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Diese
Anmeldung beansprucht die Priorität von Mamone et al., US Serien-Nr.
08/766,014, eingereicht am 13. Dezember 1996, mit dem Titel „Thermostable
DNA-Polymerase From
Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus", die die Priorität von U.S. Serien-Nr. 60/008,688,
eingereicht am 15. Dezember 1995, mit dem Titel „Thermostable DNA-Polymerase" beansprucht.
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Hintergrund
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue thermostabile DNA-Polymerasen,
die aus dem thermophilen anaeroben Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus
erhältlich
sind, auf bestimmte Deletanten und Mutanten dieses Enzyms, auf Gene
und Vektoren, die die Wildtyp- und mutanten Polymerasen kodieren, und
ihre Verwendung in Strang-Verdrängungs-Aktivität, Polymerasekettenreaktion,
DNA-Sequenzierung
und als Reverse Transkriptasen. Das Folgende ist eine Diskussion
der relevanten Technik, von denen keine als Stand der Technik für die beigefügten Ansprüche anerkannt
wird. DNA-Polymerasen sind eine Familie von Enzymen, die in der
DNA-Reparatur und -Replikation involviert sind. DNA-Polymerasen
wurden aus E.coli (z.B. E.coli-DNA-Polymerase I und das Klenow-Fragment
davon) isoliert und T4-DNA-Polymerase und kürzlich thermostabile DNA-Polymerasen
wurden isoliert (z.B. aus T.aquaticus, US Patent 4,889,818 und aus
T.litoralis). Thermostabile DNA-Polymerasen
wurden vorgeschlagen (US Patent 4,683,195) zur Verwendung bei der
Amplifikation existierender Nucleinsäuresequenzen in Mengen, die
groß sind
im Vergleich zu der ursprünglich
vorhandenen. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) und die Strang-Verdrängungs-Amplifikation
(SDA) sind zwei Verfahren zum Amplifizieren von Nucleinsäuresequenzen.
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PCR
basiert auf der Hybridisierung von Oligonucleotid-Primern an spezifische
Sequenzen entgegengesetzter Stränge
des Ziel-DNA-Moleküls
und nachfolgender Verlängerung
dieser Primer mit einer DNA-Polymerase, um zwei neue Stränge DNA
zu erzeugen, die selbst als eine Matrize für eine weitere Runde der Hybridisierung
und Verlängerung
dienen können.
In PCR-Reaktionen dient das Produkt eines Zyklus als die Matrize
für den
nächsten
Zyklus derart, dass jede Wiederholung des Zyklus die Menge der spezifischen,
in der Reaktion vorhandenen Sequenz verdoppelt, was zu einem exponentiellen
Amplifikationsprozess führt.
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PCR
beruht auf einem Prozess des Temperatur-Cyclings, um die Amplifikations-Reaktion zu fördern. Dieses
Temperatur-Cycling ist nötig,
um die Stränge
der in einem Zyklus der Reaktion gebildeten DNA zu trennen, um eine
Hybridisierung der Oligonucleotide, die zum Initiieren des nächsten Zyklus
erforderlich sind, zu ermöglichen.
DNA-Strang-Trennung wird üblicherweise
durch Schmelzen der DNA bei Temperaturen im Bereich von 90–100 °C gefolgt
von Kühlen
auf eine niedrigere Temperatur erreicht, um eine Oligonucleotidhybridisierung,
gefolgt von Verlängerung
oder Ligation, zu ermöglichen,
abhängig
vom Reaktionsprozeß.
Dieser Cycling-Prozeß kann 20
bis 50 Mal wiederholt werden, wieder abhängig vom Prozess und dem Grad
der erforderlichen Amplifikation.
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Temperatur-Cycling
wird normalerweise durch die Verwendung einer spezialisierten Ausrüstung erreicht,
allgemein genannt Thermocyclers, die durch eine weite Vielfalt mechanischer,
elektrischer oder hydraulischer Mittel arbeiten können, aber
einem gemeinsamen Zweck beim Heizen und Kühlen eines kleinen Behälters oder
einer Anzahl derartiger Behälter
dienen, in dem/denen die Amplifikations-Reaktion ausgeführt wird.
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Damit
die Amplifikations-Reaktionen mit der erwünschten Effizienz und Spezifität voranschreiten,
ist es nötig,
den Temperatur-Cycling-Prozess innerhalb von strikt definierten
und reproduzierbaren Grenzen der Temperatur und Zeit auszuführen. Ein
Fehlschlag des Temperatur-Cycling-Gerätes, die erwünschten
Bedingungen zu erreichen, wird zum teilweisen oder gesamten Fehlschlag
der Amplifikations-Reaktion
führen.
Diese strikten Erfordernisse für
die Zeit und die Temperatur des Cyclings kann starke Beschränkungen
auferlegen, falls die Handhabung großer Anzahlen von Reaktionen
erforderlich ist. Falls es erwünscht
ist, mehrere hundert oder mehr Reaktionen gleichzeitig auszuführen, würde die
Verwendung herkömmlicher
Thermocycler extrem teuer in Bezug auf die Kapitalinvestition sein,
die in die Ausrüstung
erforderlich ist, und würde
in jedem Fall zu Schwankungen zwischen individuellen Thermocyclern
neigen. Alternative Lösungen
für die
Verwendung im großen
Maßstab
wurden konstruiert, basierend auf einem mit einem Gebläse unterstützten Ofen
oder mehreren Wasserbädern,
aber derartige Lösungen
sind unvermeidbar mühsam
in der Verwendung und erfordern noch in jedem Fall, dass der Benutzer
die normalen zwingenden Schritte zum Vermeiden einer Verdampfung unternimmt,
welche extrem schwierig werden, um sie auf eine große Anzahl
von Cyclern anzuwenden.
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In
der Reverse-Transkription/Polymerasekettenreaktion (RT/PCR) wird
ein DNA-Primer an
einen Strang des Ziel-RNA-Moleküls
hybridisiert und die nachfolgende Verlängerung dieses Primers mit
einer Reversen Transkriptase erzeugt einen neuen Strang DNA, die
als eine Matrize für
PCR dienen kann. Die Herstellung der DNA-Matrize wird bevorzugt bei einer erhöhten Temperatur
ausgeführt,
um eine frühe
Beendigung der Reaktion der Reversen Transkriptase, die durch die
sekundäre
RNA-Struktur verursacht wird, zu vermeiden. Es gibt einen Mangel
effizienter Reverser Transkriptasen, die bei erhöhten Temperaturen, z.B. über 50 °C, arbeiten.
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SDA
unterscheidet sich von PCR darin, dass sie ein isothermer Amplifikations-Prozess ist, d.h.
alle Reaktionen erfolgen bei derselben Temperatur ohne die Notwendigkeit
für erhöhte Temperaturen,
um DNA-Stränge
zu schmelzen. Dies wird es möglich
durch Annahme eines Reaktionsschemas, das die Fähigkeit bestimmter DNA-Polymerasen
nutzt, dass sie, wenn sie sich entlang eines DNA-Matrize-Stranges erstrecken. alle
DNA-Moleküle,
die bereits an die Matrize hybridisiert sind, verdrängen. In
der SDA wird diese Strang-Verdrängung
verwendet, um die erzeugte Doppelstrang-DNA während des Reaktionsprozesses
zu trennen und daher eine kontinuierliche Amplifikation der Ziel-DNA-Sequenz
aufrechtzuerhalten (Walker, G. T., Little, M.C., Nadeau, J.G. and
Shank D.D. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392–396). SDA
ist deshalb im Prinzip zur Verwendung mit großen Anzahlen von Proben geeigneter
als PCR, da der isotherme Prozess, der bei Temperaturen von 37 °C bis 60 °C ausgeführt wird,
nicht erfordert, strenge Vorsichtsmaßnahmen zu ergreifen, um das
Verdampfen zu vermeiden, und kann mit einer einfachen Temperatursteuerungsausrüstung ausgeführt werden,
z.B. in einem Standardlaborinkubator.
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DNA-Polymerasen,
z.B. Sequenase, Klenow, Taq, etc., wurden auch beim DNA-Sequenzieren extensiv
verwendet, siehe z.B. „Molecular
Cloning: A Laboratory Manual" (Sambrook,
Fritsch, und Maniatis, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor laboratory
Press, 1989).
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine thermostabile DNA-Polymerase von
Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus, bereit.
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Dieses
Enzym ist für
Prozeduren nützlich,
die eine Strang-verdrängende
DNA-Synthese erfordern,
wie SDA für
DNA-Sequenzieren, Reverse Transkription und Polymerasekttenreaktion.
Enthalten im Umfang der vorliegenden Erfindung sind verschiedene
Mutanten (Deletion und Substitution), die die Thermostabilität und die
Fähigkeit
zum Replizieren von DNA mit im wesentlichen derselben Effizienz
wie die native Thermoananaerobacter thermohydrosulfuricus-Polymerase
beibehält.
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Im
einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine gereinigte
DNA-Polymerase oder
ein Fragment davon bereit, die die DNA-Polymerase-Aktivität von Thermoanaerobacter
thermohydrosulfuricus der SEQ. ID. Nr. 2 besitzt und deren Exonuclease-Aktivität durch
Austauschen des Asparaginsäure-Restes
in Position 8 mit einem Alanin-Rest entfernt ist und die mindestens
80 % Aminosäure-Homologie,
bevorzugt mindestens 900-Homologie zu mindestens einer zusammenhängenden Aminosäuresequenz
aufweist, die in 2A–D (SEQ. ID. Nr. 2) dargestellt
ist. 2A–D
repräsentiert
die Translation von einen offenen Leserahmen umspannenden Nucleotiden
1056–3674
einer Genom-DNA, die eine thermostabile DNA-Polymerase von Thermoanaerobacter
thermohydrosulfuricus (1A–E) (SEQ. ID. Nr. 1) kodiert,
die möglicherweise
die native Polymerase kodiert.
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Wenn
hier verwendet, bedeutet der Begriff Aminosäure-Homologie die Aminosäure-Identität des Eltern-Enzyms
oder konservative Aminosäure-Änderungen
daran. Die DNA-Polymerase kann durch eine Nucleinsäuresequenz
einer vollen Länge
oder einen beliebigen Teil der Nucleinsäuresequenz der vollen Länge kodiert
werden, solange wie eine funktionelle Aktivität des Polypeptids beibehalten
wird. Die Aminosäure-Sequenz
wird im wesentlichen der in 2A–D gezeigten
Sequenz oder Fragmenten davon ähnlich
sein. Eine Sequenz, die im wesentlichen ähnlich ist, wird bevorzugt
mindestens 80% Identität
(bevorzugter mindestens 90% und am meisten bevorzugt 98–100%) zur
Sequenz der 2A–D besitzen.
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Mit „Identität" ist eine Eigenschaft
von Sequenzen gemeint, die ihre Ähnlichkeit
oder Verwandtschaft misst. Identität wird durch Teilen der Anzahl
identischer Reste durch die Gesamtzahl von Resten und Multiplizieren
des Produktes mit 100 bemessen. So können zwei Kopien von genau
derselben Sequenz 100% Identität
besitzen, aber Sequenzen, die weniger stark konserviert sind und
Deletionen, Additionen oder Ersetzungen besitzen, können einen
niedrigeren Grad der Identität
besitzen. Jene Fachleute werden erkennen, dass mehrere Computerprogramme
zum Bestimmen der Sequenzidentität
erhältlich
sind.
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Das
gereinigte Enzym der vorliegenden Erfindung besitzt ein Molekulargewicht
von annähernd
90.000 Dalton, wenn es auf SDS-PAGE gemessen wird. Es besitzt eine
5'-3'-Exonuclease-Aktivität. Das Temperaturoptimum
der DNA-Synthese liegt nahe 75 °C
unter Assay-Bedingungen. Die optimalen Magnesiumion- und Manganion-Konzentrationen für die DNA-Synthese
sind 1 mM bzw. 0,5 mM.
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Der
Begriff thermostabile Polymerase bedeutet ein Enzym, das gegenüber Wärme stabil
(und wärmeresistent)
ist und zur Verwendung in SDA und/oder Sequenzieren bei einer erhöhten Temperatur
geeignet ist, z.B. 70 °C.
Das thermostabile Enzym hier muss einem einzelnen Kriterium genügen, um
für die
Amplifikations-Reaktion wirksam zu sein, d.h. das Enzym darf nicht
irreversibel denaturiert (inaktiviert) werden, wenn es den erhöhten Temperaturen
für die
Zeitdauer, die zum Bewirken der Amplifikation nötig ist, ausgesetzt wird. Die
irreversible Denaturierung für
die Zwecke hier bezieht sich auf einen permanenten und vollständigen Verlust
der enzymatischen Aktivität.
Bevorzugt wird das Enzym nicht irreversibel denaturiert bei ungefähr 70 °C, aber kann
bei höheren
Temperaturen denaturiert werden. Das hier genannte thermostabile
Enzym besitzt bevorzugt eine optimale Temperatur, bei der es funktioniert,
die höher
ist als ungefähr
40 °C, welche
die Temperatur ist, unterhalb derer die Hybridisierung des Primers
an die Matrize gefördert
wird, obwohl, abhängig
von (1) der Salzkonzentration und der Zusammensetzung und (2) der
Zusammensetzung und der Länge
des Primers, die Hybridisierung bei höheren Temperaturen (z.B. 45–70 °C) erfolgen
kann. Je höher
das Temperaturoptimum für
das Enzym ist, desto größer ist
die Spezifität
und/oder Selektivität
des vom Primer dirigierten Verlängerungsprozesses.
Jedoch liegen Enzyme, die unterhalb 40 °C aktiv sind, z.B. bei 37 °C, auch innerhalb des
Umfangs dieser Erfindung, vorausgesetzt, dass sie wärmestabil
sind. Bevorzugt reicht die optimale Temperatur von ungefähr 50 bis
80 °C, bevorzugter
50–70 °C.
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Wenn
hier verwendet, bedeutet der Begriff eine DNA-Polymerase oder ein
Fragment davon, die/das die DNA-Polymerase-Aktivität von Thermoanaerobacter
thermohydrosulfuricus besitzt, eine DNA-Polymerase oder ein Fragment
davon (wie hiernach definiert), die die Fähigkeit hat, DNA mit im wesentlichen
derselben Effizienz wie das durch die SEQ. ID. Nr. 1 kodierte Enzym
zu replizieren. Mit im wesentlichen derselben Effizienz ist gemeint
mindestens 80 % und bevorzugt mindestens 90 der Effizienz des Enzyms,
das durch SEQ. ID. Nr. 1 kodiert wird, um Desoxynucleotide einzubauen.
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Die
Erfindung umfasst auch eine stabile Enzymzusammensetzung, die eine
gereinigte thermostabile DNA-Polymerase von Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus
der SEQ. ID. Nr. 2 umfasst und deren Exonuclease-Aktivität durch
Austauschen des Asparaginsäure-Restes
in Position 8 mit einem Alanin-Rest in einem Puffer entfernt ist.
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Die
DNA-Polymerasen der vorliegenden Erfindung liegen bevorzugt in gereinigter
Form vor. Mit gereinigt ist gemeint, dass die DNA-Polymerase von
einer Mehrzahl von Wirtszellenproteinen, die normalerweise damit
in Verbindung stehen, isoliert ist; bevorzugt beträgt die Polymerase
mindestens 10% (gew/gew), z.B. mindestens 50 % (gew/gew) des Proteins
eines Präparats,
sogar bevorzugt wird sie als ein homogenes Präparat bereitgestellt, z.B.
eine homogene Lösung.
Bevorzugt ist die DNA-Polymerase ein einzelnes Polypeptid auf einem
SDS-Polyacrylamidgel.
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Puffer
um den neutralen pH (5–9),
wie 5–100
mM Tris-HCl, Phosphat oder MES sind zur Verwendung in der vorliegenden
Erfindung geeignet.
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Es
wurde gefunden, dass die gesamte Aminosäuresequenz der Polymerase nicht
für die
enzymatische Aktivität
erforderlich ist. Daher wurde z.B. die Exonuclease-Domäne deletiert,
um ein Enzym eines Molekulargewichts von annähernd 64.000 Dalton, wenn es
auf SDS-PAGE gemessen wird, zu ergeben, das die Enzymaktivität beibehält und auch
eine Aktivität
der Reversen Transkriptase besitzt, was es zum Herstellen von cDNA
nützlich
macht. Dieses Exonuclease-freie Enzym ist analog dem Klenow-Fragment
von E.coli-DNA-Polymerase I. So stellt die vorliegende Erfindung
auch Fragmente der Polymerase bereit, die die DNA-Polymerase-Aktivität von Thermoanaerobacter
thermohydrosulfuricus beibehalten, aber eine oder mehrere Aminosäuren, bevorzugt
vom Amino-Terminus, deletiert haben, während sie noch mindestens 80%
Aminosäure-Homologie
zu mindestens 40-zusammenhängender
Aminosäuresequenz,
die in 2A–D (SEQ. ID. Nr. 2) dargestellt
sind, besitzt.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine thermostabile
DNA-Polymerase bereit, die
der DNA-Polymerase von Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus
entspricht, in der bis zu einem Drittel der Aminosäuresequenz
am Amino-Terminus deletiert worden ist. Insbesondere wurde gefunden,
dass Fragmente von Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus, die
N-terminale Deletionen aufweisen, um 578 Aminosäuren (siehe 4A–C) (SEQ.
ID. Nr. 4) und 608 Aminosäuren
(siehe 3) (SEQ. ID. Nr. 3) zu ergeben, die Enzymaktivität beibehalten.
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Es
ist bevorzugt, dass die 5'-3'-Exonuclease-Aktivität der DNA-Polymerase
entfernt oder verringert ist. Dies kann durch Deletieren des Aminosäurebereichs
des Enzyms, das für
diese Aktivität
verantwortlich ist, erreicht werden, z.B. durch Deletieren bis zu
einem Drittel der Aminosäuresequenz
am Amino-Terminus, oder durch geeignete Aminosäure-Änderungen.
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Zusätzlich zu
den N-terminalen Deletionen und Aminosäure-Änderungen, um die Exonuclease-Aktivität zu entfernen
kann das Enzym konservative Aminosäure-Änderungen
im Vergleich zum nativen Enzym besitzen, die die Thermostabilität oder Enzymaktivität nicht
signifikant beeinflussen. Derartige Änderungen umfassen die Substitution
von gleich geladenen Aminosäuren
durch eine andere oder Aminosäuren
mit kleinen Seitenketten für
andere kleine Seitenketten, z.B. ala für val. Drastischere Änderungen
können
an nicht-kritischen Bereichen eingeführt werden, wo wenig oder kein
Effekt auf die Polymerase-Aktivität durch eine derartige Änderung
beobachtet wird.
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Joyce
und Steitz, Annu. Rev. Biochem, 63:777–822, 1994 diskutieren verschiedene
Funktionen der DNA-Polymerasen einschließlich des katalytischen Zentrums,
der Bindungsstelle für
den 3'-Terminus
der Primers und die dNTP-Bindungsstelle. Insbesondere erwähnt sie
Mutationen, die das Binden des dNTP im ternären Komplex beeinflussen können. Die
europäische
Patentanmeldung Nr. 0 655 506 A offenbart, dass das Vorhandensein
eines polaren, Hydroxyl-enthaltenden Aminosäurerests an einer Position
nahe der Bindungsstelle für
das dNTP-Substrat dafür
wichtig ist, dass die Polymerase fähig ist, ein Didesoxynucleotid
effizient einzubauen. Der Anmelder hat erkannt, dass die Modifikation
der dNTP-Bindungsstelle
für das
dNTP-Substrat in einer DNA-Polymerase, die von Thermoanaerobacter
thermohydrosulfuricus erhältlich
ist, durch den Einschluss eines polaren, Hydroxyl-enthaltenden Aminosäurerestes
an einer Position nahe der Bindungsstelle die Effizienz der Polymerase,
ein Didesoxynucleotid einzubauen, vergrößert. Bevorzugt ist die polare,
Hydroxyl-enthaltende Aminosäure
Tyrosin. Es wurde auch gefunden, dass Austauschen des Phenylalanins
an der Position, die 706 des nativen Enzyms entspricht, durch Tyrosin
den Einbau von Didesoxynucleotiden verbessert, wenn das Enzym zum
Sequenzieren verwendet wird. Insbesondere ist eine Polymerase von
Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus, in der die Exonuclease-Aktivität gelöscht wurde,
z.B. durch Punktmutation oder Deletion, und bei der das Phenylalanin
an der Position, die 706 des nativen Enzyms entspricht, durch eine Aminosäure ersetzt
ist, die die Effizienz des Enzyms zum Einbauen von Didesoxynucleotiden
mindestens 20-fach im Vergleich zum Wildtyp-Enzym, z.B. Tyrosin,
vergrössert,
ein besonders bevorzugtes Enzym zur Verwendung beim Sequenzieren.
Bevorzugt besitzt dieses modifizierte Enzym zwischen 540 und 582
Aminosäuren,
z.B. 560 bis 582 Aminosäuren
und bevorzugt 578 Aminosäuren.
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Die
DNA-Polymerasen der vorliegenden Erfindung können unter Verwenden von Standardtechniken konstruiert
werden, die jenen, die die Technik ausführen, geläufig sind. Im Wege des Beispiels
können,
um eine Polymerase mit der Phenylalanin-zu-Tyrosin-Mutation herzustellen, mutagene
Primer entworfen werden, damit sie die erwünschten Phe-zu-Tyr-Aminosäureänderung
(FY-Mutation in einem Primer) einbauen. Die Deletion der Exonuclease-Funktion
wird durch PCR, um den Amino-Terminus
zu entfernen, oder Standardtechniken von auf Stellen gerichtete
Mutagenese, um Punktmutationen zu erzeugen, ausgeführt.
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Verbesserte
Expression der DNA-Polymerasen der vorliegenden Erfindung kann erreicht
werden durch Änderungen
von stummen Codons (d.h. die kodierte Aminosäure wird nicht geändert).
Derartige Änderungen
können
durch die Verwendung mutagener PCR-Primer eingeführt werden. Änderungen
von stummen Codons, wie die folgenden, vergrößern die Proteinproduktion
in E.coli:
Substitution des Codons GAG für GAA;
Substitution des
Codons AGG, AGA, CGG oder CGA für
CGT oder CGC;
Substitution des Codons CTT, CTC, CTA, TTG oder
TTA für
CTG;
Substitution des Codons ATA für ATT oder ATC;
Substitution
des Codons GGG oder GGA für
GGT oder GGC.
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Die
DNA-Polymerasen der vorliegenden Erfindung werden geeigneterweise
in SDA, bevorzugt in Kombination mit einem thermostabilen Restriktionsenzym
verwendet. Demgemäß stellt
die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die eine
DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung in Kombination mit einem
thermostabilen Restriktionsenzym umfasst, z.B. BsoBI von Bacillus
stearothermophilus. Die Erfindung bietet auch ein Kit oder eine
Lösung
für SDA,
umfassend eine DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung in Kombination
und ein thermostabiles Restriktionsenzym.
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Die
Polymerasen der vorliegenden Erfindung sind auch nützlich in
Verfahren zum Erzeugen und Amplifizieren eines Nucleinsäure-Fragmentes über einen
Strang-Verdrängungs-Amplifikations(SDA)-Mechanismus.
Das Verfahren umfasst allgemein:
- a) spezifisches
Hybridisieren eines ersten Primers 5' an eine Ziel-Nucleinsäuresequenz, wobei der erste Primer
eine Restriktionsenzym-Erkennungssequenz
5' an eine Zielbindungsregion
enthält;
- b) Verlängern
des 3'-Endes des
hybridisierten Materials unter Verwenden einer DNA-Polymerase der
vorliegenden Erfindung bevorzugt eine, in der die Exonuclease-Aktivität entfernt
worden ist, bei Vorhandensein von drei dNTPs und einem dNTP ∝ S;
- c) bevorzugt Nicking an der Hemiphosphorothioat-Erkennungsstelle
mit einem Restriktionsenzym;
- d) Verlängern
des 3'-Endes an
der Nick-Stelle unter Verwenden einer DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung,
wobei das Strangabwärts-Komplement des Zielstranges
ersetzt wird; und
- e) Wiederholen der Schritte (c) und (d).
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Dieses
SDA-Verfahren schreitet mit einer linearen Amplifikations-Geschwindigkeit
voran, falls ein Primer wie oben verwendet wird. Jedoch, falls zwei
Primer verwendet werden, die an jeden Strang eines Doppel-Strang-DNA-Fragmentes
hybridisieren, schreitet das Verfahren exponentiell voran (Walker,
G.T., Little, M.C., Nadeau, J.G. und Shank D.D. (1992) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 89:392–396).
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Bestimmen der
Nucleotidbasensequenz eines DNA-Moleküls bereit. Das Verfahren umfasst
Bereitstellen eines DNA-Moleküls,
Assoziieren mit einem Primermolekül, das fähig ist, an das DNA-Molekül zu hybridisieren;
und Inkubieren der assoziierten Moleküle in einem Gefäß, das mindestens
ein und bevorzugt vier Desoxynucleotidtriphosphate und eine DNA-Polymerase
der vorliegenden Erfindung enthält,
bevorzugt eine, die die Phenylalanin-zu-Tyrosin-Mutation enthält. Auch
wird mindestens ein DNA-Synthese-terminierendes Mittel bereitgestellt,
das die DNA-Synthese
an einer spezifischen Nucleotidbase terminiert. Das Verfahren umfasst
weiter Trennen der DNA-Produkte der Inkubier-Reaktion nach der Größe, wodurch
mindestens ein Teil der Nucleotidbasensequenz des DNA-Moleküls bestimmt werden
kann.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
wird das Sequenzieren bei einer Temperatur zwischen 40 und 75 °C ausgeführt.
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In
anderen bevorzugten Ausführungsformen
besitzt die DNA-Polymerase weniger als 1.000, 250, 100, 50, 10 oder
sogar 2 Einheiten der Exonuclease-Aktivität pro mg Polymerase (gemessen
durch eine Standardprozedur, siehe unten) und ist fähig, Primer
mit nur 4, 6 oder 10 Basen einzusetzen; und die Konzentration aller vier
Desoxynucleosidtriphosphate beim Beginn des Inkubationsschrittes
in ausreichend, um zu ermöglichen, dass
die DNA-Synthese fortgesetzt wird, bis sie durch das Mittel, z.B.
ein ddNTP, terminiert wird.
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Bevorzugt
wird mehr als 2, 5, 10 oder sogar 100-facher Überschuß eines dNTPs dem entsprechenden ddNTP
bereitgestellt.
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In
einem verwandten Aspekt bietet die Erfindung ein Kit oder eine Lösung zum
DNA-Sequenzieren, umfassend
eine DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung und ein Reagenz,
das zum Sequenzieren nötig ist,
wie ein dITP, deaza-dGTP, ein Kettenterminierendes Mittel wie ein
ddNTP und gegebenenfalls eine Pyrophosphatase.
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Die
DNA-Polymerasen der vorliegenden Erfindung, die die Phenylalanin-zu-Tyrosin-Mutation enthalten,
werden auf geeignete Weise beim Sequenzieren verwendet, bevorzugt
in Kombination mit einer Pyrophosphatase. Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung
eine Zusammensetzung bereit, umfassend eine DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung,
die die Phenylalanin-zu-Tyrosin-Mutation enthält, in Kombination mit einer
Pyrophosphatase, bevorzugt eine thermostabile Pyrophosphatase von
Thermoplasma acidophilum.
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In
einem anderen verwandten Aspekt bietet die Erfindung ein Verfahren
zum Sequenzieren eines DNA-Stranges, im wesentlichen wie oben beschrieben,
mit einer oder mehreren (bevorzugt 2, 3 oder 4) Desoxyribonucleosidtriphosphaten,
einer DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung und ein erstes Ketten-terminierendes
Mittel. Die DNA-Polymerase verursacht, dass der Primer verlängert wird,
um eine erste Reihe von ersten DNA-Produkten zu bilden, die sich
in der Länge
des verlängerten
Primers unterscheiden, wobei jedes erste DNA-Produkt ein Kettenterminierendes
Mittel an seinem verlängerten
Ende besitzt, und die Anzahl von Molekülen jedes ersten DNA-Produktes
annähernd
dieselben für
im wesentlichen alle DNA-Produkte sind, die sich in der Länge durch
nicht mehr als 20 Basen unterscheiden. Das Verfahren bietet auch
Bereitstellen eines zweiten Ketten-terminierenden Mittels in der hybridisierten
Mischung bei einer Konzentration, die sich vom ersten Ketten-terminierenden
Mittel unterscheidet, wobei die DNA-Polymerase die Erzeugung einer zweiten
Reihe von zweiten DNA-Produkten verursacht, die sich in der Länge des
verlängerten
Primers unterscheidet, wobei jedes zweite DNA-Produkt das zweite
Ketten-terminierende Mittel an seinem verlängerten Ende besitzt. Die Anzahl
von Molekülen
jedes zweiten DNA-Produktes ist annähernd dieselbe für im wesentlichen
alle zweiten DNA-Produkte, die sich in der Länge voneinander um 1 bis 20
Basen unterscheiden, und ist merklich verschieden von der Anzahl
der Moleküle
all der ersten DNA-Produkte mit einer Länge, die sich um nicht mehr als
20 Basen von jener der zweiten DNA-Produkte unterscheidet.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
können
drei oder vier derartige Ketten-terminierende
Mittel verwendet werden, um unterschiedliche Produkte herzustellen,
und die Sequenzreaktion wird mit einem Magnesiumion, oder sogar
einem Mangan- oder
Eisenion (z.B. bei einer Konzentration zwischen 0,05 und 100 mM, bevorzugt
zwischen 1 und 10 mM) bereitgestellt; und die DNA-Produkte werden
gemäß des Molekulargewichts in
vier oder weniger Spuren eines Gels getrennt.
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In
einem anderen verwandten Aspekt bietet die Erfindung ein Verfahren
zum Sequenzieren einer Nucleinsäure
durch Kombinieren eines Oligonucleotid-Primers einer zu sequenzierenden
Nucleinsäure,
zwischen einem und vier Desoxyribonucleosidtriphosphaten, eine DNA-Polymerase
der vorliegenden Erfindung und mindestens zwei Ketten-terminierende
Mittel in verschiedenen Mengen, unter Bedingungen, die die Verlängerung
des Oligonucleotid-Primers begünstigen,
um Nucleinsäurefragmente
zu bilden, die zu der zu sequenzierenden Nukleinsäure komplementär sind.
Das Verfahren umfasst weiter Trennen der Nucleinsäurefragmente
durch Größe und Bestimmen
der Nucleinsäuresequenz.
Die Mittel werden voneinander durch die Intensität eines Labels in den Primer-Verlängerungsprodukten
unterschieden.
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In
einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren
zum Herstellen komplementärer
DNA durch Kombinieren eines Oligonucleotid-Primers, einer Probe
RNA, einer DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung und zwischen
einem und vier Desoxyribonucleosidphosphaten bereit, unter Bedingungen, die
die Herstellung der komplementären
DNA begünstigen.
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Die
DNA-Polymerasen der vorliegenden Erfindung, die als Reverse Transkriptasen
wirken, fehlen in beträchtlichem
Ausmaß,
und bevorzugt haben sie keine RNaseH-Aktivität und, als solche, sind sie
in RT/PCR der Herstellung von Hybridisierungs-Sonden und RNA-Sequenzierung nützlich.
In einem noch weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung gereinigte
thermostabile Reverse Transkriptase bereit, mit einer Aktivität der Reversen
Transkriptase von mehr als 1.000 Einheiten pro mg. Bevorzugt fehlt
der Reversen Transkriptase RNaseH-Aktivität; die Reverse Transkriptase
stammt von Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus; die Reverse
Transkriptase besitzt eine N-terminale Deletion oder Aminosäure-Änderungen,
die die Exonucleasefunktion entfernen. In einem weiteren Aspekt
bietet die Erfindung ein Verfahren für die Reverse Transkription/Polymerasekettenreaktion
(RT/PCR), die eine DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung und
eine DNA-Polymerase, die für
PCR geeignet ist, im selben Reaktionsgefäß nutzt. Bevorzugt stammt die
DNA-Polymerase der vorliegenden
Erfindung von Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus, sind bei
der Polymerase eine oder mehrere Aminosäuren vom Amino-Terminus gelöscht sind
oder Aminosäure-Änderungen
vorhanden sind, um die Exonuclease-Aktivität zu entfernen, und ist die
DNA-Polymerase, die für
PCR geeignet ist, die Taq-DNA-Polymerase. In einem anderen Aspekt
bietet die vorliegende Erfindung einen Kit oder eine Lösung für RT/PCR,
umfassend eine DNA-Polymerase
der vorliegenden Erfindung und eine DNA-Polymerase, die für PCR geeignet
ist. Bevorzugt stammt die DNA-Polymerase der vorliegenden Erfindung
von Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus, ist bei der Polymerase
eine oder mehrere Aminosäuren
von Amino-Terminus gelöscht
oder sind Aminosäure-Änderungen vorhanden, um die
Exonuclease-Funktion zu entfernen, und ist die DNA-Polymerase, die
für PCR
geeignet ist, die Taq-DNA-Polymerase.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
bietet die Erfindung Polymerasen, bei denen die Exonuclease-Aktivität durch
Austauschen eines Asparaginsäure-Restes in Position
8 mit einem Alanin-Rest entfernt ist. Dies ist eine bevorzugte Mutation,
da sie nicht nur die Exonuclease-Aktivität entfernt, sondern auch die
RNaseH-Aktivität
entfernt, die die Reverse Transkription beeinflussen können.
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In
einem anderen Aspekt bietet die Erfindung ein Verfahren zur Polymerasekettenreaktion
bei Vorhandensein eines Polymerase-stabilisierenden Mittels, unter
Einsetzen einer enzymatisch aktiven DNA-Polymerase mit mindestens
80% Identität
in ihrer Aminosäuresequenz
zur DNA-Polymerase von Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus
und bei der die Exonuclease-Aktivität entfernt ist. Die Polymerase-stabilisierenden
Mittel umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Glycerol (10 bis 50%
Endkonzentration), Trimethylamin-N-oxid (TMANO; bis zu 4 M Endkonzentration),
und N-Methylmorpholin-N-Oxid (MMO; bis zu 3 M Endkonzentration). Bevorzugt
wird Glycerol bei einer Endkonzentration von 30% verwendet. Mit
dem Polymerase-stabilisierenden Mittel ist ein Mittel gemeint, das
die Verwendung der Polymerase in PCR und RT/PCR ermöglicht.
Diese Mittel verringern die denaturierende Temperatur der Matrize
und stabilisieren die Polymerase. Mit Stabilisieren ist gemeint,
temperaturstabil machen. Mit Endkonzentration ist die Endkonzentration
des Mittels in der PCR- oder RT/PCR-Lösung
gemeint.
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Die
Erfindung bietet auch Kits, mit Polymerase-stabilisierenden Mitteln,
für die
Polymerasekettenreaktion, die eine enzymatisch aktive DNA-Polymerase
mit mindestens 80% Identität
in ihrer Aminosäuresequenz zur
DNA-Polymerase von Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus aufweist
und deren Exonuclease-Aktivität entfernt
ist. Die Polymerase-stabilisierenden Mittel umfassen, sind aber
nicht beschränkt
auf, Glycerol (10 bis 50% Endkonzentration), TMANO (bis zu 4 M Endkonzentration)
und MMO (bis zu 3 M Endkonzentration). Bevorzugt wird Glycerol bei
einer Endkonzentration von 30% verwendet. Auch sind Lösungen zur
Verwendung in der Polymerasekettenreaktion umfasst, die Polymerase-stabilisierende Mittel
aufweisen, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf Glycerol (10 bis 50% Endkonzentration), TMANO (bis zu 4 M Endkonzentration)
und MMO (bis zu 3 M Endkonzentration) und eine enzymatisch aktive
DNA-Polymerase mit mindestens 80 % Identität in ihrer Aminosäuresequenz
zur DNA-Polymerase von Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus
und deren Exonuclease-Aktivität
entfernt ist. Bevorzugt wird Glycerol bei einer Endkonzentration
von 30% verwendet.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
ist die Exonuclease-Aktivität
durch eine N-terminale Deletion entfernt, um zwischen 540 und 582
Aminosäuren
zu ergeben, durch Deletieren bis zu einem Drittel der Aminosäuresequenz
am N-Terminus, durch Substitution einer Aminosäure im Amino-Terminus zu einem
Drittel des Proteins, oder durch Substitution des Asparaginsäure-Restes
in Position 8 mit einem Alanin-Rest
und die Glycerol-Konzentration beträgt 30%.
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Die
Anmelder haben erkannt, dass die DNA-Polymerasen der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
um die Polymerasekettenreaktion (PCR) auszuführen, wenn die Reaktion bei
Vorhandensein eines Polymerase-stabilisierenden
Mittels, wie Glycerol, TMANO oder MMO und dergleichen, ausgeführt wird. Bevorzugt
liegt die Glycerolkonzentration im Bereich von 10 bis 50% und am
meisten bevorzugt liegt sie bei einer Endkonzentration von 30%.
TMANO und MMO können
bei Konzentrationen bis zu 4 M bzw. 3 M Endkonzentration verwendet
werden. Es wurde gezeigt, dass diese Mittel die Polymerase von Thermoanaerobacter
thermohydrosulfuricus stabilisieren (hier und US Patentanmeldung
Nr. 08/766,014, eingereicht 13. Dezember 1996, supra). So sind die
Polymerasen der vorliegenden Erfindung auch für Reverse Transkription/Polymerasekettenreaktion
(RT/PCR) unter diesen Bedingungen geeignet.
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Daher
bietet in einem anderen Aspekt die Erfindung ein Verfahren für Reverse
Transkription/Polymerasekettenreaktion, bei Vorhandensein eines
Polymerase-stabilisierenden
Mittels, unter Einsetzen einer enzymatisch aktiven DNA-Polymerase
mit mindestens 80% Identität
in ihrer Aminosäuresequenz
zur DNA-Polymerase von Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus
und bei der eine Exonucleaseaktivität entfernt ist. In bevorzugten
Ausführungsformen
umfassen die Polymerase-stabilisierenden
Mittel, sind aber nicht beschränkt auf,
Glycerol (10 bis 50% Endkonzentration), TMANO (bis zu 4 M Endkonzentration)
und MMO (bis zu 3 M Endkonzentration). Bevorzugt wird Glycerol bei
einer Endkonzentration von 30% verwendet.
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Die
Erfindung bietet auch Kits für
Reverse Transkription/Polymerasekettenreaktion, mit einem Polymerase-stabilisierenden
Mittel und aufweisend eine enzymatisch aktive DNA-Polymerase mit
mindestens 80% Identität
in ihrer Aminosäuresequenz
zur DNA-Polymerase von Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus und
bei der eine Exonucleaseaktivität
entfernt ist. Auch umfasst sind Lösungen zur Verwendung in der
Reversen Transkription/Polymerasekettenreaktion, umfassend ein Polymerase-stabilisierendes
Mittel und eine enzymatisch aktive DNA-Polymerase mit mindestens
80% Identität
in ihrer Aminosäuresequenz
zur DNA-Polymerase von Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus
und bei der eine Exonucleaseaktivität entfernt ist. In bevorzugten
Ausführungsformen
umfassen die Polymerase-stabilisierenden
Mittel, sind aber nicht beschränkt
auf, Glycerol (10 bis 50% Endkonzentration), TMANO (bis zu 4 M Endkonzentration)
und MMO (bis zu 3 M Endkonzentration). Bevorzugt wird Glycerol bei
einer Endkonzentration von 30% verwendet.
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In
bevorzugten Ausführungsformen
wird die Exonuclease-Aktivität
entfernt durch Vorsehen einer N-terminalen Deletion, um zwischen
540 bis 582 Aminosäuren
zu ergeben, durch Deletieren bis zu einem Drittel der Aminosäuresequenz
am N-Terminus, durch
Substitution einer Aminosäure
im Amine-Terminus zu einem Drittel des Proteins, durch Substitution
des Asparaginsäure-Restes
in Position 8 mit einem Alanin-Rest und die Glycerolkonzentration
beträgt
30%.
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Andere
Merkmale und Zweckmäßigkeiten
der Erfindung werden von der folgenden Beschreibung bevorzugter
Ausführungsformen
und von Ansprüchen
offenbart.
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Beschreibung
bevorzugter Ausführungsformen
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Die
Zeichnungen werden zuerst kurz beschrieben.
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Zeichnungen
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1A–E ist die
DNA-Sequenz für
5300 bp genomischer DNA, die die DNA-Polymerase voller Länge von Thermoanaerobacter
thermohydrosulfuricus (SEQ. ID. Nr. 1) flankiert und kodiert.
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2A–D ist ein
zusammenhängender
offener Leserahmen, der zum Kodieren der Polymerase voller Länge von
Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus (SEQ. ID. Nr. 2) fähig ist.
Die Translation erfolgt von einem offenen Leserahmen, der Nucleotide
1056–3674
genomischer DNA in 1A–E umspannt, die native Polymerase
kodieren.
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3 ist
der zusammenhängende
offene Leserahmen der Nucleotide 796–2616, Aminosäuren 266–872 plus
ein Initiator-Methionin am Amino-Terminus, wobei die Exo-Mutante
des Enzyms 608 Aminosäuren
enthält
(SEQ. ID. Nr. 3).
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4A–C ist der
zusammenhängende
offene Leserahmen der F412Y-Mutation der exo-mutanten Polymerase,
der 578 Aminosäuren
enthält
mit (SEQ. ID. Nr. 4). Bei Aminosäure
412 gibt es ein Tyrosin, das Phenylalanin ersetzt.
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5 ist
ein Schema von klonierten Polymerasen. Die Buchstaben A–D repräsentierten
Startstellen der verschiedenen Konstrukte, die in der Tabelle in
Beispiel 2 gezeigt sind.
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6 ist
eine grafische Darstellung, die die relative RT-Aktivität des Exo-Mutanten-Enzyms und anderer
Enzyme, die eine Aktivität
der Reversen Transkription besitzen, vergleicht. Die x-Achse zeigt
die Polymerase an (MMLV, AMV, Tth, USB). Die y-Achse repräsentiert
die Aktivität
der Reversen Transkriptase in cpm.
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7A–C ist die
DNA-Sequenz, die eine native Polymerase voller Länge von Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus
kodiert (SEQ. ID. Nr. 23).
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Beispiele
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Die
folgenden Beispiele dienen zum Veranschaulichen der DNA-Polymerasen
der vorliegenden Erfindung und sind nicht als beschränkend beabsichtigt.
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Beispiel 1: Allgemeine
Verfahren, die während
der Reinigung und Charakterisierung verwendet werden
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Assay der
DNA-Polymerase-Aktivität
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Die
DNA-Polymerase-Aktivität
wurde untersucht durch Messen der Menge des Einbaus eines radiomarkierten
Desoxynucleotids in Säure-fällbares
Material unter Verwenden aktivierter Lachs-Sperma-DNA als eine Matrize
(Richardson, C.C. (1966), DNA-Polymerase von Escherichia coli, Seiten
263–276
in G.L. Cantoni und D. R. Davies (Herausgeber), Precedures in nucleic
acid research. Harper and Row, New York). Eine Einheit der DNA-Polymerase
ist die Menge von Enzym, die den Einbau von 10 nmol Desoxynucleotidtriphosphat in
Säure-fällbares
Material in 30 min bei 70 °C
einbaut. Ein Assay besteht aus 2–10 μl Proteinlösung, die DNA-Polymerase enthält, die
mit 50 μl
Assay-Mischung inkubiert wird (20 mM Tris HCl pH 8,5 bei Raumtemperatur,
200 μM von
jedem Desoxynucleotidtriphosphat, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2,
0,2 mg/ml aktivierte Lachs-Sperma-DNA, 1 μCi 3000 Ci/mmol [α-33P]dATP) bei 70 °C 10 min lang. Die Reaktion
wird durch Zugeben der Inhalte des Assays in ein Röhrchen,
das 1 ml von jedem Träger
(50 μg/ml
Fisch-Sperma-DNA,
2 mM EDTA) und Fällungsmittel
(20 % (gew/v) Trichloressigsäure
(2 % (gew/v) Natriumpyrophosphat) enthält, gestoppt. Nach der Inkubation
auf Eis für
mindestens 5 min wird die Lösung
durch einen Glasfaserfilter (z.B. GF/B, Whatman) gefiltert, mit
mehreren ml eiskalter Waschlösung
(1 N-Salzsäure,
100 mM Natriumpyrophosphat) gewaschen, in ein Zählfläschchen mit wässrigem
flüssigen
Szintillations-Cocktail (z.B. Biosafe II, Research Products International
Corp.) angeordnet und in einem Flüssigkeits-Szintillationszähler gezählt. DNA-Polymerase-Aktivität der Testlösung wird
aus der gemessenen spezifischen Aktivität der Assay-Mischung berechnet.
Nur Aktivitätswerte,
die innerhalb des linearen Bereichs von 0,01 bis 0,2-Einheiten pro
Assay-Reaktion liegen werden, werden als signifikant akzeptiert.
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Messung der
Proteinkonzentration
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Lösungs-Protein-Konzentrationen
werden spektrophotometrisch durch Bestimmen der Absorbanz der Testlösung bei
einer Wellenlänge
von 205 nm (A205) (Scopes, R.K. (1994),
Seiten 46–48
Protein Purification. Springer-Verlag, New York) gemessen. Der Extinktionskoeffizient
der Polypeptide wird als E205 (1 mg/ml)
= 31 angenommen.
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Assay der
Exonuclease-Aktivität
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Exonuclease-Aktivität wurde
wie beschrieben gemessen (Kong, H., Kucera, R.B. und Jack, W.E. (1993)
J. Biol. Chem. 268, 1965–1975)
unter Verwenden, als ein Substrat, HindIII-verdauter Phagenλ-DNA, markiert
mit 3H durch die Wirkung von CpG-Methylase oder einem
500 bp PCR-Produkt, hergestellt aus pBR322 und markiert mit 3H durch Einbau von tritiierter TTP Exonuclease-Assays
wurden im selben Puffer ausgeführt
(20 mM Tris∙HCl
pH 8,5 bei Raumtemperatur, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2)
und bei derselben Temperatur (70 °C)
wie Polymerase-Assays.
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Assay für das Gerichtetsein
der Exonuclease
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Das
Gerichtetsein der damit verbundenen Exonuclease-Aktivität wurde
durch Überwachen
der zeitabhängigen
Freisetzung von Radioaktivität
von einem DNA-Substrat
bestimmt, das differentiell an den 5'- und 3'-Enden, wie beschrieben, markiert war
(Kong et al., supra).
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Assay für die Strang-Verdrängungs-Aktivität
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Ein
Verlängerungs-Assay
wurde entwickelt, um Polymerasen auf ihre Nützlichkeit in der SDA (Strang-Verdrängungs-Amplifikations-)Reaktion
zu bewerten (Becton-Dickinson).
Diese Verlängerungsreaktion
testet die Fähigkeit
der Polymerase, einen Stromabwärtsstrang
zu ersetzen, und seine Fähigkeit,
die Verlängerung
an einer Nick-Stelle zu initiieren. Diese Verdrängung und Initiierung an einem
Nick wird durch Assoziieren zweier Primer, die an ihren 5'-Enden markiert sind,
unmittelbar benachbart zueinander initiiert. Falls die Polymerase
eine Strang-Verdrängungs-Aktivität besitzt
und fähig
ist, an einem Nick zu initiieren, werden beide Primer verlängert und
die zwei Verlängerungsprodukte
können
sichtbar gemacht werden. Falls die Polymerase nicht an einem Nick
initiieren kann (d.h. eine Präferenz
für die
Initiierung an einer Lücke
besitzt) oder ihr eine Verdrängungs-Aktivität mangelt,
wird nur der Stromabwärts-Primer
verlängert
und nur ein Produkt wird detektiert.
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Unter
Verwenden des Plasmids pBR322 als das Ziel, wurden zwei Primer pBR1
und pBR2 synthetisiert, die unmittelbar benachbart zueinander auf
dem Plasmid assoziieren. Primer pBR1 ist der Stromaufwärts-Primer
und entspricht Basen 3661 bis 3690 in pBR322 (GGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGA) (SEQ.
ID. Nr. 5). Der Primer pBR2 assoziiert stromabwärts und entspricht pBR322 3691–3720 (TCCCCCATGTTG
TGCAAAAAAGCGGTTAGC) (SEQ. ID. Nr. 6). Diese 30mer- Oligos wurden durch
Elektroelution von einem denaturierenden Polyacrylamidgel gereinigt.
Die Primer werden in einer Kinasereaktion unter Verwenden von 10 μM-Primer, 50 mM Tris∙HCl pH
7,5, 10 mM MgCl2, 70 μCi [γ-32P]-ATP
und 10 Einheiten T4-Polynucleotidkinase 30 min lang bei 37 °C markiert.
Eine Endkonzentration von 0,2 μM
(jeweils) dieser zwei markierten Primer werden mit 200 ng PstI/HincIIverdautem
pBR322 kombiniert. Diese werden bei 98 °C 3 min lang in einem Puffer
denaturiert, der 25 nm Kaliumphosphat, pH 7,4, 2–8 mM MgCl2,
0,2 bis 1 mM dNTPs enthält
und auf die Reaktionstemperatur (50–70 °C) 2 min lang gekühlt. Eine
Einheit der Polymerase wird zugegeben und die Reaktion wird 10 min
lang fortgesetzt. Die Reaktionen werden durch Zugabe eines äquivalenten Volumens
von 95 % Formamid, 50 mM EDTA, Bromphenolblau-Farbstoff gestoppt.
25 μl werden über einem 6
% denaturierendem Gel elektrophoretisiert und das Gel wird einem
Autoradiographie-Film ausgesetzt.
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Beispiel 2: Reinigung
nativen Enzyms
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Roh-Reinigung
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Wachstum von
Thermoanaerobacter-thermohydrosulfuricus-Zellen
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Eine
lyophilisierte Kultur des Thermoanaerobacter-thermohydrosulfuricus-Stranges
JW102 wurde von der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,
GmbH (DSM) erworben. Das verwendete Wachstumsmedium war Clostridium
Thermohydrosulfuricum Medium (Medium #61 im DSM-Katalog der Stränge (1993-Ausgabe), das aus
(pro l) bestand: 10 g Trypton, 10 g Saccharose, 2 g Hefe-Extrakt,
0,2 g FeSO47H2O,
0,2 g Na2SO3, 0,08
g Na2S2O3∙5H2O und 1 mg Resazurin. Die Kultur wurde bei
70 °C unter
anaeroben Bedingungen gezogen. Nach dem Wachstum wurde das Medium
auf annähernd
Raumtemperatur gekühlt
und die Kultur durch Continuous-Flow-Zentrifugation geerntet. Die
Zellpaste wurde bei –80 °C vor nachfolgenden
Prozeduren gelagert.
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Herstellung
des Extraktes
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Gefrorene
Zellpaste (5 Gramm) wurde mit 100 ml Puffer A (50 mM Tris-HCl pH
8,0, 10 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 10 % (gew/v) Glycerol) vermischt.
Die Paste wurde bei Raumtemperatur gerührt bis die Resuspendierung
abgeschlossen war. Die resultierende Zellsuspension wurde auf 0 °C durch Inkubation
in einem Eisbad gekühlt
und annähernd
5 min lang einer Beschallung unterzogen, um die Zellen zu lysieren.
Zelltrümmer
wurden durch Zentrifugation bei 70.000 × g 20 min lang bei 4 °C entfernt.
Das überstehende
geklärte Lysat
wurde Fraktion 1 genannt.
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Flüssigkeitschromatographie-Reinigung
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Fraktion
1 wurde auf einer Niederdruck-Flüssigkeitschromatographie-Säule (70
ml Bettenvolumen, 26 mm ∅) aus DEAE-Zellulose (DE-52 Whatman)
equilibriert mit Puffer A geladen. Die Säule wurde mit mehreren Säulenvolumina
Puffer A gewaschen und die DNA-Polymerase mit einem linearen Salzgradienten
von 10 mM bis 1.000 mM NaCl in Puffer A mit einer Fließgeschwindigkeit
von 0,9 ml/min eluiert. Dies und all die nachfolgenden Chromatographie-Schritte
wurden bei einer Umgebungs-Raumtemperatur (annähernd 25 °C) ausgeführt. Der Peak der Aktivität eluierte
bei annähernd
32 mM NaCl. Aktive Fraktionen wurden gesammelt und als Fraktion
2 bezeichnet.
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Fraktion
2 wurde direkt auf eine Säule
(22 ml Bettenvolumen, 16 mm ∅) aus Heparinsepharose (Heparin
Sepharose CL-6B, Pharmacia), equilibriert mit Puffer A geladen.
Die Säule
wurde mit mehreren Säulenvolumina
Puffer A gewaschen und die DNA-Polymerase-Aktivität mit einem
linearen Salzgradienten von 10 mM bis 700 mM NaCl in Puffer A mit
einer Fließgeschwindigkeit
von 0,4 ml/min eluiert. Der Peak der Aktivität eluierte bei annähernd 400
mM NaCl. Aktive Fraktionen wurden gesammelt und als Fraktion 3 bezeichnet.
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Fraktion
3 wurde direkt auf eine Säule
(2 ml Bettenvolumen, 16 mm ∅) aus Hydroxylapatit (BioGel
HA, Bio-Rad), equilibriert mit Puffer B (50 mM Kaliumphosphat, pH
7,4, 1 mM DTT, 10 % (gew/v) Glycerol) geladen. Die Säule wurde
mit mehreren Säulenvolumina
Puffer B gewaschen und die DNA-Polymerase mit einem linearen Gradienten
von 50 mM bis 700 mM Kaliumphosphat in Puffer A bei einer Fließgeschwindigkeit
von 0,4 ml/min eluiert. Die DNA-Polymeraseenthaltenden Fraktionen
wurden gesammelt und durch Ultrafiltration (Centricon-50, Amicon)
auf ein Volumen von 100 ml konzentriert, zu dem 100 ml 100 %-iger
Glycerol gegeben wurde, um das Endprodukt zu erhalten. Es wurde
bestimmt, dass dieses Endpräparat
ungefähr
1.000 Einheiten DNA-Polymerase enthält, was als annähernd 80
% rein auf einem Coomassie-gefärbten,
denaturierenden Polyacrylamidgel (SDS-PAGE) beurteilt wurde.
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Optimierte
Reinigung
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Herstellung
des Extraktes
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Gefrorene
Zellpaste (45 Gramm) wurde in 250 ml Lysepuffer (50 mM Tris-HCl,
pH 8, 10 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,2 % (v/v) NP40, 1 mM DTT) resuspendiert.
Lysozym wurde auf 200 mg/ml Endkonzentration zugegeben und die Lösung wurde
bei Raumtemperatur 60 min lang gerührt. DNase I wurde zu 10 mg/ml
Endkonzentration gegeben und die Inkubation wurde 10 min lang fortgesetzt.
Unlösliches
Material wurde durch Ultrazentrifugation bei 70.000 × g 40 min
lang entfernt. Der dekantierte Überstand
wird Fraktion I bezeichnet.
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Polyethylenimin-Präzipation
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Ein
Probe-Polyethylenimin-(PFI)-Präzipitatinns-Experiment
wurde ausgeführt,
um die End-PEI-Konzentration für
dieses Lysat zu bestimmen und die gesamte Polymeraseaktivität mit dem
am wenigsten co-präzipitierenden
Proteingehalt zu präzipitieren.
PEI wurde von einer 10 %-igen (v/v) Stammlösung zu Fraktion I auf eine
0,4 %-ige Endkonzentration gegeben. Die Lösung wurde 20 min lang bei
4 °C gerührt. Das
PEI-Präzipitat
wurde durch Zentrifugation bei 8.000 × g 20 min lang gesammelt.
Die Polymerase-Aktivität
wurde aus dem Pellet mit 150 ml 300 mM NaCl in Puffer A extrahiert
(50 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM DTT, 1 mM EDTA und 10 Glycerol). Diese
Lösung
wurde wieder bei 17.000 × g
zentrifugiert. Ammoniumsulfat wurde zu dem Überstand auf eine 80 %-ige
Sättigung
gegeben und die Lösung
wurde 1 Stunde bei 4 °C
gerührt,
um Proteine von restlichem PEI zu präzipitieren. Die Ammoniumsulfatfraktion
wurde bei 48.000 × g
30 min lang zentrifugiert und das Pellet in 400 ml 10 mM NaCl, 50
mM Tri∙HCl,
pH 8 resuspendiert. Dies wird Fraktion II bezeichnet.
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Flüssigkeitschromatographie-Reinigung
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Eine
Säule (150
ml Bettenvolumen) aus Heparin-Sepharose CI-6B (Pharmacia) wurde
mit 150 mM NaCl im Puffer A equilibriert. Die Fraktion II wurde
bei 150 ml/h geladen und mit zwei Bettvolumina-Puffer A gewaschen.
Die Polymerase-Aktivität
wurde dann mit einem linearen Gradienten von 150 mM bis 700 mM NaCl
im Puffer A eluiert, was einen Polymerase-Peak bei ungefähr 400 mM
NaCl ergab. Die Peak-Fraktionen wurden gesammelt und 5-fach mit
100 mM NaCl im Puffer B verdünnt
(50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,1 mM DTT, 1 mM EDTA und 5 % Glycerol).
Dieser Pool wird Fraktion III bezeichnet.
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Eine
Säule (4
ml Bettvolumen) aus ssDNA-Agarose (Pharmacia) wurde mit 100 mM NaCl
im Puffer B equilibriert. Ein Drittel der Fraktion III wurde bei
einer Fließgeschwindigkeit
von 12 ml/h geladen. Die Säule
wurde mit demselben Puffer gewaschen und die Polymerase-Aktivität mit einem
linearen Gradienten von 100 mM bis 1.000 mM NaCl im Puffer B eluiert.
Der Polymerase-Aktivitäts-Peak
eluierte bei annähernd
375 mM NaCl. Die Peak-Fraktionen wurden gesammelt und mit Centricon-50
(Amicon) konzentriert und durch Zugeben eines gleichen Volumens
100 %-igem Glycerol gelagert.
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Herstellung
des Exo-Enzyms durch Subtilisin-Spaltung
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Annähernd 850
Einheiten gereinigter nativer Thermoanaerobacter-thermohydrosulfuricus-DNA-Polymerase
I wurde in 150 mM Kaliumphosphat pH 6,5 durch drei Runden der Verdünnung in
diesem Puffer und Konzentration durch Ultrafiltration ausgetauscht,
was eine Lösung
ergab, die ungefähr
250 mg Protein in 550 μl
enthielt. Subtilisin (10 μl
einer 0,06 mg/ml Lösung)
wurde zu der Polymerase gegeben und die Mischung bei 37 °C eine Stunde
lang inkubiert. Nach der Inkubation wurde die Reaktion auf 10 ml
Endvolumen mit Puffer A verdünnt
und auf eine Säule
Neparin-Sepharose geladen (4 ml Bettvolumen, 16 mm ∅),
in Puffer A equilibriert, der 150 mM NaCl enthielt. Die Säule wurde
in mehreren Säulenvolumina
dieses Puffers gewaschen und die Polymerase-Aktivität mit einem
linearen Gradienten von 150 mM bis 700 mM NaCl im Puffer A eluiert.
Aktive Fraktionen wurden gesammelt.
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Beispiel 3: Charakterisierung
des nativen Enzyms
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Allgemeine
Eigenschaften
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Das
native Enzym wandert als ein annähernd
90.000 Da-Polypeptid (gerade unterhalb der Phosphorylase B) auf
SDS-PAGE. Das Enzym besitzt Strang-Verdrängungs-Aktivität. Es besitzt
eine 5'-3'-Exonuclease-Aktivität bei annähernd 1/80
des Niveaus der Polymerase-Aktivität (Einheit:Einheit). Das Temperaturoptimum
der DNA-Synthese liegt nahe 75 °C
unter Assay-Bedingungen. Die optimale Mg2+-Konzentration
des DNA-Synthese beträgt
1 mM. Die optimale Mn2+-Konzentration der DNA-Synthese beträgt 0,5 mM.
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Assay auf
Wärmestabilität
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Um
die Wärmestabilität des Enzyms
zu bewerten, wurde eine Probe nativer Thermoanaerobacter-thermohydrosulfuricus-DNA-Polymerase
bei erhöhten
Temperaturen in mehreren Puffern inkubiert. Die Puffer bestanden
alle aus 25 mM Tris-HCl, pH 8,5, 50 mM KCl, 5 mM MgCl
2,
1 mM 2-Mercaptoethanol, 0,5 % (gew./v) Nonidet P-40 und 100 mg/ml
BSA mit den folgenden Zugaben:
BSA-Puffer: | keine
Zugaben. |
GLY-Puffer: | gebe
Glycerol auf 40 % (v/v) zu. |
MMO-Puffer: | gebe
N-Methylmorpholin-N-oxid (MMO) auf 3 M zu. |
TMANO-Puffer: | gebe
Trimethylamin-N-oxid (TMANO) auf 4 M zu. |
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Natives
Enzym (0,02 Einheiten/μl)
wurde in diesen Puffern bei verschiedenen Temperaturen inkubiert. Nach
5, 10 und 15 Minuten wurden 5 μl
aliquote Mengen entzogen und in einem frischen Röhrchen auf Eis angeordnet.
Wenn alle Proben aufgenommen waren, wurden die erwärmten aliquoten
Mengen in der üblichen Weise
einem Assay unterzogen. Die Ergebnisse sind ausgedrückt als
der Bruchteil der Aktivität,
die bei einem gegebenen Zeitpunkt bei einer gegebenen Temperatur
verbleibt.
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Das
Enzym war am wenigsten stabil im BSA-Puffer, und behielt die Hälfte der
anfänglich
gemessenen Polymerase-Aktivität
nach ungefähr
5 min bei 85 °C.
Im GLY-Puffer behielt das Enzym die Hälfte der anfänglichen
Aktivität
nach ungefähr
5 min bei 85 °C.
In MMO- und TMANO-Puffern war eine Inkubation bei 85 bis 90 °C erforderlich,
um die Hälfte
der anfänglich
gemessenen Aktivität
in 5 min zu eliminieren. Die Inkubation in irgendeinem dieser Puffer
bei 75 °C
für 15
min resultierte in nicht mehr als 20 % Verlust der anfänglichen DNA-Polymerase-Aktivität.
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Beispiel 4: Charakterisierung
des Subtilisin-gespaltenen Enzyms
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Allgemeine Eigenschaften
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Das
gespaltene Enzym wandert als ein Dublett, das aus Polypeptiden besteht,
die bei annähernd
64 kDa und 55 kDa auf SDS-PAGE wanderten. Es ist frei von detektierbarer
Exonuclease-Aktivität.
Das Enzym besitzt Strang-Verdrängungs-Aktivität. Das Enzym
besitzt eine dem nativen Enzym ähnliche
Wärmestabilität.
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Beispiel 5: Herstellung
des klonierten 64 kDa-Enzyms
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Herstellung
genomischer DNA
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Gefrorene
Zellpaste von Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus (annähernd 350
mg) wurde in 700 μl
Lysis-Puffer (50 mM Tris∙HCl
pH 8,0, 50 mM EDTA, 3 SDS (gew/v), 1 % 2-Mercaptoethanol (v/v) resuspendiert
und 1 Stunde lang bei 65 °C
inkubiert. Diese Lösung
wurde dreimal mit 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol extrahiert,
zweimal mit Chloroform und präzipitiert
mit zwei Volumina 100 %-igem Ethanol. Das Pellet wurde kurz in vacuo
getrocknet und in 700 μl
TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) aufgelöst. Die Konzentration genomischer
DNA wurde spektrophotometrisch bestimmt durch Messen der Absorbanz
bei 260 nm (1A260 = 50 μg/ml) und durch Vergleich der
UV-Fluoreszenz von Bändern
auf einem mit Ethidiumbromid gefärbten
Agarosegel, im Vergleich zu Standard-Konzentrations-Marker.
-
Herstellung
einer DNA-Polymerase I-spezifischen Sonde
-
Genomische
DNA wurde als ein Substrat für
eine PCR-Reaktion verwendet, unter Verwenden von degeneriertem Oligonucleotiden,
die gegen konservierte Bereiche der DNA-Polymerase I-Familie-Polymerasen entworfen
sind (Uemori, T., Ishino, Y., Fujita, K., Asada, K. und Kato, I.
(1993) J. Biochem. 113, 401–410).
Eine Standard-Taq
PCR-Reaktion (20 μl)
enthielt ungefähr
1 ng genomischer DNA und 1 mM von jedem Primer EPOLF (GACCC(ATC)AAC(CT)T(CG)CA(AG)A
A(CT)AT(ATC)CC (SEQ. ID. Nr. 7) und EPOLR ((GT)A(CG)(CG)A(GT) (CT)TC(AG)
TCGTG (GATC) AC (CT) TG) (SEQ. ID. Nr. 8). Nach einer Runde PCR wurde
das Produkt auf einem Agarosegel getrennt. Das Produkt um den erwartenden
600 bp-Bereich wurde aus dem Gel ausgeschritten. zerbrochen, in
TE getränkt
und als ein Substrat für
eine zweite Runde PCR unter Verwenden derselben Bedingungen verwendet.
Das resultierende ca. 600 bp-Produkt wurde direkt sequenziert unter
Verwenden der EPOLF und EPOLR-Primer (Sequenase PCR Product Sequencing
Kit, Amersham). Es wurde gefunden, dass ein offener Leserahmen dem
Zielbereich der DNA-Polymerasen
I bekannter Sequenz homolog ist, wie durch BLAST-Analyse beurteilt
wurde.
-
Herstellung
subgenomischer Bibliotheken und Screening
-
Dieses
PCR-Produkt wurde unter Verwenden eines radioaktiven oder nichtradioaktiven
Hybridisierungskits markiert (Gene Images, USB) und verwendet, um
Blots von Agarosegels genomischer DNA, die mit verschiedenen Restriktionsenzymen
verdaut war, zu untersuchen. Das Verdauen genomischer DNA mit HindIII erzeugte
ein einziges Hybridisierungsfragment von annähernd 1,7 kb. DNA-Fragmente
von annähernd
1,7 kb wurden aus einem Agarosegel ausgeschnitten und in pBluescript
II KS (+) (Stratagene) kloniert. Individuelle Kolonien, die an die
Sonde hybridisierten, wurden gereinigt und sequenziert. Auf ähnliche
Weise erzeugte ein doppeltes Verdauen von genomischer Thermoanaerobacter-thermohydrosulfuricus-DNA
mit EcoRI und XhoI ein einziges Hybridisierungsfragment von annähernd 1,9
kb und Verdauen mit EcoRI erzeugte ein einziges Hybridisierungsfragment
von annähernd
3 kb. Die Sequenzen dieser Klone wurden verschmolzen und bildeten einen
kohärenten
offenen Leserahmen, der eine hohe Homologie zu dem C-Terminusabschnitt-DNA-Polymerasen
i bekannter Sequenz besaß,
wie durch BLAST-Analyse beurteilt. Der Klon, der das 1,7 kb HindIII-Fragment
enthielt, wurde mit EcoRI und XhoI verdaut, um ein 1,4 kb-Fragment zu erzeugen,
das mit einem Gel gereinigt wurde, durch Nick-Translation mit 32P markiert wurde und verwendet wurde, um
einen Blot von genomischer Thermoanaerobacter-thermohydrosulfuricus-DNA.
verdaut mit PsfI und XhoI, zu untersuchen. Dies identifizierte ein
einziges Hybridisierungsfragment von 3 kb, das den verbleibenden
N-Terminusabschnitt des Gens enthielt. Die Nucleotidsequenz ist
in 1A–E
(SEO. ID. Nr. 1) dargestellt und ein fortlaufender offener Leserahmen, der
möglicherweise
die native Polymerase kodiert, ist in 2A–D präsentiert
(SEQ. ID. Nr. 2).
-
Herstellung
von Expressionsvektoren
-
Mehrere
PCR-Produkte wurden aus der genomischen DNA erzeugt, die das Klonieren
von Abschnitten der Polymerase-kodierenden Sequenz, die nicht die
5'-3'-Exonucleasedomäne umfasst, ermöglichte
(siehe 5). Die Buchstaben A–D repräsentieren Startstellen der
verschiedenen Konstrukte, die unten in der Tabelle dargelegt sind.
Diese abgeschnittenen Polymerase-kodierenden Sequenzen wurden unter
der Steuerung des λPL-Promotors des Expressionsvektors pRE2 platziert
(Reddy, P., Peterkofsky, A. und McKenney, K. (1989) Nucleic Acids
Res. 17, 10473–10488).
Diese Vektoren wurden im E.coli-Strang DH-1λ+(λcl+) vermehrt.
-
Um
Fehler, die durch Taq-DNA-Polymerase in PCR eingeführt wurden,
zu minimieren, wurde eine modifizierte lange PCR ausgeführt. Die
PCR-Reaktion enthielt: 20 mM Tricin (pH 8,8), 85 mM KOAc, 200 mM
von jeder dNTP, 5 % DMSO, 0,5 mM von jedem Primer, 1,5 mM MgOAc
(zugegeben als Hot-Start), 2,5 Einheiten Hot Tub (oder rTth)-DNA-Polymerase
pro 100 ml Reaktion (Amersham), 0,025 U Deep Vent DNA-(New England
Biolabs)-Polymerase pro 100 μl
Reaktion, 20–100
ng genomischer Thermoanaerobacter-thermohydrosulfuricus-DNA pro
100 μl Reaktion.
Die Cycling-Parameter bestanden aus: 94 °C 30 s, dann 68 °C 10 m 40
s × 8
Zyklen; 94 °C
30 s, dann 68 °C
12 m 00 s × 8
Zyklen; 94 °C
30 s, dann 68 °C
13 m 20 × 8
Zyklen; 94 °C
30 s, dann 68 °C
14 m 40 s × 8
Zyklen.
-
Alle
PCR-Produkte wurden mit dem reversen Primer DDREV(GGGGTACCT CTAGATCACTTGGCCAAAAACCA)
(SEQ. ID. Nr. 9) am 3'-Ende
und verschiedenen Primern, die am 5'-Ende eingesetzt wurden, erzeugt:
-
Die
resultierenden PCR-Produkte wurden mit NdeI und KpnI verdaut und
in pRE2, verdaut mit denselben Restriktionsenzymen, kloniert.
-
Stumme Änderungen
(siehe Tabelle unten) zeigen an, dass der 5'-Primer einige Codons kodiert, die mit
den nativen Sequenzen synonym sind, aber häufiger durch E.coli eingesetzt
werden. Durch dieses Verfahren wurden sechs verschiedene Klone konstruiert,
die verschiedene Polypeptide kodieren.
-
-
Expression eines klonierten
64 kDa-Enzyms
-
E.coli-Strang
MZ-1 (cl857 Lysogen), der das Plasmid pRED6404 beherbergt, wurde
in LB-Medium (pro I: 10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl),
ergänzt
mit 50 μg/ml
Ampicillin kultiviert. Die Kultivierung wurde bei 30–32 °C gezogen,
bis der OD600 1,5 erreichte, wobei bei diesem
Zeitpunkt die Kulturtemperatur auf 40–42 °C erhöht war. Das Wachstum dauerte
bei dieser Temperatur 2 Stunden lang an, bevor die Kultur in einer
Continuous-Flow-Zentrifuge geerntet wurde. Die Zellpaste wurde bei –80 °C vor nachfolgenden
Prozeduren gelagert.
-
Beispiel 6: Herstellung
eines klonierten Enzyms voller Länge
-
Das
Enzym voller Länge
wurde durch PCR von dem Klon genomischer DNA (SEQ. ID. Nr. 1) (1A–E) kloniert.
Ein 5'-Primer DDF-FOR(GGAATTCCATATGGCTTAT-AAATTTTTAATCATTGATGGTAGTAGC)
(SEQ. ID. Nr. 24) wurde synthetisiert. Dieser Primer kodiert an
einer NdeI-Stelle, setzt ein Alanin-Codon nach dem initiierenden
Methionin ein und ändert
zwei Codons zu synonymen Codons, die von E.coli bevorzugt werden
(ATA → ATC,
Ile an aa-Position 6 und GGA → GGT,
Gly an aa-Position 9). Dieser Primer wurde im Zusammenhang mit einem
Vektor-Primer von dem zusammengebauten Klon genomischer DNA verwendet,
um ein PCR-Produkt zu erzeugen, das nachfolgend mit NdeI und XhoI
verdaut und in ähnlich
verdautes pRED6404 subkloniert wurde, um ein pLS-3 zu bilden. Die
DNA für
das Enzym voller Länge
ist in 7A–C gezeigt (SEQ. ID. Nr. 23).
-
Beispiel 7: Reinigung
des klonierten 64 kDa-Enzyms
-
Herstellung eines Extraktes
-
Gefrorene
Zellpaste (370 g) wurde mit 1800 ml Puffer A (50 mM Tris-HCl, pH
8,0, 10 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 10 % (gew/v) Glycerol) kombiniert.
Die Paste wurde bei Raumtemperatur gerührt, bis die Resuspension abgeschlossen
war. Die Zellen wurden unter Verwenden einer French-Druckzelle lysiert.
Zelltrümmer
wurden durch Zentrifugation bei 70.000 × g 20 min lang bei 4 °C entfernt.
-
Flüssigkeitschromatographie-Reinigung
-
Das
geklärte
Lysat ließ man
durch eine Säule
aus DEAE-Zellulose bei 300 mM Salz laufen. Der gesammelte Durchfluss
wurde auf 70 °C
10 min lang erwärmt,
wieder durch Zentrifugation geklärt
und auf eine Säule
aus Heparin-Sepharose geladen. Die DNA-Polymerase wurde aus dieser
Säule mit
einem Salz-Gradienten wie zuvor eluiert und es wurde gefunden, dass
sie in den meisten Fällen
rein war. Falls nicht, wurde eine Säulen-Chromatographie auf Hydroxylapatit
ausgeführt.
-
Beispiel 8: Charakterisierung
des klonierten 64 kDa-Enzyms
-
Allgemeine Eigenschaften
-
Das
klonierte Enzym bezieht sich auf das gereinigte Genprodukt von pRED6404.
Das klonierte Enzym wandert als ein annähernd 64.000 Da-Polypeptid
(gerade unterhalb Kälberserum-Albumin,
MW 67.000) auf SDS-PAGE. Die spezifische Aktivität des klonierten Enzyms beträgt 28.000
Einheiten/mg. Es ist frei von detektierbarer Exonuclease-Aktivität. Das Temperatur-Optimum
der DNA-Synthese liegt nahe 72 °C
unter Assay-Bedingungen. Die optimale Mg2+-Konzentration
der DNA-Synthese beträgt
2 mM. Die optimale Mn2+-Konzentration der
DNA-Synthese beträgt
0,7 mM.
-
Reverse-Transkriptase-Aktivität
-
Das
klonierte Enzym funktionierte als eine Reverse Transkriptase in
einem Assay. der poly(rA):oligo(dT12-18)
und [3H]TTP bei 42 °C enthielt. Dieses Enzym besitzt
eine RT-Aktivität
bei Vorhandensein von Mg2+ mit oder ohne
Zugabe von Mn2+.
-
Messung der
Reverse-Transkriptase-Aktivitäten
verschiedener Enzyme unter Verwenden eine SPA-Formates
-
Amersham's Reverse-Transkriptase-Scintillations-Proximity-Assay(SPA)-Kit
NK9020), und MMLV(E70456)- und AMV-(E70041)-Enzyme wurden durch
Amersham International geliefert. Das oben hergestellte klonierte
64 kD-Enzym wurde als USB-Enzym bezeichnet. Tth (N808-0098)-Enzym
wurde von PerkinElmer erhalten.
-
MMLV-
und AMV-Enzyme wurden bei 37 °C
bzw. 42 °C
bei Vorhandensein von Magnesium getestet. Die Tth- und USB-Enzyme
wurden beide bei 60 °C
verwendet, wobei Mangan als der Co-Faktor vorhanden war. Der verwendete
Assay-Puffer war derselbe wie im SPA-Kit geliefert, mit Ausnahme,
dass der geeignete Co-Faktor in der Puffer-Mischung ersetzt war.
Im wesentlichen wurde der Assay wie folgt doppelt aufgebaut unter
Verwenden des Protokolls, das im SPA-Kit geliefert wurde, in Sarstedt-Röhrchen in
einem Gesamtreaktionsvolumen von 100 μl.
80 μl 0,77 μM [3H]TTP
in einem Puffer, bestehend aus:
50 mM Tris∙HCl pH 8
80 mM KCl
10
mM MgCl2 oder 4 mM MnCl2
10
m M DTT
0, 05 % gew/v NP40
10 μl 0,2 μM Primer/Matrize (biotinyliertes
(dT16)Oligonucleotid assoziiert an poly
r(A)) in
10 mM Tris∙HCl
pH 8
1 mM MgCl2
-
10 μl einer Einheit
(wie definiert vom Hersteller) des Enzyms, das in 50 mM Tris-HCl,
pH 8, 10 mM DTT aufgelöst
war, wurde zu jedem Röhrchen
zugegeben, um die Reaktion zu starten, und bei der angezeigten Temperatur
30 min lang inkubiert, wonach die Reaktion durch die Zugabe von
10 μl 0,56
M EDTA, pH 8 beendet wurde. 10 μl
der gelieferten Streptavidin-SPA-Kügelchen wurden dann zu jedem
Röhrchen
gegeben, und nach dem Inkubieren für weitere 10 min bei Raumtemperatur
wurden sie in einem LKB 1205-Scintillationszähler gezählt.
-
Geeignete
Kontrollen ohne Enzyme wurden auch durchgeführt. Die erhaltenen Daten sind
in 6 gezeigt. Dieses Experiment zieht nicht die Schmelztemperatur
des in diesem Experiment verwendeten Primers in Betracht, die bei
60 °C theoretisch
nur eine Minderheit des Primers zurücklassen würde, die noch an die Matrize
assoziiert wird. Dies kann tatsächlich
zu einer Unterbewertung der mit den USB- und Tth-Enzymen beobachteten Aktivität führen.
-
Verwendung der 64 kDa-Polymerase
in Strang-Verdrängungs-Amplifikation
-
Die
Exonuclease, der das oben beschriebene klonierte Enzym fehlte, wurde
in einer Strang-Verdrängungs-Amplifikation(SDA)-Reaktion
verwendet (Walker et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:392–396). Die
zu amplifizierende Ziel-DNA ist ein 1,2 kb-Klon des Insertionselements
IS 6110 von Mycobacterium tuberculosis [GenBank accession No. M29899].
Die Ziel-DNA wird in pBluescript KS (Stratagene, La Jolla, CA) kloniert.
Die Reaktionsmischung (Endkonzentration: 25 mM Kaliumphosphat, pH
7,4, 0,1 μg/ml
BSA, 0,05 μM
jedes Primers B1 (CGATCGAGCAAGCCA) (SEQ. ID. Nr. 16) und B2 (CGAGCCGCTCGCTGA)
(SEQ. ID. Nr. 17), 0,5 μM
jedes Primers S1.1 (ACCGCATCGAATGCATGT-CTCGGTAGGCG ACTCGACC) (SEQ. ID. Nr.
18) und S2.2 (CGATTCCGCTCAGACTTCTCGGGT TACTGAGATCCCT) (SEQ. ID.
Nr. 19). 1.4 mM dCTPαS,
0,5 mM von jedem dATP, dGTP und dCTP und 107 Kopien
des Ziel-Plasmids)
wurde auf 100 °C
3 min lang erwärmt,
um das Ziel zu denaturieren und dann auf 55 °C gesetzt. Nach ungefähr 5 min
bei 55 °C
wurde die Enzymmischung zugegeben (Endkonzentrationen: 35 Einheiten
64 kD-Polymerase, 160 Einheiten BsoBI-Restriktionsenzym (New England
Biolabs, Beverly, MA) und 6,9 mM MgCl2 (Gesamtreaktionsvolumen
50 μl) und die
Inkubation wurde 10 min lang fortgesetzt. Ein gleiches Volumen von
Stoplösung
(95 % Formamid, 20 mM EDTA und 0,05 von jeweils Bromphenolblau und
Xylene Cyanol FF) wurde zugegeben und 5 μl davon wurde auf einem 10 %
denaturierendem Polyacrylamidgel elektrophoretisiert. DNA wurde
sichtbar gemacht durch Färben
mit Ethidiumbromid. Die 64 kDa-Polymerase
erzeugte das erwartete Produkt einer vollen Länge von 105 Nucleotiden (Hauptprodukt)
und das erwartete 86 Nucleotid-Nick-Produkt (Nebenprodukt).
-
Verwendung der 64 kDa-Polymerase
in RT-PCT
-
Die
64kD-Polymerase wurde als eine Reverse Transkriptase zusammen mit
AmpliTaq in RT-PCR verwendet.
-
Unter
Verwenden von Kaninchen-Globin-mRNA als eine Matrize waren 106 Kopien unter dem folgenden Protokoll detektierbar.
In einem Reaktionsvolumen von 100 μl wurden die folgenden Komponenten
gesammelt: 1X PCR-Puffer (10mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl), 2 mM
MgCl2, 200 μM jeweils dNTP, 100 U menschlicher
placentaler RNAse-Inhibitor (Amersham), 106 Kopien
von Kaninchen-Globin-mRNA (BRL), 30 pmol Globin-Abwärts-Primer
(TCAGTGGTATTTGTGAGCCAGGGCA-TTGGCCACACCAGCCACCACCTTCT)
(SEQ. ID. Nr. 25), 15 pmol Globin-Aufwärts-Primer (ATCCCCCAAAACAGACAGAATGGTGCATCTGTCC)
(SEQ. ID. Nr. 26), 2,5 U AmpliTaq-Polymerase und 5 U 64 kD-Polymerase.
Die Reaktion wurde bei 65 °C
30 min lang inkubiert, gefolgt von 5 min bei 95 °C, 35 Zyklen von (95 °C für 1 min,
65 °C für 1 min,
70 °C für 2 min),
gefolgt von 72 °C
für 5 min.
Das Produkt wurde auf einem 2 % Ethidiumbromid-gefärbtem Agarosegel
aufgelöst
und das erwartete 463 bp-Produkt wurde beobachtet.
-
Unter
Verwenden der gesamten RNA von einer Rattenleber wurde ein RT-PCT-Produkt vom Albumingen
von 250 ng Matrize unter Verwenden des folgenden Protokolls detektiert.
In einem Reaktionsvolumen von 100 μl wurden die folgenden Komponenten
gesammelt: 1XPCR-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl), 2 mM
MgCl2, 200 μM jeweils dNTP, 100 U menschlicher
placentaler RNAse-Inhibitor (Amersham), 250 ng Rattenleber RNA,
30 pmol Albumin-Abwärts-Primer
(GTT CTCCTGGAAGGAGGTGCACATGGCCTC) (SEQ. ID. Nr. 27), 15 pmol Albumin-Aufwärts-Primer
(CACACAAGAGTGAGATCGCCCATCGGTTTAAGGA) (SEQ. ID. Nr. 28), 2,5 U AmpliTaq-Polymerase
und 40 U 64 kD-Polymerase. Die Reaktion wurde bei 65 °C 30 min
lang inkubiert, gefolgt von 5 min bei 95 °C, 35 Zyklen von (95 °C für 1 min,
65 °C für 1 min,
70 °C für 2 min)
gefolgt von 72 °C
für 5 min.
Das Produkt wurde auf einem 2 % Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegel
aufgelöst
und das erwartete 386 bp-Produkt wurde beobachtet.
-
Beispiel 9: Konstruktion
der FY-DNA-Polymerase von Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus
-
Ausgangsmaterial
-
Die
DNA-Konstrukte, die zum Erzeugen der FY-Polymerase verwendet wurden,
waren wie folgt:
pRED6706 ist ein Expressionsvektor, der ein
Polypeptid von 608 Aminosäuren
kodiert. Nach einem konstruierten intitiierenden Methionin repräsentieren
die verbleibenden kodierten 607 Aminosäuren den C-terminalen Abschnitt
der DNA-Polymerase
I, erhältlich
von Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus. pRED6404 ist ein Expressionsvektor,
der ein Polypeptid von 578 Aminosäuren kodiert. Nach einem konstruierten
initiierenden Methionin repräsentieren
die verbleibenden kodierten 577 Aminosäuren den C-terminalen Abschnitt
der DNA-Polymerse I, die von Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus
erhältlich
ist.
-
pPREF2
kodiert dasselbe Polypeptid mit pRED6404, besitzt aber drei stumme
Mutationen der Thermoanaerobacter-thermohydrosulfuricus-Sequenz
bei Codons 7, 10 und 11, um Codons zu eliminieren, die von E.coli
selten genutzt werden.
-
All
diese Konstrukte werden vom Expressionsvektor pRE2 erhalten (Nucleic
Acids Res. (1989) 17, 10473–88),
der den λ PL-Promotor und die α cII-Ribosomen-Bindungsstelle nutzt.
-
Konstruktion von F412Y
-
Thermoanaerobacter-thermohydrosulfuricus-DNA-Polymerase
wurde auf die Sequenz (RXXXKXXXFXXXYG) (SEQ. ID. Nr. 20) abgesucht,
um das Motiv B oder den O-Helixbereich zu lokalisieren. Die Sequenz
(RRAAKAVNFGIIYG) (SEQ. ID. Nr. 21) wurde bei Aminosäureresten
gefunden, die als 433 bis 466 des vorhergesagten pRED6706-Gen-Produkts
nummeriert waren. Ein mutagenes Oligonucleotid DDFY(AAGGTCAGAAAGCCCATAATCGCTTATGCCATATATTATG
CCATAATTTACGGC) (SEQ. ID. Nr. 22) wurde anti-parallel zu den Nucleotiden
1315–1371
der pRED6706-kodierenden Sequenz entworfen, mit Ausnahme für die Änderung
(AAA-ATA) bei nt 1325. Diese Änderung
entspricht Phenylalanin, das zu Tyrosin in der exprimierten Polymerase
geändert
wurde. Diese Oligonucleotid überlappt
auch eine einzige XhoI-Restriktionsstelle beim Nucleotid 1361.
-
Das
Oligonucleotid DDFY zusammen mit DD64pref (SEQ. ID. Nr. 13), das
komplementär
zu den Nucleotiden 94–133
der pRED6706-kodierenden Sequenz ist, enthält eine NdeI-Restriktionsstelle,
die zum Ausrichten der PCR-Amplifizierung und gleichzeitigen Mutagenese
von pRED6706 verwendet wurden. Das resultierende PCR-Produkt wurde
mit NdeI und XhoI verdaut, gereinigt durch Agarosegel-Elektrophorese und
ligiert mit dem großen
Fragment des ähnlich
behandelten pRED6404. Das ligierte Konstrukt wurde verwendet, um den
kompetenten E.coli-Strang
DH1λ+(λcl+) zu transformieren.
Klone, die ein geeignetes Restriktionsenzym-Verdauungsmuster ergaben, wurden sequenziert,
um die Mutation zu bestätigen.
-
Fremd-Mutationen
wurden zusätzlich
zu der erwünschten
Mutation in allen untersuchten Klonen gefunden, so wurde ein AflIII/KpnI-Restriktionsfragment,
das ausschließlich
die F412Y-Mutation (pRED6404-Nummerierung) enthielt, in pRED6404
subkloniert, um pLS-1 zu erhalten.
-
Beispiel 10: Reinigung
der F412Y-DNA-Polymerase
-
Das
Plasmid pLS-1 wurde in den E.coli-Strang MZ-1 (λ cl857-Lysogen) transformiert.
Ein I der Kultur im LB-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, wurde
bei 30 °C
bis OD600=1.1 gezogen. Die Temperatur wurde
auf 42 °C
angehoben und das Wachstum wurde für 2 Stunden fortgesetzt. Die
Zellen wurden durch Zentrifugation (4 g nasses Gewicht) geerntet
und im 15 ml Puffer A (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, 1
mM EDTA, 10 % (v/v) Glycerol) resuspendiert, der 50 mM NaCl enthielt.
Die Resuspension wurde viermal für
30 Sekunden beschallt und das Lysat wurde durch Zentrifugation geklärt. Das
geklärte
Lysat wurde zu 300 mM in NaCl gemacht und man ließ es durch
eine Säule
von DEAE-Zellulose (65 ml Bettvolumen) laufen, die in Puffer A,
der 300 mM NaCl enthielt, ins Gleichgewicht gebracht war. Die Durchfluss-Fraktion
(45 ml) wurde gesammelt, auf 70 °C
15 min lang erwärmt
und durch Zentrifugation geklärt.
Der geklärte Überstand
wurde mit Puffer A verdünnt,
der 50 mM NaCl enthielt, auf ein Gesamtvolumen von 120 ml. Diese
Lösung
wurde auf eine Säule
aus Heparin-Sepharose (70 ml Bettvolumen) geladen, die mit Puffer
A, der 150 mM NaCl enthielt, ins Gleichgewicht gebracht war. Die
Säule wurde
mit demselben Puffer gewaschen und die Aktivität aus der Säule mit einem linearen Salzgradienten
von 150 mM bis 700 mM NaCl-Puffer eluiert. Aktive Fraktionen, die
mehr als 90% rein durch SDS-PAGE beurteilt wurden, wurden gesammelt,
durch Ultrafiltration konzentriert und gegen 50 mM Phosphat, 50
% (v/v) Glycerol dialysiert. Die Sequenz ist in 4A–C (SEQ.
ID. Nr. 4) bereit gestellt.
-
Beispiel 11: Mutante voller
Länge ohne
5'- bis 3'-Exonuclease
-
Die
Entfernung der 5'-
bis 3'-Exonuclease-Aktivität ist für Anwendungen
erwünscht,
die für
diese Polymerase geeignet sind, einschließlich Amplifizierung und Sequenzieren.
Weil die 5'- bis
3'-Exonuclease-Aktivität co-incident
mit der RnaseH-Aktivität sein kann,
ist es auch wichtig, die 5'-
bis 3'-Exonuclease-Aktivität für die Anwendung
der Reversen Transkription zu entfernen oder reduzieren. Einzelne
Nucleotid-Substitutionen sind geeignet, um die Exonuclease-Aktivität zu reduzieren
oder zu entfernen.
-
Die
Aminosäuresequenz
der Tts-Polymerase wurde mit bekannten homologen DNA-Polymerase 1-Enzymen
wie E.coli DNA Pol I, Taq DNA-Polymerase und Tth DNA-Polymerase verglichen,
um konservierte Motive in der 5'-
bis 3'-Exonucleasedomäne zu identifizieren
(Gutman und Minton, Nucleic Acids Research, 21:4406–4407, 1993).
-
-
Ein
Carboxylat-Rest, der dafür
bekannt ist, dass er an der aktiven Exonucleasestelle der Taq DNA-Polymerase
vorhanden ist (Kim et al., Nature 376:612–616, 1995) wurde mutagenisiert.
Dieser Rest entspricht einem Asparaginsäurerest in Position 8 (D8)
in der Tts-Polymerase, der zu einem Alanin-Rest (A) mutagenisiert
wurde, um die Carboxylat-Funktion zu entfernen und die 5'- bis 3'-Exonuclease-Aktivität zu beseitigen.
Ein Oligo-Primer (CTTACATATGGCTTATAAATTTTTAATCATTG-CTGGTAGTAG) (SEQ.
ID. Nr. 28) wurde verwendet, um die Stellen-gerichtete Mutagenese
auszuführen.
Diese Mutagenese wandelt Asp8 zu Ala8 um und führt eine günstige Klonierungsstelle (NdeI)
am 5'-Ende ein.
Das pLS-3-Konstrukt (Tts-Polymerase
voller Länge) wurde
als eine Matrize und Elternklon verwendet. Ein 1,45 kb-Produkt wurde
durch PCR mit dem oben angegebenen Primer und einem internen Tts-Rückwärts-Primer
amplifiziert. Das NdeI/EcoRI-Fragment dieses PCR-Produktes wurde zurück substituiert in den pLS-3-Klon.
Der Vektor pRE2 und die bakteriellen Stränge DH1λ+ und M5248 sind wie zuvor beschrieben.
-
Jene,
die die Technik ausführen,
können
bekannte Techniken und andere ausführen, die jenen, die die Technik
ausführen,
bekannt sind, um andere Aminosäuren-Reste
im Amino-Terminus zu einem Drittel der Tts-Polymerase zu ändern, um
die Exonuclease-Aktivität
zu entfernen. Es gibt mindestens sechs konservierte Motive, die
am Amino-Terminus der homologen DNA-Polymerasen lokalisiert sind,
in dem Änderungen
in den Aminosäuren-Resten
zu einem Verlust oder einer Reduktion der Exonuclease-Aktivität führt. Diese
konservierten Motive werden in Gutman und Minton (supra) identifiziert
und von Daten von der Kristallstruktur der Taq-Polymerase gestützt (Kim, et al. (1995) Nature
376:612–616).
Die vorliegende Erfindung umfasst Änderungen in diesen Bereichen.
-
Beispiel 12: PCR mit ΔTts in 30
% Glycerol
-
PCR
wurde mit ΔTts-Enzym
bei Vorhandensein von 30 % Glycerol ausgeführt, um das Enzym zu stabilisieren
und die Temperaturen zu reduzieren, die zum DNA-Assoziieren in der Reaktion notwendig
sind. Eine 100 μl
PCR-Reaktion enthält
10 ng einer 6 kb Plasmid-Matrize, 100 pmol jeweils von Vorwärts- und
Rückwärts-Primern,
die ungefähr
500 bp entfernt sind, 200 μM
dNTP, 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 und
30 % Glycerol. Die Reaktionsmischung wurde auf 95 °C 2 min lang
erwärmt,
bevor ATts zugegeben wurde. Eine AmpliTaqTM(PE
Applied Biosystems, Foster City, CA)-Kontrollreaktion wurde getrennt
unter denselben Bedingungen ausgeführt. Das Cycling-Programm bestand
aus: 80 °C
für 15
Sekunden, 40 °C
für 30 Sekunden
und 55 °C
für 1 min,
wiederholt für
30 Zyklen. Ein PCR-Produkt einer geeigneten Größe wurde bei 2,5,5 und 10 Einheiten
von ΔTts
erzeugt, und diese Menge des Produktes war zwei- oder dreimal größer als jenes,
dass durch 2,5 Einheiten von AmpliTaqTM unter
denselben Bedingungen erzeugt wurde.
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Beispiel 13: RT/PCR-Protokoll
mit ΔTts
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Die
Reverse Transkription wird mit ΔTts-Enzym
ausgeführt,
als der erste Schritt von RT/PCR. Eine 20μl-Reaktion enthält 40 Einheiten
von ΔTts-Enzym,
5 mM MgCl2, 20 Einheiten placentalem Rnase-Inhibitor (Amersham
Pharmacia Biotech, Inc., Cleveland, OH), 1 mM jeweils von dATP,
dCTP, dGTP und dTTP, 15 pmol Primer, 10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM
KCl und 50 ng Globin-mRNA-Matrize. Man ließ die Reaktion 45 min bei 65 °C voranschreiten.
Diese 20 μl
Reaktionsmischung wurde zu einer PCR-Reaktionsmischung mit einem Endvolumen
von 100 μl
gegeben, die 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 100 pmol jeweils von Vorwärts- und
Rückwärts-Primern,
die ungefähr
500 bp entfernt waren, und 30 % Glycerol enthielt. Weitere Zugabe
von Enzym ist nicht notwendig; ΔTts
führt PCR
bei Vorhandensein von Glycerol aus. Das Cycling-Programm besteht
aus 50 Zyklen: 80 °C
für 15
Sekunden, 40 °C
für 30
Sekunden, 65 °C
für 1 min.
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Ein
Fachmann würde
leicht anerkennen, dass die vorliegende Erfindung gut angepasst
ist, um die Aufgaben auszuführen
und die erwähnten
Ziele und Zweckmäßigkeiten
zu erhalten, wie jene, die darin inhärent sind. Die Verfahren, Kits,
Lösungen
und Moleküle,
die hier beschrieben werden, sind zur Zeit repräsentativ für bevorzugte Ausführungsformen
und sind beispielhaft nicht beabsichtigt als Beschränkungen
für den
Umfang der Erfindung. Änderungen
darin und andere Verwendungen werden jenen Fachleuten einfallen
und werden innerhalb des Geistes der Erfindung umfasst sein, der
durch den Umfang der Ansprüche
definiert ist.
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Es
wird dem Fachmann einfach offenbar sein, dass variierende Substitutionen
und Modifikationen auf die Erfindung ausgeführt werden können, die
hier offenbart ist, ohne vom Umfang und Geist der Erfindung abzuweichen.
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Alle
in der Beschreibung erwähnten
Patente und Veröffentlichungen
zeigen die Niveaus der Fachleute an, die die Erfindung betrifft.
Alle Patente und Veröffentlichungen
sind hier durch Bezugnahme im selben Umfang enthalten, als wenn
jede einzelne Veröffentlichung
spezifisch und individuell als durch Bezugnahme enthalten angezeigt
wäre.
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Die
veranschaulichend hier beschriebene Erfindung kann auf geeignete
Weise in Abwesenheit eines beliebigen Elementes oder Elemente, Beschränkung oder
Beschränkungen
ausgeführt
werden, die hier nicht spezifisch offenbart ist. Daher kann z.B.
in jedem Fall hier ein beliebiger der Begriffe „umfassend", „im
wesentlichen bestehend aus" und „bestehend
aus" mit jedem der
anderen zwei Begriffe ausgetauscht werden. Die Begriffe und Ausdrücke, die
verwendet wurden, werden als Begriffe der Beschreibung und nicht
der Beschränkung
verwendet, und es gibt keine Absicht, dass bei der Verwendung derartiger
Begriffe und Ausdrücke
beliebige Äquivalente
der gezeigten und beschriebenen Merkmale oder Teile davon ausgeschlossen
werden, aber es wird anerkannt, dass verschiedene Modifikationen
innerhalb des Umfangs der beanspruchten Erfindung möglich sind.
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Zusätzlich werden,
wo Merkmale oder Aspekte der Erfindung in Begriffen von Markush-Gruppen
beschrieben werden, jene Fachleute erkennen, dass die Erfindung
auch dadurch in Form von einem/einer beliebigen individuellen Element
oder Subgruppe der Elemente der Markush-Gruppe beschrieben wird.
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Andere
Ausführungsformen
liegen innerhalb der folgenden Ansprüche.