DE102006025153A1

DE102006025153A1 - Mutierte DNA-Polymerasen mit höherer Selektivität

Info

Publication number: DE102006025153A1
Application number: DE200610025153
Authority: DE
Inventors: Andreas Prof. Dr. Marx; Nicolas Rudinger
Original assignee: Universitaet Konstanz
Current assignee: Universitaet Konstanz
Priority date: 2006-05-30
Filing date: 2006-05-30
Publication date: 2007-12-06
Also published as: WO2007137700A2; WO2007137700A3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA-Polymerase mit erhöhter Fehlpaarungsdiskriminierung, welche im Vergleich zur Wildtyp-Variante mindestens eine Mutation in ihrer Aminosäure-Sequenz aufweist, sowie eine Wirtszelle und ein Verfahren zur Herstellung der DNA-Polymerase. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der DNA-Polymerase in diagnostischen und molekularbiologischen Verfahren und ein Kit, welches die DNA-Polymerase enthält.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine DNA-Polymerase mit erhöhter Fehlpaarungsdiskriminierung, welche im Vergleich zur Wildtyp-Variante mindestens eine Mutation in ihrer Aminosäure-Sequenz aufweist, sowie eine Wirtszelle und ein Verfahren zur Herstellung der DNA-Polymerase. Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der DNA-Polymerase in diagnostischen und molekularbiologischen Verfahren und ein Kit, welches die DNA-Polymerase enthält.
Seit der Vorstellung der ersten menschlichen Genomsequenzen konzentriert sich die Forschung auf die Entdeckung genetischer Unterschiede zwischen den Individuen wie z.B. Einzelbasenmutationen (SNPs). Dies ist von Interesse, da zunehmend ersichtlich wird, dass Einzelbasenvariationen im Genom mit unterschiedlicher Arzneimittelverträglichkeit oder einer Prädisposition für verschiedenste Krankheiten verknüpft sind. In Zukunft könnte die Kenntnis medizinisch relevanter Nukleotidvariationen es ermöglichen, Therapien auf die individuelle genetische Ausstattung anzupassen und die Behandlung mit Medikamenten, die ineffektiv sind oder sogar zu Nebenwirkungen führen, zu verhindern. Es ist offensichtlich, dass Entwicklungen, die eine zeit- und kosteneffiziente Identifizierung von Nukleotidvariationen ermöglichen, zu weiteren Fortschritten in der Pharmakogenetik führen. Viele Methoden zur Erkennung von Nukleotidvariationen sind bereits beschrieben. Jede dieser Methoden weist jedoch entscheidende Nachteile auf, so dass sich bisher keine dieser Methoden durchsetzen konnte.
Zum Nachweis von Nukleinsäure-Varianten wie Mutationen oder Single-Nukleotid-Polymorphismen (SNP) können verschiedene Verfahren eingesetzt werden. Beispielsweise kann die Variante einer Target-Nukleinsäure durch Hybridisierung der zu analysierenden Nukleinsäure-Probe mit einer Sequenzvarianten-spezifischen Hybri disierungssonde unter geeigneten Hybridisierungsbedingungen erfolgen. Es hat sich jedoch herausgestellt, dass derartige Hybridisierungsmethoden, insbesondere den klinischen Anforderungen hinsichtlich der erforderlichen Selektivität derartiger Assays, nicht genügen. Deshalb hat zum Nachweis von Mutationen, Single-Nukleotid-Polymorphismen sowie anderen allelischen Sequenzvarianten insbesondere auch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) einen breiten Eingang in molekularbiologische und diagnostische Untersuchungsverfahren gefunden, wobei eine im Hinblick auf die Existenz einer Variante zu untersuchende Target-Nukleinsäure durch PCR vor der Hybridisierung amplifiziert wird. Den meisten im Stand der Technik bekannten Methoden geht eine solche Polymerase-Kettenreaktion voraus. Dazu wird, nach Isolation des genetischen Materials, die interessierende Sequenz vor der eigentlichen Analyse durch PCR amplifiziert und angereichert. Als Hybridisierungssonden für derartige Assays werden in der Regel einzelsträngige Oligonukleotide verwendet. Methoden zur direkten Bestimmung von Nukleotidunterschieden durch die PCR sind hingegen selten. Ein Grund hierfür ist die Tatsache, dass natürliche Enzyme unter typischen Bedingungen der PCR nicht ausreichend diskriminieren, um eine Aussage über die An- bzw. Abwesenheit einer Mutation, insbesondere einer Punktmutation, direkt durch PCR machen zu können.
Eine bereits im Stand der Technik bekannte Alternative zur Sequenzvariantenspezifischen Hybridisierung bietet die sogenannte allelspezifische Amplifikation (ASA). Bei diesem Nachweisverfahren werden bereits während der Amplifikation durch die PCR Varianten-spezifische Amplifikationsprimer eingesetzt, die in der Regel am 3'-terminalen Ende des Primers einen sogenannten diskriminierenden Nukleotidrest besitzen, welcher lediglich komplementär zu nur einer speziellen Variante der nachzuweisenden Target-Nukleinsäure ist.
US-Patent 5,595,890 beschreibt beispielsweise derartige Verfahren zur allelspezifischen Amplifikation sowie deren Anwendung zum Nachweis von klinisch relevanten Punktmutationen, beispielsweise im k-ras-Onkogen. US-Patent 5,521,301 beschreibt ebenfalls Verfahren zur allelspezifischen Amplifikation zur Genotypisierung des AB0-Blutgruppensystems. US-Patent 5,639,611 offenbart dagegen die Verwendung al lelspezifischer Amplifikation im Zusammenhang mit dem Nachweis der für Sichelzell-Anämie verantwortlichen Punktmutation.
Derartige Verfahren zum Nachweis von Sequenzvarianten, Polymorphismen und vor allem Punktmutationen erfordern insbesondere dann eine allelspezifische Amplifikation, wenn sich die nachzuweisende Sequenzvariante im Unterschuss verglichen mit einer im Überschuss vorhandenen Variante desselben Nukleinsäureabschnitts (bzw. desselben Gens) befindet. Eine derartige Situation ist beispielsweise dann gegeben, wenn mit Hilfe von allelspezifischer Amplifikation disseminierte Tumorzellen in Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum oder Plasma nachgewiesen werden sollen (vgl. US-Patent 5,496,699). Zu diesem Zweck wird zunächst DNA aus Körperflüssigkeiten wie Blut, Serum oder Plasma isoliert, welche sich aus einem Unterschuss von DNA aus disseminierten Tumorzellen sowie einem Überschuss an DNA aus nicht proliferierenden Zellen zusammensetzt. Die für die tumorale DNA signifikanten Mutationen im k-ras Gen müssen somit aufgrund von wenigen Kopien tumoraler DNA in Gegenwart eines Überschusses an Wildtyp-DNA nachgewiesen werden.
In diesen Methoden der allelspezifischen Amplifikation (ASA) werden Nukleotidvariationen durch die An- und Abwesenheit von DNA-Produkt nach der PCR Amplifikation bestimmt. Das Prinzip dieser ASA basiert auf der Ausbildung von kanonischen oder nicht-kanonischen Primer-Templat-Komplexen am Ende von allelspezifischen Primersonden. An einem korrekt gepaarten 3'-Primerende kann die Amplifikation durch eine DNA-Polymerase stattfinden, bei fehlgepaartem Primerende hingegen sollte die Verlängerung gehemmt sein. Jedoch weist diese Methode aufgrund der geringen Fehlpaarungsdiskriminierung von im Stand der Technik bekannten Enzymen unter typischen Bedingungen der PCR nur eine geringe Selektivität auf, die weitere aufwendige und damit zeit- und kostenintensive Optimierungsschritte bedingt. Neuerungen, die eine Erhöhung der Selektivität der allelspezifischen PCR-Amplifikation bewirken, sollten einen signifikanten Einfluss auf Verlässlichkeit und Robustheit der direkten SNP-Analyse durch die PCR haben.
Der vorliegenden Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine DNA-Polymerase mit erhöhter Fehlpaarungsdiskriminierung und damit einer erhöhten Selektivität bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gelöst.
Insbesondere wird erfindungsgemäß eine DNA-Polymerase bereitgestellt, welche sich durch mindestens eine Mutation in der Aminosäure-Sequenz von ihrer Wildtyp-Variante unterscheidet und im Vergleich zur Wildtyp-Variante eine erhöhte Fehlpaarungsdiskriminierung aufweist.
Der Begriff "DNA-Polymerase" umfasst erfindungsgemäß alle DNA-Polymerasen, welche in einer Amplifikationsreaktion, wie beispielsweise allgemein in der PCR oder der allelspezifischen Amplifikation, eingesetzt werden können. Zur Verwendung einer DNA-Polymerase beispielsweise in der PCR, weist die DNA-Polymerase vorzugsweise eine Thermostabilität innerhalb des in der PCR verwendeten Temperaturbereichs auf.
Die Begriffe "Amplifikation" bzw. "Amplifikationsreaktion" bezeichnen in diesem Zusammenhang insbesondere die Replikation bzw. Vervielfältigung einer Nukleinsäure wie beispielsweise DNA oder RNA. Desweiteren schließt die vorliegende Erfindung alle funktionell aktiven Derivate der vorstehend definierten DNA-Polymerase ein, d.h. auch solche Derivate, die geringfügige Änderungen in der Aminosäuresequenz aufweisen, welche keine wesentliche Auswirkung auf die Funktion der DNA-Polymerase haben.
Die vorliegende Erfindung umfasst in diesem Zusammenhang auch solche DNA-Polymerasen, deren Aminosäurekette entweder durch natürliche Prozesse, wie posttranslationale Prozessierung, oder durch chemische Verfahren, welche im Stand der Technik bekannt sind, modifiziert sein können. Solche Modifikationen können an verschiedenen Stellen und mehrfach in der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase vorkommen, wie beispielsweise an dem Peptid-Rückgrat, an den Aminosäure- Seitenketten oder am Amino- und/oder am Carboxy-Terminus. Sie umfassen beispielsweise Acetylierungen, Acylierungen, ADP-Ribosylierungen, Amidierungen, kovalente Verknüpfungen mit Flavinen, Häm-Anteilen, Nukleotiden oder Nukleotid-Derivaten, Lipiden oder Lipid-Derivaten, Cyclisierungen, Disulfidbrückenbindungen, Methylierungen und Demethylierungen, Cystin-Bildungen, Formylierungen, gamma-Carboxylierungen, Glycolysierungen, Hydroxylierungen, Phosphorylierungen und tRNA-vermittelte Addition von Aminosäuren. Die erfindungsgemäße DNA-Polymerase kann als individuelles Protein oder als Teil eines größeren Proteins, z.B. eines Fusionsproteins vorliegen. Desweiteren kann sie Sezernierungs- oder "Leader"-Sequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die eine einfache Reinigung und/oder Isolierung ermöglichen, wie mehrfache Histidin-Reste, oder eine einfache Detektion ermöglichen, wie beispielsweise Fluoreszenz- oder radioaktive Marker enthalten.
Der Begriff "Fehlpaarungsdiskriminierung", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Selektivität bzw. eine Erkennung gegenüber einer Basenfehlpaarung in einer Nukleinsäure sowie gegenüber dem Einbau von fehlgepaarten bzw. nicht kanonischen Nukleotiden.
Der Begriff "Mutation" umfasst erfindungsgemäß jede Veränderung einer Aminosäuresequenz der Wildtyp-Variante der vorstehend definierten DNA-Polymerase wie beispielsweise Deletionen, Additionen und/oder Substitutionen von Aminosäuren.
Weiterhin unterliegen diese, durch Addition hinzugefügten oder durch Substitution ersetzenden Aminosäuren keiner besonderen Einschränkung und umfassen neben allen natürliche Aminosäuren auch nicht-natürliche Aminosäuren wie beispielsweise D-Aminosäuren oder Aminosäuren mit modifizierten Seitenketten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Mutation der vorstehend definierten DNA-Polymerase die Substitution mindestens einer Aminosäure durch eine hydrophobere Aminosäure.
Der Begriff "hydrophobere Aminosäure" beschreibt hierin eine Aminosäure mit einer größeren Hydrophobizität als die der zu ersetzenden Aminosäure und gibt somit keine absolute, sondern eine relative Größe an. Die Hydrophobizität einer Aminosäure ist eine dem Fachmann allgemein bekannte Größe, die jedoch mit Faktoren wie beispielsweise dem pH-Wert variieren kann.
Ohne hierauf einzuschränken, gibt die folgende Tabelle 1 eine grobe Einteilung der natürlichen Aminosäuren nach ihrer Hydrophobizität an. Tabelle 1
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindungumfasst die Mutation den Austausch eines Lysin-Rests (Lys) gegen einen Methionin-Rest (Met) und/oder eines Asparagin-Rests (Asp) gegen einen Leucin-Rest (Leu).
Die erfindungsgemäße DNA-Polymerase bzw. ihre Wildtyp-Variante unterliegt hinsichtlich ihrer Herkunft keiner besonderen Einschränkung, sondern kann aus jedem beliebigen Organismus stammen, wie beispielsweise aus Säugern, Tieren, Pflanzen oder Mikroorganismen. Vorzugsweise leitet sich die DNA-Polymerase von bakteriellen DNA-Polymerasen wie Polymerasen von E. coli, Thermus aquaticus, Aquifex, Borielia, Bacillus, Chlamydia, Chlamydophila, Chloroflexus, Haemophilis, Heliobacter, Lacococcus, Methylobakterium, Myocobakterium, Rohodothermus, Rickettsia, Streptococcus, Streptomyces, Syncechocysts, Treponema, insbesondere Polymerasen thermostabiler Organismen wie Thermus aquaficus, Thermus thermophilus, Thermus fliformis, Rhodothermus obamensis, Bacillus stearothermophilus, Thermococcus gorgonarius, Pyrococcus wosei, Thermococcus litoralis, Pyrococcus species, Thermococcus kodakaraensis ab.
Die Wildtyp-Variante der vorstehend definierten DNA-Polymerase kann ebenso einer dem Fachmann bekannten DNA-Polymerase aus der Sequenzfamilie B entsprechen und beispielsweise aus Mikroorganismen wie Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus spec., Thermococcus litoralis (Vent), phi29, Thermococcus gorgonarius, Pyrococcus wosei, Thermococcus litoralis, Pyrococcus species, Thermococcus kodakaraensis stammen.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stammt die Wildtyp-Variante der vorstehend definierten DNA-Polymerase aus Pyrococcus furiosus (Pfu) und weist eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Aminosäure-Sequenz der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase im Vergleich zur ihrer vorstehend definierten, aus Pyrococcus furiosus stammenden Wildtyp-Variante, die Mutation D541L oder K593M oder die Kombination davon auf.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die vorstehend definierte DNA-Polymerase eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2 auf.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die vorstehend definierte, aus Pyrococcus furiosus stammende Wildtyp-Variante der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase eine Nukleinsäure auf, die eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 3 umfasst.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft eine Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche für die erfindungsgemäß definierte DNA-Polymerase kodiert.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform weist die vorstehend definierte Nukleinsäure eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 4 auf.
Desweiteren wird erfindungsgemäß ein Vektor, enthaltend die vorstehend definierte Nukleinsäure, bereitgestellt. Der erfindungsgemäße Vektor unterliegt keiner besonderen Einschränkung, wobei geeignete Vektoren im Stand der Technik bekannt sind. Der Vektor ist vorzugsweise zur Expression und/oder Amplifikation in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle befähigt. Dazu enthält der Vektor vorzugsweise geeignete regulatorische Elemente, wie Promotoren, Enhancer, Terminations-Sequenzen usw. Der Vektor kann auch zur stabilen Integration der erfindungsgemäßen Nukleinsäure in das genetische Material einer Wirtszelle verwendet werden. Beispiele geeigneter Vektoren sind pET15b, pET21b, pTTQ18, pASK-IBA37plus und pET30 Xa Lic.
Der hierin verwendete Ausdruck "Wirtszelle" unterliegt keiner besonderen Einschränkung und umfasst sowohl eukaryotische als auch prokaryotische Zellen, welche zur Produktion heterologer Proteine geeignet und im Stand der Technik bekannt sind. Dies sind beispielsweise Säugerzellen, tierische Zellen Pflanzenzellen oder Zellen von Mikroorganismen. Die erfindungsgemäße Wirtszelle ist vorzugsweise eine Zelle welche von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, wie beispielsweise sowohl prokaryontische Zellen, wie E. coli (insbesondere E.coli XI1-blue, DH5α, B121 (DE3), M15 [pREP4], SG13005 [pREP4], BL21 (DE3)pLysS), Halomonas elongata, Caulobacfer sp. Halobacferiumhalobium, als auch eukaryontische Zellen, wie Hefe- und andere Pilzzellen, pflanzliche und tierische Zellen, einschliesslich isolierter menschlicher Zellen, die sich in Zellkultur befinden. Des Weiteren werden unter dem Begriff "Wirtszelle" auch Zellextrakte verstanden, die bei Vorlage einer mRNA diese translatieren können, wie Weizenkeimextrakt als auch Kaninchen-Reticulocytenextrakt. Weiterhin werden hier auch in vitro Expressionssysteme als "Wirtszelle" verstanden, wie z. B. das T7 Expression System pBAD Expression System, ThioFusion" Expression Systems, trc Expression System, PL Expression System, PurePro Caulobacter Expression System, Microbiological Media and Media Components, Qiagen pQE Expression System und das Novagen pET Expression System.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase, umfassend die Schritte

(a) des Bereitstellens einer wie vorstehend definierten Wirtszelle,
(b) des Züchtens der Wirtszelle in einem geeigneten Medium und
(c) des Isolierens der DNA-Polymerase.

Die erfindungsgemäße DNA-Polymerase wird vorzugsweise durch Expression mit Hilfe geeigneter Expressionsysteme, vorzugsweise als sezerniertes Produkt selektionierbarer stabiler Transfektanden der Zelllinie E. coli BL21 (DE3) pLysS, hergestellt.
Die vorliegende Erfindung schließt alle im Stand der Technik bekannten Techniken zum Züchten von Zellen ein. Ebenso unterliegt der hierin verwendete Begriff "Isolieren" keiner besonderen Einschränkung und beinhaltet alle dem Fachmann bekannten Techniken zum Isolieren rekombinant hergestellter Peptide, Proteine und Nukleinsäuren, wie beispielsweise Elektrophorese, Gelfiltration, Microfiltration, Microdiafiltration, Dialyse, chromatographische Verfahren, Zentrifugation usw.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung der vorstehend definierten DNA-Polymerase in einem diagnostischen oder molekularbiologischen Verfahren. Gemäß einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform umfasst dieses Verfahren allelspezifische PCR, DNA-Amplifikation oder Klonierung.
Desweiteren kann die erfindungsgemäße DNA-Polymerase als hochselektives Enzym zur (Standard-)PCR-Amplifikation von z.B. Genen oder Genfragmenten und gegebenenfalls zu deren anschließenden Klonierung verwendet werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifikation von einer oder mehreren Nukleinsäure-Fehlpaarungen, welches die vorstehend definierte Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase umfasst.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit zur Verwendung in einem der vorstehend definierten Verfahren, enthaltend die erfindungsgemäße DNA-Polymerase oder die erfindungsgemäße Nukleinsäure.
Das vorstehend definierte Kit unterliegt jedoch bezüglich der möglichen Verwendung keiner besonderen Einschränkung und kann in allen Verfahren verwendet werden, in denen die erfindungsgemäße DNA-Polymerase einen Effekt aufweist. Desweiteren kann das vorstehend definierte Kit neben der erfindungsgemäßen DNA-Polymerase auch andere Substanzen, wie beispielsweise Puffer, Indikatoren, Salze, weitere Enzyme, proteinartige Verbindungen oder Hilfsstoffe enthalten.
Aufgrund der im Vergleich zur Wildtyp-Variante mindestens einen enthaltenen Mutation in der Aminosäure-Sequenz der vorstehend definierten DNA-Polymerase weist diese eine überraschend erhöhte Fehlpaarungsdiskriminierung auf. Diese Erhöhung der Selektivität der Aktivität der DNA-Polymerase ermöglicht auf vorteilhafte Weise die Entwicklung verlässlicher Systeme zum Nachweis von Mutationen oder Polymorphismen in einer Zielnukleinsäure. Desweiteren ermöglicht die vorstehend definierte DNA-Polymerase eine besonders vorteilhafte Diagnose beispielsweise direkt durch allelspezifische PCR ohne die Notwendigkeit von nachgeschalteten zeit- und kostenintensiven Aufreinigungs- oder Analyseverfahren.
Die Figuren zeigen:
1: Proteinsequenz von Pyrococcus furiosus (Pfu) wildtype exo-
2: Proteinsequenz der Mutante Pfu D541L/K593M exo-
3: Nukleotidsequenz von Pfu wildtype exo-
4: Nukleotidsequenz der Mutante D541L/K593M exo-
5: SDS-PAGE der gereinigten Pfu DNA Polymerasen-Coomassie Blau gefärbt. Es wurde 40 fmol Polymerase aufgetragen. Von links nach rechts: Marker (M), Pfu wt exo-(wt exo-), Pfu Mutante D541L/K593M exo- (D541L/K593M exo-). Die Proteine sind zu >95% rein.
6: Agarose (0,8%) gelelektrophoretische Überprüfung der PCR Experimente – von links nach rechts: Marker (M); Pfu wt exo-(wt), Mutante D541L/K593M exo-(D541L/K593M). PCR-Protokoll: Initial-denaturierung 95 °C, 2 min., dann 25 Zyklen von 95 °C, 1 min., 55 °C, 1 min., 72 °C, 3 min. Templat pETPfu wt exo-, 10 ng.
7: Echtzeit PCR Experimente mit gleicher Polymerasekonzentration und Polymeraseaktivität – von links nach rechts: Pfu wt exo- 20 nM (A), Mutante D541L/K593M exo- 20 nM, gestrichelte Linien (B), Mutante D541L/K593M exo- 40 nM, gestrichelte Linien (C). Schwarze Linien-Korrekt gepaarter Primer/Templat Komplex. Graue Linien: Fehlgepaarter Primer/Templat Komplex. PCR-Protokoll: Initialdenaturierung 95 °C, 3 min., dann Zyklen von 95 °C, 30 s, 56 °C, 35 s, 72 °C, 40 s. Template FarA und FarG jeweils 40 pM, 0,5 μM von jedem Primer, 200 μM dNTPs und 0,4 × SybrGreen. Die realtime PCR Experimente wurden in einem Biorad iCycler durchgeführt.
8: Primer Verlängerungsreaktion-Marker (–); Pfu wt exo- (wt exo-), Mutante D541L/K593M exo- (D541L/K593M exo-). Jeweils 150 nM Enzym, 200 μM dNTPs, 150 nM Primer/Templat, Reaktionszeit 30 min.
9: Primer Verlängerungsreaktion zur Detektion entfernter Fehlpaarungen-Marker (–); Pfu wt exo- (wt exo-), Mutante D541L/K593M exo- (D541L/K593M exo-). Jeweils 150 nM Enzym, 200 μM dNTPs, 150 nM Primer/Templat, Reaktionszeit 30 min.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden, nicht einschränkenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1: Expression und Proteinreinigung
Die Expression der Pfu DNA Polymerasen (in pETPfu exo-) wird in E. coli BL21 (DE3) pLysS durchgeführt. Expressionskulturen (LB-Medium mit 34 ng/μl Kanamycin, 34 ng/μl Chloramphenicol) werden 2%ig mit einer Übernachtkultur, die bei 30 °C inkubiert wird, angeimpft. Die Induktion erfolgt bei einer OD₆₀₀ = 0,5 mit 1 mM IPTG. Nach 4 h Expression werden die Kulturen bei 5300 × g für 30 min. abzentrifugiert.
Die Zellpellets werden in Lysepuffer (10 mM Tris-HCl pH 9,55, 300 mM NaCl, 0,1% Triton-X100, 1 mM Benzamidin, 1 mM PMSF v Pefabloc, 1 mg/ml Lysozym; 5 ml Lysis-Puffer/50 ml Kultur) resuspendiert und bei 37 °C für 10 min. lysiert. E. coli Proteine werden durch Hitzedenatuerierung bei 75 °C für 45 min. mit nachfolgender Zentrifugation bei 25000 × g für 30 min. bei 4 °C entfernt.
Der verbleibende Überstand wird dann durch NTA-Affinitätschromatographie (Batch-Methode) weiter gereinigt.
Die zentrifugierten Expressionslysate (in 10 mM Tris-HCl pH 9,55, 300 mM NaCl, 0,1 % Triton-X100) werden mit NTA-Matrix (Qiagen, 2-3 ml slurry/20 ml Lysat) für 20 min. bei 4 °C in einem Überkopfschüttler inkubiert. Die NTA-Matrix wird dann zweifach mit NTA-Waschpuffer (10 mM Tris-HCl pH 8,1, 100 mM NaCl, 0,1% Triton-X100, 20 mM Imidazol) gewaschen und das Protein zweimal mit NTA-Elutionspuffer (10 mM Tris-HCl pH 8,1, 100 mM NaCl, 0,1% Triton-X100, 150 mM Imidazol) eluiert.
Die erhaltenen Proteinlösungen werden über eine Sephacryl S-300 High Resolution (Amersham) Säule, voräquilibriert mit 150 mM Tris-HCl pH 8,2, 0,3 mM EDTA, gereinigt um den Puffer zu tauschen, Imidazol zu entfernen und restliche Proteinverunreinigungen zu entfernen.
Die Fraktionen, die Pfu DNA-Polymerase enthalten werden gesammelt und über eine VIVASPIN 20 50000 MWCO PES 20 × konzentriert.
Nach der Konzentration der Polymerasen, wird jeweils 1 Vol. Proteinlösung (in 150 mM Tris-HCl pH 8,2, 0,3 mM EDTA) mit 2 Vol. 75% Glycerol, 1,5 mM DTT, 0,075% CHAPS auf 50 mM Tris-HCl pH 8,2, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,05% CHAPS, 50% Glycerol verdünnt.
Die gereinigten DNA-Polymerasen (Wildtyp-Variante (wt) und Mutante D541L/K593M) wurden in Pfu-Lagerpuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,2, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,05% CHAPS, 50% Glycerol) gelagert und waren >95% rein, was durch SDS-PAGE (5) überprüft wurde. Proteinkonzentrationen wurden durch einen Bradford-Test (Roth) mit einer BSA-Standardkurve (PIERCE Albumin Standard) bestimmt.
Beispiel 2: PCR
Zunächst wurde die PCR-Aktivität der jeweiligen DNA-Polymerasen (Wildtyp-Variante (wt) und Mutante D541L/K593M) untersucht:
Das Reaktionsvolumen beträgt 50 μl mit 10 ng Templat (pETPfu wt exo-) in Pfu DNA Polymerasepuffer (20 mM Tris-HCl (pH 8,8 bei 25 °C), 2 mM MgSO₄, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 10 mM KCl, 0.1% (v/v) Triton-X100, 0,1 mg/ml BSA). Die Reaktionen enthalten 150 nM des entsprechenden Enzyms, dNTPs (200 μM von dATP, dGTP, dCTP, und TTP) und Primer (jeweils 0,5 μM). Alle PCR Experimente werden in einem Biometra Thermocycler durchgeführt.
DNA Sequenzen:

Primer 1 5'-GGT ATT GAG GGT CGC ATG ATT TTA GAT GTG GAT TAC ATA ACT G-3' (SEQ ID NO: 5)
Primer 2 5'-AGA GGA GAG TTA GAG CC CTA GGA TTT TTT AAT GTT AAG CCA GGA AG-3' (SEQ ID NO: 6)
Templat: pETPfu

Wie aus 6 ersichtlich ist, war das Wildtyp-Enzym in der Lage, DNA zu amplifizieren. Es stellte sich heraus, dass die Mutante D541L/K593M ebenfalls PCR-aktiv ist.
Beispiel 3: Echtzeit PCR Experimente
Alle Echtzeit PCR Experimente werden in einem iCycler System (BIORAD) durchgeführt. Das Reaktionsvolumen beträgt 20 μl mit 40 pM Templat in Pfu DNA Polymerasepuffer (20 mM Tris-HCl (pH 8.8 bei 25 °C), 2 mM MgSO₄, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 10 mM KCl, 0,1% (v/v) Triton-X100, 0,1 mg/ml BSA). Die Reaktionen enthalten 20 nM Wildtyp, Mutante und 40 nM Mutante für gleiche Aktivität, dNTPs (200 μM von dATP, dGTP, dCTP, und TTP), Primer (jeweils 0,5 μM) und 0,4 × SybrGreen I (Molecular Probes). Die PCR Amplifikationen werden nach folgendem Programm durchgeführt: Initialdenaturierung bei 95 °C für 3 min, gefolgt durch 20 Zyklen Denaturierung bei 95 °C für 30 s, Primeranlagerung bei 55 °C für 35 s und Extension bei 72 °C für 40 s. Alle gezeigten Daten gehen aus drei unabhängigen Experimenten hervor.

DNA Sequenzen. Primer FarT: 5'-d(CGT TGG TCC TGA AGG AGG AT) (SEQ ID NO: 7), reverse primer: 5'-d(CGC GCA GCA CGC GCC GCC GT) (SEQ ID NO: 8). Zieltemplat FarX: 5'-d(CCG TCA GCT GTG CCG TCG CGC AGC ACG CGC CGC CGT GGA CAG AGG ACT GCA GAA AAT CAA CCT XTC CTC CTT CAG GAC CAA CGT ACA GAG) (SEQ ID NO: 9); X: A, FarA; G, FarG;

Das Ergebnis der Echtzeit-PCR-Experimente wird in 7 gezeigt. Dabei ist deutlich zu erkennen, dass die Wildtyp-Variante der Pfu DNA-Polymerase nicht zwischen korrekter Basenpaarung und Basenfehlpaarung unterscheidet, sondern in beiden Fällen das PCR-Produkt mit einer vergleichbaren Amplifikationsrate herstellt (vgl. 7A). Im Gegensatz dazu ist die Amplifikationseffizienz bei Verwendung der Mutante D541L/K593M (vgl. 7B (20 nM) und 7C (40 nm)) bei Anwesenheit einer Fehlpaarung stark herabgesetzt.
Beispiel 4: Primer-Verlängerungsexperimente
Für das Aneinanderlagern von Primer und Templat werden 150 nM 5'-32P markierter Primer und Templat in Pfu Reaktionspuffer (20 mM Tris-HCl pH 8.8, 10 mM (NH₄)₂SO₄, 10 mM KCl, 0,1% Triton-X100, 0,1 mg/ml BSA, 2 mM MgSO₄) gemischt und nach Erhitzen für 5 min. auf 95 °C in einem Thermoschüttler (Eppendorf) auf 20 °C innerhalb von 30 min. abgekühlt. Nach der Anlagerung werden die Reaktion durch Zugabe von dNTPs (in 1 × Reaktionspuffer) gestartet. Die Reaktionen werden bei 68 °C für entsprechende Zeiträume ((a)-(d)) inkubiert.

(a) 30 Minuten für die qualitative Primerverlängerungsreaktion (100 μM dNTPs, jeweils 150 nM Enzym)
(b) für die Detektion entfernter Fehlpaarungen 30 Minuten, mit 200 μM dATP und 22.5 nM Enzym.

Nach der Inkubation werden die Reaktionen durch Zugabe von 2 Vol. Gel-Ladepuffer (80% formamide, EDTA (20 mM) gestoppt und durch denaturierende PAGE (12%) untersucht und autoradiographisch ausgewertet.
DNA Sequenzen:

FT20H 5'-CGTTGGTCCTGAAGGAGGAT-3' (SEQ ID NO: 10)
F33A 5'-TTTAGTTGGACAGAAGGAAGTCCTGGTTGCATG-3' (SEQ ID NO: 11)
F33G 5'-TTTAGTTGGACAGGAGGAAGTCCTGGTTGCATG-3' (SEQ ID NO: 12)

Die Untersuchungen ergaben, dass das Wildtyp-Enzym in der Lage ist, von korrekt gepaarten und fehlgepaarten Primern zu verlängern, wenngleich mit verminderter Aktivität im Vergleich zum kanonisch gepaartem Primer/Templat (vgl. 8). Im Gegensatz dazu zeigt die Mutante D541L/K593M eine wesentlich höhere Diskriminierung bezüglich einem kanonisch bzw. nicht-kanonisch gepaartem Primer/Templat als die Wildtyp-Variante (vgl. 9) und ermöglicht so die überraschend effiziente Detektion einer Fehlpaarung.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

DNA-Polymerase, welche sich durch mindestens eine Mutation in der Aminosäure-Sequenz von ihrer Wildtyp-Variante unterscheidet und im Vergleich zur Wildtyp-Variante eine erhöhte Fehlpaarungsdiskriminierung aufweist.
DNA-Polymerase nach Anspruch 1, wobei die Mutation die Substitution mindestens einer Aminosäure durch eine hydrophobere Aminosäure umfasst.
DNA-Polmerase nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Mutation die Substitution eines Lysin-Rests gegen einen Methionin-Rest und/oder eines Asparagin-Rests gegen einen Leucin-Rest umfasst.
DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Wildtyp-Variante aus Pyrococcus furiosus stammt und eine Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 1 aufweist.
DNA-Polymerase nach Anspruch 4, wobei die Aminosäure-Sequenz im Vergleich zur Wildtyp-Variante die Mutation D541L oder K593M oder die Kombination davon aufweist.
DNA-Polymerase nach Anspruch 5 mit einer Aminosäure-Sequenz gemäß SEQ ID NO: 2.
Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche für die DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert.
Nukleinsäure nach Anspruch 7, mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 4.
Vektor, enthaltend die Nukleinsäure nach einem der Ansprüche 7 oder 8.
Wirtszelle, enthaltend den Vektor nach Anspruch 9 oder die Nukleinsäure nach Anspruch 7 oder 8.
Verfahren zur Herstellung einer DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend die Schritte (a) des Bereitstellens einer Wirtszelle nach Anspruch 10, (b) des Züchtens der Wirtszelle in einem geeigneten Medium und (c) des Isolierens der DNA-Polymerase.
Verwendung der DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 6 in einem diagnostischen oder molekularbiologischen Verfahren.
Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Verfahren allelspezifische PCR, DNA-Amplifikation oder Klonierung umfasst.
Verfahren zur Identifikation von einer oder mehreren Nukleinsäure-Fehlpaarungen, welches die Verwendung der DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 6 umfasst.
Kit zur Verwendung in einem gemäß der in den Ansprüchen 12 bis 14 genannten Verfahren, enthaltend die DNA-Polymerase nach einem der Ansprüche 1 bis 6.