JP2007520227A - 誤対合識別の増加を有する変異dnaポリメラーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
(1)改変されたモチーフC配列および対応する野生型ポリメラーゼと比較して増大したミスマッチ識別を有するAファミリーDNAポリメラーゼ、またはそのクレノー断片;
(2)配列番号2で示される大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼクレノー断片に基づいて879〜881位のモチーフC配列QVH中で、少なくともアミノ酸残基Q879が親油性アミノ酸残基で置換されていることを特徴とする、実施形態(1)の好ましいDNAポリメラーゼ;
(3)実施形態(1)または(2)に記載の前記DNAポリメラーゼまたはそのクレノー断片をコードするDNA配列;
(4)実施形態(3)に記載のDNA配列を含むベクター;
(5)実施形態(4)に記載のベクターを用いて形質転換されている、および/または実施形態(3)に記載のDNAを含む、宿主細胞;
(6)実施形態(5)に記載の宿主細胞を培養しおよびDNAポリメラーゼまたはクレノー断片を培養物または培養物上清から単離することを含む、実施形態(1)または(2)に記載のDNAポリメラーゼまたはそのクレノー断片の調製のための方法;
(7)実施形態(1)または(2)に記載のDNAポリメラーゼまたはクレノー断片の、対立遺伝子特異的PCR、PCRによるDNA増幅、クローニング、などを含む、診断法および分子生物学的方法における使用;
(8)実施形態(1)または(2)に記載のDNAポリメラーゼを用いた、個別試料中の一つ以上の標的核酸における少なくとも一つの配列変異体の存在または不存在を決定するための方法;および
(9)実施形態(1)または(2)に記載の少なくとも一つのDNAポリメラーゼを含む、実施形態(8)の方法に記載の個別試料中の一つ以上の標的核酸における少なくとも一つの配列変異体の存在または不存在を決定するためのキット。
a)添加:
・デオキシヌクレオシド三リン酸;
・本発明に記載のDNAポリメラーゼのうちの一つ;
・プライマーが検出すべき標的核酸の各配列変異体について加えられ、そのプライマーは検出すべき配列変異体と相補的な配列を有し、および標的核酸中の検出すべき配列変異体は識別プライマーの少なくとも一つの3'末端、3'−隣接末端または3'−隣接−隣接末端ヌクレオチド残基と相補的である、少なくとも一つの識別ヌクレオチド残基を含む少なくとも一つの識別プライマー;
・識別プライマーの伸長によって形成されるプライマー伸長産物と相補的である、少なくとも一つの他のプライマー;
b)検出すべき配列変異体を有する標的核酸を試料が含む場合に限って識別プライマーの伸長産物が相当に得られることを特徴とする、プライマー伸長反応を実施;
c)プライマー伸長反応の産物をテンプレート核酸から分離;
d)たとえばポリメラーゼ連鎖反応によって、段階b)およびc)を繰り返して増幅産物を得る;
e)増幅産物の存在または不存在から、配列変異体の存在または不存在を決定。
プラスミドpQKF((ブラックマン(Brakman),S.,ニックチェン(Nieckchen),P.,ChemBioChem 2001,2,773−7;配列番号26に示される同等のプラスミドpQE30も参照)は、大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼI(3'→ 5'exo()のN末端6−his標識化クレノー断片の、T5プロモーター/Double lacオペレーター配列の調節下での発現を可能にする。Q879、V880およびH881をコードするモチーフC配列への突然変異の導入は、二段階目がプライマー突然変異誘発によって実施された。PCR反応は、PfuターボDNAポリメラーゼ(ストラタジーン社(Stratagene))を用いることによって、および標準的条件下で実施した。最初のPCRは、9つの標的位置それぞれについて40%の非野生型ヌクレオチドを含むように構築された処理プライマーライブラリ(5´−GTA CGT ATG ATC ATG NNN NNN NNN GAT GAA CTG GTA TTT−3´;配列番号5)および23量体下流プライマー(5´−GCT AAT TAA GCT TGG CTG CAG GC−3´;配列番号6)を用いて実施し、195量体PCR産物を生じた。第二のPCRは、アガロースゲルで精製したその195量体、および24量体アンチセンスプライマー(5´−TAC ATG GAC CTT TAC TTC GAA CGC−3´ 配列番号 7)を用いることによって実施し、および457bp産物を生じ、それをCsp45IおよびHindIIIを用いて消化しおよびpQKF(へクローニングした。結果として生じたプラスミドライブラリで大腸菌(E.coli)XL 1blue (ストラタジーン社(Stratagene))を形質転換し、クローンを寒天平板から選択しおよび別々にスーパーブロス(Superbroth)培地(100μg/ml アンピシリン)入りの96ウェルプレート中で一夜増殖させた。クレノー断片変異体は発現され、採取され、および培養物600μl中で96ウェルプレートを用いて記載の通り溶解された。得られた溶解物300μlを保存緩衝液(50mMトリス−HCl、pH7.3、1mM DTT、0.1mM EDTA、1mM PMSF、1mMベンズアミジン、1μg/mlロイペプチンおよび1μg/mlアプロニチン)900μlで希釈し、遠心分離しおよび−80℃にて保存した。
ライブラリをスクリーニングするための反応混合物は、150nMテンプレート、225nMプライマー、50mMトリス−HCl、pH7.3、10mM MgCl2、1mM DTT、0.05%トリトン(登録商標)X−100およびdNTP各200μMを含んだ。反応は、3'末端塩基が第V因子ライデン突然変異に関与するヒトSNP G1691Aへ結合するように設計されている20量体プライマーFVL20TH(5´−ACA AAA TAC CTG TAT TCC TT−3´;配列番号8)を含んだ。対合伸長効率の測定のためには、ヒト第V因子ORFの変異体対立遺伝子1691Aをコードする90量体テンプレートTFVL90A(5´−gac atc atg aga gac atc gcc tct ggg cta ata gga cta ctt cta atc tgt aag agc aga tcc ctg gac agg caa gga ata cag gta ttt−3´;配列番号9)を用い、結果としてTA塩基対をプライマーの3'末端に生じた。ミスマッチしたプライマー末端を処理するクレノー変異体の活性へ到達するためには、対応する野生型対立遺伝子1691Gをコードする90量体テンプレートTFVL90G(5´−gac atc atg aga gac atc gcc tct ggg cta ata gga cta ctt cta atc tgt aag agc aga tcc ctg gac agg cga gga ata cag gta ttt−3´;配列番号10)を用い、結果としてTGミスマッチを3'プライマー末端に生じた。伸長選択性としての活性比の評価を可能にするために、両方の反応をライブラリの各要素について平行して実施した。反応混合物10μlを、37℃に予熱した黒色384ウェルプレートへ自動液体操作装置(ハミルトン・マイクロラブ・スター社(Hamilton Microlab Star))を用いて入れ、次いで溶解物溶液5μlを加えた。10分後、クレノー変異体によって生じたdsDNAを定量するために3.4x SYBRグリーンI(モレキュラー・プローブズ社(Molecular Probes))を含んだ停止溶液(50mM トリス−HCl、pH 7.3、100mM NaCl、10mM EDTA) 30μlを加えることによって反応を停止した。蛍光強度は蛍光プレートリーダー(ポーラスター・オプティマ(Polarstar Optima)、BMGラブテクノロジーズ社(BMG Labtechnologies GmbH))を用いて励起485nmおよび測定520nmで定量した。伸長選択性を測定するためには、測定された蛍光強度の比(Fマッチ/Fミスマッチ、任意単位)を用いた。野生型よりも高い伸長選択性比(Fマッチ/Fミスマッチ)を有するすべてのDNAポリメラーゼは、伸長選択性の増大を有する酵素として同定された。
5'−32P標識化プライマーを含む特異的反応緩衝液(50mMトリス−HCl、pH7.3、10mM MgCl2、1mM DTT、0.05%トリトン(登録商標)X−100)を二倍量のテンプレートと混合することによって、プライマー−テンプレート基質をアニーリングした。混合物を95℃にて5分間加熱し、および続いて1時間にわたって冷却し室温とした。アニーリング後、dNTPを加え、および溶液を37℃にて5分間インキュベートした。15μlの反応を、5μlの酵素溶液を含む1x反応緩衝液をアニーリング混合物10μlへ加えることによって開始し、続いて37℃にて10分間インキュベートした。検定は適当な反応緩衝液中にプライマー150nM、テンプレート225nM、dNTP各1mMおよび酵素590nMを含んだ。10分間インキュベート後、ゲル負荷緩衝液(80%ホルムアミド、EDTA、20mM)30μlを加えることによって反応を停止し、および産物混合物を14%変性PAGEによって分析した(図1および2を参照)。下記のプライマーおよびテンプレート配列を、さまざまなSNP(位置に下線)に関して使用した:
プラスミドpTTQ18::Taq(配列番号25)はエンゲルケ(Engelke)他(Anal.Biochem.1990,191,396−400(1990))によって構築され、およびPtacプロモーター/lacオペレーター配列の調節下でTaqDNAポリメラーゼの発現を可能にする。LVL突然変異はTaqQVHモチーフへ、ストラタジーン社(Stratagene)クイックチェンジ(QuikChange)(登録商標)キットを用いてPCRによって導入された。結果として生じた変異体プラスミドおよび野生型プラスミドで、大腸菌(E.coli)XL1 Blue(ストラタジーン社)を形質転換した。クローンを選択し、およびスーパーブロス(Superbroth)(100μg/mlカルベニシリン)20ml中で一夜増殖させた。Taqクローンの発現は、スーパーブロス(100μg/mlカルベニシリン)1L中の培養物で実施し、および1mM IPTGを用いた16時間の誘導後に細胞を採取した。Taq DNA ポリメラーゼの精製は、エンゲルケ他 (Anal.Biochem.1990,191,396−400)によって記載された通り実施した。イオン交換による精製の代わりに、セファデックス(Sephadex)(登録商標)75(アマシャム社(Amersham))のカラムを用いたゲルろ過を適用した。得られた酵素は純度>90%であり、これはSDS PAGEによってクマシーブルー染色を用いて確認された。濃度はナノオレンジ(nanoOrange)アッセイ(モレキュラー・プローブズ社(Molecular Probes))およびクマシーブルー染色したSDS PAGEを用いて測定した。
5'−32P標識化プライマーを含む特異的反応緩衝液(50mMトリス−HCl、25℃にてpH9.2、16mM硫酸アンモニウムおよび2.5mM MgCl2、0.1%ツイーン(登録商標)20)を二倍量のテンプレートと混合することによって、プライマー−テンプレート基質をアニーリングした。混合物を95℃にて加熱し、および続いて1時間にわたって冷却し室温とした。アニーリング後、dNTPを加え、および溶液を37℃にて5分間インキュベートした。15μlの反応を、5μlの酵素溶液を含む1x反応緩衝液をアニーリング混合物10μlへ加えることによって開始し、続いて72℃にて10分間インキュベートした。検定は適当な反応緩衝液中にプライマー150nM、テンプレート225nM、dNTP各1mMおよび、Taq LVL DNAポリメラーゼ(変異体ポリメラーゼ)0.5ngおよびTaqDNAポリメラーゼ0.06ngを含んだ。10分間インキュベート後、ゲル負荷緩衝液(80%ホルムアミド、EDTA、20mM)30μlを加えることによって反応を停止し、および産物混合物を14%変性PAGEによって分析した(図3を参照)。SNPヒトゲノム第V因子ライデンDNA配列、ヒト体細胞BRAF−T1796A突然変異およびヒトジヒドロピリミジンデヒドロゲナーゼ(DPyD)突然変異G735Aに関して用いられたプライマーおよびテンプレート配列については、実施例3を参照。
リアルタイムPCRはアイサイクラー(iCycler)(バイオラッド社(BIORAD))システムを用いて実施した。反応は、各テンプレート4pMを含むTaqDNAポリメラーゼ緩衝液(50mMトリス−HCl、25℃にてpH9.2、16mM硫酸アンモニウムおよび2.5mM MgCl2、0.1%ツイーン(登録商標)20を含む総容量20μl中で実施した。最終混合物は、dNTP(dATP、dGTP、dCTPおよびTTP各200μM)、プライマー(各プライマープローブおよび逆方向プライマーそれぞれ0.5μM)および13ngのTaqDNAポリメラーゼ(配列番号4)、95ngのTaqLVL変異体由来DNAポリメラーゼ(配列番号4、782〜784位にLVLを有する)および10,000倍SybrグリーンI DMSO溶液(モレキュラー・プローブズ社(Molecular Probes))の1/50,000水希釈液を含んだ。 すべてのPCR 増幅は下記のプログラムを用いて実施した:95℃にて3分間最初の変性、次いで40サイクルの95℃にて30秒間変性、55℃にて35秒間プライマーアニーリングおよび72℃にて40秒間伸長。示した結果は、少なくとも3回反復しおよび一つの親混合物に由来する独立した3連の測定から得られた。結果を図4に要約する。下記のDNA配列を用いた:
大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼI(クレノー断片、5'→ 3'−エキソヌクレアーゼ欠損)の879〜881位(配列番号2)の、本発明に記載の変異体および文献から知られる変異体を、プライマー伸長の選択性について比較した。使用した変異体は、LVL変異体(879〜881位にLVLを有する配列番号2)および、ミニック(Minnick),T.他,J.Biol.Chem.274,3067−3075 (1999)(879〜881位にHVAを有する配列番号2)からのH881Aを有するクレノー断片に対応するQVA変異体であった。
記載の2種類の変異体を用いて、実施例3に記載のプライマー伸長検定を実施した。ヒトゲノム第V因子ライデンDNA配列を用いたミスマッチ識別を試験した:プライマー:5´−ACA AAA TAC CTG TAT TCC TT−3´(配列番号11)、野生型テンプレート:5´−GAT CCC TGG ACA GGC GAG GAA TAC AGG TAT TTT GT−3´(配列番号12)、変異体テンプレート:5´−GAT CCC TGG ACA GGC AAG GAA TAC AGG TAT TTT GT−3´(配列番号12)。2つの変異体が標準的複合体と比較してミスマッチを伸長する傾向を比較した。図5に示す通り、QVA変異体は、LVL変異体と比較してミスマッチを伸長する相当高い傾向を有した。
Claims (15)
- 配列番号2で示される大腸菌(E.coli)DNAポリメラーゼクレノー断片に基づいて879〜881位のモチーフC配列QVH中で、少なくともアミノ酸残基Q879が親油性アミノ酸残基で置換されていることを特徴とする、改変されたモチーフC配列および対応する野生型ポリメラーゼと比較して増大したミスマッチ識別を有するAファミリーDNAポリメラーゼ、またはそのクレノー断片。
- 細菌DNAポリメラーゼ、好ましくは耐熱性DNAポリメラーゼである、より好ましくはサーマス・サーモフィラス(Thermus thermophilus)、サーマス・フィリホルミス(Thermus filiformis)、ロドサーマス・オバメンシス(Rhodothermus obamensis)、またはバチルス・ステアロサーモフィラス(Bacillus stearothermophilus)由来のポリメラーゼから成る群から選択される、請求項1に記載のDNAポリメラーゼ、またはそのクレノー断片。
- 879〜881位のモチーフC配列QVH中で:
(i)H881がさらに親油性アミノ酸残基で置換されている;および/または
(ii)880位のアミノ酸残基がVal、Leu、Ile、AlaまたはTyr、特にValまたはIleである
ことを特徴とする、請求項1または2に記載のDNAポリメラーゼ、またはそのクレノー断片。 - 親油性アミノ酸残基がGly、Ala、Val、Leu、Ile、Pro、Phe、MetおよびTrpから、好ましくはGly、Ala、Val、LeuおよびIleから選択され、およびより好ましくはモチーフC配列QVHが配列LVLまたはLVGで置換されていることを特徴とする、請求項1から3のうち一つ以上に記載のDNAポリメラーゼ、またはそのクレノー断片。
- (i)782〜784位の配列QVHがLVLまたはLVGで置換されている、配列番号4に示す配列を有するTaqポリメラーゼである;または
(ii)879〜881位の配列QVHがLVLまたはLVGで置換されている、配列番号2に示す配列を有するクレノー断片である、
請求項1から4のうち一つ以上に記載のDNAポリメラーゼ、またはそのクレノー断片。 - 請求項1から5のうち一つ以上に記載のDNAポリメラーゼまたはそのクレノー断片をコードするDNA配列。
- 請求項6に記載のDNA配列を含むベクター。
- 請求項7に記載のベクターで形質転換されている、および/または請求項6に記載のDNAを含む、宿主細胞。
- 請求項8に記載の宿主細胞を培養すること、およびDNAポリメラーゼまたはクレノー断片を培養物または培養物上清から単離することを含む、請求項1から5のうち一つ以上に記載のDNAポリメラーゼまたはそのクレノー断片の調製のための方法。
- 請求項1から5のうち一つ以上に記載のDNAポリメラーゼまたはそのクレノー断片の、対立遺伝子特異的PCR、PCRによるDNA増幅、クローニング、などを含む診断法および分子生物学的方法における使用。
- 請求項1から5のうち一つ以上に記載のDNAポリメラーゼを用いることを含む、個別試料中の一つ以上の標的核酸における少なくとも一つの配列変異体の存在または不存在を決定する方法。
- 下記の段階を含む、請求項11に記載の方法:
a)添加:
・デオキシヌクレオシド三リン酸;
・請求項1から5のうち一つ以上に記載のDNAポリメラーゼ;
・プライマーが検出すべき標的核酸の各配列変異体について加えられることを特徴とし、そのプライマーは検出すべき配列変異体と相補的な配列を有し、および標的核酸中の検出すべき配列変異体は識別プライマーの少なくとも一つの3'末端、3'−隣接末端または3'−隣接−隣接末端ヌクレオチド残基と相補的であることを特徴とする、少なくとも一つの識別ヌクレオチド残基を含む少なくとも一つの識別プライマー;
・識別プライマーの伸長によって形成されるプライマー伸長産物と相補的である、少なくとも一つの他のプライマー;
b)検出すべき配列変異体を有する標的核酸を試料が含む場合に限って識別プライマーの伸長産物が相当に得られることを特徴とする、プライマー伸長反応を実施;
c)プライマー伸長反応の産物をテンプレート核酸から分離;
d)たとえばポリメラーゼ連鎖反応によって、段階b)およびc)を繰り返して増幅産物を得る;並びに
e)増幅産物の存在または不存在から、配列変異体の存在または不存在を決定。 - 段階b)からe)がリアルタイムPCRまたはリアルタイムRT−PCRとして実施されることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 請求項1から5に記載の少なくとも一つのDNAポリメラーゼを含む、請求項11から13に記載の個別試料中の一つ以上の標的核酸において少なくとも一つの配列変異体の存在または不存在を決定するためのキット。
- 下記の成分のうち一つ以上をさらに含む、請求項14に記載のキット:
・標的核酸中の検出すべき配列変異体が識別プライマーの少なくとも一つの3'末端、3'−隣接末端または3'−隣接−隣接末端ヌクレオチド残基と相補的であることを特徴とする、少なくとも一つの識別ヌクレオチド残基を含む一つ以上の識別プライマー;
・前記識別プライマーの伸長によって形成されるプライマー伸長産物と相補的である一つ以上の他のプライマー;
・デオキシヌクレオシド三リン酸;
・緩衝液;
・定量化試薬、特に介在型試薬または副溝に結合する試薬;および
・ポリメラーゼ−遮断抗体、特にTaqブロック(TaqBlock)。
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