标记5'-核酸酶探针。当探针完整时，通常在两个荧光团之间发生能量转移，使得从报告染料的荧光发射至少部分猝灭。在聚合酶链式反应的延伸步骤期间，例如，通过，例如，Taq聚合酶或具有这种活性的另一种聚合酶的5'至3'核酸酶活性裂解结合至模板核酸的5'-核酸酶探针，使得报告染料的荧光发射不再被猝灭。示例性的5'-核酸酶探针也描述在，例如，美国专利号5,210,015、美国专利号5,994,056、和美国专利号6,171,785中。在其他实施方案中，可以用两种或更多种不同的报告染料和3'末端猝灭染料或部分标记5'核酸酶探针。

术语“FRET”或“荧光共振能量转移”或“Foerster共振能量转移”是指至少两个发色团、供体发色团和受体发色团(被称为猝灭剂)之间的能量转移。当供体被具有合适波长的光辐射激发时，供体通常将能量转移至受体。受体通常以具有不同的波长的光辐射的形式重新发射转移的能量。当受体是“黑暗”猝灭剂时，它耗散除光以外的形式的转移的能量。特定的荧光团是否作为供体或受体起作用取决于FRET对其他成员的特性。常用的供体-受体对包括FAM-TAMRA对。常用的猝灭剂是DABCYL和TAMRA。常用的黑暗猝灭剂包括BlackHoleQuenchers™ (BHQ), (Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.), Iowa Black™(Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa), 和BlackBerry™ Quencher 650(BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.)。

附图简要说明

图1显示来自各种细菌的示例性DNA聚合酶的聚合酶结构域的区域的氨基酸序列比对：栖热菌种Z05 (Z05) (SEQ ID NO:12), 水生栖热菌(Taq) (SEQ ID NO:13), 丝状栖热菌(Tfi) (SEQ ID NO:14), 黄栖热菌(Tfl) (SEQ ID NO:15), 栖热菌种sps17(Sps17) (SEQ ID NO:16), 嗜热栖热菌(Tth) (SEQ ID NO:17), Thermus caldophilus(Tca) (SEQ ID NO:18), 海栖热袍菌(Tma) (SEQ ID NO:19), 那不勒斯栖热袍菌(Tne)(SEQ ID NO:20), 非洲栖热腔菌(Taf) (SEQ ID NO:21), 耐放射异常球菌(Dra) (SEQ IDNO:23), 嗜热脂肪芽孢杆菌(Bst) (SEQ ID NO:24)和热坚芽孢杆菌(Bca) (SEQ ID NO:25)。此外，显示的多肽区域包含氨基酸基序X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-G-Y-V-X₁₄-T-L (SEQ ID NO:26)，其可变位置在本文中进一步定义。对于每种聚合酶序列，这些基序用粗体突出显示。适于根据本发明的突变的氨基酸位置用星号(*)指出。比对中的缺口用点(.)指出。

图2提供了下列DNA聚合酶I酶间的序列同一性：栖热菌种Z05 DNA聚合酶(Z05)；水生栖热菌DNA聚合酶(Taq)；丝状栖热菌DNA聚合酶(Tfi)；黄栖热菌DNA聚合酶(Tfl)；栖热菌种sps17 DNA聚合酶(Sps17)；嗜热栖热菌DNA聚合酶(Tth)；Thermus caldophilus DNA聚合酶(Tca)；耐放射异常球菌DNA聚合酶(Dra)；海栖热袍菌DNA聚合酶(Tma)；那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶(Tne)；非洲栖热腔菌DNA聚合酶(Taf)；嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶(Bst)；和热坚芽孢杆菌DNA聚合酶(Bca)。(A) 整个聚合酶I酶(对应于Z05的氨基酸1-834)的序列同一性；和(B) 对应Z05的氨基酸420-834的聚合酶亚结构域的序列同一性。

图3提供了各种栖热菌种DNA聚合酶I间的序列同一性：栖热菌种Z05 DNA聚合酶(Z05)；水生栖热菌DNA聚合酶(Taq)；丝状栖热菌DNA聚合酶(Tfi)；黄栖热菌DNA聚合酶(Tfl)；栖热菌种sps17DNA聚合酶(Sps17)；嗜热栖热菌DNA聚合酶(Tth)；和Thermuscaldophilus DNA聚合酶(Tca)。(A) 整个聚合酶I酶(对应于Z05的氨基酸1-834)的序列同一性；和(B) 对应Z05的氨基酸420-834的聚合酶亚结构域的序列同一性。

发明详述

本发明提供了改进的DNA聚合酶，其中相对于功能性DNA聚合酶，聚合酶结构域中一个或多个氨基酸已经被突变。相对于聚合酶的未修饰形式，本发明的DNA聚合酶是具有增强的逆转录酶效率(例如，在Mn²⁺ 和Mg²⁺ 二价阳离子存在的情况下)和/或增强的错配耐受性、延伸速率以及RT和聚合酶抑制剂的耐受性的活性酶。在某些实施方案中，可在更低的浓度下使用突变型DNA聚合酶，来达到超过亲本酶或与其等效的性能。

更有效地进行逆转录的DNA聚合酶是有帮助的，例如，在涉及采用RT-PCR来检测和/或定量RNA目标的测定的各种应用中是有帮助的。因此，DNA聚合酶在涉及多核苷酸延伸以及逆转录或多核苷酸模板的扩增的多种应用(包括，例如在重组DNA研究和疾病的医疗诊断中的应用)中是有用的。突变DNA聚合酶也是特别有用的，因为它们对于错配、对于检测可能具有可变序列(例如，病毒目标，或癌症和其他疾病遗传标记)的目标具有耐受性。

本发明的DNA聚合酶的特征在于具有下列基序：

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-Gly-Tyr-Val-X₁₄-Thr-Leu (在本文中也用单字母代码称为X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-G-Y-V-X₁₄-T-L) (SEQID NO:8)；其中

X₁是Ala (A)、Asp (D)、Ser (S)、Glu (E)、Arg (R)或Gln (Q)；

X₂是Trp (W)或Tyr (Y)；

X₃是除Ile (I)、Leu (L)或Met (M)以外的任何氨基酸；

X₄是Glu (E)、Ala (A)、Gln (Q)、Lys (K)、Asn (N)或Asp (D)；

X₅是Lys (K)、Gly (G)、Arg (R)、Gln (Q)、His (H)或Asn (N)；

X₆是Thr (T)、Val (V)、Met (M)或Ile (I)；

X₇是Leu (L)、Val (V)或Lys (K)；

X₈是Glu (E)、Ser (S)、Ala (A)、Asp (D)或Gln (Q)；

X₉是Glu (E)或Phe (F)；

X₁₀是Gly (G)或Ala (A)；

X₁₁是Arg (R)或Lys (K)；

X₁₂是Lys (K)、Arg (R)、Glu (E)、Thr (T)或Gln (Q)；

X₁₃是Arg (R)、Lys (K)或His (H)；且

X₁₄是Glu (E)、Arg (R)或Thr (T)。

在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶的特征在于具有下列基序：

X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-Glu-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-Gly-Tyr-Val-X_a14-Thr-Leu (在本文中也用单字母代码称为X₁-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-E-X₁₀-X₁₁-X₁₂-X₁₃-G-Y-V-X₁₄-T-L) (SEQID NO:9)；其中

X₁是Ala (A)、Asp (D)或Ser (S)；

X₂是Trp (W)或Tyr (Y)；

X₃是除Ile (I)以外的任何氨基酸；

X₄是Glu (E)、Ala (A)或Gln (Q)；

X₅是Lys (K)、Gly (G)、Arg (R)或Gln (Q)；

X₆是Thr (T)或Val (V)；

X₇是Leu (L)或Val (V)；

X₈是Glu (E)、Ser (S)或Ala (A)；

X₁₀是Gly (G)或Ala (A)；

X₁₁是Arg (R)或Lys (K)；

X₁₂是Lys (K)、Arg (R)或Glu (E)；

X₁₃是Arg (R)或Lys (K)；且

X₁₄是Glu (E)或Arg (R)。

Ala-Trp-X₃-X₄-X₅-Thr-Leu-Glu-Glu-Gly-Arg-X₁₂-X₁₃-Gly-Tyr-Val-Glu-Thr-Leu (在本文中也用单字母代码称为A-W-X₃-X₄-X₅-T-L-E-E-G-R-X₁₂-X₁₃-G-Y-V-E-T-L)(SEQ ID NO:10)；其中

X₃是除Ile (I)以外的任何氨基酸；

X₄是Glu (E)或Ala (A)；

X₅是Lys (K)或Gly (G)；

X₁₂是Lys (K)或Arg (R)；且

X₁₃是Arg (R)或Lys (K)。

在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的基序的DNA聚合酶不是SEQ ID NO:2。在一些实施方案中，对应于SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:10的X₃ 位的氨基酸是除Leu (L)以外的任何氨基酸。

Ala-Trp-X₃-X₄-X₅-Thr-Leu-Glu-Glu-Gly-Arg-X₁₂-X₁₃-Gly-Tyr-Val-Glu-Thr-Leu (在本文中也用单字母代码称为A-W-X₃-X₄-X₅-T-L-E-E-G-R- X₁₂-X₁₃-G-Y-V-E-T-L)(SEQ ID NO:11)；其中

X₃是Lys (K)、Arg (R)、Ser (S)、Gly (G)或Ala (A)；

X₄是Glu (E)或Ala (A)；

X₅是Lys (K)或Gly (G)；

X₁₂是Lys (K)或Arg (R)；且

X₁₃是Arg (R)或Lys (K)。

这种基序存在于许多家族A型DNA依赖的DNA聚合酶，尤其是来自嗜热菌的热稳定DNA聚合酶的“手指”结构域中(Li等., EMBO J. 17:7514-7525, 1998)。例如，图1显示了来自下列各种细菌的DNA聚合酶中来自“手指”结构域的区域的氨基酸序列比对：热坚芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，耐放射异常球菌，非洲栖热腔菌，海栖热袍菌, 那不勒斯栖热袍菌，水生栖热菌, Thermus caldophilus，丝状栖热菌, 黄栖热菌，栖热菌种sps17，栖热菌种Z05和嗜热栖热菌。如所示，对应于上述基序的天然序列存在于这些聚合酶中间的每一个中，表明对于聚合酶的该区域的保守功能。图2提供了这些DNA聚合酶间的序列同一性。

因此，在一些实施方案中，本发明提供了包含SEQ ID NO：8、9、10或11并具有本文所述的改进的活性和/或特征的聚合酶，其中所述DNA聚合酶否则是野生型或天然存在的DNA聚合酶，如，例如，来自上面列出的嗜热细菌的任一种的聚合酶，或者与这种野生型或天然存在的DNA聚合酶基本上相同。例如，在一些实施方案中，本发明的聚合酶包括SEQ IDNO：8、9、10或11，与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、32、33、34、35、36、37或48至少80％，85％，90％或95％相同。在一个变型中，聚合酶的未修饰的形式来自于栖热菌种。在本发明的其他实施方案中，未修饰的聚合酶来自除栖热菌以外的嗜热菌种，例如栖热袍菌。许多热稳定DNA聚合酶的完整的核酸和氨基酸序列是可获得的。PCT国际专利公开号WO 92/06200中已经公布了水生栖热菌(Taq) (SEQ ID NO:2)、嗜热栖热菌(Tth) (SEQ ID NO:6)、栖热菌种Z05(SEQ ID NO:1)、栖热菌种sps17(SEQ ID NO:5)、海栖热袍菌(Tma) (SEQ ID NO:34)和非洲栖热腔菌(Taf) (SEQ ID NO:33)聚合酶中每一种的序列。Akhmetzjanov和Vakhitov(Nucleic Acids Research 20:5839, 1992)已经公布了来自黄栖热菌的DNA聚合酶的序列(SEQ ID NO:4)。来自Thermus caldophilus的热稳定DNA聚合酶的序列(SEQ ID NO:7)在EMBL/GenBank登录号U62584发现。来自丝状栖热菌的热稳定DNA聚合酶的序列(SEQ ID NO:3)可以使用例如美国专利号4,889,818提供的方法以及表1中提供的序列信息从ATCC保藏号42380中重新获得。那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶的序列(SEQ ID NO:35)来自GeneSeq专利数据库登录号R98144和PCT WO 97/09451。例如Uemori等(J Biochem (Tokyo) 113(3):401-410, 1993描述了来自热坚芽孢杆菌的热稳定DNA聚合酶的序列(SEQ ID NO:37)；也参见Swiss-Prot数据库登录号Q04957以及GenBank登录号D12982和BAA02361)。例如，美国专利号6,228,628；6,346,379；7,030,220；6,881,559；6,794,177；6,468,775, 和美国专利号7,148,049；7,179,590；7,410,782；7,378,262中也描述了可以如本文所述修饰的DNA聚合酶的未修饰的形式的实例。序列表中还提供了代表性的全长聚合酶序列。

已经预先修饰过的功能性DNA聚合酶(例如通过氨基酸取代、插入或缺失)，同样适于本文描述的突变。在一些实施方案中，这样功能性修饰的聚合酶保留SEQ ID NO:8的氨基酸基序(或SEQ ID NO:9、10或 11的基序)，且任选地SEQ ID NO:38的氨基酸基序。因此，合适的未经修饰的DNA聚合酶也包括野生型或天然存在的聚合酶的功能性变体。这种变体通常与野生型或天然存在的聚合酶具有基本上的序列同一性或相似性，典型地至少80%的序列同一性，更典型地至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性。

在一些实施方案中，本发明的以及具有包含SEQ ID NOS:8、9、10或11的聚合酶结构域的聚合酶也包含核酸酶结构域(例如，对应于Z05的1-291位)。

在一些实施方案中，本发明的聚合酶是嵌合的聚合酶，即，包含来自两种或更多种酶的多肽区域。例如美国专利号6,228,628描述了这种嵌合DNA聚合酶的实例。特别合适的是嵌合CS家族DNA聚合酶，其包括CS5(SEQ ID NO:27)和CS6(SEQ ID NO:28)聚合酶及其与SEQ ID NO:27或SEQ ID NO:28具有基本上的氨基酸序列同一性或相似性的变体(典型地至少80%氨基酸序列同一性，更典型地至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%氨基酸序列同一性)，因此可以被修饰为包含SEQ ID NO:8。CS5和CS6 DNA聚合酶是源自栖热菌种Z05和海栖热袍菌 (Tma) DNA聚合酶的嵌合酶。它们包含栖热菌酶的N-末端的5'-核酸酶结构域和Tma酶的C-末端的3'-5'核酸外切酶以及聚合酶结构域。这些酶具有有效的逆转录酶活性，可以延伸包含核苷酸类似物的引物，并可以包含α-硫代磷酸酯dNTPs、dUTP、dITP以及还有荧光素和花菁染料家族标记的dNTPs。CS5和CS6聚合酶也是有效的Mg²⁺活化的PCR酶。例如，美国专利号7,148,049中进一步描述了CS5和CS6嵌合聚合酶。

在一些实施方案中，氨基酸取代是单一的氨基酸取代。相对于未修饰的聚合酶，本文提供的DNA聚合酶在活性位点可以包含一个或多个氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代包含至少如SEQ ID NO:8所述的基序(或SEQ ID NO:9、10或 11的基序)的X₃位。在该位置上的氨基酸取代赋予增强的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率、和/或RT和聚合酶抑制剂的耐受性，产生了相对于未修饰的聚合酶具有增强的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率和/或RT和聚合酶抑制剂的耐受性的突变DNA聚合酶。通常，X₃位的氨基酸被不对应于SEQ ID NO:8中所述基序(或SEQ ID NO:9、10或 11的基序)内的天然序列的氨基酸所取代。因此，通常，X₃位的氨基酸，如果被取代，不是如这些位置存在于天然存在的聚合酶中的Ile (I)、Leu (L)或Met (M)。参见，例如图1。在某些实施方案中，在X₃位氨基酸取代包括G、A、W、P、S、T、F、Y、C、N、Q、D、E、K、V、R或H。在某些实施方案中，在X₃位氨基酸取代包括赖氨酸(K)、精氨酸(R)、丝氨酸(S)、甘氨酸(G)或丙氨酸(A)。可以使用，例如，定点诱变的已知方法和本文中进一步描述的测定中多核苷酸延伸性能的确定方法或本领域技术人员已知的其他方法确定在一个或多个鉴别的位点的其他合适的氨基酸取代。

在一些实施方案中，本发明的聚合酶包括SEQ ID NO：8，9，10或11，并进一步包含与天然的聚合酶相比的一个或多个额外的氨基酸变化(例如，通过氨基酸取代，增加或缺失)。在一些实施方案中，这种聚合酶保留了SEQ ID NO：8的氨基酸基序(或SEQ ID NO:9,10或11的基序)，并进一步包含如下的SEQ ID NO：38的氨基酸基序(对应于Z05(SEQ ID NO：1)的D580X突变)：

Thr-Gly-Arg-Leu-Ser-Ser-X₇-X₈-Pro-Asn-Leu-Gln-Asn

(在本文中也用单字母代码称为

T-G-R-L-S-S-X₇-X₈-P-N-L-Q-N) (SEQ ID NO:38)；其中

X₇是Ser (S)或Thr (T)；且

X₈是除Asp (D)或Glu (E)以外的任何氨基酸。

例如，美国专利公开号2009/0148891中更详细地讨论了由SEQ ID NO：38表征的突变。这种功能性变体聚合酶通常与野生型或天然存在的聚合酶(例如, SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、32、33、34、35、36、37、或48)具有基本上的序列同一性或相似性，典型地至少80%的氨基酸序列同一性，更典型地至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的氨基酸序列同一性。

在一些实施方案中，本发明的聚合酶包括SEQ ID NO：8，9，10或11，并进一步包含与天然的聚合酶相比的一个或多个额外的氨基酸变化(例如，通过氨基酸取代，增加或缺失)。在一些实施方案中，这种聚合酶保留了SEQ ID NO：8的氨基酸基序(或SEQ ID NO:9,10或11的基序)，并进一步包含如下的SEQ ID NO：29的氨基酸基序(对应于Z05(SEQ ID NO：1)的I588X突变)：

Pro-Asn-Leu-Gln-Asn-X₁-Pro-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-Gly (在本文中也用单字母代码称为P-N-L-Q-N-X₁-P-X₂-X₃-X₄-X₅-X₆-G) (SEQ ID NO:29)；其中

X₁ 是Ile (I)、或Leu (L)；

X₂ 是除Ile (I)或Val (V)以外的任何氨基酸；

X₃ 是Arg (R)或Lys (K)；

X₄ 是Thr (T)、Ser (S)或Leu (L)；

X₅ 是Pro (P)或Glu (E)；且

X₆ 是Leu (L)或Glu (E)。

在一些实施方案中，这种功能性变体聚合酶通常与野生型或天然存在的聚合酶(例如，SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、32、33、34、35、36、37或48)具有基本上的序列同一性或相似性，典型地至少80％氨基酸序列同一性，且更典型地至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99% 氨基酸序列同一性。

在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶在X₃位置(例如，如在选自SEQ ID NO:8、9、10或11的基序中)包含氨基酸取代，且包含对应于SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:29的氨基酸取代。

可以使用，例如，定点诱变的已知方法和本文中进一步描述的测定中多核苷酸延伸性能的确定方法或本领域技术人员已知的其他方法确定在一个或多个鉴别的位点的其他合适的氨基酸取代，例如，美国专利申请公开号2009/0148891和2009/0280539中的氨基酸取代。

因为DNA聚合酶的精确长度变化，对应于(例如，SEQ ID NOs: 8, 9, 10和11的)X₃、(SEQ ID NO:38的)X₈ 和(SEQ ID NO:29的)X₂ 的每一个的精确的氨基酸位置可以根据使用的特定突变型聚合酶而变化。氨基酸和核酸序列比对程序是容易获得的(见，例如，上文提到的那些)，考虑到本文鉴别的特定基序，所述程序用来帮助鉴别用于本发明的修饰的正确的氨基酸(和对应的密码子)。对于来自示例性的嗜热菌种的代表性的嵌合的热稳定DNA聚合酶和热稳定的DNA聚合酶，对应于X₃、X₈和X₂中每一个的位置如表1中所示。

表1. 对应于示例性聚合酶中基序位置(例如，SEQ ID NOS:8、9、10和11的)X₃、(SEQ ID NO:38的)X₈和(SEQ ID NO:29的)X₂ 的氨基酸位置。

在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶源自栖热菌种Z05 DNA聚合酶(SEQ IDNO:1)或其变体(例如，携带D580G突变等)。如上面提到的，在栖热菌种Z05 DNA聚合酶中，X₃位对应709位的异亮氨酸(I)；X₈位对应580位的天冬氨酸(D)。因此，在本发明的某些变型中，相对于栖热菌种Z05 DNA聚合酶，突变型聚合酶在I709 和/或D580包含至少一个氨基酸取代。因此，典型地，709位的氨基酸不是I。在一些实施方案中，709位的氨基酸选自G、A、V、L、R、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、或H。在某些实施方案中，709位的氨基酸残基是K、R、S、G或A。在某些实施方案中，D580位的氨基酸残基可以选自亮氨酸(L)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)、谷氨酰胺(Q)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、天冬酰胺(N)、精氨酸(R)和赖氨酸(K)。进一步，在某些实施方案中，SEQ ID NO:1的588位的氨基酸是除I以外的任何氨基酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的588位的氨基酸选自L、V、G、A、S、M、F、W、P、R、K、T、C、Y、N、Q、D、E或H。在一些实施方案中，SEQ ID NO:1的588位的氨基酸是T。

示例性的栖热菌种Z05 DNA聚合酶突变体包括包含氨基酸取代I709K (或I709R、I709S、I709G、I709A)、和/或I588T、和/或D580G的那些。在一些实施方案中，突变型栖热菌种Z05 DNA聚合酶包含，例如，氨基酸残基取代I709K (或I709R、I709S、I709G、I709A)、I588T、和D580G。在一些实施方案中，突变型栖热菌种Z05 DNA聚合酶包含，例如，氨基酸残基取代I709K和D580G、或I709R和D580G、I709S和D580G、I709G和D580G、或I709A和D580G。在一些实施方案中，突变型栖热菌种Z05 DNA聚合酶包含，例如，氨基酸残基取代I709K和I588T、或I709R和I588T、I709S和I588T、I709G和I588T、或I709A和I588T。在某些实施方案中，突变型栖热菌种Z05 DNA聚合酶包含，例如，氨基酸残基取代，所述氨基酸残基取代独立地选自I709K、I588T、和/或D580G。在某些实施方案中，突变型栖热菌种Z05 DNA聚合酶包含，例如，氨基酸残基取代，所述氨基酸残基取代独立地选自I709R、I588T和/或D580G。在某些实施方案中，突变型栖热菌种Z05 DNA聚合酶包含，例如，氨基酸残基取代，所述氨基酸残基取代独立地选自I709S、I588T、和/或D580G。在某些实施方案中，突变型栖热菌种Z05 DNA聚合酶包含，例如，氨基酸残基取代，所述氨基酸残基取代独立地选自I709G、I588T和/或D580G。在某些实施方案中，突变型栖热菌种Z05 DNA聚合酶包含，例如，氨基酸残基取代，所述氨基酸残基取代独立地选自I709A、I588T、和/或D580G。

除如本文所述的SEQ ID NOS:8、9、10、11、29 和38的基序突变以外，本发明的DNA聚合酶也可以包括其他未取代的修饰。这种修饰可以包括，例如，本领域已知的共价修饰，以赋予包括多核苷酸延伸的应用中的额外的优势。例如，一种这种修饰是热可逆的共价修饰，其使酶失活，但是在高温，如通常用于多核苷酸延伸的温度下孵育后其被逆转而激活酶。美国专利号5,773,258和5,677,152中描述了这种热可逆的修饰的示例性试剂。

可以通过突变编码对应的未修饰的聚合酶(例如，野生型聚合酶或者本发明的聚合酶来源自的对应变体)的DNA序列，如通过使用通常称为定点诱变的技术来构建本发明的DNA聚合酶。可以通过本领域普通技术人员公知的多种聚合酶链式反应(PCR)技术来突变编码聚合酶的未修饰形式的核酸分子。(参见，例如，PCR Strategies (M. A. Innis, D. H.Gelfand和J. J. Sninsky 编, 1995, Academic Press, San Diego, CA) 的第14章；PCRProtocols :A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand,J. J. Sninsky和T. J. White 编, Academic Press, NY, 1990)。

作为非限制性实例，来自Clontech的转化子定点诱变试剂盒(Transformer Site-Directed Mutagenesis kit)使用的双引物系统可以用来将定点突变引入编码聚合酶的未修饰的形式的多核苷酸。该系统中的目标质粒变性之后，两条引物同时退火到质粒；这些引物之一包含期望的定点突变，另一条包含在该质粒中引起限制性位点消除的另一个位点的突变。然后进行第二条链合成，紧密连接这两个突变，然后将获得的质粒转化入大肠杆菌的mutS菌株。从转化的细菌中分离质粒DNA，用相关的限制酶限制性酶切(从而线性化未突变的质粒)，然后重新转化进入大肠杆菌。该系统允许直接在表达质粒中产生突变，而不必亚克隆或者产生单链的噬菌粒(phagemids)。两个突变的紧密连接和随后的未突变质粒的线性化导致高突变效率并允许最少的筛选。在初始限制性位点引物的合成之后，对每个突变位点，该方法只需要使用一种新的引物类型。不是分别准备各个位点突变体，可以合成一组“设计的简并”寡核苷酸引物，用于同时在给定的位点引入所有期望的突变。可以通过对质粒DNA的诱变的区域测序来筛选转化体以鉴别并分类突变型克隆。然后可以限制性酶切每条突变型DNA并通过电泳分析，如，在突变检测增强凝胶(Mallinckrodt Baker, Inc.,Phillipsburg, NJ)上进行以验证在该序列中没有发生其他的改变(通过与未诱变处理的对照进行条带迁移比较)。或者可以对整个DNA区域测序以验证在目标区域之外没有额外的突变事件发生。

可以以多种方式产生具有多于一个氨基酸取代的DNA聚合酶。在氨基酸紧密在一起地位于多肽链中的情况下，可以使用编码所有期望的氨基酸取代的一条寡核苷酸来同时突变它们。然而如果氨基酸彼此隔开一些距离定位(例如隔开多于10个氨基酸)，则产生编码所有期望的变化的单一寡核苷酸更困难。作为替代，可以用两种可选方法中的一种。在第一种方法中，对每个待取代的氨基酸产生单独的寡核苷酸。然后将寡核苷酸同时与单链模板DNA退火，而从模板合成的DNA第二条链将编码所有期望的氨基酸取代。一种可选方法涉及两个或更多轮的诱变以产生期望的突变体。第一轮如同单突变体描述的那样：编码未修饰的聚合酶的DNA作为模板，将编码第一个期望的氨基酸取代的寡核苷酸与该模板退火，然后产生异源双链DNA分子。第二轮的诱变利用第一轮的诱变产生的突变DNA作为模板。因此，该模板已经包含一个或更多个突变。然后将编码额外的期望的氨基酸取代的寡核苷酸与该模板退火，产生的DNA链现在编码来自第一轮和第二轮的诱变两者的突变。可以使用这种产生的DNA作为第三轮的诱变中的模板，等等。或者，可以利用Seyfang和Jin的多位点诱变法(Anal. BioChem. 324:285-291. 2004)。

因此，也提供编码本发明的DNA聚合酶中任一种的重组核酸。使用本发明的编码DNA聚合酶的核酸，可以产生多种载体。在本发明的实施中可以使用包含源自与宿主细胞相容的物种的复制子和控制序列的任何载体。通常，表达载体包括与编码DNA聚合酶的核酸可操纵连接的转录和翻译调控核酸区域。术语“控制序列”是指在特定的宿主生物体中为可操纵连接的编码序列的表达所必需的DNA序列。适用于原核生物的控制序列，例如，包括启动子，任选地操纵子序列，和核糖体结合位点。此外，载体可以包含正性反向调控元件(Positive Retroregulatory Element，PRE)以增加转录的mRNA的半衰期(参见Gelfand等的美国专利号4,666,848)。转录和翻译调控核酸区域通常适合于用来表达聚合酶的宿主细胞。用于各种宿主细胞的许多类型的适当的表达载体和合适的调控序列是本领域已知的。通常，转录和翻译调控序列可以包括，例如，启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列和增强子或激活子序列。在典型的实施方案中，调控序列包括启动子和转录起始和终止序列。载体还典型地包括包含数个用于外源DNA插入的限制性位点的多接头区域。在某些实施方案中，使用“融合标志”以帮助纯化和随后标签/标志序列的去除(如果需要的话)，例如“组氨酸标签”(“His-Tag”)。然而，当从嗜常温宿主(例如大肠杆菌)中纯化热活性和/或热稳定蛋白(其中可以使用“热步骤”(heat-step))时，这些通常是不必要的。使用标准重组DNA操作制备包含编码复制序列，调控序列，表型选择基因，和感兴趣的聚合酶的DNA的合适的载体的构建。以特定的顺序将分离的质粒、病毒载体和DNA片段切割、裁剪并连接到一起以产生期望的载体，这是本领域公知的(参见，例如，Sambrook 等,Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York, NY, 2nd ed. 1989))。

在某些实施方案中，表达载体包含选择性标记基因以允许选择转化的宿主细胞。选择基因是本领域公知的，随使用的宿主细胞而变化。合适的选择基因可以包括，例如编码氨苄青霉素和/或四环素抗性的基因，其使以这些载体转化的细胞在这些抗生素存在的情况下生长。

在本发明的一个方面，将编码DNA聚合酶的核酸以单独或与载体组合地引入细胞。此处“引入”或语法上的等价物表示核酸以一种适于随后的核酸的整合、扩增和/或表达的方式进入细胞。引入的方法主要由目标细胞类型支配。示例性方法包括CaPO₄沉淀，脂质体融合，LIPOFECTIN®，电穿孔，病毒感染等。

在一些实施方案中，通常使用原核生物作为用于本发明初始的克隆步骤的宿主细胞。它们对于大量DNA的迅速生产，对于用于定点诱变的单链DNA模板的生产，对于同时筛选许多突变体以及对于产生的突变体的DNA测序特别有用。合适的原核宿主细胞包括大肠杆菌K12菌株94(ATCC No. 31,446)、大肠杆菌菌株W3110(ATCC No. 27,325)、大肠杆菌K12菌株DG116(ATCC No. 53,606)、大肠杆菌X1776(ATCC No. 31,537)和大肠杆菌B；然而大肠杆菌的许多其他菌株如HB101、JM101、NM522、NM538、NM539，以及许多其他原核生物的种和属包括杆菌如枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、其他肠杆菌科如鼠伤寒沙门氏杆菌(Salmonella typhimurium)或粘质沙雷氏菌(Serratia marcesans)和各种假单胞菌属(Pseudomonas species)的菌种全部都可以用作宿主。典型地使用如上文的Sambrook等在1.82部分描述的氯化钙方法转化原核宿主细胞或其他具有刚性细胞壁的宿主细胞。或者，可以使用电穿孔用于这些细胞的转化。例如，Dower,在Genetic Engineering, Principlesand Methods 12:275-296(Plenum Publishing Corp., 1990)；Hanahan等, Meth.Enzymol., 204:63, 1991中描述了原核生物转化技术。典型用于转化大肠杆菌的质粒包括pBR322、pUCI8、pUCI9、pUCIl8、pUC119和Bluescript M13，它们所有都描述于上文的Sambrook等的1.12-1.20部分。然而，许多其他合适的载体也是可用的。

通常通过在诱导或引起DNA聚合酶表达的适当条件下培养用包含编码DNA聚合酶的核酸的表达载体转化的宿主细胞而产生本发明的DNA聚合酶。在适于蛋白表达的条件下培养转化的宿主细胞的方法是本领域公知的(参见，例如，上文的Sambrook等)。用于从包含λ pL启动子的质粒载体产生聚合酶的合适的宿主细胞包括大肠杆菌菌株DG116(ATCC No.53606)(参见美国专利号5,079,352和Lawyer, F.C. 等, PCR Methods and Applications2:275-87, 1993)。表达之后，可以收获并分离聚合酶。例如，上文的Lawyer等中描述了用于纯化热稳定DNA聚合酶的方法。一旦纯化，可以测试(例如，如在实施例中所述)DNA聚合酶具有改进的RT效率、增强的错配耐受性、延伸速率和/或RT和聚合酶抑制剂的耐受性的能力。

本发明的改进的DNA聚合酶可以用于其中需要或期望这种酶活性的任何目的。因此，在本发明的另一个方面，提供了使用聚合酶的多核苷酸延伸的方法(例如, PCR)。适合用于多核苷酸延伸的条件是本领域公知的(参见，例如，上文的Sambrook等。也参见Ausubel等, Short Protocols in Molecular Biology(第4版，John Wiley & Sons 1999))。通常，使引物与目标核酸退火，即杂交以形成引物-模板复合物。在合适的环境中将引物-模板复合物与DNA聚合酶和三磷酸核苷接触，以允许一个或更多个核苷酸增加至引物的3'-末端，从而产生与目标核酸互补的延伸的引物。引物可以包括，例如，一个或更多个核苷酸类似物。此外，三磷酸核苷可以是常规核苷酸、非常规核苷酸(例如核糖核苷酸或标记的核苷酸)或其混合物。在一些变型中，多核苷酸延伸反应包括目标核酸的扩增。适于使用DNA聚合酶和引物对进行核酸扩增的条件也是本领域已知的(例如，PCR扩增方法)。(参见，例如，上文的Sambrook等；上文的Ausubel等；PCR Applications: Protocols for FunctionalGenomics(Innis 等编, Academic Press 1999)。在其他的非互相排斥的实施方案中，多核苷酸延伸反应包括逆转录RNA模板(例如RT-PCR) 。在一些实施方案中，改进的聚合酶用于454测序 (Margulies, M 等2005, Nature, 437, 376-380)。

任选地，引物延伸反应包含参考或未修饰的聚合酶的实际的或潜在的抑制剂。抑制剂可以抑制，例如，参考或未修饰(对照)聚合酶的核酸延伸速率和/或逆转录效率。在一些实施方案中，抑制剂是血红蛋白或其降解产物。例如，在一些实施方案中，血红蛋白降解产物是血红素分解产物，如氯高铁血红素、血卟啉、或胆红素。在一些实施方案中，抑制剂是铁螯合剂或紫色素。在其他实施方案中，抑制剂是肝素。在某些实施方案中，抑制剂是嵌入染料。在某些实施方案中，抑制剂是已经描述为聚合酶抑制剂的黑色素。参见，例如，Ekhardt，等人，Biochem Biophys Res Commun. 271(3):726-30 (2000)。

本发明的DNA聚合酶可用于在从包含聚合酶抑制剂的样品(例如，诸如血液)分离的多核苷酸模板存在的情况下延伸模板。例如，本发明的DNA聚合酶可用于在血液的主要组分血红蛋白存在的情况下，或血红蛋白降解产物存在的情况下延伸模板。血红蛋白可以降解为各种血红素分解产物，诸如氯高铁血红素、高铁血红素、血卟啉和胆红素。因此，在某些实施方案中，本发明的DNA聚合酶可用于在血红蛋白降解产物(包括但不限于氯高铁血红素、高铁血红素、血卟啉和胆红素)存在的情况下延伸模板。在特定的实施方案中，血红蛋白降解产物是氯高铁血红素。在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶可用于在约0.5至20.0μM、约0.5至10.0 μM、约0.5至5.0 μM、约1.0至10.0 μM、约1.0至5.0 μM、约2.0至5.0 μM、或约2.0至3.0 μM氯高铁血红素存在的情况下延伸模板。在其他实施方案中，本发明的DNA聚合酶可用于在至少约0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、10.0、20.0、或大于20 μM氯高铁血红素存在的情况下延伸模板。血红蛋白分解产物包括铁螯合剂和紫色素。因此，在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶可用于在铁螯合剂和/或紫色素存在的情况下延伸模板。在其他实施方案中，本发明的DNA聚合酶可用于在一定量的抑制参考或对照DNA聚合酶延伸相同模板的血红蛋白降解产物存在的情况下延伸模板。

本发明的DNA聚合酶可用于在肝素存在的情况下延伸模板。肝素通常作为从血液中分离的样品中的抗凝剂存在。在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶可用于在约1.0至400 ng/μl、1.0至300 ng/μl、1.0至200 ng/μl、5.0至400 ng/μl、5.0至300 ng/μl、5.0至200 ng/μl、10.0至400 ng/μl、10.0至300 ng/μl、或10.0至200 ng/μl肝素存在的情况下延伸模板。在一些实施方案中，本发明的DNA聚合酶可用于在至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400 ng/μl、或大于400 ng/μl肝素存在的情况下延伸模板。在其他实施方案中，本发明的DNA聚合酶可用于在一定量的抑制参考或对照DNA聚合酶延伸相同模板的肝素存在的情况下延伸模板。

在一些实施方案中，本发明的改进的聚合酶在逆转录反应中使用。在一些实施方案中，逆转录反应在含有RNA模板、一种或多种引物、和本发明的热稳定DNA聚合酶的混合物中实施。反应混合物通常含有所有四种标准脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)和含有二价阳离子和一价阳离子的缓冲液。示例性的阳离子包括，例如，Mg²⁺，尽管其他阳离子，诸如Mn²⁺或Co²⁺也可以激活DNA聚合酶。在其他实施方案中，用本发明的热活性DNA聚合酶实施逆转录反应。在特定实施方案中，如实施例中所述，本发明的改进的聚合酶在Mn²⁺或Mg²⁺存在的情况下允许更有效的扩增RNA模板，而不损害DNA模板的有效扩增。

已经使用Mn²⁺作为二价金属离子活化剂实现了热稳定DNA聚合酶的最有效的RT活性。然而，众所周知的是，当Mn²⁺存在于反应中时，DNA聚合酶的保真度较低。除非试图生成突变，通常倾向于维持较高保真度。幸运的是，大多数常规测序、PCR和RT-PCR应用不需要高保真度条件，因为该检测系统通常着眼于产物群体。随着下一代测序方法数字PCR等的出现，产物的保真度更加重要，且允许更高保真度DNA合成的方法是关键的。使用Mg²⁺作为二价金属离子活化剂实现高效RT活性对于实质性增加DNA聚合酶的保真度和允许更可靠的核酸目标的复制是优异的方式。

因为本文所述的聚合酶也可以具有增加的错配耐受性，所以该聚合酶可用于其中目标模板可能变化且无论目标模板上的变化还是需要扩增模板的方法中。这种模板的实例可以包括，例如，病毒序列、细菌序列或其他病原体序列。在许多实施方案中，期望简单地确定个体(人或非人动物)是否具有病毒或其他感染，而不管已经感染个体的精确病毒变体。作为实例，可以使用引物对以使用本发明的聚合酶来扩增HCV和检测HCV的存在，即使感染个体的特定病毒具有导致引物杂交位点错配的突变。

目标核酸可以来自生物或合成来源。目标可以是例如DNA或RNA。通常，当产生扩增子时，扩增子由DNA组成，尽管核糖核苷酸或合成的核苷酸也可以掺入扩增子。当希望检测RNA时，扩增方法通常包括使用逆转录，包括例如逆转录PCR (RT-PCR)。

特定的目标序列可以包括例如病毒核酸(例如人类免疫缺陷性病毒(HIV)、乙肝病毒(HBV)、(巨细胞病毒(CMV)、细小B19病毒、EB病毒、丙肝病毒(HCV)、人乳头瘤病毒(HPV)、日本脑炎病毒(JEV)、西尼罗河病毒(WNV)、圣路易斯脑炎病毒(SLEV)、墨累山谷脑炎病毒和Kunjin病毒)，细菌核酸(例如金黄色葡萄球菌(S. aureus)、脑膜炎球菌(Neisseriameningitidis)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、鼠型沙眼衣原体(Chlamydiamuridarum)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis))，分枝杆菌，真菌核酸，或来自动物或植物的核酸。在一些实施方案中，目标核酸是动物(例如人)核酸或来源于动物(例如人)样品(即，病毒或其他病原生物核酸可以存在于来自动物活检的样品、血液样品、尿液样品、粪便样品、唾液等)。在一些实施方案中，目标核酸是例如可包括与疾病(例如癌症，糖尿病等等)有关的变体的人遗传区。因为在一些实施方案中，本发明的聚合酶具有错配耐受性，这种酶特别有用，例如当多种相关序列可能位于一个目标序列中的时候。作为实例，本发明可用于检测病毒病原体，其中所述病毒病原体在其基因组中具有大量的变异，足以使其很难或不可能设计出能扩增大部分或所有可能病毒基因组或癌症或其他疾病基因标记中的单个或小组引物，其中序列中的可变性是已知的或很可能发生的。

使用本文所述的改进的聚合酶检测延伸产物或扩增产物的其他方法包括使用荧光双链核苷酸结合染料或荧光双链核苷酸插入染料。荧光双链DNA结合染料的实例包括SYBR-green (Molecular Probes)。可以连同熔解曲线分析使用双链DNA结合染料以测定引物延伸产物和/或扩增产物。可以在实时PCR仪器，如具有机载软件(SDS 2.1)的ABI 5700/7000(96孔格式)或ABI 7900(384孔格式)仪器上进行熔解曲线分析。或者，可以进行熔解曲线分析作为终点分析。美国专利公开号2006/0172324中描述了熔点分析的示例性方法。

在本发明的另一个方面，提供了用于本文所述的引物延伸方法的试剂盒。在一些实施方案中，为了使用的便利将试剂盒区室化，该试剂盒包含至少一个提供本发明的改进的DNA聚合酶的容器。还可以包括一个或更多个提供额外的试剂的额外的容器。在一些实施方案中，试剂盒还可以包括包含肝素或其盐或将肝素释放到溶液中的血液收集管、容器、或单元。血液收集单元可以是肝素化管。这种额外的容器可以包括本领域技术人员所知的用于根据上述方法的引物延伸操作中的任何试剂或其他元件，包括用于，例如，核酸扩增操作(例如PCR、RT-PCR)，DNA测序操作或DNA标记操作中的试剂。例如，在某些实施方案中，试剂盒进一步包括容器，所述容器提供在引物延伸条件下可与预定的多核苷酸模板杂交的5'有义引物，或包括5'有义引物和对应的3'反义引物的引物对。在其他非互相排斥的变型中，试剂盒包括一个或更多个提供三磷酸核苷(常规的和/或非常规的)的容器。在特定实施方案中，试剂盒包括α-硫代磷酸酯(α-phophorothioate)dNTPs、dUTP、dITP，和/或标记的dNTPs，如荧光素-或花菁-染料家族dNTPs。在其他非互相排斥的实施方案中，试剂盒包括一个或更多个容器，所述容器提供适于引物延伸反应的缓冲剂。

在本发明的另一个方面，提供了包含本文所述的具有增强的逆转录酶效率、错配耐受性、延伸速率和/或RT和聚合酶抑制剂的耐受性的聚合酶的反应混合物。反应混合物可以进一步包括用于，例如，核酸扩增操作(例如，PCR，RT-PCR)，DNA测序操作，或DNA标记操作中的试剂。例如，在某些实施方案中，反应混合物包括适合用于引物延伸反应的缓冲剂。反应混合物也可以包含模板核酸(DNA和/或RNA)，一种或多种引物或探针多核苷酸，三磷酸核苷(包括，例如，脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸，标记的核苷酸，非常规的核苷酸)，盐(例如，Mn²⁺, Mg²⁺)，标记(例如，荧光团)。在一些实施方案中，反应混合物包含在引物延伸条件下与预定的多核苷酸模板可杂交的5'-有义引物，或包含所述5'-有义引物和对应的3'-反义引物的引物对。在一些实施方案中，反应混合物包含α-硫代磷酸酯(α-phophorothioate)dNTPs、dUTP、dITP，和/或标记的dNTPs，如荧光素-或花菁-染料家族dNTPs。在一些实施方案中，反应混合物包含铁螯合剂或紫色染料。在某些实施方案中，反应混合物包含血红蛋白、或血红蛋白的降解产物。例如，在某些实施方案中，血红蛋白的降解产物包括血红素分解产物(如氯高铁血红素、高铁血红素、hematophoryn和胆红素)。在其他实施方案中，反应混合物包含肝素或其盐。在某些实施方案中，反应混合物含有从血液分离的模板核酸。在其他实施方案中，模板核酸是RNA，且反应混合物包含肝素或其盐。

实施例

下列实施例用于说明，但不是限制要求保护的本发明。

实施例1：文库生成

简而言之，该筛选过程中的步骤包括突变型酶的文库生成、表达和部分纯化，筛选酶的期望的性质，DNA测序，克隆纯化，和进一步表征选择的候选突变体。下面进一步描述这些步骤中的每一个。

克隆文库生成：编码Z05 D580G DNA聚合酶的聚合酶结构域的核酸经受在包括该核酸序列的质粒的Blp I和Bgl II限制性位点之间的易错(诱变)PCR。扩增的序列如SEQ IDNO：39所提供。下面给出了用于这个的引物：

。

使用1.8-3.6mM的Mg²⁺浓度范围进行PCR，以便产生具有突变率范围的文库。缓冲剂条件为50 mM Bicine pH 8.2, 115 mM KOAc, 8% w/v甘油和0.2 mM每种dNTPs。在0.15 U/µL使用GeneAmp® AccuRT热启动PCR酶。以每50 µL反应体积5x10⁵拷贝的线性化Z05 D580G质粒DNA起始，用60秒94℃温度使反应变性，然后使用15秒94℃的变性温度，15秒60℃的退火温度，120秒72℃的延伸温度以及随后5分钟在72℃温度的最终延伸进行30循环的扩增。

用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen, Inc., Valencia, CA, USA)纯化产生的扩增子，用Blp I和Bgl II切割，然后用QIAquick PCR纯化试剂盒重新纯化。通过用相同的两种限制性酶切割，用重组的碱性磷酸酶(RAS，目录＃03359123001)处理，并用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化而制备Z05 D580G载体质粒。将切割的载体和突变的插入片段以1:3的比例混合并用T4 DNA连接酶在室温处理5分钟(NEB Quick Ligation™ Kit)。用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化连接产物并通过电穿孔法将其转化入大肠杆菌宿主菌株。

将表达的培养物的等分样品涂覆在氨苄青霉素选择性培养基上以测定在每个转化中独特转化体的数量。在作为冷冻保护剂的甘油存在的情况下，将转化物存储于-70℃到-80℃。

然后将每个文库涂布在大号氨苄青霉素选择性琼脂平板上。用自动菌落挑选机(QPix2, Genetix Ltd)将单菌落转移至包含具有氨苄青霉素和10% w/v甘油的2X Luria液体培养基的384孔板。在30℃将这些平板孵育过夜以允许培养物生长，然后存储于-70℃到-80℃。加入2X Luria液体培养基的甘油量足够低以允许培养物生长，然而足够高以提供冷冻保护。以这种方式制备了若干诱变(Mg²⁺)水平的数千个菌落用于随后使用。

提取物文库制备部分1—发酵：从上述克隆文库制备适于筛选目的的部分纯化提取物的对应文库。该过程的第一步是制备每个克隆的小规模表达培养物。这些培养物以96孔形式生长；因此对于每块384孔文库平板有4块表达培养平板。从克隆文库平板的每个孔将0.5 µL转移至包含150 µL培养基A的96孔种子平板的一个孔(参见下面的表3)。这种种子平板在iEMS平板孵育器/振荡器(ThermoElectron)中于30℃下在1150 rpm振荡过夜。然后使用这些种子培养物接种相同的培养基，这次将20 µL接种进大号96孔板(Nunc # 267334)中的250 µL培养基A中。这些平板于37℃振荡孵育过夜。表达质粒包含转录控制元件，其允许在37℃表达而不能在30℃表达。过夜孵育后，培养物典型地以总细胞蛋白的1-10%表达克隆蛋白。通过离心从这些培养物中收获细胞。这些细胞或冻存(-20℃)或如下所述立即处理。

表2. 培养基A(使用前过滤灭菌)

提取物文库制备部分2—提取: 将来自发酵步骤的细胞团重悬浮在25 µL裂解缓冲液(下表3)中，转移至384孔热循环仪平板并密封。注意该缓冲液包含溶菌酶以帮助细胞裂解，并包含DNase以便从提取物中除去DNA。为了裂解细胞，将板在37℃孵育15分钟，在-20℃冷冻过夜并再次在37℃下孵育15分钟。添加硫酸铵(1.5 µL的2M溶液)并在75℃孵育平板15分钟以沉淀并失活污染蛋白，包括外源添加的核酸酶。将平板在4℃ 3000 x g离心15分钟，然后将上清液转移至新的384孔热循环仪平板。在-20℃冻存这些提取物平板用于随后的筛选中。每孔包含约0.5-3 µM的突变型文库聚合酶。

表3. 裂解缓冲液

实施例2：具有改进的逆转录效率的突变型DNA聚合酶的鉴定

针对改进的逆转录效率筛选提取文库：通过比较在RT-PCR系统中从含有pSP64poly(A) (Promega)的HCV基因型Ib 5’NTR的前800个碱基的丙型肝炎病毒(HCV)转录物JP2-5扩增240个碱基对扩增子由粗酶提取物的荧光5’核酸酶(TaqMan)活性而生成的生长曲线的Cp(交叉点)值而筛选提取物文库。

在Roche LC 480动力热循环仪上以384孔形式实施反应，各孔含有用缓冲液稀释5倍的1.5 μL个别酶提取物，所述缓冲液含有20 mM Tris-HCl(pH 8)、100 mM KCl、0.1 mMEDTA、和0.1% Tween-20，其添加至18.5 μL表4中所述的RT-PCR母液混合物中。热循环条件为：65℃时1分钟(“RT”步骤)；5个循环的94℃15秒和随后的60℃30秒；和45个循环的91℃15秒和随后的60℃ 30秒。

表4. RT-PCR母液混合物

使用上述方案筛选约5000克隆。基于如Abs Quant/二阶导数最大法计算的最早交叉点(Cp)值和高于任意截止值的荧光平台值从初始合并物中选择二十一个克隆用于再次筛选。相应于最高的提取物的培养孔被取样到新鲜的生长培养基并重新生长以产生包含最好的突变体的新的培养平板，以及用于比较的若干亲本Z05 D580X (X= G、K、和R)培养物。然后使用这些培养板来制备新鲜的粗提取物，对所述新鲜的粗提取物进行定量，且用和表1中所述的相同母液混合物条件在20 nM的浓度重新筛选。表5显示了从由于TaqMan探针的裂解导致的FAM信号增加获得的Cp值。结果显示，克隆0813-L15表达的聚合酶以比Z05 D580G亲本聚合酶更高的效率扩增RNA目标。

表5. 用突变型聚合酶扩增RNA模板获得的Cp值。

对聚合酶基因突变区的DNA序列进行测序，以确定存在于任何单一克隆的一种或多种突变。选择克隆0815-L15用于进一步测试，所以突变型聚合酶蛋白在烧瓶培养物中表达，纯化至均一，且定量。

Z05 D580G突变体在基于Mn²⁺的RT-PCR中的用途：测序结果表明，克隆0813-L15表达的聚合酶除亲本D580G突变以外还携带突变I709K和A803S。在TaqMan基于Mn²⁺的RT-PCR中将纯化的突变体Z05 D580G_I709K_A803S (0813-L15)与亲本Z05 D580G进行比较。通过比较来自JP2-5 RNA转录物和用限制性核酸内切酶EcoRI消化的pJP2-5 DNA线性质粒的扩增的Cp值来测量逆转录和PCR效率。寡核苷酸和母液混合物条件(表1) 和初始筛选中使用的相同。每个反应具有100,000个拷贝的JP2-5转录物、100,000个拷贝的pJP2-5线性质粒DNA、或1000个拷贝的pJP2-5线性质粒DNA。如上所述，在一式两份反应中使用引物1和引物2扩增所有目标，以生成240个碱基对的扩增子。在Roche Light Cycler 480热循环仪上用15 μL的反应体积进行所有反应。通过Abs Quant/二阶导数最大法计算交叉点(Cps)并将该值平均化。使用2.5 nM- 30 nM的DNA聚合酶浓度的范围实施扩增。热循环条件为：65℃时1分钟(“RT”步骤)；5个循环的94℃ 15秒和随后的60℃ 30秒；和45个循环的91℃ 15秒和随后的60℃ 30秒。表6显示从由于在20 nM酶条件裂解TaqMan探针导致的荧光信号增加获得的Cp值。

表6. 当在Mn²⁺存在的情况下扩增RNA和DNA模板时用突变型聚合酶获得的Cp值。

结果表明，与亲本酶相比，突变体Z05 D580G_I709K_A803S允许更有效扩增RNA目标，而不损害对DNA目标的PCR效率。

Z05 D580G突变体在基于Mg²⁺的RT-PCR中的用途：还比较纯化的突变体Z05D580G_I709K_A803S与亲本Z05 D580G在Mg²⁺存在的情况下进行TaqMan RT-PCR的能力。使用的母液混合物条件与表1中描述的条件相同，除了KOAc浓度从20 mM- 160 mM变化且Mn(OAc)₂用2.1 mM Mg(OAc)₂替换。每个反应具有30 nM酶和100,000个拷贝的JP2-5转录物、100,000个拷贝的pJP2-5线性质粒DNA、或1000个拷贝的pJP2-5线性质粒DNA。在一式两份反应中用相同的引物组扩增所有目标，以生成240个碱基对的扩增子。通过比较DNA和RNA之间的Cp值来测定PCR和RT-PCR效率。在Roche Light Cycler 480热循环仪上用15 μL的反应体积进行所有反应。通过Abs Quant/二阶导数最大法计算交叉点(Cps)并将Cps平均化。热循环条件为：65℃- 5分钟，70℃- 5分钟，和75℃-5分钟(3温度“RT”步骤)；5个循环的94℃15秒和随后的62℃30秒；和45个循环的91℃15秒和随后的62℃ 30秒。表7显示从由于在40 nMKOAc条件裂解TaqMan探针导致的荧光信号增加获得的Cp值。

表7. 当在Mg²⁺存在的情况下扩增RNA和DNA模板时用突变型聚合酶获得的Cp值。

结果表明，在这些条件下，突变体Z05 D580G_I709K_A803S以显著高于Z05 D580G的效率进行基于Mg²⁺的RT PCR。

测定赋予表型的一种或多种突变：在RT-PCR筛选中，0815-L15克隆表达的聚合酶表现出高于亲本Z05 D580G的RNA扩增的最佳改进。0815-L15克隆表达除亲本D580G突变以外携带I709K和A803的双重突变型聚合酶。基于氨基酸变化的性质和A803S与蛋白的C-末端的邻近，我们预测，I709K突变负责观察到的表型。通过基于PCR的位点定向诱变构建Z05D580G_I709K突变体，纯化，定量，且在使用20 mM- 160 mM的不同的KOAc浓度和30 nM酶的Mg²⁺激活的TaqMan RT-PCR中与0815-L15 (Z05 D580G_I709K_A803S)进行比较。母液混合物条件与前面表1中描述的那些条件相同，除了Mn(OAc)₂用2.1 mM Mg(OAc)₂替代。每个反应具有100,000个拷贝的JP2-5转录物、100,000个拷贝的pJP2-5线性质粒DNA、或1000个拷贝的pJP2-5线性质粒DNA。在一式两份反应中用相同的引物组扩增所有目标，以生成240个碱基对的扩增子。通过比较DNA和RNA之间的Cp值来测定PCR和RT-PCR效率。在Roche LightCycler 480热循环仪上用15 μL的反应体积进行所有反应。通过Abs Quant/二阶导数最大法计算交叉点(Cps)并将Cps平均化。热循环条件为：50℃时2分钟(“UNG”步骤)；65℃- 5分钟，68℃-5分钟，和72℃- 5分钟(3温度“RT”步骤)；5个循环的94℃ 15秒和随后的62℃ 30秒；和45个循环的91℃ 15秒和随后的62℃ 30秒。表8显示从由于在60 nM KOAc条件裂解TaqMan探针导致的荧光信号增加获得的Cp值。

表8. 用突变型聚合酶扩增RNA和DNA模板获得的Cp值。

Z05 D580G_I709K和Z05 D580G_I709K_A803S对RNA和DNA目标具有类似的Cp值，表明I709K突变赋予所观察到的RT-PCR性能的改进。

在I709位的各种氨基酸取代：检查了在Z05 D580G DNA聚合酶的I709位的各种取代对基于Mg²⁺的TaqMan RT-PCR效率的影响。首先，利用基于PCR的位点定向诱变技术在Z05D580G DNA聚合酶中生成突变，纯化且定量突变型酶。在Mg²⁺激活的TaqMan RT-PCR中使用20mM- 160 mM的不同KOAc浓度和10 nM酶将Z05D580G_I709突变体K(赖氨酸)、A (丙氨酸)、G(甘氨酸)、S(丝氨酸)、R(精氨酸)、L(亮氨酸)、和D(天冬氨酸)与亲本Z05 D580G进行比较。母液混合物条件与前面表1中描述的那些条件相同，除了使用2.0 mM Mg(OAc)₂。每个反应具有100,000个拷贝的JP2-5转录物、100,000个拷贝的pJP2-5线性质粒DNA、或1000个拷贝的pJP2-5线性质粒DNA。在一式两份反应中用相同的引物组扩增所有目标，以生成240个碱基对的扩增子。在Roche Light Cycler 480热循环仪上用15 μL的反应体积进行所有反应。通过Abs Quant/二阶导数最大法计算交叉点(Cps)并将Cps平均化。热循环条件为：50℃时3分钟(“UNG”步骤)；65℃- 5分钟，68℃-5分钟，和72℃- 5分钟(3温度“RT”步骤)；5个循环的95℃ 15秒和随后的62℃ 30秒；和45个循环的91℃ 15秒和随后的62℃ 30秒。表9显示从由于在80 nM KOAc条件裂解TaqMan探针导致的荧光信号增加获得的Cp值。

表9. 用在I709位具有各种取代的聚合酶扩增RNA和DNA模板获得的Cp值。

NS= 无TaqMan生成的生长曲线。

本实施例显示，Z05 D580G DNA聚合酶的709位的几种氨基酸取代导致RNA目标的更有效扩增。

实施例3：针对改进的3’引物错配耐受性筛选提取文库。

通过比较酶延伸与引物M13mp18的序列完美匹配的引物(DG48；SEQ ID NO:40，表10)后的最终荧光相比于具有3’ A:A错配的引物(FR744；SEQ ID NO:42；表10)的最终荧光针对改进的3’引物错配耐受性筛选实施例1的提取文库。

DG48完美匹配：

FR744 A:A错配：

。

通过在384孔热循环仪平板中将2.5µL提取物与22.5µL包含20 mM Tris-HCl, pH8, 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA和0.2% Tween-20的缓冲液混合，覆盖并在90℃加热10分钟而将上述酶提取物稀释10倍用于引物延伸反应中。具有完美匹配引物的对照反应在384孔PCR平板中将0.5 µL稀释的提取物与15 µL母液混合物混合。在改进的动态热循环仪中用CCD照相机每15秒监测已经引发的模板的延伸(参见上面的Watson)。母液混合物包含1 nM已经引发的引物模板，25 mM Tricine, pH 8.3, 100 mM KOAc, 0.6X SYBR Green I, 200µM每种dNTP, 100 nM适配子和2.5 mM Mg(OAc)₂。为了从背景荧光中区分延伸来源的荧光，实验中包括平行孔，其中通过从反应母液混合物中省略(leaving out)核苷酸而阻止引物链延伸。如上所述进行3'-错配引物(FR744, SEQ ID NO:42)的反应，除了将1.0 µL稀释的提取物加入每个反应。

使用上述方案筛选约5700突变体提取物。基于在40℃延伸1分钟和随后的在64℃延伸8.5分钟后相对于起始基线的最大荧光选择克隆。基于该标准，选择相对少量的提取物用于纯化和进一步测试。首先把它们在选择性琼脂平板上划线以确保克隆的纯净，且对聚合酶基因突变的区域的DNA序列进行测序以确定存在于任何单个克隆的突变。与该工作平行，在烧瓶培养物中表达突变型聚合酶蛋白，纯化至均一，且定量。

实施例4： M13模板的各种3’-错配的引物延伸。

本实施例表明，588和709位的取代导致产生在使用3’错配引物延伸模板时具有改进效率的聚合酶。

在M13mp18模板的各种3’-引物错配的引物延伸中将纯化的Z05 D580G I588TI709K与亲本酶Z05 D580G进行比较。模板和引物列于下表10中：

表10. 用于延伸M13mp18模板的引物。

将引物与M13mp18模板以10:1引物：模板比例进行预退火，且以1 nM终浓度与5 nM酶和25 mM Tricine(pH 8.3)、100 mM KOAc、0.6X SYBR Green I、200 µM各dNTP、100 nM适配子和2.5 mM Mg(OAc)₂一起添加至延伸反应中。在改进的动态热循环仪中一式三份进行反应，用CCD照相机每15秒监测已经引发的模板的延伸(参见上面的Watson)。将重复取平均值，且计算每个条件的最大斜率作为荧光随着时间的变化。结果显示于下表11中。

表11. 错配引物的突变型聚合酶延伸速率。

本实施例显示，与亲本酶Z05 D580G相比，Z05 D580G I588T I709K在延伸完美匹配的引物模板时快约2倍，且取决于末端3' -错配，在延伸3'-错配的引物模板时快约两至大于10倍。

实施例5：使用突变型聚合酶时，突变型BRAF质粒模板相比于野生型BRAF人基因组模板的扩增。

本实施例表明，588和709突变导致产生与亲本酶相比具有改进的错配耐受性的聚合酶。

在TaqMan PCR中将纯化的Z05 D580G I588T I709K与亲本酶Z05 D580G进行比较，用于在野生型人基因组DNA的背景中对突变型BRAF V600E目标的改进错配耐受性。

正向引物与突变序列完美匹配且与野生型序列具有单一的3’ A:A错配。反应在16µL的最终体积中具有10,000拷贝(33 ng)的野生型人基因组细胞系DNA，或具有100或10,000拷贝的包含BRAF V600E突变序列的线性化质粒。为了允许酶的不同盐条件最佳化，使用40-145 mM的KCl浓度范围进行扩增。缓冲液条件为50 mM Tris-HCl pH 8.0, 2.5 mMMgCl₂, 0.2 mM每种dNTP, 0.02 U/µL UNG和200 nM适配子。正向引物和反向引物为100nM，TaqMan探针为25 nM。在20 nM测定所有DNA聚合酶，加入2 %(v/v)酶储存缓冲液(50% v/v甘油, 100 mM KCl, 20 mM Tris pH 8.0, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5% Tween 20)。在Roche LightCycler 480热循环仪中进行反应并使用95℃温度60秒进行变性，然后使用92℃的变性温度10秒钟和62℃的退火温度30秒进行99个循环的扩增。

反应一式两份进行，通过Abs Quant/二阶导数最大法(2^nd derivative Maxmethod)计算交叉点(“Cps”)并将Cps取平均值。表12显示了在对于每种酶导致最早的高拷贝突变体Cp的KCl浓度时的平均Cp值以及计算的PCR效率。高拷贝ΔCp等于10,000拷贝的3'-错配的野生型基因组目标的反应的平均Cp值与10,000拷贝的完美匹配的质粒目标的反应的平均Cp值之间的差异。

表12. 突变型聚合酶使用3’错配引物的Cp值。

本实施例表明，Z05 D580G I588T I709K导致高拷贝ΔCp的2.3个循环的改进，表明在该PCR系统中3’-末端A:A错配的改进耐受性。

实施例6：在抑制剂存在的情况下突变型聚合酶具有改进的活性。

本实施例表明，I709K突变导致在DNA聚合酶的已知抑制剂存在的情况下RT-PCR效率的改进。

氯高铁血红素

血红蛋白(血液中的重要组分)可以降解为各种血红素分解产物，诸如氯高铁血红素、高铁血红素、血卟啉和最终的胆红素。由于这些分子是铁螯合剂和紫色素，所以它们可能利用多种机制来抑制聚合酶和/或逆转录酶活性。

使用HCV RNA 转录物的模型系统用于在使用Z05、Z05 D580G、或Z05 D580G I709K聚合酶的RT-PCR中确定氯高铁血红素的抑制作用。在有和没有添加2.5 uM氯高铁血红素(相对于DNA 聚合酶40倍摩尔过量)在扩增1,000拷贝的HCV RNA转录物的RT-PCR条件(120mM KOAc、3.3 mM Mn²⁺、60 mM Tricine；总共50 uL)中测试45 U DNA pol Z05、Z05 D580G、或Z05 D580G I709K。这些反应在Roche LightCycler 480实时PCR仪器中以12分钟RT步骤和随后的50个循环的变性和延伸运行。在JA270和CY5.5通道在最后50个循环期间检测实时荧光。使用仪器的“二阶导数最大分析”方法来确定对于各反应由荧光5'核酸酶(TaqMan)活性生成的生长曲线的Cp(交叉点)值。将所有正常反应的Cps与用氯高铁血红素的Cps进行比较，如表13中所示。在2.5 uM氯高铁血红素存在的情况下，没有观察到Z05扩增HCV RNA，而变体Z05 D580G检测到HCV，Cp延迟为3.4个循环(相比于无氯高铁血红素对照)，且Z05D580G I709K检测到HCV，Cp要早2.5个循环(相比于无氯高铁血红素对照)。

表13. 突变型聚合酶在氯高铁血红素存在和不存在的情况下的Cp值。

琼脂糖凝胶电泳证实，这些影响是由于减少的扩增导致的，而不是由卟啉氯高铁血红素分子猝灭导致的。用HCV DNA模板获得了类似的结果，表明氯高铁血红素充当通用的PCR抑制剂。

肝素

肝素是一种高度硫酸化的糖胺聚糖，且含有任何已知生物分子的最高负电荷密度之一。因此，它可以模拟核酸底物，且经常在蛋白-DNA/RNA结合测定中被用作非特异性竞争剂。氯高铁血红素充当通用聚合酶和PCR抑制剂，然而肝素优先抑制，例如，基于Z05的DNA聚合酶的逆转录。

使用上述HCV RNA RT-PCR转录物模型系统，测试100、200、400或1000 ng/uL肝素的存在，以确定使用Z05、Z05 D580G、或Z05 D580G I709K聚合酶的抑制作用。将所有正常反应的Cps与使用肝素的Cps进行比较(表14)。野生型Z05酶在12.5 ng/uL肝素存在的情况下无法扩增HCV RNA，然而Z05 D580G和Z05 D580G I709K突变体能够耐受最高达200或1000ng/ul肝素，而Cp延迟最小，这表明这些变体分别对于至少15 – 80倍更高的肝素是耐受的。

RNA和DNA底物之间的直接比较表明，Z05 D580G和Z05 D580G I709K对DNA的扩增完全不受存在高水平肝素的影响。总体而言，这些数据支持以下观点：肝素是更特异性抑制逆转录酶的抑制剂。DNA聚合酶对肝素的耐受性与各特定酶的内在RT活性的直接相关。

表14. 突变型聚合酶在渐增量的肝素存在的情况下的Cp值。

本实施例显示，I709K突变导致在抑制剂氯高铁血红素和肝素存在的情况下RT-PCR效率的改进。

实施例7：突变型聚合酶当延伸RNA模板时具有改进的引物错配耐受性。

本实施例表明，D580G和I709K突变导致产生对于引物与RNA模板错配具有改进的耐受性的聚合酶。

错配耐受性

HCV RNA转录物在引物3’-末端下的区域突变，从而使得可以在RT-PCR条件(120mM KOAc、3.3 mM Mn²⁺、60 mM Tricine；50 uL总反应体积)下用聚合酶Z05、Z05 D580G和Z05D580G I709K系统评价末端、N-1和N-2错配。这些反应在Roche LightCycler 480实时PCR仪器中以12分钟RT步骤和随后的50个循环的变性和延伸运行。在JA270和CY5.5通道在最后50个循环期间检测实时荧光。使用仪器的“二阶导数最大分析”方法来确定对于各反应由荧光5'核酸酶(TaqMan)活性生成的生长曲线的Cp(交叉点)值。通过比较Cp值来确定各DNA聚合酶的引物错配耐受性。如表15中所示，当使用错配引物时，Z05 D580G一致地具有比Z05早得多的Cp值(N是指在具有下面指示的引物：模板错配的引物3’-末端上的位置)。重要的是，Z05 D580G能够检测到亲本Z05酶不能检测到的几种错配。

表15. Z05和Z05 D580G聚合酶使用错配引物的Cp值。

在表16中，对于指明的各错配，通过比较Z05 D580G与Z05 D580G I709的Cp值而确定ΔCp值。因此，阳性ΔCp值指示Z05 D580G I709K检测到早多少个循环的TaqMan®信号。总体而言，突变Z05 D580G I709K显示最大的引物错配耐受性，对于显示的错配，相对于亲本酶Z05 D580G提供了平均4个循环的改进，反映了PCR性能的16倍改进。

表16. Z05 D580G相比于Z05 D580G I709K聚合酶使用错配引物的ΔCp。

上述实施例显示，Z05聚合酶的580和709位的取代导致当使用错配引物时的RT-PCR效率的改进。

实施例8： 709突变改进RT-PCR效率。

本实施例表明，Z05 DNA聚合酶的I709K单突变体导致产生具有改进的RT-PCR效率、但当扩增DNA模板时效率不降低的聚合酶。

将I709K突变亚克隆到Z05 DNA聚合酶骨架中作为单一突变体。表达和纯化后，在基于Mn²⁺的TaqMan® RT-PCR中将突变型Z05 I709K与DNA聚合酶Z05、Z05 D580G、和Z05D580G I709K的RT-PCR效率进行比较。母液混合物条件与前面表4中描述的那些条件相同，除了Mn(OAc)₂浓度为1.5 mM，UNG浓度为0.2U/µL，且探针浓度为100nM。将各DNA聚合酶稀释在含有20 mMTris-HCl(pH 8)、100 mMKCl、0.1 mM EDTA、和0.1% Tween-20的缓冲液中，以制备个别5X酶储存液。然后将3µL 5X酶储存液添加至适当的反应孔至15 µL总反应体积中20 nM的最终酶浓度。每个反应具有100,000个拷贝的JP2-5转录物、100,000个拷贝的pJP2-5线性质粒DNA、或1000个拷贝的pJP2-5线性质粒DNA。在四个反应的重复中用相同的引物组扩增所有目标，以生成240个碱基对的扩增子。在Roche Light Cycler 480热循环仪上进行所有反应。通过Abs Quant/二阶导数最大法计算交叉点(Cps)值并将该值平均化。热循环条件为：50℃时2分钟(“UNG”步骤)；55℃- 30秒，60℃-1分钟，和65℃-1.5分钟(3温度“RT”步骤)；5个循环的94℃ 15秒和随后的62℃ 30秒；和45个循环的91℃ 15秒和随后的62℃ 30秒。表17显示从由于裂解TaqMan®探针导致的荧光信号增加获得的Cp值。

表17. RT-PCR 中突变型聚合酶的Cp值。

该实施例显示，当与Z05亲本酶相比，I709K突变导致使用RNA模板时逆转录和扩增效率增加，而使用DNA模板时扩增效率不降低。

可以理解的是，本文所述的实施例和实施方案仅仅是用于说明性目的，基于所述实施例和实施方案的各种修改或改变将提示于本领域技术人员。

序列表信息

SEQ ID NO:1 栖热菌种Z05 DNA聚合酶(Z05)

SEQ ID NO:2 水生栖热菌DNA聚合酶(Taq)

SEQ ID NO:3 丝状栖热菌DNA聚合酶(Tfi)

SEQ ID NO:4 黄栖热菌DNA聚合酶(Tfl)

SEQ ID NO:5 栖热菌种Sps17 DNA聚合酶(Sps17)

SEQ ID NO:6 嗜热栖热菌DNA聚合酶(Tth)

SEQ ID NO:7 Thermus caldophilus DNA聚合酶(Tca)

SEQ ID NO:8

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃GYVX₁₄TL，其中X₁是A、D、S、E、R或Q；X₂是W或Y；X₃是除I、L或M以外的任何氨基酸；X₄是E、A、Q、K、N或D；X₅是K、G、R、Q、H或N；X₆是T、V、M或I；X₇是L、V或K；X₈是E、S、A、D或Q；X₉是E或F；X₁₀是G或A；X₁₁是R或K；X₁₂是K、R、E、T或Q；X₁₃是R、K或H；和X₁₄是E、R或T。

SEQ ID NO:9

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈EX₁₀X₁₁X₁₂X₁₃GYVX₁₄TL，其中X₁是A、D、或S；X₂是W或Y；X₃是除I以外的任何氨基酸；X₄是E、A、或Q；X₅是K、G、R或Q；X₆是T或V；X₇是L或V；X₈是E、S或A；X₁₀是G或A；X₁₁是R或K；X₁₂是K、R或E；X₁₃是R或K；和X₁₄是E或R。

SEQ ID NO:10

AWX₃X₄X₅TLEEGRX₁₂X₁₃GYVETL，其中X₃是除I以外的任何氨基酸；X₄是E或A；X₅是K或G；X₁₂是K或R；和X₁₃是R或K。

SEQ ID NO:11

AWX₃X₄X₅TLEEGRX₁₂X₁₃GYVETL，其中X₃是K、R、S、G、或A；X₄是E或A；X₅是K或G；X₁₂是K或R；和X₁₃是R或K。

SEQ ID NO:26天然共有基序

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈X₉X₁₀X₁₁X₁₂X₁₃GYVX₁₄TL，其中X₁是A、D、S、E、R或Q；X₂是W或Y；X₃是I、L或M；X₄是E、A、Q、K、N或D；X₅是K、G、R、Q、H或N；X₆是T、V、M或I；X₇是L、V或K；X₈是E、S、A、D或Q；X₉是E或F；X₁₀是G或A；X₁₁是R或K；X₁₂是K、R、E、T或Q；X₁₃是R、K或H；和X₁₄是E、R或T。

SEQ ID NO:27 CS5 DNA 聚合酶

SEQ ID NO:28 CS6 DNA 聚合酶

SEQ ID NO:29

PNLQNX₁PX₂X₃X₄X₅X₆G，其中X₁是I或L；X₂是除I或V以外的任何氨基酸；X₃是R或K；X₄是T、S或L；X₅是P或E；和X₆是L或E。

SEQ ID NO:30 正向引物

SEQ ID NO:31 反向引物

SEQ ID NO:32 耐放射异常球菌DNA聚合酶(Dra)

SEQ ID NO:33 非洲栖热腔菌DNA聚合酶(Taf)

SEQ ID NO:34 海栖热袍菌DNA聚合酶(Tma)

SEQ ID NO:35 那不勒斯栖热袍菌DNA聚合酶(Tne)

SEQ ID NO:36 嗜热脂肪芽孢杆菌DNA聚合酶(Bst)

SEQ ID NO:37 热坚芽孢杆菌DNA聚合酶(Bca)

SEQ ID NO:38 修饰的Z05 D580基序

T-G-R-L-S-S-X₇-X₈-P-N-L-Q-N，其中X₇是S或T；和X₈是除D或E以外的任何氨基酸。

SEQ ID NO:39 合成的编码Z05 D580G DNA聚合酶的扩增子

SEQ ID NO:48 生氢氧化碳嗜热菌DNA聚合酶(Chy)

Claims

1. DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶的氨基酸组成为：SEQ ID NO:1并且其中对应于SEQID NO:1的580位的氨基酸残基是G，和对应于SEQ ID NO:1的709位的氨基酸残基是K、R、S、G或A。

2.DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶的氨基酸组成为：SEQ ID NO:1并且其中对应于SEQID NO:1的580位的氨基酸残基是G，对应于SEQ ID NO:1的709位的氨基酸残基是K，和对应于SEQ ID NO:1的588位的氨基酸残基是T。

3.DNA聚合酶，其中所述DNA聚合酶的氨基酸组成为：SEQ ID NO:1并且其中对应于SEQID NO:1的580位的氨基酸残基是G，对应于SEQ ID NO:1的709位的氨基酸残基是K，和对应于SEQ ID NO:1的803位的氨基酸残基是S。

4.重组核酸，其编码权利要求1-3中任一项的DNA聚合酶。

5.进行引物延伸的方法，包括：

在适于引物延伸的条件下将权利要求1-3中任一项的DNA聚合酶与引物、多核苷酸模板和三磷酸核苷接触，从而产生延伸的引物。

6.权利要求5 的方法，其中所述方法在至少一种DNA聚合酶活性和/或逆转录活性抑制剂存在的情况下进行。

7.产生延伸的引物的试剂盒，其包含至少一个提供权利要求1-3中任一项的DNA聚合酶的容器。

8.权利要求7的试剂盒，进一步包含一个或更多个额外的容器，所述容器选自：

(a) 容器，其提供在引物延伸条件下与预定的多核苷酸模板可杂交的引物；

(b) 容器，其提供三磷酸核苷；以及

(c) 容器，其提供适合用于引物延伸的缓冲剂。

9.反应混合物，其包含权利要求1-3中任一项的DNA聚合酶、至少一种引物、多核苷酸模板和三磷酸核苷。

10.权利要求9的反应混合物，其中所述混合物包含至少一种DNA聚合酶活性和/或逆转录活性抑制剂。