DE69836779T2

DE69836779T2 - Mutierte chimäre DNS-Polymerasen

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Publication number: DE69836779T2
Application number: DE69836779T
Authority: DE
Inventors: Harrow David Oakland Gelfand; Lawrence Fred Oakland Reichert
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1997-07-09
Filing date: 1998-07-03
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2018-07-04
Also published as: EP0892058B1; JP4350815B2; ATE325877T1; EP0892058A3; JPH1189588A; DE69836779D1; ES2263188T3; US6228628B1; CA2240570C; EP0892058A2; CA2240570A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft mutierte chimäre thermostabile DNA-Polymerasen, Verfahren für ihre Synthese und Verfahren für ihre Verwendung. Die Enzyme sind in vielen rekombinanten DNA-Techniken verwendbar, besonders in der Nucleinsäuresequenzierung und in der Nucleinsäureamplifikation durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR).
Stand der Technik
Thermostabile DNA-Polymerasen, welche die Matrizen-spezifische Polymerisation von Desoxynucleosid-Triphosphaten (dNTPs) katalysieren, um DNA zu bilden, werden in einer Vielfalt an in vitro DNA-Synthese-Anwendungen verwendet, wie zum Beispiel DNA-Sequenzierung und DNA-Amplifikation. Üblicherweise benachteiligen natürlich vorkommende DNA-Polymerasen den Einbau von Nucleotidanalogen sehr. Diese Eigenschaft trägt zur Genauigkeit von DNA-Replikation und Reparatur bei. Der Einbau von Nucleotidanalogen ist jedoch für viele DNA-Syntheseanwendungen nützlich, besonders in der DNA-Sequenzierung.
DNA-Sequenzierungsreaktionen, die das Kettenabbruchverfahren verwenden, das ursprünglich von Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. 74: 5463–5467 beschrieben wurde, sind für den Syntheseabbruch auf ein unkonventionelles Substrat, Didesoxynucleosid-Triphosphat (ddNTP), angewiesen. Im Kettenabbruchverfahren sind sowohl das herkömmliche Substrat der DNA-Polymerase (dNTP) als auch ein Ketten-abbrechendes, unkonventionelles Substrat (ddNTP oder markierte ddNTP) in der Reaktion vorhanden. Die Synthese schreitet fort, bis ein ddNTP eingebaut wird. Um sicherzustellen, dass die Ketten- abbrechenden ddNTPs in einer geeigneten Rate eingebaut werden, wurde die den früher benützten DNA-Polymerasen innewohnende Benachteiligung des Einbaus von ddNTPs durch Bereitstellung eines Überschusses an ddNTPs umgangen.
Farbstoff-Terminator-Sequenzierung, eine Variante des Kettenabbruchverfahrens, verwendet mit Fluoreszenzfarbstoffen markierte ddNTPs, wie zum Beispiel Fluorescein oder Rhodamin, um die Synthese zu beenden und gleichzeitig die synthetisierte DNA zu markieren. Die Anwesenheit eines Farbstoffmarkers auf dem ddNTP kann die Benachteiligung des Einbaus des unkonventionellen Substrats durch DNA-Polymerase verschlimmern.
Üblicherweise wird die Sequenzierung durch das Kettenabbruchverfahren unter Verwendung wiederholter Schritte von Primer-Verlängerung, gefolgt von Hitze-Denaturierung der Primer verlängerten Produkt-Matrix-Duplexe, durchgeführt. Diese als Zyklus-Sequenzierung bezeichnete Ausführungsform wird in einem Thermocycler unter Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase durchgeführt. Kits zur Durchführung der Zyklus-Sequenzierung sind im Handel erhältlich, zum Beispiel von Perkin Elmer, Norwalk, CT.
Thermostabile DNA-Polymerasen, abgeleitet von einer Vielzahl an Organismen, sind in der Literatur ausführlich beschrieben worden und sind dem Fachmann gut bekannt. Besondere Beispiele schließen DNA-Polymerasen von einer Vielzahl an Arten der Gattung Thermus (siehe U.S. Patentnummer 5.466.591) ein, insbesondere von Thermus aquaticus (Taq-DNA-Polymerase) beschrieben in den U.S. Patentnummern 4.889.818; 5.352.600; und 5.079.352; und der DNA-Polymerase von Thermatoga maritima (Tma-DNA-Polymerase) beschrieben in den U.S. Patentnummern 5.374.553 und 5420.029.
DNA-Polymerasen besitzen üblicherweise eine oder mehrere damit verbundene exonucleolytische Aktivitäten. Zum Beispiel katalysiert die Tma-DNA-Polymerase die exonucleolytische Entfernung von Nucleotiden vom 5'-Ende einer doppelsträngigen DNA (bezeichnet als 5'- nach 3'-Exonucleaseaktivität oder 5'-Nucleaseaktivität) sowie vom 3'-Ende einer einzel- oder doppelsträngigen DNA (bezeichnet als 3'- nach 5'-Exonucleaseaktivität). Im Gegensatz dazu besitzen DNA-Polymerasen der Gattung Thermus nur 5'-Nucleaseaktivität. Ein Überblick über thermostabile DNA-Polymerasen und ihre zugehörigen Aktivitäten findet sich in Abramson, 1995, in PCR-Strategies (Innis, et al., Hrsg. Academic Press, Inc.). Zur Verwendung in der DNA-Sequenzierung wird eine DNA-Polymerase bevorzugt, der die zugehörige exonucleolytische Aktivität fehlt, es wird entweder 5'-Nucleaseaktivität oder 3'- nach 5'-Exonucleaseaktivität bevorzugt. Mutierte Formen von etlichen thermostabilen DNA-Polymerasen, welchen die 5'-Nucleaseaktivität fehlt, werden im U.S. Patentnummer 5.466.591 beschrieben.
Die europäische Patentanmeldung 0 655 506 beschreibt eine mutierte DNA-Polymerase mit einer erhöhten Fähigkeit Didesoxynucleotide einzubauen (siehe auch U.S. Patentnummer 5.614.365). Die Mutation stellt eine Punktmutation dar, die der Aminosäure 526 der T7 DNA-Polymerase entspricht. Beispiele solcher Mutationen schließen Mutationen in der Aminosäure 667 der Taq-DNA-Polymerase ein.
AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS, eine mutierte Form der Taq-DNA-Polymerase, die im Wesentlichen keine 5'-Nucleaseaktivität aufweist und ein F667Y-Mutation umfasst, wird als eine Komponente des DNA-Zyklus Sequenzierungskits von Perkin Elmer, Norwalk, CT, verkauft. Die F667Y-Mutation resultiert in einer erheblichen Verminderung in der Diskriminierung von ddNTPs. Diese Eigenschaft verbessert die von einer Farbstoff-Terminator-Sequenzierungsreaktion erhaltenen Sequenzdaten sehr und vermindert die für jede Sequenzreaktion benötigte Menge an ddNTPs. Die Verwendung der AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS hat die Probleme mit der Ungleichmäßigkeit von Peakhöhen in der Sequenzierungsspur jedoch nicht behoben, wenn sie mit ddNTPs verwendet wurden, die mit der Standard Rhodamin-Farbstofffamilie markiert waren. Eine Analyse der unter Verwendung der AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS in einer Farbstoff-Terminator-Zyklussequenzierungsreaktion erhaltenen Muster der Peakhöhen wird in Parker et al., 1996, Bio Techniques 21(4): 694–699 beschrieben.
Herkömmliche Molekularbiologie- und Nucleinsäurechemie-Techniken, die innerhalb des Fachgebietes liegen, werden in der Literatur vollständig beschrieben. Siehe zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning – A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York; Oigonucleotid Synthesis (M.J. Gait, Hrsg. 1984) Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames and S.3. Higgins. Hrsg. 1984) und eine Serie, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.).
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft mutierte, chimäre, thermostabile DNA-Polymerasen, die in Bezug auf früher beschriebene thermostabile DNA-Polymerasen erheblich verbesserte Eigenschaften aufweisen. Die DNA-Polymerase liefert erhebliche Verbesserungen, wenn sie in DNA-Sequenzierungsreaktionen verwendet wird. Die DNA-Polymerase der Erfindung stellt insbesondere die folgende Kombination an vorteilhaften Eigenschaften bereit:

– verbesserter Einbau von ddNTPs;
– verbesserte Gleichmäßigkeit von Peakhöhen in DNA-Sequenzierungsspuren, insbesondere bei Verwendung mit Farbstoff-markierten ddNTPs in einer Zyklus-Sequenzierungsreaktion;
– verminderte Pyrophosphorylierungsrate von Farbstoff-markierten ddNTPs; und
– verbesserter Einbau von dITP.

Darüber hinaus kann die DNA-Polymerase leicht und effizient in einem rekombinanten Expressionssystem in einer großen Menge exprimiert werden und dadurch die kommerzielle Produktion des Enzyms erleichtern. Die Kombination der von in der DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung vorhandenen Eigenschaften stellt einen wesentlichen Vorteil gegenüber den früher in der Literatur beschriebenen thermostabilen DNA-Polymerasen dar.
Die chimären DNA-Polymerasen der vorliegenden Erfindung bestehen aus einer N-terminalen Region, abgeleitet von der 5'-Nucleasedomäne einer DNA-Polymerase der Thermus-Art und einer C-terminalen Region, abgeleitet von der 3'- nach 5'-Exonuclease und der Polymerasendomäne der Tma-DNA-Polymerase. Die N-terminale Region enthält mindestens eine Region der DNA-Polymerase der Thermus-Art, abgeglichen mit den Aminosäuren 1–138 der Tma-DNA-Polymerase, gemäß dem in den 1A und 1B gezeigten Abgleich und kann bis einschließlich die gesamte 5'-Nucleasedomäne der DNA-Polymerase der Thermus-Art enthalten. Die C-terminale Region enthält zusätzlich zu der 3'- nach 5'-Exonuclease und den Polymerasedomänen einen Teil der 5'-Nucleasedomäne der Tma-DNA-Polymerase, abgeglichen mit dem Teil der 5'-Nuleasedomäne der DNA-Polymerase der Thermus-Art-, die in der N-terminalen Region nicht vorhanden ist.
Folglich besteht die DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung aus einer N-terminalen Region und einer C-terminalen Region, wobei

(a) die C-terminale Region aus Aminosäuren m+1 bis 893 der Thermatoga maritima (Tma)-DNA-Polymerase, SEQ ID NR: 10, besteht und wobei m zwischen 137 und 291 ist;
(b) die N-terminale Region aus den Aminosäuren 1 bis n einer DNA-Polymerase einer Thermus-Art besteht, wobei die Tma-DNA-Polymerase, SEQ ID NR: 10, gemäß den 1A und 1B mit der DNA-Polymerase einer Thermus-Art abgeglichen wird, um eine maximale Gesamtsequenzhomologie zu erzielen, und n entweder eine Aminosäure ist, die abgeglichen ist mit der Aminosäure m der Tma-DNA-Polymerase oder, im Falle dass die Aminosäure m der Tma-DNA-Polymerase mit einer Lücke abgeglichen ist, die erste Aminosäure ist, die der Lücke folgt;
(c) wobei die N-terminale Region modifiziert ist durch mindestens eine Punktmutation, welche die 5'-Nucleaseaktivität in hohem Maße reduziert oder eliminiert, wenn 5'-Nucleaseaktivität in der DNA-Polymerase der Thermus-Art vorhanden ist, oder wobei die C-terminale Region innerhalb der Region, die durch Aminosäuren m+1 bis 291 der Tma-DNA-Polymerase dargestellt ist, durch mindestens eine Punktmutation modifiziert ist, welche die 5'-Nucleaseaktivität in hohem Maße reduziert oder eliminiert, wenn 5'-Nucleaseaktivität in der Tma-DNA-Polymerase vorhanden ist;
(d) wobei die C-terminale Region durch mindestens eine Punktmutation modifiziert ist, welche die 3'- nach 5'-Exonucleaseaktivität in hohem Maße reduziert, wenn 3'- nach 5'-Exonucleaseaktivität in der Tma-DNA-Polymerase vorhanden ist, und
(e) wobei die C-terminale Region so modifiziert ist, dass diese Aminosäure 730 der Tma-DNA-Polymerase (SEQ ID NR: 10) ein Tyrosin enthält.

Die chimäre DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung wurde durch eine F730Y-Mutation in der DNA-Polymerasedomäne abgeleitet von der Tma-DNA-Polymerase modifiziert, welche die Fähigkeit der DNA-Polymerase erhöht Didesoxynucleotide einzubauen.
Die 5'-Nucleasedomäne der chimären DNA-Polymerase enthält mindestens eine Punktmutation, welche die 5'-Nucleaseaktivität erheblich reduziert oder vorzugsweise inaktiviert. Die Mutation kann entweder in der N-terminalen Region vorhanden sein, die von der 5'-Nucleasedomäne der Thermus-Art-DNA-Polymerase abgeleitet ist, oder, falls vorhanden, im Anteil der C-terminalen Region, die von der 5'-Nucleasedomäne der Tma-DNA-Polymerase abgeleitet ist. Geeignete Mutationen sind jene Punktmutationen (Substitutions- oder Deletionsmutation einzelner Aminosäuren), welche die 5'-Nucleaseaktivität in der ursprünglichen DNA-Polymerase erheblich reduzieren oder vorzugsweise inaktivieren. Folglich wird entweder die N-terminale Region durch mindestens eine Aminosäuresubstitution oder Deletion modifiziert, welche die 5'-Nucleaseaktivität in der Thermus-Art-DNA-Polymerase erheblich vermindert oder eliminiert, oder diese C-terminale Region wird durch mindesten eine Aminosäuresubstitution oder Deletion innerhalb des Bereiches der Aminosäuren m+1 bis 291 der Tma-DNA-Polymerase modifiziert, der die 5'-Nucleaseaktivität in der Tma-DNA-Polymerase erheblich vermindert oder eliminiert.
Aminosäurepositionen die für die 5'-Nucleaseaktivität einer DNA-Polymerase entscheidend sind, sind wie hierin beschrieben, gut bekannt. Substitutionen einer Aminosäure an einer oder mehreren dieser entscheidenden Positionen, oder eine Deletion einer Aminosäure an einer oder mehreren dieser entscheidenden Positionen, resultieren üblicherweise in einer Abnahme der 5'-Nucleaseaktivität. Vorzugsweise enthält die chimäre DNA-Polymerase eine Mutation, welche die 5'-Nucleaseaktivität erheblich reduziert oder inaktiviert.
Die C-terminale Region, welche die von der Tma-DNA-Polymerase abgeleitete 3'- nach 5'-Exonucleasedomäne enthält, beinhaltet mindestens eine Punktmutation, welche die 3'- nach 5'-Exonucleaseaktivität in der Tma-DNA-Polymerase erheblich reduziert oder vorzugsweise inaktiviert.
Aminosäurenpositionen die für die 3'- nach 5'-Exonucleaseaktivität einer DNA-Polymerase entscheidend sind, sind wie hierin beschrieben, gut bekannt. Eine Substitution einer Aminosäure an einer oder mehreren dieser entscheidenden Positionen, oder eine Deletion einer Aminosäure an einer oder mehreren dieser entscheidenden Positionen, resultieren in einer Abnahme der 3'- nach 5'-Nucleaseaktivität. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die C-terminale Region eine D323A und eine E325A-Mutation, welche die 3'- nach 5'-Exonucleaseaktivität inaktivieren.
In einer Ausführungsform ist die N-terminale Region von der Taq-DNA-Polymerase abgeleitet. In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die N-terminale Region aus Aminosäuren 1–190 der Taq-DNA-Polymerase und die C-terminale Region besteht aus den Aminosäuren 191–893 der Tma-DNA-Polymerase. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform, bezeichnet als F730YTma30DNA-Polymerase, besteht die N-terminale Region aus Aminosäuren 1–190 der Taq-DNA-Polymerase und enthält eine G46D-Mutation und die C-terminale Region besteht aus den Aminosäuren 191–893 der Tma-DNA-Polymerase und enthält D323A, E325A und F730Y-Mutationen.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die gereinigte DNA (chimäres Gen), welche die mutierte, chimäre, thermostabile DNA-Polymerase der Erfindung codiert, rekombinante DNA-Vektoren, welche die DNA enthalten und mit den rekombinanten Vektoren transformierte Wirtszellen. DNA-Sequenzen, welche sich nur durch stumme Nucleotidaustausche unterscheiden (d.h. welche die gleiche Aminosäuresequenz codieren), liegen innerhalb des vorgesehenen Geltungsbereiches der Erfindung.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung besteht die gereinigte DNA aus den Nucleotiden 1–570 eines die Taq-DNA-Polymerase codierenden Gens, das modifiziert wurde, um die G46D-Mutation zu codieren und die Nucleotide 571–2679 eines die Tma-DNA-Polymerase codierenden Gens, das modifiziert wurde, um die D323A, E325A und F730Y-Mutationen zu codieren.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Erzeugung der mutierten, chimären, thermostabilen DNA-Polymerase der Erfindung unter Verwendung der gereinigten DNA der vorliegenden Erfindung. Ein rekombinanter Expressionsvektor wird in einer Wirtszelle exprimiert und das exprimierte Protein wird von der Wirtszelle gereinigt.
Kurze Beschreibung der Darstellungen
1A und 1B stellen einen Aminosäuresequenzabgleich der 5'-Nucleasedomänen der Tma-DNA-Polymerase und der DNA-Polymerase von sieben Arten der Gattung Thermus bereit. Aminosäuren, die für die 5'-Nucleaseaktivität entscheidend sind, sind durch Sternchen gekennzeichnet.
2A, 2B und 2C stellen eine Sequenzspur der Zyklus-Sequenzierungsreaktion unter Verwendung der F730YTma-DNA-Polymerase bereit, wie sie in Beispiel 5 beschrieben wird.
3A, 3B und 3C stellen eine Sequenzspur der Zyklus-Sequenzierungsreaktion unter Verwendung der AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS bereit, wie sie in Beispiel 5 beschrieben wird.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine mutierte, chimäre, thermostabile DNA-Polymerase bereit, sowie Mittel zur Herstellung des Enzyms. Um das Verständnis der Erfindung zu erleichtern werden nachstehend etliche Begriffe erklärt.
Die Begriffe „Zelle", „Zelllinie" und „Zellkultur" können untereinander austauschbar verwendet werden und alle solche Bezeichnungen schließen Nachkommen ein. Die Worte „Transformanten" oder „transformierte Zellen" schließen daher die primär transformierte Zelle und die von dieser Zelle abgeleiteten Kulturen ein, ohne Berücksichtigung der Zahl der Transfers. Aufgrund absichtlicher oder unabsichtlicher Mutationen müssen nicht alle Nachkommen in ihrem DNA-Gehalt ganz identisch sein. Mutierte Nachkommen welche die gleich Funktionalität aufweisen, nach der in der ursprünglichen transformierten Zelle durchmustert wurde, sind in der Definition der Transformanten eingeschlossen.
Der Begriff „Kontrollsequenzen" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, die für die Expression einer funktionsfähig verbundenen Codierungssequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die für Prokaryonten geeigneten Kontrollsequenzen schließen zum Beispiel einen Promotor ein, wahlweise eine Operatorsequenz, eine Ribosomenbindungsstelle, positive Regulationselemente (siehe U.S. Patentnummer 4.666.848) und möglicherweise andere Sequenzen.
Der Begriff „Expressionsclon" bezieht sich auf DNA-Sequenzen, welche eine gewünschte Codierungsequenz und Kontrollsequenzen in funktionsfähiger Verbindung enthalten, sodass die mit diesen Sequenzen transformierten Wirte in der Lage sind die codierten Proteine zu produzieren. Der Begriff „Expressionssystem" bezieht sich auf einen mit einem Expressionsclon transformierten Wirt. Um die Transformation zu bewirken kann der Expressionsclon in einen Vektor aufgenommen werden; die relevante DNA kann aber auch in das Wirtschromosom integriert werden.
Der Begriff „Gen" bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, welche Kontroll- und Codierungssequenzen umfasst, die für die Produktion eines wiederauffindbaren bioaktiven Polypeptids oder Vorläufers notwendig sind.
Der Begriff „funktionsfähig verbunden" bezieht sich auf die Positionierung der Codierungssequenz in einer solchen Weise, dass Kontrollsequenzen so funktionieren werden, dass sie die Expression des durch die Codierungssequenz codierten Proteins antreiben. Eine Codierungssequenz, welche mit Kontrollsequenzen „funktionsfähig verbunden" ist, bezieht sich demnach auf eine Konfiguration worin die Codierungssequenzen unter Leitung einer Kontrollsequenz exprimiert werden können.
Der Begriff „Oligonucleotid", wie er hierin verwendet wird, ist als ein Molekül definiert, welches ein oder mehrere Desoxyribonucleotide oder Ribonucleotide umfasst. Die genaue Größe wird von vielen Faktoren abhängen, welche wiederum von der endgültigen Funktion oder Verwendung der Oligonucleotide abhängen. Oligonucleotide können durch jedes passende Verfahren erzeugt werden, einschließlich zum Beispiel durch Clonierung und Restriktion von geeigneten Sequenzen und durch direkte chemische Synthese durch ein Verfahren wie zum Beispiel dem Phosphotriester-Verfahren von Narang et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 90–99; dem Phosphodiester-Verfahren von Brown et al., 1979, Meth. Enzymol. 68: 109–151; dem Diethylphosphoraminditverfahren von Beaucage et al., 1981, Tetrahedron Lett. 22: 1859–1862; und dem Verfahren mit festen Trägern von U.S. Patennummer 4,458,066. Ein Überblick über Syntheseverfahren wird in Goodchild, 1990, Bioconjugate Chemistry 1(3): 165–187 bereitgestellt.
Der Begriff „Primer", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Oligonucleotid, das in der Lage ist als ein Initiationspunkt der Synthese zu fungieren, wenn es unter Bedingungen gestellt wird, in denen Primer-Verlängerung initiiert wird. Synthese eines Primerverlängerungsproduktes, welches mit einem Nucleinsäurestrang komplementär ist, wird in der Anwesenheit der erforderlichen vier verschiedenen Nucleosidtriphosphate und einer thermostabilen DNA-Polymerase in einem geeigneten Puffer, bei einer passenden Temperatur initiiert. Ein „Puffer" schließt Cofaktoren ein, (wie zum Beispiel divalente Metallionen) und Salze (um die geeignete Ionenstärke bereitzustellen), die auf den gewünschten pH-Wert eingestellt sind.
Ein Primer, der an den nicht-codierenden Strang einer Gensequenz hybridisiert (entsprechend ist er eine Untersequenz des Codierungsstranges), wird hierin als ein „stromaufwärts" Primer bezeichnet. Ein Primer der mit dem codierenden Strang einer Gensequenz hybridisiert, wird hierin als ein „stromabwärts" Primer bezeichnet.
Die Begriffe „Restriktionsendonucleasen" und „Restriktionsenzyme" beziehen sich auf Enzyme, üblicherweise bakteriellen Ursprungs, welche doppelsträngige DNA an, oder nahe einer spezifischen Nucleotidsequenz spalten.
Der Begriff „thermostabiles Enzym", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein Enzym, das hitzebeständig ist und ein erhöhtes Temperatur-Reaktionsoptimum aufweist. Das thermostabile Enzym der vorliegenden Erfindung katalysiert Primer-Verlängerungen am besten bei einer Temperatur zwischen 60 und 90°C und ist unter den in Zyklus-Sequenzierungsreaktionen und Polymerasekettenreaktions-Amplifikatioen üblicherweise verwendeten Zyklusbedingungstemperaturen verwendbar (beschrieben in U.S. Patentnummer 4,965,188).
Wie hierin verwendet, bezieht sich eine „Punktmutation" in einer Aminosäuresequenz entweder auf eine einzelne Aminosäuresubstitution oder eine einzelne Aminosäuredeletion. Eine Punktmutation wird vorzugsweise durch einen geeigneten Codonaustausch in der codierenden DNA in eine Aminosäuresequenz eingeführt.
Einzelne Aminosäuren in einer Sequenz werden hierin als AN dargestellt, wobei A das Standard-Ein-Buchstaben-Symbol für die Aminosäure in der Sequenz darstellt und N die Position in der Sequenz. Mutationen innerhalb einer Aminosäuresequenz werden hierin als A₁NA₂ dargestellt, wobei A₁ das Standard-Ein-Buchstaben-Symbol für die Aminosäure in der nicht-mutierten Proteinsequenz, A₂ das Standard-Ein-Buchstaben-Symbol für die Aminosäure in der mutierten Proteinsequenz und N die Position in der Aminosäuresequenz darstellt. Zum Beispiel stellt eine G46D-Mutation einen Austausch von Glycin zu Asparaginsäure bei der Aminosäuresposition 46 dar. Die Aminosäurepositionen werden basierend auf der Volllängensequenz des Proteins nummeriert, von dem der die Mutation umfassende Bereich stammt. In der vorliegenden Erfindung werden Mutationen des Proteinbereiches, der aus einer Thermus-Art-DNA-Polymerase stammt, daher gemäß der Volllängensequenz der Thermus-Art-DNA-Polymerase nummeriert, wohingegen vom Bereich der Tma-DNA-Polymerase abgeleitete Mutationen gemäß den Volllängensequenzen der Tma-DNA-Polymerase nummeriert werden. Darstellungen von Nucleotiden und Punktmutationen in den DNA-Sequenzen sind analog.
Wie hierin verwendet, bezieht sich ein „chimäres" Protein auf ein Protein dessen Aminosäuresequenz ein Fusionsprodukt von Untersequenzen der Aminosäuresequenzen von mindestens zwei unterschiedlichen Proteinen darstellt. Ein chimäres Protein wird vorzugsweise nicht durch direkte Manipulation der Aminosäuresequenzen erzeugt, sonder wird stattdessen von einem „chimären" Gen exprimiert, welches die chimäre Aminosäuresequenz codiert. Die chimären Proteine der vorliegenden Erfindung bestehen aus einer aminoterminalen (N-terminalen) Region, abgeleitet von einer Thermus-Art-DNA-Polymerase und einer carboxyterminalen (C-terminalen) Region, abgeleitet von einer Tma-DNA-Polymerase. Die N-terminale Region bezieht sich auf eine Region, welche sich vom N-Terminus (Aminosäureposition 1) bis zu einer internen Aminosäure erstreckt. Ähnlich bezieht sich die C-terminale Region auf eine Region, die sich von einer internen Aminosäure bis zum C-Terminus erstreckt. In den chimären Proteinen der vorliegenden Erfindung erstreckt sich die N-terminale Region vom N-Terminus (Aminosäureposition 1) bis zum Anfang der C-terminalen Region, welche sich bis zum C-Terminus erstreckt. Gemeinsam schließen die N-terminalen und C-terminalen Regionen daher die gesamte Aminosäuresequenz ein.
Die mit den DNA-Polymerasen assoziierten exonucleolytischen Aktivitäten (3'- nach 5'-Exonucleaseaktivität und 5'-Nucleaseaktivität, die auch als 5'- nach 3'-Exonucleaseaktivität bezeichnet wird) und Verfahren zur Messung dieser Aktivitäten, sind im Fachgebiet gut bekannt. Wie hierin verwendet, ist eine Aktivität „wesentlich reduziert", wenn sie auf weniger als etwa 20% reduziert ist, vorzugsweise auf weniger als etwa 10% und besonders bevorzugt auf weniger als 1% der im nicht-mutierten Enzym vorhandenen Aktivität. Eine Aktivität ist „inaktiviert" oder „im Wesentlichen inaktiviert", wenn sie auf ein Niveau reduziert ist, das für den Zweck der typischen oder bevorzugten Verwendung des Enzyms vernachlässigbar ist.
Thermostabile DNA-Polymerase der Erfindung
Die typische thermostabile DNA-Polymerase der Erfindung ist eine chimäre DNA-Polymerase in welcher die N-terminale Region aus einer N-terminalen Region einer Thermus-Art-DNA-Polymerase besteht und die C-terminale Region aus einer C-terminalen Region der Tma-DNA-Polymerase besteht. Die N-terminale Region der Thermus-Art-DNA-Polymerase schließt einen Teil oder die gesamte 5'-Nucleasedomäne ein. Die C-terminale Region der Tma-DNA-Polymerase schließt einen Teil oder möglicherweise nichts der 5'-Nucleasedomäne und die gesamte 3'- nach 5'-Exonuclease- und DNA-Polymerasedomäne ein. Der Teil der 5'-Nucleasedomäne der Tma-DNA-Polymerase, welcher von der C-terminalen Region des chimären Proteins eingeschlossen wird, wird gemäß den 1A und 1B mit dem Teil der 5'-Nucleasendomäne der Thermus-Art-DNA-Polymerase abgeglichen sein, der nicht von der N-terminalen Region des chimären Proteins eingeschlossen wird.
Die chimäre DNA-Polymerase enthält außerdem die F730Y-Mutation, welche die Effizienz erhöht mit der die DNA-Polymerase ddNTPs einbaut. Die chimäre DNA-Polymerase enthält auch eine oder mehrere Punktmutationen, welche die 5'-Nucleaseaktivität wesentlich vermindern oder eliminieren und eine oder mehrere Punktmutationen, welche die 3'- nach 5'-Exonucleaseaktivität wesentlich vermindern oder eliminieren.
1. Die chimären Proteindomänen
Die DNA-Polymerasen der Arten der Gattung Thermus und die Tma-DNA-Polymerase sind in der Gesamtstruktur ähnlich. In diesen DNA-Polymerasen sind die Exonuclease- und die DNA-Polymeraseaktivitäten der Enzyme in getrennten Proteinbereichen vorhanden (den Aktivitätsdomänen). Die ungefähren Aktivitätsdomänen einer repräsentativen Thermus-Art-DNA-Polymerase, der Taq-DNA-Polymerase und der Tma-DNA-Polymerase werden in der nachstehenden Tabelle gezeigt (siehe auch U.S. Patentnummer 5,420,029). Die homologen Aktivitätsdomänen, welche die 5'-Nucleaseaktivität codieren und jene, welche die DNA-Polymeraseaktivität codieren, weisen ungefähr die gleiche Länge auf (siehe 1A und 1B). Der Längenunterschied zwischen den Regionen, welche die 3'- nach 5'-Exonucleaseaktivität in der Tma-DNA-Polymerase codieren und der abgeglichenen Region der Taq-DNA-Polymerase, entsprechen dem Fehlen einer 3'- nach 5'-Exonucleaseaktivität in der Taq-DNA-Polymerase.
Aktivitätsdomänen (ungefähre Aminosäurepositionen)
Signifikante Aminosäuresequenzähnlichkeiten bestehen zwischen Thermus-Art-DNA-Polymerasen und der Tma-DNA-Polymerase. Zum Beispiel deutet ein Aminosäuresequenzvergleich einer repräsentativen Thermus-Art-DNA-Polymerase, der Taq-DNA-Polymerase und der Tma-DNA-Polymerase unter Verwendung des GAP-Computerprogrammes (Genetics Computer Group, Madison, WI) mit den Standardparametern an, dass die Aminosäuresequenzen über die gesamten Aminosäuresequenzen oder über die 5'-Nucleasedomänen ungefähr 44% identisch und 66% ähnlich sind.
Aufgrund der gesamten Struktur- und Sequenzähnlichkeiten behalten die chimären Enzyme die in der Tma-DNA-Polymerase vorhandene Gesamtstruktur und Aktivitätsdomänen bei. Die wesentliche Veränderung ist, dass die Aminosäuresequenz der N-terminalen Region des chimären Enzyms jene der Region einer Thermus-Art-DNA-Polymerase ist, abgeglichen gemäß den 1A und 1B. Das chimäre Enzym der vorliegenden Erfindung ist daher eine mutierte Tma-DNA-Polymerase, wobei die 5'-Nucleasedomäne durch die abgeglichene Domäne aus einer Thermus-Art-DNA-Polymerase ersetzt worden ist. Die „abgeglichene Domäne" wird hierin durch einen Aminosäuresequenzabgleich definiert, wie er in den 1A und 1B bereitgestellt wird.
Die 1A und 1B stellen einen Aminosäuresequenzabgleich der 5'-Nucleasedomänen der Tma-DNA-Polymerase und sieben repräsentativen Thermus-Art-DNA-Polymerasen bereit. Die sieben repräsentativen Thermus-Art-DNA-Polymerasen werden gemeinsam mit den hierin verwendeten Abkürzungen und den Sequenzidentifikationsnummern für die Aminosäuresequenzen der 5'-Nucleasedomänen in der nachstehend Tabelle angeführt.
Die Übereinstimmung der Aminosäuren und der Regionen innerhalb dieser DNA-Polymerasen wird vom Aminosäureabgleich erhalten.
Etliche zusätzliche Arten der Gattung Thermus sind identifiziert worden und sind von Hinterlegungsstellen wie der American Type Culture Collection (ATCC) und der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (DSM) erhältlich. Wie nachstehend besprochen, können DNA-Polymerasen und die codierenden Gene von den hinterlegten Stämmen gewonnen und mit einem Routineverfahren sequenziert werden. Ein Routine-Sequenzabgleich der Aminosäuresequenz einer Thermus-Art-DNA-Polymerasesequenz mit der Tma-DNA-Polymerasesequenz unter Verwendung von zum Beispiel dem GAP-Progamm, zur Maximierung der Gesamt-Sequenzhomologie, wird die Verwendung der Thermus-DNA-Polymerasesequenz in einer chimären DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung ermöglichen.
In dem chimären Protein der Erfindung wird die erste Aminosäure der Region von der Tma-DNA-Polymerase mit einer Aminosäure beginnen, welche der Aminosäure folgt, die mit der letzten Aminosäure der Thermus-Art-DNA-Polymerasesequenz abgeglichen ist und wird den Rest (bis einschließlich Aminosäure 893) der Tma-DNA-Polymerasesequenz enthalten. Die Sequenz der gesamten Tma-DNA-Polymerase wird als SEQ ID NR: 10 bereitgestellt. Vorzugsweise wird die Aminosäuresequenz der Thermus-Art-DNA-Polymerase mit einer Aminosäuresequenz der Tma-DNA-Polymerase an einem Punkt verbunden, an welchem die beiden Aminosäuresequenzen identisch oder ähnlich sind. Zum Beispiel besteht eine bevorzugte Ausführungsform aus den Aminosäuren 1–190 der Taq-DNA-Polymerase und den Aminosäuren 191–893 der Tma-DNA-Polymerase. Aminosäure 190 der Tma-DNA-Polymerase ist mit der Aminosäure 190 der Taq- DNA-Polymerase abgeglichen und der Tma-DNA-Polymeraseanteil des chimären Enzyms beginnt mit der nächsten Aminosäure, Aminosäure 191.
In Bereichen, wo die beiden DNA-Polymerasen identisch sind, ist die Identifikation der letzten Aminosäure von der Thermus-Art-DNA-Polymerase innerhalb des Bereiches willkürlich. Da die Aminosäuren 191 und 192 in der Taq-DNA-Polymerase und Tma-DNA-Polymerase identisch sind (und unter den Thermus-Art-DNA-Polymerasen konserviert sind), ist zum Beispiel ein chimäres Protein, welches die Aminosäuren 1–191 der Taq-Polymerase enthält, von den chimären Proteinen, die die Aminosäuren 1–191 oder 1–192 der Taq-DNA-Polymerase enthalten, nicht unterscheidbar. Die in den Beispielen beschriebene Ausführungsform der Erfindung wird im Hinblick auf ursprüngliche Abweichung des Enzyms dahingehend bezeichnet, dass sie die Aminosäuren 1–190 der Taq-DNA-Polymerase enthält.
In dem in den 1A und 1B bereitgestellten Sequenzabgleich wird eine Aminosäure in der Länge ausgespart, wo sie in die Tma-DNA-Sequenzen bei den Positionen 54–55 und 225–226 inseriert ist, um den Abgleich mit fünf von sieben der Thermus-Art-DNA-Polymerasen zu ermöglichen, welche eine zusätzliche Aminosäure an diesen Positionen enthalten. Infolgedessen gibt es für diese beiden, in diesen fünf Thermus-Arten vorhandenen Aminosäuren, keine abgeglichenen Aminosäuren in der Tma-DNA-Polymerase. Ein Fachmann wird erkennen, dass ein geeignetes chimäres Protein, welches einen N-terminalen Bereich von einer dieser fünf Thermus-Art-DNA-Polymerasen enthält, das mit der Aminosäure endet, die mit einer Leerstelle in der Tma-DNA-Polymerase abgeglichen ist, in einer solchen Weise konstruiert werden kann, dass der von der Tma-DNA-Polymerase abgeleitete Bereich bei der ersten Aminosäure nach der Lücke beginnt.
Ein entscheidender Aspekt der chimären DNA-Polymerase ist, dass sie durch ein chimäres Gen codiert wird, in welchem der Bereich der die Tma-DNA-Polymerasesequenz codiert, mindestens bis einschließlich der alternativen Ribosomenbindungsstelle, die im Volllängen-Tma-DNA-Polymerasegen etwa bei Codons 133–137 vorhanden ist, und vorzugsweise bis einschließlich dem Methionin 140-Startcodon, durch eine Gensequenz ersetzt wird, die den entsprechenden Bereich von einer Thermus-Art-DNA-Polymerase codiert. Die Anwesenheit des Volllängen Tma-DNA-Polymerasegens dieser alternativen Ribosomen- Bindungsstelle, sowie des Startcodons, resultiert in der bevorzugten Expression einer verkürzten Tma-DNA-Polymerase, die mit Aminosäure 140 beginnt. Wie nachstehend beschrieben, ist der Austausch dieses Bereiches des Tma-DNA-Polymerasegens entscheidend für die effiziente Expression des chimären Volllängen-Proteins. In der chimären DNA-Polymerase der Erfindung ersetzt daher der N-terminale Bereich von einer Thermus-Art-DNA-Polymerase einen Bereich der Tma-DNA-Polymerase, der mindestens bis einschließlich Aminosäure 137 umfasst und vorzugsweise bis einschließlich Aminosäure 140.
Der Bereich von jeder Thermus-Art-DNA-Polymerase, der mit den Aminosäuren 1–137 der Tma-DNA-Polymerase abgeglichen ist, wird von einem Aminosäure-Sequenzabgleich erhalten, wie er in den Figuren bereitgestellt wird. Zum Beispiel stellt der Bereich der Taq-DNA-Polymerase, der mit den Aminosäuren 1–137 der Tma-DNA-Polymerase abgeglichen ist, die Aminosäuren 1–142 dar (siehe 1A und 1B) und die Aminosäure der Taq-DNA-Polymerase, die mit M140 der Tma-DNA-Polymerase abgeglichen ist stellt L145 dar. Ausführungsformen in welchen der N-terminale Bereich von der Taq-DNA-Polymerase stammt, werden daher mindestens die Aminosäuren 1–142 umfassen und vorzugsweise die Aminosäuren 1–145 der Taq-DNA-Polymerase. Ähnlich wird für die Ausführungsformen in welchen der N-terminale Bereich von einer anderen Thermus-Art-DNA-Polymerase stammt, der Bereich der Thermus-Art-DNA-Polymerase, der mit den Aminosäuren 1–137 und 140 der Tma-DNA-Polymerase abgeglichen ist, von dem in den Figuren bereitgestellten Sequenzabgleich erhalten.
Ein Fachmann wird erkennen, dass geringfügige Mutationen, Additionen oder Deletionen in eine DNA-Polymerase eingeführt werden können, welche die funktionellen Eigenschaften des Enzyms nicht ändern und dass ein solches mutiertes Enzym in jeder Hinsicht äquivalent zum nicht-mutierten Enzym ist. Zum Beispiel ist bekannt, dass eine Deletion von mehreren N-terminalen Aminosäuren der Taq-DNA-Polymerase die funktionellen Eigenschaften des Enzyms nicht ändert. Gleichermaßen ist bekannt, dass Substitutionsmutationen an vielen der Aminosäurepositionen im Wesentlichen keine Wirkung zu haben scheinen. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung, werden DNA-Polymerasen, die geringfügige Mutationen enthalten, welche die funktionellen Eigenschaften des Enzyms nicht ändern, als gleichwertig zur nicht-mutierten DNA-Polymerase erachtet.
2. Punktmutationen in der 5'-Nucleasedomäne
Die 5'-Nucleasedomäne der chimären DNA-Polymerase enthält eine oder mehrere Punktmutationen (einzelne Aminosäuresubstitutions- oder Deletionsmutationen), welche die 5'-Nucleaseaktivität vermindern oder ausschalten. Da die 5'-Nucleasedomäne des chimären Proteins Teile enthält, die von einer Thermus-Art-DNA-Polymerase abgeleitet sind und in den meisten Ausführungsformen von der Tma-DNA-Polymerase, können Mutationen, welche die 5'-Nucleaseaktivität erheblich vermindern oder ausschalten, entweder in den von der Thermus-Art-DNA-Polymerase stammenden Teil oder den von der Tma-DNA-Polymerase stammenden Teil eingeführt werden.
Basierend auf Aminosäure-Sequenzabgleichen sind die DNA-Polymerasen in Gruppen eingeteilt worden, bezeichnet als Familien A, B und C, gemäß der Homologie mit den E. coli-DNA-Polymerasen I, II und III (siehe zum Beispiel Ito und Braithwaite, Nucl. Acids Res. 19(15): 4045–4047. Die Tma- und Thermus-Art-DNA-Polymerasen sind Mitglieder der Familie der A-DNA-Polymerasen, welche mit der E. coli-DNA-Polymerase I verwandt sind. Aminosäuren, die unter der Familie der A-DNA-Polymerasen konserviert sind und die entscheidend für die 5'-Nucleaseaktivität der DNA-Polymerase sind, sind identifiziert worden (siehe zum Beispiel, Gutman et al., 1993, Nucl. Acids Res. 21: 4407. Aufgrund der Konservierung der Aminosäuren, welche für die 5'-Nucleaseaktivität in der Familie der A-DNA-Polymerasen entscheidend sind, ermöglicht die Identifizierung von entscheidenden Aminosäuren in einer DNA-Polymerase, wie zum Beispiel der E. coli-DNA-Polymerase I oder der Taq-DNA-Polymerase, die Identifizierung von entscheidenden Aminosäuren in anderen DNA-Polymerasen der Familie A, basierend auf einem Sequenzabgleich, wie er in den 1A und 1B bereitgestellt wird. Entscheidende Aminosäuren können in zusätzlichen Thermus-Art-DNA-Polymerasen durch einen Routine-Sequenzabgleich mit den hierin bereitgestellten Sequenzen identifiziert werden.
Aminosäuren, die als entscheidend für die 5'-Nucleaseaktivität identifiziert wurden, sind in den 1A und 1B mit einem Sternchen gekennzeichnet. Die Positionen der entscheidenden Aminosäuren innerhalb jeder DNA-Polymerase werden durch den Abgleich erhalten. Zum Beispiel sind diese entscheidenden Aminosäuren mit Bezug auf die Taq-DNA-Polymerasesequenz (SEQ ID NR: 2), wie folgt:
D18, R25, G46, D67, F73, R74, Y81, G107, E117, D119, D120, 142, D144, G187, D188, D191 und G195.
Es wäre nicht überraschend, wenn in der Zukunft zusätzliche entscheidende Aminosäuren identifiziert werden würden. Nachdem Mutationen dieser Aminosäurepositionen, wie sie hierin beschrieben sind, in einer Reduktion oder Beseitigung der 5'-Nucleaseaktivität resultieren würden, wären solche Mutationen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet.
Im Allgemeinen wird eine oder mehrere dieser Aminosäurepositionen entweder deletiert oder zu einer Aminosäure mit unterschiedlicher Eigenschaft mutiert, um die 5'-Nucleaseaktivität zu vermindern oder auszuschalten. Zum Beispiel kann eine saure Aminosäure wie Asp (D) in eine basische (Lys, Arg, His), neutrale (Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Met, Phe, Trp) oder eine polare aber nicht geladene Aminosäure (Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn oder Gln) verändert werden. Die bevorzugte G46D-Mutation substituiert das saure Asp für das polare, aber nicht geladene Gly. Im Allgemeinen werden Mutationen nach Ala oder Gly bevorzugt, um die Verformung der Proteinstruktur zu minimieren.
Substitutionsmutationen, welche die Ladungseigenschaften der Aminosäuren erhalten, können auch die 5'-Nucleaseaktivität abschwächen. Zum Beispiel beschreibt U.S. Patent 5,474,920 drei Mutationen in der Taq-DNA-Sequenz, welche die 5'-Nucleaseaktivtät vermindern oder ausschalten. Obwohl eine der Mutationen, R25C (basisch zu polar, aber nicht geladen), in einer Veränderung zu einer Aminosäure mit unterschiedlicher Eigenschaft resultiert, resultieren zwei der Mutationen, F73L (neutral zu neutral) und R74H (basisch zu basisch) nicht in einer Veränderung in der Eigenschaft. Trotzdem schwächen alle drei Mutationen die 5'-Nucleaseaktivität ab. Besonders Mutationen an jeder entscheidenden Aminosäureposition, welche die 5'-Nucleaseaktivität beeinflusst, kann routinemäßig durch Mutation der DNA-Polymerase und Messung der resultierenden Aktivität bestimmt werden. Ein sensitiver und zweckmäßiger Test wird im U.S. Patent 5,466,591 beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die 5'-Nucleasedomäne der chimären DNA-Polymerase eine Mutation, entsprechend einer G46D-Mutation in der Taq-DNA-Polymerase, welche die 5'-Nucleaseaktivität mindestens 1000-fach vermindert (siehe U.S. Patent 5,466,591).
Mutationen in der Aminosäuresequenz werden durch Einbau geeigneter Mutationen in die codierende Sequenz erzielt. Solche Mutationen in der DNA-Sequenz werden wie nachstehend genauer beschrieben unter Verwendung von Techniken durchgeführt, die im Fachgebiet gut bekannt sind.
3. Punktmutationen in der 3'- nach 5'-Exonucleasedomäne
Die 3'- nach 5'-Exonucleasedomäne der chimären DNA-Polymerase enthält eine oder mehrere Punktmutationen (einzelne Aminosäuresubstitutions- oder Deletionsmutationen), welche die 3'- nach 5'-Exonucleaseaktivität vermindern oder eliminieren. Die 3'- nach 5'-Exonucleasedomäne des chimären Proteins ist innerhalb des von der Tma-DNA-Polymerase abgeleiteten Teils enthalten. Geeignete Mutationen sind daher jene, welche die 5'-Nucleaseaktivität der Tma-DNA-Polymerase erheblich vermindern oder ausschalten.
Drei Aminosäure-„Motive", die für die 3'- nach 5'-Exonucleaseaktivität in der Tma-DNA-Polymerase, gemeinsam mit den entscheidenden Aminosäuren innerhalb jedes Motivs entscheidend sind, sind identifiziert worden (siehe U.S. Patentnummer 5,420,029). Die entscheidenden Aminosäuren werden nachstehend aufgelistet. Mutationen einer oder mehrerer dieser Aminosäuren, welche die 3'- nach 5'-Exonucleaseaktivität in der Tma-DNA-Polymerase vermindern, können in der DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Aminosäuren der Tma-DNA-Polymerase, die entscheidend für die 3'- nach 5'-Exonucleaseaktivität sind

Motiv Entscheidende Aminosäuren

A D323, E325, L329

B N385, D389, L393

C Y464, D468
Es wäre nicht überraschend, wenn zusätzliche entscheidende Aminosäuren in der Zukunft identifiziert werden würden. Nachdem Mutationen bei diesen, wie hierin beschriebenen, Aminosäurepositionen in der Verminderung oder Beseitigung der 3'- nach 5'-Exonucleaseaktivität resultieren, wären solche Mutationen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet.
Wie vorstehend für die Verminderung der 5'-Nucleaseaktivität beschrieben, wird die Verminderung oder Beseitigung der 3'- nach 5'-Exonucleaseaktivtät durch eine Substitutions- oder Deletionsmutation einer oder mehrerer dieser entscheidenden Aminosäuren erreicht, vorzugsweise einer Substitutionsmutation einer Aminosäure die eine unterschiedliche Eigenschaft aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die 3'- nach 5'-Exonucleasedomäne der Tma-DNA-Polymerase durch D323A und E325A-Mutationen mutiert, die gemeinsam die 3'- nach 5'-Exonucleaseaktivität im Wesentlichen ausschalten.
Mutationen in der Aminosäuresequenz werden durch Einbau von geeigneten Mutationen in der codierenden Gensequenz erzielt. Solche Mutationen in der DNA-Sequenz werden, wie nachstehend weiter beschrieben, unter Verwendung von im Fachgebiet gut bekannten Techniken durchgeführt.
Vorteile der DNA-Polymerase der Erfindung
Die chimäre thermostabile DNA-Polymerase der Erfindung stellt eine erhebliche Verbesserung gegenüber den in der Literatur beschriebenen thermostabilen DNA-Polymerasen dar. Im Besonderen stellt die DNA-Polymerase der Erfindung die folgende Kombination an Eigenschaften bereit:

– verbesserten Einbau der ddNTPs;
– verbesserte Gleichmäßigkeit der Peakhöhen in den DNA-Sequenzspuren, im besonderen wenn sie mit Farbstoff-markierten ddNTPs in einer Zyklus-Sequenzierungsreaktion verwendet werden;
– verminderte Rate der Pyrophosphorolyse von Farbstoff-markierten ddNTPs; und
– verbesserten Einbau von dITP.
– Darüber hinaus kann die DNA-Polymerase leicht und effizient in hoher Menge in einem rekombinanten Expressionssystem exprimiert werden und dadurch die kommerzielle Produktion des Enzyms erleichtern.

Die Kombination der Eigenschaften, welche die DNA-Polymerase der Erfindung besitzt, ist besonders in Farbstoff-Terminator-Zyklus- Sequenzierungsreaktionen nützlich und stellt erheblich verbesserte Ergebnisse bereit. Jede dieser Eigenschaften wird nachstehend besprochen.
1. Verbesserter Einbau von ddNTPs
Die chimäre DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung enthält die F730Y-Mutation, die dafür bekannt ist, dass sie die Effizienz des Einbaus der ddNTPs erhöht.
Im Vergleich dazu ist die AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS eine mutierte Form der Taq-DNA-Polymerase, welche die analoge Mutation enthält (F667Y). AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS weist eine erhöhte Einbaueffizienz der ddNTPs auf, es fehlen ihr aber mehrere der anderen Eigenschaften, die von der DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung gezeigt werden.
2. Verbesserte Gleichmäßigkeit von Peakhöhen in DNA-Sequenzierungsspuren
Eine vorteilhafte Eigenschaft der DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung ist, dass sie in einheitlichen Peakhöhen in dem Sequenzierungsspuren resultiert, wenn sie in einer Farbstoff-Terminator-Zyklus-Sequenzierungsreaktion verwendet wird (auch als Chromatogramme oder Elektropherogramme bezeichnet). Ungleichmäßige Peakhöhen können die Genauigkeit der Basenbenennung vermindern und den Mutations- und Polymorphismus-Nachweis schwieriger gestalten.
Ungleichmäßigkeit der Peakhöhen in der Farbstoff-Terminator-Zyklus-Sequenzierungsreaktion ist ein Problem, das noch nicht gelöst worden war. Zum Beispiel sind die in den Farbstoff-Terminator-Sequenzierungsreaktionen erhaltenen Peakhöhenmuster uneinheitlich, obwohl AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS ddNTPs effizienter einbaut, als nicht-mutierte Taq-DNA-Polymerase (siehe Parker et al., 1996, BioTechniques 21(4): 694–699. Die Ungleichmäßigkeit resultiert zumindest teilweise in einer Abhängigkeit von Peakhöhen auf den Sequenzinhalt. Zum Beispiel kann die von einem G nach einem A erhaltene Peakhöhe überaus klein sein, was exakte Basenbestimmung schwierig macht. Umgekehrt kann die Höhe, welche von einem A nach einem G erhalten wird, sehr hoch sein. Besonders problematische Muster schließen G nach A oder C, A nach A oder C und T nach T ein, welche in sehr niedrigen Peakhöhen resultieren können. Sehr hohe Peakhöhen, wie zum Beispiel Ergebnisse von A nach G, sind alleine weniger problematisch, können aber benachbarte niedrige Signale unlesbar machen.
Wie in diesen Beispielen gezeigt, resultiert die Verwendung der chimären DNA-Polymerase der Erfindung in Zyklus-Sequenzierungsreaktionen in erheblich einheitlicheren Peakhöhen, als jenen, die mit AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS erhalten wurden. Die verbesserte Gleichmäßigkeit der Peakhöhen resultiert in einer wesentlichen Erhöhung der Genauigkeit der Basenbestimmung und macht den Mutations- und Polymorphismusnachweis leichter.
3. Verminderte Geschwindigkeit der Pyrophosghorolyse von Farbstoff-markierten ddNTPs
DNA-Polymerasen katalysieren den Matrizen-abhängigen Einbau einer Desoxynucleotids an den 3'-Hydroxyterminus eines Primers, mit der gleichzeitigen Freisetzung von anorganischem Pyrophosphat (PPi). Diese Polymerisationsreaktion ist reversibel. DNA-Polymerasen können auch die umgekehrte Reaktion, Pyrophosphorolyse, katalysieren, das ist der Abbau von DNA in der Anwesenheit von PPi. Die Reaktion wird nachstehend zusammengefasst: DNA + dNTP <-> DNAn+1 + PPi
Anorganische Pyrophosphatase (PPase), die auch als Pyrophosphat-Phosphohydrolase bekannt ist, katalysiert die Hydrolyse von anorganischem Pyrophosphat (PPi) zu zwei Molekülen von Orthophosphat. PPase spielt in der RNA und DNA-Synthese in vivo eine zentrale Rolle. Durch Spaltung von PPi verschiebt dieses Enzym das gesamte Gleichgewicht zugunsten der Synthese.
Pyrophosphorolyse kann für DNA-Sequenzierungsreaktionen schädlich sein. Die Genauigkeit der DNA-Sequenzierungsreaktionen hängt von genauen Bandpositionen ab, eine Verminderung der Größe von nur einem Nucleotid kann in Gelartifakten, wie zum Beispiel verminderten oder fehlenden Banden resultieren. Pyrophosphorolyse resultiert in der Entfernung von Basen vom 3'-Ende des Primer-Verlängerungsproduktes. Darüber hinaus ermöglicht die Entfernung der eingebauten terminalen ddNMP (Didesoxynucleosid-Monophosphat) von einem mit ddNMP beendeten Fragment, die anschließende Verlängerung, was zur Verminderung der Signalstärke an der betroffenen Position und einem verminderten oder fehlenden Peak im Elektropherogramm führt.
Es ist daher wünschenswert, die Pyrophosphorolysereaktion in Sequenzierungsreaktionen zu minimieren. Das Hinzufügen von PPase zur Reaktion verschiebt das gesamte Gleichgewicht zugunsten der Synthese durch Spaltung von PPi. Die Verwendung von PPase zur Verbesserung der Sequenzierungsreaktionen wird in Tabor und Richardson, 1990, J. Biol. Chem. 265(14): 8322–8328; und in PCT-Patentveröffentlichungsnummer WO 90/12111 beschrieben. Die im Handel erhältlichen Zyklus-Sequenzierungskits von Perkin Elmer (Norwalk, CT), welche AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS enthalten, beinhalten PPase zur Reduktion der Pyrophosphorolyse.
Überraschenderweise werden die Zyklus-Sequenzierungsreaktionen unter Verwendung der DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung durch Pyrophosphorolyse der Farbstoff-markierten ddNTP-Terminatoren viel weniger beeinflusst. Wie in den Beispielen beschrieben, ergaben die mit einer Reihe von PPase-Konzentrationen von 0 bis 20 Einheiten durchgeführten Zyklus-Sequenzierungsreaktionen im Wesentlichen identische Ergebnisse. Die DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung scheint das Erfordernis für PPase in den Zyklus-Sequenzierungsreaktionen daher stark zu reduzieren.
4. Verbesserter Einbau von dITP
In einer typischen Zyklus-Sequenzierungsreaktion wird dITP statt dGTP verwendet, um die Kompressionen in G/C-reichen Bereichen zu vermindern. Der Einbau von dITP in DNA vermindert die Denaturierungstemperatur und erleichtert die Denaturierung der Sekundärstruktur. Da DNA-Polymerasen dITP benachteiligen, welches ein unkonventionelles Nucleotid ist, muss die dITP-Konzentration in einer Reaktion wesentlich erhöht werden, um einen ausreichenden Einbau zu erhalten. Zum Beispiel ist dITP in für AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS optimierten Reaktionsbedingungen in fünffach höheren Konzentrationen vorhanden, als die Konzentrationen für dATP, dCTP und dTTP.
Im Gegensatz dazu baut die DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung dITP effizienter ein, was ermöglicht, dass die Reaktion bei einheitlichen dNTP-Konzentrationen durchgeführt wird. Wie in den Beispielen beschrieben, ist nur eine zwei- bis dreifach höhere dITP-Konzentration wie die Konzentration von dATP, dCTP und dTTP für die DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung optimal.
5. Expressionseffizienz
Wie vorstehend beschrieben, ist das chimäre Enzym der vorliegenden Erfindung eine mutierte Tma-DNA-Polymerase, wobei die 5'-Nucleasedomäne durch die abgeglichene Domäne von einer Thermus-Art-DNA-Polymerase ersetzt wurde. Das Enzym wird von einem chimären Gen exprimiert, welches ein mutiertes Tma-DNA-Polymerasegen ist, wobei der Genbereich, der die 5'-Nucleasedomäne codiert durch den abgeglichen Bereich des Thermus-Art-DNA-Polymerasegens ersetzt worden ist. Ein erheblicher Vorteil des chimären Gens ist es, dass es die Expression einer Volllängen-DNA-Polymerase in einem rekombinanten Expressionssystem effizienter ermöglicht, als es vom Tma-DNA-Polymerasegen möglich ist.
Die Expression einer Volllängen-DNA-Polymerase von einem rekombinanten Expressionssystem, welches eine natürliche Volllängen-Tma-DNA-Polymerase-Gensequenz enthält, ist aufgrund der bevorzugten Expression einer verkürzten Proteinform problematisch (siehe U.S. Patentnummer 5,420,029). Das verkürzte Protein, das als Met140Tma bezeichnet wird, besteht aus den Aminosäuren 140–893 des Volllängenproteins und scheint aus der Translation, beginnend am Methionin an Position 140, zu resultieren. Die Anwesenheit einer mutmaßlichen Ribosomenbindungsstelle bei Codon 133–137 weist ferner darauf hin, dass das verkürzte Protein aus einer Translation, beginnend beim internen Methionin resultiert. Die bevorzugte Expression des verkürzten Met140Tma-Proteins stellt eine erhebliche Schwierigkeit in der Expression und Reinigung einer Volllängen Tma-DNA-Polymerase dar.
Das chimäre DNA-Polymerasegen enthält eine Thermus-Art-DNA-Polymerasegensequenz in einem Bereich, der mindestens bis einschließlich der alternativen Ribosomenbindungsstelle, die in dem Volllängen-Tma-DNA-Polymerasegen etwa bei den Codons 133–137 liegt, und vorzugsweise bis einschließlich dem internen Startcodon, Codon 140, abgeglichen ist. Die Tma-DNA-Polymerase-Gensequenz, bis einschließlich dem Bereich, der die Ribosomenbindungsstelle enthält und vorzugsweise das für die Translation von Met140Tma verantwortliche Startcodon, wird durch den abgeglichenen Bereich eines Thermus-Art-DNA-Polymerasegens ersetzt. Der abgeglichene Bereich eines Thermus-Art-DNA-Polymerasegens sorgt nicht für eine unerwünschte interne Initiation des verkürzten Proteins. Als ein Ergebnis exprimiert ein rekombinantes Expressionssystem, welches das chimäre DNA-Polymerasegen enthält, ausschließlich eine chimäre Volllängen-DNA-Polymerase.
Herstellung der DNA-Polymerase der Erfindung
Die DNA-Polymerase der Erfindung ist ein chimäres Enzym, das aus einem von der Thermus-Art-DNA-Polymerase abgeleiteten Teil und einem von der Tma-DNA-Polymerase abgeleiteten Teil besteht. Das chimäre Enzym wird von einem chimären Gen erzeugt, d.h. einer DNA, die das chimäre Enzym codiert und aus einem vom Thermus-Art-DNA-Polymerasegen abgeleiteten Teil und einem vom Tma-DNA-Polymerasegen abgeleiteten Teil besteht. Das chimäre Gen wird, wie nachstehend genau beschrieben, vom Thermus-Art-DNA-Polymerasegen und vom Tma-DNA-Polymerasegen unter Verwendung von im Fachgebiet der Molekularbiologie gut bekannten Standard-Genmanipulationstechniken erzeugt.
Das die Tma-DNA-Polymerase codierende Gen ist in den U.S. Patentnummern 5,420,029 und 5,466,591 beschrieben. Die Nucleotidsequenz des Tma-DNA-Polymerasegens, sowie auch die gesamte Aminosäuresequenz des codierenden Proteins, werden darin beschrieben. Beispiel 5 des '029 Patents beschreibt die Konstruktion einer Vielzahl an Plasmiden, welche das Volllängen Tma-DNA-Polymerasegen enthalten, beginnend mit den Plasmiden pTma01 (hinterlegt als Escherichia coli DG101, pBSM-TmaXma7-1 mit der ATCC-Nummer 68471 am 7. November 1990; wieder hinterlegt als ATCC-Nummer 98764, am 22. Mai 1998) und pTma04 (hinterlegt als Escherichia coli DG101, pBSM:TmaXma11-1delta Ba/Bg1, unter der ATCC-Nummer 68472 am 7. November 1990; wieder hinterlegt als ATCC-Nummer 98765, am 22. Mai 1998), sowie auch die Plasmide pTma12-1 und pTma13. Jeder dieser Expressionsvektoren ist als eine Quelle des Tma-DNA-Polymerasegens geeignet.
Gene, die DNA-Polymerasen von etlichen Thermus-Arten codieren, einschließlich der Nucleotidsequenz des DNA-Polymerasegens und der Aminosäuresequenz des codierenden Proteins, sind beschrieben worden. Etliche dieser Gene sind von öffentlich zur Verfügung stehenden Plasmiden erhältlich. Die Gene von zusätzlichen Thermus-Arten sind vom Wirtsorganismus unter Verwendung der in den U.S. Patentnummern 5,079,352; 5,618,711; 5,455,170; 5,405,774 und 5,466,591 beschriebenen Verfahren erhältlich.
Das die Taq-DNA-Polymerase codierende Gen, wird in den U.S. Patentnummern 5,079,352 und 5,466,591 beschrieben. Die Nucleotidsequenz des Taq-DNA-Polymerasegens, sowie die gesamte Aminosäuresequenz des codierten Proteins, werden darin beschrieben. Beispiele V–VII des '352-Patentes beschreiben die Konstruktion einer Vielzahl von Expressionsplasmiden, die das Volllängen-Taq-DNA-Polymerasegen enthalten, beginnend mit den Plasmiden pFC83, ATCC-Nummer 67422, hinterlegt am 29. Mai 1987; wieder hinterlegt als ATCC-Nummer 98763, am 22. Mai 1998) und pFC85 (ATCC-Nummer 67421, hinterlegt am 29. Mai 1987; wieder hinterlegt als ATCC-Nummer 98762, am 22. Mai 1998), sowie auch die Plasmide pLSP1, pLSG2, pSYC1578, pLSG5 und pLSG6. Jeder dieser Expressionsvektoren ist als eine Quelle des Taq-DNA-Polymerasegens geeignet.
Das die Tth-DNA-Polymerase codierende Gen, Verfahren zum Erhalt des Gens, sowie Expressionsplasmide, die das Gen enthalten, werden in den U.S. Patentnummern 5,618,711 und 5,466,591 beschrieben.
Das die TZ05-DNA-Polymerase codierende Gen, Verfahren zum Erhalt des Gens, sowie Expressionsplasmide, die das Gen enthalten, werden in den U.S. Patentnummern 5,455,170 und 5,466,591 beschrieben.
Das die Tsps17-DNA-Polymerase codierende Gen, Verfahren zum Erhalt des Gens, sowie Expressionsplasmide, die das Gen enthalten, werden in den U.S. Patentnummern 5,405,774 und 5,466,591 beschrieben.
Das Tfl-DNA-Polymerasegen wird in Akhmetzjanov und Vakhitov, 1992, Nucleic Acids Research 20(21): 5839 beschrieben.
Das Tfi-DNA-Polymerasegen kann von ATCC 43280 unter Verwendung der Verfahren wiedergefunden werden, die in den Patenten beschrieben sind auf die verwiesen wurde (siehe auch 1984, FEMS Microbiol. Lett. 22: 149–153 (1984)).
Das Tca-DNA-Polymerasegen wird in Know, 1997, Mol. Cells 7(2): 264–271 beschrieben; und die Nucleotidsequenz ist unter der EMBL/GenBank Hinterlegungsnummer U62584 erhältlich.
Weitere Thermus-Art-DNA-Polymerasegene können unter Verwendung von Techniken wiedergefunden werden, die in den vorstehend zitierten Patenten von den folgenden ATCC-Hinterlegungen beschrieben werden: ATCC 43814 und 43815 (siehe Alfredsson, 1986, Appl. Environ. Microbiol. 52: 1313–1316); ATCC 27978 (siehe Ramaley, 1970, J. Bacteriol. 114: 556–562; 1973; ebenda 103: 527–528); ATCC 31674 (siehe U.S. Patentnummern 4.442.214 und 4.480.036); ATCC 35948 (T. ruber, siehe Loginova, 1984, Int. J. Syst. Bacteriol. 34: 498–499)).
Weitere Thermus-Arten können unter Verwendung von Techniken wiedergefunden werden, die in den vorstehend zitierten Patenten der folgenden Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM)-Hinterlegungen beschrieben werden: DSM: 1279 (NUM: 2244) (siehe Loginova, et al., 1975, Izv. Akad. Nauk SSSR Ser. Biol.: 304–307); DSM: 579; DSM 625 (NUM: 2248) (siehe Degryse et al., 1978, Arch. Microbiol. 189: 196); DSM: 1279; (NUM: 3844) (siehe Loginova et al., 1984, Int. J. Syst. Bacteriol.: 498–499); und DSM: 625 (NUM: 1002) (siehe Brock und Freeze, 1969, J. Bacteriol.: 289–297).
Weitere Thermus-Arten schließen T. oshimai ein (siehe Williams et al., 1996, Int. J. Syst. Bacteriol. 46(2): 403–408); T. silvanus und T. chliarophilus (siehe Tenreiro et al., 1995, Int. J. Syst. Bacteriol. 45(4): 633–639); T. scotoductus (siehe Tenreiro et al., 1995, Res. Microbiol. 146(4): 315–324); und T. ruber (siehe Shadrina et al., 1982, Mikrobiologiia 51(4): 611–615).
Nach der hierin bereitgestellten Anleitung und unter Verwendung von ausschließlich gut bekannten Techniken, wird ein Fachmann im Stande sein die DNA-Polymerasegene aus einer beliebigen Zahl an Expressionsvektoren zu erzeugen, welche ein chimäres, für die Expression der chimären DNA-Polymerase geeignetes Gen der Erfindung in jedem einer Vielzahl von Wirtssystemen enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht das chimäre Enzym der Erfindung aus Aminosäuren 1–190 der Taq-DNA-Polymerase und den Aminosäuren 191–893 der Tma-DNA-Polymerase, beide Bereiche sind in geeigneter Weise mutiert, um assoziierte Exonucleaseaktivität zu eliminieren. Diese bevorzugte Ausführungsform kann direkt von den Taq-DNA-Polymerase- und Tma-DNA-Polymerasegenen konstruiert werden, welche entweder von den vorstehen beschriebenen, hinterlegten Plasmiden oder aus Wirtsorganismen gewonnen werden. Solche chimäre DNA-Polymerasen können jedoch am leichtesten vom Plasmid pUC18:Tma25 konstruiert werden, welches bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 98443 am 18. Mai 1997 hinterlegt wurde.
Plasmid pUC18:Tma25 enthält ein chimäres Gen, welches ein chimäres Protein codiert, bestehend aus den Aminosäuren 1–190 der Taq-DNA-Polymerase und den Aminosäuren 191–893 der Tma-DNA-Polymerase. Das durch pUC18:Tma25 codierte chimäre Protein enthält die G46D-Mutation im Anteil der Taq-DNA-Polymerase. Die Nucleotidsequenz des chimären Gens von pUC18:Tma25 wird als SEQ ID NR: 9 bereitgestellt.
Geeignete Expressionssysteme werden von pUC18:Tma25 durch Subclonierung des chimären Gens in einen geeigneten Expressionsvektor konstruiert, wobei ein oder mehrere Punktmutationen eingeführt werden, welche die 3'- nach 5'-Exonucleaseaktivtät des codierten Proteins abschwächen oder ausschalten und die F730Y-Mutation in den Tma-DNA-Polymeraseanteil einführen. Die Konstruktion eines bevorzugen Expressionssystems, welches ein chimäres Protein codiert, das eine G46D-Mutation in der 5'-Nucleasedomäne, D323A und E325A-Mutationen in der 3'- nach 5'-Exonucleasedomäne und eine F730Y-Mutation im Tma-DNA-Polymeraseanteil aufweist, wird in den Beispielen beschrieben.
Die Nucleotidsequenz von pUC18:Tma25, welche die Aminosäuren 1–190 der Taq-DNA-Polymerase codiert, wurde von Plasmid pRDA3-2 abgeleitet, beschrieben in der U.S. Patentnummer 5,466,591 und codiert daher eine Aminosäuresequenz, welche die darin beschriebene G46D-Mutation enthält. Die Nucleotidsequenz von pRDA3-2 und daher pUC18:Tma25, enthält in Bezug auf die native Taq-DNA-Polymerase-Gensequenz (SEQ ID NR: 9) auch zusätzliche Mutationen, die stumm sind, d.h. die codierte Aminosäure nicht ändern.
Aufgrund der Redundanz des genetischen Codes, codieren eine große Zahl an DNA-Sequenzen üblicherweise eine bestimmte Aminosäuresequenz und sind in diesem Sinne äquivalent. Wie nachstehend beschrieben, kann es wünschenswert sein, die eine oder andere äquivalente DNA-Sequenz zur Verwendung in einem Expressionsvektor auszuwählen, basierend auf der bevorzugten Codonverwendung der Wirtszelle, in welchen der Expressionsvektor inseriert wird. Die vorliegende Erfindung ist dafür vorgesehen, alle DNA-Sequenzen zu umfassen, welche das chimäre Enzym codieren. Die chimären Gene der vorliegenden Erfindung sind nicht darauf beschränkt nur Sequenzen von Wildtyp-Thermus-Arten und Tma-DNA- Polymerasegenen zu enthalten, sondern können jede der DNA-Sequenzen enthalten, die eine chimäre DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung codieren.
Die Produktion des Enzyms der Erfindung wird unter Verwendung eines rekombinanten Expressionsclons durchgeführt. Die Konstruktion des rekombinanten Expressionsclons, die Transformation der Wirtszelle mit dem Expressionsclon und die Züchtung der transformierten Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Expression fördern, kann in einer Vielzahl von Arten unter Verwendung von im Fachgebiet gut verstandenen Techniken der Molekularbiologie durchgeführt werden. Verfahren für jeden dieser Schritte werden nachstehend allgemein beschrieben. Bevorzugte Verfahren werden in den Beispielen ausführlich beschrieben.
Ein funktionsfähiger Expressionsclon wird durch Platzierung der Codierungssequenz in funktionsfähiger Verbindung mit geeigneten Kontrollsequenzen in einen Expressionsvektor konstruiert. Der Vektor kann so geplant sein, dass er in der Zelle autonom repliziert oder in die chromosomale DNA der Wirtszelle integriert. Der daraus resultierende Clon wird verwendet, um einen geeigneten Wirt zu transformieren und der transformierte Wirt wird unter Bedingungen gezüchtet, die für die Expression der codierenden Sequenz geeignet sind. Das exprimierte Protein wird vom Medium oder von den Zellen isoliert, obwohl Rückgewinnung und Reinigung des Proteins in manchen Fällen nicht notwendig sein muss.
Die Konstruktion von geeigneten Clonen, welche die Codierungsequenz und eine Kontrollsequenz enthalten, setzt Standard-Ligations- und Restriktionstechniken ein, die im Fachgebiet gut verstanden werden. Im Allgemeinen werden isolierte Plasmide, DNA-Sequenzen oder synthetisierte Oligonucleotide gespalten, modifiziert und in der gewünschten Form wieder ligiert. Geeignete Restriktionsstellen können, falls sie normalerweise nicht vorhanden sind, an das Ende der Codierungssequenz hinzugefügt werden, um die Konstruktion eines Expressionsclons zu erleichtern.
Ortsspezifische DNA-Spaltung wird durch Behandlung mit einem geeigneten Restriktionsenzym (oder Enzymen) unter Bedingungen durchgeführt, die generell im Fachgebiet verstanden werden und von den Herstellern von im Handel erhältlichen Restriktionsenzymen vorgegeben sind. Siehe z.B. Produkt-Kataloge von Amersham (Arlington Heights, IL), Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) und New England Biolabs (Beverley, MA). Im Allgemeinen wird etwa 1 μg an Plasmid oder anderer DNA durch eine Einheit an Enzym in etwa 20 μl Pufferlösung gespalten; in den nachstehenden Beispielen wird im Allgemeinen ein Überschuss an Restriktionsenzym verwendet, um sicherzustellen, dass die Spaltung der DNA vollständig ist. Inkubationszeiten von etwa ein bis zwei Stunden bei einer Temperatur, die für ein bestimmtes Enzym optimal ist, sind üblich. Nach jeder Inkubation wird das Protein durch Extraktion mit Phenol und Chloroform entfernt; An diese Extraktion kann durch Ether-Extraktion und Rückgewinnung der DNA von den wässrigen Fraktionen durch Ausfällung mit Ethanol angeschlossen werden. Falls gewünscht kann die Größenauftrennung der gespaltenen Fragmente durch Polyacrylamidgel- oder Agarosegelelektrophorese unter Verwendung von Standardtechniken durchgeführt werden. Siehe z.B. Maxam et al., Methods in Enzymology, 1980, 65: 499–500.
Restriktions-gespaltene Fragmente mit einzelsträngigen „überhängenden" Enden können durch Behandlung mit dem großen Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I (Klenow), in der Anwesenheit der vier Desoxynucleosid-Triphosphate (dNTPs) unter Verwendung von Inkubationszeiten von etwa 15 bis 25 Minuten, bei 20°C bis 25°C in 50 mM Tris, pH-Wert 7,6, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT und 5 bis 10 μM dNTPs mit glatten Enden versehen werden (doppelsträngigen Enden). Das Klenow-Fragment füllt bei 5'-überhängenden Enden auf, entfernt aber 3'-überhängende Stränge auch wenn die vier dNTPs vorhanden sind. Falls nötig, kann durch Bereitstellung von einem oder mehreren ausgewählten dNTPs, innerhalb der durch die Natur der überhängenden Enden diktierten Limitierungen, Reparatur durchgeführt werden. Nach der Behandlung mit Klenow, wird das Gemisch mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt. Ähnliche Ergebnisse können unter Verwendung von S1-Nuclease erzielt werden, da die Behandlung mit S1-Nuclease unter geeigneten Bedingungen in der Hydrolyse jedes einzelsträngigen Teils einer Nucleinsäure resultiert.
Ligationen werden in 15–30 μl Volumen unter den folgenden Standardbedingungen und Temperaturen durchgeführt: 20 mM Tris-Cl, pH-Wert 7,5, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 33 μg/ml Rinderserumalbumin und entweder 40 μM ATP und 0,01–0,2 (Weiss) Einheiten T4 DNA-Ligase bei 0°C (für Ligation von Fragmenten mit komplementären einzelsträngigen Enden), oder 1 mM ATP in 0,3–0,6 Einheiten T4 DNA-Ligase bei 14°C (für Ligation von „glatten Enden"). Intermolekulare Ligationen von Fragmenten mit komplementären Enden werden gewöhnlich bei DNA-Gesamtkonzentrationen (5–100 nM Gesamtkonzentration der Enden) von 33–100 μg/ml durchgeführt. Intermolekulare Ligationen von glatten Enden (die gewöhnlich einen 20–30-fachen molaren Überschuss an Linkern einsetzt, wahlweise) werden bei einer Gesamtkonzentration der Enden von 1 μM durchgeführt.
In der Vektorkonstruktion wird das Vektorfragment üblicherweise mit bakterieller oder Alkalischer Phosphatase aus dem Kälberdarm (BAP oder CIAP) behandelt, um das 5'-Phosphat zu entfernen und die Religation und Rekonstruktion des Vektors zu verhindern. Die Spaltungsbedingungen von BAP und CIAP sind im Fachgebiet gut bekannt und veröffentlichte Protokolle sind gewöhnlich den im Handel erhältlichen BAP und CIAP-Enzymen beigelegt. Um die Nucleinsäurefragmente wiederzufinden, wird die Erzeugung mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol ausgefällt, um die Phosphatase zu entfernen und die DNA zu reinigen. Alternativ kann die Religation von unerwünschten Vektorfragmenten durch Restriktionsenzymspaltung vor oder nach der Ligation verhindert werden, wenn geeignete Restriktionsstellen vorliegen.
In den nachstehend dargelegten Konstruktionen werden die richtigen Ligationen für Plasmidkonstruktionen bestätigt, indem zuerst ein geeigneter Wirt, wie zum Beispiel der E. coli Stamm DG101 (ATCC 47043) oder der E. coli Stamm DG116 (ATCC 53606) mit dem Ligationsgemisch transformiert wird. Erfolgreiche Transformanten werden wie es im Fachgebiet verstanden wird, durch Ampicillin, Tetracyclin oder andere antibiotische Resistenz oder Sensitivität oder durch Verwendung anderer Marker, abhängig von der Art der Plasmidkonstruktion, ausgewählt. Plasmide von den Transformanten werden dann gemäß dem Verfahren von Clewell et al., 1969, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62: 1159, erzeugt, wahlweise nach einer Chloramphenicol-Amplifikation (Clewell, 1972, J. Bacteriol. 110: 667). Alternativ kann Plasmid-DNA unter Verwendung des „Säure-Basen"-Extraktionsverfahren auf Seite 11 der Bethesda Research Laboratories Veröffentlichung Focus 5 (2) erzeugt werden und sehr reine Plasmid-DNA kann erhalten werden, indem die Schritte 12 bis einschließlich 17 des Protokolls durch CsCl/Ethidiumbromid-Ultrazentrifugation der DNA ersetzt werden. Die isolierte DNA wird durch Restriktionsenzymspaltung und/oder durch das Didesoxy-Verfahren von Sanger et al., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463 wie ferner von Messing et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9: 309, oder durch das Verfahren von Maxam et al., 1980, Methods in Enzymolopy 65: 499, beschrieben analysiert.
Die Kontrollsequenzen, Expressionsvektoren und Transformationsverfahren sind von der Wirtszellart abhängig die verwendet wird, um das Gen zu exprimieren. Im Allgemeinen werden prokaryontische-, Hefe-, Insekten- oder Säugerzellen als Wirte verwendet. Prokaryontische Wirte sind generell am effizientesten und am zweckmäßigsten für die Produktion von rekombinanten Proteinen und werden daher für die Expression des Proteins bevorzugt.
Der am häufigsten zur Expression von rekombinanten Proteinen verwendete Prokaryont ist E. coli. Es können jedoch auch andere Stämme als E. coli, wie zum Beispiel Bacillen, zur rekombinanten Expression des Proteins verwendet werden, zum Beispiel Bacillus subtilis, verschiedenste Arten von Pseudomonas und andere bakterielle Stämme. In solchen prokaryontischen Systemen werden üblicherweise Plasmidvektoren verwendet, die Replikationsstellen und Kontrollsequenzen, abgeleitet vom Wirt oder einer Art, die mit dem Wirt kompatibel ist, enthalten.
Zur Expression von Konstrukten unter der Kontrolle der meisten bakteriellen Promotoren, kann der E. coli Stamm MM294, erhalten vom E. coli Genetic Stock Center unter GCSC #6135, als der Wirt verwendet werden. Für Expressionsvektoren mit der P_LN_RBS oder P_LT_RBS-Kontrollsequenz, kann das Lambda-Lysogen des E. coli K12-Stammes MC1000, N₇N₅₃cI857 SusP₈₀, ATCC 39531, verwendet werden. E. coli DG116, der bei der ATCC (ATCC 53606) am 7. April 1987 hinterlegt wurde und E. coli KB2, der bei der ATCC (ATCC 53075) am 29. März 1985 hinterlegt wurde, sind auch als Wirtszellen nützlich. Für M13 Phagen-Rekobinanten werden E. coli Stämme eingesetzt, wie zum Beispiel der E. coli K12-Stamm DG98 (ATCC 39768), die für Phageninfektion empfänglich sind. Der DG98-Stamm wurde bei der ATCC am 13. Juli 1984 hinterlegt.
Zum Beispiel wird E. coli üblicherweise unter Verwendung von Derivaten von pBR322, beschrieben von Bolivar et al., 1977, Gene 2: 95, transformiert. Plasmid pBR322 enthält Gene für Ampicillin- und Tetracyclinresistenz. Diese Arzneimittelresistenzmarker können durch Konstruktion des gewünschten Vektors entweder beibehalten oder zerstört werden und so beim Nachweis der Anwesenheit einer gewünschten Rekombinante helfen. Häufig verwendete prokaryontische Kontrollsequenzen z.B. ein Promotor für die Transkriptionsinitiation, wahlweise mit einem Operator, gemeinsam mit einer Ribosomenbindungsstellensequenz, schließen die β-Lactamase (Penicillininase) und Lactose (lac)-Promotorsysteme ein (Chang et al., 1977, Nature 198: 1056), das Tryptophan (trp)-Promotorsystem (Goeddel et al., 1980, Nucl. Acids Res. 8: 4057) und der von Lambda abgeleitete P_L-Promotor (Shimatake et al., 1981, Nature 292: 128) und die Gen-N-Ribosomen-Bindungsstelle (N_RBS). Eine übertragbare Kontroll-Systemkassette wird in der am 8. Dezember 1987 herausgegebenen U.S. Patentnummer 4,711,845 dargelegt. Diese Kassette umfasst einen PI-Promotor, der mit der N_RBS funktionsfähig verbunden ist, die wiederum stromaufwärts von einer dritten DNA-Sequenz positioniert ist, welche mindestens eine Restriktionsstelle aufweist, welche die Spaltung innerhalb von sechs Basenpaaren 3' von der N_RBS-Sequenz erlaubt. Ebenso nützlich ist die von Chang et al., in der europäischen Patentveröffentlichungsnummer 196.864 beschriebene Phosphatase A (phoA)-System, veröffentlicht am 8. Oktober 1986. Jedes erhältliche und mit Prokaryonten kompatible Promotorsystem kann jedoch zur Konstruktion eines Expressionsvektors der Erfindung verwendet werden.
Zusätzlich zu Bakterien, können auch eukaryontische Mikroben, wie zum Beispiel Hefe, als rekombinante Wirtszellen verwendet werden. Laborstämme von Saccharomyces cerevisiae, Bäckerhefe, werden häufig verwendet, obwohl etliche andere Stämme allgemein erhältlich sind. Während Vektoren gebräuchlich sind, die den 2-Mikron-Replikationsursprung verwenden (Broach, 1983, Meth. Enz. 101: 307), sind andere für die Hefeexpression geeignete Plasmidvektoren bekannt (siehe zum Beispiel Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39; Tschempe et al., 1980, Gene 10: 157; und Clarke et al., 1983, Meth. Enz. 101: 300). Kontrollsequenzen für Hefevektoren schließen Promotoren für die Synthese von glykolytischen Enzymen ein (Hess et al., 1968, J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149; Holland et al., 1978, Biotechnology 17: 4900; und Holland et al., 1981, J. Biol. Chem. 256: 1385). Zusätzliche im Fachgebiet bekannte Promotoren schließen den Promotor für die 3-Phosphoglyceratkinase ein (Hitzeman et al., 1980, J. Biol. Chem. 255: 2073) und für andere glykolytische Enzyme wie zum Beispiel Glyceraldehyd 3-Phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyrovat-Decarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvat-Kinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase. Andere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil einer über Wachstumsbedingungen kontrollierten Transkription aufweisen, sind die Promotorregionen für Alkohol-Dehydrogenase 2, Isocytochrom C, saure Phosphatase, Abbauenzyme, die mit dem Stickstoffmetabolismus in Verbindung stehen und Enzyme die für Maltose- und Galactose-Nutzung verantwortlich sind (Holland, vorstehend).
Terminatorsequenzen können auch verwendet werden, um die Expression zu verstärken, wenn sie an das 3'-Ende der Codierungssequenzen platziert werden. Solche Terminatoren werden in den 3' nicht-translatierten Bereichen nach den Codierungssequenzen in von Hefe stammenden Genen beobachtet. Jeder Vektor, der einen Hefe-kompatiblen Promotor, Replikationsursprung und andere Kontrollsequenzen aufweist, ist zur Verwendung in der Konstruktion von Hefe-Expressionsvektoren geeignet.
Die Codierungssequenzen können auch in eukaryontischen Wirtszellkulturen exprimiert werden, die von multizellulären Organismen stammen. Siehe zum Beispiel Tissue Culture, Academic Press, Cruz und Patterson, Herausgeber (1973). Nützliche Wirtszelllinien umfassen COS-7, COS-A2, CV-1, Mäusezellen wie zum Beispiel die Mäuse-Myelome N51 und VERO, HeLa-Zellen, und Chinesische Hamster Ovar (CHO)-Zellen. Expressionsvektoren für solche Zellen schließen normalerweise Promotoren und Kontrollsequenzen ein, die mit Säugerzellen kompatibel sind, wie zum Beispiel die herkömmlich verwendeten frühen und späten Promotoren des Simian Virus 40 (SV40) (Fiers et al., 1978, Nature 273: 113) oder andere virale Promotoren wie zum Beispiel jene, die von Polyoma, Adenovirus 2, Rinder-Papillomavirus (BPV) oder Avian Sarcomaviren oder Immunglobulinpromotoren und Hitzeschockpromotoren abgeleitet sind. Ein System zur Expression von DNA in Säugersystemen, welches ein Rinder-Papillomavirus-Vektorsystem verwendet, wird in der U.S. Patentnummer 4,419,446 beschrieben. Eine Modifikation dieses Systems ist in U.S. Patentnummer 4,601,978 beschrieben. Allgemeine Aspekte von Säugerzell-Wirtsystemtransformationen sind von Axel, U.S. Patentnummer 4.399.216 beschrieben worden. „Enhancer"-Regionen sind bei der Optimierung der Expression auch wichtig; diese sind im Allgemeinen Sequenzen, die stromaufwärts vom Promotorbereich gefunden werden. Replikationsursprünge können, falls sie benötigt werden, von viralen Quellen erhalten werden. Integration in das Chromosom ist jedoch ein häufiger Mechanismus für die DNA-Replikation in Eukaryonten.
Pflanzenzellen können auch als Wirte verwendet werden und Kontrollsequenzen, die mit Pflanzenzellen kompatibel sind, wie zum Beispiel der Nopalin-Synthasepromotor und die Polyadenylierungs-Signalsequenzen (Depicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Gen. 1: 561) sind erhältlich. Expressionssysteme, die Insektenzellen einsetzen, die das durch Baculovirus-Vektoren bereitgestellte Kontrollsystem nützen, sind auch beschrieben worden (Miller et al., in Genetic Engineering (1986), Setlow et al., Hrsg. Plenum Publishing, Bd. 8, Seiten 277–297). Auf Insektenzellen basierende Expression kann in Spodoptera frugipeida bewerkstelligt werden. Diese Systeme sind auch in der Herstellung von rekombinanten Enzymen erfolgreich.
Abhängig von der verwendeten Wirtszelle, wird die Transformation unter Verwendung von für diese Zellen angebrachten Standardtechniken durchgeführt. Die Calziumbehandlung, die wie beschrieben von Cohen, 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110 Calciumchlorid einsetzt, wird für Prokaryonten oder andere Zellen verwendet, welche beträchtliche Zellwandbarrieren aufweisen. Infektion mit Agrobacterium tumefaciens (Shaw et al., 1983, Gene 23: 315) wird für bestimmte Pflanzenzellen verwendet. Für Säugerzellen wird das Calciumphosphat-Ausfällungvertahren von Graham und van der Eb, 1978, Virology 52: 546 bevorzugt. Transformationen in Hefe werden gemäß dem Verfahren von Van Solingen et al., 1977, J. Bact. 130: 946, und Hsiao et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 3829 durchgeführt.
Es kann wünschenswert sein, die das Enzym der Erfindung codierende DNA-Sequenz zu verändern, um zum Beispiel eine Sequenz bereitzustellen, die mit der Codonverwendung der Wirtszelle kompatibler ist, ohne die Aminosäuresequenz des codierten Protein zu verändern. Solche Veränderungen zu den anfänglichen 5–6 Codons können die Expressionseffizienz verbessern. DNA-Sequenzen, die verändert worden sind, um die Expressionseffizienz zu verbessern, die aber gleiche Aminosäuresequenz codieren, werden als äquivalent angesehen und werden von der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Eine Vielzahl an gezielten Primer-spezifischen Mutageneseverfahren ist vorhanden und im Fachgebiet gut bekannt (siehe zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989, zweite Ausgabe, Kapitel 15.51, „Oligonucleotid-mediated Mutagenesis". Die Polymerase- Kettenreaktion (PCR) kann verwendet werden, um gezielte Mutagenese durchzuführen. In einer anderen, jetzt in Fachgebiet üblichen Technik, wird ein synthetisches Oligonucleotid, das die gewünschte Mutation codiert, als ein Primer verwendet, um die Synthese einer komplementären Nucleinsäuresequenz zu lenken, welche in einem einzelsträngigen Vektor, wie pBSM13+-Derivaten enthalten ist, der als eine Matrize für die Konstruktion des Verlängerungsproduktes des mutagenisierenden Primers dient. Die mutagenisierte DNA wird in ein Wirtsbakterium transformiert und Kulturen der transformierten Bakterien, werden ausplattiert und identifiziert. Die Identifizierung der veränderten Vektoren kann den Transfer der DNA von ausgewählten Transformanten auf einen Nitrozellulosefilter oder eine andere Membran einschließen, sowie die mit dem kinasierten, synthetischen, mutagenen Primer hybridisierten „Abhebungen" bei einer Temperatur, die Hybridisierung einer genauen Übereinstimmung mit der veränderten Sequenz erlauben, aber Hybridisierungen mit dem ursprünglichen, nicht-mutagenisierten Strang verhindern. Transformanten, die DNA enthalten, die mit der Sonde hybridisiert, werden dann gezüchtet (die Sequenz der DNA wird im Allgemeinen durch Sequenzanalyse bestätigt) und dient als ein Reservoir der veränderten DNA.
Sobald das Protein einmal in einer rekombinanten Wirtszelle exprimiert worden ist, kann die Reinigung des Proteins gewünscht werden. Eine Vielzahl an Reinigungsvorgängen kann verwendet werden, um die rekombinante thermostabile DNA-Polymerase der Erfindung zu reinigen. Beispiele umfassen die Verfahren zur Reinigung der Taq-DNA-Polymerase, beschrieben in den U.S. Patentnummern 4,889,818; 5,352,600; und 5,079,352; die Verfahren zur Reinigung der DNA-Polymerase von Thermus thermophilus (Tth), beschrieben in den U.S. Patentnummern 5,618,711 und 5,310,652; die Verfahren zur Reinigung der Tma-DNA-Polymerase, beschrieben in den U.S. Patentnummern 5,374,553 und 5,420,029. Verfahren zur Reinigung dieser DNA-Polymerasen werden auch in der U.S. Patentnummer 5,466,591 beschrieben.
In einem bevorzugten Verfahren wird die Expression der DNA-Polymerase in E. coli durchgeführt, die eine mesophile bakterielle Wirtszelle ist. Da E. coli Wirtsproteine hitzeempfindlich sind, kann die rekombinante thermostabile DNA-Polymerase durch Hitzeinaktivierung des rohen Lysats erheblich angereichert werden. Dieser Schritt wird in der Anwesenheit einer ausreichenden Menge an Salz (üblicherweise 0,2–0,4 M Ammoniumsulfat) durchgeführt, um die ionischen Interaktionen der DNA-Polymerase mit den anderen Zelllysatproteinen zu vermindern.
Die Aktivität der gereinigten DNA-Polymerase wird wie beschrieben in Lawyer et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 6427 getestet.
Für Langzeit-Stabilität muss das gereinigte DNA-Polymeraseenzym in einem Puffer gelagert werden, der ein oder mehrere nicht ionische, polymere Detergentien enthält. Solche Detergentien sind im Allgemeinen jene, die ein Molekulargewicht im Bereich von ungefähr 100 bis 250.000 aufweisen, vorzugsweise etwa 4.000 bis 200.000 Daltons und das Enzym bei einem pH-Wert von etwa 3,5 bis etwa 9,5 vorzugsweise von etwa 4 bis 8,5 stabilisieren. Beispiele solcher Detergetien umfassen jene, die auf den Seiten 295–298 von McCutcheon's Emulsifiers & Detergents, Nordamerikanische Ausgabe (1983), veröffentlicht von der McCutcheon Division of MC Publishing Co. 175 Rock Road, Glen Rock, NJ (USA), näher beschrieben werden. Vorzugsweise werden die Detergentien aus der Gruppe ausgewählt, die ethoxylierte Fettalkoholether und Laurylether, ethoxylierte Alkylphenole, Octylphenoxypolyethoxyethanolverbindungen, modifizierte oxyethylierte und/oder oxypropylierte geradkettige Alkohole, Polyethylenglycol-Monooleatverbindungen, Polysorbatverbindungen und phenolische Fettalkoholether umfassen. Besonders bevorzugt werden Tween 20^TM, ein polyoxyethyliertes (20) Sorbitan-Monolaurat von ICI Americas Inc. (Wilmington, DE) und Iconol^TM NP-40, ein ethoxyliertes Alkylphenol (Nonyl) von BASF Wyandotte Corp. (Parsippany, NJ).
Die thermostabilen Enzyme dieser Erfindung können für jeden Zweck verwendet werden, in welchem eine thermostabile DNA-Polymerase notwendig oder erwünscht ist. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Enzym zur DNA-Sequenzierung verwendet (siehe Innis et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 9436–9440).
Die folgenden Beispiele werden nur zum Zweck der Illustration dargeboten und sind auf keinen Fall dazu gedacht den Geltungsbereich der beanspruchten Erfindung einzuschränken. In diesen Beispielen sind alle Prozentanteil, sofern nicht anders angeführt, wenn sie sich auf Feststoffe beziehen pro Gewischt und pro Volumen, falls sie sich auf Flüssigkeiten beziehen.
Beispiel 1
Konstruktion eines Expressionssystems
Ein Expressionssystem wird unter Verwendung von herkömmlichen im Fachgebiet gut bekannten Techniken von dem hinterlegten Plasmid pUC18:Tma25 konstruiert, welches das Gen enthält, das die Nucleotidsequenz SEQ ID NR: 9 aufweist. Die beteiligten Schritte, die nachstehend genauer beschrieben werden, sind wie folgt:

– Die in pUC18:Tma25 enthaltene Codierungssequenz der DNA-Polymerase wird in einem pDG160 Expressionsvektor subcloniert, das resultiert in Plasmid pTM25.
– Die D323A und E325A-Mutationen werden durch gezielte Primer-spezifische Mutagenese zu pTMA25 hinzugefügt, das resultiert in Plasmid pTMA30.
– Die mutierte Gen-Codierungssequenz von pTMA30 wird dann in einen pDG184 Expressionsvektor subcloniert, sodass die Codons 1–283 deletiert werden, das resultiert in Plasmid pTMA31.
– Die F730Y-Mutation wird durch gezielte Primer-spezifische Mutagenese zu pTMA31 hinzugefügt, das resultiert in Plasmid pTMA31 [F730Y].
– Ein Fragment der mutierten Codierungssequenz von pTMA31 [F730Y], das die F730Y-Mutation enthält, wird in pTMA30 subcloniert, um das entsprechende nicht-mutierte Fragment zu ersetzen, das resultiert in Plasmid pTMA30[F730Y].

Nach jedem Mutagenese- oder Subclonierungsschritt, werden die E. coli Stamm-DG116-Wirtszellen mit den Plasmidkonstrukten transformiert. Ampicillinresistente (Plasmid-enthaltende) Kolonien werden unter Verwendung von Standardverfahren auf die Anwesenheit des gewünschten Plasmids durchmustert. Üblicherweise werden zuerst Kolonien für die Anwesenheit eines Plasmids der erwarteten Größe durch gelelektrophoretische Größenfraktionierung ausgewählt. Kandidatenkolonien werden weiter auf Plasmide durchmustert, die nach Spaltung mit einem oder mehreren Restriktionsenzymen die erwarteten Fragmentmuster zeigen. Schließlich werden die mutagenisierten Stellen und die Ligationsübergänge sequenziert, um die erwartete Sequenz zu bestätigen.
Plasmid pDG160 wird im U.S. Patentnummer 5,618,711 beschrieben. Plasmid pDG160 ist ein Clonierungs- und Expressionsvektor, der den Bakteriophagen λ P_L-Promotor und die N-Gen-Ribosomenbindungsstelle (siehe U.S. Patentnummer 4,711,845, das hierin durch Verweis einbezogen wird), einen Restriktionsstellen-Polylinker der so gelegen ist, dass in den Polylinker clonierte Sequenzen unter Kontrolle des λ P_L-Promotors und der N-Gen-Ribosomenbindungsstelle exprimiert werden können und einen Transkriptionsterminator des Bacillus thuringiensis Delta-Toxingens (siehe U.S. Patentnummer 4.666.848) umfasst. Plasmid pDG160 trägt auch ein mutiertes RNAII-Gen, welches das Plasmid temperatursensitiv für die Kopienzahl macht (siehe U.S. Patentnummer 4,631,257).
Diese Elemente agieren gemeinsam, um aus Plasmid pDG160 einen sehr nützlichen und starken Expressionsvektor zu machen. Bei 30–32°C ist die Kopienzahl des Plasmids niedrig und in einer Wirtszelle, die ein temperatursensitives Repressorgen trägt, wie zum Beispiel cl857, ist der λ P_L-Promotor nicht funktionsfähig. Bei 37–41°C ist die Kopienzahl des Plasmids jedoch 50-fach höher als bei 30–32°C und der cl857-Repressor wird inaktiviert, was dem P_L-Promotor ermöglicht zu funktionieren. Plasmid pDG160 trägt auch einen Ampicillin-Resistenzmarker (AmpR). Kurz gesagt umfasst Plasmid pDG160 den AmpR-Marker, den P_L-Promotor und die N-Gen-Ribosomenbindungsstelle, einen Polylinker und das BT-cry-PRE (BT positive retro-regulatorische Element, U.S. Patentnummer 4,666,848) in einem ColE1 cop^ts-Vektor.
Plasmid pDG184 wird in U.S. Patentnummer 5,420,029 beschrieben. Das Plasmid pDG184 ist ein Derivat von pDG160, modifiziert, um eine NocI-Stelle am Startcodon des inserierten Gens zu umfassen. Der Rest des Plasmids unterscheidet sich funktionell von pDG160 nicht.
I. Subclonierung I
Die Codierungssequenz der DNA-Polymerase wird von Plasmid pUC18:Tma25 wie folgt in einen pDG160 Expressionsvektor subcloniert:

A. Plasmid pUC18:Tma25, ein 5347 Basenpaare (bp)-Plasmid wird durch Spaltung mit Nsp V, das einmal an Position 2084 spaltet (nummeriert, beginnend mit dem ersten Nucleotid der Codierungssequenz linearisiert.
B. Das resultierend aus der Nsp V-Spaltung linearisierte Plasmid wird weiter mit Bam HI gespalten, das bei den Nucleotid (nt)-Positionen 1661, 1989, 2039 und 2686 spaltet. Ein 602 bp Nsp V/Bam HI-Fragment (nt 2085–2686), welches das 3'-Ende des DNA-Polymerasegens enthält, wird gelgereinigt.
C. In einer getrennten Reaktion wird das aus der Nsp V-Spaltung resultierende, linearisierte Plasmid weiter mit Hind III gespalten, das an Positionen 2629 und 5342 spaltet. Ein 2089 bp Nsp V/Hind III-Fragment (nt 5343–2084), welches das 5'-Ende des DNA-Polymerasegens enthält, wird gelgereinigt.
D. Plasmid pDG160 wird mit Hind III und Bam HI gespalten und mit alkalischer Phosphatase aus dem Kälberdarm (CIAP) behandelt, um das 5'-Phosphat zu entfernen und die Religation und Rekonstruktion des Vektors zu verhindern. Alternativ wird das gespaltene Vektorfragment gelgereinigt.
E. Die isolierten Fragmente der Schritte B und C werden mit dem gespaltenen pDG160-Plasmid von Schritt D in einem Verhältnis von 2:2:1 bei einer Konzentration von 10–40 ng/μl an Gesamt-DNA vereinigt und ligiert, das resultiert in einem 8218 bp Plasmid.
F. Das Ligationsprodukt wird in E. coli DG116-Zellen (vorstehend beschrieben) transformiert und die als pTMA25 bezeichneten Transformationskolonien, die das gewünschte Plasmid enthalten, werden mittels Durchmusterung identifiziert.

II. Mutagenese I: D323A und E325A
Mutationen in der Codierungssequenz der DNA-Polymerase von pTMA25, die in den D323A und E325A Aminosäuremutationen resultieren, werden unter Verwendung von gezielter Primer-spezifischer Mutagenese erzeugt. Für die Annehmlichkeit in späteren Manipulationen, werden zusätzliche Mutationen gemacht, die eine Bgl II-Restriktionsenzym-Spaltungstelle entfernen und eine Spe I-Restriktionenzym-Spaltungestelle erzeugen. Diese zusätzlichen Mutationen werden so erzeugt, dass die codierte Aminosäuresequenz unverändert bleibt.
Die folgenden Primer werden in der Mutagenese verwendet:

– Primer P1: mutagner stromaufwärts Primer, der den Nucleotiden 958–988 der SEQ ID NR: 9 entspricht, mit Mutationen, wie sie in der nachstehenden Tabelle beschrieben werden.
– Primer P2: mutagener stromaufwärts Primer, der aus dem reversen Komplement von Primer P1 besteht.
– Primer P3: stromaufwärts Primer, der den Nucleotiden 608–627 der SEQ ID NR: 9 entspricht, welche die Xba I Stelle umfassen (Nucleotide 621–626).
– Primer P4: stromabwärts Primer, der den Nucleotiden 1319–1339 von SEQ ID NR: 9 entspricht, der einen Teil der Sac I-Stelle umfasst (Nucleotide 1318–1323).

Die Sequenz des mutagenen stromaufwärts Primers P1 besteht aus Nucleotiden 958–988 des codierenden Stranges der SEQ ID NR: 9, mit der Ausnahme der in der nachfolgenden Tabelle gezeigten Veränderungen. Die Veränderung in Codon 323 (Nucleotide 967–969) resultierte in der Entfernung der Bgl II-Stelle. Die Veränderungen in den Codons 326 (Nucleotide 966–978) und 327 (Nucleotide 979–981) haben keinen Effekt auf die Sequenz der codierten Aminosäure, resultieren aber in der Bildung einer Spe I-Stelle.
Mutationen in dem Primer P1
Die Mutagenese wird wie nachstehend beschrieben durchgeführt. Alle Amplifikationen werden durch PCR unter im Fachgebiet gut bekannten Bedingungen durchgeführt. Zum Beispiel können die Amplifikationen unter Verwendung des GeneAmp PCR-Reagenskits mit AmpliTaq^® DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Norwalk, CT) durchgeführt werden.

A. Ein Bereich der Codierungssequenz wird unter Verwendung der Primer P3 und P2 von gereinigtem pTMA25 amplifiziert und das daraus resultierende, amplifizierte 381 bp Produkt wird gelgereinigt.
B. Ein Bereich der Codierungssequenz wird unter Verwendung des Primers P1 und P4 von gereinigtem pTMA25 amplifiziert und das daraus resultierende, amplifizierte 382 bp Produkt wird gelgereinigt.
C. Die amplifizierten Produkte der Schritte A und B werden vereinigt, bei 95°C hitzedenaturiert, angelagert und mit DNA-Polymerase unter Verwendung von Standardtechniken verlängert.
D. Die angelagerte und verlängerte Duplex-DNA von Schritt C wird unter Verwendung der Primer P3 und P4 wieder amplifiziert und das daraus resultierende 732 bp Produkt wird gelgereinigt.
E. Die amplifizierte DNA von Schritt D wird mit Xba I und Sac I gespalten.
F. Plasmid pTMA25 wird mit Xba I und Sac I gespalten und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm behandelt, um das 5' Phosphat zu entfernen und die Religation und Rekonstruktion des Vektors zu verhindern.
G. Die gespaltene DNA von Schritt E wird mit dem gespaltenen Plasmid von Schritt F in einem 3:1 Verhältnis vereinigt und ligiert.
H. Das Ligationsprodukt wird in E. coli DG116-Zellen transformiert und die Transformantenkolonien, die das gewünschte Plasmid enthalten, bezeichnet als pTMA30, werden mittels Durchmusterung identifiziert.

III. Subclonierung II
Die mutierte Gencodierungssequenz von pTMA30 wird dann derart in einen pDG184 Expressionsvektor subcloniert, dass die Codons 1–283 deletiert sind. Die hierin verwendeten Nucleotid-Positionsnummern, beziehen sich auf die Position innerhalb des Plasmids, wobei die Position 1 durch die Eco RI-Stelle stromaufwärts vom P_L-Promotor definiert ist. Die Subclonierung wird wie folgt durchgeführt.

A. Plasmid pTMA30, ein 8218 bp Plasmid, wird mit Mlu I gespalten, das bei Nucleotidposition 4443 spaltet; Bsp HI, das bei den Positionen 1210, 4761, 5769 und 5874 spaltet; und Afl II, das bei Position 7827 spaltet. Die Afl II-Spaltung wird durchgeführt, um ein 3554 bp Bsp HI/Bsp HI-Fragment weiter abzubauen, das in Größe ähnlich dem gewünschten 3233 bp Bsp HI/Mlu I-Fragment ist, damit die Isolierung des gewünschten Fragments erleichtert wird. Die Spaltung ergibt sechs Fragmente mit Längen von 3233, 1952, 1601, 1008, 318 und 105 bp. Das 3233 bp Bsp HI/Mlu I-Fragment, das den Nucleotiden 1211–4443 des Plasmids entspricht, wird durch Gelelektrophorese isoliert.
B. Plasmid pDG184, ein 5474 bp Plasmid wird mit Mlu I gespalten, das bei Position 1699 spaltet und Nco I, das bei Position 284 spaltet. Die gespaltenen Fragmente werden mit alkalischer Phosphatase (CIAP) aus dem Kälberdarm behandelt, um das 5'-Phosphat zu entfernen und Religation und Rekonstruktion des Vektors zu verhindern. Alternativ wird das 4059 bp Fragment durch Gelelektrophorese isoliert.
C. Das isolierte Fragment von Schritt A wird mit dem gespaltenen pDG184-Plamsid von Schritt B in einem Verhältnis von 1:1 bei einer Konzentration von 10–40 ng/μl an Gesamt-DNA vereinigt und ligiert, das resultiert in einem 7292 bp Plasmid.
D. Ligationsprodukt wird in E. coli DG116-Zellen transformiert und die Transformanten, die das gewünschte Plasmid enthalten, bezeichnet als pTMA31, werden mittels Durchmusterung identifiziert.

IV. Mutagenese II: F730Y
Zusätzliche Mutationen in der DNA-Polymerase-Codierungssequenz von pTMA31, die in der F730Y-Mutation in den codierten Aminosäuresequenzmutationen resultierten, wurden unter Verwendung von gezielter Primer-gerichteter Mutagenese durchgeführt, die analog zu jene vorstehend beschriebenen waren.
Die folgenden Primer wurden in der Mutagenese verwendet:

– Primer FR1: mutagener stromaufwärts Primer; der den Nucleotiden 2173–2202 der SEQ ID NR: 9 entspricht, mit den in der nachfolgenden Tabelle beschriebenen Mutationen.
– Primer FR2: mutagener stromabwärts Primer, der im Wesentlichen aus dem reversen Komplement von Primer FR1 besteht, aber den Nucleotiden 2172–2200 der SEQ ID NR: 9 entspricht.
– Primer FR3: stromaufwärts Primer, der den Nucleotiden 1952–1972 von SEQ ID NR: 9 entspricht, der stromaufwärts von der Bst XI-Stelle liegt.
– Primer FR4: stromabwärts Primer, der den Nucleotiden 2415–2433 von SEQ ID NR: 9 entspricht, der stromabwärts von der Xma I-Stelle liegt.

Die Sequenz des mutagenen stromaufwärts Primers FR1 besteht aus den Nucleotiden 2173–2202 des codierenden Stranges von SEQ ID NR: 9, mit der Ausnahme der der nachfolgenden Tabelle gezeigten Veränderungen. Die Veränderungen im Codon 729 (2185–2187) beeinflusst die Sequenz der codierten Aminosäure nicht, resultiert aber in der Bildung einer Hpa I-Stelle.
Mutationen in dem Primer FR1
Die Mutagenese wurde wie nachstehend beschrieben durchgeführt:

A. Ein Bereich der Codierungssequenz wurde vom gereinigten pTMA31 unter Verwendung der Primer FR3 und FR2 amplifiziert und das daran resultierende amplifizierte 249 bp Produkt wurde gelgereinigt.
B. Ein Bereich einer Codierungssequenz wurde vom gereinigten pTMA31 unter Verwendung der Primer FR1 und FR4 amplifiziert und das daraus resultierende amplifizierte 261 bp Produkt wurde gelgereinigt.
C. Die amplifizierten Produkte der Schritte A und B wurden vereinigt, bei 95°C hitzedenaturiert, angelagert und mit DNA-Polymerase unter Verwendung von Standardtechniken verlängert.
D. Die angelagerte und verlängerte Duplex-DNA von Schritt C wurde unter Verwendung der Primer FR3 und FR4 wieder amplifiziert und das daraus resultierende amplifizierte 482 bp Produkt wurde unter Verwendung eines Phenol/Chloroformgemisches extrahiert und mit EtOH ausgefällt.
E. Die amplifizierte DNA von Schritt D wurde mit Bst I und Xma I gespalten und das gewünschte 337 bp DNA-Fragment wurde unter Verwendung einer CENTRICON 100 Säule (Amicon, Beverly, MA) von kleineren Fragmenten abgetrennt.
F. Plasmid pTMA31 wurde mit Bst XI und Xba I gespalten.
G. Die gespaltene DNA von Schritt E wurde mit dem gespaltenen Plasmid von Schritt F in einem Verhältnis von 3:1 vereinigt und ligiert.
H. Das Ligationsprodukt wurde in E. coli DG116-Zellen transformiert. Kolonien wurden durch Amplifikation der Plasmid-DNA unter Verwendung der Primer FR3 und FR4 auf die Anwesenheit des gewünschten mutierten Plasmids durchmustert, welche einen Bereich amplifizieren, der die einmalige Hpa I-Stelle umfasst, die während der Mutagenese eingeführt wurde, Spaltung des amplifizierten Produktes mit Hpa I und Analyse des Spaltungsproduktes durch Gelelektrophorese. Eine Kolonie, die das gewünschte Plasmid enthält, bezeichnet als pTMA31[F730Y], wurde ausgewählt und die Gensequenz wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.

Das resultierende Expressionssystem exprimiert eine DNA-Polymerase, bezeichnet als F730YTma31 DNA-Polymerase, die aus den Aminosäuren 284–893 der Tma-DNA-Polymerase besteht, mutiert mit den D323A, E325A und F730Y Mutationen.
V. Subclonierung III
Ein Fragment der mutierten Codierungssequenz von pTMA31 [F730Y], das die F730Y-Mutation enthält, wurde in pTMA30 subcloniert, um das entsprechende nicht-mutierte Fragment zu ersetzen, was in Plasmid pTMA30[F730Y] resultierte. Die hierin verwendeten Nucleotidpositionsnummern beziehen sich auf die Position innerhalb des Plasmids, wobei Position 1 durch die Eco RI-Stelle stromaufwärts vom λ P_L-Promotor definiert ist. Die Subclonierung wurde wie folgt durchgeführt.

A. Plasmid pTMA31 [F730Y], ein 7292 bp Plasmid wurde mit Mlu I gespalten, das bei Nucleotidposition 3517 spaltet und mit Spe I, das bei Position 412 spaltet. Das 3105 bp Mlu I/Spe I-Fragment, das den Nucleotiden 413 bis 3517 des Plasmids entspricht, wurde durch Gelelektrophorese isoliert.
B. Plasmid pTMA30, ein 8218 bp Plasmid wurde mit Mlu I gespalten, das bei den Nucleotidpositionen 4443 spaltet und mit Spe I, das bei Position 1338 spaltet. Das 5113 bp Mlu I/Spe I-Fragment, das den Nucleotiden 444–138 des Plasmidfragments entspricht, wurde durch Gelelektrophorese isoliert.
C. Das isolierte Fragment von Schritt A wird mit dem isolierten Fragment von Schritt B in einem Verhältnis von 1:1 bei einer Konzentration von 10–40 ng/μl der Gesamt-DNA vereinigt und ligiert.
D. Das Ligationsprodukt wurde in E. coli DG116-Zellen transformiert. Die Kolonien wurden durch Amplifizierung der Plasmid-DNA unter Verwendung von Primern auf die Anwesenheit des gewünschten Plasmid durchmustert, die Bereiche amplifizieren, welche die während der Mutagenese eingeführten einmaligen Hpa I und Spe I-Stellen einschließen; Spalten der amplifizierten Produkte mit Hpa I und Spe I und Analyse der Spaltungsprodukte durch Gelelektrophorese. Plasmid-DNA wurde von Kolonien erzeugt, die Plasmide enthielten, welche die erwarteten Spaltungsmuster in der Durchmusterung aufwiesen und wurden weiter durch Spaltung mit Hpa I, Spe I und Mlu I analysiert, gefolgt von Gelanalyse der gespaltenen DNA. Eine Kolonie, die ein gewünschtes Plasmid enthält, bezeichnet als pTMA30[F730Y], wurde ausgewählt und die Gensequenz wurde durch DNA-Sequenzierung bestätigt.

Das resultierende Expressionsplasmid pTMA30[F730Y] befindet sich unter der Kontrolle des Bakteriophagen λ P_L-Promotors und der Gen-N-Ribosomenbindungsstelle und eines positiven regulatorischen Elements (PRE, Transkriptionsterminator) aus dem Bacillus thuringiensis Delta-Toxingen. Das Plasmid trägt auch ein mutiertes RNA-II-Gen, welches das Plasmid temperatursensitiv für die Kopienzahl macht, sowie ein Ampicillinresistenzgen.
Beispiel 2
Expression der rekombinanten DNA-Polymerase
Dieses Beispiel beschreibt die Expression und Reinigung von F730YTma30 DNA-Polymerase unter Verwendung eines Expressionssystems, E. coli K12-Stamm DG116-Zellen, die das Plasmid pTMA30[F730Y] beherbergen, wie es im Wesentlichen in Beispiel 1 beschrieben wird.
Anfängliches Wachstum der Expressionssystem-Zellen wurde in einer Impfflasche durchgeführt. Großtechnische Fermentation wurde in einer 10 Liter Fermentationsflasche durchgeführt, die mit der Impfkultur inokuliert wurde. Die verwendeten Medien und Protokolle waren wie folgt:
Das Impfmedium bestand aus 1 × Bonner-Vogel-Salzen (9,6 mM Zitronensäure, 57 mM K₂HPO₄, 16,8 mM NaNH₄HPO₄, 0,8 mM MgSO₄), + 25 mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 10 μg/ml Thiamin-HCl, 0,2% Glucose, 0,25 Casaminosäuren und 100 μg/ml Ampicillin und Methicillin. Das Medium wurde aus sterilen Stammlösungen zusammengestellt und dann vor der Verwendung filtersterilisiert.
Fermentationsmedium bestand aus 1 × Bonner-Vogel-Salzen (9,6 mM Zitronensäure, 57 mM K₂HPO₄, 16,8 mM NaNH₄HPO₄, 0,8 mM MgSO₄), + 25 mM (NHa)₂SO₄, 2 mM MgSO₄, 10 μM MnSO₄, 6,9 μM ZnCl₂, 8,4 μM CoCl₂, 8,3 μM NaMoO₄, 6,8 μM CaCl₂, 7,4 μM CuCl₂, 8,1 μM H₃BO₃, 1 μM FeCl₃, 0,5 ml/l Macoll P2000 Antischaum, 10 μg/ml Thiamin-HCl, 1,6% Glucose, 2,0% Casaminosäuren und 100 μg/ml Ampicillin. Die vorstehenden Inhaltsstoffe (bis einschließlich dem Antischaum) wurden in situ bei 121°C für 20 Minuten sterilisiert und der Rest wurde von sterilen Stammlösungen gerade vor der Inokulation hinzugefügt.
Die Impfkultur wurde in einer 100 ml Flasche an Impfmedium mit 0,1 ml gefrorenen Expressionssystemzellen inokuliert. Nach der Inokulation wurde die Kultur über Nacht bei 30°C geschüttelt. Die gesamte Flaschenkultur wurde verwendet, um eine 10 Liter Fermenterkultur zu inokulieren.
Die Fermentation wurde wie folgt durchgeführt. Die Ausgangstemperatur war 30°C, der pH-Wert wurde bei 6,9 +/– 0,1 mit 4 N NH₄OH und Eisessig kontrolliert und der aufgelöste Sauerstoff bei 30% durch Einstellen der Schüttelrate, wie benötigt von einem minimalen Ausgangswert von 300 UpM kontrolliert. Die Sauerstoffanreicherungsrate wurde bei 5 Liter pro Minute konstant gehalten. Wenn die Kultur, nach etwa 6–7,5 Stunden, eine OD (680 nm) von 2,5 erreicht hatte, wurde die Temperatur auf 38,5°C geändert, um die Synthese der DNA-Polymerase unter Verwendung einer Auslaufrate von 0,40°C/Minute zu induzieren. Der Fermentation wurde ermöglicht über Nacht bis zu einer gesamten Laufzeit von etwa 24 Stunden fortzufahren.
Beispiel 3
Reinigung der rekombinanten DNA-Polymerase
Dieses Beispiel beschreibt die Reinigung der exprimierten F730YTma30 DNA-Polymerase von der vorstehend beschriebenen Fermentation. Die Reinigung wurde im Wesentlichen wie beschrieben von Lawyer et al., 1993, PCR Method and Applications 2: 275–287 wie nachstehend beschrieben mit Veränderungen durchgeführt.
Die folgenden Standardabkürzungen werden verwendet:

PEI: = Polyethylenimin
TLCK: = N-α-p-tosyl-L-lysin-chloromethylketon-HCl

PEI ist im Handel unter anderem von Polysciences, Inc. (Warrington, PA) erhältlich. TCLK ist unter anderem von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) erhältlich.
Ungefähr 150 Gramm von der Fermentation eingefrorene Zellen (–70°C) wurden in Lysepuffer aufgetaut (50 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5), der 10 mM EDTA, 1 mM Dithothreitol (DTT), 2 mM Pefabloc SC (CenterChem, Inc., Stamford, CT); 1 μg/ml Leupetin (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und 1 mM TLCK enthielt. Die Zellen wurden durch fünfmalige Passage durch einen Mikrofluidizer bei 10.000 psi lysiert. Das Lysat wurde mit Lysepuffer auf ein Endvolumen von 5,5 × Zellengewicht verdünnt. Das resultierende Lysat wurde als Fraktion I bezeichnet.
Ammoniumsulfat wurde bis zu einer Konzentration von 0,2 M schrittweise zum Fraktion-I-Lysat hinzugefügt. Die Fraktion I wurde dann wie folgt mit PEI ausgefällt.
PEI-Titrationen wurden verwendet, um die minimale Menge an PEI zu bestimmen die notwendig ist, um Nucleinsäuren auszufällen. 10 μl von jeder Probeausfällung wurden zu 100 μl 0,5 μg/ml Ethidium Bromid in einer Standard-Mikrovertiefungsplatte hinzugefügt. Standards bestanden aus entsprechend verdünntem Lysat, das kein PEI enthielt. Die Platte wurde mit UV-Licht beleuchtet und die Konzentration von PEI, die zur Entfernung von mindestens 99% der Nucleinsäure nötig waren, wurde bestimmt.
PEI wurde langsam unter Rühren bis zu 0,4% (Konzentration wie aus dem Titrationen bestimmt) hinzugefügt. Das PEI-behandelte Lysat wurde in einem JA-10 Rotor (500 ml Flaschen) bei 8.000 UpM (11.300 × g) für 30 Minuten bei 5°C zentrifugiert. Der Überstand (Fraktion II) wurde vorsichtig abgegossen und aufbewahrt.
Ammoniumsulfat wurde zu dem Fraktion-II-Überstand bis zu einer Konzentration von 0,4 M hinzugefügt. Fraktion II wurde wie folgt mit Hitze behandelt.
Die Hitzebehandlung wurde in einem 3 Liter Braun Fermentiergerät durchgeführt. Die Schüttelrate war 250 UpM. Die Temperatur wurde über 6 Minuten auf 75°C erhöht, für 15 Minuten beibehalten und dann so schnell wie möglich auf 30°C abgekühlt. Der mit Hitze behandelte Fraktion II-Überstand von der PEI-Ausfällung wurde aus dem Fermentiergerät entfernt und für mindesten 30 Minuten auf Eis beibehalten und dann wie vorstehend beschrieben zentrifugiert. Der Überstand (Fraktion III) wurde vorsichtig abgegossen und aufbewahrt.
Fraktion III wurde wie folgt einer Phenyl-Sepharosen-Säulenchromatographie unterzogen. Eine 250 ml Radialsäule (Sepragen Corp., Hayward, CA) wurde mit Phenyl Sepharose Fast Flow („High sub") (Pharmacia, Piscataway, NJ) bepackt. Fraktion III wurde mit 50 mM Tris (pH-Wert 7,5), 10 mM EDTA verdünnt, um Ammoniumsulfat auf 0,3 M zu reduzieren und dann auf die Säule aufzutragen. Die Säule wurde für 15–20 Minuten (3–4 Säulenvolumen) in jedem der 4 folgenden Puffer gewaschen (Durchflussrate von 50 ml/Minute): (1) 50 mM Tris, pH-Wert 7,5, 10 mM EDTA, 0,3 M Ammoniumsulfat, 1 mM DTT; (2) 25 mM Tris, pH-Wert 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM DTT; (3) 25 mM Tris, pH-Wert 7,5, 1 mM EDTA, 20% Vol./Vol. Ethylenglycol, 1 mM DTT; und (4) 25 mM Tris, pH-Wert 7,5, 1 mM EDTA, 20% Vol./Vol. Ethylenglycol, 1 mM DTT, 2.0 M Harnstoff. Das Harnstoff-Eluat, das die DNA-Polymerase (Fraktion IV) enthielt, wurde als ein einzelner Pool von ungefähr 3 bis 18 Minuten der Harnstoffelution gesammelt. Der gesamte Phenyl-Sepharosensäulenschritt war in weniger als 2 Stunden abgeschlossen.
Fraktion IV wurde wie folgt einer Heparin-Sepharosen-Säulenchromatographie unterzogen. Fraktion IV (etwa 750 ml) wurde in 0,05 M KCl (von einer 3 M Stammlösung) gemacht und dann auf eine 100 ml Radial-Heparinsepharosesäule aufgetragen, die in 25 mM Tris, pH-Wert 7,5, 1 mM EDTA, 0,05 M KCl, 1 mM DTT äquilibriert worden war. Nach dem Auftragen wurde die Säule für 30 Minuten in Äquilibrierungspuffer gewaschen (Durchflussrate von 20 ml/Minute) und dann in 25 mM Tris, pH-Wert 7,5, 1 mM EDTA, 0,10 M KCl, 1 mM DTT. Schließlich wurde die DNA-Polymerase in einem 12-Säulenvolumsgradienten in 25 mM Tris, pH-Wert 7,5, 1 mM EDTA und 0,10 bis 0,5 KCl, 1 mM DTT eluiert, wobei 75 Fraktionen von je 16 ml gesammelt wurden. Der Heparin-Sepharosesäulenschritt war in weniger als 3 Stunden abgeschlossen. Die Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert und manche frühe Fraktionen, die DNA-Polymerase enthielten, die weniger rein waren, wurden vom Pool (Fraktion V) entfernt.
Fraktion V wurde auf einer Amicon YM30-Membran (Amicon Inc. Beverley, MA) auf 20 ml konzentriert. Das Konzentrat wurde über Nacht bei 4°C gegen 3 × Lagerungspuffer dialysiert (60 mM Tris, pH-Wert 8,0, 0,3 mM EDTA, 0,3 mM KCl, 3 mM DTT). Glyzerin wurde zum Dialysat bis zu einer Konzentration von 50% (Vol./Vol.), von einer 80% (Vol./Vol.) Stammlösung hinzugefügt. Tween 20^TM, wurde bis zu einer Endkonzentration von 0,2% (Gew./Vol.) von einer 10% (Gew./Vol.) Stammlösung hinzugefügt. Steriles Wasser wurde hinzugefügt, um das Volumen der Präparation auf das 3-fache Volumen des ursprünglichen Lysats zu bringen, was Fraktion VI, eine lagerungsstabile Präparation von F730YTmaDNA-Polymerase ergab.
Fraktion VI wurde im Wesentlichen wie in Lawyer et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 6427 beschrieben, auf DNA-Polymeraseaktivität untersucht.
Beispiel 4
Verlängerungsrate
Die Verlängerungsrate der F730YTma30 DNA-Polymerase wurde unter Verwendung eines durch die Matrize limitierten Primer-Verlängerungstests durchgeführt. Der Test wurde unter Verwendung eines Überschusses an DNA-Polymerase durchgeführt, unter diesen Bedingungen ist die Verlängerungsrate unabhängig von der DNA-Polymerasekonzentration.
Das chimäre Enzym der vorliegenden Erfindung, F730YTma30 DNA-Polymerase, wurde mit der F730YTma31 DNA-Polymerase verglichen, die vom vorstehend beschriebenen Plasmid pTMA31 [F730Y] exprimiert wurde. F730YTma31 DNA-Polymerase ist eine mutierte Version der UlTma^TM DNA-Polymerase (Perkin Elmer, Norwalk, CT), welche die D323A und E325A-Mutation beinhaltet, welche 3'- nach 5'-Exonucleaseaktivität und die F730Y-Mutation inaktivieren. F730YTma30 DNA-Polymerase und F730YTma31 DNA-Polymerase unterscheiden sich hauptsächlich dadurch, dass F730YTma30 DNA-Polymerase die 5'-Nucleasedomäne der Taq-DNA-Polymerase enthält, die mutiert worden ist, um die 5'-Nucleaseaktivität zu inaktivieren, wobei der F730YTma31 DNA-Polymerase die ersten 283 Aminosäuren der Tma-DNA-Polymerase fehlen. Demgemäß fehlt der F730YTma31 DNA-Polymerase die 5'-Nucleaseaktivität, als ein Ergebnis einer Deletion eines Großteils der 5'-Nucleasedomäne.
DNA-Polymerase-Erzeugungen wurden zuerst wie beschrieben von Lawyer et al., 1989, J. Biol. Chem. 264: 6427 getestet, um die Konzentration einer Einheit zu bestimmen und um eine Menge an Enzym zu bestimmen, die benötigt wird, damit ein Enzym in Überschuss vorliegt. Basierend auf diesen Test wurde bestimmt, dass die Verwendung von einer Einheit an F730YTma30 DNA-Polymerase oder 3,5 Einheiten an F730YTma31 DNA-Polymerase im nachstehend beschriebenen Verlängerungsratentest ausreichend war, um sicherzustellen, dass die Verlängerungsrate unabhängig von der Enzymkonzentration war. Die Definition einer Einheit eines Enzyms wurde in Lawyer et al., 1989, vorstehend, definiert.
Die Verlängerungsrate wurde für 3 Minuten bei 75°C in einem 50 μl Reaktionsgemisch getestet, das 5 μl DNA-Polymerase enthielt (verdünnt wie in Lawyer et al., 1989, vorstehend, um die vorstehend beschriebene Einheitsmenge zu enthalten) und 45 μl eines Reaktionspuffers, der 50 mM Bicin, pH-Wert 8,3, 25°C; 2,5 mM MgCl2, 1 mM β-Mercaptoethanol; je 200 μM dATP, dGTP und dTTP; 100 μM [α-³³P]dCTP (0,8 μCi/Reaktion); und 0,075 pmol der vorher an Primer DG48 (SEQ ID NR: 5'-GGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGC) angelagerten M12mp18 Matrizen DNA (Perkin Elmer, Norwalk, CT) enthält. Die Reaktionen wurden durch das Hinzufügen von 10 μl 60 mM EDTA beendet und bei 0°C gelagert.
Ein 25 μl Anteil der abgebrochenen Reaktion wurde mit 1 ml 2 mM EDTA mit 50 μg/ml zerrissener Lachsperma-DNA als ein Träger verdünnt. Die DNA wurde durch die Zugabe von 1 ml 20% Trichloressigsäure (Gew./Vol.) und 2% Natrium Pyrophosphat ausgefällt und bei 0°C für 15 Minuten inkubiert. Ausgefällte DNA wurde auf GF/C-Filterscheiben (Whatman International Ltd., Maidstone, England) gesammelt und ausgiebig mit 5% Trichloressigsäure und 2% Natriumpyrophosphat, dann mit 5% Trichloressigsäure, dann mit 5 ml 95% Ethanol gewaschen, getrocknet und gezählt.
Die pro Minute eingebaute Menge an 100 μM [α-³³P]dCMP wurde für jede Probe bestimmt. Die nachstehend gezeigten Daten stellen den Durchschnitt von zwei Reaktionen dar.
Die Daten deuten darauf hin, dass F730YTma30 DNA-Polymerase, wie sie im vorstehenden Test gemessen wurde, eine 41% höhere Verlängerungsrate aufweist als F730YTma31 DNA-Polymerase. Im Hinblick auf den Unterschied zwischen den beiden Enzymen deuten die Daten darauf hin, dass die Anwesenheit der 5'-Nucleasedomäne der Taq-DNA-Polymerase in der F730YTma30 DNA-Polymerase, obwohl sie durch die G46D-Mutation inaktiviert ist, in einer erheblich höheren Verlängerungsrate resultiert.
Die Verlängerungsprodukte von einer Reihe an Zeitpunkten wurden durch denaturierende Agarosegelelektrophorese weiter analysiert, welche bestätigten, dass die Ergebnisse eine Steigerung in der Verlängerungsrate des Enzyms darstellen.
Beispiel 5
Farbstoff-Terminator-Zyklussequenzierung
Dieses Beispiel zeigt, die Anwendung von F730YTma30 DNA-Polymerase in Farbstoff-markierter Didesoxy-Terminator-Zyklussequenzierung. Zum Vergleich wurden auch Zyklus-Sequenzierungsreaktionen unter Verwendung von AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS durchgeführt, einer mutierten Form der Taq-DNA-Polymerase, welcher die Exonucleaseaktivität fehlt und die eine F667Y-Mutation beinhaltet, die analog zur F730Y-Mutation in der F730YTma30 DNA-Polymerase ist.
Zyklussequenzierungsreaktionen wurden unter Verwendung der Reagenzien und Produkte des ABI PRISM^TM Farbstoff-Terminator-Zyklussequenzierungs-Corekits mit AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS (Perkin Elmer, Norwalk, CT) durchgeführt. Die getrennte Verpackung der Reagenzien in diesem Kit ermöglichte den leichten Austausch von AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS gegen F730YTma30 DNA-Polymerase. In diesem Kit wird die AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS gemeinsam mit rTth-Thermostabiler-Anorganischer-Pyrophosphatase bereitgestellt. Für die Reaktionen, die F730YTma30 DNA-Polymerase verwenden, wird das DNA-Polymerase/Pyrophosphatasegemisch des Kits gegen 10 Einheiten von F730YTma30 DNA-Polymerase und 20 Einheiten rTth-Thermostabiler-Anorganischer-Pyrophosphatase ausgetauscht. rTth-Thermostabile-Anorganische-Pyrophosphatase wird in der gleichzeitig angemeldeten U.S. Patentnummer 5.665.551 beschrieben.
Die mit dem Kit bereitgestellte positive Kontrollmatrize, pGEM^®-3Zf(+) und der Primer-21M13, wurden verwendet. Reaktionen wurden in einem GeneAmp^® PCR-System 9600 Thermocycler (Perkin Elmer, Norwalk, CT) unter Verwendung des empfohlenen „Thermal-Cycling"-Protokolls (25 Zyklen: 96°C für 10 Sekunden, 50°C für 5 Sekunden und 60°C für 4 Minuten) durchgeführt.
Die Verlängerungsprodukte wurden von nicht eingebauten Farbstoff-Terminatoren durch Spin-Säulenreinigung unter Verwendung einer Centri-Sep^TM Säule von Princeton Separations (Adelphia, NJ) gereinigt und in einer Vakuumzentrifuge, wie im Protokoll empfohlen, getrocknet. Proben wurden in 6 μl Ladepuffer (deionisiertes Formamid und 25 mM EDTA (pH-Wert 8,0) resuspendiert, der 50 mg/l Blau-Dextran in einem Verhältnis von 5:1 Formamid zu EDTA/Blau-Dextran enthielt). Die Proben wurden mit einer Vortex gemischt, abzentrifugiert, zum Denaturieren für 3 Minuten auf 90°C erhitzt und dann direkt auf ein vorelektrophoretisiertes 48 cm (gut lesbares) 4% Polyacrylamid/6 M Harnstoffgel aufgetragen und auf einem ABI PRISM^TM 377 DNA-Sequenziergerät (Perkin Elmer, Norwalk, CT) entsprechend den Anweisungen des Herstellers analysiert.
Die resultierenden Sequenzierungsspuren werden in den Figuren gezeigt. 2A, 2B und 2C stellen eine Sequenzierungsspur von einer Zyklus-Sequenzierungsreaktion unter Verwendung der F730YTma30 DNA-Polymerase bereit und die 3A, 3B und 3C stellen Sequenzierungsspuren von einer Zyklus-Sequenzierungsreaktion unter Verwendung von AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS bereit. Die Basenbestimmung wurde so eingestellt, dass sie nach dem Primer mit dem zehnten Nucleotid beginnt.
Aus einem Vergleich der Sequenzspuren ist klar, dass die Verwendung der F730YTma30 DNA-Polymerase in einer erheblichen Verbesserung der gesamten Gleichmäßigkeit der Peakhöhen resultiert, wenn sie mit den Ergebnissen verglichen werden, die unter Verwendung der AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS erhalten wurden. Im Besonderen erhöht die Verwendung der F730YTma30 DNA-Polymerase die Peakhöhen von jenen Basen wesentlich, die aufgrund des DNA-Sequenzkontexts in sehr niedrigen Peakhöhen resultieren wenn AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS verwendet wird, wie zum Beispiel G nach A oder C, A nach A oder C, und T nach T. In ähnlicher Weise vermindert die Verwendung der F730YTma30 DNA-Polymerase die Peakhöhen von jenen Basen erheblich, die aufgrund des DNA-Sequenzkontexts in sehr hohen Peakhöhen resultieren, wenn AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS verwendet wird, wie zum Beispiel A nach G. Die Gleichmäßigkeit der Peakhöhen trägt zu einer Erhöhung der Genauigkeit der Sequenzierung bei.
Die Genauigkeit der Sequenzierung, d.h. die richtig sequenzierte Basenfraktion, im Durchschnitt für zwei duplizierte Reaktionen ermittelt, wurde von den Ergebnissen der automatisierten Basebestimmung durch die ABI PRISM^TM 377 DNA-Sequenzierungssystem-Analysesoftware berechnet. Die Ergebnisse werden nachstehend in der Tabelle zusammengefasst. Üblicherweise sind die Sequenzierungsfehler in dem Bereich neben dem Primer und in den terminalen Bereichen, entfernt vom Primer, am häufigsten. Infolgedessen wurden die ersten 10 Nucleotide nach dem Primer ignoriert und die Genauigkeit wurde getrennt für die anschließenden 50 Nucleotide, die nächsten 500 Nucleotide und schließlich für die beiden terminalen Regionen, jeweils von 100 Nucleotiden Länge, berechnet.
Vergleich der Genauigkeit der Sequenzierungen
Die Ergebnisse zeigen, dass F730YTma30 DNA-Polymerase eine erhebliche Verbesserung in der Sequenzierungsgenauigkeit bereitstellt; auffallenderweise dermaßen so bei längeren Leselängen (> 560 Nucleotide). Die Verwendung der F730YTma30 DNA-Polymerase eliminiert Fehler im 500-Nucleotid-Bereich aus Nucleotiden 51–500 und aus der ersten terminalen Region aus Nucleotiden 551–650, völlig. Darüber hinaus verlängerte die Verwendung der F730YTma30 DNA-Polymerase die Länge des mit einer Genauigkeit sequenzierbaren Ziels von mindestens 97% um mindestens 100 Nucleotide, von 650 Nucleotiden unter Verwendung der AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS auf mindestens 750 Nucleotiden unter Verwendung der F730YTma30 DNA-Polymerase.
Beispiel 6
Farbstoff-Primer-Zyklussequenzierung
Dieses Beispiel zeigt die Anwendung der DNA-Polymerase der Erfindung in der Farbstoff-Primersequenzierung.
Zyklus-Sequenzierungsreaktionen werden in einem Puffer durchgeführt, der aus 25 mM Tris-HCl (pH-Wert 9,1) und 3,5 mM MgCl₂ besteht. Vier einzelne Reaktionen für jeden der vier Didesoxy-Terminatoren werden durchgeführt. Reaktionsbedingungen für jeder der vier Reaktionen werden nachstehend beschrieben:
1. Didesoxy-ATP-Reaktionen (5 μl):

100 μM jeweils von dATP, dCTP und dTTP (Perkin-Elmer),
100 μM c7dGTP (Pharmacia, Piscataway, NJ),
0,5 μM ddATP (Pharmacia),
0,1 μg M13mp18 einzelsträngige DNA-Matrize (Perkin-Elmer),
0,4 pmol JOE Farbstoff-Primer (Perkin-Elmer),
1 Einheit DNA-Polymerase, und
5 Einheiten rTth thermostabile anorganische Pyrophosphatase.

2. Didesoxy-CTP-Reaktionen (5 μl):

100 μM jeweils von dATP, dCTP und dTTP (Perkin-Elmer),
100 μM c7dGTP (Pharmacia),
0,5 μM ddCTP (Pharmacia),
0,1 μg M13mp18 einzelsträngige DNA-Matrize (Perkin-Elmer),
0,4 pmol FAM Farbstoff-Primer (Perkin-Elmer),
1 Einheit DNA-Polymerase, und
5 Einheiten rTth thermostabile anorganische Pyrophosphatase.

3. Didesoxy-GTP-Reaktionen (10 μl):

100 μM jeweils von dATP, dCTP und dTTP (Perkin-Elmer),
100 μM c7dGTP (Pharmacia, Piscataway, NJ),
0,5 μM ddCTP (Pharmacia),
0,2 μg M13mp18 einzelsträngige DNA-Matrize (Perkin-Elmer),
0,8 pmol TAMRA Farbstoff-Primer (Perkin-Elmer),
2 Einheiten DNA-Polymerase, und
10 Einheiten rTth thermostabile anorganische Pyrophosphatase.

4. Didesoxy-TTP-Reaktionen (10 μl):

100 μM jeweils von dATP, dCTP und dTTP (Perkin-Elmer);
100 μM c7dGTP (Pharmacia),
0,5 μM ddTTP (Pharmacia),
0,2 μg M13mp18 einzelsträngige DNA-Matrize (Perkin-Elmer),
0,8 pmol ROX Farbstoff-Primer (Perkin-Elmer),
2 Einheiten DNA-Polymerase, und
10 Einheiten rTth thermostabile anorganische Pyrophosphatase.

Jede der vier Reaktionen wird in einen vorgeheizten (75°C) Perkin-Elmer GeneAmp^® PCR-System-9600-Thermocycler platziert und 15 Zyklen von 96°C für 15 Sekunden, 55°C für 1 Sekunde und 70°C für 1 Minute unterzogen, gefolgt von 15 Zyklen von 96°C für 15 Sekunden und 70°C für 1 Minute. Die vier Reaktionen werden vereinigt und durch Hinzufügen von 100 μl 95% Ethanol und 2,0 μl 3 M Natriumacetat (pH-Wert 5,3) bei 4°C für 15 Minuten ausgefällt. Die vereinigte Reaktion wird für 15 Minuten mikrozentrifugiert, um den Niederschlag zu sammeln, der Überstand wird dann entfernt und das Pellet getrocknet. Das Pellet wird in 6 μl entionisiertem Formamid/50 mM EDTA (pH-Wert 8,0) 5/1 (Vol./Vol.) resuspendiert, auf 95°C für 2 Minuten erhitzt und direkt auf ein vorelektrophoretisiertes 4% Polyacrylamid/6 M Harnstoffgel aufgetragen und elektrophoretisiert und auf einem ABI PRISM^TM 377 DNA-Sequenziergerät (Perkin Elmer, Norwalk, CT) gemäß den Anweisungen des Herstellers analysiert.
Beispiel 7
Effekt von Pyrophosphatase
In den vorstehend in Beispiel 5 beschriebenen Farbstoff-Terminatorreaktionen werden 20 Einheiten der rTth-Thermostabilen-norganischen Pyrophosphatase (PPase) zu der Reaktion hinzugefügt, um die Wirkungen der Pyrophosphorolyse zu vermindern. Diese Menge an PPase ist für Reaktionen als vorteilhaft befunden worden, die AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS verwenden. Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um die Wirkung der PPase-Konzentration auf die Ergebnisse der Zyklus-Sequenzierungsreaktionen unter Verwendung von F730YTma30 DNA-Polymerase zu bestimmen.
Farbstoff-Terminator-Zyklus-Sequenzierungsreaktionen werden im Wesentlichen wie vorstehend in Beispiel 5 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die PPase-Konzentration zwischen den Reaktionen variierte. PPase-Konzentrationen von 0, 0,5, 1 und 20 Einheiten pro Reaktion wurden getestet. Die Ziel-DNA, pGEM-3Zf(+) und der verwendete Primer M13(–21) waren aus dem ABI PRISM^TM Farbstoff-Terminator-Zyklussequenzierungs-Corekit von Perkin Elmer (Norwalk, CT). Alle Reaktionen wurden in zweifacher Ausführung durchgeführt.
Die Ergebnisse jeder Sequenzierungsreaktion wurden durch direkten Vergleich der Sequenzierungsspuren verglichen. Die Ergebnisse zeigten keine offensichtlichen Unterschiede zwischen den vier PPase-Konzentrationen. Die Peakhöhen der Sequenzspuren und der Background waren bis zu einem Lesen von mindestens 500 Basenpaaren vergleichbar. Die Daten deuteten daher darauf hin, dass die Verwendung der F730YTma30 DNA-Polymerase den Zyklussequenzierungsreaktionen ermöglicht ohne PPase durchgeführt zu werden.
Beispiel 8
Optimale dITP-Konzentration
Der vorstehend in Beispiel 5 verwendete ABI PRISM^TM Farbstoff-Terminator-Zyklussequenzierungs-Corekit mit AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS (Perkin Elmer, Norwalk, CT) stellt ein dNTP-Gemisch bereit, das dITP, dATP, dCTP und dTTP in einem Verhältnis von 5:1:1:1 enthält. Die erhöhte Konzentration von dITP gleicht die niedrigere dITP-Einbaueffizienz aus, welche die AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS besitzt. Eine Analyse der Stärke von G-Signalhöhen, beschrieben in Beispiel 5, die in den Zyklus-Sequenzierungsreaktionen erzeugt werden, deuten darauf hin, dass F730YTma30 DNA-Polymerase dITP mit größerer Effizienz einbaut und infolgedessen die dITP-Konzentration verringert werden sollte. Weitere Reaktionen wurden durchgeführt, um eine optimale Konzentration von dITP für die Verwendung in Farbstoff-Terminator-Zyklus-Sequenzierungsreaktionen unter Verwendung der F730YTma30 DNA-Polymerase zu bestimmen.
Reaktionen wurden im Wesentlichen wie in Beispiel 5 beschrieben unter Verwendung des ABI PRISM^TM Farbstoff-Terminator-Zyklussequenzierungs-Corekits mit AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS durchgeführt. Anstelle des mit dem Kit bereitgestellten dNTP-Gemisches wurden dNTP-Gemische verwendet, die je 100 μM dATP, dCTP und dTTP und eine Reihe an dITP-Konzentrationen in einem TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 8, 0,1 mM EDTA) enthielten. Wie in Beispiel 5 beschrieben wurde ein F730YTma30 DNA-Polymerase/rTth-Therrnostabile-Anorganische-Pyrophosphatase-Gemisch gegen das AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS/rTth-Thermostabile-Anorganische-Pyrophosphatase-Gemisch ausgetauscht, das im Kit bereitgestellt wird.
Die optimale dITP-Konzentration wurde durch Vergleich der beiden Sequenzspuren und der nicht aufbereiteten Signalstärkedaten bestimmt. Basierend auf diesen Experimenten wurde festgestellt, dass die dITP-Konzentration vorzugsweise auf 150–250 μM gesenkt wird. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die F730YTma30 DNA-Polymerase dITP wesentlich effizienter einbaut als die AmpliTaq^® DNA-Polymerase FS.
Weitere Experimente, die durchgeführt wurden, um die F730YTma30 DNA-Polymerase mit anderen thermostabilen DNA-Polymerasen zu vergleichen (Ergebnisse nicht gezeigt), weisen auch darauf hin, dass die F730YTma30 DNA-Polymerase eine wesentlich erhöhte Effizienz des dITP-Einbaus im Vergleich mit anderen thermostabilen DNA-Polymerasen besitzt.
Hinterlegungen
Die folgenden Hinterlegungen wurden am angegebenen Datum durchgeführt:
Die Hinterlegung wurde von ROCHE MOLECULAR SYSTEMS, Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda California 94501, U.S.A. bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, U.S.A., nach den Bestimmungen des Budapester Vertrags, nach internationaler Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zwecke von Patentverfahren und den Bestimmungen darunter (Budapester Vertrag) gemacht. Das sichert die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur für 30 Jahre ab dem Hinterlegungsdatum. Der Organismus wird unter den Bedingungen des Budapester Vertrags durch die ATCC zur Verfügung gestellt werden und unterliegt einer Vereinbarung zwischen den Anmeldern und der ATCC, was eine dauernde und uneingeschränkte Verfügbarkeit der Nachkommen der Kultur für die Öffentlichkeit nach der Verleihung des entsprechenden U.S. Patents oder nach, welches auch immer zuerst kommt, der Offenlegung einer jeden U.S. oder ausländischen Patentanmeldung für die Öffentlichkeit sicherstellt und die Verfügbarkeit der Nachkommen für jemanden sicherstellt, der gemäß 35 U.S.C. § 122 und den entsprechenden Regeln des Kommissars dazu (einschließlich 37 C.F.R. § 1.14 mit besonderer Bezugnahme auf 886 OG 638), durch den U.S. Kommissar von Patenten und Warenzeichen dazu als berechtigt festgestellt wurde. Der Bevollmächtigte der vorliegenden Erfindung stimmt zu, dass falls die hinterlegte Kultur während der Züchtung unter geeigneten Bedingungen sterben, verloren gehen, oder zerstört werden sollte, sie sofort nach Benachrichtigung mit einer lebenden Probe der gleichen Kultur ersetzt wird. Die Verfügbarkeit des hinterlegten Stammes soll nicht als eine Bewilligung ausgelegt werden, die Erfindung in Zuwiderhandlung der, von irgendeiner Regierung in Übereinstimmung mit ihren Patentrechten, gewährten Verwertungsrechte auszuüben. ROCHE MOLECULAR SYSTEM, Inc., 1145 Atlantic Avenue, Alameda California 94501, U.S.A. hat F. HOFFMANN-LA ROCHE AG. 124 Grenzacherstrasse, CH-4070 Basel, Schweiz, beauftragt sich in ausländischen Patentanmeldungen unter Prioritätsbeanspruchung aus der U.S. Patentanmeldungs-Seriennummer 60-023376, auf das vorstehend erwähnte, hinterlegte, biologische Material zu beziehen und hat die uneingeschränkte und unwiderrufliche Zustimmung gegeben, dass das hinterlegte Material der Öffentlichkeit zugänglich gemacht wird.

Claims

Thermostabile DNA-Polymerase, bestehend aus einer N-terminalen Region und einer C-terminalen Region, wobei (a) die C-terminale Region aus Aminosäuren m+1 bis 893 der Thermatoga maritima (Tma)-DNA-Polymerase, SEQ ID NO: 10, besteht und wobei m zwischen 137 und 291 ist; (b) die N-terminale Region aus den Aminosäuren 1 bis n einer DNA-Polymerase einer Thermus-Art besteht, wobei die Tma-DNA-Polymerase, SEQ ID NO: 10, gemäß den 1A und 1B mit der DNA-Polymerase einer Thermus-Art abgeglichen wird, um eine maximale Gesamtsequenzhomologie zu erzielen, und n entweder eine Aminosäure ist, die abgeglichen ist mit der Aminosäure m der Tma-DNA-Polymerase oder, im Falle dass die Aminosäure m der Tma-DNA-Polymerase mit einer Lücke abgeglichen ist, die erste Aminosäure, die der Lücke folgt; (c) wobei die N-terminale Region modifiziert ist durch mindestens eine Punktmutation, welche die 5'-Nucleaseaktivität in hohem Maße reduziert oder eliminiert, wenn 5'-Nucleaseaktivität in der DNA-Polymerase der Thermus-Art vorhanden ist, oder wobei die C-terminale Region innerhalb der Region, die durch Aminosäuren m+1 bis 291 der Tma-DNA-Polymerase dargestellt ist, durch mindestens eine Punktmutation modifiziert ist, welche die 5'-Nucleaseaktivität in hohem Maße reduziert oder eliminiert, wenn 5'-Nucleaseaktivität in der Tma-DNA-Polymerase vorhanden ist; (d) wobei die C-terminale Region durch mindestens eine Punktmutation modifiziert ist, welche die 3'- nach 5'-Exonucleaseaktivität in hohem Maße reduziert, wenn 3'- nach 5'-Exonucleaseaktivität in der Tma-DNA-Polymerase vorhanden ist; und (e) wobei die C-terminale Region so modifiziert ist, dass diese bei Aminosäure 730 der Tma-DNA-Polymerase (SEQ ID NO: 10) ein Tyrosin enthält.
Thermostabile DNA-Polymerase nach Anspruch 1, wobei die N-terminale Region eine Punktmutation bei einer Aminosäure enthält, die abgeglichen ist mit einer Aminosäure in der Taq-DNA-Polymerase, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus D18, R25, G46, D67, F73, R74, Y81, G107, E117, D119, D120, D142, D144, G187, D188, D191 und G195 gemäß der Abgleichung wie dargestellt in 1A und 1B.
Thermostabile DNA-Polymerase nach Anspruch 1, wobei die C-terminale Region eine Punktmutation an einer Aminosäureposition enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus D323, E325, L329, N385, D389, L393, Y464 und D468 der Tma-DNA-Polymerase (SEQ ID NO: 10).
Thermostabile DNA-Polymerase nach Anspruch 2, wobei die N-terminale Region eine Asparaginsäure an einer Aminosäure enthält, die abgeglichen ist mit der Aminosäure G46 der Taq-DNA-Polymerase gemäß der Abgleichung wie dargestellt in 1A und 1B.
Thermostabile DNA-Polymerase nach Anspruch 3, wobei die C-terminale Region eine D323A- oder E325A-Mutation der Tma-DNA-Polymerase (SEQ ID NO: 10) enthält.
Thermostabile DNA-Polymerase nach Anspruch 1, wobei die Thermus-Art ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Thermus aquaticus, Thermus flavus, Thermus thermophilus, Thermus species Z05, Thermus caldofilus, Thermus species sps17 und Thermus filiformis.
Thermostabile DNA-Polymerase nach Anspruch 6, wobei die Thermus-Art Thermus aquaticus ist.
Thermostabile DNA-Polymerase nach Anspruch 7, wobei n = 190 ist.
Thermostabile DNA-Polymerase nach Anspruch 8, wobei die N-terminale Region eine G46D-Mutation enthält, und wobei die C-terminale Region eine D323A-Mutation und eine E325A-Mutation der Tma-DNA-Polymerase (SEQ ID NO: 10) enthält.
Isolierte DNA, die eine thermostabile DNA-Polymerase codiert, wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht.
Plasmid, umfassend eine DNA, die eine thermostabile DNA-Polymerase codiert, wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht.
Expressionsvektor, enthaltend eine DNA, die eine thermostabile DNA-Polymerase codiert, wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht.
Wirtszelle, transformiert mit einem Expressionsvektor umfassend eine DNA, die eine thermostabile DNA-Polymerase codiert, wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 beansprucht.
Verfahren zur Herstellung einer thermostabilen DNA-Polymerase, umfassend: (a) Züchten einer Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor transformiert ist, umfassend eine DNA, die eine thermostabile DNA-Polymerase wie beansprucht in einem der Ansprüche 1 bis 9 codiert, unter Bedingungen, welche die Expression der thermostabilen DNA-Polymerase begünstigen; und (b) Isolieren der thermostabilen DNA-Polymerase aus der Wirtszelle.
Thermostabile DNA-Polymerase, hergestellt nach einem Verfahren wie beansprucht in Anspruch 14.
Verfahren zur Sequenzierung einer Nucleinsäure, wobei eine thermostabile DNA-Polymerase wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 oder 15 beansprucht, verwendet wird.
Verwendung einer thermostabilen DNA-Polymerase wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 oder 15 beansprucht, in einer Nucleinsäureamplifikations- oder -sequenzierungsreaktion.
Zusammensetzung, umfassend eine thermostabile DNA-Polymerase wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 oder 15 beansprucht, und ein oder mehrere nicht-ionische(s) polymere(s) Detergenzien.
Kit zur Ausführung einer Primerverlängerungsreaktion, umfassend eine thermostabile DNA-Polymerase wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 oder 15 beansprucht.