本発明は、対応する非改変対照ポリメラーゼと比較して、増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに/又はRT及びポリメラーゼ阻害剤耐性を含む、改良された活性を有するDNAポリメラーゼ、並びにこのようなDNAポリメラーゼを作製及び使用する方法を提供する。態様によっては、配列番号1の709番目に対応するDNAポリメラーゼのアミノ酸がI、L又はM以外の任意のアミノ酸であり、そして、対照DNAポリメラーゼは、配列番号1の709番目に対応する対照DNAポリメラーゼのアミノ酸がI、L又はMであることを除いては、前記DNAポリメラーゼと同じアミノ酸配列を有する。例えば、態様によっては、改良された配列番号1の709番目に対応する位置のアミノ酸は、G、A、V、R、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K又はHから選択される。
態様によっては、増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに/又はRT及びポリメラーゼ阻害剤耐性を有するDNAポリメラーゼは、
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−G−Y−V−X14−T−L:
[ここで、
X1は、A、D、S、E、R又はQであり;
X2は、W又はYであり;
X3は、I、L又はM以外の任意のアミノ酸であり;
X4は、E、A、Q、K、N又はDであり;
X5は、K、G、R、Q、H又はNであり;
X6は、T、V、M又はIであり;
X7は、L、V又はKであり;
X8は、E、S、A、D又はQであり;
X9は、E又はFであり;
X10は、G又はAであり;
X11は、R又はKであり;
X12は、K、R、E、T又はQであり;
X13は、R、K又はHであり;そして
X14は、E、R又はTである]
をポリメラーゼドメイン中に含むモチーフを含んでなる(配列番号8)。
態様によっては、X3は、G、A、W、P、S、T、F、Y、C、N、Q、D、E、K、V、R又はHから選択される。
態様によっては、増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに/又はRT及びポリメラーゼ阻害剤耐性を有するDNAポリメラーゼは、
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−E−X10−X11−X12−X13−G−Y−V−X14−T−L:
[ここで、
X1は、A、D又はSであり;
X2は、W又はYであり;
X3は、I以外の任意のアミノ酸であり;
X4は、E、A又はQであり;
X5は、K、G、R又はQであり;
X6は、T又はVであり;
X7は、L又はVであり;
X8は、E、S又はAであり;
X10は、G又はAであり;
X11は、R又はKであり;
X12は、K、R又はEであり;
X13は、R又はKであり;そして
X14は、E又はRである]
をポリメラーゼドメイン中に含むモチーフを含んでなる(配列番号9)。
態様によっては、増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに/又はRT及びポリメラーゼ阻害剤耐性を有するDNAポリメラーゼは、
A−W−X3−X4−X5−T−L−E−E−G−R−X12−X13−G−Y−V−E−T−L:
[ここで、
X3は、I以外の任意のアミノ酸であり;
X4は、E又はAであり;
X5は、K又はGであり;
X12は、K又はRであり;そして
X13は、R又はKである]
をポリメラーゼドメイン中に含むモチーフを含んでなる(配列番号10)。
態様によっては、増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに/又はRT及びポリメラーゼ阻害剤耐性を有するDNAポリメラーゼは、
A−W−X3−X4−X5−T−L−E−E−G−R−X12−X13−G−Y−V−E−T−L:
[ここで、
X3は、K、R、S、G又はAであり;
X4は、E又はAであり;
X5は、K又はGであり;
X12は、K又はRであり;そして
X13は、R又はKである]
をポリメラーゼドメイン中に含むモチーフを含んでなる(配列番号11)。
態様によっては、配列番号1の580番目に対応するDNAポリメラーゼのアミノ酸は、D又はE以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、配列番号1の580番目に対応するDNAポリメラーゼのアミノ酸はD以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、配列番号1の580番目に対応するDNAポリメラーゼのアミノ酸は、L、G、T、Q、A、S、N、R及びKからなる群から選択される。
態様によっては、DNAポリメラーゼは、配列番号1の580及び588から選択される位置に対応する1以上のアミノ酸において、さらに変異を含む。態様によっては、配列番号1の580番目に対応するDNAポリメラーゼのアミノ酸は、D又はE以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、配列番号1の580番目に対応するDNAポリメラーゼのアミノ酸は、L、G、T、Q、A、S、N、R及びKからなる群から選択される。態様によっては、配列番号1の588番目に対応するDNAポリメラーゼのアミノ酸は、I以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、配列番号1の588番目に対応するDNAポリメラーゼのアミノ酸は、L、V、G、A、S、M、F、W、P、R、K、T、C、Y、N、Q、D、E又はHから選択される。態様によっては、配列番号1の588番目に対応するDNAポリメラーゼのアミノ酸は、Tである。
様々なDNAポリメラーゼが本発明による変異に従う。特に適切なものは、様々な種の好熱性細菌由来の野生型又は天然型の熱安定性ポリメラーゼを含む熱安定性ポリメラーゼ、ならびに、アミノ酸置換、挿入もしくは欠失、又は他の改変により、そのような野生型又は天然型の酵素から得た合成熱安定性ポリメラーゼである。非改変型ポリメラーゼの例としては、例えば、CS5、CS6もしくはZ05DNAポリメラーゼ、又はこれらと少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する機能的DNAポリメラーゼが挙げられる。他の非改変ポリメラーゼとしては、例えば、以下の好熱性細菌の種のいずれかに由来するDNAポリメラーゼ(又は、そのようなポリメラーゼと少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する機能的DNAポリメラーゼ)が挙げられる:サーモトガ・マリティマ(Thermotoga maritima)(配列番号34);サーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus)(配列番号2);サーマス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)(配列番号6);サーマス・フラバス(Thermus flavus)(配列番号4);サーマス・フィリホルミス(Thermus filiformis)(配列番号3);サーマス種sps17(Thermus sp. Sps17)(配列番号5);サーマス種Z05(Thermus sp. Z05)(配列番号1);サーモトガ・ネアポリタナ(Thermotoga neopolitana)(配列番号35);サーモシフォ・アフリカヌス(Thermosipho africanus)(配列番号33);サーマス・カルドフィラス(Thermus caldophilus)(配列番号7)、デイノコッカス・ラディオデュランス(Deinococcus radiodurans)(配列番号32)、バチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)(配列番号36)又はバチルス・カルドテナクス(Bacillus caldotenax)(配列番号37)。適切なポリメラーゼとしてはまた、逆転写酵素(RT)活性及び/又は、リボヌクレオチドもしくは他の2’改変ヌクレオチドのような特殊なヌクレオチドを取り込む能力を有するものが挙げられる。
効率的な逆転写活性を有する熱安定性DNAポリメラーゼは、特にRT−PCR、特に単一酵素RT−PCRを行うのに適切である一方、逆転写活性を有する熱活性であるが、熱安定性ではないDNAポリメラーゼもまた本発明による変異に従う。例えば、増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに/又は逆転写酵素(RT)及びポリメラーゼ阻害剤耐性の特性は、RT−PCRにおけるRT工程に重要であり、この工程は、熱活性であるが、熱安定性でないDNAポリメラーゼを不活性化する温度において行う必要がない。RT工程の後、熱安定性DNAポリメラーゼを添加することができ、あるいはPCR増幅工程を行うための反応混合物に予め含ませることができる。この二番目の方法は、RT工程の間、完全に活性化しないように、化学的に改変された熱安定性DNAポリメラーゼ(あるいは熱安定性DNAポリメラーゼを不活性化するための他のホットスタート技術)を用いることにより、特に有用である。効率的な逆転写活性を有し、熱活性であるが、熱安定性でないDNAポリメラーゼの例は、カルボキシドテルムス・ヒドロゲノホルマンス(Carboxydothermus hydrogenoformans)由来のDNAポリメラーゼ(Chy;配列番号48)である。例えば、米国特許第6,468,775号及び第6,399,320号を参照のこと。
態様によっては、当該DNAポリメラーゼは、
(a)サーマス種Z05DNAポリメラーゼ(Z05)(配列番号1);
(b)サーマス・アクアティカスDNAポリメラーゼ(Taq)(配列番号2);
(c)サーマス・フィリホルミスDNAポリメラーゼ(Tfi)(配列番号3);
(d)サーマス・フラバスDNAポリメラーゼ(Tfl)(配列番号4);
(e)サーマス種sps17DNAポリメラーゼ(Sps17)(配列番号5);
(f)サーマス・サーモフィルスDNAポリメラーゼ(Tth)(配列番号6);
(g)サーマス・カルドフィラスDNAポリメラーゼ(Tca)(配列番号7);及び
(h)カルボキシドテルムス・ヒドロゲノホルマンスDNAポリメラーゼ(Chy)(配列番号48)からなる群から選択されるポリメラーゼと、少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する。
態様によっては、上記DNAポリメラーゼはサーモトガDNAポリメラーゼである。例えば、態様によっては、当該DNAポリメラーゼは、
(a)サーモトガ・マリティマDNAポリメラーゼ(Tma)(配列番号34);
(b)サーモトガ・ネアポリタナDNAポリメラーゼ(Tne)(配列番号35);
からなる群から選択されるポリメラーゼと少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する。
態様によっては、上記DNAポリメラーゼは、配列番号1と少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、より好ましくは少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有する。態様によっては、当該DNAポリメラーゼは、サーマス種Z05DNAポリメラーゼ(Z05)DNAポリメラーゼであり、且つ709番目のアミノ酸は、I以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、当該DNAポリメラーゼは、Z05DNAポリメラーゼ(すなわち、配列番号1)であり、709番目のアミノ酸は、I、L又はM以外の任意のアミノ酸である。例えば、態様によっては、709番目のアミノ酸は、G、A、V、R、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K又はHから選択される。態様によっては、当該DNAポリメラーゼは、Z05DNAポリメラーゼであり、709番目のアミノ酸は、K、R、S、G又はAである。態様によっては、当該DNAポリメラーゼは、580番目にさらに置換を含んでなるZ05DNAポリメラーゼであり、580番目のアミノ酸は、D又はE以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、当該DNAポリメラーゼはZ05DNAポリメラーゼであり、580番目のアミノ酸は、D以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、当該DNAポリメラーゼはZ05DNAポリメラーゼであり、580番目のアミノ酸は、L、G、T、Q、A、S、N、R及びKからなる群から選択される。
態様によっては、変異ポリメラーゼは、対照DNAポリメラーゼと比較して、増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに/又は逆転写酵素(RT)及びポリメラーゼ阻害剤耐性を有する変異ポリメラーゼであり、ここで配列番号1の588番目に対応する熱安定性DNAポリメラーゼのアミノ酸は、I又はV以外の任意のアミノ酸であり、そして対照DNAポリメラーゼとは、配列番号1の588番目に対応する対照DNAポリメラーゼのアミノ酸がI又はVであることを除いて熱安定性DNAポリメラーゼと同一のアミノ酸配列を有する。態様によっては、配列番号1の588番目に対応する熱安定性DNAポリメラーゼのアミノ酸は、G、A、W、P、S、T、F、Y、C、N、Q、D、E、K、R、L、M又はHから選択される。態様によっては、ポリメラーゼは、
Pro−Asn−Leu−Gln−Asn−X1−Pro−X2−X3−X4−X5−X6−Gly
[ここで、
X1は、Ile(I)又はLeu(L)であり;
X2は、Ile(I)又はVal(V)以外の任意のアミノ酸であり;
X3は、Arg(R)又はLys(K)であり;
X4は、Thr(T)、Ser(S)又はLeu(L)であり;
X5は、Pro(P)又はGlu(E)であり;
X6は、Leu(L)又はGlu(E)である]
をポリメラーゼドメイン中に含むモチーフを含んでなる(配列番号29)。
変異誘発された又は改良されたポリメラーゼは、置換によらない他の改変を含むことができる。そのような改変の一つは、酵素を不活性化する熱可逆的な共有結合修飾であり、典型的にポリヌクレオチド伸長に用いられる温度などの高温でインキュベートすると、逆に酵素を活性化する。かかる熱可逆的修飾のための典型的な試薬は、米国特許第5,773,258号及び第5,677,152号に記載されている。
態様によっては、逆転写酵素活性は、リアルタイムRT−PCR増幅、及びpSP64ポリ(A)におけるHCV遺伝子型Ib 5’NTRの最初の800塩基から生成されるC型肝炎ウイルス(HCV)転写物の検出により行われる(Promega)ことにより決定される。2又はそれ以上の反応混合物において、C型肝炎ウイルス(HCV)転写物のコピー数を滴定することができる(数種類の反応混合物において、例えば、1:5滴定、1:10滴定、例えば、10,000コピー、1000コピー、100コピー、10コピー、1コピー、0コピー)。本発明のポリメラーゼの逆転写酵素能力を、本明細書に記載されるように、事前に選択された単位時間にわたり、参照ポリメラーゼ(例えば、天然又は非改変ポリメラーゼ)の逆転写酵素能力と比較することができる。逆転写酵素能力が改良されたポリメラーゼは、天然又は非改変ポリメラーゼと比較して、より優れた効率で転写物を増幅し、転写物を増幅するのに、より少ないPCRサイクル数を必要とする(すなわち、本明細書で計算されるように、低いCp値を示す)。さらに、態様によっては、改良されたRT機能を有するポリメラーゼはまた、長いRNA鋳型(例えば、少なくとも500又は1000又は2000又は5000又それ以上のヌクレオチド長)の改良された複製物を有する。
様々な他の面においては、本発明は、本明細書に記載される変異又は改良DNAポリメラーゼをコードする組換え核酸、前記組換え核酸を含んでなるベクター、及び前記ベクターで形質転換した宿主細胞を提供する。特定の態様においては、当該ベクターは発現ベクターである。そのような発現ベクターを含んでなる宿主細胞は、組換え核酸の発現に適切な条件下で宿主細胞を培養することにより変異又は改良ポリメラーゼを生成するための本発明の方法に有用である。本発明のポリメラーゼは、反応混合物及び/又はキットに含まれていてもよい。組換え核酸、宿主細胞、ベクター、発現ベクター、反応混合物及びキットの態様は、上記及び本明細書に記載される通りである。
さらに別の面においては、ポリヌクレオチド伸長を行う方法が提供される。本方法は通常、本明細書に記載される増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに/又はRT及びポリメラーゼ阻害剤耐性を有するDNAポリメラーゼを、プライマーが伸長するのに適切な条件下で、プライマー、鋳型ポリヌクレオチド及びヌクレオシド三リン酸と接触させ、これにより伸長されたプライマーを生成する工程を含む。該鋳型ポリヌクレオチドは、例えば、鋳型RNA又はDNAであってもよい。特定の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、RNAである。ヌクレオチド三リン酸は、例えば、リボヌクレオチド及び/又は標識されたヌクレオチドのような特殊なヌクレオチドを含むことができる。さらに、プライマー及び/又は鋳型は、1つ以上のヌクレオチド類似体を含むことができる。変形によっては、ポリヌクレオチド伸長方法は、変異又は改良DNAポリメラーゼを、ポリヌクレオチドの増幅に適切な条件下でプライマー対、鋳型ポリヌクレオチド及びヌクレオシド三リン酸と接触させる工程を含むポリヌクレオチド増幅方法である。ポリヌクレオチド伸長反応には、例えば、PCR、等温伸長又はシークエンシング(例えば、454シークエンシング反応)がなりうる。特定の態様では、プライマー伸長方法は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含む。鋳型ポリヌクレオチドは、任意の生体サンプルに由来してもよい。
任意で、プライマー伸長反応は、参照又は非改変のポリメラーゼの実際の又は潜在的な阻害剤を含む。阻害剤は、参照又は非改変(対照)のポリメラーゼの核酸伸長速度及び/又は逆転写効率を阻害することができる。態様によっては、阻害剤は、ヘモグロビン、又はこの分解産物である。例えば、態様によっては、ヘモグロビンの分解産物は、ヘム分解産物、例えばヘミン、ヘマトポルフィリン、又はビリルビンである。態様によっては、阻害剤は、鉄キレート剤又は紫色色素である。他の態様では、阻害剤は、ヘパリン又はメラニンである。特定の態様では、阻害剤は、インターカレーション染料である。態様によっては、インターカレーション染料は、[2−[N−ビス−(3−ジメチルアミノプロピル)−アミノ]−4−[2,3−ジヒドロ−3−メチル−(ベンゾ−1,3−チアゾール−2−イル)−メチルインデン]−1−フェニル−キノリニウム]+である。態様によっては、インターカレーション染料は、[2−[N−(3−ジメチルアミノプロピル)−N−プロピルアミノ]−4−[2,3−ジヒドロ−3−メチル−(ベンゾ−1,3−チアゾール−2−イル)−メチルインデン]−1−フェニル−キノリニウム]+である。態様によっては、インターカレーション染料は、[2−[N−(3−ジメチルアミノプロピル)−N−プロピルアミノ]−4−[2,3−ジヒドロ−3−メチル−(ベンゾ−1,3−チアゾール−2−イル)−メチルインデン]−1−フェニル−キノリニウム]+ではない。態様によっては、伸長に好適な条件は、Mg++を含む。態様によっては、伸長に好適な条件は、Mn++を含む。
本発明はまた、そのようなポリヌクレオチド伸長方法において有用なキットも提供する。通常キットは、本明細書に記載される変異又は改良DNAポリメラーゼを提供する、少なくとも1つの容器を含む。特定の態様においては、キットはさらに、1つ以上の追加の試薬を提供する1つ以上の追加の容器を含む。例えば、特定の変形においては、1つ以上の追加の容器は、ヌクレオシド三リン酸;ポリヌクレオチド伸長に適切な緩衝液;及び/又は、ポリヌクレオチド伸長条件下で、所定の鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な1つ以上のプライマー若しくはポリヌクレオチドプローブを提供する。鋳型ポリヌクレオチドは、任意の種類の生体サンプルに由来してもよい。
さらに、本発明のポリメラーゼを含んでなる反応混合物が提供される。反応混合物はまた、鋳型核酸(DNA及び/又はRNA)、1つ以上のポリヌクレオチドプライマー又はポリヌクレオチドプローブ、ヌクレオシド三リン酸(例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、標識されたヌクレオシド三リン酸、特殊なヌクレオシド三リン酸を含む)、緩衝液、塩類、標識(例えば、蛍光体)も含むことができる。態様によっては、鋳型ポリヌクレオチドはRNAである。態様によっては、反応混合物は、鉄キレート剤又は紫色染料を含んでなる。特定の態様では、反応混合物は、ヘモグロビン、又はヘモグロビンの分解産物を含んでなる。例えば、特定の態様では、ヘモグロビンの分解産物は、ヘム分解産物、例えばヘミン、ヘマチン、ヘマトポルフィリン(hematophoryn)、及びビリルビンを含んでなる。他の態様では、反応混合物は、ヘパリン又はこの塩を含んでなる。任意で、反応混合物は、インターカレート染料(限定することなく、上記又は本明細書の他の場所に記載されたものを含む)を含んでなる。特定の態様では、反応混合物は、血液から単離された鋳型核酸を含んでなる。他の態様では、鋳型核酸はRNAであり、反応混合物は、ヘパリン又はこの塩を含んでなる。
本発明のさらなる態様が本明細書に記載される。
定義
他に断りがない限り、本明細書で用いる技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本質的に本明細書に記載のものと同様の任意の方法及び材料を本発明の実施又は試験に用いることができるが、例示的な方法と材料のみを記載する。本発明の目的上、以下の用語は下記のとおり定義される。
用語「a」、「an」及び「the」は、文脈から明らかに別の意味を示さない限り、複数の指示対象を含む。
「アミノ酸」とは、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質中に組み込むことができる任意の単量体単位を指す。本明細書で使用する場合、「アミノ酸」という用語は、以下の20個の天然の又は遺伝的にコードされるアルファ−アミノ酸を含む:アラニン(Ala又はA)、アルギニン(Arg又はR)、アスパラギン(Asn又はN)、アスパラギン酸(Asp又はD)、システイン(Cys又はC)、グルタミン(Gln又はQ)、グルタミン酸(Glu又はE)、グリシン(Gly又はG)、ヒスチジン(His又はH)、イソロイシン(Ile又はI)、ロイシン(Leu又はL)、リジン(Lys又はK)、メチオニン(Met又はM)、フェニルアラニン(Phe又はF)、プロリン(Pro又はP)、セリン(Ser又はS)、スレオニン(Thr又はT)、トリプトファン(Trp又はW)、チロシン(Tyr又はY)及びバリン(Val又はV)。「X」残基が定義されていない場合、これらは「任意のアミノ酸」として定義する。これらの20の天然アミノ酸の構造は、例えば、Stryer et al., Biochemistry, 5th ed., Freeman and Company (2002)に示されている。セレノシステイン及びピロリジンのような追加のアミノ酸もまた、遺伝的にコードされうる(Stadtman (1996) "selenocysteine," Annu Rev Biochem. 65:83-100 and Ibba et al. (2002) "Genetic code: introducing pyrrolidine, " Curr Biol. 12(13):R464-R466)。「アミノ酸」という用語は、非天然アミノ酸、(例えば修飾された側鎖及び/又は骨格を有する)修飾アミノ酸及びアミノ酸アナログも含む。例えば、Zhang et al. (2004) "Selective incorporation of 5-hydroxy tryptophan into proteins in mammalian cells," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(24):8882-8887, Anderson et al. (2004) "An expanded genetic code with a functional quadruplet codon" Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101(20):7566-7571, Ikeda et al. (2003) "Synthesis of a novel histidine analogue and its efficient incorporation into a protein in vivo," Protein Eng. Pes. Sel. 16(9):699-706, Chin et al. (2003) "An Expanded Eukaryotic Genetic Code," Science 301(5635):964-967, James et al. (2001) "Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues," Protein Eng. Pes. Sel. 14(12):983-991, Kohrer et al. (2001) "Import of amber and ochre suppressor tRNAs into mammalian cells: A general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins," Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(25): 14310-14315,Bacher et al. (2001) "Selection and Characterization of Escherichia coli Variants Capable of Growth on an Otherwise Toxic tryptophan Analogue," J. Bacteriol. 183(18):5414-5425, Hamano-Takaku et al. (2000) "A Mutant Escherichia coli Tyrosyl-tRNA Synthetase Utilizes the Unnatural Amino Acid Azatyrosine More Efficiently than tyrosine," J. Biol. Chem. 275(51):40324-40328, and Budisa et al. (2001) "Proteins with {beta}-(thienopyrrolyl)alanines as alternative chromophores and pharmaceutically active amino acids," Protein Sci. 10(7): 1281-1292を参照のこと。
さらに例示すると、アミノ酸は典型的には、置換又は非置換のアミノ基、置換又は非置換のカルボキシ基、及び1つ以上の側鎖もしくは基、又はそれらの基のいずれかの類似体を含む有機酸である。側鎖の例としては、例えば、チオール、セレノ、スルホニル、アルキル、アリール、アシル、ケト、アジド、ヒドロキシル、ヒドラジン、シアノ、ハロ、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン又はこれらの基の任意の組み合わせが挙げられる。他の代表的なアミノ酸としては、限定しないが、光励起性架橋剤を含んでなるアミノ酸、金属結合性アミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属含有アミノ酸、新規な官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有結合的又は非共有結合的に相互作用するアミノ酸、フォトケージされた(photocaged)及び/又は光異性化可能アミノ酸、放射性アミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含んでなるアミノ酸、グリコシル化アミノ酸、他の炭水化物修飾アミノ酸、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含んでなるアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学的開裂可能な、及び/又は光開裂可能なアミノ酸、炭素結合した糖を含むアミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸及び1つ以上の有毒部位を含んでなるアミノ酸が挙げられる。
「生体サンプル」という用語は、生物から得られる様々なサンプルの種類を包含し、診断又はモニタリングアッセイにおいて用いられ得る。該用語は、尿、尿沈渣、血液、唾液、及び他の生物起源の液体サンプル、固体組織サンプル、例えば生検材料、若しくは組織培養物、又はこれらに由来する細胞、及びこれらの後代を包含する。該用語は、これらの調達後に何らかの操作、例えば試薬での処理、可溶化、沈殿又は特定の成分の濃縮をしたサンプルを包含する。該用語は、臨床サンプルを包含し、細胞培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生体液、組織サンプルも含む。
「変異」という用語は、本発明のDNAポリメラーゼに関しては、対応する機能的なDNAポリメラーゼに対して、1つ以上のアミノ酸置換を含んでなるポリペプチド、典型的には組換え体を意味する。
「非改変型」という用語は、変異ポリメラーゼに関しては、本発明の変異DNAポリメラーゼを定義づけるために本明細書で用いられる用語である:「非改変型」という用語は、変異ポリメラーゼを特徴づけるものとして特定された1つ以上のアミノ酸位置を除き、変異ポリメラーゼのアミノ酸配列を有する機能的DNAポリメラーゼを指す。したがって、(a)その非改変型及び(b)1つ以上の特定のアミノ酸置換という観点から変異DNAポリメラーゼのことを述べた場合、それは、変異ポリメラーゼが、特定のアミノ酸置換を除き、それ以外では特定のモチーフ中に非改変型と同一のアミノ酸配列を有することを意味する。「非改変ポリメラーゼ」(及び、したがって増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度及び/又はRT及びポリメラーゼ阻害剤耐性を有する改変型)は所望の機能性、例えば、ジデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、リボヌクレオチド類似体、色素標識ヌクレオチドの取り込みの改良、5’ヌクレアーゼ活性の調節、3’ヌクレアーゼ(又はプルーフリーディング)活性の調節等を提供するために追加の変異を含んでもよい。したがって、本明細書に記載されるように本発明を実施する際には、DNAポリメラーゼの非改変型をあらかじめ決定する。DNAポリメラーゼの非改変型には、例えば、野生型及び/又は天然DNAポリメラーゼ又は既に意図的に改変されたDNAポリメラーゼがなりうる。ポリメラーゼの非改変型は、好ましくは種々な好熱性細菌由来のDNAポリメラーゼのような熱安定性DNAポリメラーゼ、ならびに野生型又は天然型の熱安定性ポリメラーゼと実質的な配列同一性を有するその機能的変異体である。そのような変異体としては、例えば、米国特許第6,228,628号及び米国特許第7,148,049号に記載されたキメラDNAポリメラーゼのようなキメラDNAポリメラーゼが挙げられる。特定の態様においては、ポリメラーゼの非改変型は逆転写酵素(RT)活性を有する。
「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱に安定で、耐熱性で、二本鎖核酸を変性させるのに必要な時間の間、高温にさらした際に、続くポリヌクレオチド伸長反応を行うために十分な活性を保持し、不可逆的に変性(不活性化)しない酵素を指す。核酸の変性に必要な加熱条件は、当業界で周知であり、例えば、米国特許第4,683,202号、第4,683,195号及び第4,965,188号に例示されている。本明細書で使用するとおり、熱安定性ポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応(「PCR」)のような温度サイクル反応での使用に適切である。本明細書での不可逆的変性とは、不変で完全な酵素活性の欠失を指す。熱安定性ポリメラーゼにとって酵素活性とは、鋳型核酸鎖と相補的なポリヌクレオチド伸長産物を生成するのに適切な方法でヌクレオチドの結合を触媒する作用を指す。好熱性細菌由来の熱安定性DNAポリメラーゼとしては、例えば、サーモトガ・マリティマ、サーマス・アクアティカス、サーマス・サーモフィルス、サーマス・フラバス、サーマス・フィリホルミス、サーマス種sps17、サーマス種Z05、サーマス・カルドフィラス、バチルス・カルドテナクス、サーモトガ・ネアポリタナ及びサーモシフォ・アフリカヌス由来のDNAポリメラーゼが挙げられる。
「熱活性」という用語は、RT−PCR及び/又はPCR反応における逆転写又はアニーリング/伸長工程で通常用いられる温度(すなわち、45〜80℃)で触媒機能を維持する酵素を指す。熱安定性酵素とは、核酸の変性に必要な高温にさらした際に、不可逆的に不活性化又は変性しないものである。熱活性酵素は熱安定性であってもなくてもよい。熱活性DNAポリメラーゼは、限定しないが、大腸菌、モロニーマウス白血病ウイルス及びトリ骨髄芽球症ウイルスを含む好熱性種又は中温性種由来のDNA又はRNA依存性であってよい。
本明細書で使用する場合、「キメラ」タンパク質とは、そのアミノ酸配列が、少なくとも二つの異なるタンパク質由来のアミノ酸配列の部分配列の融合産物であるタンパク質を指す。キメラタンパク質は、典型的には、アミノ酸配列を直接操作することにより生成されるのではなく、むしろキメラアミノ酸配列をコードする「キメラ」遺伝子から発現される。特定の態様においては、例えば、本発明の変異DNAポリメラーゼの非改変型は、サーマス種DNAポリメラーゼ由来のアミノ末端(N末端)領域とTmaDNAポリメラーゼ由来のカルボキシ末端(C末端)領域からなるキメラタンパク質である。N末端領域は、N末端(1番目のアミノ酸)から内部アミノ酸までの領域をさす。同様に、C末端領域は、内部アミノ酸からC末端までの領域を指す。
「アプタマー」という用語は、米国特許第5,693,502号に記載されているように、DNAポリメラーゼを認識して結合し、ポリメラーゼ活性を効率的に阻害する一本鎖DNAを指す。RT−PCRにおけるアプタマー及びdUTP/UNGの使用はまた、例えば、Smith, E.S. et al, (Amplification of RNA: High-temperature Reverse Transcription and DNA Amplification with a Magnesium-activated Thrmostable DNA Polymerase, in PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Dieffenbach, C.W. and Dveksler, G.S., Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 211-219, (2003))に開示される。
変異DNAポリメラーゼに関する文脈において、別の配列(例えば領域、断片、ヌクレオチド又はアミノ酸位置等)との「対応」は、ヌクレオチド又はアミノ酸位置番号によるナンバリングをし、次いで配列同一性の割合を最大にするように配列をアラインメントする方法に基づく。「[特定の配列]の位置[X]に対応する」アミノ酸とは、特定された配列の同等のアミノ酸とアライメントする目的のポリペプチドにおけるアミノ酸を意味する。一般的に、本明細書に記載されるように、ポリメラーゼの位置に対応するアミノ酸は、下記に記載するアライメントアルゴリズム、例えばBLASTを用いて決定することができる。得られた「対応領域」内の全ての位置が同一である必要はないため、対応領域内の一致しない位置が「対応位置」とみなされる場合もある。したがって、本明細書で、特定のDNAポリメラーゼの「アミノ酸位置[X]に対応するアミノ酸位置」といえば、他のDNAポリメラーゼ、構造的類似体及びファミリーの中で、それらをアラインメントさせたものに基づいた同等の位置を指す。本発明の態様によっては、アミノ酸位置の「対応」を、配列番号1、2、3、4、5、6、7、32、33、34、35、36、37又は48の1つ以上のモチーフを含んでなるポリメラーゼの領域に対して決定する。ポリメラーゼのポリペプチド配列が配列番号1、2、3、4、5、6、7、32、33、34、35、36、37又は48と異なる場合には(例えば、アミノ酸の変化又はアミノ酸の付加又は欠失により)、本明細書で述べる改良された活性に関与する特定の変異は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、32、33、34、35、36、37又は48のものと同じ位置番号にはないかもしれない。このことは、例えば、表1で示される。
本明細書で使用する場合、「組換え体」とは、組換え法により意図的に改変されたアミノ酸配列又はヌクレオチド配列のことを指す。本明細書では、「組換え核酸」という用語は、一般的には制限エンドヌクレアーゼによる核酸の操作により、天然には通常ない形で、元々はin vitroで生成された核酸を意味する。したがって、直鎖状の単離された変異DNAポリメラーゼ核酸、又は通常は結合しないDNA分子を結合させることによりin vitroで生成した発現ベクターは、どちらも本発明の目的の組換え体とみなす。一旦組換え核酸を生成し、宿主細胞中に再導入すれば、それは非組換え的に、すなわち、in vitroでの操作よりもむしろ宿主細胞のin vivoの細胞機構を使って複製するだろう;しかし、一旦組換えで生成されたそのような核酸は、その後は非組換え的に複製されるが、それでも本発明の目的の組換え体とみなされることが理解される。「組換えタンパク質」は、組み換え技術を使って、すなわち、上述した組換え核酸の発現を通して、生成されたタンパク質である。
核酸は、別の核酸配列と機能的関係に置かれる時、「作用可能に連結される」。例えば、プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に作用可能に連結しており;又はリボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に作用可能に連結している。
「宿主細胞」という用語は、細胞培養において増殖させる際の単細胞原核生物と真核生物の両方(例えば細菌、酵母及び放線菌類)、そしてより高等の植物又は動物由来の単細胞を指す。
「ベクター」という用語は、典型的には二本鎖のDNA断片を指し、外来DNA断片がその中に挿入されていてもよい。又は、ベクターは例えば、プラスミド由来でもよい。ベクターは、宿主細胞内でベクターの自律複製を促進する「レプリコン」ポリヌクレオチド配列を含む。外来DNAは、宿主細胞中に本来存在しないDNAである異種DNAとして定義され、それは例えば、ベクター分子を複製し、選択可能又はスクリーニング可能なマーカーをコードするか、又は導入遺伝子をコードする。ベクターは、外来又は異種DNAを適切な宿主細胞に輸送するために用いられる。一旦宿主細胞に入れば、ベクターは宿主の染色体DNAとは独立に又はそれと同時に複製することができ、ベクターとその挿入DNAの複数のコピーを生成することができる。その上、ベクターは挿入DNAからmRNA分子への転写を可能にするか、又は挿入DNAからRNAの複数のコピーを複製する、必要な因子も含むことができる。発現ベクターの中には、発現したmRNAの半減期を長くし、かつ/又はmRNAからのタンパク質分子への翻訳を可能にする、挿入DNAに隣接した配列因子をさらに含むものもある。このように、挿入DNAによりコードされるmRNAとポリペプチドの多数の分子を、迅速に合成することができる。
「ヌクレオチド」という用語は、天然のリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドのモノマーを指すのに加え、本明細書中では、文脈から明らかにそうでないと示されていない限り、ヌクレオチドが用いられている個々の状況(例えば、相補的塩基へのハイブリダイゼーション)に関して機能的に同等である、誘導体及び類似体を含む、関連するその構造的変異体も指すことが理解されるべきある。
「核酸」又は「ポリヌクレオチド」という用語は、リボース核酸(RNA)もしくはデオキシリボース核酸(DNA)ポリマー又はその類似体に相当しうるポリマーを指すと本明細書で理解される。これは、RNAやDNAのようなヌクレオチドのポリマー、ならびに合成型、その修飾(例えば化学的又は生化学的に修飾された)型、及び混合ポリマー(例えばRNAサブユニットとDNAサブユニットの両方を含む)を含む。修飾の例としては、メチル化、類似体での天然ヌクレオチドの1つ以上の置換、無電荷結合のようなヌクレオチド間修飾(例えばメチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等)、懸垂部分(例えばポリペプチド)、挿入剤(例えばアクリジン、ソラーレン等)、キレート剤、アルキル化剤及び修飾結合(例えばアルファアノマー核酸等)が挙げられる。水素結合や他の化学的相互作用を介して指定配列に結合する能力において、ポリヌクレオチドを模倣する合成分子もまた含まれる。核酸の合成型は他の結合(例えばNielsen et al. (Science 254:1497-1500, 1991)に記載されるようなペプチド核酸)を含むことができるが、典型的には、ヌクレオチドモノマーはホスホジエステル結合を介して結合する。核酸には、例えば染色体又は染色体セグメント、ベクター(例えば発現ベクター)、発現カセット、裸のDNA又はRNAポリマー、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)産物、オリゴヌクレオチド、プローブ及びプライマーがなりえる。又は核酸はそれらを含むことができる。核酸は例えば、一本鎖、二本鎖、又は三本鎖であることができ、特定の長さに限定されない。他に断りがない限り、特定の核酸配列は、任意で、明示された任意の配列に加え、相補的配列を含んでなるか、又はコードする。
「オリゴヌクレオチド」という用語は、少なくとも2つの核酸モノマー単位(例えばヌクレオチド)を含む核酸を指す。オリゴヌクレオチドは、典型的には約6〜約175の核酸モノマー単位、より典型的には約8〜約100の核酸モノマー単位、さらにより典型的には約10〜約50の核酸モノマー単位(例えば約15、約20、約25、約30、約35又はそれ以上の核酸モノマー単位)を含む。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、そのオリゴヌクレオチドの最終的な機能又は用途を含む多くの要因によって決まる。オリゴヌクレオチドは場合により、限定しないが、既存の又は天然の配列の単離、DNA複製又は増幅、逆転写、適切な配列のクローニング及び制限消化、又はNarang et al. (Meth. Enzymol. 68:90-99, 1979)のホスホトリエステル法;Brown et al. (Meth. Enzymol. 68:109-151, 1979)のホスホジエステル法;Beaucage et al. (Tetrahedron Lett. 22: 1859-1862, 1981)のジエチルホスホルアミダイト法;Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc. 103:3185-3191, 1981)のトリエステル法;自動合成法;もしくは米国特許第4,458,066号の固相支持体法などの方法による直接化学合成、又は当業者に公知の他の方法を含む任意の適切な方法により調製される。
「プライマー」という用語は、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド伸長が開始する条件下(例えば適切な緩衝液中及び適切な温度又は温度サイクル(例えばポリメラーゼ連鎖反応でのような)で、必要なヌクレオシド三リン酸(コピーされる鋳型により決まる)の存在とポリメラーゼを含んでなる条件下)に置かれた時に、鋳型依存(鋳型−directed)の核酸合成の開始点として作用しうるポリヌクレオチドのことを指す。さらに例示すると、プライマーは様々な他のオリゴヌクレオチド媒介合成方法において、例えばRNAのde novo合成及びin vitro転写関連過程(例えば核酸配列ベース増幅(NASBA)、転写媒介増幅(TMA)等)の開始剤として、使用することもできる。プライマーは典型的には一本鎖オリゴヌクレオチド(例えば、オリゴデオキシリボヌクレオチド)である。プライマーの適切な長さは、プライマーの企図される用途により決まるが、典型的には6〜40ヌクレオチド、より典型的には15〜35ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は一般に、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するためにより低い温度を必要とする。プライマーは鋳型の正確な配列を反映する必要はないが、プライマーを伸長させるために、鋳型とハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならない。特定の態様においては、「プライマー対」という用語は、増幅させる核酸配列の5’末端の相補体とハイブリダイズする5’センスプライマー(「フォワード」と呼ばれる場合もある)と、増幅させる配列の3’末端とハイブリダイズする3’アンチセンスプライマー(「リバース」と呼ばれる場合もある)とを含むプライマーのセットを意味する(例えば、標的配列がRNAとして発現されるか、又はRNAである場合)。プライマーは、必要であれば、分光的、光化学的、生化学的、免疫化学的又は化学的手法により検出可能な標識を取り込むことにより、標識することができる。例えば、有用な標識としては、32P、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素(ELISAアッセイに汎用される)、ビオチン、又はそれに対する抗血清もしくはモノクローナル抗体が入手可能であるハプテン及びタンパク質が挙げられる。
核酸塩基、ヌクレオシド三リン酸又はヌクレオチドについて述べる場合、「従来の」又は「天然の」という用語は、記載されたポリヌクレオチド中に本来存在するもの(すなわち、DNAの場合にはdATP、dGTP、dCTP及びdTTP)を指す。加えて、シークエンシングのような、in vitroでのDNA合成反応においては、dGTPの代わりにdITP及び7−デアザ−dGTPが頻繁に用いられ、dATPの代わりに7−デアザ−dATPを用いることができる。それらをまとめて、dNTPと呼んでもよい。
核酸塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドについて述べる場合、「特殊な」又は「改変された」という用語は、特定のポリヌクレオチド中に本来存在する従来の塩基、ヌクレオシド又はヌクレオチドの改変、誘導、類似体を含む。特定の特殊なヌクレオチドは、従来のdNTPと比較してリボース糖の2’位で改変されている。したがって、RNAの場合は天然のヌクレオチドはリボヌクレオチド(すなわちATP、GTP、CTP、UTP、総称してrNTP)だが、それらのヌクレオチドは、比較したらdNTPには存在しない、糖の2’位にヒドロキシル基を有するため、本明細書では、リボヌクレオチドはDNAポリメラーゼの基質としては特殊なヌクレオチドである。本明細書では、特殊なヌクレオチドとしては、限定しないが、核酸シークエンシングにターミネーター(terminator)として用いられる化合物が挙げられる。ターミネーター化合物の例としては、限定しないが、2’,3’ジデオキシ構造を有し、ジデオキシヌクレオシド三リン酸と呼ばれる化合物が挙げられる。ジデオキシヌクレオシド三リン酸ddATP、ddTTP、ddCTP及びddGTPは、まとめてddNTPと呼ばれる。ターミネーター化合物のその他の例としては、リボヌクレオチドの2’−PO4類似体(例えば、米国特許出願公開第2005/0037991号及び第2005/0037398号を参照)が挙げられる。他の特殊ヌクレオチドとしては、ホスホロチオエートdNTP([α−S]dNTP)、5’−[α−ボラノ]−dNTP、[α]−メチルホスホネートdNTP及びリボヌクレオシド三リン酸(rNTP)が挙げられる。特殊な塩基は、32P、33P又は35Sのような放射性同位体;蛍光標識;化学発光標識;生物発光標識;ビオチンのようなハプテン標識;又は、ストレプトアビジンもしくはアビジンのような酵素標識により標識してもよい。蛍光標識としては、フルオレセインファミリーの色素のような負に帯電した色素、又はローダミンファミリーの色素のような電荷が中性である色素、又はシアニンファミリーの色素のような正に帯電した色素を挙げることができる。フルオレセインファミリーの色素としては、例えば、FAM、HEX、TET、JOE、NAN及びZOEが挙げられる。ローダミンファミリーの色素としては、テキサスレッド、ROX、R110、R6G及びTAMRAが挙げられる。FAM、HEX、TET、JOE、NAN、ZOE、ROX、R110、R6G、テキサスレッド及びTAMRAにより標識した様々な色素又はヌクレオチドは、Perkin-Elmer (Boston, MA), Applied Biosystems (Foster City, CA)又はInvitrogen/Molecular Probes (Eugene, OR)より販売されている。シアニンファミリーの色素としてはCy2、Cy3、Cy5及びCy7が挙げられ、それらはGE Healthcare UK Limited (Amersham Place, Little Chalfont, Buckinghamshire, England)により販売されている。
本明細書で使用する場合、「配列同一性の割合」は、比較ウィンドウを通して2つの最適にアラインメントさせた配列を比較することにより求められ、ここで比較ウィンドウ中の配列部分は、2つの配列の最適アラインメントのための参照配列(付加又は欠失を含まない)と比較して、付加又は欠失(すなわちギャップ)を含むことができる。割合は、同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が両方の配列中に存在する位置の数を調べて一致した位置の数を求め、一致した位置の数を比較ウィンドウ中の位置の総数で割り、その結果を100倍して配列同一性の割合を求めることにより算出する。
2つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における「同一」又は「同一性」の割合という用語は、同じである2つ以上の配列又は部分配列のことをいう。比較ウィンドウ、又は下記の配列比較アルゴリズムの1つを使ってもしくは手作業でのアラインメントと目視検査により測定するよう指定された領域にわたって、最大の対応となるように比較、アラインメントした時に、配列が同じであるヌクレオチド又はアミノ酸残基を特定の割合で有する場合(例えば、特定の領域にわたって少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%又は少なくとも95%の同一性)、配列は互いに「実質的に同一」である。これらが少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%の同一性を有する場合、配列は互いに「実質的に同一」である。それらの定義は、試験配列の相補体にも適用する。場合により、同一性は少なくとも長さ約50ヌクレオチド、又はより典型的には長さ100〜500もしくは1000以上のヌクレオチドの領域にわたって存在する。
2つ以上のポリペプチド配列に関する文脈における「類似性」又は「類似性の割合」という用語は、比較ウィンドウ、又は下記の配列比較アルゴリズムの1つを使ってもしくは手作業でのアラインメントと目視検査により測定するよう指定された領域にわたって、最大の対応となるように比較、アラインメントした時に、保存されたアミノ酸置換により定義されるものと同一か又は類似のアミノ酸残基を特定の割合(例えば、特定領域にわたって60%の類似性、場合により65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%の類似性)で有する、2つ以上の配列又は部分配列のことをいう。少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%又は少なくとも55%が互いに類似している場合、配列は互いに「実質的に類似」している。場合により、この類似性は、少なくとも長さ約50アミノ酸、より典型的には少なくとも長さ約100〜500又は1000以上のアミノ酸の領域にわたって存在する。
配列比較においては、通常1つの配列を参照配列とし、試験配列をその参照配列と比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験及び参照配列をコンピューターに入力し、必要ならば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。デフォルトプログラムパラメータが通常用いられるが、代替パラメータを指定することもできる。そしてプログラムパラメータに基づき、配列比較アルゴリズムが参照配列に対する試験配列の配列同一性又は類似性の割合を算出する。
「比較ウィンドウ」は、本明細書で使用する場合、20〜600、一般的には約50〜約200、より一般的には約100〜約150からなる群から選択される連続する位置の数のいずれか一つのセグメントを指すことを含み、ここでは、2つの配列を最適にアラインメントした後で、配列を同じ数の連続する位置の参照配列と比較してもよい。比較のための配列のアラインメント方法は当業界で周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Smith and Watermanのローカルホモロジーアルゴリズム(Adv. Appl. Math. 2:482, 1970)、Needleman and Wunschのホモロジーアラインメントアルゴリズム(J. Mol. Biol. 48:443, 1970)、Pearson and Lipmanの類似性検索法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988)、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行(例えば、GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)又は手動での配列及び目視検査(例えば、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995 supplement)参照)により実施できる。
配列同一性及び配列類似性の割合を求めるのに適切なアルゴリズムの例としては、BLAST及びBLAST2.0アルゴリズムが挙げられ、それらはそれぞれ、Altschul et al. (Nuc. Acids Res. 25:3389-402, 1977)及びAltschul et al. (J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990))に記載されている。BLAST分析を実行するためのソフトウェアは、the National Center for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)から市販されている。このアルゴリズムは、第1に、データベース配列中の同じ長さの文字列とアラインメントさせた際に、いくつかの正の値の閾値Tと一致する又は満たす検索配列中の長さWの短い文字列を同定することにより、高スコア配列ペア(HSP)を同定する。Tを、近接(neighbourhood)文字列スコア閾値と呼ぶ(上述のAltschul el al.,)。これらの初期近接文字列のヒットは、これらを含むより長いHSPを見出すための初期検索の種(シード)として機能する。文字列のヒットは、各々の配列に沿って、累積アラインメントスコアが増加し得る限り両方向に伸長する。ヌクレオチド配列についての累積スコアは、パラメータM(一致残基の対に対する報酬スコア;常に>0)及びN(不一致残基に対するペナルティスコア;常に<0)を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリクスは、累積スコアを計算するために使用される。各々の方向への文字列のヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最高値から量X減少した時、負のスコアの残基アラインメントの1つ以上の累積によって累積スコアがゼロ又はそれ以下になった時、又はいずれかの配列の末端に達した時に停止する。BLASTアルゴリズムパラメータW、T及びXは、アラインメントの感度及び速度を決定する。BLASTNプログラムは、(ヌクレオチド配列の場合)初期値として文字列の長さ(W)が11、期待値(E)が10、M=5、N=−4及び両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列の場合は、BLASTPプログラムは、初期値として文字列の長さが3、期待値(E)が10、BLOSUM62スコアリングマトリクス(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915, 1989参照)アラインメント(B)が50、期待値(E)が10、M=5、N=−4及び両鎖の比較を用いる。
BLASTアルゴリズムは、2つの配列間の類似性の統計解析も行う(例えば、Karlin and Altschul, Proc. Natl Acad. Sci. USA 90:5873-87, 1993参照)。BLASTアルゴリズムが提供する類似性の1つの基準は、最小和確率(P(N))である。P(N)は、2つのヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の間の一致が偶然に起こる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸を参照核酸と比較した最小和確率が約0.2未満、典型的には約0.01未満、より典型的には約0.001未満である場合、核酸は参照配列と類似していると見なされる。
「逆転写効率」という用語は、所定の逆転写反応において、cDNAとして逆転写されるRNA分子の比率を指す。特定の態様では、本発明の変異DNAポリメラーゼは、これらのDNAポリメラーゼの非改変の形態と比較して、改良された逆転写効率を有する。即ち、これらの変異DNAポリメラーゼは、特定の反応条件下でこれらの非改変の形態のものよりも高い比率でRNA鋳型を逆転写する。逆転写効率を、例えば、RNA鋳型を用いたPCR反応のクロッシングポイント(Cp)を測定すること、及びそのCp値と、RNA及びDNA増幅が、例えば実施例に記載されるような共通のプライマーセット及び同一のポリメラーゼを使用する(UがTに置き換えられることを除いて)同一の配列のDNA鋳型が増幅される対照反応のCp値を比較することにより、測定することができる。RNAが鋳型として用いられる場合、試験ポリメラーゼが対照ポリメラーゼと比較して減少したCp値を有するが、DNAが鋳型として用いられる場合、対照ポリメラーゼと比較して、実質的に変化していないCp値を有する場合、試験ポリメラーゼは、改良されたRT効率を有する。態様によっては、本発明のポリメラーゼは、RNA鋳型に関して、Cpが、対応する対照ポリメラーゼよりも少なくとも、1、2、3、4又は5単位少ない、改良されたRT効率を有する。
「ミスマッチ耐性」という用語は、核酸に1以上のヌクレオチドを(例えば共有結合的に)付加することにより鋳型依存的に核酸(例えば、プライマー又は他のオリゴヌクレオチド)を伸長する際に、ミスマッチ含有配列を許容するポリメラーゼの能力を意味する。用語「3’末端ミスマッチ耐性」とは、伸長される核酸(例えば、プライマー又は他のオリゴヌクレオチド)が、プライマーの3’末端のヌクレオチドにおいてその鋳型内にミスマッチを有する場合に、(ほぼ相補的な)ミスマッチ含有配列を許容するポリメラーゼの能力を意味する。鋳型に対するミスマッチはまた、プライマーの3’末端から二番目のヌクレオチド、又はプライマーの配列内の別の場所に位置してもよい。
「ミスマッチ識別能」という用語は、1つ以上のヌクレオチドを核酸(例えば、プライマー又は他のオリゴヌクレオチド)に(例えば、共有結合的に)付加することにより鋳型依存的に核酸を伸長する際に、完全に相補的な配列をミスマッチ含有配列から識別するポリメラーゼの能力を指す。「3’末端ミスマッチ識別能」という用語は、伸長させる核酸(例えば、プライマー又は他のオリゴヌクレオチド)が、核酸がハイブリダイズする鋳型と比較して、その核酸の3’末端にミスマッチを有する場合に、(ほぼ相補的な)ミスマッチ含有配列から完全に相補的な配列を識別するポリメラーゼの能力を指す。「ミスマッチ」という用語は、相補的な二重鎖形成(又は潜在的な二重鎖形成)配列ではない伸長における、1以上の塩基の不対合(又は「非相補的な塩基対合」)の存在を意味する。
「Cp値」又は「クロッシングポイント」値という用語は、標的核酸の投入量の定量ができる値を指す。Cp値は、二次導関数最大値法(second−derivative maximum method)(Van Luu-The, et al., "Improved real-time RT-PCR method for high-throughput measurements using second derivative calculation and double correction," BioTechniques, Vol. 38, No. 2, February 2005, pp. 287-293)により求めることができる。二次導関数最大値法において、Cpは二次導関数曲線の第1のピークに相当する。このピークは指数増大期の開始に相当する。二次導関数法により、リアルタイムの蛍光強度曲線の二次導関数値が算出され、1つの値のみが得られる。オリジナルのCp法は、ある区間で定義された強度値の微分可能な近似、例えば、多項式関数によるものに基づく。その後三次導関数を算出する。Cp値は、三次導関数の最小根である。Cpはまたフィットポイント法(fit point method)を用いて求めることもでき、ここでは、Cpは指数増大範囲における補助線(threshold line)との平行線の交点から求める(Van Luu-The, et al., BioTechniques, Vol. 38, No. 2, February2005, pp. 287-293)。Cp値は、二次導関数最大値法による計算により、Rocheにより提供されるLightCycler装置により提供された。
「PCR効率」という用語は、サイクルからサイクルへの増幅効率の指標を指す。PCR効率は、式:PCR効率(%)=(10(-傾き)−1)×100を用いて、それぞれの条件で算出される。ここで、傾きは、y軸にプロットされたコピー数の対数とx軸にプロットされたCpを用いた直線回帰により算出した。PCR効率を、完全一致鋳型プライマー又はミスマッチ鋳型プライマーを用いて測定することができる。
用語「核酸伸長速度」とは、生体触媒(例えば酵素、例えばポリメラーゼ、リガーゼ等)が、核酸に1以上のヌクレオチドを(例えば共有結合的に)付加することにより鋳型依存的又は鋳型非依存的に核酸(例えば、プライマー又は他のオリゴヌクレオチド)を伸長する速度を意味する。説明するように、本明細書で記載される特定の変異DNAポリメラーゼは、これらが、所定の反応条件下でこれらの非改変の形態と比較してより高い伸長速度においてプライマーを伸長することができるように、これらのDNAポリメラーゼの非改変の形態と比較して改良された核酸伸長速度を有する。
用語「RT及びポリメラーゼ阻害剤耐性」とは、対照ポリメラーゼのポリメラーゼ活性又は逆転写活性を阻害する量の阻害剤の存在下において活性(ポリメラーゼ又は逆転写活性)を維持するポリメラーゼの能力を意味する。態様によっては、改良されたポリメラーゼは、対照ポリメラーゼ活性を実質的に排除する量の阻害剤の存在下において、ポリメラーゼ又は逆転写活性を有することができる。「対照ポリメラーゼ」とは、配列番号1の709番目に対応する位置にイソロイシン(I)を含むが、それ以外は改良されたポリメラーゼと同一であるポリメラーゼを意味する。
「5’ヌクレアーゼプローブ」という用語は、少なくとも1つの発光標識部位を含んでなり、標的核酸の検出をする5’ヌクレアーゼ反応で用いられるオリゴヌクレオチドを指す。態様によっては、例えば、5’ヌクレアーゼプローブは、わずかに1つの発光部位(例えば、蛍光色素等)を含む。特定の態様においては、5’ヌクレアーゼプローブは、選択された条件下でプローブがヘアピン構造を形成することができるような自己相補的領域を含む。さらに例示すると、態様によっては、5’ヌクレアーゼプローブは少なくとも2つの標識部位を含んでなり、2つの標識のうち1つが開裂又はオリゴヌクレオチドから分離した後、発光強度が増す。特定の態様においては5’ヌクレアーゼプローブを、2つの異なる蛍光色素、例えば5’末端レポーター色素及び3’末端クエンチャー色素又は部位で標識する。態様によっては、5’ヌクレアーゼプローブを、末端部位以外の、又は末端位置に加えて1つ以上の部位で標識する。プローブがインタクトな状態であれば、典型的には、レポーター色素からの蛍光発光が少なくとも部分的には消光されるように、2つの蛍光色素分子間でエネルギー転移が起こる。ポリメラーゼ連鎖反応の伸長工程で、例えば、鋳型核酸に結合した5’ヌクレアーゼプローブは、例えばTaqポリメラーゼ又はこの活性を有する別のポリメラーゼの5’−3’ヌクレアーゼ活性により、レポーター色素の蛍光発光がこれ以上消光されないように開裂する。5’ヌクレアーゼプローブの例は、例えば、米国特許第5,210,015号;米国特許第5,994,056号;及び米国特許第6,171,785号にも記載されている。他の態様においては、5’ヌクレアーゼプローブは、2つ以上の異なるレポーター色素と3’末端クエンチャー色素又は部位で標識してもよい。
「FRET」又は「蛍光共鳴エネルギー転移」又は「フェルスター共鳴エネルギー転移」という用語は、少なくとも二つの発色分子、ドナー発色分子及びアクセプター発色分子(クエンチャーと呼ぶ)間のエネルギー転移を指す。ドナーは通常、適切な波長の光放射により励起された時、アクセプターにエネルギーを転移する。アクセプターは通常、異なる波長での光放射の形で転移されたエネルギーを再放出する。アクセプターが「ダーク」クエンチャーの場合、転移されたエネルギーは光以外の形で放出される。特定の蛍光色素分子がドナー又はアクセプターとして作用するか否かは、FRET対の他の要素の性質による。通常用いられるドナー−アクセプター対としては、FAM−TAMRA対が挙げられる。通常用いられるクエンチャーはDABCYL及びTAMRAである。通常用いられるダーククエンチャーとしては、ブラックホールクエンチャー(BlackHole Quencher)(登録商標)(BHQ)、(Biosearch Technologies, Inc., Novato, Cal.)、アイオワブラック(Iowa Black)(登録商標)(Integrated DNA Tech., Inc., Coralville, Iowa)、及びブラックベリー(登録商標)クエンチャー650(BBQ−650))(BlackBerry Quencher 650 (BBQ-650) (Berry & Assoc., Dexter, Mich.)が挙げられる。
本発明は、機能的なDNAポリメラーゼと比較して、ポリメラーゼドメイン中の1以上のアミノ酸に変異導入した、改良されたDNAポリメラーゼを提供する。本発明のDNAポリメラーゼは、ポリメラーゼの非改変の形態と比較して、(例えば、Mn2+及びMg2+二価陽イオンの存在下で)増大した逆転写酵素効率、及び/又は増大したミスマッチ耐性、伸長速度、並びに逆転写酵素(RT)及びポリメラーゼ阻害剤耐性を有する活性酵素である。特定の態様では、変異DNAポリメラーゼは、親酵素として優れた又は同等の性能のために、低い濃度で用いてもよい。
逆転写をより効率的に行なうDNAポリメラーゼは、例えば、RNA標的を検出及び/又は定量するためのRT−PCRを用いるアッセイに関する様々な用途において有用である。DNAポリメラーゼは、それ故、例えば、組み換えDNA研究及び疾患の医療診断における用途を含む、ポリヌクレオチド伸長及び鋳型ポリヌクレオチドの逆転写又は増幅に関する様々用途において有用である。変異DNAポリメラーゼはまた、変化しやすい配列(例えば、ウイルス標的、又は癌及び他の疾患の遺伝子マーカー)を有する検出標的のためのミスマッチに対するこれらの耐性のために、特に有用である。
本発明のDNAポリメラーゼは、以下のモチーフを有することにより特徴づけることができる:
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−Gly−Tyr−Val−X14−Thr−Leu(本明細書において、1文字コードで、X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−X9−X10−X11−X12−X13−G−Y−V−X14−T−Lとも呼ぶ);
ここで、
X1は、Ala(A)、Asp(D)、Ser(S)、Glu(E)、Arg(R)又はGln(Q)であり;
X2は、Trp(W)又はTyr(Y)であり;
X3は、Ile(I)、Leu(L)又はMet(M)以外の任意のアミノ酸であり;
X4は、Glu(E)、Ala(A)、Gln(Q)、Lys(K)、Asn(N)又はAsp(D)であり;
X5は、Lys(K)、Gly(G)、Arg(R)、Gln(Q)、His(H)又はAsn(N)であり;
X6は、Thr(T)、Val(V)、Met(M)又はIle(I)であり;
X7は、Leu(L)、Val(V)又はLys(K)であり;
X8は、Glu(E)、Ser(S)、Ala(A)、Asp(D)又はGln(Q)であり;
X9は、Glu(E)又はPhe(F)であり;
X10は、Gly(G)又はAla(A)であり;
X11は、Arg(R)又はLys(K)であり;
X12は、Lys(K)、Arg(R)、Glu(E)、Thr(T)又はGln(Q)であり;
X13は、Arg(R)、Lys(K)又はHis(H)であり;そして
X14は、Glu(E)、Arg(R)又はThr(T)である(配列番号8)。
態様によっては、X3は、G、A、W、P、S、T、F、Y、C、N、Q、D、E、K、V、R又はHから選択される。
態様によっては、本発明のDNAポリメラーゼは、以下のモチーフを有することにより特徴づけることができる:
X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−Glu−X10−X11−X12−X13−Gly−Tyr−Val−Xa14−Thr−Leu(本明細書において、1文字コードで、X1−X2−X3−X4−X5−X6−X7−X8−E−X10−X11−X12−X13−G−Y−V−X14−T−Lとも呼ぶ);
ここで、
X1は、Ala(A)、Asp(D)又はSer(S)であり;
X2は、Trp(W)又はTyr(Y)であり;
X3は、Ile(I)以外の任意のアミノ酸であり;
X4は、Glu(E)、Ala(A)又はGln(Q)であり;
X5は、Lys(K)、Gly(G)、Arg(R)又はGln(Q)であり;
X6は、Thr(T)又はVal(V)であり;
X7は、Leu(L)又はVal(V)であり;
X8は、Glu(E)、Ser(S)又はAla(A)であり;
X10は、Gly(G)又はAla(A)であり;
X11は、Arg(R)又はLys(K)であり;
X12は、Lys(K)、Arg(R)又はGlu(E)であり;
X13は、Arg(R)又はLys(K)であり;そして
X14は、Glu(E)又はArg(R)である(配列番号9)。
態様によっては、本発明のDNAポリメラーゼは、以下のモチーフを有することにより特徴づけることができる:
Ala−Trp−X3−X4−X5−Thr−Leu−Glu−Glu−Gly−Arg−X12−X13−Gly−Tyr−Val−Glu−Thr−Leu(本明細書において、1文字コードで、A−W−X3−X4−X5−T−L−E−E−G−R−X12−X13−G−Y−V−E−T−Lとも呼ぶ);
ここで、
X3は、Ile(I)以外の任意のアミノ酸であり;
X4は、Glu(E)又はAla(A)であり;
X5は、Lys(K)又はGly(G)であり;
X12は、Lys(K)又はArg(R)であり;そして
X13は、Arg(R)又はLys(K)である(配列番号10)。
態様によっては、配列番号9又は配列番号10のモチーフを含むDNAポリメラーゼは、配列番号2ではない。態様によっては、配列番号9又は配列番号10の位置X3に対応するアミノ酸は、Leu(L)以外の任意のアミノ酸である。
態様によっては、本発明のDNAポリメラーゼは、以下のモチーフを有することにより特徴づけることができる:
Ala−Trp−X3−X4−X5−Thr−Leu−Glu−Glu−Gly−Arg−X12−X13−Gly−Tyr−Val−Glu−Thr−Leu(本明細書において、1文字コードで、A−W−X3−X4−X5−T−L−E−E−G−R−X12−X13−G−Y−V−E−T−Lとも呼ぶ);
ここで、
X3は、Lys(K)、Arg(R)、Ser(S)、Gly(G)又はAla(A)であり;
X4は、Glu(E)又はAla(A)であり;
X5は、Lys(K)又はGly(G)であり;
X12は、Lys(K)又はArg(R)であり;そして
X13は、Arg(R)又はLys(K)である(配列番号11)。
このモチーフは、多くのファミリーA型DNA依存性DNAポリメラーゼ、特に好熱性細菌由来の熱安定性DNAポリメラーゼの「フィンガー」ドメインの中に存在する。(Li et al., EMBO J. 17:7514-7525, 1998)。例えば、図1は、以下のいくつかの細菌種由来のDNAポリメラーゼの「フィンガー」ドメインからの領域のアミノ酸配列アラインメントを示す:バチルス・カルドテナクス、バチルス・ステアロサーモフィラス、デイノコッカス・ラディオデュランス、サーモシフォ・アフリカヌス、サーモトガ・マリティマ、サーモトガ・ネアポリタナ、サーマス・アクアティカス、サーマス・カルドフィラス、サーマス・フィリホルミス、サーマス・フラバス、サーマス種sps17、サーマス種Z05及びサーマス・サーモフィルス。図示されるように、上記のモチーフに対応する天然の配列がこれらのポリメラーゼの各々に存在しており、ポリメラーゼのこの領域が保存された機能を有することが示唆される。図2は、これらのDNAポリメラーゼの間の配列同一性を示す。
したがって、態様によっては、本発明は、配列番号8、9、10又は11を含んでなり、本明細書に記載するように活性及び/又は特性が改良されているポリメラーゼを提供し、ここで、DNAポリメラーゼは、それ以外は、例えば、上記の好熱性細菌の任意の種由来のポリメラーゼのような野生型もしくは天然型のDNAポリメラーゼであるか、又はそのような野生型もしくは天然型のDNAポリメラーゼと実質的に同一である。例えば、態様によっては、本発明のポリメラーゼは、配列番号8、9、10又は11を含んでなり、配列番号1、2、3、4、5、6、7、32、33、34、35、36、37又は48と少なくとも80%、85%、90%又は95%同一である。一つの変形においては、ポリメラーゼの非改変型は、サーマス属の種由来である。本発明の他の態様では、非改変ポリメラーゼはサーマス以外の好熱性種、例えば、サーモトガ由来である。非常に多くの熱安定性DNAポリメラーゼの全核酸及びアミノ酸配列が入手可能である。サーマス・アクアティカス(Taq)(配列番号2)、サーマス・サーモフィルス(Tth)(配列番号6)、サーマス種Z05(配列番号1)、サーマス種sps17(配列番号5)、サーモトガ・マリティマ(Tma)(配列番号34)及びサーモシフォ・アフリカヌス(Taf)(配列番号33)のポリメラーゼの各配列が、国際公開第92/06200号で公開されている。サーマス・フラバス(配列番号4)由来のDNAポリメラーゼの配列は、Akhmetzjanov and Vakhitov (Nucleic Acids Research 20:5839, 1992) で公開されている。サーマス・カルドフィラス由来の熱安定性DNAポリメラーゼの配列(配列番号7)は、EMBL/GenBank Accession No. U62584で入手できる。サーマス・フィリホルミス由来の熱安定性DNAポリメラーゼの配列(配列番号3)は、表1で提供される配列情報とともに、例えば米国特許第4,889,818号で提供された方法を用いて、ATCC受託番号42380から得ることができる。サーモトガ・ネアポリタナDNAポリメラーゼの配列(配列番号35)は、GeneSeq Patent Data Base Accession No. R98144及び国際公開第97/09451号のものである。バチルス・カルドテナクス由来の熱安定性 DNAポリメラーゼの配列(配列番号37)は、例えば、Uemori et al. (J Biochem (Tokyo) 113(3):401-410, 1993; Swiss-Prot database Accession No. Q04957 and GenBank Accession Nos. D12982 and BAA02361も参照)に記載されている。本明細書に記載されるように改変できるDNAポリメラーゼの非改変型の例はまた、例えば、米国特許第6,228,628号;第6,346,379号;第7,030,220号;第6,881,559号;第6,794,177号;第6,468,775号;及び米国特許第7,148,049号;第7,179,590号;第7,410,782号;第7,378,262号にも記載されている。代表的な全長ポリメラーゼ配列はまた、本配列表でも提供されている。
すでに(例えば、アミノ酸置換、付加又は欠失により)改変されている機能的なDNAポリメラーゼもまた、本明細書で記載される変異に従う。態様によっては、そのような機能的に改変されたポリメラーゼは、配列番号8のアミノ酸モチーフ(又は配列番号9、10又は11のモチーフ)、及び任意で配列番号38のアミノ酸モチーフを保持する。したがって、好適な非改変のDNAポリメラーゼはまた、野生型又は天然型のポリメラーゼの機能的な変異体を含む。かかる変異体は、典型的には、野生型又は天然型ポリメラーゼと実質的な配列同一又は配列類似性、少なくとも80%の配列同一性、より典型的には少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するだろう。
態様によっては、本発明のポリメラーゼは、配列番号8、9、10又は11を含んでなるポリメラーゼドメインを有し、ヌクレアーゼドメイン(例えば、Z05の1〜291番目に対応する)をも含んでなる。
態様によっては、本発明のポリメラーゼはキメラポリメラーゼであり、すなわち、2つ以上の酵素由来のポリペプチド領域を含んでなる。そのようなキメラDNAポリメラーゼの例は、例えば、米国特許第6,228,628号に記載されている。特に適切なものは、キメラCSファミリーDNAポリメラーゼであり、それにはCS5(配列番号27)、CS6(配列番号28)ポリメラーゼ、及び配列番号27又は配列番号28と実質的なアミノ酸配列同一性又は類似性(典型的には少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、より典型的には少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%のアミノ酸配列同一性)を有するその変異体が含まれ、したがって、それらは配列番号8を含むように改変することができる。CS5及びCS6DNAポリメラーゼは、サーマス種Z05及びサーモトガ・マリティマ(Tma)DNAポリメラーゼに由来するキメラ酵素である。それらは、サーマス酵素のN末端5’ヌクレアーゼドメインとTma酵素のC末端3’−5’エキソヌクレアーゼ及びポリメラーゼドメインを含んでなる。これらの酵素は効率的な逆転写酵素活性を有し、ヌクレオチド類似体含有プライマーを伸長することができ、アルファ−ホスホロチオエートdNTP、dUTP、dITPならびにフルオレセイン及びシアニン色素ファミリーで標識されたdNTPを組み込むことができる。CS5及びCS6ポリメラーゼは効率的なMg2+活性化PCR酵素でもある。CS5及びCS6キメラポリメラーゼは、さらに例えば、米国特許第7,148,049号に記載されている。
態様によっては、アミノ酸置換は一つのアミノ酸置換である。本明細書で提供されるDNAポリメラーゼは、非改変のポリメラーゼと比較して、活性部位において1以上のアミノ酸置換を含むことができる。態様によっては、アミノ酸置換は、配列番号8に記載されるモチーフ(又は配列番号9、10又は11のモチーフ)の少なくともX3の位置に含む。この位置におけるアミノ酸置換は、非改変のポリメラーゼと比較して、増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに/又はRT及びポリメラーゼ阻害剤耐性を与え、増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに/又はRT及びポリメラーゼ阻害剤耐性を有する変異DNAポリメラーゼを生ずる。典型的に、X3の位置におけるアミノ酸は、配列番号8に記載されるモチーフ(又は配列番号9、10又は11のモチーフ)内の天然の配列に対応しないアミノ酸で置換される。したがって、典型的に、X3の位置におけるアミノ酸は、置換される場合、天然のポリメラーゼにおいてこれらの位置に生ずるようなIle(I)、Leu(L)又はMet(M)ではない。例えば、図1を参照のこと。特定の態様では、アミノ酸置換は、X3の位置において、G、A、W、P、S、T、F、Y、C、N、Q、D、E、K、V、R又はHを含む。特定の態様では、アミノ酸置換は、X3の位置においてリジン(K)、アルギニン(R)、セリン(S)、グリシン(G)又はアラニン(A)を含む。1以上の同定される部位における他の好適なアミノ酸置換を、例えば、部位特異的変異誘発、及び本明細書でさらに記載されるアッセイにおけるポリヌクレオチド伸長性能の決定の既知の方法、あるいは当業者に知られている他のものを用いて決定することができる。
態様によっては、本発明のポリメラーゼは、配列番号8、9、10又は11を含んでなり、さらに、天然のポリメラーゼと比較して1つ以上の追加のアミノ酸の変化(例えば、アミノ酸置換、付加又は欠失による)を含んでなる。態様によっては、そのようなポリメラーゼは、配列番号8のアミノ酸モチーフ(又は配列番号9、10又は11のモチーフ)を保持し、さらに、以下のように配列番号38のアミノ酸モチーフ(Z05(配列番号1)のD580X変異に対応する)を含んでなる:
Thr−Gly−Arg−Leu−Ser−Ser−X7−X8−Pro−Asn−Leu−Gln−Asn(本明細書において、1文字コードで、T−G−R−L−S−S−X7−X8−P−N−L−Q−Nとも呼ぶ)
ここで、X7は、Ser(S)又はThr(T)であり;
X8は、Asp(D)又はGlu(E)以外の任意のアミノ酸である(配列番号38)。
配列番号38により特徴づけられる変異は、例えば、米国特許出願公開第2009/0148891号でより詳細に述べられている。かかる機能的な変異体ポリメラーゼは、典型的には、野生型又は天然型のポリメラーゼ(例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、32、33、34、35、36、37又は48)と実質的な配列同一性、又は類似性、典型的には少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、より典型的には、少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%のアミノ酸配列同一性を有するだろう。
態様によっては、本発明のポリメラーゼは、配列番号8、9、10、又は11を含み、さらに、天然のポリメラーゼと比較して1以上の更なるアミノ酸変化(例えば、アミノ酸置換、付加又は欠失による)を含んでなる。態様によっては、そのようなポリメラーゼは配列番号8のアミノ酸モチーフ(又は配列番号9、10又は11のモチーフ)を保持し、さらに、以下のように配列番号29のアミノ酸モチーフ(Z05(配列番号1)のI588X変異に対応する)を含んでなる:
Pro−Asn−Leu−Gln−Asn−X1−Pro−X2−X3−X4−X5−X6−Gly(本明細書において、1文字コードで、P−N−L−Q−N−X1−P−X2−X3−X4−X5−X6−Gとも呼ぶ);
ここで、
X1は、Ile(I)又はLeu(L)であり;
X2は、Ile(I)又はVal(V)以外の任意のアミノ酸であり;
X3は、Arg(R)又はLys(K)であり;
X4は、Thr(T)、Ser(S)又はLeu(L)であり;
X5は、Pro(P)又はGlu(E)であり;そして
X6は、Leu(L)又はGlu(E)である(配列番号29)。
態様によっては、そのような機能的変異ポリメラーゼは、典型的には野生型又は天然型のポリメラーゼ(例えば、配列番号1、2、3、4、5、6、7、32、33、34、35、36、37又は48)と実質的な配列同一性又は類似性、典型的には少なくとも80%のアミノ酸配列同一性、より典型的には少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%のアミノ酸配列同一性を有するだろう。
態様によっては、本発明のDNAポリメラーゼは、X3の位置に(例えば、配列番号8、9、10又は11から選択されるモチーフにおいてのような)アミノ酸置換を含んでなり、配列番号38及び配列番号29に対応するアミノ酸置換を含んでなる。
1以上の同定された部位における他の好適なアミノ酸置換を、例えば、部位特異的変異誘発、及び本明細書、又は当業者に知られている他のもの、例えば、米国特許出願第2009/0148891号及び第2009/0280539号に記載されるアミノ酸置換に記載されるアッセイにおけるポリヌクレオチド伸長性能の決定の既知の方法を用いて決定される。
DNAポリメラーゼの正確な長さは変わるので、X3(例えば、配列番号8、9、10及び11のもの)、X8(配列番号38のもの)及びX2(配列番号29のもの)のそれぞれに対応する正確なアミノ酸位置は、使用する特定の変異ポリメラーゼにより変化しうる。アミノ酸及び核酸配列アラインメントプログラムは容易に入手でき(例えば、上述のもの参照)、本明細書で同定された特定の得られたモチーフが、本発明に従った改変のための正確なアミノ酸(及び対応するコドン)を同定するのに役立つ。代表的なキメラ熱安定性DNAポリメラーゼ及び例示的な好熱性種由来の熱安定性DNAポリメラーゼにおける、X3、X8及びX2のそれぞれに対応する位置を表1に示す。
表1.例示的なポリメラーゼにおけるモチーフの位置X
3(例えば、配列番号8、9、10及び11のもの)、X
8(配列番号38のもの)及びX
2(配列番号29のもの)に相当するアミノ酸の位置
態様によっては、本発明のDNAポリメラーゼは、サーマス種Z05DNAポリメラーゼ(配列番号1)由来又はその変異体(例えば、D580G変異等)である。上述したように、サーマス種Z05DNAポリメラーゼにおいては、X3の位置は709番目のイソロイシン(I)に対応し;X8の位置は580番目のアスパラギン酸(D)に対応する。このように本発明の特定の変形において、変異ポリメラーゼは、サーマス種Z05DNAポリメラーゼに対し、I709及び/又はD580において、少なくとも1つのアミノ酸置換を含んでなる。従って、典型的には、709番目のアミノ酸は、Iではない。態様によっては、709番目のアミノ酸は、G、A、V、L、R、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、又はHから選択される。特定の態様においては、709番目のアミノ酸残基は、K、R、S、G、又はAである。特定の態様においては、D580の位置のアミノ酸残基は、ロイシン(L)、グリシン(G)、スレオニン(T)、グルタミン(Q)、アラニン(A)、セリン(S)、アスパラギン(N)、アルギニン(R)及びリジン(K)から選択されうる。さらに、特定の態様では、配列番号1の588番目のアミノ酸は、I以外の任意のアミノ酸である。態様によっては、配列番号1の588番目のアミノ酸は、L、V、G、A、S、M、F、W、P、R、K、T、C、Y、N、Q、D、E又はHから選択される。態様によっては、配列番号1の588番目のアミノ酸は、Tである。
代表的なサーマス種Z05DNAポリメラーゼ変異体の例としては、アミノ酸置換I709K(又はI709R、I709S、I709G、I709A)、及び/又はI588T、及び/又はD580Gを含んでなるものが挙げられる。態様によっては、サーマス種Z05DNAポリメラーゼ変異体は、例えば、アミノ酸残基置換I709K(又はI709R、I709S、I709G、I709A)、I588T、及び/又はD580Gを含んでなる。態様によっては、サーマス種Z05DNAポリメラーゼ変異体は、例えば、アミノ酸残基置換I709K及びD580G、又はI709R及びD580G、I709S及びD580G、I709G及びD580G、又はI709A及びD580Gを含んでなる。態様によっては、サーマス種Z05DNAポリメラーゼ変異体は、例えば、アミノ酸残基置換I709K及びI588T、又はI709R及びI588T、I709S及びI588T、I709G及びI588T、又はI709A及びI588Tを含んでなる。特定の態様では、サーマス種Z05DNAポリメラーゼ変異体は、例えば、I709K、I588T、及び/又はD580Gから独立して選択されるアミノ酸残基置換を含んでなる。特定の態様では、例えば、サーマス種Z05DNAポリメラーゼ変異体は、I709R、I588T、及び/又はD580Gから独立して選択されるアミノ酸残基置換を含んでなる。特定の態様では、サーマス種Z05DNAポリメラーゼ変異体は、例えば、I709S、I588T、及び/又はD580Gから独立して選択されるアミノ酸残基置換を含んでなる。特定の態様では、サーマス種Z05DNAポリメラーゼ変異体は、例えば、I709G、I588T、及び/又はD580Gから独立して選択されるアミノ酸残基置換を含んでなる。特定の態様では、サーマス種Z05DNAポリメラーゼ変異体は、例えば、I709A、I588T、及び/又はD580Gから独立して選択されるアミノ酸残基置換を含んでなる。
本明細書に記載される配列番号8、9、10、11、29及び38のモチーフの変異に加えて、本発明のDNAポリメラーゼはまた、他の置換によらない改変を含むことができる。かかる改変は、例えば、ポリヌクレオチド伸長を含む適用において更なる利点を与えることが当業者に知られている共有結合修飾を含んでもよい。例えば、そのような改変の一つは、酵素を不活性化する熱可逆的な共有結合修飾であり、典型的にポリヌクレオチド伸長に用いられる温度などの高温でインキュベートすると、逆に酵素を活性化する。かかる熱可逆的な修飾のための典型的な試薬は、米国特許出願第5,773,258号、及び第5,677,152号に記載される。
本発明のDNAポリメラーゼは、対応する非改変ポリメラーゼ(例えば、野生型ポリメラーゼ又は本発明のポリメラーゼの由来となっている対応する変異体)をコードするDNA配列を、部位特異的変異誘発と一般に呼ばれる技術を用いて変異させることにより生成することができる。ポリメラーゼの非改変型をコードする核酸分子を、当業者に周知の様々なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術により変異させることができる(例えば、PCR Strategies (M. A. Innis, D. H. Gelfand, and J. J. Sninsky eds., 1995, Academic Press, San Diego, CA) at Chapter 14; PCR Protocols : A Guide to Methods and Applications (M. A. Innis, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky, and T. J. White eds., Academic Press, NY, 1990参照)。
非限定的な例として、ポリメラーゼの非改変型をコードするポリヌクレオチドに部位特異的変異を導入するために、クロンテック(Clontech)の部位特異的変異導入キット(Transformer Site-Directed Mutagenesis kit)を用いた2プライマー法を採用してもよい。この方法で標的プラスミドを変性した後、2つのプライマーを同時にそのプラスミドにアニーリングさせる;これらのプラスミドのうちの一方は所望の部位特異的変異を含み、他方は制限部位を削除する、プラスミド中の別の箇所の変異を含む。その後第二鎖合成を行い、これらの二つの変異をしっかりと連結し、得られたプラスミドで大腸菌mutS株を形質転換する。形質転換した菌からプラスミドDNAを単離し、関連する制限酵素で切断し(これにより変異していないプラスミドを線状化する)、次いで大腸菌を再び形質転換する。この方法を用いれば、サブクローニング又は一本鎖ファージミドの生成を必要とせずに、発現プラスミドに直接変異を生成できる。2つの変異の強固な連結及びそれに続く変異していないプラスミドの線状化により高い変異効率が得られ、最小限のスクリーニングが可能になる。最初の制限部位プライマーを合成すれば、後はこの方法では変異部位当たりたった1つの新規プライマー型の使用が必要なだけである。それぞれの位置の変異体を個別に調製するよりも、定められた部位に所望の変異の全てを同時に導入するために、「設計された縮重」オリゴヌクレオチドプライマーセットを合成することができる。変異誘発された領域を含めてプラスミドDNAの配列を決定し、変異体クローンを同定、選別することにより、形質転換体をスクリーニングすることができる。次いで各変異DNAを切断し、例えばMutation Detection Enhancement gel(Mallinckrodt Baker, Inc., Phillipsburg, NJ)での電気泳動により分析して、配列中に他の変更が起こらなかったことを確かめる(変異誘発しなかった対照とのバンドシフトの比較による)。又は、全DNA領域の配列を決定して、標的領域の外側で追加の変異現象が起こらなかったことを確かめることができる。
1つより多いアミノ酸が置換されたDNAポリメラーゼは、様々な方法で生成することができる。ポリペプチド鎖中で互いに近接した位置にあるアミノ酸の場合、所望のアミノ酸置換の全てをコードする1つのオリゴヌクレオチドを用いて同時にそれらを変異させてもよい。しかし、アミノ酸が互いにある程度の距離を置いて位置している(例えば、10アミノ酸を超えて離れている)場合、所望の変化の全てをコードする1つのオリゴヌクレオチドを生成するのはより困難である。その代わりに、2つの代替法の1つを使用してもよい。第一の方法では、置換する各アミノ酸のために、個別にオリゴヌクレオチドを生成する。次にそのオリゴヌクレオチドを一本鎖鋳型DNAに同時にアニーリングさせれば、鋳型から合成されるDNAの第二鎖が、所望のアミノ酸置換の全てをコードすることになる。別の方法では、所望の変異体を生成する2ラウンド以上の変異誘発を行う。第一ラウンドは、1つの変異について記載された通りである:非改変ポリメラーゼをコードするDNAを鋳型として使用し、第一の所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアニーリングさせ、次にヘテロ二本鎖DNA分子を生成する。変異誘発の第二ラウンドでは、変異誘発の第一ラウンドで生成した変異したDNAを鋳型として使用する。このように、この鋳型はすでに1つ以上の変異を含む。次に、追加の所望のアミノ酸置換をコードするオリゴヌクレオチドをこの鋳型にアリーリングすれば、得られたDNA鎖は、変異誘発の第一及び第二ラウンドの両方からの変異をコードすることとなる。この得られたDNAは変異誘発の第三ラウンド等で鋳型として使用できる。あるいは、Seyfang & Jin(Anal. Biochem. 324:285-291, 2004)の多部位変異誘発法を使用してもよい。
したがって、本発明のDNAポリメラーゼのいずれかをコードする組換え核酸もまた提供される。DNAポリメラーゼをコードする本発明の核酸を用いて、様々なベクターを生成することができる。宿主細胞と適合する種に由来するレプリコンと調節配列を含む任意のベクターを、本発明の実施に用いることができる。一般的に発現ベクターは、DNAポリメラーゼをコードする核酸と作用可能に連結された転写及び翻訳調節核酸領域を含む。「調節配列」という用語は、特定の宿主生物において、作用可能に連結されたコード配列が発現するのに必要なDNA配列を指す。原核生物に適切な調節配列としては、例えば、プロモーター、場合によりオペレーター配列及びリボソーム結合部位が挙げられる。さらに、ベクターは、転写されたmRNAの半減期を長くするPositive Retroregulatory Element(PRE)を含んでもよい(Gelfand et al.,米国特許第4,666,848号参照)。転写及び翻訳調節核酸領域は、ポリメラーゼを発現させるために用いる宿主細胞に一般的に適したものである。様々な宿主細胞のための、非常に多くの種類の適切な発現ベクター及び適切な調節配列が当業界において公知である。一般に、転写及び翻訳調節配列としては、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始及び終結配列、翻訳開始及び終結配列、ならびにエンハンサー又はアクチベーター配列が挙げられる。典型的な態様では、調節配列はプロモーターと転写開始及び終結配列とを含む。ベクターは通常、外来DNAの挿入のための複数の制限部位を含むポリリンカー領域を含む。特定の態様においては、精製及び、所望であれば、続けて行うFLAGタグ配列の除去を容易にするために「融合フラッグ」、例えば「Hisタグ」が用いられる。しかしながら、一般的に、「加熱工程」を使用できる中温性宿主(例えば、大腸菌)から熱活性及び/又は熱安定性タンパク質を精製する際には、それらは不要である。複製配列、調節配列、表現型選択遺伝子及び対象となるポリメラーゼをコードするDNAを含む適切なベクターの生成は、標準的な組換えDNA法を用いて行われる。当業界で周知のように(例えば、Sambrook et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press、New York、NY、2nd ed. 1989)参照)、単離されたプラスミド、ウイルスベクター及びDNA断片を切断し、加工し、特定の順序で一緒に連結して所望のベクターを生成する。
特定の態様においては、発現ベクターは形質転換された宿主細胞の選択を可能にする選択可能なマーカー遺伝子を含む。選択遺伝子は当業界で周知であり、使用する宿主細胞により異なる。適切な選択遺伝子としては、例えば、アンピシリン及び/又はテトラサイクリン耐性をコードする遺伝子を挙げることができ、こうした耐性遺伝子により、それらのベクターで形質転換された細胞がそれらの抗生物質の存在下で増殖できるようになる。
本発明の一つの面においては、DNAポリメラーゼをコードする核酸は、単独で又はベクターと共に細胞内に導入される。本明細書で使用する場合、「に導入される」又はその文法的同等語は、核酸がその後の核酸の組み込み、増幅及び/又は発現に適切な方法で細胞内に入ることを意味する。導入の方法は、標的となる細胞の種類により大きく異なる。導入方法の例としては、CaPO4沈澱、リポソーム融合、LIPOFECTIN(登録商標)、エレクトロポレーション、ウイルス感染等が挙げられる。
態様によっては、本発明の最初のクローニング工程の宿主として、典型的に、原核生物が用いられる。それらは、大量のDNAの迅速な生成、部位特異的変異誘発に用いる一本鎖鋳型DNAの生成、多数の変異体の同時スクリーニング、及び生成された変異体のDNA配列決定のために特に有用である。適切な原核生物宿主細胞としては、大腸菌K12株94(ATCCNo.31,446)、大腸菌W3110株(ATCCNo.27,325)、大腸菌K12株DG116(ATCCNo.53,606)、大腸菌X1776(ATCCNo.31,537)及び大腸菌Bが挙げられる;しかし、他の多くのHB101、JM101、NM522、NM538、NM539のような大腸菌株、及び、枯草菌(Bacillus subtilis)のようなバチルス属、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)又はセラチア・マルセサンス(Serratia marcesans)のような他の腸内細菌、様々なシュードモナス(Pseudomonas)種を含む他の多くの原核生物の種及び属は、どれも宿主として使用することができる。原核宿主細胞又は堅い細胞壁を有する他の宿主細胞は、通常上述のsection 1.82 of Sambrook et al.に記載されている塩化カルシウム法を用いて形質転換される。あるいは、それらの細胞の形質転換にエレクトロポレーションを使用することができる。原核生物の形質転換技術は、例えばDower, in Genetic Engineering, Principles and Methods 12:275-296 (Plenum Publishing Corp., 1990); Hanahan et al., Meth. Enzymol, 204:63, 1991に記載されている。大腸菌の形質転換に通常用いられるプラスミドとしては、pBR322、pUCI8、pUCI9、pUCI18、pUC119及びBluescriptM13が挙げられ、それらは全て上述のsections 1.12-1.20 of Sambrook et al.に記載されている。しかし、他の多くの適切なベクターも同様に利用可能である。
本発明のDNAポリメラーゼは、典型的に、DNAポリメラーゼをコードする核酸を含む発現ベクターにより形質転換された宿主細胞を、DNAポリメラーゼの発現を誘導するか又は引き起こすのに適切な条件下で培養することにより生成する。形質転換された宿主細胞をタンパク質発現に適切な条件下で培養する方法は、当業界で周知である(例えば前述のSambrook et al.参照)。ラムダpLプロモーター含有プラスミドベクターからのポリメラーゼの生成に適切な宿主細胞としては、大腸菌株DG116(ATCCNo.53606)(米国特許第5,079,352号及びLawyer, F.C.et al., PCR Method and Applications 2:275-87, 1993参照)が挙げられる。発現後、ポリメラーゼを回収、単離することができる。熱安定性DNAポリメラーゼの精製方法は、例えば前述のLawyer et al.に記載されている。一度精製されると、改良されたRT効率、増大したミスマッチ耐性、伸長速度、並びに/又はRT及びポリメラーゼ阻害剤耐性の能力を(例えば、実施例において記載されるように)試験することができる。
本発明の改良DNAポリメラーゼは、この種の酵素活性が必要又は所望である任意の目的に使用してよい。したがって、本発明の別の面においては、ポリメラーゼを用いたポリヌクレオチド伸長の方法(例えば、PCR)が提供される。ポリヌクレオチド伸長に適切な条件は、当業界で公知である(例えば、上述のSambrook et al.参照。Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (4th ed.,John Wiley & Sons 1999)も参照)。一般に、プライマーを標的核酸にアニーリングし、すなわちハイブリダイズさせて、プライマー−鋳型複合体を形成させる。プライマー−鋳型複合体を適切な環境下でDNAポリメラーゼ及びヌクレオシド三リン酸と接触させ、プライマーの3’末端に1つ以上のヌクレオチドを付加し、それにより標的核酸に相補的な伸長プライマーを生成する。プライマーとしては、例えば、1つ以上のヌクレオチド類似体を挙げることができる。さらに、ヌクレオシド三リン酸は、従来のヌクレオチド、特殊なヌクレオチド(例えば、リボヌクレオチド又は標識されたヌクレオチド)又はその混合物でありうる。変形によっては、ポリヌクレオチド伸長反応は、標的核酸の増幅を含んでなる。DNAポリメラーゼ及びプライマー対を用いた核酸増幅に適切な条件もまた、当業界で公知である(例えば、PCR増幅法)。(例えば、上述のSambrook et al.,;上述のAusubel et al.,; PCR Applications: Protocols for Functional Genomics (Innis et al. eds., Academic Press 1999参照))。他の相互排他的でない実施形態では、ポリヌクレオチド伸長反応は、RNA鋳型の逆転写を含む(例えば、RT−PCR)。態様によっては、改良されたポリメラーゼは、454シークエンシングにおける使用が見出される(Margulies, M et al. 2005, Nature, 437, 376-380を参照のこと)。
任意で、プライマー伸長反応は、参照又は非改変のポリメラーゼの実際のあるいは潜在的な阻害剤を含む。阻害剤は、例えば、参照又は非改変の(対照)ポリメラーゼの核酸伸長速度及び/又は逆転写効率を阻害することができる。態様によっては、阻害剤は、ヘモグロビン又はこの分解産物である。例えば、態様によっては、ヘモグロビンの分解産物は、ヘム分解産物、例えばヘミン、ヘマトポルフィリン、及びビリルビンである。態様によっては、阻害剤は、鉄キレート剤又は紫色色素である。他の態様では、阻害剤はヘパリンである。特定の態様では、阻害剤は、インターカレート染料である。特定の態様では、阻害剤は、ポリメラーゼ阻害剤として記載されているメラニンである。例えば、Ekhardt, et al., Biochem Biophys Res Commun. 271(3):726-30 (2000)を参照のこと。
本発明のDNAポリメラーゼは、ポリメラーゼ阻害剤、例えば血液を含むサンプルから単離された鋳型ポリヌクレオチドの存在下で鋳型を伸長するために用いることができる。例えば、本発明のDNAポリメラーゼは、血液の主成分であるヘモグロビンの存在下で、又はヘモグロビン分解産物の存在下で鋳型を伸長するために用いることができる。ヘモグロビンは、様々なヘム分解産物、例えばヘミン、ヘマチン、ヘマトポルフィリン、及びビリルビンに分解され得る。従って、特定の態様では、本発明のDNAポリメラーゼは、限定することなく、ヘミン、ヘマチン、ヘマトポルフィリン、及びビリルビンを含む、ヘモグロビン分解産物の存在下で鋳型を伸長するために用いることができる。特定の態様では、ヘモグロビン分解産物は、ヘミンである。態様によっては、本発明のDNAポリメラーゼは、約0.5〜20.0μM、約0.5〜10.0μM、約0.5〜5.0μM、約1.0〜10.0μM、約1.0〜5.0μM、約2.0〜5.0μM、又は約2.0〜3.0μMのヘミンの存在下で鋳型を伸長するために用いることができる。他の態様では、本発明のDNAポリメラーゼは、少なくとも約0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、10.0、20.0又は20μM超のヘミンの存在下で鋳型を伸長するために用いることができる。ヘモグロビンの分解産物は、鉄キレート剤及び紫色色素を含む。従って、態様によっては、本発明のDNAポリメラーゼは、鉄キレート剤及び/又は紫色色素の存在下で鋳型を伸長するために用いることができる。他の態様では、本発明のDNAポリメラーゼは、参照又は対照DNAポリメラーゼにより同一の鋳型の伸長を阻害する量のヘモグロビン分解産物の存在下で鋳型を伸長するために用いることができる。
本発明のDNAポリメラーゼは、ヘパリンの存在下で鋳型を伸長するために用いることができる。ヘパリンは、一般的に、血液から単離されたサンプルにおいて抗凝固因子として存在する。態様によっては、本発明のDNAポリメラーゼは、約1.0〜400ng/μl、1.0〜300ng/μl、1.0〜200ng/μl、5.0〜400ng/μl、5.0〜300ng/μl、5.0〜200ng/μl、10.0〜400ng/μl、10.0〜300ng/μl又は10.0〜200ng/μlヘパリンの存在下で鋳型を伸長するために用いることができる。態様によっては、本発明のDNAポリメラーゼは、少なくとも約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400ng/μl、又は400ng/μl超のヘパリンの存在下で鋳型を伸長するために用いることができる。他の態様では、本発明のDNAポリメラーゼは、参照又は対照DNAポリメラーゼにより同一の鋳型の伸長を阻害する量のヘパリンの存在下で鋳型を伸長するために用いることができる。
態様によっては、本発明の改良されたポリメラーゼは、逆転写反応に用いられる。態様によっては、逆転写反応は、RNA鋳型、1以上のプライマー、及び本発明の熱安定性DNAポリメラーゼを含んでなる混合物中で行なわれる。反応混合物は、典型的に、全て4つの標準的なデオキシリボヌクレオシド三リン酸、及び二価陽イオン、及び一価の陽イオンを含むバッファを含んでなる。陽イオンの例としては、例えば、Mg2+挙げらるが、他の陽イオン、例えばMn2+又はCo2+もまた、DNAポリメラーゼを活性化することができる。他の態様では、逆転写反応は、本発明の熱活性DNAポリメラーゼを用いて行なってもよい。特定の実施形態では、本発明の改良されたポリメラーゼは、実施例に記載されるような、Mn2+又はMg2+の存在下でのDNA鋳型の効率的な増幅を妥協することなく、RNA鋳型のより効率的な増幅を可能にする。
熱安定性DNAポリメラーゼにおける最も効率的なRT活性は、二価金属イオン活性化因子としてをMn2+用いて達成される。しかしながら、反応中にMn2+が存在する場合、DNAポリメラーゼの正確性は低くなることがよく知られている。変異の生成を試みない限り、一般的に、高い正確性を維持することが好まれる。幸いなことに、最も従来通りの配列決定、PCR、及びRT−PCR増幅は、検出システムが一般的に、生成物の集合で判断するため、高い正確性条件を必要としない。次世代の配列決定であるデジタルPCR等の出現に伴い、生成物の正確性はより重要となり、高い正確性のDNA合成を可能にする方法は、重要である。二価金属イオン活性化因子としてMg2+を用いて効率的なRT活性を達成することは、DNAポリメラーゼの正確性を実質的に向上させ、核酸標的のより信頼できる複製を可能にする優れた方法である。
本明細書に記載されるポリメラーゼは、増加したミスマッチ耐性を有し得るので、該ポリメラーゼは、標的鋳型の変化が起こりやすいが、鋳型が、標的鋳型における変異に関わらず増幅することが望まれる方法において、用途を見出す。かかる鋳型の例としては、例えば、ウイルス、細菌、又は他の病原体配列が挙げられる。多くの実施形態では、感染している個体が有する正確なウイルス変形に関わらず、個体(ヒト又はヒト以外の動物)がウイルス又は他の感染を有しているか否かを単に決定することが望まれる。例としては、個体を感染させる特定のウイルスが、プライマーハイブリダイゼーション部位においてミスマッチをもたらす変異を有する場合であっても、本発明のポリメラーゼを用いたHCVを増幅するためにプライマー対を使用することができ、HCVの存在を検出することができる。
標的核酸は、生物学的起源又は合成的起源に由来してもよい。標的は、例えば、DNA又はRNAでもよい。一般的に、増幅産物が生成される場合、増幅産物はDNAからなるが、リボヌクレオチド又は合成ヌクレオチドはまた、蔵副産物に組み込まれ得る。RNAを検出することを望む場合、増幅プロセスは、典型的に、逆転写PCR(RT−PCR)を含む、逆転写の使用に関する。
特定の標的配列としては、例えば、ウイルス核酸(例えば、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、B型肝炎ウイルス(HBV)、(サイトメガロウイルス(CMV)、パルボウイルスB19、エプスタイン・バールウイルス、C型肝炎ウイルス(HCV)、ヒトパピローマウイルス(HPV)、日本脳炎ウイルス(JEV)、ウエストナイルウイルス(WNV)、セントルイス脳炎ウイルス(SLEV)、マリーバレー脳炎ウイルス、及びクンジンウイルス)、細菌核酸(例えば、黄色ブドウ球菌(S. aureus)、髄膜炎菌(Neisseria meningitidis)、熱帯熱原虫(Plasmodium falciparum)、クラミジア・ムリダルム(Chlamydia muridarum)、クラミジア・トラコマチス(Chlamydia trachomatis))、マイコバクテリア核酸、真菌核酸、又は動物若しくは植物由来の核酸が挙げられる。態様によっては、標的核酸は、動物(例えば、ヒト)核酸であり、動物(例えば、ヒト)サンプル由来でもよい(即ち、ウイルス又は他の病原生物核酸は、動物生検からのサンプル、血液サンプル、尿サンプル、糞便サンプル、唾液等中に存在してもよい)。態様によっては、標的核酸は、例えば、疾患(例えば、癌、糖尿病等)に関連する変化を含み得るヒト遺伝子領域である。態様によっては、本発明のポリメラーゼがミスマッチ耐性を有するので、かかる酵素は、例えば、関連する配列の多様性が標的配列中に存在する場合、特に有用である。例としては、配列中の変化が知られている又は変化が起こる可能性が高いウイルスゲノム、又は癌若しくは他の疾患の遺伝子マーカーの大部分あるいは全てを増幅する一つの又は少数のプライマーを設計することをこれらのゲノムにおいて困難、又は不可能にするのに十分な変形を有するウイルス病原体を検出するために用いることができる。
本明細書に記載する改良ポリメラーゼを用いた、伸長産物又は増幅産物の他の検出方法としては、蛍光二本鎖ヌクレオチド結合色素又は蛍光二本鎖ヌクレオチドインターカレーション色素の使用が挙げられる。蛍光二本鎖DNA結合色素の例としては、SYBRgreen(Molecular Probes)が挙げられる。二本鎖DNA結合色素は、プライマー伸長産物及び/又は増幅産物を測定する融解曲線分析と併せて使用できる。融解曲線分析は、ABI5700/7000(96ウェル型)又はABI7900(384ウェル型)装置のようなリアルタイムPCR装置と搭載ソフトウェア(SDS2.1)を用いて行うことができる。もしくは、融解曲線分析はエンドポイント分析として行うこともできる。融解曲線分析の方法の例が米国特許出願公開第2006/0172324号に記載されている。
本発明の別の面では、本明細書に記載するプライマー伸長方法に用いられるキットが提供される。態様によっては、キットは、使用の簡易性のために区分され、本発明にしたがって改良されたDNAポリメラーゼを提供する少なくとも1つの容器を含む。追加の試薬を提供する1つ以上の追加の容器を含むこともできる。態様によっては、キットは、血液回収チューブ、容器、又はヘパリン若しくはこれらの塩を含む、又は溶液にヘパリンを放出するユニットを含んでもよい。血液回収ユニットは、ヘパリン化したチューブでもよい。そのような追加の容器は、上述の方法にしたがったプライマー伸長法で用いる当業者に認識された任意の試薬又は他の要素を含むことができ、それには、例えば、核酸増幅法(例えば、PCR、RT−PCR)、DNAシークエンシング法又はDNAラベリング法で用いる試薬が含まれる。例えば、特定の態様においては、キットはさらに、プライマー伸長条件下で所定の鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能な5’センスプライマー、又は5’センスプライマー及び対応する3’アンチセンスプライマーを含んでなるプライマー対を提供する容器を含む。他の相互排他的でない変形においては、キットは(従来の及び/又は特殊な)ヌクレオシド三リン酸を提供する1つ以上の容器を含む。特定の態様では、キットは、アルファ−ホスホロチオエートdNTP、dUTP、dITP、及び/又は例えばフルオレセイン又はシアニン色素ファミリーdNTPのような標識されたdNTPを含む。さらに他の相互排他的でない態様においては、キットは、プライマー伸長反応に適切な緩衝液を提供する1つ以上の容器を含む。
本発明の別の面においては、反応混合物は、本明細書に記載されるように、増大した逆転写酵素効率、ミスマッチ耐性、伸長速度、並びに/又はRT及びポリメラーゼ阻害剤耐性を有するポリメラーゼを含んで提供される。反応混合物は、例えば、核酸増幅法(例えば、PCR、RT−PCR)、DNAシークエンシング法又はDNAラベリング法で用いる試薬をさらに含むことができる。例えば、特定の態様においては、反応混合物はプライマー伸長反応に適切な緩衝液を含んでなる。反応混合物はまた、鋳型核酸(DNA及び/又はRNA)、1つ以上のプライマー又はプローブポリヌクレオチド、ヌクレオシド三リン酸(例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、標識されたヌクレオチド、特殊なヌクレオチドを含む)、塩類(例えば、Mn2+、Mg2+)、標識(例えば、蛍光色素分子)を含むこともできる。態様によっては、反応混合物はプライマー伸長条件下で所定の鋳型ポリヌクレオチドにハイブリダイズ可能な5’センスプライマー、又は5’センスプライマー及び対応する3’アンチセンスプライマーを含んでなるプライマー対を含む。態様によっては、反応混合物は、アルファ−ホスホロチオエートdNTP、dUTP、dITP、及び/又は例えばフルオレセイン又はシアニン色素ファミリーdNTPのような標識されたdNTPを含む。態様によっては、反応混合物は、鉄キレート剤又は紫色染料を含んでなる。特定の態様では、反応混合物は、ヘモグロビン、又はヘモグロビンの分解産物を含んでなる。例えば、特定の態様では、ヘモグロビンの分解産物は、ヘム分解産物、例えばヘミン、ヘマチン、ヘマトポルフィリン(hematophoryn)、及びビリルビンを含んでなる。他の態様では、反応混合物は、ヘパリン又はこの塩を含んでなる。特定の態様では、反応混合物は、血液から単離された鋳型核酸を含んでなる。他の態様では、鋳型核酸はRNAであり、反応混合物は、ヘパリン又はこの塩を含んでなる。
以下の実施例は本発明を例示するために提供されるが、何ら限定するものではない。
実施例1:ライブラリー生成
簡単に言えば、このスクリーニング過程における工程には、ライブラリー作成、変異酵素の発現及び部分精製、所望の性質をもつ酵素のスクリーニング、DNAシークエンシング、クローン精製、選択された変異体候補のさらなる特性評価が含まれた。これらの工程のそれぞれについて、以下にさらに説明する。
クローンライブラリー作成:Z05 D580G DNAポリメラーゼのポリメラーゼドメインをコードする核酸を、この核酸配列を含むプラスミドのBlpI及びBglII制限部位の間でエラープローン(変異誘発)PCRにかけた。増幅した配列を配列番号39とした。これに用いたプライマーは以下の通りである:
フォワードプライマー:5’−CTACCTCCTGGACCCCTCCAA−3’(配列番号30);及び
リバースプライマー:5’−ATAACCAACTGGTAGTGGCGTGTAA−3’(配列番号31)。
様々な変異率のライブラリーを作成するために、1.8〜3.6mMのMg2+濃度の範囲でPCRを実施した。緩衝液条件は、50mMビシンpH8.2、115mM KOAc、8%w/vグリセロール、0.2mMの各dNTPであった。GeneAmp(登録商標)AccuRTホットスタートPCR酵素を0.15U/μLで使用した。反応容量50μL当たり5×105コピーの線状化Z05 D580GプラスミドDNAで開始し、94℃、60秒で変性させ、続いて変性温度94℃で15秒、アニーリング温度60℃で15秒、伸長温度72℃で120秒の条件で30サイクルの増幅を行い、最後に72℃で5分間最終伸長を行った。
得られた増幅産物をQIAquickPCR精製キット(Qiagen, Inc.,Valencia, CA, USA)で精製し、BlpI及びBglIIで切断し、次いでQIAquickPCR精製キットで再び精製した。Z05 D580Gベクタープラスミドは、同じ2つの制限酵素で切断し、アルカリホスファターゼ、組換え体(RAS, cat#03359123001)で処理し、QIAquickPCR精製キットで精製することにより調製した。切断したベクターと変異した挿入断片を1:3の比で混合し、室温で5分間T4DNAリガーゼにより処理した(NEB Quick Ligation(登録商標)キット)。ライゲーションしたものをQIAquickPCR精製キットで精製し、エレクトロポレーションにより大腸菌宿主株を形質転換した。
各形質転換における特徴的な形質転換体の数を調べるために、発現した培養物の一部をアンピシリン選択培地にまいた。形質転換体は、凍結保護物質としてのグリセロールの存在下−70℃〜−80℃で保存した。
次に、各ライブラリーを大型のアンピシリン選択寒天培地にまいた。個々のコロニーを、自動コロニーピッカー(QPix2, Genetix Ltd)を用いて、アンピシリンと10%w/vグリセロールを含む2×Luriaブロスの入った384ウェルプレートに移した。それらのプレートを30℃で一晩インキュベートして培養物を増殖させ、その後−70℃〜−80℃で保存した。2×Luriaブロスに添加したグリセロールは、培養物の増殖を可能にするのに十分なほど少量だったが、凍結保護のためには十分多い量だった。後に使用するために、この方法により複数の変異誘発(Mg2+)レベルで数千個のコロニーを調製した。
抽出物ライブラリー調製1−発酵:上述のクローンライブラリーから、スクリーニング用に適切な、部分精製された抽出物の対応するライブラリーを調製した。この過程の第一工程は、各クローンの小規模の発現培養物を生成することであった。それらの培養物を96ウェルフォーマットで増殖させた;したがって、384ウェルライブラリープレート毎に4枚の発現培養物プレートとなった。0.5μLをクローンライブラリープレートの各ウェルから、150μLの培地A(下記表3を参照)を含む96ウェルの種プレートのウェルへと移した。この種プレートを、iEMSプレートインキュベーター/シェーカー(ThemoElectron)中で、1150rpm、30℃で一晩振盪培養した。次に、それらの種培養物を同じ培地に接種するのに用い、今度は大型の96ウェルプレート(Nunc #267334)の250μLの培地A中に20μLを接種した。それらのプレートを37℃で一晩振盪しながらインキュベートした。発現プラスミドは、37℃で発現するが30℃では発現しない転写調節因子を含んでいた。一晩インキュベートした後、培養物は典型的には全細胞タンパク質の1〜10%でクローンタンパク質を発現した。それらの培養物から細胞を遠心分離により回収した。それらの細胞を凍結するか(−20℃)又は後述するようにすぐに処理した。
抽出物ライブラリー調製2−抽出:発酵工程で得た細胞ペレットを25μLの溶解緩衝液(下記表3)中に再懸濁し、384ウェルのサーモサイクラープレートに移して密閉した。なお、緩衝液は細胞溶解を補助するためにリゾチームを含み、抽出物からDNAを除去するためにデオキシリボヌクレアーゼ(DNase)を含む。細胞を溶解させるために、プレートを37℃で15分間インキュベートし、−20℃で一晩凍結し、37℃で15分間再びインキュベートした。硫酸アンモニウムを添加し(2M溶液を1.5μL)、外来的に添加されたヌクレアーゼを含む汚染タンパク質を沈澱、不活性化させるために、プレートを75℃で15分間インキュベートした。プレートを3000×gで15分間、4℃で遠心し、上清を新しい384ウェルサーモサイクラープレートに移した。それらの抽出物プレートを後にスクリーニングで使用するために−20℃で凍結した。各ウェルには約0.5〜3μMの変異ライブラリーポリメラーゼ酵素が含まれていた。
実施例2:改良された逆転写効率を有する変異DNAポリメラーゼの同定
改良された逆転写効率についての抽出ライブラリーのスクリーニング:抽出ライブラリーを、pSP64ポリ(A)(Promega)中のHCV遺伝子型Ib 5’NTRの最初の800塩基を含むC型肝炎ウイルス(HCV)転写物JP2−5からの240塩基対増幅産物の増幅から、RT−PCRシステムにおける粗製酵素の蛍光5’ヌクレアーゼ(TaqMan)活性により生成された増殖曲線からのCp(クロッシングポイント)値を比較することによりスクリーニングした。
反応を、18.5μLの表4に記載するRT−PCRマスター混合物に添加された、20mM Tris−HCl、pH8、100mM KCl、0.1mM EDTA、及び0.1%Tween−20を含んでなるバッファで5倍希釈された1.5μLの個々の酵素抽出物を含む各ウェルを用いて、384ウェル形式において、Roche LC 480カイネティックサーモサイクラー上で行なった。熱サイクル条件は、65℃において1分(「RT」工程);94℃で15秒間、その後60℃で30秒の5サイクル;及び91℃で15秒、その後60℃で30秒の45サイクルであった。
上記のプロトコールを用いて、約5000個のクローンをスクリーニングした。21個のクローンを、Abs Quant/2nd derivative max法により算出された任意のカットオフ値を上回るもっとも早いクロッシングポイント(Cp)値及び蛍光プラトー値に基づいて、再スクリーニングのための元のプールから選択した。上位の抽出物に対応する培養ウェルを新鮮な増殖培地に採取して移し、最も優れた変異を含む新たな培養プレートを作るために再増殖させ、同様にいくつかの親のZ05 D580X(X=G、K、及びR)を比較に用いるために培養する。これらの培養プレートを、その後、新鮮な粗製抽出物を作製するために用い、これを定量し、表1に記載される同一のマスター混合条件を用いた20nM濃度において際すクリーニングした。表5は、TaqManプローブの切断により、FANシグナルから得られるCp値が増加することを示す。結果は、クローン0813−L15により発現されたポリメラーゼが、親のZ05 D580Gよりも高い効率でRNA標的を増幅することを示す。
ポリメラーゼ遺伝子の変異誘発領域のDNA配列を、任意の単一のクローンに存在する変異を決定するために配列決定した。クローン0815−L15を更なる試験のために選択し、このような変異ポリメラーゼタンパク質をフラスコ培養において発現させ、均一化のために精製し、そして定量した。
Mn2+型RT−PCRにおけるZ05 D580G変異体の使用:配列決定の結果は、クローン0813−L15により発現されるポリメラーゼが、親のD580G変異に加えて、I709K及びA803S変異を有していることを明らかにした。精製された変異体Z05 D580G_I709K_A803S(0813−L15)を、TaqMan Mn2+型RT−PCRにおいて親のZ05 D580Gと比較した。逆転写及びPCR効率を、JP2−5 RNA転写物及び制限エンドヌクレアーゼEcoRIを用いて消化されるpJP2−5 DNA線状プラスミドの増幅からのCp値を比較することにより測定した。オリゴヌクレオチド及びマスター混合条件(表1)は、元のスクリーニングに用いたものと同一であった。各反応は、JP2−5転写物の100,000コピー、pJP2−5線状プラスミドDNAの100,000コピー、又はpJP2−5線状プラスミドDNAの1000コピーのいずれかを有した。全ての標的を、240塩基対増幅産物を生成するための二重の反応において、上記のようにプライマー1及びプライマー2を用いて増幅した。全ての反応を15μLの反応容量で、Roche Light Cycler 480サーマルサイクラー上で行った。クロッシングポイント(Cp)をAbs Quant/2nd derivative max法により算出し、平均した。増幅を2.5nM〜30nMの濃度の範囲のDNAポリメラーゼを用いて行った。熱サイクル条件は、65℃において1分(「RT」工程);94℃で15秒間、その後60℃で30秒の5サイクル;及び91℃で15秒、その後60℃で30秒の45サイクルであった。表6は、20nM酵素条件において、TaqManプローブの切断により、蛍光シグナルから得られるCp値が増加することを示す。
結果は、変異体Z05 D580G_I709K_A803Sが、親酵素と比較して、DNA標的に関するPCR効率を損なうことなく、RNA標的のより効率的な増幅を可能にすることを示す。
Mg2+型RT−PCRにおけるZ05 D580G変異体の使用:精製された変異体Z05 D580G_I709K_A803Sを、Mg2+の存在下で、TaqMan RT−PCRを遂行する能力についても親のZ05 D580Gと比較した。マスター混合条件には、KOAc濃度が、20mM〜160mMに変更され、Mn(OAc)2が、2.1mM Mg(OAc)2で置き換えられることを除いて、表1に記載されるものと同一のものを用いた。各反応は、30nM酵素と、JP2−5転写物の100,000コピー、pJP2−5線状プラスミドDNAの100,000コピー、又はpJP2−5線状プラスミドDNAの1000コピーのいずれかを有した。全ての標的を、240塩基対増幅産物を生成するための二重の反応において、同一のプライマーセットを用いて増幅した。PCR及びRT−PCR効率をDNAとRNAのCp値を比較することにより決定した。全ての反応を15μLの反応容量で、Roche Light Cycler 480サーマルサイクラー上で行った。クロッシングポイント(Cp)をAbs Quant/2nd derivative max法により算出し、平均した。熱サイクル条件は、65℃において5分、70℃において5分、及び75℃において5分(3温度「RT」工程);94℃で15秒間、その後62℃で30秒の5サイクル;並びに91℃で15秒、その後62℃で30秒の45サイクルであった。表7は、40n KOAc条件において、TaqManプローブの切断により、蛍光シグナルから得られるCp値が増加することを示す。
結果は、変異体Z05 D580G_I709K_A803Sが、これらの条件下で、Z05 D580Gよりも著しく優れた効率で、Mg2+型RT PCRを行うことを示す。
変異に寄与する表現型の決定:クローン0815−L15により発現されたポリメラーゼは、RT−PCRスクリーニングにおいて、親のZ05 D580Gを上回る最も改良されたRNA増幅を示す。クローン0815−L15は、親のD580G変異に加えて変異I709K及びA803を有する二重変異ポリメラーゼを発現する。アミノ酸変化の性質、及びA803Sとタンパク質のC末端の近さに基づいて、我々は、I709K変異が、観察される表現型に寄与することを予測した。Z05 D580G_I709K変異をPCRに基づく部位特異的変異誘発により構築し、精製し、定量し、20mM〜160mMの様々なKOAc及び30nM酵素を用いて、Mg2+で活性化されたTaqMan RT−PCRにおいて、0815−L15(Z05 D580G_I709K_A803S)と比較した。マスター混合条件は、Mn(OAc)2が2.1mM Mg(OAc)2で置き換えられることを除いて、先に表1に記載したものと同様であった。各反応は、JP2−5転写物の100,000コピー、pJP2−5線状プラスミドDNAの100,000コピー、又はpJP2−5線状プラスミドDNAの1000コピーのいずれかを有した。全ての標的を、240塩基対増幅産物を生成するための二重の反応において、同一のプライマーセットを用いて増幅した。PCR及びRT−PCR効率をDNAとRNAのCp値を比較することにより決定した。全ての反応を15μLの反応容量で、Roche Light Cycler 480サーマルサイクラー上で行った。クロッシングポイント(Cp)をAbs Quant/2nd derivative max法により算出し、平均した。熱サイクル条件は、50℃で2分(「UNG」工程);65℃で5分、68℃で5分、及び72℃で5分(3温度「RT」工程);94℃で15秒間、その後62℃で30秒の5サイクル;並びに91℃で15秒、その後62℃で30秒の45サイクルであった。表8は、60mM KOAc条件において、TaqManプローブの切断により、蛍光シグナルから得られるCp値が増加することを示す。
Z05 D580G_I709K及びZ05 D580G_I709K_A803Sは、RNA及びDNA標的に関して、同様のCp値を有し、I709K変異は、RT−PCR性能において観察される改良に寄与することを示す。
位置I709における様々なアミノ酸置換:Z05 D580GDNAポリメラーゼのMg2+型TaqMan RT−PCR効率に関する位置I709における様々なアミノ酸置換の効果を試験した。最初に、Z05 D580GDNAポリメラーゼにおいて、該変異をPCRに基づく部位特異的変異誘発技術を用いて作製し、変異酵素を、精製し、定量した。、Z05D580G_I709変異体K(リジン)、A(アラニン)、G(グリシン)、S(セリン)、R(アルギニン)、L(ロイシン)及びD(アスパラギン酸)を、20mM〜160mMの様々な濃度のKOAc及び10nM酵素を用いて、Mg2+で活性化されたTaqMan RT−PCRにおいて比較した。マスター混合条件は、2.0mM Mg(OAc)2が用いられることを除いて、先に表1に記載したものと同様であった。各反応は、JP2−5転写物の100,000コピー、pJP2−5線状プラスミドDNAの100,000コピー、又はpJP2−5線状プラスミドDNAの1000コピーのいずれかを有した。全ての標的を、240塩基対増幅産物を生成するための二重の反応において、同一のプライマーセットを用いて増幅した。全ての反応を15μLの反応容量で、Roche Light Cycler 480サーマルサイクラー上で行った。クロッシングポイント(Cp)をAbs Quant/2nd derivative max法により算出し、平均した。熱サイクル条件は、50℃で3分(「UNG」工程);65℃にで5分、68℃で5分、及び72℃で5分(3温度「RT」工程);95℃で15秒間、その後62℃で30秒の5サイクル;並びに91℃で15秒、その後62℃で30秒の45サイクルであった。表9は、80mM KOAc条件において、TaqManプローブの切断により、蛍光シグナルから得られるCp値が増加することを示す。
この実施例は、Z05 D580G DNAポリメラーゼの位置709におけるいくつかのアミノ酸置換が、RNA標的のより効率的な増幅をもたらすことを示す。
実施例3:改良された3’プライマーミスマッチ耐性についての抽出ライブラリースのスクリーニング
実施例1の抽出ライブラリーを、プライマーM13mp18の配列に完全に一致するプライマー(DG48;配列番号40、表10)の酵素による伸長後の最終的な蛍光と、3’A:Aミスマッチを有するプライマー(FR744;配列番号42;表10)の最終的な蛍光を比較することにより、改良された3’プライマーミスマッチ耐性についてスクリーニングした。
DG48 完全一致:
5’−GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGC−3’(配列番号40)
FR744 A:Aミスマッチ:
5’−GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCA−3’(配列番号42)
上記の酵素抽出物を、384ウェルサーモサイクラープレート中で、2.5μLの抽出物と、20mM Tris−HCl、pH8、100mM KCl、0.1mM EDTA及び0.2%Tween−20を含んでなる22.5μLのバッファを合わせることにより、プライマー伸長反応のために10倍に希釈し、蓋をし、90℃で10分間加熱した。完全一致プライマーを含む対照反応は、384ウェルPCRプレート中で、0.5μLの希釈された抽出物と15μLマスター混合物を合わせた。プライムする鋳型の伸長を、CCDカメラを用いた改変されたカイネティックサーマルサイクラーにおいて、15秒毎に観察した(Watson、同上を参照のこと)。マスター混合物は、1nMのプライムする鋳型プライマー、25mMトリシン、pH8.3、100mM KOAc、0.6X SYBR Green I、200μM各dNTP、100nMアプタマー、及び2.5mM Mg(OAc)2を含んでなる。伸長に由来する蛍光と、バックグラウンドの蛍光を区別するために、並行するウェルを、プライマー鎖伸長が、反応マスター混合物からヌクレオチドを除くことにより防がれる実験に含んだ。3’ミスマッチプライマー(FR744、配列番号42)を含む反応を、1.0μLの希釈された抽出物を各反応に添加することを除いて、上記のように行った。
上記のプロトコールを用いて、約5700個の変異体抽出物をスクリーニングした。クローンを、40℃で1分の伸長、その後の64℃における8.5分の伸長後に開始のベースラインと比較した最大蛍光に基づいて選択した。この基準に基づいて、比較的少数の抽出物を精製及び更なる試験のために選択した。これらを、クローンの純度を確実にするために、選択寒天プレートに縞状に播種し、ポリメラーゼ遺伝子の変異領域のDNA配列を、任意の単一のクローンに存在した変異を決定するために、配列決定した。この試験に並行して、変異ポリメラーゼタンパク質をフラスコ培養において発現させ、均一性のために精製し、定量した。
実施例4:M13鋳型に対する様々な3’ミスマッチのプライマー伸長
この実施例は、位置588及び709における置換が、3’ミスマッチのプライマーを用いて鋳型を伸長する改良された効率を有するポリメラーゼをもたらすことを例証する。
精製されたZ05 D580G I588T I709Kを、M13mp18鋳型に対する様々な3’ミスマッチのプライマー伸長において、親酵素Z05 D580Gと比較した。鋳型及びプライマを下記の表10に列挙する。
プライマーを10:1のプライマー:鋳型比において、M13mp18鋳型と予めアニーリングさせ、5nM酵素及び25mMトリシン、pH8.3、100mM KOAc、0.6X SYBR Green I、200μM各dNTP、100nMアプタマー、並びに2.5mM Mg(OAc)2と併せて、1nM最終濃度で伸長反応に添加した。反応をCCDカメラを用いて、改変されたカイネティックサーマルサイクラー中で、15秒毎に観察されるプライムされた鋳型の伸長を用いて3重に行なった(Watson、同上を参照のこと)。複製物を、平均し、各条件についての最大勾配を、時間にわたる蛍光の変化として算出した。結果を下記の表11に示す。
この実施例は、Z05 D580G I588T I709Kが、完全一致プライマー鋳型の伸長において親酵素Z05 D580Gより約2倍超早く、3’末端ミスマッチに依存して3’末端ミスマッチプライマー鋳型の伸長において、約2〜10倍超早いことを示す。
実施例5:変異ポリメラーゼを用いた、野生型BRAFヒトゲノム鋳型と比較した、変異BRAFプラスミド鋳型の増幅
この実施例は、変異588及び709が、親酵素と比較して改良されたミスマッチ耐性を有するポリメラーゼをもたらすことを示す。
精製されたZ05 D580G I588T I709Kを、野生型ヒトゲノムDNAのバックグラウンドにおける、変異BRAF V600E標的の改良されたミスマッチ耐性について、TaqMan PCRにおいて親酵素Z05 D580Gと比較した。
フォワードプライマーは、変異配列と完全に一致し、野生型配列に対して一つの3’A:Aミスマッチを有する。反応は、16μLの最終容量中、野生型ヒトゲノム細胞株DNAの最も早い10,000コピー(33ng)、又はBRAF V600E変異配列を含む線状プラスミドの100又は10,000コピーを有する。酵素の様々な塩の最適化を可能にするために、増幅を、40〜145mMのKClの濃度範囲を用いて行った。バッファ条件は、50mM Tris−HCl pH8.0、2.5mM MgCl2、0.2mM各dNTP、0.02U/μL UNG、及び200nMアプタマーであった。フォワード及びリバースプライマーは、100nMであり、TaqManプローブは、25nMであった。全てのDNAポリメラーゼを、20nMにおいて評価し、2%(v/v)酵素保存バッファ(50%v/vグリセロール、100mM KCl、20mM Tris pH8.0、0.1mM EDTA、1mM DTT、0.5%Tween20)を添加した。反応を、Roche LightCycler 480サーマルサイクラー中で行い、60秒間、95℃の温度で変性させ、その後10秒間、92℃の変性温度、及び30秒間、62℃のアニーリング温度を用いて99サイクルの増幅を行った。
反応を二重に行い、クロッシングポイント(“Cp”)をAbs Quant/2nd derivative Max法により算出し、Cpを平均した。平均されたCp値を表12に示し、最も早い高コピー変異Cpをもたらす各酵素についてのKCl濃度においてPCR効率を算出した。高コピーΔCpは、3’ミスマッチを有する野生型ゲノム標的の10,000コピーを含む反応の平均Cp値と、完全一致プラスミド標的の10,000コピーを含む反応の平均Cp値との差に等しい。
本実施例は、Z05 D580G I588T I709Kが、高コピーΔCpにおいて2.3サイクルの改良をもたらすこと例証し、本PCRシステムにおいて、3’末端A:Aミスマッチの改良された耐性を例証する。
実施例6:変異ポリメラーゼは、阻害剤の存在下で改良された活性を有する。
本実施例は、I709K変異が、DNAポリメラーゼの既知の阻害剤の存在下で改良されたRT−PCR効率をもたらすことを例証する。
ヘミン
血液中の重要な成分であるヘモグロビンは、様々なヘム分解産物、例えばヘミン、ヘマチン、ヘマトポルフィリン、及び最終的にはビリルビンに分解され得る。これらの分子は、鉄キレート剤及び紫色色素の双方であるので、これらは、ポリメラーゼ及び/又は逆転写酵素活性を阻害するいくつかの機構を用い得る。
HCV RNA転写物を用いたモデルシステムは、Z05、Z05 D580G又はZ05 D580G I709Kポリメラーゼを用いたRT−PCRにおけるヘミンの阻害的効果を決定するために用いられる。45U DNA pol Z05、Z05 D580G又はZ05 D580G I709Kを、2.5uMヘミン(DNA polに対して40M倍過剰)の添加及び不添加で、HCV RNA転写物の1,000コピーを増幅するRT−PCR条件(120mM KOAc、3.3mM Mn2+、60mMトリシン;合計50uL)において試験した。これらの反応を、12分のRT工程、続く変性及び伸長の50サイクルを用いてRoche LightCycler 480リアルタイムPCR装置中で行った。リアルタイム蛍光を、最後の50サイクルの間、JA270及びCY5.5チャネルにおいて検出した。各反応について、蛍光5’ヌクレアーゼ(TaqMan)活性により生成される増殖曲線からのCp(クロッシングポイント)値を、装置の「2nd derivative Max analysis」法を用いて決定した。全ての正常な反応のCpを、表13に示すように、ヘミンを含むものと比較した。2.5uMヘミンの存在下で、HCV RNAの増幅は、Z05により観察されなかったのに対し、変異体Z05 D580Gは、3.4サイクル遅れたCp(対ヘミンを含まない対照)でHCVを検出し、Z05 D580G I709Kは、2.5サイクル早いCp(対ヘミンを含まない対照)でHCVを検出した。
アガロース電気泳動は、これらの効果は、減少した増幅に寄るものであり、ポルフィリンヘミン分子によるクエンチングによるものではないことを確証した。同様の結果は、HCV DNA鋳型存在下で得られ、ヘミンが一般的にPCR阻害剤として作用することを示唆する。
ヘパリン
ヘパリンは、高度に硫酸化されたグリコサミノグリカンであり、最も高い負の電荷密度を有する任意の既知の生体分子の一つを含む。それ自体、核酸基質をによく似ており、しばしばタンパク質‐DNA/RNA結合アッセイにおいて非特異的競合物として用いられる。ヘミンが一般的なポリメラーゼ及びPCR阻害剤として作用するのに対し、ヘパリンは、好ましいことに逆転写、例えば、Z05型DNAポリメラーゼを阻害する。
上記のHCV RNA RT−PCR増幅モデルシステムを用いて、100、200、400又は1000ng/uLのヘパリンの存在を、Z05、Z05 D580G、又はZ05 D580G I709Kポリメラーゼを用いて、阻害的効果を決定するために試験した。全ての正常な反応のCpを、ヘパリンを含むものと比較した(表14)。野生型Z05酵素が12.5ng/uLヘパリンの存在下でHCV RNAを増幅することができないのに対し、Z05 D580G及びZ05 D580G I709K変異体は、最小のCp遅延とともに、最大200又は1000ng/ulヘパリンに対する耐性を有し、これらの変異体が、それぞれ少なくとも15〜80倍超の耐性を有することを示す。
RNA及びDNA基質間の直接的な比較は、Z05 D580G及びZ05 D580G I709KによるDNAの増幅が、高レベルのヘパリンの存在により完全に影響を受けないことを明らかにした。全体として、これらのデータは、ヘパリンが逆転写をより特異的に阻害する阻害剤であるという考えを支持する。DNA polのヘパリンに対する耐性は、それぞれの特定の酵素についての本質的なRT活性と直接的に相関する。
本実施例は、I709K変異が、阻害剤であるヘミン及びヘパリンの存在下において改良されたRT−PCR効率をもたらすことを示す。
実施例7:変異ポリメラーゼは、RNA鋳型を伸長する場合に、改良されたプライマーミスマッチ耐性を有する。
本実施例は、D580G及びI709K変異が、RNA鋳型に対するプライマーミスマッチについての改良された耐性を有するポリメラーゼをもたらすことを例証する。
ミスマッチ耐性
末端、N−1及びN−2のミスマッチを、ポリメラーゼZ05、Z05 D580G及びZ05 D580G I709Kを含む、RT−PCR条件(120mM KOAc、3.3mM Mn2+、60mMトリシン;50uLの合計反応容量)において体系的に評価することができるように、HCV RNA転写物をプライマー3’末端の領域において変異誘発した。これらの反応を、12分のRT工程、続く変性及び伸長の50サイクルを用いてRoche LightCycler 480リアルタイムPCR装置中で行った。リアルタイム蛍光を、最後の50サイクルの間、JA270及びCY5.5チャネルにおいて検出した。各反応についての蛍光5’ヌクレアーゼ(TaqMan)活性により生成される増殖曲線からのCp(クロッシングポイント)値を、装置の「2nd derivative Max analysis」法を用いて決定した。様々なDNAポリメラーゼについてのプライマーミスマッチ耐性を、Cp値を比較することにより決定した。表15に示すように、Z05 D580Gは、ミスマッチプライマーを用いた場合に、一貫してZ05よりもより早いCp値を有した(Nは、下に示すプライマー:鋳型ミスマッチを有するプライマー3’末端上の位置を表す)。重要なことに、Z05 D580Gは、親Z05酵素が検出することのできないいくつかのミスマッチを検出することができる。
表16では、ΔCp値を、示されるような各ミスマッチについて、Z05 D580GのCp値をZ05 D580G I709Kと比較することにより決定した。従って、正のΔCp値は、TaqMan(登録商標)シグナルがZ05 D580G I709Kにより何回のサイクル先に検出されるかを示す。全体として、変異Z05 D580G I709Kは、優れたプライマーミスマッチ耐性を示し、示されるミスマッチについて、親酵素Z05 D580Gよりも平均で4サイクルの改良を提供し、PCR性能において16倍の改良を示す。
上記の実施例は、Z05ポリメラーゼの位置580及び709における置換が、ミスマッチプライマーを用いた場合に、改良されたRT−PCR効率をもたらすことを示す。
実施例8:709変異は、RT−PCR効率を改良する。
本実施例は、Z05 DNAポリメラーゼにおけるI709Kの単一の変異が、DNA鋳型を増幅する場合に、効率を減少ることなく、改良されたRT−PCR効率を有するポリメラーゼをもたらすことを示す。
I709K変異を、Z05 DNAポリメラーゼ骨格に、単一の変異としてサブクローニングした。発現及び精製後、変異体Z05 I709KのRT−PCR効率を、Mn2+型TaqMan(登録商標)RT−PCRにおいて、DNAポリメラーゼZ05、Z05 D580G、及びZ05 D580G I709Kと比較した。マスター混合物条件を、Mn(OAc)2濃度が1.5mM、UNG濃度が0.2U/μL、及びプローブ濃度が100nMであることを除いて、先の表4に記載されるものと同一であった。各DNAポリメラーゼを20mM Tris−HCl、pH8、100mM KCl、0.1mM EDTA、及び0.1% Tween−20を含んでなるバッファで希釈し、個々に5X酵素酵素ストックを作製した。その後、3μLの5X酵素ストックを15μLの合計反応容量中、最終酵素濃度20nMとなるように、適切な反応ウェルに添加した。各反応は、JP2−5転写物の100,000コピー、pJP2−5線状プラスミドDNAの100,000コピー、又はpJP2−5線状プラスミドDNAの1000コピーのいずれかを有した。全ての標的を、240塩基対増幅産物を生成するための四重の反応において、同一のプライマーセットを用いて増幅した。全ての反応をRoche Light Cycler 480サーマルサイクラー上で行った。クロッシングポイント(Cp)をAbs Quant/2nd derivative max法により算出し、平均した。熱サイクル条件は、50℃で2分(「UNG」工程);55℃で30秒、60℃で1分、及び65℃で1.5分(3温度「RT」工程);94℃で15秒間、その後62℃で30秒の5サイクル;並びに91℃で15秒、その後62℃で30秒の45サイクルであった。表17は、TaqMan(登録商標)プローブの切断により、蛍光シグナルから得られるCp値が増加することを示す。
本実施例は、I709K変異が、親酵素Z05と比較した場合、DNA鋳型を用いる増幅効率を減少させることなく、RNA鋳型を用いる増加した逆転写及び増幅効率をもたらすことを示す。
本明細書に記載する実施例及び態様は、単に例示することが目的であり、その内容を踏まえた様々な改変又は変形が当業者に提示されるであろうことが分かる。
非公式配列表