WO2020013058A1 - Ｒｎａからの核酸増幅反応に適したｄｎａポリメラーゼ変異体 - Google Patents

Ｒｎａからの核酸増幅反応に適したｄｎａポリメラーゼ変異体 Download PDF

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WO2020013058A1
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WO
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amino acid
acid residue
dna polymerase
mutant
reverse transcriptase
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PCT/JP2019/026513
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上森　隆司
裕之 松本
憲介 齋藤
美和 秋友
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タカラバイオ株式会社
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1252—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07007—DNA-directed DNA polymerase (2.7.7.7), i.e. DNA replicase
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides

Definitions

  • the present invention relates to a DNA polymerase mutant suitable for a nucleic acid amplification reaction from RNA. Furthermore, the present invention relates to a method for improving the activity of amplifying a nucleic acid from an existing DNA polymerase, and a method for producing a mutant DNA polymerase suitable for a nucleic acid amplification reaction from the RNA.
  • DNA polymerase plays a central role in the accurate transmission of genetic information from generation to generation, such as replication and retention of the genome.
  • DNA polymerases function intracellularly as enzymes responsible for the synthesis of DNA.
  • Deoxyribonucleoside triphosphates are present in the presence of metal activators such as Mg 2+ in the order required for replication of template DNA or template polynucleotide. Is polymerized.
  • DNA polymerase is involved in a series of DNA synthesis processes including DNA replication, DNA repair, recombination and gene amplification. During each DNA synthesis step, the template DNA is replicated once or several times to produce identical duplicates.
  • DNA replication can be repeated many times, for example, as in the polymerase chain reaction.
  • RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
  • a one-step RT-PCR method has been developed in which the reverse transcription reaction and PCR are performed continuously without opening the reaction vessel.
  • a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity may be used.
  • the reverse transcription reaction and the PCR are performed with the same reaction solution composition, it is essential to balance the reverse transcription reaction and the PCR.
  • techniques for improving the reverse transcription efficiency when the reverse transcription reaction and the PCR have the same reaction solution composition have been reported. (See Patent Documents 1 to 3).
  • An object of the present invention is to provide an improved genetic engineering method for creating a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity suitable for performing a reverse transcription reaction and a nucleic acid amplification reaction in the same container.
  • the present inventors have conducted intensive studies to develop a DNA polymerase mutant having a reverse transcriptase activity suitable for performing a reverse transcription reaction and a nucleic acid amplification reaction.
  • the present inventors have succeeded in finding a method for producing a DNA polymerase mutant having a reverse transcriptase activity superior to that of the prior art, and completed the present invention.
  • a first invention of the present invention is a mutant of a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity, comprising a sequence consisting of 12 amino acids A1 to A12, wherein A1 is a branched-chain amino acid residue.
  • A2 is a hydrophilic neutral amino acid residue or a hydrophobic aliphatic amino acid residue
  • A3 is a hydrophilic neutral amino acid residue
  • A4 is an acidic amino acid residue or a hydrophilic neutral amino acid residue
  • A5 is a branched amino acid residue
  • A6 is a hydrophobic aliphatic amino acid residue or a hydrophilic neutral amino acid residue
  • A7 is a branched-chain amino acid residue
  • A8 is a proline residue or a hydrophilic neutral amino acid residue
  • A9 is a hydrophobic aromatic amino acid residue, a basic amino acid residue or a hydrophilic neutral amino acid residue
  • A10 is an acidic amino acid residue or a basic amino acid residue
  • A11 is an acidic amino acid residue
  • A12 is a hydrophobic aliphatic amino acid residue
  • the amino acid of A3 and / or A10 has been substituted with another basic amino acid residue different from that before mutation.
  • mutant DNA polymerase having reverse transcriptase activity wherein A1 is leucine, A3 is glutamine, A5 is leucine, A7 is isoleucine, and A11 is Those in which glutamic acid and A12 are alanine are preferred.
  • the amino acid of A3 and / or A10 in the sequence of 12 amino acids is selected from the group consisting of lysine, arginine and histidine. What is substituted by is preferable. Although not particularly limited, substitution with arginine is preferred.
  • the mutant DNA polymerase having a reverse transcriptase activity of the first invention of the present invention is particularly preferably derived from a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity suitable for performing a reverse transcription reaction and a nucleic acid amplification reaction in the same container.
  • a DNA polymerase derived from Thermus thermophilus a DNA polymerase derived from Thermus aquaticus, a DNA polymerase derived from Bacillus cardotenax, a DNA polymerase derived from Bacillus stearothermophilus, or a DNA derived from Alicyclobacillus acid Caldarius Polymerase variants are preferred.
  • the second invention of the present invention relates to a kit comprising the DNA polymerase mutant having a reverse transcriptase activity of the first invention of the present invention.
  • the kit may include various components as a kit for preparing a reaction solution suitable for a reverse transcription reaction and a nucleic acid amplification reaction described below.
  • the third invention of the present invention relates to a composition comprising the DNA polymerase mutant having a reverse transcriptase activity of the first invention of the present invention.
  • the composition may contain various components as a composition suitable for a reverse transcription reaction and a nucleic acid amplification reaction described below.
  • the fourth invention of the present invention is a method for producing a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity suitable for nucleic acid amplification from RNA, (1) selecting a DNA polymerase comprising a sequence consisting of the following 12 amino acids A1 to A12; A1 is a branched amino acid residue; A2 is a hydrophilic neutral amino acid residue or a hydrophobic aliphatic amino acid residue; A3 is a hydrophilic neutral amino acid residue; A4 is an acidic amino acid residue or a hydrophilic neutral amino acid residue; A5 is a branched amino acid residue; A6 is a hydrophobic aliphatic amino acid residue or a hydrophilic neutral amino acid residue, A7 is a branched-chain amino acid residue; A8 is a proline residue or a hydrophilic neutral amino acid residue; A9 is a hydrophobic aromatic amino acid residue, a basic amino acid residue or a hydrophilic neutral amino acid residue; A10 is an acidic amino acid residue or a basic amino
  • step (1) in the sequence consisting of the 12 amino acids in the step (1), A1 is leucine, A3 is glutamine, A5 is leucine, A7 is isoleucine, A11 is glutamic acid and A12 is alanine. It may be a step of selecting a DNA polymerase. Further, step (2) may be a step in which A3 and / or A10 are substituted with an amino acid selected from the group consisting of lysine, arginine and histidine.
  • the production method of the fourth invention of the present invention may be combined with a method of preparing a nucleic acid encoding the mutant and introducing the nucleic acid into an appropriate host to express the mutant.
  • the fifth invention of the present invention relates to a method for improving a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity, which comprises a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity and comprising a sequence consisting of 12 amino acids represented by the following A1 to A12: And / or substituting the amino acid of A10 with another basic amino acid residue:
  • A1 is a branched amino acid residue;
  • A2 is a hydrophilic neutral amino acid residue or a hydrophobic aliphatic amino acid residue;
  • A3 is a hydrophilic neutral amino acid residue;
  • A4 is an acidic amino acid residue or a hydrophilic neutral amino acid residue;
  • A5 is a branched amino acid residue;
  • A6 is a hydrophobic aliphatic amino acid residue or a hydrophilic neutral amino acid residue, A7 is a branched-chain amino acid residue;
  • A8 is a proline residue or a hydrophilic neutral amino acid residue;
  • A9 is a hydropho
  • the DNA polymerase having a reverse transcriptase activity may be, for example, A1 is leucine, A3 is glutamine, A5 is leucine, A7 is isoleucine, and A11 is A DNA polymerase in which glutamic acid and A12 are alanine can be selected.
  • A3 and / or A10 in the sequence consisting of 12 amino acids can be replaced with, for example, an amino acid selected from the group consisting of lysine, arginine and histidine.
  • a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity comprising a sequence consisting of 12 amino acids A1 to A12, A1 is leucine; A2 is serine or alanine; A3 is glutamine; A4 is glutamic acid or asparagine; A5 is leucine; A6 is alanine or asparagine; A7 is isoleucine; A8 is proline, serine or threonine; A9 is tyrosine, arginine or glutamine; A10 is glutamic acid or lysine; A11 is glutamic acid; A12 is preferably an alanine; and a mutant in which the amino acid of A3 and / or A10 has been substituted with another basic amino acid residue different from that before mutagenesis. For example, the amino acid of A3 and / or A10 is lysine. Or a mutant of DNA polymerase substituted with an amino acid selected from the group consisting of
  • a DNA polymerase mutant having a reverse transcriptase activity suitable for performing a reverse transcription reaction and a nucleic acid amplification reaction in the same container and a method for producing the same are provided.
  • the DNA polymerase having the reverse transcriptase activity having the specific amino acid sequence site represented by A1 to A12 can carry out the mutation introduction of the present invention, and as a result, the DNA polymerase is more reversely mutated than before.
  • the transcription reaction time can be shortened, and a sufficient quantity can be generated as the initial template amount for the subsequent nucleic acid amplification reaction, and the reverse transcriptase reaction and the nucleic acid amplification reaction can achieve higher detection sensitivity in a shorter time than before. it can.
  • the DNA polymerase mutant having reverse transcriptase activity of the present invention relates to a DNA polymerase mutant suitable for a reverse transcriptase reaction and a nucleic acid amplification reaction.
  • the mutant of the present invention is a mutant of a DNA polymerase having reverse transcriptase activity, comprising a sequence consisting of 12 amino acids A1 to A12, wherein A1 is a branched-chain amino acid residue; A2 is a hydrophilic neutral amino acid residue or a hydrophobic aliphatic amino acid residue; A3 is a hydrophilic neutral amino acid residue; A4 is an acidic amino acid residue or a hydrophilic neutral amino acid residue; A5 is a branched amino acid residue; A6 is a hydrophobic aliphatic amino acid residue or a hydrophilic neutral amino acid residue, A7 is a branched-chain amino acid residue; A8 is a proline residue or a hydrophilic neutral amino acid residue; A9 is a hydrophobic aromatic amino
  • the mutant having the above structure is a DNA polymerase mutant suitable for a reverse transcription reaction and a nucleic acid amplification reaction performed in one container.
  • the “branched amino acid residue” is exemplified by a valine residue, an isoleucine residue or a leucine residue.
  • the “hydrophilic neutral amino acid residue” is exemplified by a serine residue, a threonine residue, an asparagine residue or a glutamine residue.
  • the “hydrophobic aliphatic amino acid residue” is exemplified by a glycine residue or an alanine residue.
  • the “acidic amino acid residue” is exemplified by an aspartic acid residue or a glutamic acid residue.
  • hydrophobic aromatic amino acid residue is exemplified by a phenylalanine residue, a tyrosine residue or a tryptophan residue.
  • basic amino acid residue is exemplified by a lysine residue, an arginine residue or a histidine residue.
  • A1 is leucine
  • A3 is glutamine
  • A5 is leucine
  • A7 isoleucine
  • A11 is glutamic acid
  • A12 is alanine.
  • a DNA polymerase having transcriptase activity can be used as a material for the mutant.
  • a preferred example of the mutant of the present invention is a DNA polymerase comprising a sequence consisting of the above 12 amino acids A1 to A12 and having a reverse transcriptase activity, wherein the amino acid A3 and / or A10 is selected from lysine, arginine and histidine.
  • a variant substituted with an amino acid selected from the group consisting of: Particularly preferred is a mutant substituted with arginine.
  • a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity comprising a sequence consisting of 12 amino acids A1 to A12, A1 is leucine; A2 is serine or alanine; A3 is glutamine; A4 is glutamic acid or asparagine; A5 is leucine; A6 is alanine or asparagine; A7 is isoleucine; A8 is proline, serine or threonine; A9 is tyrosine, arginine or glutamine; A10 is glutamic acid or lysine; A11 is glutamic acid; A12 is alanine; and a mutant in which the amino acid of A3 and / or A10 is substituted with another basic amino acid residue different from that before mutation is introduced.
  • the amino acid of A3 and / or A10 is It may be a mutant of a DNA polymerase substituted with an amino acid selected from the group consisting of lysine, arginine and histidine.
  • the amino acid sequence from position 680 to position 691 in SEQ ID NO: 1 of the polymerase corresponds to A1 to A12, and Specifically, it is the amino acid sequence of “LSQELAIPYEEA” (SEQ ID NO: 18). Accordingly, the glutamine residue at A3 (position 682) and / or the glutamic acid residue at A10 (position 689) of the Thermus thermophilus-derived DNA polymerase is replaced with an amino acid selected from the group consisting of lysine, arginine and histidine, preferably arginine.
  • a mutant obtained by substitution mutation is exemplified as the mutant of the present invention.
  • a mutant of the Thermus thermophilus-derived DNA polymerase having "LSRELAIPYREA" (SEQ ID NO: 19) can be suitably used as a DNA polymerase mutant suitable for a reverse transcriptase reaction and a nucleic acid amplification reaction.
  • the mutant b13b46 of the DNA polymerase derived from Thermus thermophilus prepared in Example 1 of the present specification is a mutant having the above-mentioned Q682R and E689R.
  • Similar mutants can also be prepared using a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity derived from Thermus aquaticus, Bacillus cardotenax, Bacillus stearothermophilus or Alicyclobacillus acid cardarius. .
  • a DNA polymerase having reverse transcriptase activity derived from Bacillus cardotenax has a sequence of “LAQNLNISRKEA” (SEQ ID NO: 20) as a 12 amino acid sequence consisting of A1 to A12. ing.
  • the 12 amino acid sequence of a DNA polymerase having reverse transcriptase activity derived from Bacillus stearothermophilus is "LAQNLNITRKEA” (SEQ ID NO: 21).
  • the 12 amino acid sequence of the DNA polymerase having a reverse transcriptase activity derived from Alicyclobacillus acid Caldarius is "LAQNLNIPQKEA" (SEQ ID NO: 22).
  • the 12 amino acid sequence of the DNA polymerase having reverse transcriptase activity derived from Thermus aquaticus is "LSQELAIPYEEEA" (positions 678 to 689 of SEQ ID NO: 25).
  • LSQELAIPYEEEA positions 678 to 689 of SEQ ID NO: 25.
  • A3 and / or A10 in these amino acid sequences have been substituted with basic amino acid residues are exemplified as the mutants of the present invention.
  • a mutant in which the amino acid of A3 and / or A10 is substituted with an amino acid selected from the group consisting of lysine, arginine and histidine.
  • Particularly preferred is a mutant substituted with arginine.
  • thermostable polymerase derived from a thermophilic bacterium, or a mesophilic DNA polymerase suitable for an isothermal nucleic acid amplification method in which a similar mutation is introduced are also included in the DNA polymerase mutant of the present invention. That is, Pol I type or Family A type DNA polymerase can also be suitably used as a target for the mutagenesis of the present invention.
  • the DNA polymerase mutant of the present invention may be a combination of mutations introduced into sites other than the 12 amino acid sequences shown in A1 to A12 as long as the reverse transcriptase activity and the nucleic acid amplification activity are not impaired.
  • the amino acid sequence of a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity before mutagenesis for example, a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity derived from Thermus thermophilus (NCBI ⁇ Reference ⁇ Sequence ⁇ WP_01122845.1) or Thermus Acqua
  • Thermus Acqua With respect to the amino acid sequence of a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity derived from Atticus (Genbank @ Acc. No.
  • a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity derived from Bacillus cardotenax (NCBI ⁇ Reference ⁇ Sequence ⁇ WP_047758145.1) and a reverse transcriptase activity derived from Bacillus stearothermophilus
  • a DNA polymerase (Genbank @ Acc. @ No. AAA855558.1) or a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity derived from Alicyclobacillus acid Caldarius (Genbank @ Acc. @ No.BAF33373.1)
  • the 12 amino acids A1 to A12 described above are used.
  • DNA polymerase mutant having reverse transcriptase activity of the present invention may be a mutant further lacking exonuclease activity.
  • DNA polymerases derived from Thermus thermophilus, Thermus aquaticus, Bacillus cardotenax, Bacillus stearothermophilus, Alicyclobacillus acid cardarius, etc. lack 5 ⁇ 3 exonuclease activity. Mutants are known.
  • the mutant lacking the exonuclease activity lacks the 5 ⁇ 3 exonuclease domain located on the N-terminal side of DNA polymerase.
  • the mutant of the present invention can be a mutant having no 5 ⁇ 3 exonuclease activity by deleting the 5 ⁇ 3 exonuclease domain.
  • the DNA polymerase mutant having reverse transcriptase activity of the present invention can produce a target cDNA even under reverse transcription reaction conditions in which the DNA polymerase before mutation introduction cannot achieve reverse transcription.
  • the reverse transcription reaction conditions include a reduction in reaction time and an increase in reaction temperature.
  • the amount of the reverse transcription reaction product is increased as compared with the DNA polymerase before the introduction of the mutation.
  • a reverse transcription reaction requiring about 30 minutes in a 60 ° C. reaction using a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity derived from Thermus thermophilus was carried out using a mutant of the present invention prepared from the DNA polymerase.
  • the mutant of the present invention can be expected to further improve in terms of resistance to an inhibitor during the reaction and affinity for a template nucleic acid, as compared with the existing DNA polymerase having a reverse transcriptase activity.
  • reverse transcriptase activity can be significantly improved with respect to Pol I type or family A type DNA polymerase, which originally has low reverse transcriptase activity.
  • DNA polymerase variants with reverse transcriptase activity suitable for performing can be created.
  • the mutant of the present invention may be a fusion protein with a PIP box (PIP @ box: PCNA ⁇ interaction ⁇ protein ⁇ box).
  • PCNA a protein that promotes DNA polymerase activity, can also promote the reverse transcriptase activity of a DNA polymerase having reverse transcriptase activity.
  • the DNA polymerase mutant of the present invention in which the PIP box is fused can be produced by combining the technique described in International Publication WO2017 / 090687.
  • composition of the present invention means a composition containing the DNA polymerase mutant having reverse transcriptase activity of the present invention.
  • One embodiment of the composition of the present invention is a composition suitable for a reverse transcription reaction and a nucleic acid amplification reaction.
  • components necessary for the reverse transcription reaction and the polymerase chain reaction (RT-PCR) for example, divalent metal salts, dNTPs , Buffer components, reducing agents, sterile water and the like.
  • composition of the present invention may also contain appropriate primers when the RNA to be amplified / detected is known.
  • a composition suitable for the reverse transcription reaction and the isothermal nucleic acid amplification reaction a composition containing the same components as described above is preferable, as long as the composition contains the components necessary for the reverse transcription reaction and the isothermal nucleic acid amplification reaction.
  • the divalent metal ion constituting the divalent metal salt is not particularly limited, and examples thereof include a manganese ion and a magnesium ion. Suitable divalent metal ions and their concentrations for reverse transcriptase are known in the art.
  • the divalent metal ion can be provided in the form of a salt, such as chloride, sulfate, or acetate.
  • the concentration of the divalent metal ion in the composition of the present invention is preferably, for example, 0.5 to 20 mM.
  • the dNTP at least one of dATP, dCTP, dGTP, dTTP, or a derivative thereof is used. Preferably, four mixtures of dATP, dCTP, dGTP and dTTP are used.
  • the buffer component for maintaining the pH is not particularly limited, Tris buffer, Tricine buffer, Bicine buffer, HEPES buffer, acetate buffer or phosphate buffer may be used. Is exemplified.
  • buffer components and their concentrations suitable for reverse transcription and nucleic acid amplification reactions are known in the art.
  • the reducing agent for the reverse transcription reaction include, but are not particularly limited to, DTT (dithiothreitol) and 2-mercaptoethanol. Suitable reducing agents and their concentrations for reverse transcription reactions are known in the art.
  • the chain length of the primer is preferably 6 nucleotides or more, more preferably 10 nucleotides or more, and preferably 100 nucleotides or less from the viewpoint of oligonucleotide synthesis. Preferably it is 30 nucleotides or less.
  • a mixture of oligonucleotides having a chain length of 6 to 8 nucleotides may be used as random primers for the purpose of nonspecific cDNA synthesis.
  • the oligonucleotide can be chemically synthesized, for example, by a known method.
  • Oligonucleotides derived from biological samples may also be used. For example, they may be produced by isolation from restriction endonuclease digests of DNA prepared from natural samples.
  • the nucleic acid amplification reaction it may include a primer pair designed according to the sequence of the nucleic acid to be amplified.
  • the reverse transcription reaction primer may also serve as one of the nucleic acid amplification primers.
  • the kit of the present invention is an RT-PCR kit or an RT-isothermal nucleic acid amplification kit suitable for a reverse transcription reaction and a nucleic acid amplification reaction method.
  • the kit of the present invention includes: Contains DNA polymerase mutants, divalent metal salts, dNTPs, buffer components, reducing agents, and other components suitable for reverse transcription and nucleic acid amplification reactions suitable for the reverse transcription reaction and nucleic acid amplification reaction of the present invention described in A kit for preparing a reverse transcription reaction / nucleic acid amplification reaction solution by mixing them at the time of use, containing the above-described composition of the present invention, and only adding a template DNA and water (such as sterile water) at the time of use.
  • a template DNA and water such as sterile water
  • kits containing the composition of the present invention in a dry state A kit containing a primer specific to a target RNA and an RNA for a positive control for the purpose of detecting a specific RNA is also included in the present invention.
  • the divalent metal salt, dNTPs, buffer component, and reducing agent are as described above.
  • composition or kit of the present invention may further contain components necessary for detecting the amplified double-stranded nucleic acid, such as an intercalator and a fluorescently labeled probe.
  • an intercalator and a fluorescently labeled probe.
  • SYBR registered trademark
  • Green I Green I
  • TB Green registered trademark
  • TaqMan registered trademark
  • Cycleave registered trademark
  • molecular beacon probes are used as fluorescent label probes. And the like.
  • the method for producing a DNA polymerase mutant having a reverse transcriptase activity of the present invention The method for producing a DNA polymerase mutant suitable for a reverse transcriptase reaction and a nucleic acid amplification reaction according to the present invention is described in 1. above.
  • the present invention relates to a method for producing a DNA polymerase mutant described in (1).
  • a specific embodiment of the production method of the present invention is a method for producing a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity suitable for nucleic acid amplification from RNA, (1) selecting a DNA polymerase comprising a sequence consisting of the following 12 amino acids A1 to A12; A1 is a branched amino acid residue; A2 is a hydrophilic neutral amino acid residue or a hydrophobic aliphatic amino acid residue; A3 is a hydrophilic neutral amino acid residue; A4 is an acidic amino acid residue or a hydrophilic neutral amino acid residue; A5 is a branched amino acid residue; A6 is a hydrophobic aliphatic amino acid residue or a hydrophilic neutral amino acid residue, A7 is a branched-chain amino acid residue; A8 is a proline residue or a hydrophilic neutral amino acid residue; A9 is a hydrophobic aromatic amino acid residue, a basic amino acid residue or a hydrophilic neutral amino acid residue; A10 is an acidic amino acid residue or
  • a DNA polymerase comprising a 12 amino acid sequence comprising an amino acid sequence in which A1 is leucine, A3 is glutamine, A5 is leucine, A7 is isoleucine, A11 is glutamic acid and A12 is alanine is used as a material for mutagenesis. You can choose.
  • the DNA polymerase having reverse transcriptase activity selected above is substituted with A3 and / or A10 by an amino acid selected from the group consisting of lysine, arginine and histidine. Is preferred. Particularly preferably, it is substituted with arginine.
  • Step (1) can be carried out by extracting a DNA polymerase containing the amino acid sequence consisting of A1 to A12 by a conventional method, for example, by homology search using a computer.
  • a known amino acid sequence database can be used for the search.
  • a nucleic acid encoding the DNA polymerase selected in the step (1) is prepared, and a codon corresponding to A3 and / or A10 of the nucleic acid is converted into a codon of a basic amino acid residue. Is done.
  • Such base substitution can be performed by a known method, and for example, a commercially available mutagenesis kit may be used.
  • the full length of the nucleic acid encoding the mutant after mutagenesis may be chemically synthesized.
  • mutations may be introduced into sites other than the 12 amino acid sequences shown in A1 to A12.
  • a nucleic acid encoding the mutant can be prepared and introduced into an appropriate host to express the mutant. Codon optimization may be performed to enable expression of the mutant of interest in the host used or to increase the expression level. The codon optimization is preferably performed by a method commonly used in this field.
  • the mutant can be produced by incorporating a nucleic acid encoding the amino acid sequence of the mutant into an appropriate expression vector.
  • the expression vector preferably contains a nucleic acid encoding the mutant reverse transcriptase mutant of the present invention, and an expression control sequence operably linked to the nucleic acid.
  • the expression control sequence is not particularly limited, and examples thereof include a promoter and a gene involved in the control of the promoter, a ribosome binding sequence, a polyadenylation signal, a transcription termination sequence (transcription terminator), an enhancer, and the like. Further, it may contain a gene encoding a marker (drug resistance gene, fluorescent marker, luminescent marker, etc.) used for selecting transformants.
  • ⁇ ⁇ There is no particular limitation on the expression vector into which the nucleic acid encoding the DNA polymerase mutant having the reverse transcriptase activity of the present invention is inserted, as long as it is an expression vector commonly used in this field.
  • a vector capable of autonomous replication in a host cell and a vector which can be integrated into a host chromosome can be used.
  • a vector compatible with the host may be used.
  • plasmid vector for example, a plasmid vector, a phage vector, a virus vector and the like can be used.
  • plasmid vector plasmids suitable for the host to be used, for example, a plasmid derived from Escherichia coli, a plasmid derived from a bacterium belonging to the genus Bacillus, and a plasmid derived from yeast are well known to those skilled in the art, and many are commercially available. In the present invention, these known plasmids and variants thereof can be used.
  • ⁇ phage for example, Charon4A, Charon21A, EMBL3, EMBL4, ⁇ gt10, ⁇ gt11, ⁇ ZAP
  • virus vector for example, animal viruses such as retrovirus and vaccinia virus Insect viruses such as baculovirus can be used.
  • many heterologous protein expression systems using yeast, insect cells, and mammalian cells as hosts have been constructed, and are already commercially available. These expression systems may be used for the production of the mutant DNA polymerase having reverse transcriptase activity of the present invention.
  • the promoter mounted on the expression vector used in the production method of the present invention can be selected according to the host.
  • promoters derived from Escherichia coli, phage, etc. such as trp promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter, etc.
  • trp promoter trp promoter
  • lac promoter lac promoter
  • PL promoter PL promoter
  • PR promoter PR promoter
  • an expression system in which a phage-derived promoter and an RNA polymerase gene are combined for example, a pET expression system
  • the expression vector of the present invention may further include a nucleic acid encoding an affinity tag.
  • the nucleic acid encoding the affinity tag is inserted into a vector so that the fusion protein of the reverse transcriptase mutant of the present invention and the affinity tag is expressed.
  • the affinity tag include a histidine (His) tag, a glutathione S-transferase (GST) tag, a maltose binding protein (maltose binding protein) (MBP) tag, and an 8-residue amino acid.
  • a nucleic acid encoding a Strep (II) tag consisting of (Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys) and the like is exemplified.
  • the tag may be added at any position on the 5 ′ end and / or 3 ′ end of the nucleic acid encoding the DNA polymerase mutant having a reverse transcriptase activity of the present invention, so that the expression and the tag function are not hindered. May be added as appropriate.
  • the tag is preferably a tag that can be cleaved at the stage of purification of the expressed polypeptide.
  • cleavable tags include fusion polypeptides such as Factor Xa, PreScission Protease, thrombin (Thrombin), enterokinase (enterokinase), and TEV protease (Tobacco Etch Virus Protease).
  • fusion polypeptides such as Factor Xa, PreScission Protease, thrombin (Thrombin), enterokinase (enterokinase), and TEV protease (Tobacco Etch Virus Protease).
  • a tag including a nucleic acid encoding a recognition sequence of a cleavage protease is exemplified.
  • Method for improving DNA polymerase having reverse transcriptase activity of the present invention can be carried out as follows. That is, in a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity comprising a sequence consisting of 12 amino acids represented by A1 to A12, the amino acids A3 and / or A10 are substituted with another basic amino acid residue.
  • a DNA polymerase having a reverse transcriptase activity and having a sequence consisting of 12 amino acids represented by the following A1 to A12 can be selected as a candidate before mutagenesis.
  • A1 is a branched amino acid residue
  • A2 is a hydrophilic neutral amino acid residue or a hydrophobic aliphatic amino acid residue
  • A3 is a hydrophilic neutral amino acid residue
  • A4 is an acidic amino acid residue or a hydrophilic neutral amino acid residue
  • A5 is a branched amino acid residue
  • A6 is a hydrophobic aliphatic amino acid residue or a hydrophilic neutral amino acid residue
  • A7 is a branched-chain amino acid residue
  • A8 is a proline residue or a hydrophilic neutral amino acid residue
  • A9 is a hydrophobic aromatic amino acid residue, a basic amino acid residue or a hydrophilic neutral amino acid residue
  • A10 is an acidic amino acid residue or a basic amino acid residue
  • A11 is an acidic amino acid residue
  • A12 is a hydrophobic aliphatic amino acid residue.
  • Examples of a method for selecting the candidate DNA polymerase having reverse transcriptase activity include a method of extracting a DNA polymerase containing the amino acid sequence consisting of A1 to A12 by a conventional method, for example, by homology search using a computer. .
  • the search can be performed using a known amino acid sequence database.
  • the sequence consisting of 12 amino acids is obtained by mutating a DNA polymerase having an amino acid sequence in which A1 is leucine, A3 is glutamine, A5 is leucine, A7 is isoleucine, A11 is glutamic acid, and A12 is alanine.
  • Material can be used suitably.
  • improvement of the DNA polymerase is achieved by substituting A3 and / or A10 amino acids with another basic amino acid residue. Specifically, the reverse transcription activity of DNA polymerase is improved, and the amount of reverse transcript (cDNA) produced per reaction time is increased.
  • A3 and / or A10 with an amino acid selected from the group consisting of lysine, arginine and histidine. Particularly preferred is substitution with an arginine residue.
  • a mutation may be further introduced at a site other than the 12 amino acid sequence represented by A1 to A12 as long as the reverse transcriptase activity and the nucleic acid amplification activity are not impaired.
  • the DNA polymerase having the reverse transcriptase activity to be improved is not particularly limited, and examples thereof include Thermos thermophilus, Thermos aquaticus, Bacillus cardotenax, Bacillus stearothermophilus, and Alicyclo.
  • thermostable polymerases derived from thermophilic bacteria, mesophilic DNA polymerases suitable for isothermal nucleic acid amplification, and amino acid substitutions, insertions or deletions thereof, or other variants thereof Both are included.
  • it may be a Pol I type or a family A type DNA polymerase having low intrinsic reverse transcriptase activity.
  • Tth DNA Polymerase Mutant The nucleotide sequence of a gene encoding a wild-type DNA polymerase derived from Thermus thermophilus (Tth) HB8 strain was determined by NCBI Reference Sequence No. WP_11222845.1. The amino acid sequence of the DNA polymerase is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Artificial genes having sequences in which mutations were introduced at specific sites in the amino acid sequence (sequences consisting of 12 amino acids represented by A1 to A12 of the present invention) were chemically synthesized.
  • the resulting artificial gene was introduced into a plasmid pET6xHN-N (Takara Bio USA) using In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit (Takara Bio USA).
  • the resulting plasmid has a nucleotide sequence encoding a Tth DNA polymerase mutant with a histidine tag added to the N-terminal.
  • Escherichia coli BL21 DE3 (manufactured by Takara Bio Inc.) was transformed with the plasmid, and cultured overnight at 37 ° C. on a 1.5% agarose LB plate containing 100 ⁇ g / mL ampicillin. Three single colonies were selected from this plate, inoculated on an LB medium containing 100 ⁇ g / mL of ampicillin (hereinafter referred to as LB-AP medium), and cultured at 37 ° C. overnight with shaking. Further, 300 ⁇ L of the above culture solution was inoculated into 25 mL of LB-AP medium, and cultured with shaking at 37 ° C. overnight. When the OD600 reached 0.6, IPTG having a final concentration of 1 mM was added to the culture solution, induction culture was further performed at 37 ° C. for 21 hours, and the cells were collected.
  • LB-AP medium containing 100 ⁇ g / mL of ampicillin
  • the cells obtained above were suspended in 2 mL of a solution containing 50 mM Tris-HCl pH 8.0 (4 ° C.), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA (pH 8.0), and 5% glycerol (hereinafter referred to as Buffer S). Then, lysozyme (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.) was added to a final concentration of 0.1 mg / mL, and the mixture was shaken at 4 ° C. for 1 hour. After shaking, the mixture was centrifuged at 15,000 xg for 30 minutes at 4 ° C, and the supernatant was recovered. The collected supernatant was kept at 85 ° C. for 15 minutes and then centrifuged at 4 ° C. @ 15,000 ⁇ g for 30 minutes. The supernatant after heating was concentrated about 20 times by centrifugation using an Amicon@Ultra-0.5 mL column.
  • the obtained concentrate was used in the following tests as a roughly purified solution of Tth ⁇ DNA polymerase mutant.
  • the number of units of the enzyme used was as follows. Regarding DNA polymerase activity, activated salmon sperm DNA was used as a template / primer, and 10 nmol of all nucleotides was acid-insoluble in a reaction solution at pH 9.3 at 74 ° C. for 30 minutes. The activity taken into the product was calculated as 1 U.
  • Tth DNA polymerase mutants 5U and 2.5U of Taq prepared in experimental methods (1) Body The reaction mixture in a final volume of 50 ⁇ L containing (Takara Bio Inc.) was prepared. As a control, a reaction solution containing wild-type Tth DNA polymerase was also prepared.
  • RT-PCR conditions were set as a 45-cycle reaction in which treatment was performed at 90 ° C. for 30 seconds, 60 ° C. for 1 minute, and 95 ° C. for 1 minute, followed by 95 ° C. for 15 seconds and 56 ° C. for 45 seconds.
  • the thermal cycler performed real-time PCR using TP-990 ⁇ ThermalCycler ⁇ Dice (registered trademark) Real ⁇ Time ⁇ SystemIII (manufactured by Takara Bio Inc.) to measure the Ct value.
  • Example 1 Preparation of Tth DNA Polymerase Mutant
  • an artificial gene encoding a mutant protein in which glutamine at position 682 in the wild-type amino acid sequence of Tth DNA polymerase was replaced with arginine was prepared.
  • a recombinant plasmid having the obtained artificial gene was prepared, and the protein was expressed and the expressed protein was purified according to Experimental method 1 (1).
  • the thus obtained Tth DNA polymerase mutant having a substitution mutation from glutamine at position 682 to arginine (Q682R) was designated as b13.
  • glutamic acid at position 689 of the wild-type amino acid sequence of Tth DNA polymerase was replaced with arginine (E689R) Tth DNA polymerase mutant (designated b46), glutamine at position 682 was replaced with arginine, and glutamic acid at position 689 was replaced with glutamic acid.
  • the amino acid sequence and the nucleic acid sequence of the mutant protein are shown in SEQ ID NOs: 5 to 10.
  • Example 2 Evaluation Test 1 for Reverse Transcription Activity of Tth DNA Polymerase Mutant For the mutant Tth DNA polymerase and the wild-type Tth DNA polymerase prepared in Example 1, a reverse transcription activity evaluation test was performed in accordance with the experimental method (2). Normally, when a wild-type Tth DNA polymerase is used, the reverse transcription reaction is usually performed at 60 ° C. for 30 minutes, but in this example, the performance was compared with a short reverse transcription reaction time of 60 ° C. for 1 minute. Table 1 shows the results. Since the Ct value is inversely proportional to the initial amount of the target, it can be used to calculate the initial copy number of DNA. For example, when the Ct value is smaller by one (minus), the amount of DNA serving as a template for PCR is twice as large.
  • Example 3 Fusion protein of PIP box and Tth mutant The fusion protein of the Tth DNA polymerase mutant and the PCNA binding domain described in Example 1 was examined. First, according to the method described in Example 4 of International Publication WO2017 / 090685, 3 PIPs having three PIP boxes having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 in the sequence listing are tandemly arranged on the N-terminal side of each Tth DNA polymerase mutant, and wild-type. A fusion protein of Tth DNA polymerase (PIP-L14-PIP-L14-PIP-L15-Tth DNA polymerase) was prepared. The fusion protein was named 3PIP-wild type.
  • fusion proteins of 3PIP and the b13, b46 and b13b46 mutants described in Example 1 were also prepared, and these were named 3PIP-b13, 3PIP-b46 and 3PIP-b13b46.
  • a Puf PCNA D143R mutant (PCNA13), which is a polymerase-related factor that recognizes the PIP box, was prepared by the method described in Examples in International Publication WO2007 / 004654.
  • RNA used as a template for the reverse transcription reaction was prepared as follows.
  • the Ministry of Health, Labor and Welfare, Pharmaceutical and Food Bureau, Food Safety Department, Surveillance and Safety Division notified “Norovirus Detection Methods” (Attachment No. 1105001 issued by the Food Safety Inspection on November 5, 2003; Last revision: October 22, 2013)
  • RNA of nucleotide sequence including a region to be PCR-amplified with primers for GI detection and GII detection having the same nucleotide sequence as described in JASJ 1022 No. 1 (hereinafter referred to as “official method”) was prepared by a conventional method.
  • reaction solution having a final volume of 25 ⁇ L containing 5 U of the above-mentioned 3PIP-Tth ⁇ DNA polymerase mutant was prepared.
  • reaction solutions containing wild-type and wild-type Tth ⁇ DNA polymerase with 3PIP added to the N-terminal were also prepared.
  • RT-PCR conditions were as follows: treatment at 58 ° C. for 5 minutes and 95 ° C. for 30 seconds, followed by 5 cycles of reaction at 95 ° C. for 5 seconds and 56 ° C. for 1 minute.
  • a 40-cycle reaction was set as one cycle.
  • the thermal cycler is the same as in the second embodiment.
  • Table 2 shows the results of the GI detection. Similarly, the results of GII detection are shown in Table 3.
  • any of b13, b46 and b13b46 of the present invention in which the PIP box was added to the N-terminal compared to the wild type and the wild-type in which the PIP box was added to the N-terminal was confirmed.
  • Example 4 Reverse transcription activity evaluation test 2 of Tth DNA polymerase mutant
  • the b13 and b13b46 mutants in which the ability of the reverse transcription reaction was improved in Example 2 were evaluated by detecting norovirus in actual samples. That is, a norovirus-positive stool sample collected from a subject with informed consent was suspended in PBS to about 10% (w / v), and then centrifuged at 15,000 rpm for 5 minutes. . 1 ⁇ L of the supernatant thus obtained was used for the following reaction.
  • a reaction solution containing wild-type Tth DNA polymerase was also prepared.
  • the RT-PCR conditions were Tth D In the case of A polymerase, after treating at 90 ° C. for 3 minutes, 58 ° C. for 5 minutes or 30 minutes, and at 95 ° C. for 30 seconds, a 5-cycle reaction with 95 ° C. for 5 seconds and 56 ° C.
  • the reaction was set to 40 cycles in which 5 seconds and 30 seconds at 56 ° C.
  • One cycle of the Tth DNA polymerase mutant was treated at 90 ° C. for 3 minutes, 58 ° C. for 5 minutes and 95 ° C. for 30 seconds, and then 95 ° C. for 5 seconds.
  • the reaction was set to 5 cycles with 30 seconds at 56 ° C. and 40 cycles with 5 seconds at 90 ° C. and 30 seconds at 56 ° C.
  • the thermal cycler was the same as in Example 2.
  • Tth ⁇ DNA polymerase was able to be detected only when the reverse transcription reaction was performed at 58 ° C. for 30 minutes for the detection of norovirus GI in feces.
  • the b13 and b13b46 mutants of the present invention could be detected even when the reverse transcription reaction was performed at a short time of 58 ° C. for 5 minutes. From this, it was confirmed that the mutant of the present invention maintained the improvement of the reverse transcriptase reaction even in the detection using the actual sample.
  • Example 5 Reverse Transcription Activity Evaluation Test 3 of Tth DNA Polymerase Mutant A comparison was made between the Tth DNA polymerase mutant of the present invention and a Tth DNA polymerase mutant that was previously reported to be capable of performing a reverse transcription reaction efficiently at high temperature. According to the description in Japanese Patent No. 3844975, a crude enzyme solution of a Tth DNA polymerase mutant was prepared by the method of Experimental Method (1). That is, at position 681 in the amino acid sequence described in Taq DNA polymerase (Genbank Acc. No. BAA067755.1), NCBI Reference Sequence No.
  • Tth DNA polymerase Since the amino acid sequence of Tth DNA polymerase based on the amino acid sequence described in WP_01128284 corresponds to position 683, a Tth DNA polymerase mutant in which glutamic acid at position 683 of the amino acid sequence is substituted with phenylalanine, lysine, leucine, arginine, or tyrosine was used. Prepared. These amino acid variants were named E683F, E683K, E683L, E683R, and E683Y variants, respectively.
  • the Tth ⁇ DNA polymerase mutant in which the glutamic acid at position 683 was substituted failed to produce an amplification product derived from the template, or had a higher Ct value than the Tth ⁇ DNA polymerase mutant of the present invention.
  • it means that the amount of the initial template DNA at the start of the PCR is reduced, that is, the amount of the cDNA by the reverse transcription reaction before the PCR is about ⁇ or less, and As a result, it was confirmed that the reverse transcription reaction activity was superior to that prepared by the conventional technique.
  • Escherichia coli BL21 DE3 (manufactured by Takara Bio Inc.) was transformed with the plasmid, and cultured overnight at 37 ° C. on a 1.5% agarose LB plate containing 100 ⁇ g / mL ampicillin. Three single colonies were selected from this plate, inoculated on an LB medium containing 100 ⁇ g / mL of ampicillin (hereinafter referred to as LB-AP medium), and cultured at 37 ° C. overnight with shaking. Further, 30 ml of the above culture solution was inoculated into 3 L of LB-AP medium, and cultured at 37 ° C. overnight with shaking. When the OD600 reached 0.6, IPTG having a final concentration of 1 mM was added to the culture solution, induction culture was further performed at 37 ° C. for 4 hours, and the cells were collected.
  • LB-AP medium containing 100 ⁇ g / mL of ampicillin
  • 3 g of the cells obtained above were suspended in 12 ml of a buffer (50 mM Tris ⁇ HCl pH 7.0 (4 ° C.), 4 ⁇ M PMSF, 1 mM DTT, 10% glycerol), and the mixture was stirred with Sonic 180 W for 10 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged at 10,000 rpm for 30 minutes at 4 ° C. The supernatant was recovered and heat-treated at 60 ° C. for 30 minutes. After the heat-treated supernatant was cooled on ice for 30 minutes, it was centrifuged at 11,000 rpm for 30 minutes (4 ° C.) to recover the supernatant.
  • a buffer 50 mM Tris ⁇ HCl pH 7.0 (4 ° C.), 4 ⁇ M PMSF, 1 mM DTT, 10% glycerol
  • the obtained supernatant was subjected to DEAE Sepharose Fast Flow (manufactured by GE Healthcare), CM Sepharose Fast Flow (manufactured by GE Healthcare), Sephadex-G100, Heparin Sepharose (manufactured by GE Healthcare, Inc.)
  • a purified solution of the Bca DNA polymerase mutant protein was prepared in the following order, and used in the following tests.
  • the number of units of the enzyme used was as follows.
  • DNA polymerase activity activated salmon sperm DNA was used as a template / primer, and 10 nmol of all nucleotides was acid-insoluble in a reaction solution at pH 9.3 at 74 ° C. for 30 minutes. The activity taken into the product was calculated as 1 U.
  • the Escherichia coli BL21 DE3 strain transformed with the plasmid was cultured in the same manner as described in Experimental method (3) to collect the cells.
  • a purified solution of Aac DNA polymerase mutant was prepared from 3 g of the bacterial cells obtained above by the same purification method described in Experimental method (3), and used in the following tests.
  • the number of units of the enzyme used is the same as in the case of Bca @ DNA polymerase.
  • Escherichia coli BL21 DE3 strain transformed with the plasmid was cultured in the same manner as described in Experimental method (3), and cells were collected.
  • Activated salmon sperm DNA was prepared at a final concentration of 100 ⁇ M [3H] -dTTP and a final concentration of 0.25 mg / ml. That is, using activated salmon sperm DNA as a template / primer, the activity of incorporating 10 nmol of all nucleotides into the acid-insoluble precipitate in 30 minutes at 74 ° C. in the above-mentioned reaction solution for activity measurement was measured as 1 U.
  • the reverse transcription activity was measured for the Bca, Aac, and Taq DNA polymerase mutants obtained in (3), (4), and (5) above.
  • the reverse transcription activity was measured using a reaction solution of 50 mM Tris-HCl, pH 8.3 (37 ° C.), 5 mM Tris-HCl pH 7.5 (37 ° C.), 85 mM KCl, 8 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 0.1% NP-40. , 0.02 mg / ml Poly (A), 2.5 mM dTTP, and 100 ⁇ Ci / ml [3H] -dTTP.
  • Experimental method (7) Method for evaluating reverse transcription activity of Bca, Aac, and Taq DNA polymerase mutant The following method was used for the Bca, Aac, and Taq DNA polymerase mutants obtained in (3), (4), and (5) above. Tested the reverse transcription reaction. In the test, a part of the components of the BcaBEST (trademark) RNA PCR Kit (manufactured by Takara Bio Inc.) was used.
  • 2 ⁇ Bca 1st Buffer included in the kit 25 mM MgSO 4, RNase Inhibitor (40 U / ul), 10 mM dNTP, and a final concentration of 0 having the base sequence of SEQ ID NO: 26 in the Sequence Listing are 0. 0.5 ⁇ M of reverse transcription primer, 500 ⁇ M of final concentration of dNTP, and 10 ng / ⁇ L of final concentration of HL60 total RNA (manufactured by Takara Bio Inc.) as a template were added to Bca prepared by Experimental Methods (3), (4) and (5).
  • Aac and 0.5 ⁇ l of a Taq DNA polymerase mutant purified solution were added to prepare 10 ⁇ L of a reverse transcription reaction solution.
  • reaction solutions containing wild-type Bca, Aac, and Taq DNA polymerase were also prepared.
  • ⁇ PCR conditions were set to a 40-cycle reaction in which the initial denaturation was performed at 90 ° C for 30 seconds, followed by one cycle of 95 ° C for 5 seconds and 60 ° C for 30 seconds.
  • the thermal cycler performed real-time PCR using TP-990 ⁇ ThermalCycler ⁇ Dice (registered trademark) Real ⁇ Time ⁇ SystemIII (manufactured by Takara Bio Inc.) to measure the Ct value.
  • Example 6 Evaluation test 1 for reverse transcription activity of Bca, Aac and Taq mutant Evaluation test 1 was performed on the Bca, Aac and Taq DNA polymerase mutants obtained in the above (3), (4) and (5) by the method described in the above experimental method (6). Table 5 shows the results.
  • each DNA polymerase mutant b13b46 has a mutation corresponding to the “Q682R + E689R” mutation in the Tth DNA polymerase mutant b13b46 (that is, the amino acids at positions corresponding to positions 682 and 689 in the amino acid sequence of Tth DNA polymerase are different from each other). Arginine).
  • the Bca (b13b46) mutant prepared as compared to the Bca native form has increased reverse transcription activity while maintaining the polymerase activity, and has about twice the reverse transcription activity as compared to the native form. Has improved.
  • the reverse transcription activity of the Aac (b13b46) mutant was improved about 4 times as compared with the native form while maintaining the polymerase activity.
  • the Taq (b13b46) mutant improved the reverse transcription activity by about 9-fold compared to the native form while maintaining the polymerase activity.
  • Example 7 Evaluation test 2 for reverse transcription activity of Bca, Aac and Taq mutant For the Bca, Aac and Taq DNA polymerase mutants obtained in (3), (4) and (5) above, the amount of cDNA synthesized was confirmed and the reverse transcription activity was evaluated.
  • Evaluation test 2 was performed by the method described in the above-mentioned experimental method (7).
  • Table 6 shows the results.
  • the initial template DNA amount at the time of PCR was 510- to 1000-fold or more as compared with the wild-type enzyme in each mutant.
  • An increase in the amount of template DNA means that there was an increase in the amount of cDNA due to the reverse transcription reaction before PCR, and the mutant had a 510 to 1000-fold or more improvement in the ability of the wild-type in the reverse transcription reaction.
  • the present invention can improve the reverse transcriptase activity of DNA polymerases classified into Pol I type or Family A type.
  • the DNA polymerase having a reverse transcriptase activity suitable for performing a reverse transcription reaction and a nucleic acid amplification reaction in the same container.
  • a reaction with high reverse transcription efficiency can be performed even when an RNA having a strong secondary structure, which has been difficult to perform a reverse transcription reaction, is used as a template.
  • detection at the same level or higher can be performed in a shorter time than in the conventional enzyme.
  • the DNA polymerase having reverse transcriptase activity of the present invention is useful in a wide range of fields such as genetic engineering, biology, medicine, and agriculture.
  • SEQ ID NO: 1 DNA polymerase I Thermus thermophilus
  • SEQ ID NO: 2 PCR forward Primer lambda RNA
  • SEQ ID NO: 3 PCR Reverse Primer lambda RNA
  • SEQ ID NO: 4 Probe lambda RNA.
  • DNA polymerase variant Tth b13 SEQ ID NO: 6 DNA polymerase variant Tth b13 SEQ ID NO: 7: DNA polymerase variant Tth b46 SEQ ID NO: 8: DNA polymerase variant Tth b46 SEQ ID NO: 9: DNA polymerase variant Tth b13 b46 SEQ ID NO: 10: DNA polymerase variant Tth b13 b46 SEQ ID NO: 11: PIP-L14-PIP-L14-PIP-L15 Tth SEQ ID NO: 12: PCR forward Primer COG1F SEQ ID NO: 13: PCR Reverse Primer COG1R SEQ ID NO: 14: PCR forward Primer COG2F SEQ ID NO: 15: PCR Reverse Primer COG2R SEQ ID NO: 16: Probe RING1-TP (a).

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Abstract

特定のＡ１～Ａ１２の１２アミノ酸からなる配列を含む、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの変異体であって、前記Ａ３及び/又はＡ１０のアミノ酸が変異導入前のものとは別の塩基性アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体、当該ＤＮＡポリメラーゼを含むキット並びに組成物、当該ＤＮＡポリメラーゼの製造方法および既存の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの改良方法が提供される。

Description

ＲＮＡからの核酸増幅反応に適したＤＮＡポリメラーゼ変異体
　本発明は、ＲＮＡからの核酸増幅反応に適したＤＮＡポリメラーゼ変異体に関する。さらに、既存のＤＮＡポリメラーゼについてＲＮＡからの核酸増幅活性を向上させるための方法、および当該ＲＮＡからの核酸増幅反応に適したＤＮＡポリメラーゼ変異体の製造方法に関する。
　ＤＮＡポリメラーゼはゲノムの複製や保持という、世代から世代へと遺伝情報を正確に伝達するための中心的な役割を担っている。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡの合成を担う酵素として細胞内で機能しており、鋳型ＤＮＡ又は鋳型ポリヌクレオチドの複製に必要なオーダーのＭｇ２＋のような金属活性化因子の存在下、デオキシリボヌクレオシド３リン酸を重合付加している。ｉｎ　ｖｉｖｏにおいて、ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ複製、ＤＮＡ修復、組換え及び遺伝子増幅を含む一連のＤＮＡ合成過程に関与している。それぞれのＤＮＡ合成過程の間に、鋳型ＤＮＡは一度又は数回複製され、同一の複製物を生成する。これに対しｉｎ　ｖｉｔｒｏでは、例えばポリメラーゼ連鎖反応の際のように、ＤＮＡ複製は何回も繰り返すことができる。
　いわゆる逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）は、増幅によってＲＮＡ標的を検出又は定量するために多くの用途に使用される技術である。ＰＣＲによってＲＮＡ標的を増幅するために、最初にＲＮＡ鋳型をｃＤＮＡに逆転写することが必要である。典型的なＲＴ－ＰＣＲ法は、ＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡを合成する逆転写酵素と、生成したｃＤＮＡを鋳型として核酸増幅を行う耐熱性ＤＮＡポリメラーゼによって行われる。この場合、使用する逆転写酵素と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのそれぞれに適した反応液組成を設定する必要がある。場合によっては、逆転写反応と続く核酸増幅反応の間で反応チューブの蓋を開けることもあり、クロスコンタミネーションの危険性を無視できない。そのため反応容器を開けることなく逆転写反応とＰＣＲを連続実施するワンステップＲＴ－ＰＣＲ法が開発された。この方法では、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼが用いられることがある。しかしながら、逆転写反応とＰＣＲを同一反応液組成で行うことから、逆転写反応とＰＣＲのバランスを取ることが必須であった。また、逆転写反応とＰＣＲを同一反応液組成である場合の逆転写効率を向上させるための技術が報告されてきた。（特許文献１～３参照）。
　さらに最近では、いろいろな等温核酸増幅反応方法が提案され、実用化されてきている。この等温核酸増幅方法においても、ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応と組み合わせることが多くなってきているが、上記ＲＴ－ＰＣＲ法と同じ問題が発生してきている。即ち、ＲＴ－等温核酸増幅方法においても、逆転写反応と等温核酸増幅を同一反応液組成で行うこと、逆転写反応と等温核酸増幅のバランスを取ることが求められていた。
日本特許第３８４４９７５号公報 国際公開ＷＯ２０１２／１３９７４８号パンフレット 国際公開ＷＯ２０１４／０９０８３６号パンフレット
　同一容器内で逆転写反応と核酸増幅反応を行うのに適した逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼを創生する遺伝子工学的改良方法を提供することにある。
　本発明者らは、逆転写反応と核酸増幅反応を行うのに適した逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体を開発すべく鋭意研究した結果、驚くべきことに、特定のアミノ酸配列部位に変異を導入することによって、従来技術よりすぐれた逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体を作製する方法を見出すことに成功し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明の第一の発明は、Ａ１～Ａ１２の１２アミノ酸からなる配列を含む、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの変異体であって、ここで
　Ａ１は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
　Ａ２は、親水性の中性アミノ酸残基あるいは疎水性の脂肪族アミノ酸残基であり；
　Ａ３は、親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ４は、酸性アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ５は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
　Ａ６は、疎水性の脂肪族アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり、
　Ａ７は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
　Ａ８は、プロリン残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ９は、疎水性の芳香族アミノ酸残基、塩基性アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ１０は、酸性アミノ酸残基あるいは塩基性アミノ酸残基であり；
　Ａ１１は、酸性アミノ酸残基であり；
　Ａ１２は、疎水性の脂肪族アミノ酸残基であり；及び
前記のＡ３及び／又はＡ１０のアミノ酸が変異導入前のものとは別の塩基性アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体、に関する。
　本発明の第一の発明の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体は、変異導入前の上記１２アミノ酸からなる配列の、Ａ１がロイシン、Ａ３がグルタミン、Ａ５がロイシン、Ａ７がイソロイシン、Ａ１１がグルタミン酸及びＡ１２がアラニンであるものが好適である。また、本発明の第一の発明の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体において、上記１２アミノ酸からなる配列のＡ３及び／又はＡ１０のアミノ酸がリシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されているものが好適である。特に限定はされないが、アルギニンへの置換が好ましい。
　本発明の第一の発明の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体は、同一容器内で逆転写反応と核酸増幅反応を行うのに適した逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ由来であれば特に限定はされないが、例えばサーマス・サーモフィルス由来ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアティカス由来ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・カルドテナックス由来ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラス由来ＤＮＡポリメラーゼあるいはアリシクロバチラス・アシッドカルダリウス由来ＤＮＡポリメラーゼの変異体が好適である。
　本発明の第二の発明は、本発明の第一の発明の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体を含むキットに関する。当該キットは、後述の逆転写反応と核酸増幅反応に適した反応溶液を調製するキットとして、各種成分を含んでいてもよい。
　本発明の第三の発明は、本発明の第一の発明の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体を含む組成物に関する。当該組成物は、後述の逆転写反応と核酸増幅反応に適した組成物として、各種成分を含んでいてもよい。
　本発明の第四の発明は、ＲＮＡからの核酸増幅に適した逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの製造方法であって、
（１）以下のＡ１～Ａ１２の１２アミノ酸からなる配列を含む、ＤＮＡポリメラーゼを選択する工程；
　Ａ１は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
　Ａ２は、親水性の中性アミノ酸残基あるいは疎水性の脂肪族アミノ酸残基であり；
　Ａ３は、親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ４は、酸性アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ５は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
　Ａ６は、疎水性の脂肪族アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり、
　Ａ７は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
　Ａ８は、プロリン残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ９は、疎水性の芳香族アミノ酸残基、塩基性アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ１０は、酸性アミノ酸残基あるいは塩基性アミノ酸残基であり；
　Ａ１１は、酸性アミノ酸残基であり；
　Ａ１２は、疎水性の脂肪族アミノ酸残基であり；及び
（２）工程（１）で選択されたＤＮＡポリメラーゼの、上記１２アミノ酸からなる配列におけるＡ３及び／又はＡ１０のアミノ酸が変異導入前のものとは別の塩基性アミノ酸残基に置換する工程、を含む方法に関する。
　本発明の第四の発明の製造方法は、工程（１）が上記１２アミノ酸からなる配列において、Ａ１がロイシン、Ａ３がグルタミン、Ａ５がロイシン、Ａ７がイソロイシン、Ａ１１がグルタミン酸及びＡ１２がアラニンであるＤＮＡポリメラーゼを選択する工程であってもよい。さらに工程（２）は、Ａ３及び／又はＡ１０がリシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸に置換される工程であってもよい。
　本発明の第四の発明の製造方法は、当該変異体をコードする核酸を作成し、適切な宿主に導入して変異体を発現させる方法を組み合わせてもよい。
　本発明の第五の発明は、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの改良方法であって、以下のＡ１～Ａ１２に示す１２アミノ酸からなる配列を含む、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、Ａ３及び／又はＡ１０のアミノ酸を別の塩基性アミノ酸残基に置換することを特徴とする方法：
　Ａ１は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
　Ａ２は、親水性の中性アミノ酸残基あるいは疎水性の脂肪族アミノ酸残基であり；
　Ａ３は、親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ４は、酸性アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ５は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
　Ａ６は、疎水性の脂肪族アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり、
　Ａ７は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
　Ａ８は、プロリン残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ９は、疎水性の芳香族アミノ酸残基、塩基性アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ１０は、酸性アミノ酸残基あるいは塩基性アミノ酸残基であり；
　Ａ１１は、酸性アミノ酸残基であり；及び
　Ａ１２は、疎水性の脂肪族アミノ酸残基である、に関する。
　本発明の第五の発明の改良方法において、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、例えば、上記１２アミノ酸からなる配列の、Ａ１がロイシン、Ａ３がグルタミン、Ａ５がロイシン、Ａ７がイソロイシン、Ａ１１がグルタミン酸及びＡ１２がアラニンであるＤＮＡポリメラーゼを選択することができる。さらに、本発明の第五の発明の改良方法において、上記１２アミノ酸からなる配列のＡ３及び／又はＡ１０を例えば、リシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸に置換することができる。
　本発明の第一から第五の発明において、Ａ１～Ａ１２の１２アミノ酸からなる配列を含む、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、
　Ａ１は、ロイシン；
　Ａ２は、セリンあるいはアラニン；
　Ａ３は、グルタミン；
　Ａ４は、グルタミン酸あるいはアスパラギン；
　Ａ５は、ロイシン；
　Ａ６は、アラニンあるいはアスパラギン；
　Ａ７は、イソロイシン；
　Ａ８は、プロリン、セリンあるいはスレオニン；
　Ａ９は、チロシン、アルギニンあるいはグルタミン；
　Ａ１０は、グルタミン酸あるいはリシン；
　Ａ１１は、グルタミン酸；
　Ａ１２は、アラニン；及び
前記のＡ３及び／又はＡ１０のアミノ酸が変異導入前のものとは別の塩基性アミノ酸残基に置換された変異体が好ましく、例えば、Ａ３及び／又はＡ１０のアミノ酸がリシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群より選択されたアミノ酸に置換されたＤＮＡポリメラーゼの変異体であってもよい。
　本発明により、同一容器内で逆転写反応と核酸増幅反応を行うのに適した逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体並びにその製造方法が提供される。本発明によれば、上記Ａ１～Ａ１２で示される特定のアミノ酸配列部位を有する逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼであれば、本発明の変異導入を行うことができ、その結果として従来よりも逆転写反応時間を短縮でき、さらにつづく核酸増幅反応用の初期鋳型量として十分な数量を生成させることができ、逆転写酵素反応と核酸増幅反応を従来以上の検出感度を短時間で達成することができる。
１．本発明の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体
　本発明の第一の態様は、逆転写酵素反応と核酸増幅反応に適したＤＮＡポリメラーゼ変異体に関するものである。本発明の変異体は、Ａ１～Ａ１２の１２アミノ酸からなる配列を含む、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの変異体であって、ここで
　Ａ１は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
　Ａ２は、親水性の中性アミノ酸残基あるいは疎水性の脂肪族アミノ酸残基であり；
　Ａ３は、親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ４は、酸性アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ５は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
　Ａ６は、疎水性の脂肪族アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり、
　Ａ７は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
　Ａ８は、プロリン残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ９は、疎水性の芳香族アミノ酸残基、塩基性アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ１０は、酸性アミノ酸残基あるいは塩基性アミノ酸残基であり；
　Ａ１１は、酸性アミノ酸残基であり；　
　Ａ１２は、疎水性の脂肪族アミノ酸残基であり、そして前述のＡ３及び／又はＡ１０のアミノ酸が別の塩基性アミノ酸残基に置換された変異体である。
　上記構成の変異体は、一容器で実施される逆転写反応と核酸増幅反応に適したＤＮＡポリメラーゼ変異体である。
　本明細書において「分枝鎖アミノ酸残基」は、バリン残基、イソロイシン残基あるいはロイシン残基が例示される。同様に「親水性の中性アミノ酸残基」は、セリン残基、スレオニン残基、アスパラギン残基あるいはグルタミン残基が例示される。「疎水性の脂肪族アミノ酸残基」は、グリシン残基あるいはアラニン残基が例示される。「酸性アミノ酸残基」は、アスパラギン酸残基あるいはグルタミン酸残基が例示される。「疎水性の芳香族アミノ酸残基」は、フェニルアラニン残基、チロシン残基あるいはトリプトファン残基が例示される。「塩基性アミノ酸残基」は、リシン残基、アルギニン残基あるいはヒスチジン残基が例示される。
　本発明の具体的な態様としては、例えば上記Ａ１～Ａ１２からなる１２アミノ酸配列のうち、Ａ１がロイシン、Ａ３がグルタミン、Ａ５がロイシン、Ａ７がイソロイシン、Ａ１１がグルタミン酸及びＡ１２がアラニンである、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼが変異体の材料として使用できる。
　本発明の変異体の好ましい例は、上記のＡ１～Ａ１２の１２アミノ酸からなる配列を含み、かつ逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、Ａ３及び／又はＡ１０のアミノ酸が、リシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている変異体である。特に好ましくは、アルギニンに置換した変異体である。
　さらに好ましくは、Ａ１～Ａ１２の１２アミノ酸からなる配列を含む、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼであって、
　Ａ１は、ロイシン；
　Ａ２は、セリンあるいはアラニン；
　Ａ３は、グルタミン；
　Ａ４は、グルタミン酸あるいはアスパラギン；
　Ａ５は、ロイシン；
　Ａ６は、アラニンあるいはアスパラギン；
　Ａ７は、イソロイシン；
　Ａ８は、プロリン、セリンあるいはスレオニン；
　Ａ９は、チロシン、アルギニンあるいはグルタミン；
　Ａ１０は、グルタミン酸あるいはリシン；
　Ａ１１は、グルタミン酸；
　Ａ１２は、アラニン；及び
前記のＡ３及び／又はＡ１０のアミノ酸が変異導入前のものとは別の塩基性アミノ酸残基に置換された変異体が例示され、例えば、Ａ３及び／又はＡ１０のアミノ酸がリシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群より選択されたアミノ酸に置換されたＤＮＡポリメラーゼの変異体であってもよい。
　特に限定はされないが、例えばサーマス・サーモフィルス由来の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの場合、当該ポリメラーゼの配列番号１で６８０位から６９１位までのアミノ酸配列が前記Ａ１からＡ１２に相当し、具体的には「ＬＳＱＥＬＡＩＰＹＥＥＡ」（配列番号１８）のアミノ酸配列である。従って、サーマス・サーモフィルス由来ＤＮＡポリメラーゼのＡ３（６８２位）のグルタミン残基及び／又はＡ１０（６８９位）のグルタミン酸残基を、リシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸、好ましくはアルギニンに置換変異させた変異体が本発明の変異体として例示される。「ＬＳＲＥＬＡＩＰＹＲＥＡ」（配列番号１９）を有するサーマス・サーモフィルス由来ＤＮＡポリメラーゼの変異体が逆転写酵素反応と核酸増幅反応に適したＤＮＡポリメラーゼ変異体として好適に使用できる。例えば、本願明細書実施例１で調製したサーマス・サーモフィルス由来ＤＮＡポリメラーゼの変異体ｂ１３ｂ４６は、上記Ｑ６８２ＲおよびＥ６８９Ｒを有する変異体である。
　同様の変異体は、サーマス・アクアティカス由来、バチルス・カルドテナックス由来、バチルス・ステアロサーモフィラス由来あるいはアリシクロバチラス・アシッドカルダリウス由来の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼでも作製することができる。
　本発明の具体的な態様としては、例えばバチルス・カルドテナックス由来の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、上記Ａ１～Ａ１２からなる１２アミノ酸配列として「ＬＡＱＮＬＮＩＳＲＫＥＡ」（配列番号２０）の配列を有している。同様にバチルス・ステアロサーモフィラス由来の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの１２アミノ酸配列は「ＬＡＱＮＬＮＩＴＲＫＥＡ」（配列番号２１）である。さらにアリシクロバチラス・アシッドカルダリウス由来の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの１２アミノ酸配列は「ＬＡＱＮＬＮＩＰＱＫＥＡ」（配列番号２２）である。また、サーマス・アクアティカス由来の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの１２アミノ酸配列は「ＬＳＱＥＬＡＩＰＹＥＥＡ」（配列番号２５の６７８位～６８９位）である。これらのアミノ酸配列中のＡ３及び／又はＡ１０が、塩基性アミノ酸残基に置換されているものが本発明の変異体として例示される。特に限定されないが例えば、Ａ３及び／又はＡ１０のアミノ酸が、リシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている変異体である。特に好ましくは、アルギニンに置換した変異体である。これらの変異体の他、好熱性細菌由来の耐熱性ポリメラーゼ、等温核酸増幅法に適した中温性ＤＮＡポリメラーゼに同様の変異を導入したものも本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体に包含される。即ち、ポルＩ型、あるいはファミリーＡ型のＤＮＡポリメラーゼも本発明の変異導入のターゲットとして好適に使用できる。
　本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、逆転写酵素活性と核酸増幅活性を損なわない限りは、さらに上記Ａ１～Ａ１２に示す１２アミノ酸配列以外の部位への変異の導入を組み合わせたものであってもよい。特に限定はされないが、変異導入前の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列、例えば、サーマス・サーモフィルス由来の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ＷＰ＿０１１２２８４０５．１）あるいはサーマス・アクアティカス由来の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＢＡＡ０６７７５．１）のアミノ酸配列に対して、上記Ａ１～Ａ１２に示す１２アミノ酸配列部位以外の部分においては、少なくとも８０％、８１、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する機能的ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。これらのＤＮＡポリメラーゼは、ＲＴ－ＰＣＲ法において好適に使用できる。同様にＲＴ－等温核酸増幅法の場合では、バチルス・カルドテナックス由来の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ＷＰ＿０４７７５８１４５．１）、バチルス・ステアロサーモフィラス由来の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃ．　Ｎｏ．ＡＡＡ８５５５８．１）あるいはアリシクロバチラス・アシッドカルダリウス由来の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃ．　Ｎｏ．ＢＡＦ３３３７３．１）において、上記Ａ１～Ａ１２に示す１２アミノ酸配列部位以外の部分においては、少なくとも８０％、８１、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のアミノ酸配列同一性を有する機能的ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
　本発明の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体は、さらにエキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体であってもよい。例えば、サーマス・サーモフィルス、サーマス・アクアティカス、バチルス・カルドテナックス、バチルス・ステアロサーモフィラス、アリシクロバチラス・アシッドカルダリウス等に由来するＤＮＡポリメラーゼについては５→３エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体が知られている。前記エキソヌクレアーゼ活性を欠失した変異体は、ＤＮＡポリメラーゼのＮ末端側に位置する５→３エキソヌクレアーゼドメインを欠失している。本発明の変異体についても同様に５→３エキソヌクレアーゼドメインを欠失させ、５→３エキソヌクレアーゼ活性を有しない変異体とすることができる。
　本発明の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体は、変異導入前の当該ＤＮＡポリメラーゼが逆転写を達成しえない逆転写反応条件下でも目的のｃＤＮＡを作ることができる。前記逆転写反応条件としては、反応時間の短縮、反応温度の高温化等が挙げられる。あるいは、同一条件で逆転写を実施した場合に変異導入前のＤＮＡポリメラーゼよりも逆転写反応産物の量が増加すること等が挙げられる。特に限定はされないが例えば、サーマス・サーモフィルス由来の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用した６０℃反応で３０分間程度を要する逆転写反応を、当該ＤＮＡポリメラーゼから作成された本発明の変異体を使用することにより６０℃　１～５分間という短時間で完了することが可能となる。また、日本特許第３８４４９７５号公報で開示されている技術で調製した逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体と比較しても逆転写反応においてすぐれている。さらに本発明の変異体は、既存の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼに比べ反応時の阻害物質耐性や鋳型核酸に対する親和性という点でさらなる改善が期待できる。本発明においては、本来の逆転写酵素活性が低いポルＩ型、あるいはファミリーＡ型のＤＮＡポリメラーゼに対して、その逆転写酵素活性を著しく改善することができるため、逆転写反応と核酸増幅反応を行うのに適した逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体を創生することができる。
　さらに本発明の変異体は、ＰＩＰボックス（ＰＩＰ　ｂｏｘ：ＰＣＮＡ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｏｘ）との融合タンパク質であってもよい。ＤＮＡポリメラーゼ活性を促進するタンパク質であるＰＣＮＡは、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性も促進することができる。特に限定はされないが、国際公開ＷＯ２０１７／０９０６８５号パンフレット記載の技術と組み合わせ、ＰＩＰボックスが融合された本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を作製することができる。
２．本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を含む組成物又はキット
　本発明の組成物は、前記の本発明の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体を含む組成物を意味する。本発明の組成物の一態様としては、逆転写反応と核酸増幅反応に適した組成物であり、上記１．で述べた本発明の逆転写酵素反応と核酸増幅反応に適したＤＮＡポリメラーゼ変異体に加え、例えば逆転写反応とポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ＰＣＲ）に必要な成分、例えば、二価金属塩、ｄＮＴＰｓ、緩衝成分、還元剤、滅菌水等を含有する。また本発明の組成物は、増幅／検出すべきＲＮＡが明らかな場合には適切なプライマーを含んでいてもよい。一方、逆転写反応と等温核酸増幅反応に適した組成物の場合も逆転写反応と等温核酸増幅反応に必要な成分を含む限りは、上記と同様の成分を含む組成物が好適である。
　前記二価金属塩を構成する二価金属イオンとしては、特に限定するものではないが、マンガンイオン、マグネシウムイオンが例示される。逆転写酵素に適する二価金属イオンとその濃度は、当該分野で知られている。二価金属イオンは塩化物、硫酸塩、または酢酸塩等の塩の形態で供給され得る。本発明を特に限定するものではないが、本発明の組成物中の二価金属イオンの濃度としては、例えば０．５～２０ｍＭが好ましく例示される。前記ｄＮＴＰとしては、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、もしくはそれらの誘導体の少なくとも１種が使用される。好適にはｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの４種類の混合物が使用される。
　ｐＨ維持のための緩衝成分としては特に限定するものではないが、トリス（Ｔｒｉｓ）緩衝液、トリシン緩衝液、バイシン緩衝液、へぺス（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、酢酸緩衝液あるいはリン酸緩衝液が例示される。例えば、逆転写反応と核酸増幅反応に適する緩衝成分とその濃度は、当該分野で知られている。逆転写反応用の還元剤としては、特に限定するものではないが、ＤＴＴ（ジチオトレイトール）、２－メルカプトエタノールが例示される。逆転写反応に適する還元剤とその濃度は、当該分野で知られている。
　逆転写反応には、例えばｒａｎｄｏｍ　６ｍｅｒｓ、ｏｌｉｇｏ　ｄＴ　ｐｒｉｍｅｒおよび遺伝子特異的プライマーがプライマーとして使用できる。当該プライマーの鎖長は、ハイブリダイゼーションの特異性の観点から、好ましくは６ヌクレオチド以上であり、更に好ましくは１０ヌクレオチド以上であり、オリゴヌクレオチドの合成の観点から、好ましくは１００ヌクレオチド以下であり、更に好ましくは３０ヌクレオチド以下である。なお、非特異的なｃＤＮＡ合成を目的としたランダムプライマーとしては鎖長６～８ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドの混合物を使用してもよい。前記オリゴヌクレオチドは、例えば公知の方法により化学的に合成することができる。また、生物試料由来のオリゴヌクレオチドであっても良く、例えば天然の試料より調製したＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ消化物から単離して作製しても良い。核酸増幅反応のためには、増幅すべき核酸の配列に応じて設計されたプライマー対を含んでいてもよい。逆転写反応用のプライマーが核酸増幅用のプライマーの一方を兼ねていてもよい。
　本発明のキットは、逆転写反応と核酸増幅反応法に適したＲＴ－ＰＣＲ用キットあるいはＲＴ－等温核酸増幅用キットである。本発明のキットとしては、上記１．で述べた本発明の逆転写反応と核酸増幅反応に適したＤＮＡポリメラーゼ変異体、二価金属塩、ｄＮＴＰ、緩衝成分、還元剤、やその他の逆転写反応と核酸増幅反応に適した成分を含有し、使用時にこれらを混合して逆転写反応／核酸増幅反応溶液を調製するためのキット、前記の本発明の組成物を含有し、使用時に鋳型ＤＮＡと水（滅菌水等）を添加するのみで使用可能なキット、さらに前記の本発明の組成物が乾燥状態で含有されたキット、等が例示される。特定のＲＮＡの検出を目的とした、標的ＲＮＡに特異的なプライマーや陽性コントロール用のＲＮＡを含有するキットも本発明に包含される。なお、上記二価金属塩、ｄＮＴＰｓ、緩衝成分、および還元剤は、上記で説明したとおりである。
　さらに本発明の組成物あるいはキットは、増幅された二本鎖核酸の検出に必要な成分、例えば、インターカレーターや蛍光標識プローブ等を含有していてもよい。インターカレーターとしてはＳＹＢＲ（登録商標）　Ｇｒｅｅｎ　Ｉ、ＴＢ　Ｇｒｅｅｎ（登録商標）やその他の核酸結合性色素が、蛍光標識プローブとしては、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ、Ｃｙｃｌｅａｖｅ（登録商標）プローブあるいはモレキュラービーコンプローブ等が、それぞれ挙げられる。
３．本発明の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体の製造方法
　本発明の逆転写酵素反応と核酸増幅反応に適したＤＮＡポリメラーゼ変異体の製造方法は、上記１．に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体の製造方法に関するものである。
　本発明の製造方法の具体的な態様としては、ＲＮＡからの核酸増幅に適した逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの製造方法であって、
（１）以下のＡ１～Ａ１２の１２アミノ酸からなる配列を含む、ＤＮＡポリメラーゼを選択する工程；
　Ａ１は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
　Ａ２は、親水性の中性アミノ酸残基あるいは疎水性の脂肪族アミノ酸残基であり；
　Ａ３は、親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ４は、酸性アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ５は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
　Ａ６は、疎水性の脂肪族アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり、
　Ａ７は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
　Ａ８は、プロリン残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ９は、疎水性の芳香族アミノ酸残基、塩基性アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ１０は、酸性アミノ酸残基あるいは塩基性アミノ酸残基であり；
　Ａ１１は、酸性アミノ酸残基であり；
　Ａ１２は、疎水性の脂肪族アミノ酸残基であり；及び
（２）工程（１）で選択されたＤＮＡポリメラーゼの、上記１２アミノ酸からなる配列におけるＡ３及び／又はＡ１０のアミノ酸が変異導入前のものとは別の塩基性アミノ酸残基に置換する工程、を含む方法が例示される。
　上記態様においては、１２アミノ酸からなる配列が、Ａ１がロイシン、Ａ３がグルタミン、Ａ５がロイシン、Ａ７がイソロイシン、Ａ１１がグルタミン酸及びＡ１２がアラニンであるアミノ酸配列を含むＤＮＡポリメラーゼを変異導入用の材料として選択することができる。
　本発明の製造方法においては、工程（２）において、上記選択された逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼについて、Ａ３及び／又はＡ１０がリシン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸に置換することが好ましい。特に好ましくは、アルギニンに置換される。
　工程（１）は、上記Ａ１～Ａ１２からなるアミノ酸配列を含むＤＮＡポリメラーゼを常法により、例えばコンピューターを使ったホモロジー検索で抽出し、実施することができる。検索には公知のアミノ酸配列データベースを使用できる。
　工程（２）では、工程（１）で選択されたＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸を調製し、当該核酸のＡ３及び／又はＡ１０に相当するコドンを塩基性アミノ酸残基のコドンに変換することで実施される。このような塩基置換は公知の方法で実施することができ、例えば市販の変異導入キットを使用してもよい。変異導入後の変異体をコードする核酸の全長を化学合成してもよい。さらに、上記Ａ１～Ａ１２に示す１２アミノ酸配列以外の部位への変異の導入を組み合わせてもよい。
　本発明の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体を製造する場合、当該変異体をコードする核酸を作成し、適切な宿主に導入して変異体を発現させることができる。使用する宿主において目的の変異体を発現可能にするため、または発現量を増加させるために、コドンの最適化を行ってもよい。該コドン最適化は、本分野において通常使用されている方法によって行うことが好ましい。
　本発明の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体の製造では、当該変異体のアミノ酸配列をコードする核酸を適当な発現ベクターに組み込んで前記変異体を製造することができる。その際発現ベクターは、本発明の変異体逆転写酵素変異体をコードする核酸、および該核酸と作動可能に連結された発現調節配列を含むことが好ましい。当該発現調節配列は特に限定されるものではないが、プロモーターならびにプロモーターの制御に関わる遺伝子、リボソーム結合配列、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列（転写ターミネーター）、エンハンサー等が挙げられる。さらに形質転換体の選別に用いられるマーカー（薬剤耐性遺伝子、蛍光マーカー、発光マーカーなど）をコードする遺伝子を含んでいてもよい。
　本発明の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードする核酸を挿入する発現ベクターとしては、本分野において通常使用されている発現ベクターであれば、特に限定は無い。宿主細胞において自立複製が可能なベクターや宿主染色体に組み込まれ得るベクターを使用することができる。宿主に適合するベクターを使用すればよい。
　本発明の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードする核酸を挿入する発現ベクターとして、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、ウイルスベクター等を使用することができる。プラスミドベクターとしては、使用する宿主に適したプラスミド、例えば大腸菌由来のプラスミド、バチルス属細菌由来のプラスミド、酵母由来のプラスミドが当業者に周知であり、また、市販されているものも多い。本発明には、これら公知のプラスミドやその改変体を使用することができる。ファージベクターとしては、例えば、λファージ（例えば、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ）等を使用することができ、ウイルスベクターとしては、例えば、レトロウイルス、ワクシニアウイルス等の動物ウイルス、バキュロウイルス等の昆虫ウイルスを使用することができる。さらに、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞を宿主とする異種タンパク質発現系も数多く構築されており、また、すでに市販もされている。本発明の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体の製造には、これら発現系を使用してもよい。
　本発明の製造方法で用いる発現ベクターに搭載するプロモーターは宿主に応じて選択することができ、例えば大腸菌ではｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターやそれらの改変体を使用することができるが、前記のものに限定されるものではない。さらに、ファージ由来のプロモーターとＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み合わせた発現系（例えばｐＥＴ発現系等）を利用してもよい。
　また、発現させたポリペプチドの精製を容易にするために、本発明の発現ベクターは、アフィニティタグをコードする核酸をさらに含んでいてもよい。アフィニティタグをコードする核酸は、本発明の逆転写酵素変異体と当該アフィニティタグの融合タンパク質が発現されるようにベクターに挿入される。本発明を何ら限定するものではないが、アフィニティタグとしては、例えば、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、マルトース結合タンパク質（ｍａｌｔｏｓｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ；ＭＢＰ）タグ、８残基のアミノ酸（Ｔｒｐ－Ｓｅｒ－Ｈｉｓ－Ｐｒｏ－Ｇｌｎ－Ｐｈｅ－Ｇｌｕ－Ｌｙｓ）からなるＳｔｒｅｐ（ＩＩ）タグなどをコードする核酸が例示される。当該タグを付加する位置は、本発明の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードする核酸の５’末端および／または３’末端側のいずれでもよく、発現およびタグ機能の障害とならない位置に適宜付加すればよい。なお、該タグは、発現させたポリペプチドの精製段階において切断できるタグが好ましい。本発明を何ら限定するものではないが、かかる切断できるタグとしては、例えば、Ｆａｃｒｏｒ　Ｘａ、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ、トロンビン（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ）、エンテロキナーゼ（ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ）、ＴＥＶプロテアーゼ（Ｔｏｂａｃｃｏ　Ｅｔｃｈ　Ｖｉｒｕｓ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ）などの融合ポリペプチド切断用プロテアーゼの認識配列をコードする核酸を含むタグが例示される。
４．本発明の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの改良方法
　本発明の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの改良方法は、以下のようにして実施することができる。即ち、Ａ１～Ａ１２に示す１２アミノ酸からなる配列を含む、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、Ａ３及び／又はＡ１０のアミノ酸を別の塩基性アミノ酸残基に置換することを特徴とする。
　本発明の改良方法では、まず以下のＡ１～Ａ１２に示す１２アミノ酸からなる配列を含む、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼが変異導入前の候補として選択することができる。
　Ａ１は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
　Ａ２は、親水性の中性アミノ酸残基あるいは疎水性の脂肪族アミノ酸残基であり；
　Ａ３は、親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ４は、酸性アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ５は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
　Ａ６は、疎水性の脂肪族アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり、
　Ａ７は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
　Ａ８は、プロリン残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ９は、疎水性の芳香族アミノ酸残基、塩基性アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
　Ａ１０は、酸性アミノ酸残基あるいは塩基性アミノ酸残基であり；
　Ａ１１は、酸性アミノ酸残基であり；及び
　Ａ１２は、疎水性の脂肪族アミノ酸残基である。
　当該候補となる逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼを選択する方法としては、上記Ａ１～Ａ１２からなるアミノ酸配列を含むＤＮＡポリメラーゼを常法により、例えばコンピューターを使ったホモロジー検索によって抽出する方法が挙げられる。検索は公知のアミノ酸配列データベースを使用して実施することができる。
　本発明の具体的な態様においては、１２アミノ酸からなる配列はＡ１がロイシン、Ａ３がグルタミン、Ａ５がロイシン、Ａ７がイソロイシン、Ａ１１がグルタミン酸及びＡ１２がアラニンであるアミノ酸配列を有するＤＮＡポリメラーゼが変異導入用の材料として好適に使用できる。この選択された逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼについて、Ａ３及び／又はＡ１０のアミノ酸を別の塩基性アミノ酸残基に置換することにより、ＤＮＡポリメラーゼの改良が達成される。具体的には、ＤＮＡポリメラーゼの有する逆転写活性が向上し、反応時間当たりの逆転写産物（ｃＤＮＡ）生成量が増加する。
　上記アミノ酸置換については、Ａ３及び／又はＡ１０をリシン、アルギニンおよびヒスチジンからなる群から選択されるアミノ酸に置換することが好ましい。特に好ましくは、アルギニン残基への置換である。本発明の改良方法については、逆転写酵素活性と核酸増幅活性を損なわない限りは、上記Ａ１～Ａ１２に示す１２アミノ酸配列以外の部位にさらに変異を導入してもよい。また、本発明においては、改良する逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼに特に限定はなく、例えば、サーマス・サーモフィルス、サーマス・アクアティカス、バチルス・カルドテナックス、バチルス・ステアロサーモフィラス、アリシクロバチラス・アシッドカルダリウス等に由来するＤＮＡポリメラーゼのほか、好熱性細菌由来の耐熱性ポリメラーゼ、等温核酸増幅法に適した中温性ＤＮＡポリメラーゼ並びにそのアミノ酸置換、挿入若しくは欠失、又は他の改変体のいずれもが含まれる。言い換えれば、本来の逆転写酵素活性が低いポルＩ型、あるいはファミリーＡ型のＤＮＡポリメラーゼであってもよい。
　以下に本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
実験方法
（１）Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体の調製方法
　Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（Ｔｔｈ）　ＨＢ８株由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｎｏ．ＷＰ＿０１１２２８４０５．１に開示されている。当該ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号１に示す。当該アミノ酸配列中の特定の部位（本発明のＡ１～Ａ１２に示す１２アミノ酸からなる配列部分）に変異を導入した配列の人工遺伝子を、それぞれ化学的に合成した。得られた人工遺伝子は、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ（タカラバイオＵＳＡ社製）を用いて、プラスミドｐＥＴ６ｘＨＮ－Ｎ（タカラバイオＵＳＡ社製）に導入した。得られたプラスミドは、Ｎ末端側にヒスチジンタグが付加されたＴｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードする塩基配列を有している。
　次に、当該プラスミドで大腸菌ＢＬ２１　ＤＥ３株（タカラバイオ社製）を形質転換し、１００μｇ／ｍＬ濃度のアンピシリンを含む１．５％アガロースＬＢプレート上で３７℃で終夜培養を行った。このプレートから３つのシングルコロニーを選択して１００μｇ／ｍＬ濃度のアンピシリンを含むＬＢ培地（以下ＬＢ－ＡＰ培地と称する）に植菌し、３７℃で終夜振とう培養を行った。さらに前記培養液３００μＬをＬＢ－ＡＰ培地２５ｍＬに接種し、３７℃で終夜振とう培養した。ＯＤ６００値が０．６になった時に、培養液に終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加えてさらに３７℃で２１時間誘導培養を行い、菌体を採取した。
　上記で得られた菌体を２ｍＬの５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ　ｐＨ８．０（４℃）、１００ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、５％グリセロールを含む溶液（以下、Ｂｕｆｆｅｒ　Ｓと称する）に懸濁し、最終濃度０．１ｍｇ／ｍＬになるようにリゾチーム（Ｓｉｎｏｐｈａｒｍ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｒｅａｇｅｎｔ　Ｃｏ．，Ｌｔｄ社製）を添加し、４℃で１時間振とうした。振とう後、４℃　１５，０００×ｇで３０分間遠心し、上清を回収した。回収した上清は、８５℃で１５分保持した後、４℃　１５，０００×ｇで３０分間遠心した。加熱後の上清は、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－０．５ｍＬカラムを用いて遠心により約２０倍濃縮した。
　得られた濃縮液をＴｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体粗精製溶液として、以下の試験に使用した。なお使用酵素のユニット数は、ＤＮＡポリメラーゼ活性については、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型／プライマーとして用い、ｐＨ９．３の反応液中にて７４℃において、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を１Ｕとして算出した。
（２）Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体の逆転写活性評価方法
　上記（１）で得られたＴｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体について、以下の方法で逆転写反応を試験した。即ち、当該Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体粗抽出溶液について、５×ＲＴ－ＰＣＲ緩衝液（終濃度５０ｍＭ　バイシン緩衝液（ｐＨ８．２）、終濃度１１５ｍＭ　酢酸カリウム、終濃度８％グリセロール、）、終濃度２．５ｍＭ　酢酸マンガン、終濃度０．１％　ＢＳＡ、配列表の配列番号２及び３記載の塩基配列を有する終濃度０．２μＭのプライマー対、配列表の配列番号４記載の塩基配列を有する終濃度０．２μＭのプローブ、終濃度０．３ｍＭ　ｄＮＴＰ、鋳型となる鎖長４．４ｋｂのＲＮＡ（λＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ　ＡＣＣ．　Ｎｏ．Ｊ０２４５９．１）の核酸番号１２６９７から１７０９０の領域に相当するＲＮＡ。１×１０７コピー相当）、実験方法（１）で調製したＴｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体５Ｕ並びに２．５ＵのＴａｑ抗体（タカラバイオ社製）を含む最終容量５０μＬの反応液を調製した。対照として、野生型Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液も調製した。
　ＲＴ－ＰＣＲ条件は、９０℃　３０秒、６０℃　１分、９５℃　１分間処理した後、９５℃　１５秒、５６℃　４５秒を１サイクルとする４５サイクル反応に設定した。サーマルサイクラーは、ＴＰ－９９０　ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（登録商標）Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＳｙｓｔｅｍＩＩＩ（タカラバイオ社製）を用いて、リアルタイムＰＣＲを行い、Ｃｔ値を測定した。
実施例１　Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体の調製
　実験方法（１）に従って、Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼの野生型アミノ酸配列において、６８２位のグルタミンをアルギニンに置き換えた変異体タンパク質をコードする人工遺伝子を調製した。得られた人工遺伝子を保持する組換えプラスミドを作製し、実験方法１（１）にしたがってタンパク発現ならびに発現されたタンパク質の精製を行った。こうして得られた、６８２位のグルタミンからアルギニンへの置換変異（Ｑ６８２Ｒ）を有するＴｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体をｂ１３と命名した。同様にして、Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼの野生型アミノ酸配列の６８９位のグルタミン酸をアルギニンに置き換えた（Ｅ６８９Ｒ）Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体（ｂ４６と命名した）、６８２位のグルタミンをアルギニンに、６８９位のグルタミン酸をアルギニンにそれぞれ置き換えた（Ｑ６８２Ｒ＋Ｅ６８９Ｒ）Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体（ｂ１３ｂ４６と命名した）を調製した。前記変異体タンパク質のアミノ酸配列及び核酸配列を配列番号５～１０に示す。
実施例２　Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体の逆転写活性評価試験１
　実施例１で調製したＴｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体及び野生型Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼについて、実験方法（２）にしたがって逆転写活性評価試験を行った。通常野生型Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼを使用する場合、逆転写反応は６０℃　３０分間が標準であるが、本実施例では６０℃　１分間という短い逆転写反応時間でその性能を比較した。その結果を表１に示す。Ｃｔ値はターゲットの初期量に反比例するため、ＤＮＡの初期コピー数の算出に使用できる。例えば、Ｃｔ値が１小さい（マイナス）とＰＣＲの鋳型となるＤＮＡ量が２倍多いことになる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１に示したように、変異体ｂ１３、ｂ４６及びｂ１３ｂ４６のいずれにおいても、ＰＣＲ時の初期鋳型ＤＮＡ量が野生型酵素と比較して１００倍～１０００倍以上になっていることが確認できた。鋳型ＤＮＡ量の増加は、ＰＣＲ前の逆転写反応によるｃＤＮＡ量の増加があったことを意味しており、当該変異体が逆転写反応において野生型の１００倍～１０００倍以上の能力向上があったことが確認できた。
実施例３　ＰＩＰボックスとＴｔｈ変異体の融合タンパク質
　実施例１記載のＴｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体とＰＣＮＡ結合ドメインの融合タンパク質について検討した。まず国際公開ＷＯ２０１７／０９０６８５号パンフレット　実施例４記載の方法に従い、各Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体のＮ末端側に配列表の配列番号１１記載のアミノ酸配列を有するＰＩＰボックスが３つ縦列した３ＰＩＰと野生型Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼの融合タンパク質（ＰＩＰ－Ｌ１４－ＰＩＰ－Ｌ１４－ＰＩＰ－Ｌ１５－Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ）を作製した。当該融合タンパク質は、３ＰＩＰ－野生型と命名した。同様に３ＰＩＰと実施例１で説明したｂ１３、ｂ４６ならびにｂ１３ｂ４６変異体との融合タンパク質も作製したこれらは、３ＰＩＰ－ｂ１３、３ＰＩＰ－ｂ４６並びに３ＰＩＰ－ｂ１３ｂ４６と命名した。また、ＰＩＰボックスを認識するポリメラーゼ関連因子であるＰｕｆ　ＰＣＮＡ　Ｄ１４３Ｒ変異体（ＰＣＮＡ１３）は、国際公開ＷＯ２００７／００４６５４号パンフレット　実施例記載の方法で調製した。
　本実施例において、逆転写反応の鋳型となるＲＮＡについては、以下のようにして調製した。即ち、厚生労働省　医薬食品局　食品安全部　監視安全課より通知された「ノロウイルスの検出法について」（平成１５年１１月５日付け食安監発第１１０５００１号別添　最終改正：平成２５年１０月２２日付け食安監発１０２２第１号）（以下「公定法」と記載する）に記載されたものと同じ塩基配列のＧＩ検出用およびＧＩＩ検出用プライマーでＰＣＲ増幅される領域を含む塩基配列のＲＮＡをそれぞれ常法により調製した。
　上記方法で調製した鋳型となるＲＮＡ及び５×ＲＴ－ＰＣＲ緩衝液、終濃度２．５ｍＭ　酢酸マンガン、終濃度０．１％　ＢＳＡ、公定法で定められた配列表の配列番号１２及び１３記載の塩基配列を有する終濃度０．２μＭのＧＩプライマー対あるいは配列表の配列番号１４及び１５記載の塩基配列を有する終濃度０．２μＭのＧＩＩプライマー対、配列表の配列番号１６記載の塩基配列を有する終濃度０．２μＭのＧＩ検出用プローブあるいは配列表の配列番号１７記載の塩基配列を有する終濃度０．２μＭのＧＩＩ検出用プローブ、終濃度０．３ｍＭのｄＮＴＰ、終濃度４％のポリ（エチレングリコール）ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ）４－ノニルフェニル　３－スルホプロピルエーテル、終濃度８５０ｎＭのＰＣＮＡ１３、前述の３ＰＩＰ－Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体５Ｕを含む最終容量２５μＬの反応液を調製した。対照として、野生型及び３ＰＩＰがＮ末側に付加した野生型Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液も調製した。ＲＴ－ＰＣＲ条件は、５８℃　５分、９５℃　３０秒間処理した後、９５℃　５秒、５６℃　１分を１サイクルとする５サイクル反応、連続して９０℃　５秒、５６℃　１分を１サイクルとする４０サイクル反応に設定した。サーマルサイクラーは、実施例２と同じである。ＧＩ検出の結果を表２に示す。同様にＧＩＩ検出の結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表２及び表３に示したように、野生型並びにＰＩＰボックスがＮ末側に付加した野生型と比較してＰＩＰボックスがＮ末側に付加した本発明のｂ１３、ｂ４６ならびにｂ１３ｂ４６のいずれの場合でも初期鋳型ＤＮＡ量の増加が確認できた。
実施例４　Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体の逆転写活性評価試験２
　上記実施例２で逆転写反応の能力向上が認められたｂ１３並びにｂ１３ｂ４６変異体について、実検体でのノロウイルス検出によって評価を行った。即ち、インフォームドコンセントの得られた被験者より採取されたノロウイルス陽性の糞便検体を約１０％（ｗ／ｖ）となるようＰＢＳに懸濁した後、１５，０００ｒｐｍにて５分間遠心処理を行った。こうして得られた上清１μＬを以下の反応に使用した。即ち、前記糞便上清液１μＬ、５×ＲＴ－ＰＣＲ緩衝液（終濃度５０ｍＭ　トリシン緩衝液（ｐＨ８．１５）、終濃度５０ｍＭ　酢酸カリウム、終濃度８％グリセロール、終濃度１％のＤＭＳＯ、終濃度２．５ｍＭ　酢酸マンガン、終濃度０．１％　ＢＳＡ、公定法で定められた終濃度０．２μＭのＧＩプライマー対、終濃度０．２μＭのＧＩ検出用プローブ、終濃度０．３ｍＭのｄＮＴＰ、前述の３ＰＩＰ－Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体５Ｕ、終濃度４％のポリ（エチレングリコール）４－ノニルフェニル　３－スルホプロピルエーテル並びに２．５ＵのＴａｑ抗体（タカラバイオ社製）を含む最終容量２５μＬの反応液を含む調製した。対照として、野生型Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液も調製した。ＲＴ－ＰＣＲ条件は、Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼの場合は、９０℃　３分、５８℃　５分あるいは３０分、９５℃　３０秒間処理した後、９５℃　５秒、５６℃　３０秒を１サイクルとする５サイクル反応、連続して９０℃　５秒、５６℃　３０秒を１サイクルとする４０サイクル反応に設定した。Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体の場合は、９０℃　３分、５８℃　５分、９５℃　３０秒間処理した後、９５℃　５秒、５６℃　３０秒を１サイクルとする５サイクル反応、連続して９０℃　５秒、５６℃　３０秒を１サイクルとする４０サイクル反応に設定した。サーマルサイクラーは、実施例２と同じである。
　上記検討の結果、糞便中のノロウイルスＧＩ検出について、Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写反応が５８℃　３０分の場合のみ検出することができた。一方、本発明のｂ１３並びにｂ１３ｂ４６変異体は、逆転写反応が５８℃　５分という短時間であっても検出できた。このことから、本発明の変異体が実検体を用いた検出においても逆転写酵素反応の向上が保持されていることが確認できた。
実施例５　Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体の逆転写活性評価試験３
　本発明のＴｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体と、以前に高温かつ効率よく逆転写反応ができると報告されたＴｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体との比較を行った。日本特許第３８４４９７５号公報の記載に従い、実験方法（１）の方法でＴｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体の粗酵素液を調製した。即ち、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ（Ｇｅｎｂａｎｋ　Ａｃｃ．Ｎｏ．ＢＡＡ０６７７５．１）記載のアミノ酸配列の６８１位が、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｎｏ．ＷＰ＿０１１２２８４０５記載のアミノ酸配列に基づくＴｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列では６８３位に相当することから、前記アミノ酸配列の６８３位のグルタミン酸をフェニルアラニン、リシン、ロイシン、アルギニンあるいはチロシンに置換変異したＴｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体を調製した。これらのアミノ酸変異体をそれぞれＥ６８３Ｆ、Ｅ６８３Ｋ、Ｅ６８３Ｌ、Ｅ６８３Ｒ、Ｅ６８３Ｙ変異体と命名した。
　評価方法は、逆転写反応時間を６０℃　１分から２分に変更した以外は、上記実験方法（２）記載の方法で実施した。その結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４に示したように、６８３位のグルタミン酸を置換したＴｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体は鋳型由来の増幅物を産生できないか、あるいは本発明のＴｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体と比較してＣｔ値が大きくなっている。言い換えれば、ＰＣＲ開始時の初期鋳型ＤＮＡ量が減少していること、すなわちＰＣＲ前の逆転写反応によるｃＤＮＡ量が約１／２以下であることを意味しており、当該変異体が逆転写反応において従来技術で調製したものより逆転写反応活性において優れていることが確認できた。
実験方法
（３）Ｂｃａ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体の調製方法
　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ（Ｂｃａ）由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｎｏ．ＮＺ＿ＣＰ０２５０７４．１に開示されている。当該ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号２３に示す。当該アミノ酸配列中の特定の部位（本発明のＡ１～Ａ１２に示す１２アミノ酸からなる配列部分）に変異を導入した配列の人工遺伝子を、それぞれ化学的に合成し、実験方法（１）記載の方法でＮ末端側にヒスチジンタグが付加された　Ｂｃａ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子を含むプラスミドを調製した。
　次に、当該プラスミドで大腸菌ＢＬ２１　ＤＥ３株（タカラバイオ社製）を形質転換し、１００μｇ／ｍＬ濃度のアンピシリンを含む１．５％アガロースＬＢプレート上、３７℃で終夜培養を行った。このプレートから３つのシングルコロニーを選択して１００μｇ／ｍＬ濃度のアンピシリンを含むＬＢ培地（以下ＬＢ－ＡＰ培地と称する）に植菌し、３７℃で終夜振とう培養を行った。さらに前記培養液３０ｍｌをＬＢ－ＡＰ培地３Ｌに接種し、３７℃で終夜振とう培養した。ＯＤ６００値が０．６になった時に、培養液に終濃度１ｍＭのＩＰＴＧを加えてさらに３７℃で４時間誘導培養を行い、菌体を採取した。
　上記で得られた菌体３ｇを１２ｍｌのバッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ　ｐＨ７．０（４℃）、４μＭ　ＰＭＳＦ、１ｍＭ　ＤＴＴ、１０％グリセロール）に懸濁し、Ｓｏｎｉｃ　１８０Ｗで１０分間攪拌した。その後、１０，０００ｒｐｍで３０分間４℃で遠心分離した。該上清を回収し、６０℃で３０分間熱処理した。熱処理後の上清を氷上で３０分冷却後に１１，０００ｒｐｍ、３０分（４℃）で遠心分離を行い上清を回収した。
　得られた上清は、ＤＥＡＥ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、ＣＭ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、Ｓｅｐｈａｄｅｘ－Ｇ１００、Ｈｅｐａｒｉｎ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）、Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）の順に用いてＢｃａ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体タンパクの精製液を調製し、以下の試験に使用した。なお使用酵素のユニット数は、ＤＮＡポリメラーゼ活性については、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型／プライマーとして用い、ｐＨ９．３の反応液中にて７４℃において、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を１Ｕとして算出した。
実験方法
（４）Ａａｃ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体の調製方法
　Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ（Ａａｃ）由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｎｏ．ＡＢ２７５４８１．１に開示されている。当該ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号２４に示す。当該アミノ酸配列中の特定の部位（本発明のＡ１～Ａ１２に示す１２アミノ酸からなる配列部分）に変異を導入した配列の人工遺伝子を、それぞれ化学的に合成し、実験方法（１）記載の方法でＮ末端側にヒスチジンタグが付加された　Ａａｃ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子を含むプラスミドを調製した。
　次に、当該プラスミドで形質転換された大腸菌ＢＬ２１　ＤＥ３株の培養は、実験方法（３）記載と同様の方法で行い菌体を採取した。
　上記で得られた菌体３ｇを、実験方法（３）記載の同様の精製法でＡａｃ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体の精製液を調製し、以下の試験に使用した。なお使用酵素のユニット数は、Ｂｃａ　ＤＮＡポリメラーゼの場合と同じである。
実験方法
（５）Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体の調製方法
　Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）由来の野生型ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の塩基配列は、ＮＣＢＩ　Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｎｏ．Ｄ３２０１３．１に開示されている。当該ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を配列表の配列番号２５に示す。当該アミノ酸配列中の特定の部位（本発明のＡ１～Ａ１２に示す１２アミノ酸からなる配列部分）に変異を導入した配列の人工遺伝子を、それぞれ化学的に合成し、実験方法（１）記載の方法でＮ末端側にヒスチジンタグが付加された　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードする遺伝子を含むプラスミドを調製した。
　次に、当該プラスミドで形質転換された大腸菌ＢＬ２１　ＤＥ３株の培養は、実験方法（３）記載と同様の方法で行い、菌体を採取した。
　上記で得られた菌体１３ｇを３９ｍｌのバッファー（１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ　ｐＨ７．５（４℃）、２００ｍＭ、ＥＤＴＡ　ｐＨ７．５、２．４μＭ　ＰＭＳＦ）に懸濁し、Ｓｏｎｉｃ　１８０Ｗで１０分攪拌後、１２０００ｒｐｍ（４℃）　３０分遠心分離し、上清を回収後、硫安を１．３４ｇと１０％ＰＥＩを０．６４ｍＬ添加し、３０分（４℃）撹拌し、３０分間遠心分離（４℃）後、上清を回収した。さらに該上清を７５℃で１５分間熱処理し、氷上で３０分間冷却後、３５，０００ｒｐｍ（４℃）で６０分間遠心分離し、上清を回収した。得られた上清を、Ｐｈｅｎｙｌ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｃｌ－４Ｂ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。
　なお使用酵素のユニット数は、Ｂｃａ　ＤＮＡポリメラーゼの場合と同じである。
実験方法
（６）Ｂｃａ、Ａａｃ、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体の逆転写活性評価方法
　上記（３）、（４）、（５）で得られたＢｃａ、Ａａｃ、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体についてポリメラーゼ（Ｐｏｌ）活性を測定した。前記Ｐｏｌ活性は、反応液として終濃度２５ｍＭ　ＴＡＰＳ緩衝液（ｐＨ９．３、２５℃）、終濃度５０ｍＭ　ＫＣｌ、終濃度２ｍＭ　ＭｇＣｌ２、終濃度０．１ｍＭ　ＤＴＴ、終濃度　各２００μＭ　ｄＡＴＰ・ｄＧＴＰ・ｄＣＴＰ、終濃度１００μＭ　［３Ｈ］－ｄＴＴＰ、終濃度０．２５ｍｇ／ｍｌ活性化サケ精子ＤＮＡを調製して行った。即ち、活性化サケ精子ＤＮＡを鋳型／プライマーとして用い、上記の活性測定用反応液中にて７４℃において、３０分間に１０ｎｍｏｌの全ヌクレオチドを酸不溶性沈殿物に取り込む活性を１Ｕとして測定した。
　次に上記（３）、（４）、（５）で得られたＢｃａ、Ａａｃ、Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体について逆転写活性を測定した。逆転写活性は、反応液として５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，ｐＨ８．３（３７℃）、５ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ７．５　（３７℃）、８５ｍＭ　ＫＣｌ、８ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ＤＴＴ、０．１％　ＮＰ－４０、０．０２ｍｇ／ｍｌ　Ｐｏｌｙ（Ａ）、２．５ｍＭ　ｄＴＴＰ、１００μＣｉ／ｍｌ　［３Ｈ］－ｄＴＴＰを調製して行った。即ち、上記の活性測定用反応液中にて、Ｐｏｌｙ（ｒＡ）・ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２－１８を鋳型／プライマーとして、３７℃、１０分間に１ｎｍｏｌの［３Ｈ］ｄＴＴＰを取り込む酵素活性を１Ｕとして測定した。
実験方法
（７）Ｂｃａ、Ａａｃ並びにＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体の逆転写活性評価方法
　上記（３）、（４）、（５）で得られたＢｃａ、Ａａｃ並びにＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体について、以下の方法で逆転写反応を試験した。
　当該試験では、ＢｃａＢＥＳＴ（商標）　ＲＮＡ　ＰＣＲ　Ｋｉｔ（タカラバイオ社製）の構成品の一部を利用した。即ち、それぞれのＤＮＡポリメラーゼ変異体精製溶液について、該キット付属の２×Ｂｃａ　１ｓｔ　Ｂｕｆｆｅｒ、２５ｍＭ　ＭｇＳＯ４、ＲＮａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　（４０Ｕ／ｕｌ）、１０ｍＭ　ｄＮＴＰ、配列表の配列番号２６の塩基配列を有する終濃度０．５μＭの逆転写プライマー、終濃度５００μＭのｄＮＴＰ、鋳型となる終濃度１０ｎｇ／μＬのＨＬ６０　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ（タカラバイオ社製）に、実験方法（３）、（４）、（５）で調製したＢｃａ、Ａａｃ並びにＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体精製溶液０．５　ｕｌ反応液を加えた、逆転写反応液１０μＬをそれぞれ調製した。対照として、野生型のＢｃａ、Ａａｃ並びにＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを含む反応液もそれぞれ調製した。
　逆転写条件は、６５℃　６０秒、５５℃　５分、９５℃　２分間処理した。サーマルサイクラーは、ＴＰ－９９０　ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（登録商標）Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＳｙｓｔｅｍＩＩＩ（タカラバイオ社製）を用いた。
　さらに得られたｃＤＮＡ溶液をリアルタイムＰＣＲで試験した。ＲＲ４２０Ａ　ＴＢ　Ｇｒｅｅｎ（登録商標）　Ｐｒｅｍｉｘ　Ｅｘ　Ｔａｑ（商標）　（Ｔｌｉ　ＲＮａｓｅＨ　Ｐｌｕｓ）（タカラバイオ社製）を使用してリアルタイムＰＣＲを行った。配列表の配列番号２６の塩基配列を有する終濃度０．２μＭのフォワードプライマー、配列表の配列番号２７の塩基配列を有する終濃度０．２μＭのリバースプライマー、上記逆転写反応で得られたそれぞれのｃＤＮＡ１μＬを添加し、１反応当たり２５μＬ系のＰＣＲ反応液としてリアルタイムＰＣＲ反応に供した。
　ＰＣＲ条件は、９０℃　３０秒で初期変性後、９５℃　５秒、６０℃　３０　秒を１サイクルとする４０サイクル反応に設定した。サーマルサイクラーは、ＴＰ－９９０　ＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ　Ｄｉｃｅ（登録商標）Ｒｅａｌ　Ｔｉｍｅ　ＳｙｓｔｅｍＩＩＩ（タカラバイオ社製）を用いて、リアルタイムＰＣＲを行い、Ｃｔ値を測定した。
実施例６　Ｂｃａ、Ａａｃ並びにＴａｑ変異体の逆転写活性評価試験１
　評価試験１は、上記（３）、（４）、（５）で得られたＢｃａ、Ａａｃ並びにＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体について、上記実験方法（６）記載の方法で実施した。その結果を表５に示す。なお、各ＤＮＡポリメラーゼ変異体ｂ１３ｂ４６は、Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体ｂ１３ｂ４６における「Ｑ６８２Ｒ＋Ｅ６８９Ｒ」変異に対応する変異を有するもの（すなわち、Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列における６８２位および６８９位に対応する位置のアミノ酸がそれぞれアルギニンに置換したもの）である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５で示すように、Ｂｃａ天然型に比較して作製したＢｃａ（ｂ１３ｂ４６）変異体はポリメラーゼ活性を維持しつつ、逆転写活性を高めており、天然型と比較して約２倍逆転写活性が向上した。Ａａｃの場合は、天然型に対してＡａｃ（ｂ１３ｂ４６）変異体はポリメラーゼ活性を維持しつつ天然型と比較して約４倍逆転写活性が向上した。Ｔａｑの場合は、天然型に対してＴａｑ（ｂ１３ｂ４６）変異体はポリメラーゼ活性を維持しつつ天然型と比較して約９倍逆転写活性が向上した。
実施例７　Ｂｃａ、Ａａｃ並びにＴａｑ変異体の逆転写活性評価試験２
　上記（３）、（４）、（５）で得られたＢｃａ、Ａａｃ並びにＴａｑ　ＤＮＡポリメラーゼ変異体について、ｃＤＮＡの合成量を確認し逆転写活性を評価した。
　評価試験２は、上記実験方法（７）記載の方法で実施した。その結果を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表６で示すように、いずれの変異体においても、ＰＣＲ時の初期鋳型ＤＮＡ量が野生型酵素と比較して５１０倍～１０００倍以上になっていることが確認できた。鋳型ＤＮＡ量の増加は、ＰＣＲ前の逆転写反応によるｃＤＮＡ量の増加があったことを意味しており、当該変異体が逆転写反応において野生型の５１０倍～１０００倍以上の能力向上があったことが確認できた。また、本発明はポルＩ型、あるいはファミリーＡ型に分類されるＤＮＡポリメラーゼに対して、その逆転写酵素活性を改善できることを確認した。
　本発明により同一容器内で逆転写反応と核酸増幅反応を行うのに適した逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼを提供することができた。当該ＤＮＡポリメラーゼを用いることにより、これまで逆転写反応が困難であった強固な二次構造を有するＲＮＡを鋳型とした場合であっても逆転写効率の良い反応が可能になった。さらに当該逆転写反応の効率向上により同一容器内で逆転写反応と核酸増幅反応を連続して実施する場合、従来技術の酵素よりも短時間で同レベル以上の検出が可能になった。このように本発明の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、遺伝子工学、生物学、医学、農業等幅広い分野において有用である。
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１：　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｉ　Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２：　ＰＣＲ　ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　ｌａｍｂｄａ　ＲＮＡ
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　３：　ＰＣＲ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　ｌａｍｂｄａ　ＲＮＡ
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　４：　Ｐｒｏｂｅ　ｌａｍｂｄａ　ＲＮＡ．　５’－ｅｎｄ　ｉｓ　ｌａｂｅｌｅｄ　ＦＡＭ　ａｎｄ　３’－ｅｎｄ　ｉｓ　ｌａｂｅｌｅｄ　ＢＨＱ１
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　５：　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｖａｒｉａｎｔ　Ｔｔｈ　ｂ１３
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　６：　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｖａｒｉａｎｔ　Ｔｔｈ　ｂ１３
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　７：　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｖａｒｉａｎｔ　Ｔｔｈ　ｂ４６
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　８：　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｖａｒｉａｎｔ　Ｔｔｈ　ｂ４６
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　９：　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｖａｒｉａｎｔ　Ｔｔｈ　ｂ１３　ｂ４６
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１０：　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｖａｒｉａｎｔ　Ｔｔｈ　ｂ１３　ｂ４６
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１１：　ＰＩＰ－Ｌ１４－ＰＩＰ－Ｌ１４－ＰＩＰ－Ｌ１５　Ｔｔｈ
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１２：　ＰＣＲ　ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　ＣＯＧ１Ｆ
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１３：　ＰＣＲ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　ＣＯＧ１Ｒ
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１４：　ＰＣＲ　ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　ＣＯＧ２Ｆ
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１５：　ＰＣＲ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　ＣＯＧ２Ｒ　
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１６：　Ｐｒｏｂｅ　ＲＩＮＧ１－ＴＰ（ａ）．　５’－ｅｎｄ　ｉｓ　ｌａｂｅｌｅｄ　Ｃｙ５　ａｎｄ　３’－ｅｎｄ　ｉｓ　ｌａｂｅｌｅｄ　ＢＨＱ３
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１７：　Ｐｒｏｂｅ　ＲＩＮＧ２ＡＬ－ＴＰ．　５’－ｅｎｄ　ｉｓ　ｌａｂｅｌｅｄ　ＲＯＸ　ａｎｄ　３’－ｅｎｄ　ｉｓ　ｌａｂｅｌｅｄ　ＢＨＱ２
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１８：　Ａ　ｐａｒｔｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（Ａ１－Ａ１２）　ｏｆ　　Ｔｔｈ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　１９：　Ａ　ｐａｒｔｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（Ａ１－Ａ１２）　ｏｆ　　Ｔｔｈ　ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｖａｒｉａｎｔ
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２０：　Ａ　ｐａｒｔｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（Ａ１－Ａ１２）　ｏｆ　Ｂｃａ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２１：　Ａ　ｐａｒｔｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（Ａ１－Ａ１２）　ｏｆ　Ｂｓｔ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２２：　Ａ　ｐａｒｔｉａｌ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　（Ａ１－Ａ１２）　ｏｆ　Ａａｃ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２３：ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｉ　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｃａｌｄｏｔｅｎａｘ　
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２４：ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｉ　Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２５：ＤＮＡ　ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｉ　Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２６：ＰＣＲ　ｆｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　ｈＡＣＴＢ－Ｆ
ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：　２７：ＰＣＲ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　ｈＡＣＴＢ－５３３

Claims (10)

  1. 　Ａ１～Ａ１２の１２アミノ酸からなる配列を含む、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの変異体であって、ここで
    　Ａ１は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
    　Ａ２は、親水性の中性アミノ酸残基あるいは疎水性の脂肪族アミノ酸残基であり；
    　Ａ３は、親水性の中性アミノ酸残基であり；
    　Ａ４は、酸性アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
    　Ａ５は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
    　Ａ６は、疎水性の脂肪族アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり、
    　Ａ７は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
    　Ａ８は、プロリン残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
    　Ａ９は、疎水性の芳香族アミノ酸残基、塩基性アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
    　Ａ１０は、酸性アミノ酸残基あるいは塩基性アミノ酸残基であり；
    　Ａ１１は、酸性アミノ酸残基であり；
    　Ａ１２は、疎水性の脂肪族アミノ酸残基であり；及び
    　前記のＡ３及び／又はＡ１０のアミノ酸が変異導入前のものとは別の塩基性アミノ酸残基に置換されていることを特徴とする、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体。
  2. 　変異導入前の１２アミノ酸からなる配列の、Ａ１がロイシン、Ａ３がグルタミン、Ａ５がロイシン、Ａ７がイソロイシン、Ａ１１がグルタミン酸及びＡ１２がアラニンである、請求項１記載の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体。
  3. 　１２アミノ酸からなる配列のＡ３及び／又はＡ１０のアミノ酸がリシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されている、請求項１又は２記載の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体。
  4. 　サーマス・サーモフィルス由来ＤＮＡポリメラーゼ、サーマス・アクアティカス由来ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・カルドテナックス由来ＤＮＡポリメラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィラス由来ＤＮＡポリメラーゼあるいはアリシクロバチラス・アシッドカルダリウス由来ＤＮＡポリメラーゼの変異体である請求項１～３のいずれか１項に記載の変異体。
  5. 　請求項１～４のいずれかに記載の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体を含むキット。
  6. 　請求項１～４のいずれかに記載の逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体を含む組成物。
  7. 　ＲＮＡからの核酸増幅に適した逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの製造方法であって、
    （１）Ａ１～Ａ１２の１２アミノ酸からなる配列を含むＤＮＡポリメラーゼを選択する工程；
    　Ａ１は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
    　Ａ２は、親水性の中性アミノ酸残基あるいは疎水性の脂肪族アミノ酸残基であり；
    　Ａ３は、親水性の中性アミノ酸残基であり；
    　Ａ４は、酸性アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
    　Ａ５は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
    　Ａ６は、疎水性の脂肪族アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり、
    　Ａ７は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
    　Ａ８は、プロリン残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
    　Ａ９は、疎水性の芳香族アミノ酸残基、塩基性アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
    　Ａ１０は、酸性アミノ酸残基あるいは塩基性アミノ酸残基であり；
    　Ａ１１は、酸性アミノ酸残基であり；
    　Ａ１２は、疎水性の脂肪族アミノ酸残基であり；及び
    （２）工程（１）で選択されたＤＮＡポリメラーゼの、上記１２アミノ酸からなる配列におけるＡ３及び／又はＡ１０のアミノ酸が変異導入前のものとは別の塩基性アミノ酸残基に置換する工程、を含む方法。
  8. 　工程（１）において、１２アミノ酸からなる配列において、Ａ１がロイシン、Ａ３がグルタミン、Ａ５がロイシン、Ａ７がイソロイシン、Ａ１１がグルタミン酸及びＡ１２がアラニンであるＤＮＡポリメラーゼを選択する、請求項７記載の製造方法。
  9. 　工程（２）において、Ａ３及び／又はＡ１０がリシン、アルギニン及びヒスチジンからなる群より選択されるアミノ酸に置換されることを特徴とする、請求項７又は８記載の製造方法。
  10. 　逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼの改良方法であって、以下のＡ１～Ａ１２に示す１２アミノ酸からなる配列を含む、逆転写酵素活性を有するＤＮＡポリメラーゼにおいて、Ａ３及び／又はＡ１０のアミノ酸を別の塩基性アミノ酸残基に置換することを特徴とする方法：
    　Ａ１は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
    　Ａ２は、親水性の中性アミノ酸残基あるいは疎水性の脂肪族アミノ酸残基であり；
    　Ａ３は、親水性の中性アミノ酸残基であり；
    　Ａ４は、酸性アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
    　Ａ５は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
    　Ａ６は、疎水性の脂肪族アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり、
    　Ａ７は、分枝鎖アミノ酸残基であり；
    　Ａ８は、プロリン残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
    　Ａ９は、疎水性の芳香族アミノ酸残基、塩基性アミノ酸残基あるいは親水性の中性アミノ酸残基であり；
    　Ａ１０は、酸性アミノ酸残基あるいは塩基性アミノ酸残基であり；
    　Ａ１１は、酸性アミノ酸残基であり；及び
    　Ａ１２は、疎水性の脂肪族アミノ酸残基である。
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