JP3626226B2 - 熱安定性核酸ポリメラーゼ - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、高温性始原菌ピロジクチウム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ）の種からの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ並びに該酵素の単離および調製方法に関する。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、多くの組換えＤＮＡ技術、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸の増幅において有用である。
【０００２】
Ｅ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）のような中温性微生物からのＤＮＡポリメラーゼの単離に関しては広範囲に渡る研究が行われている。例えば、Ｂｅｓｓｍａｎ ら， １９５７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２２３：１７１−１７７、並びにＢｕｔｔｉｎおよびＫｏｒｎｂｅｒｇ， １９６６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４１：５４１９−５４２７を参照のこと。
【０００３】
核酸増幅方法の発明に伴って、高温性微生物からのＤＮＡポリメラーゼに対する関心が高まった。最初に存在した量に比べて多い量に現存の核酸配列を増幅させるための耐熱性酵素（例えば米国特許第 ４，１６５，１８８号に記載されたもの）の利用が、ＰＣＲ法を記載している米国特許第 ４，６８３，１９５号と同第 ４，６８３，２０２号に報告された。それらの特許は参考として本明細書中に組み込まれる。
【０００４】
ＰＣＲ法は、標的核酸の変性、プライマーのハイブリダイゼーション、およびＤＮＡポリメラーゼにより触媒される相補鎖の合成を含んで成る。各プライマーの伸長生成物が所望の核酸配列の生産のための鋳型となる。それらの特許明細書は、使用するポリメラーゼが耐熱性ポリメラーゼであれば、熱によってポリメラーゼ活性が破壊されないだろうから、各変性段階の後にポリメラーゼを添加する必要がないと開示している。
【０００５】
テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ；Ｔａｑ ）からの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｌａｗｙｅｒら， １９８９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：６４２７−６４３７ 並びに米国特許第 ４，８８９，８１８号および同第 ５，０７９，３５２号（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されたように、クローニングされ、発現され、精製されている。Ｔ．アクアティカスから単離されたＤＮＡポリメラーゼ活性の粗調製は他のものによっても記載されている（Ｃｈｉｅｎ ら， １９７６， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １２７：１５５０−１５５７ 、およびＫａｌｅｄｉｎ ら， １９８０， Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ ４５：６４４−６５１）。
【０００６】
米国特許第 ４，８８９，８１８号、欧州特許出願公開第２５８，０１７ 号およびＰＣＴ公報第ＷＯ８９／０６６９１号（これらの開示は参考として本明細書中に組み込まれる）はいずれも、テルムス・アクアティカスからの〜９４ ｋＤａの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの単離と組換え発現、並びにＰＣＲにおけるそのポリメラーゼの利用を記載している。Ｔ．アクアティカスＤＮＡポリメラーゼはＰＣＲや他の組換えＤＮＡ技術で使用するのに特に好ましいけれども、多数の他の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼも精製され、クローニングされ、発現されている（同時係属中の一般譲渡されたＰＣＴ公報第ＷＯ ９１／０９９５０， ＷＯ ９２／０３５５６， ＷＯ ９２／０６２００ およびＷＯ ９２／０６２０２ 号を参照のこと；これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０００７】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、例えばＰＣＲによるＤＮＡ増幅の実施の際のように、短時間の間９３〜９５℃に加熱した時でも不可逆的に不活性化されない。対照的に、この高温ではＥ．コリＤＮＡ ＰｏｌＩは不活性化される。
始原高温性菌、例えばピロジクチウム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ）種およびメタノピルス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）種は、約１１０ ℃までの温度で増殖し８０℃以下では増殖することができない（Ｓｔｅｔｔｅｒ ら， １９９０， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ７５：１１７−１２４を参照のこと；これは参考として本明細書中に組み込まれる）。それらの硫黄還元性完全嫌気性菌は海底環境から単離される。
【０００８】
例えば、Ｐ．アビシィは、深さ２，０００ メートルのグアヤマスメキシコ（Ｇｕａｙｍａｓ Ｍｅｘｉｃｏ）から吹き出す深海の活動「発煙」火孔から３２０ ℃の火道水中で単離された（Ｐｌｅｙら， １９９１， Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４：２４５）。ピロジクチウム種とは対照的に、９０℃またはその付近の最適増殖温度と１００ ℃またはその付近の最大増殖温度を有する他の高温性微生物は培養が難しくない。例えば、テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）からＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子がクローニングされ配列決定されている（欧州特許出願公開第４５５，４３０ 号）。
【０００９】
これに対して、極端に高温性の微生物の培養は、それらが寒天固形培地上で増殖できないことにより難しくなっている。ピロジクチウム種の個々の細胞は非常にもろく、該生物は繊維状網目構造として増殖する。標準的な細菌醗酵技術は、細胞がもろく、且つ細胞が常用の醗酵装置のスチール部分に目詰まりを起こす網状構造として増殖する傾向があるため、ピロジクチウム種を培養するのは非常に困難である（Ｓｔａｌｅｙ， Ｊ．Ｔ．ら編， Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １９８９， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ を参照のこと。これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００１０】
それらの難点は、特徴付けとアミノ酸配列分析用に多量の精製された核酸ポリメラーゼ酵素を調製するための実験室培養を妨害する。当業者らは１０６ 〜１０７ 細胞／ｍｌに到達する細胞密度にピロジクチウムを培養することができるかもしれない（例えば、Ｐｈｉｐｐｓら， １９９１， ＥＭＢＯ Ｊ． １０（７）：１７１１−１７２２ を参照のこと）。対照的に、Ｅ．コリは通常０．３ 〜１．０ ×１０１１細胞／ｍｌに増殖される。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
従って、それらの高温性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を、例えばそれらのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列を決定することにより、更に特徴づける必要がある。適当な宿主生物中で該遺伝子をクローニングしそして発現せしめることにより、生来の宿主の培養に関連する以前の難点を回避できる。加えて、増加された耐熱性を有する高温性ＤＮＡポリメラーゼを製造することは当業界において望ましい。そのようなＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ法を改良し、且つ他の組換え技術、例えばＤＮＡ配列決定、ニックトランスレーションおよび逆転写において耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使った時に得られる結果を改善することができる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ピロジクチウム種からのＤＮＡポリメラーゼについてのＤＮＡおよびアミノ酸配列情報、組換え発現ベクター並びに精製プロトコールを提供することにより、上記の要求を満たす。
【００１３】
本発明は、核酸鋳型鎖に相補的な核酸鎖を形成するヌクレオシド三リン酸の結合を触媒する精製された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを提供する。この酵素はピロジクチウム種由来のＤＮＡポリメラーゼである。好ましい態様では、該酵素はＰ．オクルタムまたはＰ．アビシィ由来である。この物質は、核酸配列を容易に操作および／または分析できるように、与えられた核酸配列から最初に存在する量に比べて多量に核酸配列が生産される温度循環増幅反応において利用することができる。
【００１４】
Ｐ．オクルタムおよびＰ．アビシィのＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードする遺伝子も同定されクローニングされ、本発明の耐熱性酵素を調製する更に別の手段を提供する。加えて、Ｐ．オクルタムおよびＰ．アビシィ酵素をコードする遺伝子並びにＰ．オクルタムおよびＰ．アビシィＤＮＡポリメラーゼ活性をコードするそれらの遺伝子の誘導体のＤＮＡ配列とアミノ酸配列も提供される。更に、Ｐ．オクルタムおよびＰ．アビシィＤＮＡポリメラーゼ活性をコードし且つ３′→５′エキソヌクレアーゼ欠損形を発現する変形遺伝子もまた提供される。
【００１５】
本発明は、１または複数の非イオン性高分子界面活性剤を含有する緩衝液中に上述の精製された耐熱性Ｐ．オクルタムおよび／またはＰ．アビシィ酵素を含んで成る安定な酵素組成物も包含する。
最後に、本発明は本発明の耐熱性ポリメラーゼの精製方法を提供する。
【００１６】
かくして、本発明は、ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列および発現ベクターを提供する。本発明の理解を促すために、様々な用語を下記に定義する。
【００１７】
「細胞」、「細胞系」および「細胞培養物」なる用語は互いに交換可能に用いることができ、そのような名称は全て子孫を含む。「形質転換体」または「形質転換された細胞」なる語は、一次形質転換細胞および継代数に関係なくその細胞から誘導された培養物を包含する。計画的または偶然の突然変異のため、全ての子孫のＤＮＡ含量が正確に同じでなくてもよい。もとの形質転換細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能性を有する変異型子孫は、形質転換体の定義の中に含まれる。
【００１８】
「調節配列」なる用語は、特定の宿主生物中での操作可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を言う。原核生物に適当である調節配列としては、例えば、プロモーター、所望によりオペレーター配列、リボソーム結合部位、ことによると他の配列が挙げられる。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを使うことが知られている。
【００１９】
「発現系」なる用語は、それらのＤＮＡ配列によって形質転換された宿主がコードされるタンパク質を産生することができるように、作用可能な結合において所望のコード配列と調節配列とを含有するＤＮＡ配列を言う。形質転換を成し遂げるために、発現系はベクター上に含まれてもよいが、関連ＤＮＡが宿主染色体中に組み込まれてもよい。
【００２０】
「遺伝子」なる用語は、回収可能な生物活性ポリペプチドまたは前駆体の生産に必要な調節配列とコード配列とを含んで成るＤＮＡ配列を言う。ポリペプチドは、全長遺伝子配列によりコードされるかまたは酵素活性が保持されさえすればコード配列の任意部分によりコードされてもよい。
「作用可能に連結された」という用語は、調節配列がコード配列によりコードされるタンパク質の発現を指令する働きをするようなコード配列の配置を言う。よって、発現調節配列に「作用可能に連結された」コード配列とは、調節配列の指令下でコード配列を発現せしめることができる配置を指す。
【００２１】
ピロジクチウムポリメラーゼを含有する混合物に関連して言及される「混合物」なる用語は、ピロジクチウムポリメラーゼを含有するが他のタンパク質を含むこともできる物質の集合体を言う。ピロジクチウムポリメラーゼが組換え宿主細胞から誘導される場合、他のタンパク質は通常その宿主に関連するものであろう。宿主が細菌である場合、夾雑タンパク質はもちろん細菌タンパク質であろう。
【００２２】
「非イオン性高分子界面活性剤」なる用語は、イオン電荷を全く持たず、本発明の目的上、約３．５ 〜約９．５ のｐＨ域、好ましくは４．０ 〜９．０ のｐＨ域においてピロジクチウム酵素を安定化する能力により特徴づけられる界面活性剤である。
本明細書中で使用する「オリゴヌクレオチド」なる用語は、２以上、好ましくは３以上、通常は１０以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから成る分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、該オリゴヌクレオチドの最終的機能または用途といった様々な要因に依存するだろう。
【００２３】
オリゴヌクレオチドは、例えば、適当な配列のクローニングと制限、並びにＮａｒａｎｇら， １９７９， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：９０−９９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ ら， １９７９， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：１０９−１５１のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら， １９８１， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２２：１８５９−１８６２のホスホルアミダイト法；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ら， １９８１， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０３：３１８５−３１９１ のトリエステル法または自動合成法；および米国特許第４，４５８，０６６ 号の固体支持体法などの方法による直接化学合成を包含する任意の適当な方法により、調製することができる。
【００２４】
本明細書中で使用する「プライマー」なる用語は、天然型であろうと合成型であろうと、プライマー伸長が開始される条件下に置いた時に合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。核酸鎖に相補的であるプライマー伸長生成物の合成は、適当な温度で適当な緩衝液の中でヌクレオシド三リン酸とＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素の存在下で開始される。「緩衝液」は、所望のｐＨに調整された補因子（例えば二価金属イオン）および塩（適当なイオン強度を提供するため）を含有する。
【００２５】
ピロジクチウムポリメラーゼ用には、緩衝液は好ましくは、１０〜１００ｍＭ ＫＣｌ 、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ 緩衝液（ｐＨ ７．５〜８．５ ）および１００ μｇ／ｍｌのゼラチン（ゼラチンは必要でないし、ある用途、例えばＤＮＡ配列決定には避けるべきであるけれども）と共に、１〜３ｍＭのマグネシウム塩、好ましくはＭｇＣｌ２ 、５０〜２００ μＭ の各ヌクレオチド、および０．２ 〜１ μＭ の各プライマーを含有する。
【００２６】
プライマーは、好ましくは一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーの適切な長さは該プライマーの意図する用途に依存するが、典型的には１５〜３５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は一般に、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するのにより低い温度を必要とする。プライマーは鋳型の配列を正確に反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズするほど十分に相補的でなければならない。
【００２７】
「プライマー」なる用語は、特に増幅させる予定の標的領域の一端または両端に関する情報に幾らか曖昧さがある場合、複数のプライマーを指すことができる。例えば、核酸配列がタンパク質配列から推定される場合、「プライマー」は実際には遺伝暗号の縮重に基づいて考えられ得る全てのコドン変異を表す配列を含有するプライマーオリゴヌクレオチドの集合体である。この集合体のうちの１つのプライマーは標的配列の末端と相同であろう。同様に、「保存された」領域が集団の中で有意なレベルの多形性を示すならば、隣接配列を増幅するであろうプライマーの混合物を調製することができる。
【００２８】
プライマーは、鋳型の特定配列の鎖に「実質上」相補的であることができる。プライマーは、プライマー伸長が起こる鋳型鎖とハイブリダイズするのに十分な程「相補的」でなければならない。プライマー配列は鋳型の配列を正確に反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片をプライマーの５′末端に取り付けてもよいが、ただし、プライマー配列の残部は鋳型鎖に実質上相補的であろう。プライマー中に非相補的塩基または長い配列を点在させることができるが、ただし、プライマー配列が、鋳型の配列とハイブリダイズしそれによってプライマー伸長生成物の合成のための鋳型プライマー複合体を形成するのに十分な相補性を有することを前提とする。
【００２９】
プライマーは、所望であれば、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段によって検出可能な標識を組み込むことにより、標識することができる。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（ＥＬＩＳＡ において汎用されるような）、ビオチン、またはそれに対する抗血清もしくはモノクローナル抗体が入手可能であるタンパク質およびハプテンが挙げられる。標識は、プライマーまたはプライマー伸長生成物（例えば増幅されたＤＮＡ）のいずれかの固相支持体上への固定化を容易にするためにプライマーを「捕捉する」のにも使うことができる。
【００３０】
「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」なる語は、特定のヌクレオチド配列のところまたはその付近で二本鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素をいう。
「耐熱性ポリメラーゼ」および「耐熱性酵素」なる用語は、熱に対して安定であり、熱抵抗性であり、且つ正しい形でのヌクレオチドの結合を触媒して鋳型核酸鎖に相補的であるプライマー伸長生成物を形成する酵素をいう。一般的に、プライマー伸長生成物の合成はプライマーの３′末端で始まり、合成が終わるまで鋳型鎖に沿って５′方向に進行する。
【００３１】
本発明のピロジクチウム耐熱性酵素は、米国特許第 ４，９６５，１８８号（本明細書中に引用により組み込まれる）に記載されたようなポリメラーゼ連鎖反応またはＰＣＲとして知られる増幅反応における効果的使用のための必要条件を満たす。ピロジクチウム酵素は、ＰＣＲ法における重要な段階である二本鎖核酸の変性を行うのに必要な時間の間高温にかけた時、不可逆的に変性（不活性化）された状態にならない。この目的上の不可逆的変性とは、酵素活性の永久且つ完全な損失を言う。核酸変性に必要な加熱条件は、例えば、緩衝液塩濃度並びに変性させようとする核酸の組成と長さに依存するだろうが、典型的には約９０℃〜約１０５ ℃の範囲であり、その時間は主に温度と核酸の長さに依存して、典型的には数秒間〜４分間までであろう。
【００３２】
緩衝液塩濃度および／または核酸のＧＣ組成が増加すると、より高温が要求されるかもしれない。ピロジクチウム酵素は約９５℃〜１００ ℃の温度への比較的短期暴露から不可逆的に変性された状態にはならない。ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼの極端な耐熱性は、以前に特徴づけられた耐熱性酵素を上回る追加の利点を提供する。本発明より以前には、１００ ℃ほど高い変性温度での効率的ＰＣＲは提案されていなかった。この目的での耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは今まで全く記載されたことがない。
【００３３】
しかしながら、標的核酸のＧ／Ｃ含量が増加すると、二本鎖を変性せしめるのに必要な温度（Ｔｄｅｎ ）も増加する。９５℃を越えるＴｄｅｎ 段階を必要とする標的配列には、従来のプロトコールでは二本鎖を部分的に不安定にし、それによって有効Ｔｄｅｎ を下げるためにＰＣＲ中に溶剤を含めることを必要とする（Ｋｏｒｇｅ ら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：９１０−９１４、およびＷｏｎｇら， １９９１， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：２２５１−２２５９；これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００３４】
それらの剤は、二本鎖ＤＮＡを不安定にすることに加えて、プライマーの安定性に影響を及ぼし、酵素活性を阻害し、そして様々な濃度のＤＭＳＯまたはホルムアミドは好熱性ＤＮＡポリメラーゼの耐熱性（即ち半減期）を減少させるだろう。従って、それらの補助溶剤を使用する時には相当な数の最適化実験および反応条件を評価しなければならない。これに対して、他の点では標準的なＰＣＲにおいてＰｏｃ またはＰａｂ ＤＮＡポリメラーゼを使って単純にＴｄｅｎ を１００ ℃に上げることにより、ＰＣＲ生成物の完全な鎖分離が促進され、ＤＮＡらせん不安定化剤の必要性を排除することができる。
【００３５】
本明細書中に開示される極度な高温性ポリメラーゼは、１００ ℃を越える温度で、そして１１０ ℃ほどの高温でさえも、安定である。しかしながらそれらの温度では、ｐＨやイオン強度に依存して、標的ＤＮＡの完全性が悪影響を受ける場合がある（Ｅｋｅｒｔ およびＫｕｎｋｅｌ， １９９２， ＰＣＲ ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｑｕｉｒｋｅ およびＴａｙｌｏｒ編， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ２２５−２４４頁；これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００３６】
ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼは、それが機能するのには約４５℃より高い最適温度を有する。４５℃より低い温度は鋳型へのプライマーのハイブリダイゼーションを促進するが、塩組成と濃度並びにプライマー組成と長さに依存して、鋳型へのプライマーのハイブリダイゼーションはより高温（例えば４５〜７０℃）で起こることができ、プライマーハイブリダイゼーション反応の特異性を促進し得る。本発明の酵素は８５℃までの広い温度範囲に渡り活性を示す。最適活性は鋳型に依存するが通常は７０〜８０℃の範囲であろう。
【００３７】
本発明は、ピロジクチウム種の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性をコードするＤＮＡ配列を提供する。本発明の好ましい態様は、Ｐ．アビシィおよびＰ．オクルタムＤＮＡポリメラーゼの核酸配列とアミノ酸配列を提供する。完全なＰ．アビシィおよびＰ．オクルタムＤＮＡポリメラーゼコード配列は、配列番号１（Ｐ．アビシィ）および配列番号３（Ｐ．オクルタム）として下記に記述される。推定アミノ酸配列は配列番号２（Ｐ．アビシィ）および配列番号４（Ｐ．オクルタム）として記載される。便宜上、それらのポリメラーゼのヌクレオチド配列とアミノ酸配列は参考のため番号付けされる。
【００３８】
本発明は、Ｐ．オクルタムおよびＰ．アビシィＤＮＡポリメラーゼ配列と他の耐熱性ポリメラーゼ酵素との比較手段を与える核酸配列を提供する。そのような比較は、それらの新規配列が、真性細菌耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする以前に記載された核酸配列と無関係であることを証明する。結果として、公表された既知の真性細菌耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ配列に基づいてピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼ酵素を同定する手段は、ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードする核酸配列を単離するのに適していない。
【００３９】
【表１】
【００４０】
【表２】
【００４１】
【表３】
【００４２】
【表４】
【００４３】
【表５】
【００４４】
【表６】
【００４５】
本発明の結果として、ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列を使って新規の縮重プライマーを設計し、今まで発見されなかった高温性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を見つけ出すことができる。縮重プライマー法の一般的効用は、ＰＣＴ公報第ＷＯ ９２／０６２０２ 号（この開示は参考として本明細書中に組み込まれる）において例示されている。
【００４６】
この刊行物は、テルモシフォ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子をクローニングするための縮重プライマーの使用を記載している。本発明より前に、縮重プライミング法が新規耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を単離するのに適することが証明された。それらの方法の成功の一部は、例えばテルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）およびテルムス・テルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ間で保存されたモチーフの同定に存する。
【００４７】
よって、例えばピロジクチウム種のような極端な高温性菌とテルムス種のような非高温菌との間のＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列の相違のため、それらの縮重プライミング法は今まではピロジクチウムポリメラーゼ遺伝子の単離および発現に適さなかった。本出願人らは、極端な高温性微生物から新規ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を単離するのに縮重プライミング法を使用することを可能にした。
【００４８】
高温菌Ｔ．リトラリス （Ｔｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は既に記載されている。Ｔｌｉ， ＰａｂおよびＰｏｃ ＤＮＡポリメラーゼは真核生物ＤＮＡポリメラーゼを表すアミノ酸配列モチーフを含む一方で、Ｐａｂ およびＰｏｃ ＤＮＡポリメラーゼはＴｌｉ ＤＮＡポリメラーゼとは限定された所々のアミノ酸配列一致しか有さない。詳しくは、アミノ酸配列の整列は、Ｐｏｃ またはＰａｂ ＤＮＡポリメラーゼとＴｌｉ ＤＮＡポリメラーゼとの間でわずか３７％〜３９％の配列一致しか示さない。
【００４９】
Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼと不一致である重要な領域は、領域１（配列番号２および４の ４３８〜 ４５８位）の前の２０アミノ酸と領域１の後ろの１０アミノ酸中に存在する。加えて、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼとの不一致を示す重要な領域は領域４（配列番号２および４の ６１１〜 ６３４位）の前の１０〜１５アミノ酸と領域４の後ろの１０〜１５アミノ酸中に存在する。それらの領域並びにポリメラーゼ活性部位の他の部分はＰａｂ およびＰｏｃ ＤＮＡポリメラーゼ中では高度に保存されており、それらのＤＮＡポリメラーゼ酵素の驚くほどの耐熱性にかなり寄与している。
【００５０】
従って、本発明は、２つのピロジクチウムポリメラーゼ酵素のＤＮＡ配列とアミノ酸配列を提供することにより、他の極端に高温性のＤＮＡポリメラーゼ酵素およびそれらの酵素のコード配列の単離を可能にする。Ｐ．オクルタムおよびＰ．アビシィの配列と既知の耐熱性酵素配列との更なる整列は、１００ ℃の変性温度での効率的ＰＣＲに適する追加の新規酵素の選択的同定を可能にする。
【００５１】
上記に示したＤＮＡ配列およびアミノ酸配列並びにそれらの配列をコードするＤＮＡ化合物は、多種多様の宿主細胞中でのピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼの発現を指令する組換えＤＮＡ発現ベクターを設計し作製するのに利用することができる。上記に示したＤＮＡ配列の全部または一部をコードするＤＮＡ化合物は、他の始原菌、特にピロジクチウム種からの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを同定するためのプローブとしても利用することができ、そして上記に示したアミノ酸配列は、耐熱性ポリメラーゼを同定および精製するのに用いることができる抗体を調製するための免疫原として使われるペプチドを設計するのに利用することができる。
【００５２】
ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼをコードするアミノ酸配列をコードする組換えベクターは、典型的には組換えＤＮＡ技術における使用の前に精製されるだろう。本発明はそのような精製方法を提供する。
Ｐ．オクルタムまたはＰ．アビシィポリメラーゼ遺伝子を発現する組換えＥ．コリ宿主から精製されたＤＮＡポリメラーゼの分子量は、上記方法により約９０ ｋＤａであると決定される。推定アミノ酸配列によって決定した時のこの同一ＤＮＡポリメラーゼの分子量は、約９２．６キロダルトンであると算出される。
【００５３】
本発明の重要な観点は、組換えピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼの生産である。よって本発明は、本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの調製方法も提供し、該方法は
（ａ） 前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡベクターによって形質転換された宿主細胞を培養する段階；および
（ｂ） 前記培養物から前記宿主細胞中で生産された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを単離する段階
を含んで成る。
【００５４】
上述したように、この酵素をコードする遺伝子は２つの模範的なピロジクチウム種であるＰ．オクルタムとＰ．アビシィのゲノムＤＮＡからクローニングされた。Ｐ．オクルタム（Ｐｏｃ） ＤＮＡポリメラーゼの完全コード配列は、プラスミドｐＰｏｃ４ の〜２．５２ ｋｂ ＮｈｅＩ制限断片中に容易に得ることができる。このプラスミドは宿主細胞Ｅ．コリ Ｓｕｒｅ Ｒ 細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中において１９９３年 ５月１１日に受託番号６９３０９ のもとアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された。Ｐ．アビシィ（Ｐａｂ） ＤＮＡポリメラーゼの完全コード配列は、プラスミドｐＰａｂ１４の〜３．７４ ｋｂ ＳａｌＩ制限断片中に容易に得ることができる。このプラスミドは宿主細胞Ｅ．コリ Ｓｕｒｅ Ｒ 細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中において１９９３年 ５月１１日に受託番号６９３１０ のもとＡＴＣＣに寄託された。
【００５５】
耐熱性Ｐａｂ およびＰｏｃ ＤＮＡポリメラーゼ酵素の完全コード配列および推定アミノ酸配列は上記に与えられている。しかしながら、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する生物活性遺伝子産物を生産するために該ＤＮＡポリメラーゼの全コード配列が必要なわけではない。ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼ配列をコードするＤＮＡの入手可能性は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するミューテイン（変異タンパク質）形を生じるように該コード配列を変更する機会を提供する。
【００５６】
コード配列の約１／３のアミノ（Ｎ）末端の欠失は、ポリメラーゼアッセイにおいて全く活性である遺伝子産物を提供する。ポリメラーゼの幾つかのＮ末端短縮形が活性であることから、それらのポリメラーゼの発現に使われる遺伝子構成物はコード配列のＮ末端短縮形を包含することができる。
【００５７】
Ｎ末端欠失に加えて、ピロジクチウムポリメラーゼを含んで成るペプチド鎖内の個々のアミノ酸残基を酸化、還元または他の誘導化により修飾することができ、またタンパク質を開裂せしめて活性を保持している断片を得ることもできる。活性を損なわないそのような変更は、Ｐｏｃ またはＰａｂ ポリメラーゼに関する定義から該タンパク質を除外するものではなく、特別に本発明の範囲内に含まれるものである。
【００５８】
欠失、付加、または翻訳中にＤＮＡポリメラーゼ中に取り込まれるアミノ酸を変えるような変更によるＰｏｃ またはＰａｂ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の一次構造への修飾は、該タンパク質の高温ＤＮＡポリメラーゼ活性を破壊せずに行うことができる。そのような置換または他の変更は、本発明の予想の範囲内に入るＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質の生成をもたらす。同様に、Ｐｏｃ またはＰａｂ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローン化ゲノム配列または相同の合成配列を使って、ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼ活性を有する融合ポリペプチドを発現させることができ、あるいは生来のＰｏｃ またはＰａｂ ＤＮＡポリメラーゼのものと同じアミノ酸配列を有するタンパク質を発現させることができる。
【００５９】
従って本発明は、Ｐｏｃ およびＰａｂ ＤＮＡポリメラーゼ酵素の完全なコード配列を提供する。このコード配列から様々な宿主系に適用可能な発現ベクターを作製し、そして該コード配列を発現せしめることができる。本発明のポリメラーゼコード配列の一部分も、様々な種において他の耐熱性ポリメラーゼコード配列を検索するためのプローブとして有用である。従って、少なくとも４〜６アミノ酸をコードするゲノムＤＮＡの部分を少なくとも４〜６アミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドプローブとして合成し、耐熱性ポリメラーゼをコードする追加のＤＮＡを検索するのに用いることができる。
【００６０】
Ｐａｂ およびＰｏｃ の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子と他の種の対応遺伝子のヌクレオチド配列の間に正確な一致がないかもしれないので、偽陽性を避けるのに十分な緊縮条件下でハイブリダイゼーションを得るために、約１２〜１８ヌクレオチドをコードするオリゴマー（４〜６アミノ酸配列をコードする）が通常必要である。６アミノ酸をコードする配列はそのようなプローブに十分な情報を与える。
【００６１】
本発明は、Ｐａｂ およびＰｏｃ ＤＮＡポリメラーゼのコード配列とアミノ酸配列を提供することにより、他の耐熱性ポリメラーゼ酵素およびそれらの酵素のコード配列の単離を可能にする。詳しくは、本発明は、追加のピロジクチウム種であるＰ．ブロッキィ（Ｐ． ｂｒｏｃｋｉｉ）、およびＭ．カンドレリ（Ｍ． ｋａｎｄｌｅｒｉ）などのメタノピルス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）種を含む極端な高温菌のような関連の始原菌からのＤＮＡ単離物中に含まれるＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードする核酸を同定するためのプライマーおよびプローブを調製する手段を提供する。
【００６２】
Ｐａｂ とＰｏｃ ＤＮＡポリメラーゼコード配列の間にはそのような幾つかの類似領域が存在する。長さ９コドンの領域には、それらの領域に対応するプローブを使って、少なくとも５コドンの連続配列用のプローブと同一である（そして相補的である）耐熱性ポリメラーゼ酵素をコードする配列を同定し単離することができる。長さ６コドンの領域には、この領域に対応するプローブを使って、少なくとも５コドンの連続配列用のプローブと同一である耐熱性ポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列を同定し単離することができる。
【００６３】
ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼ酵素中には見つかるが生来のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼと生来のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ中には欠けている１つの特性は、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性である。この３′→５′エキソヌクレアーゼ活性は、合成された核酸配列の誤って組み込まれた塩基または不適正塩基がこの活性によって除去されるため一般的に望ましいと考えられる。しかしながら、ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼ酵素中に見つかる３′→５′エキソヌクレアーゼ活性は、プライマーの３′末端を変更することによりＰＣＲにおいて非特異的なバックグラウンド増幅をも増大させ得る。
【００６４】
３′→５′エキソヌクレアーゼ活性はプライマーまたは一本鎖鋳型のような一本鎖ＤＮＡを除去し得る。本質的に、一本鎖プライマーまたは鋳型のどの３′−ヌクレオチドも該酵素により不対のものとして処理されそして分解される。ＰＣＲにおけるプライマー分解を避けるために、プライマーの３′末端にホスホロチオエートを付加することができる。ホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドは、３′→５′エキソヌクレアーゼによる除去に対して一層抵抗性である。
【００６５】
生来のＰａｂ もしくはＰｏｃ ＤＮＡポリメラーゼと同一の酵素を生産しようと望むにせよまたは該酵素の誘導体もしくは類似体を生産しようと望むにせよ、該ポリメラーゼの組換え形態の生産は、典型的には発現ベクターの作製、該ベクターによる宿主細胞の形質転換、および発現が起こるような条件下での形質転換された宿主細胞の培養を伴う。発現ベクターを作製するために、成熟酵素（この用語は本明細書中全ミューテインを包含するものとして使われる）または該ポリメラーゼの融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを得る。
【００６６】
ここで融合ポリペプチドは、本発明のポリメラーゼから誘導されるアミノ酸配列と、ポリメラーゼ活性の破壊をもたらさない追加のアミノ酸配列または制御条件（例えばペプチダーゼでの処理）下で開裂されて活性タンパク質を与えるような追加のアミノ酸配列とを含んで成る。次いでコード配列を適当な調節配列と作用可能な結合において発現ベクター中に配置させる。
【００６７】
ベクターは、宿主細胞中で自律的に複製するかまたは宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込まれるように設計することができる。該ベクターを使って適当な宿主を形質転換せしめ、そして形質転換された宿主を組換えピロジクチウムポリメラーゼの発現に適当な条件下で培養する。培地または細胞からピロジクチウムポリメラーゼを単離する。幾つかの不純物が許容され得る場合、該タンパク質の回収と精製は場合によって必要でないことがある。
【００６８】
所望のコード配列と調節配列を含有する適当なベクターの作製は、当業界においてよく理解されている標準的連結および制限技術を使用する（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹを参照のこと；これは参考として本明細書中に組み込まれる）。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列、または合成されたオリゴヌクレオチドは、所望の形態に切断され、修飾され、そして再連結される。通常入手できないならば、適当な制限部位をコード配列の末端に付加して当業界において既知の方法により発現ベクターの作製を容易にすることができる。
【００６９】
配列変更を必要とするベクターまたはコード配列の部分には、様々な部位特異的プライマー指令突然変異誘発法が利用可能である。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使って部位特異的突然変異誘発を実施することができる。ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｉｎｎｉｓら編， １９９０， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ およびＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｅｎｒｙ Ｅｒｌｉｃｈ編， １９８９， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹは、ＰＣＲを使ってＤＮＡをクローニングし、修飾し、そして配列決定する方法を記載しており、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【００７０】
調節配列、発現ベクターおよび形質転換法は、遺伝子を発現せしめるのに使う宿主細胞の型に依存する。一般的には、宿主として原核生物、酵母、昆虫または哺乳動物細胞が使われる。原核生物宿主は一般に組換えタンパク質の生産に最も効率的で且つ好都合であり、従ってピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼ酵素の発現に好ましい。
【００７１】
組換えタンパク質の発現に最も頻繁に使われる原核生物はＥ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ ）である。構成物のクローニングおよび配列決定、並びに大部分の細菌プロモーターの調節下での構成物の発現には、Ｅ．コリ遺伝子貯蔵センター（Ｅ． ｃｏｌｉ． Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ ）からＧＣＳＣ ＃６１３５のもとに得られるＥ．コリ Ｋ１２株ＭＭ２９４ を宿主として使用することができる。ＰＬ ＮＲＢＳ 調節配列を有する発現ベクターには、Ｅ．コリ Ｋ１２株ＭＣ１０００ラムダ溶原素、Ｎ７Ｎ５３ｃＩ８５７ ＳｕｓＰ８０， ＡＴＣＣ ３９５３１ を使うことができる。
【００７２】
１９８７年４月７日にＡＴＣＣに寄託されたＥ．コリ ＤＧ１１６（ＡＴＣＣ ５３６０６）、および１９８５年３月２９日にＡＴＣＣに寄託されたＥ．コリ ＫＢ２（ＡＴＣＣ ５３０７５）も有用な宿主細胞である。Ｍ１３ ファージ組換え体には、ファージ感染に対して感受性であるＥ．コリ株、例えばＥ．コリ Ｋ１２株ＤＧ９８が使用される。ＤＧ９８は１９８４年７月１３日にＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ ３９７６８）に寄託された。
【００７３】
しかしながら、Ｅ．コリ以外の微生物株、例えばバシラス菌、例えばバシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、様々な種のシュードモナス菌、および他の菌株をピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼ酵素の組換え発現に使うこともできる。
細菌に加えて、真核微生物、例えば酵母を組換え宿主細胞として使うこともできる。例えば、Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら， １９７９， Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３９ ； Ｔｓｃｈｅｍｐｅ ら， １９８０， Ｇｅｎｅ １０：１５７ ；およびＣｌａｒｋｅら， １９８３， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． １０１：３００ を参照のこと。
【００７４】
ピロジクチウム遺伝子は、多細胞生物から誘導した真核細胞培養物中で発現せしめることもできる。例えば、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＣｒｕｚおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ 編 （１９７３） を参照のこと。有用な宿主細胞系としては、ＣＯＳ−７， ＣＯＳ−Ａ２， ＣＶ−１ 、マウス細胞、例えばマウスミエローマＮ５１ およびＶＥＲＯ、ＨｅＬａ細胞、並びにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ） 細胞が挙げられる。植物細胞も宿主細胞として有用であり、植物細胞と適合性である調節配列、例えばノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら， １９８２， Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌｎ． Ｇｅｎ． １：５６）が利用可能である。
【００７５】
使用する宿主細胞に依存して、そのような細胞に適当な標準技術を使って形質転換が行われる。原核生物または実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞には、Ｃｏｈｅｎ， １９７２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６９：２１１０ により記載されたような塩化カルシウムを使用するカルシウム処理が使われる。哺乳動物細胞には、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， １９７８， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：５４６のリン酸カルシウム沈澱法が好ましい。酵母中への形質転換は、Ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎら， １９７７， Ｊ． Ｂａｃｔ． １３０：９４６および Ｈｓｉａｏら， １９７９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７６：３８２９ の方法に従って行われる。
【００７６】
ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼが組換え宿主細胞中で発現されたら、該タンパク質の精製が望ましいだろう。上述した精製手順を使って本発明の組換え耐熱性ポリメラーゼを精製することができるけれども、疎水的相互作用クロマトグラフィー精製法が好ましい。疎水的相互作用クロマトグラフィーは、疎水基を含む無電荷の材料との疎水的相互作用の強度の差に基づいて物質が分離される分離技術である。典型的には、まずカラムを疎水結合に好ましい条件下で、例えば高イオン強度下で平衡化する。下降性の塩勾配を使って試料を溶出せしめることができる。
【００７７】
組換え耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを精製するための詳細なプロトコールは、例えば、１９９２年３月５日に発行されたＰＣＴ特許公報第ＷＯ ９２／０３５５６ 号および１９９１年７月１１日に発行されたＰＣＴ特許公報第ＷＯ ９１／０９９５０ 号に記載されている。それらの刊行物は参考として本明細書中に組み込まれる。テルモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）についてその中に記載された方法が適当である。実施例９（下記参照）は組換えピロジクチウムポリメラーゼ酵素を精製するための好ましいプロトコールを提供する。
【００７８】
長期安定性のためには、ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼ酵素は、好ましくは１または複数の非イオン性高分子界面活性剤を含有する緩衝液中に保存される。そのような界面活性剤は一般に約１００ 〜２５０，０００ 、好ましくは約４，０００ 〜２００，０００ ダルトンの範囲内の分子量を有し、そして約３．５ 〜約９．５ 、好ましくは約４ 〜８．５ のｐＨにおいて該酵素を安定化する。そのような界面活性剤の例として、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＭＣ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， １７５， Ｒｏｃｋ Ｒｏａｄ， Ｇｌｅｎ Ｒｏｃｋ， ＮＪ （ＵＳＡ） により出版されたＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ ＆ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ， Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ 版（１９８３）の２９５ 〜２９８ 頁に明記されたものが挙げられる。この全開示は参考として本明細書中に組み込まれる。
【００７９】
好ましくは、界面活性剤は、エトキシル化脂肪アルコールエーテルおよびラウリルエーテル、エトキシル化アルキルフェノール、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、修飾されたオキシエチル化および／またはオキシプロピル化直鎖アルコール、ポリエチレングリコールモノオレエート化合物、ポリソルベート化合物、並びにフェノール性脂肪アルコールエーテルから成る群から選ばれる。特により好ましいのは、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｎｓ Ｉｎｃ．， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｅ．からのポリオキシエチル化（２０）ソルビタンモノラウレートすなわちＴｗｅｅｎ−２０、およびＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ Ｃｏｒｐ． Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ， ＮＪ からのエトキシル化アルキルフェノール（ノニル）すなわちＩｃｏｎｏｌＴＭ ＮＰ−４０である。
【００８０】
本発明の耐熱性酵素は、そのような酵素活性が必要または所望であるどんな目的にも用いることができる。特に好ましい態様では、該酵素はＰＣＲとして知られる核酸増幅反応を触媒する。
ＰＣＲ法は当業界で周知であり（米国特許第 ４，６８３，１９５号；同第 ４，６８３，２０２号および同第 ４，９６５，１８８号を参照のこと；この各々は参考として本明細書中に組み込まれる）、更に販売業者、例えばＰｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒはＰＣＲ試薬を販売しておりＰＣＲプロトコールを発表しているけれども、ＰＣＲ法をよく知らない人への本発明の平明と十分な理解のためにＰＣＲ情報を下記に幾つか提供する。
【００８１】
ＰＣＲにより試料中の標的核酸配列を増幅させるために、該配列は増幅系の成分に近づきやすくなければならない。一般に、この近づきやすさ（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ）は、試料から核酸を単離することによって保証される。生物学的試料から核酸を抽出する様々な技術が当業界で既知である。例えば、Ｈｉｇｕｃｈｉ ら， １９８９， ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｅｒｌｉｃｈ編， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） に記載されたものを参照のこと。
【００８２】
試料中の核酸をまず変性せしめ（試料核酸が二本鎖であると仮定して）てからＰＣＲ反応を開始するため、そして試料によっては単に加熱することが細胞の破壊を引き起こすため、試料からの核酸の単離は時折鎖分離と共に行うことができる。しかしながら、鎖分離は物理的、化学的または酵素的手段を含む任意の適当な変性法によって成し遂げることができる。典型的な熱変性は、約８０〜１０５ ℃の範囲の温度と数秒から約１〜１０分までの範囲の時間を必要とする。
【００８３】
上述したように、鎖分離は試料核酸の単離と共にまたは別々の段階として行うことができる。ＰＣＲ法の好ましい態様では、鎖分離は、二本鎖の変性を引き起こすがポリメラーゼの不可逆的変性を引き起こさないような効果的な時間の間十分に高温に反応液を加熱することによって達成される（米国特許第 ４，９６５，１８８号を参照のこと）。しかしながら、たとえ鎖分離がどんな方法で達成されても、一度鎖が分離されれば、ＰＣＲの次の段階は、分離した鎖を標的配列に隣接するプライマーとハイブリダイズせしめることを含む。次いでプライマーを伸長して標的配列の相補的コピーを形成せしめ、そして所望の量の増幅核酸を得るのに必要な回数だけ、変性、ハイブリダイゼーションおよび伸長のサイクルを繰り返す。
【００８４】
好結果のＰＣＲ増幅のために、各プライマーが二本鎖配列に沿ってハイブリダイズする位置が、一方のプライマーから合成される伸長生成物がその鋳型（相補鎖）から分離された時に他方のプライマーの伸長のための鋳型として働くような位置であるように、プライマーは設計される。
ＰＣＲにおけるプライマーの鋳型依存性伸長は、適当な塩、金属カチオンおよびｐＨ緩衝系から成る反応媒質中で適当量の４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ， ｄＧＴＰ， ｄＣＴＰ， およびｄＴＴＰ）の存在下で重合剤によって触媒される。
【００８５】
この増幅方法は、既知配列の多量の特定核酸配列を生産するのに有用なだけでなく、存在することは知られているが完全に特定されていない核酸配列を生産するのにも有用である。一方のプライマーから合成される伸長生成物がその鋳型（相補鎖）から分離された時に、限定された長さの核酸配列への他方のプライマーの伸長のための鋳型として働くことができるような該配列に沿った相対位置のところで所望の配列の別の鎖にハイブリダイズするであろう２つのオリゴヌクレオチドプライマーを調製することができるように、該配列の両端のところの十分な数の塩基のみを十分詳細に知る必要がある。該配列の両端のところの塩基についての知識が増えれば増えるほど、標的核酸配列のためのプライマーの特異性や方法の有効性も高まり得る。
【００８６】
精製された形または未精製の形でのどんな核酸配列も、それが所望の特定の核酸配列を含むかまたは含む疑いのあることを前提として、出発核酸として使用することができる。該方法は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ（伝令ＲＮＡを含む）を使用することができ、このＤＮＡまたはＲＮＡは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
【００８７】
例えば、鋳型がＲＮＡならば、ＲＮＡを相補的コピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列に変換する適当な重合剤は、逆転写酵素（ＲＴ）、例えばトリ骨髄芽球症ウイルスＲＴ、およびＨｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．により発見および製造されそしてＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから市販されている逆転写酵素活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるテルムス・テルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＣＴ特許公報ＷＯ ９１／０９９５０ を参照のこと）である。
【００８８】
核酸が一本鎖であるにせよ二本鎖であるにせよ、ピロジクチウム由来のＤＮＡポリメラーゼは変性段階においてあるいは温度がハイブリダイゼーションを促進する範囲内にあるかまたはそれに下げられつつある時に添加することができる。ピロジクチウムポリメラーゼの耐熱性は該ポリメラーゼを何時でも反応混合物に添加できるようにするけれども、反応混合物が緊縮ハイブリダイゼーション温度よりも低く冷却されないだろう時点で該ポリメラーゼを反応混合物中に添加することにより、非特異的増幅を実質的に阻止することができる。
【００８９】
ハイブリダイゼーション後、反応混合物は、酵素活性が促進または最適化されるような温度、すなわちハイブリダイズしたプライマーと鋳型からのプライマー伸長生成物の合成を促進する酵素活性を増加させるのに十分な温度に加熱または維持される。その温度は実際に各々の核酸鋳型に相補的である各プライマーの伸長生成物を合成するのに十分でなければならないが、それの相補的鋳型からの各伸長生成物を変性せしめるほど高くてはならない（即ち温度は通常約８０〜９０℃未満である）。
【００９０】
使用する核酸に依存して、この合成反応に有効な典型的な温度は、一般に約４０〜８０℃、好ましくは５０〜７５℃の範囲である。Ｐ．オクルタムおよびＰ．アビシィＤＮＡポリメラーゼ酵素については温度は約６５〜７５℃がより好ましい。この合成に必要とされる時間は、温度、核酸の長さおよび酵素に依存して約０．５ 〜４０分またはそれ以上に及ぶことができる。伸長時間は通常約３０秒〜３分である。核酸が長ければ、より長い時間が相補鎖の合成に必要である。
【００９１】
当業者らは、ＰＣＲ法が最も普通には耐熱性酵素を使った自動化法として実施されることを知っているだろう。この方法では、変性領域、プライマーアニーリング領域および反応領域を通して反応混合物の温度が循環される。耐熱性酵素の使用に合わせて特別に改造された機械が Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ 社から市販されている。当業者はまた、前の反応からの増幅された核酸によるＰＣＲの汚染の問題も知っているだろう。この問題を減少させる方法は米国特許出願第６０９，１５７ 号（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に与えられている。
【００９２】
ＰＣＲ増幅は、末端どうし結合した幾つかのプライマー分子の配列を含有する二本鎖副産物であるプライマー二量体またはオリゴマーを生成し得る。その収量は増幅された標的配列の収量に反比例する。熱循環の欠損下でそして標的ＤＮＡの存在下または非存在下で周囲温度および周囲温度下であっても、ＰＣＲ試薬の全部を混合すると常に、非特異的プライミングとプライマー二量体およびオリゴマー形成が起こり得る。
【００９３】
例えば、Ｔａｑ ポリメラーゼは最適温度が約７５〜８０℃であるけれども、３７℃では約１〜２％活性を保持している。非特異的伸長およびプライマー二量体形成を克服する方法としては、最初の増幅サイクルの前に全試薬が一緒にされないような形で、少なくとも１つの試薬を他のものから分離することが挙げられる。ＰＣＴ特許公報第ＷＯ ９１／１２３４２ 号（これは参考として本明細書中に組み込まれる）は、非特異的伸長とプライマー二量体を最少にするための方法および組成物を記載している。
【００９４】
ピロジクチウム種の極端に高い最適増殖温度のため、本発明は非特異的プライマー伸長を最少にするのに有用であろう組成物を提供する。詳しくは、ピロジクチウム・オクルタム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ）とＰ．アビシィ（Ｐ． ａｂｙｓｓｉ）の最適増殖温度は１００ 〜１０５ ℃であり、これは例えばテルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）よりも約３０〜３５℃高い。従って、室温でのピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼの残余活性は最少であると予想され、ＰＣＲの第一サイクルより前に少なくとも１つの試薬を分離する必要性を取り除くことができる。よって、本発明は、ワックスバリヤーや他の試薬分離手段を使用せずにＰＣＲにおける非緊縮アニーリング温度での非特異的伸長を減少させる可能性を提供する。
【００９５】
当業者は、本発明が、ＤＮＡポリメラーゼ活性が効用を有する任意の方法の実施のための新規組成物を提供することを認識するだろう。好ましい態様では、該酵素はＰＣＲによる核酸配列の増幅に有用である。他の増幅方法、特にＰＬＣＲ（Ｂａｒａｎｙ， １９９１， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １ （１）：５−１３）またはギャップ−ＬＣＲ（例えば１９９０年２月８日に発行されたＰＣＴ特許公報第ＷＯ ９０／０１０６９ 号を参照のこと）のような熱変性段階を必要とするものが本発明から役立つだろう。３′−５′エキソヌクレアーゼ欠損 ＰａｂおよびＰｏｃ ＤＮＡポリメラーゼ酵素から循環配列決定法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ら， １９８９， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：４９４−４９９ 、およびＫｏｏｐら， １９９２， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：４４２−４４７；これらは参考として本明細書中に組み込まれる）が特に有益であろう。
【００９６】
本発明は、本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含んで成るキットも提供し、好ましくは、１または複数の非イオン性高分子界面活性剤、および所望によりＰＣＲ反応を実施するのに有用な他の試薬、例えば一組のプライマー、プローブまたはヌクレオシド三リン酸前駆体を含有する緩衝液中に前記ポリメラーゼを含んで成る安定な酵素組成物も提供する。
【００９７】
ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応による核酸配列の増幅が有用である多様な方法を実施する際に非常に有用である。そのような方法としては、クローニング、ＤＮＡ配列決定、逆転写および非対称ＰＣＲが挙げられる。更に、本発明の酵素は、診断、法医学および調査用途での使用に適当である。次の例は例示のために与えるのであって本発明の特許請求の範囲を限定するためではない。
【００９８】
実施例１：ピロジクチウム・アビシィＤＮＡライブラリーの作製およびコロニーブロット耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイによる Ｐａｂ ポリメラーゼ遺伝子の同定
ピロジクチウム・アビシィ（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ａｂｙｓｓｉ）細胞はＤｒ． Ｋａｒｌ Ｏ． Ｓｔｅｔｔｅｒ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ， Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ から拝領した。単離物 ＡＶＺ （ＤＳＭ６１５８）は、Ｐｌｅｙら， １９９１， Ｓｙｓｔｅｍ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４：２４５−２５３（これは参考として本明細書中に組み込まれる）中に記載されている。
【００９９】
Ｌａｗｙｅｒら， １９８９， Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６４ （１１）：６４２７−６４３７（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に記載された方法によりＤＮＡを精製した。約２５μｇ のピロジクチウム・アビシィＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化し、ゲル電気泳動によりサイズ分画した。３．５ ｋｂよりも大きく且つ８．５ ｋｂより小さい断片 １０ ｎｇを、ｐＵＣ１９ ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ ）のＢａｍＨＩ 部位中へのクローニングに使用した。
【０１００】
ｐＵＣ１９ プラスミドベクターはＢａｍＨＩ クローニング部位の上流にｌａｃ プロモーターを有する。該プロモーターは、プロモーター配列を欠くクローン化された転写解読枠の異種発現を誘導することができる。組換えプラスミドをＥ．コリ ＳＵＲＥ 細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に形質転換せしめた。ＳＵＲＥＲ 細胞の遺伝子型はｍｃｒＡ， Δ（ｍｃｒＢＣ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｒｒ）１７１， ｅｎｄＡ１， ｓｕｐＥ４４， ｔｈｉ−１，λ−， ｇｙｒＡ９６， ｒｅｌＡ１， ｌａｃ， ｒｅｃＢ， ｒｅｃＪ， ｓｂｃＣ， ｕｍｕＣ：：Ｔｎ５（ｋａｎＲ ）， ｕｒｖＣ，（Ｆ’， ｐｒｏＡＢ， ｌａｃｌＺΔＭ１５， Ｔｎ１０〔ｔｅｔ Ｒ 〕）である。
【０１０１】
耐熱性および高温性ＤＮＡポリメラーゼ活性の検出用の迅速なフィルターアッセイを使ってピロジクチウム・アビシィゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングした（Ｓａｎｇｅｒら， １９９１， Ｇｅｎｅ ９７：１１９−１２３；これは参考として本明細書中に組み込まれる）。この方法に従って、組換えコロニーをニトロセルロース膜に結合し、そしてα〔３２Ｐ〕標識ｄＮＴＰｓ を含む重合緩衝液中で高温においてインキュベーションする。
【０１０２】
乾燥したフィルターのオートラジオグラフィーにより、高温性ＤＮＡポリメラーゼ活性を発現するコロニーを直接同定することができる。膜に結合させたコロニーを９５℃に加熱して宿主ＤＮＡポリメラーゼを不可逆的に不活性化し、次いで高温でインキュベートして高温性ＤＮＡポリメラーゼ活性の存在を明らかにする。
【０１０３】
ペトリ皿あたり約５００ コロニーを塗抹し、３７℃で一晩増殖させた。続いて、コロニーをニトロセルロース膜上にレプリカ塗抹し、４時間増殖させた。ニトロセルロース膜の上側を下にしてアガロースプレート上に置き、それをクロロホルム／トルエン（１：１）混合物に浸した濾紙上に室温で２０分間置いた。次いで、透過したコロニーを含有する膜を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．８， ７ｍＭ ＭｇＣｌ２， ３ｍＭ β−メルカプトエタノール（βＭｅ）を含有する重合緩衝液中で９５℃にて５分間インキュベートして非耐熱性（例えばＥ．コリ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を不活性化した。
【０１０４】
不活性化の直後に、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．８， ７ｍＭ ＭｇＣｌ２， ３ｍＭ βＭｅ， １２μＭ ｄＣＴＰ， １２μＭ ｄＧＴＰ， １２μＭ ｄＡＴＰ， １２μＭ ｄＴＴＰおよび１μＣｉ／ｍｌ のα〔３２Ｐ〕−ｄＧＴＰを含有する重合緩衝液に膜を移した。６５℃で３０分間のインキュベーション後、膜を５％（ｗ／ｖ） ＴＣＡ と１％（ｗ／ｖ） ピロリン酸塩の溶液中で５分間に渡り２回洗浄し、取り込まれなかったα〔３２Ｐ〕−ｄＧＴＰを除去した。−７０℃でのオートラジオグラフィーにより膜を分析した。３日後、複製した膜のＸ線フィルム上に７つのクローンが現れた。
【０１０５】
それらの７つのクローンからプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析を行って挿入断片のサイズとｐＵＣ１９ ベクターに関する挿入断片の方向性を決定した。最大のクローンｐＰａｂ１４に関してＤＮＡ配列分析を行った。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡから購入した正および逆配列決定用「万能」プライマーそれぞれＮｏ． １２１２および１２３３を使って予備ＤＮＡ配列を得た。予備ＤＮＡ配列から更なる配列決定用プライマーを設計し、クローン化挿入断片の一層内部の領域のＤＮＡ配列を得た。両方の鎖についてＤＮＡ配列分析を実施した。
【０１０６】
実施例２：Ｐａｂ ポリメラーゼ遺伝子の発現
プラスミドｐＤＧ１６８は、λＰＬ プロモーターおよびＮ遺伝子リボソーム結合部位（米国特許第 ４，７１１，８４５号を参照のこと；これは参考として本明細書中に組み込まれる）、ポリリンカー中にクローニングされる配列がλＰＬ −ＮＲＢＳ の調節下で発現され得るように配置された制限部位ポリリンカー、並びにバシラス・スリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）デルタ毒素遺伝子からの転写ターミネーター（米国特許第 ４，６６６，８４８号を参照のこと；これは参考として本明細書中に組み込まれる）を含んで成る、λＰＬ クローニングおよび発現ベクターである。
【０１０７】
プラスミドｐＤＧ１６８は、プラスミドをコピー数に対して温度感受性にする変異ＲＮＡＩＩ遺伝子（米国特許第 ４，６３１，２５７号を参照のこと；これは参考として本明細書中に組み込まれる）およびＥ．コリ Ｋ１２株ＤＧ１１６ 中のアンピシリン耐性遺伝子も担持している。ｐＤＧ１６８の作製は、１９９１年７月１１日に発行されたＰＣＴ特許公報第ＷＯ ９１／０９９５０ 号の実施例６に記載されており、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【０１０８】
それらの要素が協力して働き、有用且つ強力な発現ベクターを提供する。３０〜３２℃では、プラスミドのコピー数は小さく、温度感受性λリプレッサー遺伝子を有する宿主細胞、例えばｃＩ８５７ 中で、ＰＬ プロモーターは機能しない。しかしながら３７〜４１℃では、プラスミドのコピー数は３０〜３２℃の時の２５〜５０倍高く、ｃＩ８５７ リプレッサーが不活性化されてプロモーターが機能できるようになる。よって、Ｐａｂ ＤＮＡポリメラーゼ用の発現ベクターを作製するのにｐＤＧ１６８を選んだ。
【０１０９】
ｐＰａｂ１４のＤＮＡ配列分析は、ヌクレオチド位置８６９ にＡＴＧコドンを有しそしてヌクレオチド位置３２８０にＴＧＡ終結コドンを有する８０３ アミノ酸の転写解読枠を明らかにした。オリゴヌクレオチドプライマー ＡＷ３９７（配列番号５）と ＡＷ３９８（配列番号６）を用いたＰＣＲ増幅によりＰａｂ 遺伝子の５′末端を変異誘発せしめた（後述する）。
【０１１０】
ＡＷ３９７（配列番号５）は、ＡＴＧ出発コドンのところでＰａｂ ＤＮＡ配列を変更せしめてＮｄｅＩ制限部位を導入するように設計された正プライマーである。プライマー ＡＷ３９７（配列番号５）はまた、Ｐａｂ ポリメラーゼ遺伝子配列の第５および６コドン中に変異を導入し、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を変えることなくＥ．コリによるコドン用法とより一層適合できるようにする。逆プライマー ＡＷ３９８（配列番号６）は、アミノ酸位置１７４ に相当するＳｐｅＩ部位を導入するために選択した。その上、ＳｐｅＩ部位の後ろにＫｐｎＩ部位が導入された。
【０１１１】
ＰＣＲ反応混合物は、５０μｌ の反応容量中に、鋳型としてのＳａｌＩで直鎖状にしたｐＰａｂ１４ ＤＮＡ １０ ｎｇ；１０ピコモルのプライマー ＡＷ３９７（配列番号５）および ＡＷ３９８（配列番号６）；各々５０μＭ のｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ；２ ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．３ ；５０ｍＭ ＫＣｌ並びに１単位のＴａｑ ポリメラーゼを含有した。反応温度プロフィールは９５℃で３０秒；６５℃で３０秒および７２℃で３０秒であり、１２サイクルに渡り増幅せしめた。
【０１１２】
５００ ｂｐの増幅生成物をＮｄｅＩとＫｐｎＩで消化し、１％（ｗ／ｖ）Ｓｅａｋｅｍ アガロースゲル上に負荷した。ＧｅｎｅＣｌｅａｎ キット（Ｂｉｏ １０１， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を使ってＰＣＲ生成物断片を精製し、そしてＮｄｅＩとＫｐｎＩで消化しておいた発現ベクターｐＤＧ１６８中にサブクローニングした。得られたクローンをｐＡＷ１１１と命名した。制限酵素分析とＤＮＡ配列分析により所望の変異を確認した。
【０１１３】
Ｐａｂ ポリメラーゼ遺伝子の３′末端を制限酵素消化と合成オリゴヌクレオチド二本鎖の使用により変更した。アミノ酸位置７８５ 〜７８６ のＡｆｌＩＩ 部位からのＰａｂ ポリメラーゼ（ｐｏｌ） 遺伝子の３′末端に従って ＡＷ３９９（配列番号７）を設計した。それは同じくＴＧＡ終結コドンをＴＡＡに変更する。 ＡＷ４００（配列番号８）は、それの５′末端にＸｍａＩ粘着末端を有すること以外は ＡＷ３９９（配列番号７）の相補鎖である。 ＡＷ３９９（配列番号７）が ＡＷ４００（配列番号８）にアニールすると、粘着ＡｆｌＩＩ／ＸｍａＩ末端を有する６０ ｂｐ の合成二本鎖を生じる。次いでこの二本鎖を、ＡｆｌＩＩ とＸｍａＩで消化されたプラスミドｐＰａｂ２ 中にクローニングした。得られたプラスミドをｐＡＷ１１３と命名した。
【０１１４】
プラスミドＰａｂ２は、実施例１に記載したようなゲノムライブラリーから単離された７つのクローンのうちの１つであった。プラスミドＰａｂ２は完全なＰａｂ ｐｏｌ 遺伝子を含むが、その５′末端がＰａｂ１４ よりも〜２５０ ｂｐ短い。すなわち、それは隣接する５′末端の ＡｆｌＩＩ部位を欠いており、上述したような３′末端の ＡｆｌＩＩ−ＸｍａＩ断片を合成二本鎖 ＡＷ３９９（配列番号７）／ ＡＷ４００（配列番号８）で置換するクローニング方策を容易にした。置換された断片のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列分析によって確認した。
【０１１５】
最後に、Ｐａｂ ポリメラーゼ遺伝子領域のＳｐｅＩから終結コドンまでの１．８９ ｋｂ 断片を、ＳｐｅＩとＸｍａＩでの消化によりｐＡＷ１１３から単離し、そしてゲル電気泳動により精製した。得られた断片を、ＳｐｅＩとＸｍａＩで消化しておいたプラスミドｐＡＷ１１１と連結せしめた。
【０１１６】
連結条件は、２０μｌ の反応液あたり２０μｇ／ｍｌのＤＮＡ， ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ７．４， ５０ｍＭ ＮａＣｌ， １０ｍＭ ＭｇＣｌ２， ４０μＭ ＡＴＰ および０．２ Ｗｅｉｓｓ 単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ、１６℃で一晩であった。連結生成物をＤＧ１１６ 宿主細胞中に形質転換せしめた。候補物を適当な制限酵素部位についてスクリーニングした。所望のプラスミドをｐＡＷ１１５と命名した。
【０１１７】
この実施例において使用するオリゴヌクレオチドを下記に示す。
【０１１８】
実施例３：ピロジクチウム・オクルタム （Ｐｏｃ） ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニング
Ｐａｂ およびＰｏｃ ゲノムＤＮＡ（各０．５ μｇ ）をＨｉｎｄＩＩＩ で消化し、そして０．８ ％（ｗ／ｖ） アガロースゲルを通したゲル電気泳動により分離した。ピロジクチウム・オクルタム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ）細胞は、Ｄｒ． Ｋａｒｌ Ｏ． Ｓｔｅｔｔｅｒ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ， Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ から拝領した。Ｌａｗｙｅｒら， １９８９， Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６４ （１１）：６４２７−６４３７（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に記載された方法によりＤＮＡを精製した。
【０１１９】
ゲル中のＤＮＡ断片を１．５Ｍ ＮａＣｌ および０．５Ｍ ＮａＯＨ 溶液中で３０分間変性せしめ、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．０ および１．５Ｍ ＮａＣｌ の溶液中で３０分間中和し、そして２０×ＳＳＰＥ（３．６Ｍ ＮａＣｌ， ２００ｍＭ ＮａＰＯ４／ｐＨ ７．４， ２０ｍＭ ＥＤＴＡ／ｐＨ ７．４ ）を使ってＢｉｏｄｙｎｅ ナイロン膜（Ｐａｌｌ Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔ， Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ， ＮＹ ）に移行せしめた。次いで膜に結合したＤＮＡを、Ｐａｂ ポリメラーゼ遺伝子のアミノ酸 ５１５〜６１４ をコードする３２Ｐ−標識された２４０ ｂｐのＰＣＲ生成物にハイブリダイズせしめた。
【０１２０】
予備ハイブリダイゼーション溶液は、６×ＳＳＰＥ、５×デンハーツ試薬、０．５ ％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ、１００ μｇ／ｍｌの変性され尖断されたサケ精子ＤＮＡであった。ハイブリダイゼーション溶液は、２×デンハーツ試薬を使用し、そして１０６ ｃｐｍ の３２Ｐ−標識されＰＣＲ増幅されたプローブを含むこと以外は同じであった。予備ハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションは両方とも５５℃で行われた。ブロットを次の通りに順次洗浄した：２×ＳＳＰＥ， ０．５ ％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ 中で室温にて１０分間；２×ＳＳＰＥ， ０．１ ％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ 中で室温にて１５分間；０．１ ％（ｗ／ｖ） ＳＳＰＥ， ０．１ ％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ 中で室温にて５分間。
【０１２１】
ＨｉｎｄＩＩＩ 消化物において約３．８ ｋｂのところに強いシグナルが検出された。これは、Ｐｏｃ ポリメラーゼ遺伝子がＰａｂ ポリメラーゼ遺伝子と相同性を有することを示唆した。従って、Ｐａｂ ポリメラーゼ遺伝子配列から設計した幾つかのＰＣＲプライマーを、Ｐｏｃ ポリメラーゼ遺伝子の一部分の増幅について評価した。プライマー対 ＬＳ４１７（配列番号３４）と ＬＳ３９６（配列番号３５）を使ったＰＣＲから、サイズが２９５ ｂｐの特定のＰＣＲ生成物が得られた。
【０１２２】
ＰＣＲは、５０μｌ の総容量中、１×ＰＣＲ緩衝液、５０μＭ のｄＮＴＰｓ 、０．１ μＭ の各プライマー、１．２５単位のＴａｑ の最終濃度において実施された。１×ＰＣＲ緩衝液は２０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ８．４， ５０ｍＭ ＫＣｌ， ２ｍＭ ＭｇＣｌ２を含んだ。反応液を３５サイクルに渡り増幅させた。
【０１２３】
次いで２９５ ｂｐのＰＣＲ生成物をＤＮＡ配列分析にかけた。該ＤＮＡ配列は、Ｐｏｃ ポリメラーゼ遺伝子がこの領域内でＰａｂ ポリメラーゼ遺伝子と７８％の一致を有することを示した。このＤＮＡ配列データを使って、Ｐｏｃ ポリメラーゼ特異的オリゴヌクレオチドプローブ ＡＷ３９４（配列番号９）を設計した。３２Ｐ−標識した ＡＷ３９４（配列番号９）を使ってゲノムＰｏｃ ＤＮＡバンクをスクリーニングし、Ｐｏｃ ポリメラーゼクローンを得た。ゲノムＰｏｃ ＤＮＡバンクの作製は、ゲノムＰａｂ ＤＮＡバンクについて実施例１に記載した通りであった。
【０１２４】
ニトロセルロースフィルター上で約５５，０００個のアンピシリン耐性コロニーを選択し、３２Ｐ−標識した ＡＷ３９４（配列番号９）とハイブリダイズせしめた。該プローブとハイブリダイズした６つのコロニーからプラスミドＤＮＡを単離した。予備ハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーション条件は上述した通りであった。洗浄条件は６×ＳＳＰＥ， ０．５ ％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ 中で室温にて５分間に続き、２×ＳＳＰＥ， ０．１ ％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ 中で５５℃にて１５分間であった。制限酵素分析とＰＣＲ分析を行い、挿入断片のサイズおよびｐＵＣ１９ ベクターに関する方向性を決定した。その結果、ｐＰｏｃ３ とｐＰｏｃ５ が同一クローンであることがわかった。同定された全てのＰｏｃ ポリメラーゼクローンのコード領域、５′末端非翻訳領域および３′末端非翻訳領域のサイズを下記に列挙する。
【０１２５】
【０１２６】
ｐＰｏｃ４ に関してＤＮＡ配列分析を行った。万能プライマーと逆配列決定用プライマーを使って予備ＤＮＡ配列情報を得た。このＤＮＡ配列から追加の配列決定用プライマーを設計し、挿入断片の一層内部の領域のＤＮＡ配列を得た。ＤＮＡ配列分析は両方の鎖について行った。
【０１２７】
実施例４：Ｐｏｃ ポリメラーゼ遺伝子の発現
オリゴヌクレオチドプライマー ＡＷ４０８（配列番号１０）とＡＷ４０９Ａ（配列番号１１）を用いてＰＣＲ増幅によりプラスミドｐＰｏｃ４ 中のＰｏｃ ポリメラーゼ遺伝子の５′末端を変異誘発せしめた。 ＡＷ４０８（配列番号１０）は、ＡＴＧ開始コドンのところでＰｏｃ 遺伝子のＤＮＡ配列を変更せしめてＮｓｉＩ制限部位を導入するように設計された正プライマーである。
【０１２８】
プライマー ＡＷ４０８（配列番号１０）はまた、Ｐｏｃ 遺伝子の第２，３，５および６コドン中に変異を導入し、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を変えることなくＥ．コリのコドン用法とより一層適合できる配列を提供するように設計された。逆プライマーＡＷ４０９Ａ（配列番号１１）は、アミノ酸位置３８にＸｂａＩ部位を導入するために選択した。その上、その後のサブクローニングのためにＸｂａＩ部位の後ろにＫｐｎＩ部位が導入された。
【０１２９】
ＫｐｎＩで直鎖状にしたプラスミドｐＰｏｃ４ を、 ＡＷ４０８（配列番号１０）／ＡＷ４０９Ａ（配列番号１１）プライマー対を使った増幅のためのＰＣＲ鋳型として使用し、１３８ ｂｐのＰＣＲ生成物を得た。ＰＣＲ増幅手順は実施例２において上述した通りであった。増幅された断片をＮｓｉＩで消化し、次いでクレノウで処理してＮｓｉＩ切断末端を平滑末端にし、そして最後にＫｐｎＩで消化した。
【０１３０】
生じた断片を、ＮｄｅＩで消化した後クレノウで修復して突出末端をフルインして連結用の平滑末端を提供した発現ベクターｐＤＧ１６４（ＰＣＴ特許公報第ＷＯ ９１／０９９５０ 号の実施例６ｂに詳細に記載されており、これは参考として本明細書中に組み込まれる）と連結せしめた。この連結は、λＰＬ プロモーターとバクテリオファージＴ７ 遺伝子１０リボソーム結合部位の調節下にＰｏｃ ポリメラーゼ遺伝子の５′末端のフレーム内コード配列を与えた。得られた構成物をｐＡＷ１１８と命名した。
【０１３１】
Ｐｏｃ ポリメラーゼ遺伝子の３′末端のサブクローニングを行うために、終結コドンの後ろにＫｐｎＩ部位を導入した。これは次のようなＰＣＲ法によって行われた。アミノ酸位置６９８−６９９ にＥｓｐＩ部位を導入する正プライマーを選択し、変更された終結コドン（ＴＡＡ）の直後にＫｐｎＩ部位を組み込むように逆プライマーを設計した。増幅された３３５ ｂｐ断片をＥｓｐＩとＫｐｎＩで消化し、ＥｓｐＩとＫｐｎＩで消化されたプラスミドｐＰｏｃ４ 中にクローニングした。得られた構成物をｐＡＷ１２０と命名した。
【０１３２】
最後に、Ｐｏｃ Ｐｏｌ 遺伝子領域ＸｂａＩから終結コドンまでをＸｂａＩとＫｐｎＩでの消化によりｐＡＷ１２０から単離した。得られた２．３ ｋｂ断片を、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化しておいたｐＡＷ１１８と連結せしめた。この連結生成物を発現用のＤＧ１１６ 宿主細胞中に形質転換せしめ、所望のプラスミドをｐＡＷ１２１と命名した。
【０１３３】
この実施例において使用するオリゴヌクレオチドを下記に示す。
【０１３４】
実施例５：トリプトファンプロモーターベクター中での Ｐａｂ ｐｏｌ 遺伝子と Ｐｏｃ ｐｏｌ 遺伝子の発現
Ｐａｂ ｐｏｌ 遺伝子とＰｏｃ ｐｏｌ 遺伝子は、Ｅ．コリのＴｒｐ プロモーターの調節下で過剰発現せしめることができる。発現クローンの作製は次のようにして行った：発現クローンｐＡＷ１１５中のλＰＬ プロモーターを、鋳型としてプラスミドｐＬＳＧ１０（プラスミドｐＬＳＧ１０は米国特許第 ５，０７９，３５２号に記載されており、それは参考として本明細書中に組み込まれる）を使いそしてプライマーとして ＡＷ５００（配列番号１４）と ＡＷ５０１（配列番号１５）を使ったＰＣＲ増幅により生成されたＴｒｐ プロモーターにより置換した。得られたＰＣＲ生成物をＮｓｐＶとＮｄｅＩで消化し、そしてＮｓｐＶとＮｄｅＩで消化されたｐＡＷ１１５中にクローニングし、Ｅ．コリ Ｔｒｐプロモーターの調節下にあるＰａｂ ｐｏｌ 発現クローン ｐＡＷ１１８ を生ぜしめた。
【０１３５】
ｐＡＷ１２１のＰｏｃ ｐｏｌ 遺伝子中の内部ＮｄｅＩ部位は、ＮｓｐＶ−ＮｄｅＩλＰＬ プロモーター断片とＴｒｐ プロモーター断片との交換を複雑にする。従って、ｐＬＳＧ１０からのＴｒｐ プロモーター配列断片の増幅用にプライマー ＡＷ５００（配列番号１４）と ＡＷ５０２（配列番号１６）を設計し、ｐＡＷ１２１からの５′末端の１１０ ｂｐのＮｄｅＩ−ＸｂａＩ断片の増幅用にプライマー ＡＷ５０３（配列番号１７）と ＡＷ５０４（配列番号１８）を設計した。
【０１３６】
ＡＷ５０２（配列番号１６）と ＡＷ５０３（配列番号１７）は９ヌクレオチドが重複している。重複発現ＰＣＲを使って、Ｔｒｐ プロモーター断片と５′末端 １１０ ｂｐ 断片を融合せしめた。得られたＰＣＲ生成物をＮｓｐＶとＸｂａＩで消化し、そしてＮｓｐＶとＸｂａＩで消化しておいたｐＡＷ１２１中にクローニングした。得られたＰｏｃ ｐｏｌ 発現クローンをｐＡＷ１２３と命名した。
【０１３７】
【０１３８】
実施例６：３′→５′エキソヌクレアーゼ活性の評価：忠実度アッセイ
ＰＣＲ法により提供される増幅レベルが非常に高いため（１０１１〜 ６×１０１２倍まで）、或る用途には複製の正確度（忠実度）が重要である。ＰＣＲ忠実度は次の２段階過程に基づいている：誤挿入および誤伸長。ＤＮＡポリメラーゼが正しくない塩基を挿入しそして生じた３′−不適正末端が伸長されなければ、下流のプライマー結合部位が存在しないので、この先端が切り取られた伸長生成物を増幅せしめることができない。
【０１３９】
ＤＮＡポリメラーゼは適正３′末端よりも遅く不適正３′末端を伸長する。更に、異なる不適正組合せは異なる速度で広がる。Ｋｗｏｋら， １９９０， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：９９９−１００５ 、およびＨｕａｎｇ ら， １９９２， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：４５６７−４５７３を参照のこと。
生来の３′→５′エキソヌクレアーゼ活性またはプルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、誤挿入された塩基を伸長前に除去することにより忠実度を改善することができる。誤伸長の前に３′末端不適正ヌクレオチドを除去する３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの能力を評価するために、便利なＰＣＲおよび制限エンドヌクレアーゼ消化アッセイを開発した。
【０１４０】
テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（Ｌａｗｙｅｒら， １９８９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：６４２７−６４３７ および米国特許第 ５，０７９，３５２号）中のＢａｍＨＩ 制限酵素認識配列の最初のヌクレオチドに完全に適合するかまたは３′が不適合である（可能な限りの組合せを有する）数個のプライマーを設計した。完全適合プライマー ＦＲ４３４（配列番号２９）と ＦＲ４３８（配列番号３３）は、ＢａｍＨＩ 制限酵素で完全消化すると１３２ ｂｐと１９ ｂｐ のＤＮＡ断片を生じる１５１ ｂｐ生成物を増幅する。正プライマー ＦＲ４３４（配列番号２９）の３′末端ヌクレオチドは、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド１７７８に相当する。
【０１４１】
正プライマー ＦＲ４３５（配列番号３０）、 ＦＲ４３６（配列番号３１）および ＦＲ４３７（配列番号３２）は、野生型Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌ遺伝子と野生型プライマー ＦＲ４３８（配列番号３３）伸長生成物に関して、それぞれＡ：Ｃ，Ｔ：ＣおよびＣ：Ｃに相当する単一の３′末端不適正組合せを含む。プライマー ＦＲ４３５（配列番号３０）、 ＦＲ４３６（配列番号３１）および ＦＲ４３７（配列番号３２）からの不正確または誤伸長は、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド１７７８−１７８３ に相当するＢａｍＨＩ 認識部位を除去する。あるいは、エキソヌクレオチド分解的プルーフリーディングは３′末端の不適正ヌクレオチドを除去し、そして正しいｄＧ残基の取り込みを可能にし、診断用ＢａｍＨＩ 制限酵素部位を含むようになったＰＣＲ生成物の蓄積をもたらす。
【０１４２】
ＦＲ４３５（配列番号３０）、 ＦＲ４３６（配列番号３１）および ＦＲ４３７（配列番号３２）プライマーは全てがもとの標的に対して不適合であるため、このＰＣＲ／エンドヌクレアーゼ消化アッセイは、「変異体」プライマーを補正しそして診断用ＢａｍＨＩ 開裂部位を含むＰＣＲ生成物を生ぜしめるためにサイクル毎にエキソヌクレオチド分解的プルーフリーディングを必要とする。いずれかのサイクルにおける誤伸長は、次のサイクルにおいて、アッセイに使用するプライマー全てに完全に適合する（プライマー ＦＲ４３８〔配列番号３３〕伸長から）効率的にコピーされた（変異体）鋳型を生じるだろう。
【０１４３】
【０１４４】
プライマー ＦＲ４３４（配列番号２９）はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１７６０〜１７７８に全く同一であり、そしてプライマー ＦＲ４３８（配列番号３３）はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８９１〜１９１０に相補的である。プライマー ＦＲ４３５（配列番号３０）、 ＦＲ４３６（配列番号３１）および ＦＲ４３７（配列番号３２）はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１７６０〜１７７７に全く同一であり、そして１７７８位に（＊，下線によって）指摘した３′末端不適正ヌクレオチドを含有する。
【０１４５】
組換えＰａｂ およびＰｏｃ ＤＮＡポリメラーゼは、それぞれプラスミドｐＡＷ１１５またはｐＡＷ１２１を含むＥ．コリ Ｋ１２のＤＧ１１６ 株から精製した。この精製は、実施例９に従って、細胞溶解、７５〜８５℃での加熱処理、大量核酸のポリミンＰ沈澱、フェニルセファロースクロマトグラフィーおよびヘパリンセファロースクロマトグラフィーを伴った。
【０１４６】
この忠実度アッセイを使って、野生型組換えＰａｂ およびＰｏｃ ＤＮＡポリメラーゼは不適正プライマー ＦＲ４３５（配列番号３０）、 ＦＲ４３６（配列番号３１）および ＦＲ４３７（配列番号３２）を補正し、必要なＢａｍＨＩ 開裂部位を含有するＰＣＲ生成物を生ぜしめることができる。これは３′→５′エキソヌクレオチド分解的プルーフリーディング活性の存在を証明する。
【０１４７】
実施例７：Ｐａｂ ｐｏｌ および Ｐｏｃ ｐｏｌ の３′→５′エキソヌクレアーゼ変異体の製造
Ａｓｐ１８７とＧｌｕ１８９のコドンをアラニンコドンに変更するのに重複伸長ＰＣＲによる部位特異的突然変異誘発を使って、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を欠くＰａｂ およびＰｏｃ ｐｏｌ 遺伝子を作製した。簡単に言えば、重複伸長ＰＣＲによる突然変異誘発は、独立的ＰＣＲ反応に相補的オリゴプライマーを含めることによる、ＤＮＡ断片の作製を含む（この方法の詳細な説明については、Ｈｉｇｕｃｈｉ ら， １９８８， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：７３５１−７３６７、およびＨｏら， １９８９， Ｇｅｎｅ ７７：５１−５９を参照のこと；これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１４８】
該方法によれば、それらの断片は、重複末端がアニールする次の「融合」反応において組み合わされ、各鎖の３′重複部分が相補鎖の３′伸長のためのプライマーとして働けるようにする。得られた融合生成物はＰＣＲにより更に増幅される。重複しているオリゴプライマー中にヌクレオチド変異を組み込むことにより、ヌクレオチド配列中に特異的変異を導入することができる。
【０１４９】
Ｐａｂ の３′→５′エキソヌクレアーゼ欠失変異体の作製は次のようにして行った。Ａｓｐ１８７〜Ｇｌｕ１８９に及び、そのＡｓｐ１８７とＧｌｕ１８９の両方がアラニンにより置換されている、重複した２つのプライマー ＡＷ４９３（配列番号２０）と ＡＷ４９４（配列番号２１）を設計した。それぞれアミノ酸位置１７４−１７５ とアミノ酸位置３０４−３０５ のユニークＳｐｅＩとＮｓｉＩ制限部位のところに位置し、かくして融合生成物を発現ベクターにもう一度連結できるようにするために、２つの外部プライマー ＡＷ４９２（配列番号１９）と ＡＷ４９５（配列番号２２）を選択した。
【０１５０】
プライマーセット ＡＷ４９２（配列番号１９）／ ＡＷ４９３（配列番号２０）と ＡＷ４９４（配列番号２１）／ ＡＷ４９５（配列番号２２）はそれぞれ７０ ｂｐ と３７３ ｂｐの断片であった。生じた２断片（２７ヌクレオチドが３′重複している）を、次のプライマー伸長反応での変性とアニーリングによって融合せしめた。４１６ ｂｐの融合生成物を、２つの外部プライマー ＡＷ４９２（配列番号１９）と ＡＷ４９５（配列番号２２）を使ったＰＣＲにより更に増幅せしめた。次いで変異誘発された４１６ ｂｐ断片をＳｐｅＩとＮｓｉＩで切断し、同じくＳｐｅＩとＮｓｉＩで切断された親クローンｐＡＷ１１５中にもう一度連結せしめた。生じた変異体クローンをｐｅｘｏ−Ｐａｂと命名し、所望の変異を配列分析により確認した。
【０１５１】
同様に、同じアプローチを使ってＰｏｃ の３′→５′エキソヌクレアーゼ欠損変異体を作製した。突然変異を導入するのに使った重複プライマーは ＡＷ４８９（配列番号２４）と ＡＷ４９０（配列番号２５）である。２つの外部プライマー ＡＷ４８８（配列番号２３）と ＡＷ４９１（配列番号２６）は、それぞれアミノ酸位置３７−３９ と２６０−２６２ のユニークＸｂａＩおよびＢｓｓＨＩＩ制限部位のところに位置する。
【０１５２】
プライマーセット ＡＷ４８８（配列番号２３）／ ＡＷ４８９（配列番号２４）と ＡＷ４９０（配列番号２５）／ ＡＷ４９１（配列番号２６）を使ったＰＣＲからの生成物は、それぞれ４７６ ｂｐと２４３ ｂｐの断片であった。それらの２断片を融合せしめ、そして外部プライマー ＡＷ４８８（配列番号２３）と ＡＷ４９１（配列番号２６）を使ったＰＣＲ増幅にかけた。次いで変異誘発された断片をＸｂａＩとＢｓｓＨＩＩで切断し、親クローンｐＡＷ１１５中にもう一度連結せしめた。生じた変異体クローンをｐｅｘｏ−Ｐｏｃと命名した。
【０１５３】
不適正組合せ含有プルーフリーディングアッセイを使ってｐｅｘｏ−Ｐａｂ ＤＮＡポリメラーゼとｐｅｘｏ−Ｐｏｃ ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を調べた。その結果は、ｐｅｘｏ−Ｐａｂ ｐｏｌとｐｅｘｏ−Ｐｏｃ ｐｏｌの両方が３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を欠いていることを示した。
【０１５４】
【０１５５】
実施例８：ＰＣＲにおける Ｐａｂ ｐｏｌ ， Ｐｏｃ ｐｏｌ および Ｔａｑ ｐｏｌ の耐熱性の比較
高温菌ピロジクチウム属の増殖温度の上限は１１０ ℃である。精製された組換えＰａｂ ｐｏｌ， Ｐｏｃ ｐｏｌおよびＴａｑ ｐｏｌ のＰＣＲ法における耐熱性を試験するために、次の実験を実施した：０．１ ｐｇ， １ ｐｇおよび１０ ｐｇ のＭ１３ ＤＮＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ ）をＰａｂ， ＰｏｃおよびＴａｑ によるＰＣＲ分析のための鋳型として使用した。反応液を９５℃または１００ ℃の変性温度で２５， ３０， ３５および４０サイクルにかけた。プライマーとしてＢＷ３６（配列番号２７）とＢＷ４２（配列番号２８）を使うことにより、３５０ ｂｐのＰＣＲ生成物を生ぜしめた。
【０１５６】
ＰＣＲは、５０μｌ の総反応容量中で、１×ＰＣＲ緩衝液、５０μＭ のｄＮＴＰｓ 、０．１ μＭ の各プライマー、０．２５単位のＰａｂ または０．１ 単位のＰｏｃ または１．２５単位のＴａｑ の最終濃度において実施した。
【０１５７】
Ｐａｂ ＤＮＡポリメラーゼの１単位とＰｏｃ ＤＮＡポリメラーゼの１単位は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと同様に、７４℃にて３０分間あたり１０ナノモルの全ｄＮＴＰｓ を酸不溶性物質中に組み込むであろう酵素の量として定義される。Ｐｏｃ およびＰａｂ ＤＮＡポリメラーゼは、反応液組成に次のような変化を伴って、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼについて米国特許第 ４，８８９，８１８号（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に記載された通りにアッセイされる。Ｐａｂ ＤＮＡポリメラーゼ：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．３ （２５ ℃）， １００ｍＭ ＫＣｌ， ５ｍＭ ＭｇＣｌ２ 。Ｐｏｃ ＤＮＡポリメラーゼ：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０ （２５ ℃）， １０ｍＭ ＫＣｌ， ５ｍＭ ＭｇＣｌ２。
【０１５８】
Ｐａｂ 用の１×ＰＣＲ緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．４， １００ｍＭ ＫＣｌ， １．５ｍＭ ＭｇＣｌ２ 。Ｐｏｃ 用の１×ＰＣＲ緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．４， １０ｍＭ ＫＣｌ， １．０ｍＭ ＭｇＣｌ２。Ｔａｑ 用の１×ＰＣＲ緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ８．４， ５０ｍＭ ＫＣｌ， １．５ｍＭ ＭｇＣｌ２。増幅プロフィールは、９５℃または１００ ℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のプライマーアニーリングおよび伸長を含む。結果は、Ｐａｂ ｐｏｌ およびＰｏｃ ｐｏｌ は極端に耐熱性であり、１００ ℃までの変性温度を使用するＰＣＲにおいて効率的に機能することを示した。対照的に、Ｔａｑ ｐｏｌ は１００ ℃のそれらの条件下では全く生成物をもたらさなかった。
【０１５９】
実施例９：組換えピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼの精製
組換えピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼは次のようにして精製する。簡単に言えば、細胞を１容のＴＥ緩衝液（１ｍＭ ＤＴＴ を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ７．５，および１．０ｍＭ ＥＤＴＡ）中で解凍し、そしてプロテアーゼ阻害剤（２．４ｍＭ にＰＭＳＦ〔フェニルメチルスルホニルフルオリド〕、１μｇ／ｍｌにロイペプチン、および０．２ｍＭ にＴＬＣＫ〔（−）−１−クロロ−３−トシルアミド−７−アミノ−２−ヘプタノン塩酸塩〕）を添加する。
【０１６０】
細胞を２０，０００ ｐｓｉにてＡｍｉｎｃｏフレンチプレッシャーセル中で溶解せしめ、超音波処理して粘度を低下させる。超音波処理液をＴＥ緩衝液で希釈し、そして湿潤細胞重量の５．５ 倍にプロテアーゼ阻害剤を添加し（画分Ｉ）、０．２Ｍ硫酸アンモニウムに調整し、そして素早く８５℃に加熱して８５℃で１５分間維持する。加熱処理した上清を素早く０℃に冷却し、そして２０，０００×Ｇで３０分間の遠心の後、Ｅ．コリ細胞膜と変性タンパク質を除去する。
【０１６１】
ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼを含有する上清（画分ＩＩ）を保存する。核酸の＞９５％を沈澱せしめるのに必要なポリミンＰのレベルを試行沈澱によって決定する（通常は０．６ 〜１％ ｗ／ｖの範囲）。０℃で３０分間迅速に攪拌しながら所望量のポリミンＰをゆっくり添加し、上清を２０，０００×Ｇで３０分間遠心し、沈澱した核酸を除去する。ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼを含有する上清（画分ＩＩＩ ）を保存する。
【０１６２】
画分ＩＩＩ を０．３ Ｍ硫酸アンモニウムに調整し、そして５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ７．５， ０．３Ｍ 硫酸アンモニウム， １０ｍＭ ＥＤＴＡ および１ｍＭ ＤＴＴ 中で平衡化されているフェニルセファロースカラムに適用する。該カラムを２〜４カラム容積の同緩衝液で洗浄し（Ａ２８０ がベースラインに達するまで）、次いで１〜２カラム容積の５０ｍＭ ＫＣｌ含有ＴＥ緩衝液で洗浄してＥ．コリ汚染タンパク質の大部分を除去する。次いで５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ７．５， ２Ｍ 尿素， ２０％（ｗ／ｖ） エチレングリコール， １０ｍＭ ＥＤＴＡ および１ｍＭ ＤＴＴ を含有する緩衝液を用いてカラムからピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼを溶出せしめ、そしてＤＮＡポリメラーゼ活性を有する画分をプールする（画分ＩＶ）。
【０１６３】
組換えピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼの最終精製は、ヘパリンセファロースクロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、またはＡｆｆｉｇｅｌ ブルークロマトグラフィーを使って達成される。組換えピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼを２．５ ×貯蔵緩衝液〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．０， ２５０ｍＭ ＫＣｌ， ２．５ｍＭ ＤＴＴ， ０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．５％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ−２０〕中に透析し、１．５ 容の無菌８０％（ｗ／ｖ） グリセロールと混合し、そして−２０℃で貯蔵することができる。
【０１６４】
実施例 １０：ピロジクチウム・オクルタムＤＮＡポリメラーゼの耐熱性
ピロジクチウム・オクルタム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ）ＤＮＡポリメラーゼの耐熱性は、様々な時間の長さに渡り１００ ℃でインキュベーションした後で該活性を測定することにより評価した。ＰＣＲ増幅条件を模倣するつもりであるがＤＮＡ合成が起こらないように選択された混合物中で、ＤＮＡポリメラーゼをインキュベートした。該酵素混合物は次の試薬を含んだ：
【０１６５】
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
２００ μＭ ｄＡＴＰ
１ｍＭ ＭｇＣｌ２
０．１ μｇ の一本鎖ＤＮＡ
２０ピコモルのプライマー（３０塩基オリゴマー）
【０１６６】
活性を測定するために、インキュベートした酵素混合物５μｌ を、次の試薬から成る反応混合物４５μｌ に添加した：
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０
６ｍＭ ＭｇＣｌ２
７５ｍＭ ＫＣｌ
１ｍＭ β−メルカプトエタノール
各２００ μＭ のｄＡＴＰ， ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ
２００ μＭ の〔α−３３Ｐ〕ｄＣＴＰ
２．５ μｇ の活性化されたサケ精子ＤＮＡ
活性は７５℃で１０分間の間に取り込まれたｄＮＭＰの量として測定された。
【０１６７】
ある実施態様では、０，１，２および４時間の間インキュベーションを実施した。４時間より少ない時間インキュベートした反応液は、全ての活性アッセイを一緒に実施するために全てのインキュベーションが間隙するまで氷上に維持しておいた。測定された活性を、各高温インキュベーション後に残存している初活性の比率として表示し、下記に与える。
【０１６８】
【０１６９】
１００ ℃での０， １， ２， ３， ４， ６， ７ および８ 時間のインキュベーションを使って同様な実験を行った。その結果を下記に与える。
【０１７０】
１００ ℃で８時間のインキュベーション後でさえも、検出可能な活性の低下は全く観察されなかった。ピロジクチウム・アビシィ（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ａｂｙｓｓｉ）からのＤＮＡポリメラーゼの耐熱性も同様であると予想される。
【０１７１】
実施例 １１： Ｅｘｏ − 欠失変異体
ポリメラーゼ活性を保持しながらエキソヌクレアーゼ活性を欠いているアミノ（Ｎ）末端欠失変異体ＤＮＡポリメラーゼを作製した。３６６， ３８６および４０３ アミノ酸が欠失しており、それぞれ４８， ４６および４４キロダルトン（ｋＤａ） のタンパク質を生じる３種の「小型」Ｐａｂ ＤＮＡポリメラーゼを製造した。後述の通り変異体ポリメラーゼ遺伝子を作製し発現せしめた。
【０１７２】
Ｐａｂ ＤＮＡポリメラーゼをコードする全長配列の部分配列を、下記に示すプライマーを使って発現プラスミドｐＡＷ１１５から増幅せしめた。上流プライマー ＡＷ５９４， ＡＷ５９３ およびＡＷ５７６ の各々は、ＡＴＧ開始コドンを導入し、ＡＴＧ開始コドンの前にＮｄｅＩ制限部位を導入し、そして最初の６コドンの中に幾つかの変異を導入し、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を変えずにＥ．コリのコドン用法とより適合性である配列を提供する。
【０１７３】
プライマー ＡＷ５９４はアミノ酸３６７ 位と３６８ 位の間にＡＴＧ開始コドンを導入し、３６６ アミノ酸欠失変異体をもたらす。同様に、プライマー ＡＷ５９３はアミノ酸３８７ 位と３８８ 位の間にＡＴＧ開始コドンを導入し、３８６ アミノ酸欠失変異体をもたらし、そしてプライマー ＡＷ５７６はアミノ酸 ４０４位と ４０５位の間にＡＴＧ開始コドンを導入し、４０３ アミノ酸欠失変異体をもたらす。単一の下流プライマー ＡＷ５７７は、アミノ酸４５４ 位に相当するＡｐａＩ部位を含む各増幅用に使用した。それらのプライマーの配列を５′から３′方向において下記に与える。
【０１７４】
【０１７５】
各増幅は、鋳型として１００ ｐｇの直鎖状にしたｐＡＷ１１５を使って５０μｌ の反応容量において次の条件下で実施した：１０ピコモルの各プライマー、５０μＭ の各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．８ 、１０ｍＭ ＫＣｌおよび１ＵのＵｌＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ ）。増幅のための温度プロフィールは、各々が９５℃で３０秒と５５℃で３０秒とから成る２０サイクルであった。
【０１７６】
増幅生成物をＮｄｅＩとＡｐａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を使って精製した。精製した生成物をＮｄｅＩとＡｐａＩで消化されたｐＡＷ１１５中にサブクローニングし、それによって元の１３６４塩基の断片を２６６， ２０６または１５５ 塩基の増幅挿入断片により置換した。得られたクローンをｐＡＷ１２６（４０３ アミノ酸欠失変異体）、ｐＡＷ１２９（３８６ アミノ酸欠失変異体）、およびｐＡＷ１３０（３６６ アミノ酸欠失変異体）と命名した。置換された断片のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列分析により確認した。
【０１７７】
得られた発現ベクターの各々を、本質的に前の実施例に記載された通りに、Ｅ．コリ中で発現せしめた。４８および４６ ｋＤａタンパク質の発現は中程度であったが、一方４４ ｋＤａタンパク質の発現は非常に高かった。熱処理した各タンパク質の粗抽出物は、実施例１０に記載の活性アッセイを使って分析するとポリメラーゼ活性を示した。
【０１７８】
ＡＴＣＣ 寄託
下記のバクテリオファージおよび菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ），１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， Ｕ．Ｓ．Ａ． に寄託された。それらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約およびその規則（ブタペスト条約）の規定のもとに行われた。これは寄託日から３０年間に渡る生存培養物の維持を保証する。
【０１７９】
寄託生物は、ブタペスト条約の規定のもと、そして関連する米国特許および／または外国特許もしくは特許出願の刊行物の発行後の無制限の入手可能性を保証するという出願人とＡＴＣＣとの協定を条件として、ＡＴＣＣにより入手可能にされるだろう。寄託された菌株の入手可能性は、いずれかの政府の権限のもとにその特許法に従って認められる権利に反して本発明を実施するための認可であると解してはならない。
【０１８０】
【０１８１】
上述した明細書は、当業者が本発明を実施できるのに十分であると考えられる。寄託した態様は本発明の１つの観点の例示のつもりであるため、本発明は寄託された細胞系により範囲を限定されるべきではなく、機能的に等価であるいずれの細胞系も本発明の範囲内に含まれる。材料の寄託は本明細書に書かれた記載が本発明のいずれかの観点の実施（最良の実施形態を含む）を可能にするのに不十分であるという容認を構成するものではなく、また寄託物は特許請求の範囲をそれらが表示する特定の説明に限定するものであると解釈されるべきではない。実際、上記説明から、当業者には上記のものの他に本発明の様々な変形が明白であろうし、それらは本発明の特許請求の範囲内に含まれるだろう。
【０１８２】
【配列表】
【０１８３】
【０１８４】
【０１８５】
【０１８６】
【０１８７】
【０１８８】
【０１８９】
【０１９０】
【０１９１】
【０１９２】
【０１９３】
【０１９４】
【０１９５】
【０１９６】
【０１９７】
【０１９８】
【０１９９】
【０２００】
【０２０１】
【０２０２】
【０２０３】
【０２０４】
【０２０５】
【０２０６】
【０２０７】
【０２０８】
【０２０９】
【０２１０】
【０２１１】
【０２１２】
【０２１３】
【０２１４】
【０２１５】
【０２１６】
【０２１７】
【０２１８】
【０２１９】
【０２２０】
【産業上の利用分野】
本発明は、高温性始原菌ピロジクチウム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ）の種からの熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ並びに該酵素の単離および調製方法に関する。耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、多くの組換えＤＮＡ技術、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸の増幅において有用である。
【０００２】
Ｅ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ）のような中温性微生物からのＤＮＡポリメラーゼの単離に関しては広範囲に渡る研究が行われている。例えば、Ｂｅｓｓｍａｎ ら， １９５７， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２２３：１７１−１７７、並びにＢｕｔｔｉｎおよびＫｏｒｎｂｅｒｇ， １９６６， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２４１：５４１９−５４２７を参照のこと。
【０００３】
核酸増幅方法の発明に伴って、高温性微生物からのＤＮＡポリメラーゼに対する関心が高まった。最初に存在した量に比べて多い量に現存の核酸配列を増幅させるための耐熱性酵素（例えば米国特許第 ４，１６５，１８８号に記載されたもの）の利用が、ＰＣＲ法を記載している米国特許第 ４，６８３，１９５号と同第 ４，６８３，２０２号に報告された。それらの特許は参考として本明細書中に組み込まれる。
【０００４】
ＰＣＲ法は、標的核酸の変性、プライマーのハイブリダイゼーション、およびＤＮＡポリメラーゼにより触媒される相補鎖の合成を含んで成る。各プライマーの伸長生成物が所望の核酸配列の生産のための鋳型となる。それらの特許明細書は、使用するポリメラーゼが耐熱性ポリメラーゼであれば、熱によってポリメラーゼ活性が破壊されないだろうから、各変性段階の後にポリメラーゼを添加する必要がないと開示している。
【０００５】
テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ ；Ｔａｑ ）からの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、Ｌａｗｙｅｒら， １９８９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：６４２７−６４３７ 並びに米国特許第 ４，８８９，８１８号および同第 ５，０７９，３５２号（これらは参考として本明細書中に組み込まれる）に記載されたように、クローニングされ、発現され、精製されている。Ｔ．アクアティカスから単離されたＤＮＡポリメラーゼ活性の粗調製は他のものによっても記載されている（Ｃｈｉｅｎ ら， １９７６， Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ． １２７：１５５０−１５５７ 、およびＫａｌｅｄｉｎ ら， １９８０， Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ ４５：６４４−６５１）。
【０００６】
米国特許第 ４，８８９，８１８号、欧州特許出願公開第２５８，０１７ 号およびＰＣＴ公報第ＷＯ８９／０６６９１号（これらの開示は参考として本明細書中に組み込まれる）はいずれも、テルムス・アクアティカスからの〜９４ ｋＤａの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの単離と組換え発現、並びにＰＣＲにおけるそのポリメラーゼの利用を記載している。Ｔ．アクアティカスＤＮＡポリメラーゼはＰＣＲや他の組換えＤＮＡ技術で使用するのに特に好ましいけれども、多数の他の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼも精製され、クローニングされ、発現されている（同時係属中の一般譲渡されたＰＣＴ公報第ＷＯ ９１／０９９５０， ＷＯ ９２／０３５５６， ＷＯ ９２／０６２００ およびＷＯ ９２／０６２０２ 号を参照のこと；これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０００７】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、例えばＰＣＲによるＤＮＡ増幅の実施の際のように、短時間の間９３〜９５℃に加熱した時でも不可逆的に不活性化されない。対照的に、この高温ではＥ．コリＤＮＡ ＰｏｌＩは不活性化される。
始原高温性菌、例えばピロジクチウム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ）種およびメタノピルス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）種は、約１１０ ℃までの温度で増殖し８０℃以下では増殖することができない（Ｓｔｅｔｔｅｒ ら， １９９０， ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ７５：１１７−１２４を参照のこと；これは参考として本明細書中に組み込まれる）。それらの硫黄還元性完全嫌気性菌は海底環境から単離される。
【０００８】
例えば、Ｐ．アビシィは、深さ２，０００ メートルのグアヤマスメキシコ（Ｇｕａｙｍａｓ Ｍｅｘｉｃｏ）から吹き出す深海の活動「発煙」火孔から３２０ ℃の火道水中で単離された（Ｐｌｅｙら， １９９１， Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４：２４５）。ピロジクチウム種とは対照的に、９０℃またはその付近の最適増殖温度と１００ ℃またはその付近の最大増殖温度を有する他の高温性微生物は培養が難しくない。例えば、テルモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）からＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子がクローニングされ配列決定されている（欧州特許出願公開第４５５，４３０ 号）。
【０００９】
これに対して、極端に高温性の微生物の培養は、それらが寒天固形培地上で増殖できないことにより難しくなっている。ピロジクチウム種の個々の細胞は非常にもろく、該生物は繊維状網目構造として増殖する。標準的な細菌醗酵技術は、細胞がもろく、且つ細胞が常用の醗酵装置のスチール部分に目詰まりを起こす網状構造として増殖する傾向があるため、ピロジクチウム種を培養するのは非常に困難である（Ｓｔａｌｅｙ， Ｊ．Ｔ．ら編， Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ， １９８９， Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ， Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ を参照のこと。これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００１０】
それらの難点は、特徴付けとアミノ酸配列分析用に多量の精製された核酸ポリメラーゼ酵素を調製するための実験室培養を妨害する。当業者らは１０６ 〜１０７ 細胞／ｍｌに到達する細胞密度にピロジクチウムを培養することができるかもしれない（例えば、Ｐｈｉｐｐｓら， １９９１， ＥＭＢＯ Ｊ． １０（７）：１７１１−１７２２ を参照のこと）。対照的に、Ｅ．コリは通常０．３ 〜１．０ ×１０１１細胞／ｍｌに増殖される。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】
従って、それらの高温性ＤＮＡポリメラーゼ酵素を、例えばそれらのアミノ酸配列およびそれをコードするＤＮＡ配列を決定することにより、更に特徴づける必要がある。適当な宿主生物中で該遺伝子をクローニングしそして発現せしめることにより、生来の宿主の培養に関連する以前の難点を回避できる。加えて、増加された耐熱性を有する高温性ＤＮＡポリメラーゼを製造することは当業界において望ましい。そのようなＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ法を改良し、且つ他の組換え技術、例えばＤＮＡ配列決定、ニックトランスレーションおよび逆転写において耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを使った時に得られる結果を改善することができる。
【００１２】
【課題を解決するための手段】
本発明は、ピロジクチウム種からのＤＮＡポリメラーゼについてのＤＮＡおよびアミノ酸配列情報、組換え発現ベクター並びに精製プロトコールを提供することにより、上記の要求を満たす。
【００１３】
本発明は、核酸鋳型鎖に相補的な核酸鎖を形成するヌクレオシド三リン酸の結合を触媒する精製された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを提供する。この酵素はピロジクチウム種由来のＤＮＡポリメラーゼである。好ましい態様では、該酵素はＰ．オクルタムまたはＰ．アビシィ由来である。この物質は、核酸配列を容易に操作および／または分析できるように、与えられた核酸配列から最初に存在する量に比べて多量に核酸配列が生産される温度循環増幅反応において利用することができる。
【００１４】
Ｐ．オクルタムおよびＰ．アビシィのＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードする遺伝子も同定されクローニングされ、本発明の耐熱性酵素を調製する更に別の手段を提供する。加えて、Ｐ．オクルタムおよびＰ．アビシィ酵素をコードする遺伝子並びにＰ．オクルタムおよびＰ．アビシィＤＮＡポリメラーゼ活性をコードするそれらの遺伝子の誘導体のＤＮＡ配列とアミノ酸配列も提供される。更に、Ｐ．オクルタムおよびＰ．アビシィＤＮＡポリメラーゼ活性をコードし且つ３′→５′エキソヌクレアーゼ欠損形を発現する変形遺伝子もまた提供される。
【００１５】
本発明は、１または複数の非イオン性高分子界面活性剤を含有する緩衝液中に上述の精製された耐熱性Ｐ．オクルタムおよび／またはＰ．アビシィ酵素を含んで成る安定な酵素組成物も包含する。
最後に、本発明は本発明の耐熱性ポリメラーゼの精製方法を提供する。
【００１６】
かくして、本発明は、ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列および発現ベクターを提供する。本発明の理解を促すために、様々な用語を下記に定義する。
【００１７】
「細胞」、「細胞系」および「細胞培養物」なる用語は互いに交換可能に用いることができ、そのような名称は全て子孫を含む。「形質転換体」または「形質転換された細胞」なる語は、一次形質転換細胞および継代数に関係なくその細胞から誘導された培養物を包含する。計画的または偶然の突然変異のため、全ての子孫のＤＮＡ含量が正確に同じでなくてもよい。もとの形質転換細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能性を有する変異型子孫は、形質転換体の定義の中に含まれる。
【００１８】
「調節配列」なる用語は、特定の宿主生物中での操作可能に連結されたコード配列の発現に必要なＤＮＡ配列を言う。原核生物に適当である調節配列としては、例えば、プロモーター、所望によりオペレーター配列、リボソーム結合部位、ことによると他の配列が挙げられる。真核細胞はプロモーター、ポリアデニル化シグナルおよびエンハンサーを使うことが知られている。
【００１９】
「発現系」なる用語は、それらのＤＮＡ配列によって形質転換された宿主がコードされるタンパク質を産生することができるように、作用可能な結合において所望のコード配列と調節配列とを含有するＤＮＡ配列を言う。形質転換を成し遂げるために、発現系はベクター上に含まれてもよいが、関連ＤＮＡが宿主染色体中に組み込まれてもよい。
【００２０】
「遺伝子」なる用語は、回収可能な生物活性ポリペプチドまたは前駆体の生産に必要な調節配列とコード配列とを含んで成るＤＮＡ配列を言う。ポリペプチドは、全長遺伝子配列によりコードされるかまたは酵素活性が保持されさえすればコード配列の任意部分によりコードされてもよい。
「作用可能に連結された」という用語は、調節配列がコード配列によりコードされるタンパク質の発現を指令する働きをするようなコード配列の配置を言う。よって、発現調節配列に「作用可能に連結された」コード配列とは、調節配列の指令下でコード配列を発現せしめることができる配置を指す。
【００２１】
ピロジクチウムポリメラーゼを含有する混合物に関連して言及される「混合物」なる用語は、ピロジクチウムポリメラーゼを含有するが他のタンパク質を含むこともできる物質の集合体を言う。ピロジクチウムポリメラーゼが組換え宿主細胞から誘導される場合、他のタンパク質は通常その宿主に関連するものであろう。宿主が細菌である場合、夾雑タンパク質はもちろん細菌タンパク質であろう。
【００２２】
「非イオン性高分子界面活性剤」なる用語は、イオン電荷を全く持たず、本発明の目的上、約３．５ 〜約９．５ のｐＨ域、好ましくは４．０ 〜９．０ のｐＨ域においてピロジクチウム酵素を安定化する能力により特徴づけられる界面活性剤である。
本明細書中で使用する「オリゴヌクレオチド」なる用語は、２以上、好ましくは３以上、通常は１０以上のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドから成る分子として定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、該オリゴヌクレオチドの最終的機能または用途といった様々な要因に依存するだろう。
【００２３】
オリゴヌクレオチドは、例えば、適当な配列のクローニングと制限、並びにＮａｒａｎｇら， １９７９， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：９０−９９のホスホトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ ら， １９７９， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ６８：１０９−１５１のホスホジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅら， １９８１， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２２：１８５９−１８６２のホスホルアミダイト法；Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ ら， １９８１， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １０３：３１８５−３１９１ のトリエステル法または自動合成法；および米国特許第４，４５８，０６６ 号の固体支持体法などの方法による直接化学合成を包含する任意の適当な方法により、調製することができる。
【００２４】
本明細書中で使用する「プライマー」なる用語は、天然型であろうと合成型であろうと、プライマー伸長が開始される条件下に置いた時に合成の開始点として作用することができるオリゴヌクレオチドを指す。核酸鎖に相補的であるプライマー伸長生成物の合成は、適当な温度で適当な緩衝液の中でヌクレオシド三リン酸とＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素の存在下で開始される。「緩衝液」は、所望のｐＨに調整された補因子（例えば二価金属イオン）および塩（適当なイオン強度を提供するため）を含有する。
【００２５】
ピロジクチウムポリメラーゼ用には、緩衝液は好ましくは、１０〜１００ｍＭ ＫＣｌ 、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ 緩衝液（ｐＨ ７．５〜８．５ ）および１００ μｇ／ｍｌのゼラチン（ゼラチンは必要でないし、ある用途、例えばＤＮＡ配列決定には避けるべきであるけれども）と共に、１〜３ｍＭのマグネシウム塩、好ましくはＭｇＣｌ２ 、５０〜２００ μＭ の各ヌクレオチド、および０．２ 〜１ μＭ の各プライマーを含有する。
【００２６】
プライマーは、好ましくは一本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーの適切な長さは該プライマーの意図する用途に依存するが、典型的には１５〜３５ヌクレオチドの範囲である。短いプライマー分子は一般に、鋳型と十分に安定なハイブリッド複合体を形成するのにより低い温度を必要とする。プライマーは鋳型の配列を正確に反映する必要はないが、鋳型とハイブリダイズするほど十分に相補的でなければならない。
【００２７】
「プライマー」なる用語は、特に増幅させる予定の標的領域の一端または両端に関する情報に幾らか曖昧さがある場合、複数のプライマーを指すことができる。例えば、核酸配列がタンパク質配列から推定される場合、「プライマー」は実際には遺伝暗号の縮重に基づいて考えられ得る全てのコドン変異を表す配列を含有するプライマーオリゴヌクレオチドの集合体である。この集合体のうちの１つのプライマーは標的配列の末端と相同であろう。同様に、「保存された」領域が集団の中で有意なレベルの多形性を示すならば、隣接配列を増幅するであろうプライマーの混合物を調製することができる。
【００２８】
プライマーは、鋳型の特定配列の鎖に「実質上」相補的であることができる。プライマーは、プライマー伸長が起こる鋳型鎖とハイブリダイズするのに十分な程「相補的」でなければならない。プライマー配列は鋳型の配列を正確に反映する必要はない。例えば、非相補的ヌクレオチド断片をプライマーの５′末端に取り付けてもよいが、ただし、プライマー配列の残部は鋳型鎖に実質上相補的であろう。プライマー中に非相補的塩基または長い配列を点在させることができるが、ただし、プライマー配列が、鋳型の配列とハイブリダイズしそれによってプライマー伸長生成物の合成のための鋳型プライマー複合体を形成するのに十分な相補性を有することを前提とする。
【００２９】
プライマーは、所望であれば、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段によって検出可能な標識を組み込むことにより、標識することができる。例えば、有用な標識としては、３２Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（ＥＬＩＳＡ において汎用されるような）、ビオチン、またはそれに対する抗血清もしくはモノクローナル抗体が入手可能であるタンパク質およびハプテンが挙げられる。標識は、プライマーまたはプライマー伸長生成物（例えば増幅されたＤＮＡ）のいずれかの固相支持体上への固定化を容易にするためにプライマーを「捕捉する」のにも使うことができる。
【００３０】
「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」なる語は、特定のヌクレオチド配列のところまたはその付近で二本鎖ＤＮＡを切断する細菌酵素をいう。
「耐熱性ポリメラーゼ」および「耐熱性酵素」なる用語は、熱に対して安定であり、熱抵抗性であり、且つ正しい形でのヌクレオチドの結合を触媒して鋳型核酸鎖に相補的であるプライマー伸長生成物を形成する酵素をいう。一般的に、プライマー伸長生成物の合成はプライマーの３′末端で始まり、合成が終わるまで鋳型鎖に沿って５′方向に進行する。
【００３１】
本発明のピロジクチウム耐熱性酵素は、米国特許第 ４，９６５，１８８号（本明細書中に引用により組み込まれる）に記載されたようなポリメラーゼ連鎖反応またはＰＣＲとして知られる増幅反応における効果的使用のための必要条件を満たす。ピロジクチウム酵素は、ＰＣＲ法における重要な段階である二本鎖核酸の変性を行うのに必要な時間の間高温にかけた時、不可逆的に変性（不活性化）された状態にならない。この目的上の不可逆的変性とは、酵素活性の永久且つ完全な損失を言う。核酸変性に必要な加熱条件は、例えば、緩衝液塩濃度並びに変性させようとする核酸の組成と長さに依存するだろうが、典型的には約９０℃〜約１０５ ℃の範囲であり、その時間は主に温度と核酸の長さに依存して、典型的には数秒間〜４分間までであろう。
【００３２】
緩衝液塩濃度および／または核酸のＧＣ組成が増加すると、より高温が要求されるかもしれない。ピロジクチウム酵素は約９５℃〜１００ ℃の温度への比較的短期暴露から不可逆的に変性された状態にはならない。ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼの極端な耐熱性は、以前に特徴づけられた耐熱性酵素を上回る追加の利点を提供する。本発明より以前には、１００ ℃ほど高い変性温度での効率的ＰＣＲは提案されていなかった。この目的での耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは今まで全く記載されたことがない。
【００３３】
しかしながら、標的核酸のＧ／Ｃ含量が増加すると、二本鎖を変性せしめるのに必要な温度（Ｔｄｅｎ ）も増加する。９５℃を越えるＴｄｅｎ 段階を必要とする標的配列には、従来のプロトコールでは二本鎖を部分的に不安定にし、それによって有効Ｔｄｅｎ を下げるためにＰＣＲ中に溶剤を含めることを必要とする（Ｋｏｒｇｅ ら， １９９２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：９１０−９１４、およびＷｏｎｇら， １９９１， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：２２５１−２２５９；これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００３４】
それらの剤は、二本鎖ＤＮＡを不安定にすることに加えて、プライマーの安定性に影響を及ぼし、酵素活性を阻害し、そして様々な濃度のＤＭＳＯまたはホルムアミドは好熱性ＤＮＡポリメラーゼの耐熱性（即ち半減期）を減少させるだろう。従って、それらの補助溶剤を使用する時には相当な数の最適化実験および反応条件を評価しなければならない。これに対して、他の点では標準的なＰＣＲにおいてＰｏｃ またはＰａｂ ＤＮＡポリメラーゼを使って単純にＴｄｅｎ を１００ ℃に上げることにより、ＰＣＲ生成物の完全な鎖分離が促進され、ＤＮＡらせん不安定化剤の必要性を排除することができる。
【００３５】
本明細書中に開示される極度な高温性ポリメラーゼは、１００ ℃を越える温度で、そして１１０ ℃ほどの高温でさえも、安定である。しかしながらそれらの温度では、ｐＨやイオン強度に依存して、標的ＤＮＡの完全性が悪影響を受ける場合がある（Ｅｋｅｒｔ およびＫｕｎｋｅｌ， １９９２， ＰＣＲ ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ， Ｑｕｉｒｋｅ およびＴａｙｌｏｒ編， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ， ２２５−２４４頁；これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【００３６】
ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼは、それが機能するのには約４５℃より高い最適温度を有する。４５℃より低い温度は鋳型へのプライマーのハイブリダイゼーションを促進するが、塩組成と濃度並びにプライマー組成と長さに依存して、鋳型へのプライマーのハイブリダイゼーションはより高温（例えば４５〜７０℃）で起こることができ、プライマーハイブリダイゼーション反応の特異性を促進し得る。本発明の酵素は８５℃までの広い温度範囲に渡り活性を示す。最適活性は鋳型に依存するが通常は７０〜８０℃の範囲であろう。
【００３７】
本発明は、ピロジクチウム種の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性をコードするＤＮＡ配列を提供する。本発明の好ましい態様は、Ｐ．アビシィおよびＰ．オクルタムＤＮＡポリメラーゼの核酸配列とアミノ酸配列を提供する。完全なＰ．アビシィおよびＰ．オクルタムＤＮＡポリメラーゼコード配列は、配列番号１（Ｐ．アビシィ）および配列番号３（Ｐ．オクルタム）として下記に記述される。推定アミノ酸配列は配列番号２（Ｐ．アビシィ）および配列番号４（Ｐ．オクルタム）として記載される。便宜上、それらのポリメラーゼのヌクレオチド配列とアミノ酸配列は参考のため番号付けされる。
【００３８】
本発明は、Ｐ．オクルタムおよびＰ．アビシィＤＮＡポリメラーゼ配列と他の耐熱性ポリメラーゼ酵素との比較手段を与える核酸配列を提供する。そのような比較は、それらの新規配列が、真性細菌耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする以前に記載された核酸配列と無関係であることを証明する。結果として、公表された既知の真性細菌耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ配列に基づいてピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼ酵素を同定する手段は、ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードする核酸配列を単離するのに適していない。
【００３９】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
本発明の結果として、ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列を使って新規の縮重プライマーを設計し、今まで発見されなかった高温性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を見つけ出すことができる。縮重プライマー法の一般的効用は、ＰＣＴ公報第ＷＯ ９２／０６２０２ 号（この開示は参考として本明細書中に組み込まれる）において例示されている。
【００４６】
この刊行物は、テルモシフォ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子をクローニングするための縮重プライマーの使用を記載している。本発明より前に、縮重プライミング法が新規耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を単離するのに適することが証明された。それらの方法の成功の一部は、例えばテルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）およびテルムス・テルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ間で保存されたモチーフの同定に存する。
【００４７】
よって、例えばピロジクチウム種のような極端な高温性菌とテルムス種のような非高温菌との間のＤＮＡポリメラーゼアミノ酸配列の相違のため、それらの縮重プライミング法は今まではピロジクチウムポリメラーゼ遺伝子の単離および発現に適さなかった。本出願人らは、極端な高温性微生物から新規ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を単離するのに縮重プライミング法を使用することを可能にした。
【００４８】
高温菌Ｔ．リトラリス （Ｔｌｉ）のＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は既に記載されている。Ｔｌｉ， ＰａｂおよびＰｏｃ ＤＮＡポリメラーゼは真核生物ＤＮＡポリメラーゼを表すアミノ酸配列モチーフを含む一方で、Ｐａｂ およびＰｏｃ ＤＮＡポリメラーゼはＴｌｉ ＤＮＡポリメラーゼとは限定された所々のアミノ酸配列一致しか有さない。詳しくは、アミノ酸配列の整列は、Ｐｏｃ またはＰａｂ ＤＮＡポリメラーゼとＴｌｉ ＤＮＡポリメラーゼとの間でわずか３７％〜３９％の配列一致しか示さない。
【００４９】
Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼと不一致である重要な領域は、領域１（配列番号２および４の ４３８〜 ４５８位）の前の２０アミノ酸と領域１の後ろの１０アミノ酸中に存在する。加えて、Ｔｌｉ ＤＮＡポリメラーゼとの不一致を示す重要な領域は領域４（配列番号２および４の ６１１〜 ６３４位）の前の１０〜１５アミノ酸と領域４の後ろの１０〜１５アミノ酸中に存在する。それらの領域並びにポリメラーゼ活性部位の他の部分はＰａｂ およびＰｏｃ ＤＮＡポリメラーゼ中では高度に保存されており、それらのＤＮＡポリメラーゼ酵素の驚くほどの耐熱性にかなり寄与している。
【００５０】
従って、本発明は、２つのピロジクチウムポリメラーゼ酵素のＤＮＡ配列とアミノ酸配列を提供することにより、他の極端に高温性のＤＮＡポリメラーゼ酵素およびそれらの酵素のコード配列の単離を可能にする。Ｐ．オクルタムおよびＰ．アビシィの配列と既知の耐熱性酵素配列との更なる整列は、１００ ℃の変性温度での効率的ＰＣＲに適する追加の新規酵素の選択的同定を可能にする。
【００５１】
上記に示したＤＮＡ配列およびアミノ酸配列並びにそれらの配列をコードするＤＮＡ化合物は、多種多様の宿主細胞中でのピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼの発現を指令する組換えＤＮＡ発現ベクターを設計し作製するのに利用することができる。上記に示したＤＮＡ配列の全部または一部をコードするＤＮＡ化合物は、他の始原菌、特にピロジクチウム種からの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡを同定するためのプローブとしても利用することができ、そして上記に示したアミノ酸配列は、耐熱性ポリメラーゼを同定および精製するのに用いることができる抗体を調製するための免疫原として使われるペプチドを設計するのに利用することができる。
【００５２】
ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼをコードするアミノ酸配列をコードする組換えベクターは、典型的には組換えＤＮＡ技術における使用の前に精製されるだろう。本発明はそのような精製方法を提供する。
Ｐ．オクルタムまたはＰ．アビシィポリメラーゼ遺伝子を発現する組換えＥ．コリ宿主から精製されたＤＮＡポリメラーゼの分子量は、上記方法により約９０ ｋＤａであると決定される。推定アミノ酸配列によって決定した時のこの同一ＤＮＡポリメラーゼの分子量は、約９２．６キロダルトンであると算出される。
【００５３】
本発明の重要な観点は、組換えピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼの生産である。よって本発明は、本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの調製方法も提供し、該方法は
（ａ） 前記耐熱性ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列を含んで成るＤＮＡベクターによって形質転換された宿主細胞を培養する段階；および
（ｂ） 前記培養物から前記宿主細胞中で生産された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを単離する段階
を含んで成る。
【００５４】
上述したように、この酵素をコードする遺伝子は２つの模範的なピロジクチウム種であるＰ．オクルタムとＰ．アビシィのゲノムＤＮＡからクローニングされた。Ｐ．オクルタム（Ｐｏｃ） ＤＮＡポリメラーゼの完全コード配列は、プラスミドｐＰｏｃ４ の〜２．５２ ｋｂ ＮｈｅＩ制限断片中に容易に得ることができる。このプラスミドは宿主細胞Ｅ．コリ Ｓｕｒｅ Ｒ 細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中において１９９３年 ５月１１日に受託番号６９３０９ のもとアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に寄託された。Ｐ．アビシィ（Ｐａｂ） ＤＮＡポリメラーゼの完全コード配列は、プラスミドｐＰａｂ１４の〜３．７４ ｋｂ ＳａｌＩ制限断片中に容易に得ることができる。このプラスミドは宿主細胞Ｅ．コリ Ｓｕｒｅ Ｒ 細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中において１９９３年 ５月１１日に受託番号６９３１０ のもとＡＴＣＣに寄託された。
【００５５】
耐熱性Ｐａｂ およびＰｏｃ ＤＮＡポリメラーゼ酵素の完全コード配列および推定アミノ酸配列は上記に与えられている。しかしながら、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する生物活性遺伝子産物を生産するために該ＤＮＡポリメラーゼの全コード配列が必要なわけではない。ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼ配列をコードするＤＮＡの入手可能性は、ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するミューテイン（変異タンパク質）形を生じるように該コード配列を変更する機会を提供する。
【００５６】
コード配列の約１／３のアミノ（Ｎ）末端の欠失は、ポリメラーゼアッセイにおいて全く活性である遺伝子産物を提供する。ポリメラーゼの幾つかのＮ末端短縮形が活性であることから、それらのポリメラーゼの発現に使われる遺伝子構成物はコード配列のＮ末端短縮形を包含することができる。
【００５７】
Ｎ末端欠失に加えて、ピロジクチウムポリメラーゼを含んで成るペプチド鎖内の個々のアミノ酸残基を酸化、還元または他の誘導化により修飾することができ、またタンパク質を開裂せしめて活性を保持している断片を得ることもできる。活性を損なわないそのような変更は、Ｐｏｃ またはＰａｂ ポリメラーゼに関する定義から該タンパク質を除外するものではなく、特別に本発明の範囲内に含まれるものである。
【００５８】
欠失、付加、または翻訳中にＤＮＡポリメラーゼ中に取り込まれるアミノ酸を変えるような変更によるＰｏｃ またはＰａｂ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の一次構造への修飾は、該タンパク質の高温ＤＮＡポリメラーゼ活性を破壊せずに行うことができる。そのような置換または他の変更は、本発明の予想の範囲内に入るＤＮＡによりコードされるアミノ酸配列を有するタンパク質の生成をもたらす。同様に、Ｐｏｃ またはＰａｂ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローン化ゲノム配列または相同の合成配列を使って、ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼ活性を有する融合ポリペプチドを発現させることができ、あるいは生来のＰｏｃ またはＰａｂ ＤＮＡポリメラーゼのものと同じアミノ酸配列を有するタンパク質を発現させることができる。
【００５９】
従って本発明は、Ｐｏｃ およびＰａｂ ＤＮＡポリメラーゼ酵素の完全なコード配列を提供する。このコード配列から様々な宿主系に適用可能な発現ベクターを作製し、そして該コード配列を発現せしめることができる。本発明のポリメラーゼコード配列の一部分も、様々な種において他の耐熱性ポリメラーゼコード配列を検索するためのプローブとして有用である。従って、少なくとも４〜６アミノ酸をコードするゲノムＤＮＡの部分を少なくとも４〜６アミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドプローブとして合成し、耐熱性ポリメラーゼをコードする追加のＤＮＡを検索するのに用いることができる。
【００６０】
Ｐａｂ およびＰｏｃ の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子と他の種の対応遺伝子のヌクレオチド配列の間に正確な一致がないかもしれないので、偽陽性を避けるのに十分な緊縮条件下でハイブリダイゼーションを得るために、約１２〜１８ヌクレオチドをコードするオリゴマー（４〜６アミノ酸配列をコードする）が通常必要である。６アミノ酸をコードする配列はそのようなプローブに十分な情報を与える。
【００６１】
本発明は、Ｐａｂ およびＰｏｃ ＤＮＡポリメラーゼのコード配列とアミノ酸配列を提供することにより、他の耐熱性ポリメラーゼ酵素およびそれらの酵素のコード配列の単離を可能にする。詳しくは、本発明は、追加のピロジクチウム種であるＰ．ブロッキィ（Ｐ． ｂｒｏｃｋｉｉ）、およびＭ．カンドレリ（Ｍ． ｋａｎｄｌｅｒｉ）などのメタノピルス（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）種を含む極端な高温菌のような関連の始原菌からのＤＮＡ単離物中に含まれるＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードする核酸を同定するためのプライマーおよびプローブを調製する手段を提供する。
【００６２】
Ｐａｂ とＰｏｃ ＤＮＡポリメラーゼコード配列の間にはそのような幾つかの類似領域が存在する。長さ９コドンの領域には、それらの領域に対応するプローブを使って、少なくとも５コドンの連続配列用のプローブと同一である（そして相補的である）耐熱性ポリメラーゼ酵素をコードする配列を同定し単離することができる。長さ６コドンの領域には、この領域に対応するプローブを使って、少なくとも５コドンの連続配列用のプローブと同一である耐熱性ポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列を同定し単離することができる。
【００６３】
ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼ酵素中には見つかるが生来のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼと生来のＴｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ中には欠けている１つの特性は、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性である。この３′→５′エキソヌクレアーゼ活性は、合成された核酸配列の誤って組み込まれた塩基または不適正塩基がこの活性によって除去されるため一般的に望ましいと考えられる。しかしながら、ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼ酵素中に見つかる３′→５′エキソヌクレアーゼ活性は、プライマーの３′末端を変更することによりＰＣＲにおいて非特異的なバックグラウンド増幅をも増大させ得る。
【００６４】
３′→５′エキソヌクレアーゼ活性はプライマーまたは一本鎖鋳型のような一本鎖ＤＮＡを除去し得る。本質的に、一本鎖プライマーまたは鋳型のどの３′−ヌクレオチドも該酵素により不対のものとして処理されそして分解される。ＰＣＲにおけるプライマー分解を避けるために、プライマーの３′末端にホスホロチオエートを付加することができる。ホスホロチオエート修飾されたヌクレオチドは、３′→５′エキソヌクレアーゼによる除去に対して一層抵抗性である。
【００６５】
生来のＰａｂ もしくはＰｏｃ ＤＮＡポリメラーゼと同一の酵素を生産しようと望むにせよまたは該酵素の誘導体もしくは類似体を生産しようと望むにせよ、該ポリメラーゼの組換え形態の生産は、典型的には発現ベクターの作製、該ベクターによる宿主細胞の形質転換、および発現が起こるような条件下での形質転換された宿主細胞の培養を伴う。発現ベクターを作製するために、成熟酵素（この用語は本明細書中全ミューテインを包含するものとして使われる）または該ポリメラーゼの融合ポリペプチドをコードするＤＮＡを得る。
【００６６】
ここで融合ポリペプチドは、本発明のポリメラーゼから誘導されるアミノ酸配列と、ポリメラーゼ活性の破壊をもたらさない追加のアミノ酸配列または制御条件（例えばペプチダーゼでの処理）下で開裂されて活性タンパク質を与えるような追加のアミノ酸配列とを含んで成る。次いでコード配列を適当な調節配列と作用可能な結合において発現ベクター中に配置させる。
【００６７】
ベクターは、宿主細胞中で自律的に複製するかまたは宿主細胞の染色体ＤＮＡ中に組み込まれるように設計することができる。該ベクターを使って適当な宿主を形質転換せしめ、そして形質転換された宿主を組換えピロジクチウムポリメラーゼの発現に適当な条件下で培養する。培地または細胞からピロジクチウムポリメラーゼを単離する。幾つかの不純物が許容され得る場合、該タンパク質の回収と精製は場合によって必要でないことがある。
【００６８】
所望のコード配列と調節配列を含有する適当なベクターの作製は、当業界においてよく理解されている標準的連結および制限技術を使用する（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ 第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋら， １９８９， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹを参照のこと；これは参考として本明細書中に組み込まれる）。単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列、または合成されたオリゴヌクレオチドは、所望の形態に切断され、修飾され、そして再連結される。通常入手できないならば、適当な制限部位をコード配列の末端に付加して当業界において既知の方法により発現ベクターの作製を容易にすることができる。
【００６９】
配列変更を必要とするベクターまたはコード配列の部分には、様々な部位特異的プライマー指令突然変異誘発法が利用可能である。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使って部位特異的突然変異誘発を実施することができる。ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ， Ｉｎｎｉｓら編， １９９０， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ およびＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｈｅｎｒｙ Ｅｒｌｉｃｈ編， １９８９， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， ＮＹは、ＰＣＲを使ってＤＮＡをクローニングし、修飾し、そして配列決定する方法を記載しており、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【００７０】
調節配列、発現ベクターおよび形質転換法は、遺伝子を発現せしめるのに使う宿主細胞の型に依存する。一般的には、宿主として原核生物、酵母、昆虫または哺乳動物細胞が使われる。原核生物宿主は一般に組換えタンパク質の生産に最も効率的で且つ好都合であり、従ってピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼ酵素の発現に好ましい。
【００７１】
組換えタンパク質の発現に最も頻繁に使われる原核生物はＥ．コリ（Ｅ． ｃｏｌｉ ）である。構成物のクローニングおよび配列決定、並びに大部分の細菌プロモーターの調節下での構成物の発現には、Ｅ．コリ遺伝子貯蔵センター（Ｅ． ｃｏｌｉ． Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ ）からＧＣＳＣ ＃６１３５のもとに得られるＥ．コリ Ｋ１２株ＭＭ２９４ を宿主として使用することができる。ＰＬ ＮＲＢＳ 調節配列を有する発現ベクターには、Ｅ．コリ Ｋ１２株ＭＣ１０００ラムダ溶原素、Ｎ７Ｎ５３ｃＩ８５７ ＳｕｓＰ８０， ＡＴＣＣ ３９５３１ を使うことができる。
【００７２】
１９８７年４月７日にＡＴＣＣに寄託されたＥ．コリ ＤＧ１１６（ＡＴＣＣ ５３６０６）、および１９８５年３月２９日にＡＴＣＣに寄託されたＥ．コリ ＫＢ２（ＡＴＣＣ ５３０７５）も有用な宿主細胞である。Ｍ１３ ファージ組換え体には、ファージ感染に対して感受性であるＥ．コリ株、例えばＥ．コリ Ｋ１２株ＤＧ９８が使用される。ＤＧ９８は１９８４年７月１３日にＡＴＣＣ（ＡＴＣＣ ３９７６８）に寄託された。
【００７３】
しかしながら、Ｅ．コリ以外の微生物株、例えばバシラス菌、例えばバシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、様々な種のシュードモナス菌、および他の菌株をピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼ酵素の組換え発現に使うこともできる。
細菌に加えて、真核微生物、例えば酵母を組換え宿主細胞として使うこともできる。例えば、Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら， １９７９， Ｎａｔｕｒｅ ２８２：３９ ； Ｔｓｃｈｅｍｐｅ ら， １９８０， Ｇｅｎｅ １０：１５７ ；およびＣｌａｒｋｅら， １９８３， Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚ． １０１：３００ を参照のこと。
【００７４】
ピロジクチウム遺伝子は、多細胞生物から誘導した真核細胞培養物中で発現せしめることもできる。例えば、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， ＣｒｕｚおよびＰａｔｔｅｒｓｏｎ 編 （１９７３） を参照のこと。有用な宿主細胞系としては、ＣＯＳ−７， ＣＯＳ−Ａ２， ＣＶ−１ 、マウス細胞、例えばマウスミエローマＮ５１ およびＶＥＲＯ、ＨｅＬａ細胞、並びにチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ） 細胞が挙げられる。植物細胞も宿主細胞として有用であり、植物細胞と適合性である調節配列、例えばノパリンシンターゼプロモーターおよびポリアデニル化シグナル配列（Ｄｅｐｉｃｋｅｒら， １９８２， Ｊ． Ｍｏｌ． Ａｐｐｌｎ． Ｇｅｎ． １：５６）が利用可能である。
【００７５】
使用する宿主細胞に依存して、そのような細胞に適当な標準技術を使って形質転換が行われる。原核生物または実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞には、Ｃｏｈｅｎ， １９７２， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ６９：２１１０ により記載されたような塩化カルシウムを使用するカルシウム処理が使われる。哺乳動物細胞には、ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ ｄｅｒ Ｅｂ， １９７８， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：５４６のリン酸カルシウム沈澱法が好ましい。酵母中への形質転換は、Ｖａｎ Ｓｏｌｉｎｇｅｎら， １９７７， Ｊ． Ｂａｃｔ． １３０：９４６および Ｈｓｉａｏら， １９７９， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７６：３８２９ の方法に従って行われる。
【００７６】
ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼが組換え宿主細胞中で発現されたら、該タンパク質の精製が望ましいだろう。上述した精製手順を使って本発明の組換え耐熱性ポリメラーゼを精製することができるけれども、疎水的相互作用クロマトグラフィー精製法が好ましい。疎水的相互作用クロマトグラフィーは、疎水基を含む無電荷の材料との疎水的相互作用の強度の差に基づいて物質が分離される分離技術である。典型的には、まずカラムを疎水結合に好ましい条件下で、例えば高イオン強度下で平衡化する。下降性の塩勾配を使って試料を溶出せしめることができる。
【００７７】
組換え耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを精製するための詳細なプロトコールは、例えば、１９９２年３月５日に発行されたＰＣＴ特許公報第ＷＯ ９２／０３５５６ 号および１９９１年７月１１日に発行されたＰＣＴ特許公報第ＷＯ ９１／０９９５０ 号に記載されている。それらの刊行物は参考として本明細書中に組み込まれる。テルモトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）についてその中に記載された方法が適当である。実施例９（下記参照）は組換えピロジクチウムポリメラーゼ酵素を精製するための好ましいプロトコールを提供する。
【００７８】
長期安定性のためには、ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼ酵素は、好ましくは１または複数の非イオン性高分子界面活性剤を含有する緩衝液中に保存される。そのような界面活性剤は一般に約１００ 〜２５０，０００ 、好ましくは約４，０００ 〜２００，０００ ダルトンの範囲内の分子量を有し、そして約３．５ 〜約９．５ 、好ましくは約４ 〜８．５ のｐＨにおいて該酵素を安定化する。そのような界面活性剤の例として、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ ＭＣ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．， １７５， Ｒｏｃｋ Ｒｏａｄ， Ｇｌｅｎ Ｒｏｃｋ， ＮＪ （ＵＳＡ） により出版されたＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ’ｓ Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ ＆ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ， Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａｎ 版（１９８３）の２９５ 〜２９８ 頁に明記されたものが挙げられる。この全開示は参考として本明細書中に組み込まれる。
【００７９】
好ましくは、界面活性剤は、エトキシル化脂肪アルコールエーテルおよびラウリルエーテル、エトキシル化アルキルフェノール、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、修飾されたオキシエチル化および／またはオキシプロピル化直鎖アルコール、ポリエチレングリコールモノオレエート化合物、ポリソルベート化合物、並びにフェノール性脂肪アルコールエーテルから成る群から選ばれる。特により好ましいのは、ＩＣＩ Ａｍｅｒｉｃａｎｓ Ｉｎｃ．， Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ， Ｄ．Ｅ．からのポリオキシエチル化（２０）ソルビタンモノラウレートすなわちＴｗｅｅｎ−２０、およびＢＡＳＦ Ｗｙａｎｄｏｔｔｅ Ｃｏｒｐ． Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ， ＮＪ からのエトキシル化アルキルフェノール（ノニル）すなわちＩｃｏｎｏｌＴＭ ＮＰ−４０である。
【００８０】
本発明の耐熱性酵素は、そのような酵素活性が必要または所望であるどんな目的にも用いることができる。特に好ましい態様では、該酵素はＰＣＲとして知られる核酸増幅反応を触媒する。
ＰＣＲ法は当業界で周知であり（米国特許第 ４，６８３，１９５号；同第 ４，６８３，２０２号および同第 ４，９６５，１８８号を参照のこと；この各々は参考として本明細書中に組み込まれる）、更に販売業者、例えばＰｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒはＰＣＲ試薬を販売しておりＰＣＲプロトコールを発表しているけれども、ＰＣＲ法をよく知らない人への本発明の平明と十分な理解のためにＰＣＲ情報を下記に幾つか提供する。
【００８１】
ＰＣＲにより試料中の標的核酸配列を増幅させるために、該配列は増幅系の成分に近づきやすくなければならない。一般に、この近づきやすさ（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ）は、試料から核酸を単離することによって保証される。生物学的試料から核酸を抽出する様々な技術が当業界で既知である。例えば、Ｈｉｇｕｃｈｉ ら， １９８９， ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｅｒｌｉｃｈ編， Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ） に記載されたものを参照のこと。
【００８２】
試料中の核酸をまず変性せしめ（試料核酸が二本鎖であると仮定して）てからＰＣＲ反応を開始するため、そして試料によっては単に加熱することが細胞の破壊を引き起こすため、試料からの核酸の単離は時折鎖分離と共に行うことができる。しかしながら、鎖分離は物理的、化学的または酵素的手段を含む任意の適当な変性法によって成し遂げることができる。典型的な熱変性は、約８０〜１０５ ℃の範囲の温度と数秒から約１〜１０分までの範囲の時間を必要とする。
【００８３】
上述したように、鎖分離は試料核酸の単離と共にまたは別々の段階として行うことができる。ＰＣＲ法の好ましい態様では、鎖分離は、二本鎖の変性を引き起こすがポリメラーゼの不可逆的変性を引き起こさないような効果的な時間の間十分に高温に反応液を加熱することによって達成される（米国特許第 ４，９６５，１８８号を参照のこと）。しかしながら、たとえ鎖分離がどんな方法で達成されても、一度鎖が分離されれば、ＰＣＲの次の段階は、分離した鎖を標的配列に隣接するプライマーとハイブリダイズせしめることを含む。次いでプライマーを伸長して標的配列の相補的コピーを形成せしめ、そして所望の量の増幅核酸を得るのに必要な回数だけ、変性、ハイブリダイゼーションおよび伸長のサイクルを繰り返す。
【００８４】
好結果のＰＣＲ増幅のために、各プライマーが二本鎖配列に沿ってハイブリダイズする位置が、一方のプライマーから合成される伸長生成物がその鋳型（相補鎖）から分離された時に他方のプライマーの伸長のための鋳型として働くような位置であるように、プライマーは設計される。
ＰＣＲにおけるプライマーの鋳型依存性伸長は、適当な塩、金属カチオンおよびｐＨ緩衝系から成る反応媒質中で適当量の４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸（ｄＡＴＰ， ｄＧＴＰ， ｄＣＴＰ， およびｄＴＴＰ）の存在下で重合剤によって触媒される。
【００８５】
この増幅方法は、既知配列の多量の特定核酸配列を生産するのに有用なだけでなく、存在することは知られているが完全に特定されていない核酸配列を生産するのにも有用である。一方のプライマーから合成される伸長生成物がその鋳型（相補鎖）から分離された時に、限定された長さの核酸配列への他方のプライマーの伸長のための鋳型として働くことができるような該配列に沿った相対位置のところで所望の配列の別の鎖にハイブリダイズするであろう２つのオリゴヌクレオチドプライマーを調製することができるように、該配列の両端のところの十分な数の塩基のみを十分詳細に知る必要がある。該配列の両端のところの塩基についての知識が増えれば増えるほど、標的核酸配列のためのプライマーの特異性や方法の有効性も高まり得る。
【００８６】
精製された形または未精製の形でのどんな核酸配列も、それが所望の特定の核酸配列を含むかまたは含む疑いのあることを前提として、出発核酸として使用することができる。該方法は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ（伝令ＲＮＡを含む）を使用することができ、このＤＮＡまたはＲＮＡは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
【００８７】
例えば、鋳型がＲＮＡならば、ＲＮＡを相補的コピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列に変換する適当な重合剤は、逆転写酵素（ＲＴ）、例えばトリ骨髄芽球症ウイルスＲＴ、およびＨｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ｉｎｃ．により発見および製造されそしてＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒから市販されている逆転写酵素活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼであるテルムス・テルモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ（ＰＣＴ特許公報ＷＯ ９１／０９９５０ を参照のこと）である。
【００８８】
核酸が一本鎖であるにせよ二本鎖であるにせよ、ピロジクチウム由来のＤＮＡポリメラーゼは変性段階においてあるいは温度がハイブリダイゼーションを促進する範囲内にあるかまたはそれに下げられつつある時に添加することができる。ピロジクチウムポリメラーゼの耐熱性は該ポリメラーゼを何時でも反応混合物に添加できるようにするけれども、反応混合物が緊縮ハイブリダイゼーション温度よりも低く冷却されないだろう時点で該ポリメラーゼを反応混合物中に添加することにより、非特異的増幅を実質的に阻止することができる。
【００８９】
ハイブリダイゼーション後、反応混合物は、酵素活性が促進または最適化されるような温度、すなわちハイブリダイズしたプライマーと鋳型からのプライマー伸長生成物の合成を促進する酵素活性を増加させるのに十分な温度に加熱または維持される。その温度は実際に各々の核酸鋳型に相補的である各プライマーの伸長生成物を合成するのに十分でなければならないが、それの相補的鋳型からの各伸長生成物を変性せしめるほど高くてはならない（即ち温度は通常約８０〜９０℃未満である）。
【００９０】
使用する核酸に依存して、この合成反応に有効な典型的な温度は、一般に約４０〜８０℃、好ましくは５０〜７５℃の範囲である。Ｐ．オクルタムおよびＰ．アビシィＤＮＡポリメラーゼ酵素については温度は約６５〜７５℃がより好ましい。この合成に必要とされる時間は、温度、核酸の長さおよび酵素に依存して約０．５ 〜４０分またはそれ以上に及ぶことができる。伸長時間は通常約３０秒〜３分である。核酸が長ければ、より長い時間が相補鎖の合成に必要である。
【００９１】
当業者らは、ＰＣＲ法が最も普通には耐熱性酵素を使った自動化法として実施されることを知っているだろう。この方法では、変性領域、プライマーアニーリング領域および反応領域を通して反応混合物の温度が循環される。耐熱性酵素の使用に合わせて特別に改造された機械が Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ 社から市販されている。当業者はまた、前の反応からの増幅された核酸によるＰＣＲの汚染の問題も知っているだろう。この問題を減少させる方法は米国特許出願第６０９，１５７ 号（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に与えられている。
【００９２】
ＰＣＲ増幅は、末端どうし結合した幾つかのプライマー分子の配列を含有する二本鎖副産物であるプライマー二量体またはオリゴマーを生成し得る。その収量は増幅された標的配列の収量に反比例する。熱循環の欠損下でそして標的ＤＮＡの存在下または非存在下で周囲温度および周囲温度下であっても、ＰＣＲ試薬の全部を混合すると常に、非特異的プライミングとプライマー二量体およびオリゴマー形成が起こり得る。
【００９３】
例えば、Ｔａｑ ポリメラーゼは最適温度が約７５〜８０℃であるけれども、３７℃では約１〜２％活性を保持している。非特異的伸長およびプライマー二量体形成を克服する方法としては、最初の増幅サイクルの前に全試薬が一緒にされないような形で、少なくとも１つの試薬を他のものから分離することが挙げられる。ＰＣＴ特許公報第ＷＯ ９１／１２３４２ 号（これは参考として本明細書中に組み込まれる）は、非特異的伸長とプライマー二量体を最少にするための方法および組成物を記載している。
【００９４】
ピロジクチウム種の極端に高い最適増殖温度のため、本発明は非特異的プライマー伸長を最少にするのに有用であろう組成物を提供する。詳しくは、ピロジクチウム・オクルタム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ）とＰ．アビシィ（Ｐ． ａｂｙｓｓｉ）の最適増殖温度は１００ 〜１０５ ℃であり、これは例えばテルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）よりも約３０〜３５℃高い。従って、室温でのピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼの残余活性は最少であると予想され、ＰＣＲの第一サイクルより前に少なくとも１つの試薬を分離する必要性を取り除くことができる。よって、本発明は、ワックスバリヤーや他の試薬分離手段を使用せずにＰＣＲにおける非緊縮アニーリング温度での非特異的伸長を減少させる可能性を提供する。
【００９５】
当業者は、本発明が、ＤＮＡポリメラーゼ活性が効用を有する任意の方法の実施のための新規組成物を提供することを認識するだろう。好ましい態様では、該酵素はＰＣＲによる核酸配列の増幅に有用である。他の増幅方法、特にＰＬＣＲ（Ｂａｒａｎｙ， １９９１， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １ （１）：５−１３）またはギャップ−ＬＣＲ（例えば１９９０年２月８日に発行されたＰＣＴ特許公報第ＷＯ ９０／０１０６９ 号を参照のこと）のような熱変性段階を必要とするものが本発明から役立つだろう。３′−５′エキソヌクレアーゼ欠損 ＰａｂおよびＰｏｃ ＤＮＡポリメラーゼ酵素から循環配列決定法（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ ら， １９８９， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ７：４９４−４９９ 、およびＫｏｏｐら， １９９２， ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １４：４４２−４４７；これらは参考として本明細書中に組み込まれる）が特に有益であろう。
【００９６】
本発明は、本発明の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを含んで成るキットも提供し、好ましくは、１または複数の非イオン性高分子界面活性剤、および所望によりＰＣＲ反応を実施するのに有用な他の試薬、例えば一組のプライマー、プローブまたはヌクレオシド三リン酸前駆体を含有する緩衝液中に前記ポリメラーゼを含んで成る安定な酵素組成物も提供する。
【００９７】
ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応による核酸配列の増幅が有用である多様な方法を実施する際に非常に有用である。そのような方法としては、クローニング、ＤＮＡ配列決定、逆転写および非対称ＰＣＲが挙げられる。更に、本発明の酵素は、診断、法医学および調査用途での使用に適当である。次の例は例示のために与えるのであって本発明の特許請求の範囲を限定するためではない。
【００９８】
実施例１：ピロジクチウム・アビシィＤＮＡライブラリーの作製およびコロニーブロット耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ活性アッセイによる Ｐａｂ ポリメラーゼ遺伝子の同定
ピロジクチウム・アビシィ（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ａｂｙｓｓｉ）細胞はＤｒ． Ｋａｒｌ Ｏ． Ｓｔｅｔｔｅｒ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ， Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ から拝領した。単離物 ＡＶＺ （ＤＳＭ６１５８）は、Ｐｌｅｙら， １９９１， Ｓｙｓｔｅｍ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４：２４５−２５３（これは参考として本明細書中に組み込まれる）中に記載されている。
【００９９】
Ｌａｗｙｅｒら， １９８９， Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６４ （１１）：６４２７−６４３７（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に記載された方法によりＤＮＡを精製した。約２５μｇ のピロジクチウム・アビシィＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分消化し、ゲル電気泳動によりサイズ分画した。３．５ ｋｂよりも大きく且つ８．５ ｋｂより小さい断片 １０ ｎｇを、ｐＵＣ１９ ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， ＣＡ ）のＢａｍＨＩ 部位中へのクローニングに使用した。
【０１００】
ｐＵＣ１９ プラスミドベクターはＢａｍＨＩ クローニング部位の上流にｌａｃ プロモーターを有する。該プロモーターは、プロモーター配列を欠くクローン化された転写解読枠の異種発現を誘導することができる。組換えプラスミドをＥ．コリ ＳＵＲＥ 細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）中に形質転換せしめた。ＳＵＲＥＲ 細胞の遺伝子型はｍｃｒＡ， Δ（ｍｃｒＢＣ−ｈｓｄＲＭＳ−ｍｒｒ）１７１， ｅｎｄＡ１， ｓｕｐＥ４４， ｔｈｉ−１，λ−， ｇｙｒＡ９６， ｒｅｌＡ１， ｌａｃ， ｒｅｃＢ， ｒｅｃＪ， ｓｂｃＣ， ｕｍｕＣ：：Ｔｎ５（ｋａｎＲ ）， ｕｒｖＣ，（Ｆ’， ｐｒｏＡＢ， ｌａｃｌＺΔＭ１５， Ｔｎ１０〔ｔｅｔ Ｒ 〕）である。
【０１０１】
耐熱性および高温性ＤＮＡポリメラーゼ活性の検出用の迅速なフィルターアッセイを使ってピロジクチウム・アビシィゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングした（Ｓａｎｇｅｒら， １９９１， Ｇｅｎｅ ９７：１１９−１２３；これは参考として本明細書中に組み込まれる）。この方法に従って、組換えコロニーをニトロセルロース膜に結合し、そしてα〔３２Ｐ〕標識ｄＮＴＰｓ を含む重合緩衝液中で高温においてインキュベーションする。
【０１０２】
乾燥したフィルターのオートラジオグラフィーにより、高温性ＤＮＡポリメラーゼ活性を発現するコロニーを直接同定することができる。膜に結合させたコロニーを９５℃に加熱して宿主ＤＮＡポリメラーゼを不可逆的に不活性化し、次いで高温でインキュベートして高温性ＤＮＡポリメラーゼ活性の存在を明らかにする。
【０１０３】
ペトリ皿あたり約５００ コロニーを塗抹し、３７℃で一晩増殖させた。続いて、コロニーをニトロセルロース膜上にレプリカ塗抹し、４時間増殖させた。ニトロセルロース膜の上側を下にしてアガロースプレート上に置き、それをクロロホルム／トルエン（１：１）混合物に浸した濾紙上に室温で２０分間置いた。次いで、透過したコロニーを含有する膜を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．８， ７ｍＭ ＭｇＣｌ２， ３ｍＭ β−メルカプトエタノール（βＭｅ）を含有する重合緩衝液中で９５℃にて５分間インキュベートして非耐熱性（例えばＥ．コリ）ＤＮＡポリメラーゼ活性を不活性化した。
【０１０４】
不活性化の直後に、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．８， ７ｍＭ ＭｇＣｌ２， ３ｍＭ βＭｅ， １２μＭ ｄＣＴＰ， １２μＭ ｄＧＴＰ， １２μＭ ｄＡＴＰ， １２μＭ ｄＴＴＰおよび１μＣｉ／ｍｌ のα〔３２Ｐ〕−ｄＧＴＰを含有する重合緩衝液に膜を移した。６５℃で３０分間のインキュベーション後、膜を５％（ｗ／ｖ） ＴＣＡ と１％（ｗ／ｖ） ピロリン酸塩の溶液中で５分間に渡り２回洗浄し、取り込まれなかったα〔３２Ｐ〕−ｄＧＴＰを除去した。−７０℃でのオートラジオグラフィーにより膜を分析した。３日後、複製した膜のＸ線フィルム上に７つのクローンが現れた。
【０１０５】
それらの７つのクローンからプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析を行って挿入断片のサイズとｐＵＣ１９ ベクターに関する挿入断片の方向性を決定した。最大のクローンｐＰａｂ１４に関してＤＮＡ配列分析を行った。Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ， ＭＡから購入した正および逆配列決定用「万能」プライマーそれぞれＮｏ． １２１２および１２３３を使って予備ＤＮＡ配列を得た。予備ＤＮＡ配列から更なる配列決定用プライマーを設計し、クローン化挿入断片の一層内部の領域のＤＮＡ配列を得た。両方の鎖についてＤＮＡ配列分析を実施した。
【０１０６】
実施例２：Ｐａｂ ポリメラーゼ遺伝子の発現
プラスミドｐＤＧ１６８は、λＰＬ プロモーターおよびＮ遺伝子リボソーム結合部位（米国特許第 ４，７１１，８４５号を参照のこと；これは参考として本明細書中に組み込まれる）、ポリリンカー中にクローニングされる配列がλＰＬ −ＮＲＢＳ の調節下で発現され得るように配置された制限部位ポリリンカー、並びにバシラス・スリンジエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）デルタ毒素遺伝子からの転写ターミネーター（米国特許第 ４，６６６，８４８号を参照のこと；これは参考として本明細書中に組み込まれる）を含んで成る、λＰＬ クローニングおよび発現ベクターである。
【０１０７】
プラスミドｐＤＧ１６８は、プラスミドをコピー数に対して温度感受性にする変異ＲＮＡＩＩ遺伝子（米国特許第 ４，６３１，２５７号を参照のこと；これは参考として本明細書中に組み込まれる）およびＥ．コリ Ｋ１２株ＤＧ１１６ 中のアンピシリン耐性遺伝子も担持している。ｐＤＧ１６８の作製は、１９９１年７月１１日に発行されたＰＣＴ特許公報第ＷＯ ９１／０９９５０ 号の実施例６に記載されており、これは参考として本明細書中に組み込まれる。
【０１０８】
それらの要素が協力して働き、有用且つ強力な発現ベクターを提供する。３０〜３２℃では、プラスミドのコピー数は小さく、温度感受性λリプレッサー遺伝子を有する宿主細胞、例えばｃＩ８５７ 中で、ＰＬ プロモーターは機能しない。しかしながら３７〜４１℃では、プラスミドのコピー数は３０〜３２℃の時の２５〜５０倍高く、ｃＩ８５７ リプレッサーが不活性化されてプロモーターが機能できるようになる。よって、Ｐａｂ ＤＮＡポリメラーゼ用の発現ベクターを作製するのにｐＤＧ１６８を選んだ。
【０１０９】
ｐＰａｂ１４のＤＮＡ配列分析は、ヌクレオチド位置８６９ にＡＴＧコドンを有しそしてヌクレオチド位置３２８０にＴＧＡ終結コドンを有する８０３ アミノ酸の転写解読枠を明らかにした。オリゴヌクレオチドプライマー ＡＷ３９７（配列番号５）と ＡＷ３９８（配列番号６）を用いたＰＣＲ増幅によりＰａｂ 遺伝子の５′末端を変異誘発せしめた（後述する）。
【０１１０】
ＡＷ３９７（配列番号５）は、ＡＴＧ出発コドンのところでＰａｂ ＤＮＡ配列を変更せしめてＮｄｅＩ制限部位を導入するように設計された正プライマーである。プライマー ＡＷ３９７（配列番号５）はまた、Ｐａｂ ポリメラーゼ遺伝子配列の第５および６コドン中に変異を導入し、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を変えることなくＥ．コリによるコドン用法とより一層適合できるようにする。逆プライマー ＡＷ３９８（配列番号６）は、アミノ酸位置１７４ に相当するＳｐｅＩ部位を導入するために選択した。その上、ＳｐｅＩ部位の後ろにＫｐｎＩ部位が導入された。
【０１１１】
ＰＣＲ反応混合物は、５０μｌ の反応容量中に、鋳型としてのＳａｌＩで直鎖状にしたｐＰａｂ１４ ＤＮＡ １０ ｎｇ；１０ピコモルのプライマー ＡＷ３９７（配列番号５）および ＡＷ３９８（配列番号６）；各々５０μＭ のｄＡＴＰ， ｄＣＴＰ， ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ；２ ｍＭ ＭｇＣｌ２；１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．３ ；５０ｍＭ ＫＣｌ並びに１単位のＴａｑ ポリメラーゼを含有した。反応温度プロフィールは９５℃で３０秒；６５℃で３０秒および７２℃で３０秒であり、１２サイクルに渡り増幅せしめた。
【０１１２】
５００ ｂｐの増幅生成物をＮｄｅＩとＫｐｎＩで消化し、１％（ｗ／ｖ）Ｓｅａｋｅｍ アガロースゲル上に負荷した。ＧｅｎｅＣｌｅａｎ キット（Ｂｉｏ １０１， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， ＣＡ）を使ってＰＣＲ生成物断片を精製し、そしてＮｄｅＩとＫｐｎＩで消化しておいた発現ベクターｐＤＧ１６８中にサブクローニングした。得られたクローンをｐＡＷ１１１と命名した。制限酵素分析とＤＮＡ配列分析により所望の変異を確認した。
【０１１３】
Ｐａｂ ポリメラーゼ遺伝子の３′末端を制限酵素消化と合成オリゴヌクレオチド二本鎖の使用により変更した。アミノ酸位置７８５ 〜７８６ のＡｆｌＩＩ 部位からのＰａｂ ポリメラーゼ（ｐｏｌ） 遺伝子の３′末端に従って ＡＷ３９９（配列番号７）を設計した。それは同じくＴＧＡ終結コドンをＴＡＡに変更する。 ＡＷ４００（配列番号８）は、それの５′末端にＸｍａＩ粘着末端を有すること以外は ＡＷ３９９（配列番号７）の相補鎖である。 ＡＷ３９９（配列番号７）が ＡＷ４００（配列番号８）にアニールすると、粘着ＡｆｌＩＩ／ＸｍａＩ末端を有する６０ ｂｐ の合成二本鎖を生じる。次いでこの二本鎖を、ＡｆｌＩＩ とＸｍａＩで消化されたプラスミドｐＰａｂ２ 中にクローニングした。得られたプラスミドをｐＡＷ１１３と命名した。
【０１１４】
プラスミドＰａｂ２は、実施例１に記載したようなゲノムライブラリーから単離された７つのクローンのうちの１つであった。プラスミドＰａｂ２は完全なＰａｂ ｐｏｌ 遺伝子を含むが、その５′末端がＰａｂ１４ よりも〜２５０ ｂｐ短い。すなわち、それは隣接する５′末端の ＡｆｌＩＩ部位を欠いており、上述したような３′末端の ＡｆｌＩＩ−ＸｍａＩ断片を合成二本鎖 ＡＷ３９９（配列番号７）／ ＡＷ４００（配列番号８）で置換するクローニング方策を容易にした。置換された断片のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列分析によって確認した。
【０１１５】
最後に、Ｐａｂ ポリメラーゼ遺伝子領域のＳｐｅＩから終結コドンまでの１．８９ ｋｂ 断片を、ＳｐｅＩとＸｍａＩでの消化によりｐＡＷ１１３から単離し、そしてゲル電気泳動により精製した。得られた断片を、ＳｐｅＩとＸｍａＩで消化しておいたプラスミドｐＡＷ１１１と連結せしめた。
【０１１６】
連結条件は、２０μｌ の反応液あたり２０μｇ／ｍｌのＤＮＡ， ２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ７．４， ５０ｍＭ ＮａＣｌ， １０ｍＭ ＭｇＣｌ２， ４０μＭ ＡＴＰ および０．２ Ｗｅｉｓｓ 単位のＴ４ ＤＮＡリガーゼ、１６℃で一晩であった。連結生成物をＤＧ１１６ 宿主細胞中に形質転換せしめた。候補物を適当な制限酵素部位についてスクリーニングした。所望のプラスミドをｐＡＷ１１５と命名した。
【０１１７】
この実施例において使用するオリゴヌクレオチドを下記に示す。
実施例３：ピロジクチウム・オクルタム （Ｐｏｃ） ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のクローニング
Ｐａｂ およびＰｏｃ ゲノムＤＮＡ（各０．５ μｇ ）をＨｉｎｄＩＩＩ で消化し、そして０．８ ％（ｗ／ｖ） アガロースゲルを通したゲル電気泳動により分離した。ピロジクチウム・オクルタム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ）細胞は、Ｄｒ． Ｋａｒｌ Ｏ． Ｓｔｅｔｔｅｒ， Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ， Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ， Ｇｅｒｍａｎｙ から拝領した。Ｌａｗｙｅｒら， １９８９， Ｊ． Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２６４ （１１）：６４２７−６４３７（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に記載された方法によりＤＮＡを精製した。
【０１１９】
ゲル中のＤＮＡ断片を１．５Ｍ ＮａＣｌ および０．５Ｍ ＮａＯＨ 溶液中で３０分間変性せしめ、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．０ および１．５Ｍ ＮａＣｌ の溶液中で３０分間中和し、そして２０×ＳＳＰＥ（３．６Ｍ ＮａＣｌ， ２００ｍＭ ＮａＰＯ４／ｐＨ ７．４， ２０ｍＭ ＥＤＴＡ／ｐＨ ７．４ ）を使ってＢｉｏｄｙｎｅ ナイロン膜（Ｐａｌｌ Ｂｉｏｓｕｐｐｏｒｔ， Ｅａｓｔ Ｈｉｌｌｓ， ＮＹ ）に移行せしめた。次いで膜に結合したＤＮＡを、Ｐａｂ ポリメラーゼ遺伝子のアミノ酸 ５１５〜６１４ をコードする３２Ｐ−標識された２４０ ｂｐのＰＣＲ生成物にハイブリダイズせしめた。
【０１２０】
予備ハイブリダイゼーション溶液は、６×ＳＳＰＥ、５×デンハーツ試薬、０．５ ％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ、１００ μｇ／ｍｌの変性され尖断されたサケ精子ＤＮＡであった。ハイブリダイゼーション溶液は、２×デンハーツ試薬を使用し、そして１０６ ｃｐｍ の３２Ｐ−標識されＰＣＲ増幅されたプローブを含むこと以外は同じであった。予備ハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションは両方とも５５℃で行われた。ブロットを次の通りに順次洗浄した：２×ＳＳＰＥ， ０．５ ％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ 中で室温にて１０分間；２×ＳＳＰＥ， ０．１ ％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ 中で室温にて１５分間；０．１ ％（ｗ／ｖ） ＳＳＰＥ， ０．１ ％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ 中で室温にて５分間。
【０１２１】
ＨｉｎｄＩＩＩ 消化物において約３．８ ｋｂのところに強いシグナルが検出された。これは、Ｐｏｃ ポリメラーゼ遺伝子がＰａｂ ポリメラーゼ遺伝子と相同性を有することを示唆した。従って、Ｐａｂ ポリメラーゼ遺伝子配列から設計した幾つかのＰＣＲプライマーを、Ｐｏｃ ポリメラーゼ遺伝子の一部分の増幅について評価した。プライマー対 ＬＳ４１７（配列番号３４）と ＬＳ３９６（配列番号３５）を使ったＰＣＲから、サイズが２９５ ｂｐの特定のＰＣＲ生成物が得られた。
【０１２２】
【０１２３】
次いで２９５ ｂｐのＰＣＲ生成物をＤＮＡ配列分析にかけた。該ＤＮＡ配列は、Ｐｏｃ ポリメラーゼ遺伝子がこの領域内でＰａｂ ポリメラーゼ遺伝子と７８％の一致を有することを示した。このＤＮＡ配列データを使って、Ｐｏｃ ポリメラーゼ特異的オリゴヌクレオチドプローブ ＡＷ３９４（配列番号９）を設計した。３２Ｐ−標識した ＡＷ３９４（配列番号９）を使ってゲノムＰｏｃ ＤＮＡバンクをスクリーニングし、Ｐｏｃ ポリメラーゼクローンを得た。ゲノムＰｏｃ ＤＮＡバンクの作製は、ゲノムＰａｂ ＤＮＡバンクについて実施例１に記載した通りであった。
【０１２４】
ニトロセルロースフィルター上で約５５，０００個のアンピシリン耐性コロニーを選択し、３２Ｐ−標識した ＡＷ３９４（配列番号９）とハイブリダイズせしめた。該プローブとハイブリダイズした６つのコロニーからプラスミドＤＮＡを単離した。予備ハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーション条件は上述した通りであった。洗浄条件は６×ＳＳＰＥ， ０．５ ％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ 中で室温にて５分間に続き、２×ＳＳＰＥ， ０．１ ％（ｗ／ｖ） ＳＤＳ 中で５５℃にて１５分間であった。制限酵素分析とＰＣＲ分析を行い、挿入断片のサイズおよびｐＵＣ１９ ベクターに関する方向性を決定した。その結果、ｐＰｏｃ３ とｐＰｏｃ５ が同一クローンであることがわかった。同定された全てのＰｏｃ ポリメラーゼクローンのコード領域、５′末端非翻訳領域および３′末端非翻訳領域のサイズを下記に列挙する。
【０１２５】
ｐＰｏｃ４ に関してＤＮＡ配列分析を行った。万能プライマーと逆配列決定用プライマーを使って予備ＤＮＡ配列情報を得た。このＤＮＡ配列から追加の配列決定用プライマーを設計し、挿入断片の一層内部の領域のＤＮＡ配列を得た。ＤＮＡ配列分析は両方の鎖について行った。
【０１２７】
実施例４：Ｐｏｃ ポリメラーゼ遺伝子の発現
オリゴヌクレオチドプライマー ＡＷ４０８（配列番号１０）とＡＷ４０９Ａ（配列番号１１）を用いてＰＣＲ増幅によりプラスミドｐＰｏｃ４ 中のＰｏｃ ポリメラーゼ遺伝子の５′末端を変異誘発せしめた。 ＡＷ４０８（配列番号１０）は、ＡＴＧ開始コドンのところでＰｏｃ 遺伝子のＤＮＡ配列を変更せしめてＮｓｉＩ制限部位を導入するように設計された正プライマーである。
【０１２８】
プライマー ＡＷ４０８（配列番号１０）はまた、Ｐｏｃ 遺伝子の第２，３，５および６コドン中に変異を導入し、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を変えることなくＥ．コリのコドン用法とより一層適合できる配列を提供するように設計された。逆プライマーＡＷ４０９Ａ（配列番号１１）は、アミノ酸位置３８にＸｂａＩ部位を導入するために選択した。その上、その後のサブクローニングのためにＸｂａＩ部位の後ろにＫｐｎＩ部位が導入された。
【０１２９】
ＫｐｎＩで直鎖状にしたプラスミドｐＰｏｃ４ を、 ＡＷ４０８（配列番号１０）／ＡＷ４０９Ａ（配列番号１１）プライマー対を使った増幅のためのＰＣＲ鋳型として使用し、１３８ ｂｐのＰＣＲ生成物を得た。ＰＣＲ増幅手順は実施例２において上述した通りであった。増幅された断片をＮｓｉＩで消化し、次いでクレノウで処理してＮｓｉＩ切断末端を平滑末端にし、そして最後にＫｐｎＩで消化した。
【０１３０】
生じた断片を、ＮｄｅＩで消化した後クレノウで修復して突出末端をフルインして連結用の平滑末端を提供した発現ベクターｐＤＧ１６４（ＰＣＴ特許公報第ＷＯ ９１／０９９５０ 号の実施例６ｂに詳細に記載されており、これは参考として本明細書中に組み込まれる）と連結せしめた。この連結は、λＰＬ プロモーターとバクテリオファージＴ７ 遺伝子１０リボソーム結合部位の調節下にＰｏｃ ポリメラーゼ遺伝子の５′末端のフレーム内コード配列を与えた。得られた構成物をｐＡＷ１１８と命名した。
【０１３１】
Ｐｏｃ ポリメラーゼ遺伝子の３′末端のサブクローニングを行うために、終結コドンの後ろにＫｐｎＩ部位を導入した。これは次のようなＰＣＲ法によって行われた。アミノ酸位置６９８−６９９ にＥｓｐＩ部位を導入する正プライマーを選択し、変更された終結コドン（ＴＡＡ）の直後にＫｐｎＩ部位を組み込むように逆プライマーを設計した。増幅された３３５ ｂｐ断片をＥｓｐＩとＫｐｎＩで消化し、ＥｓｐＩとＫｐｎＩで消化されたプラスミドｐＰｏｃ４ 中にクローニングした。得られた構成物をｐＡＷ１２０と命名した。
【０１３２】
最後に、Ｐｏｃ Ｐｏｌ 遺伝子領域ＸｂａＩから終結コドンまでをＸｂａＩとＫｐｎＩでの消化によりｐＡＷ１２０から単離した。得られた２．３ ｋｂ断片を、ＸｂａＩとＫｐｎＩで消化しておいたｐＡＷ１１８と連結せしめた。この連結生成物を発現用のＤＧ１１６ 宿主細胞中に形質転換せしめ、所望のプラスミドをｐＡＷ１２１と命名した。
【０１３３】
この実施例において使用するオリゴヌクレオチドを下記に示す。
実施例５：トリプトファンプロモーターベクター中での Ｐａｂ ｐｏｌ 遺伝子と Ｐｏｃ ｐｏｌ 遺伝子の発現
Ｐａｂ ｐｏｌ 遺伝子とＰｏｃ ｐｏｌ 遺伝子は、Ｅ．コリのＴｒｐ プロモーターの調節下で過剰発現せしめることができる。発現クローンの作製は次のようにして行った：発現クローンｐＡＷ１１５中のλＰＬ プロモーターを、鋳型としてプラスミドｐＬＳＧ１０（プラスミドｐＬＳＧ１０は米国特許第 ５，０７９，３５２号に記載されており、それは参考として本明細書中に組み込まれる）を使いそしてプライマーとして ＡＷ５００（配列番号１４）と ＡＷ５０１（配列番号１５）を使ったＰＣＲ増幅により生成されたＴｒｐ プロモーターにより置換した。得られたＰＣＲ生成物をＮｓｐＶとＮｄｅＩで消化し、そしてＮｓｐＶとＮｄｅＩで消化されたｐＡＷ１１５中にクローニングし、Ｅ．コリ Ｔｒｐプロモーターの調節下にあるＰａｂ ｐｏｌ 発現クローン ｐＡＷ１１８ を生ぜしめた。
【０１３５】
ｐＡＷ１２１のＰｏｃ ｐｏｌ 遺伝子中の内部ＮｄｅＩ部位は、ＮｓｐＶ−ＮｄｅＩλＰＬ プロモーター断片とＴｒｐ プロモーター断片との交換を複雑にする。従って、ｐＬＳＧ１０からのＴｒｐ プロモーター配列断片の増幅用にプライマー ＡＷ５００（配列番号１４）と ＡＷ５０２（配列番号１６）を設計し、ｐＡＷ１２１からの５′末端の１１０ ｂｐのＮｄｅＩ−ＸｂａＩ断片の増幅用にプライマー ＡＷ５０３（配列番号１７）と ＡＷ５０４（配列番号１８）を設計した。
【０１３６】
ＡＷ５０２（配列番号１６）と ＡＷ５０３（配列番号１７）は９ヌクレオチドが重複している。重複発現ＰＣＲを使って、Ｔｒｐ プロモーター断片と５′末端 １１０ ｂｐ 断片を融合せしめた。得られたＰＣＲ生成物をＮｓｐＶとＸｂａＩで消化し、そしてＮｓｐＶとＸｂａＩで消化しておいたｐＡＷ１２１中にクローニングした。得られたＰｏｃ ｐｏｌ 発現クローンをｐＡＷ１２３と命名した。
【０１３７】
実施例６：３′→５′エキソヌクレアーゼ活性の評価：忠実度アッセイ
ＰＣＲ法により提供される増幅レベルが非常に高いため（１０１１〜 ６×１０１２倍まで）、或る用途には複製の正確度（忠実度）が重要である。ＰＣＲ忠実度は次の２段階過程に基づいている：誤挿入および誤伸長。ＤＮＡポリメラーゼが正しくない塩基を挿入しそして生じた３′−不適正末端が伸長されなければ、下流のプライマー結合部位が存在しないので、この先端が切り取られた伸長生成物を増幅せしめることができない。
【０１３９】
ＤＮＡポリメラーゼは適正３′末端よりも遅く不適正３′末端を伸長する。更に、異なる不適正組合せは異なる速度で広がる。Ｋｗｏｋら， １９９０， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：９９９−１００５ 、およびＨｕａｎｇ ら， １９９２， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２０：４５６７−４５７３を参照のこと。
生来の３′→５′エキソヌクレアーゼ活性またはプルーフリーディング活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、誤挿入された塩基を伸長前に除去することにより忠実度を改善することができる。誤伸長の前に３′末端不適正ヌクレオチドを除去する３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼの能力を評価するために、便利なＰＣＲおよび制限エンドヌクレアーゼ消化アッセイを開発した。
【０１４０】
テルムス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子（Ｌａｗｙｅｒら， １９８９， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４：６４２７−６４３７ および米国特許第 ５，０７９，３５２号）中のＢａｍＨＩ 制限酵素認識配列の最初のヌクレオチドに完全に適合するかまたは３′が不適合である（可能な限りの組合せを有する）数個のプライマーを設計した。完全適合プライマー ＦＲ４３４（配列番号２９）と ＦＲ４３８（配列番号３３）は、ＢａｍＨＩ 制限酵素で完全消化すると１３２ ｂｐと１９ ｂｐ のＤＮＡ断片を生じる１５１ ｂｐ生成物を増幅する。正プライマー ＦＲ４３４（配列番号２９）の３′末端ヌクレオチドは、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド１７７８に相当する。
【０１４１】
正プライマー ＦＲ４３５（配列番号３０）、 ＦＲ４３６（配列番号３１）および ＦＲ４３７（配列番号３２）は、野生型Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌ遺伝子と野生型プライマー ＦＲ４３８（配列番号３３）伸長生成物に関して、それぞれＡ：Ｃ，Ｔ：ＣおよびＣ：Ｃに相当する単一の３′末端不適正組合せを含む。プライマー ＦＲ４３５（配列番号３０）、 ＦＲ４３６（配列番号３１）および ＦＲ４３７（配列番号３２）からの不正確または誤伸長は、Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌ遺伝子のヌクレオチド１７７８−１７８３ に相当するＢａｍＨＩ 認識部位を除去する。あるいは、エキソヌクレオチド分解的プルーフリーディングは３′末端の不適正ヌクレオチドを除去し、そして正しいｄＧ残基の取り込みを可能にし、診断用ＢａｍＨＩ 制限酵素部位を含むようになったＰＣＲ生成物の蓄積をもたらす。
【０１４２】
ＦＲ４３５（配列番号３０）、 ＦＲ４３６（配列番号３１）および ＦＲ４３７（配列番号３２）プライマーは全てがもとの標的に対して不適合であるため、このＰＣＲ／エンドヌクレアーゼ消化アッセイは、「変異体」プライマーを補正しそして診断用ＢａｍＨＩ 開裂部位を含むＰＣＲ生成物を生ぜしめるためにサイクル毎にエキソヌクレオチド分解的プルーフリーディングを必要とする。いずれかのサイクルにおける誤伸長は、次のサイクルにおいて、アッセイに使用するプライマー全てに完全に適合する（プライマー ＦＲ４３８〔配列番号３３〕伸長から）効率的にコピーされた（変異体）鋳型を生じるだろう。
【０１４３】
プライマー ＦＲ４３４（配列番号２９）はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１７６０〜１７７８に全く同一であり、そしてプライマー ＦＲ４３８（配列番号３３）はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１８９１〜１９１０に相補的である。プライマー ＦＲ４３５（配列番号３０）、 ＦＲ４３６（配列番号３１）および ＦＲ４３７（配列番号３２）はＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド１７６０〜１７７７に全く同一であり、そして１７７８位に（＊，下線によって）指摘した３′末端不適正ヌクレオチドを含有する。
【０１４５】
組換えＰａｂ およびＰｏｃ ＤＮＡポリメラーゼは、それぞれプラスミドｐＡＷ１１５またはｐＡＷ１２１を含むＥ．コリ Ｋ１２のＤＧ１１６ 株から精製した。この精製は、実施例９に従って、細胞溶解、７５〜８５℃での加熱処理、大量核酸のポリミンＰ沈澱、フェニルセファロースクロマトグラフィーおよびヘパリンセファロースクロマトグラフィーを伴った。
【０１４６】
この忠実度アッセイを使って、野生型組換えＰａｂ およびＰｏｃ ＤＮＡポリメラーゼは不適正プライマー ＦＲ４３５（配列番号３０）、 ＦＲ４３６（配列番号３１）および ＦＲ４３７（配列番号３２）を補正し、必要なＢａｍＨＩ 開裂部位を含有するＰＣＲ生成物を生ぜしめることができる。これは３′→５′エキソヌクレオチド分解的プルーフリーディング活性の存在を証明する。
【０１４７】
実施例７：Ｐａｂ ｐｏｌ および Ｐｏｃ ｐｏｌ の３′→５′エキソヌクレアーゼ変異体の製造
Ａｓｐ１８７とＧｌｕ１８９のコドンをアラニンコドンに変更するのに重複伸長ＰＣＲによる部位特異的突然変異誘発を使って、３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を欠くＰａｂ およびＰｏｃ ｐｏｌ 遺伝子を作製した。簡単に言えば、重複伸長ＰＣＲによる突然変異誘発は、独立的ＰＣＲ反応に相補的オリゴプライマーを含めることによる、ＤＮＡ断片の作製を含む（この方法の詳細な説明については、Ｈｉｇｕｃｈｉ ら， １９８８， Ｎｕｃ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １６：７３５１−７３６７、およびＨｏら， １９８９， Ｇｅｎｅ ７７：５１−５９を参照のこと；これらは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１４８】
該方法によれば、それらの断片は、重複末端がアニールする次の「融合」反応において組み合わされ、各鎖の３′重複部分が相補鎖の３′伸長のためのプライマーとして働けるようにする。得られた融合生成物はＰＣＲにより更に増幅される。重複しているオリゴプライマー中にヌクレオチド変異を組み込むことにより、ヌクレオチド配列中に特異的変異を導入することができる。
【０１４９】
Ｐａｂ の３′→５′エキソヌクレアーゼ欠失変異体の作製は次のようにして行った。Ａｓｐ１８７〜Ｇｌｕ１８９に及び、そのＡｓｐ１８７とＧｌｕ１８９の両方がアラニンにより置換されている、重複した２つのプライマー ＡＷ４９３（配列番号２０）と ＡＷ４９４（配列番号２１）を設計した。それぞれアミノ酸位置１７４−１７５ とアミノ酸位置３０４−３０５ のユニークＳｐｅＩとＮｓｉＩ制限部位のところに位置し、かくして融合生成物を発現ベクターにもう一度連結できるようにするために、２つの外部プライマー ＡＷ４９２（配列番号１９）と ＡＷ４９５（配列番号２２）を選択した。
【０１５０】
プライマーセット ＡＷ４９２（配列番号１９）／ ＡＷ４９３（配列番号２０）と ＡＷ４９４（配列番号２１）／ ＡＷ４９５（配列番号２２）はそれぞれ７０ ｂｐ と３７３ ｂｐの断片であった。生じた２断片（２７ヌクレオチドが３′重複している）を、次のプライマー伸長反応での変性とアニーリングによって融合せしめた。４１６ ｂｐの融合生成物を、２つの外部プライマー ＡＷ４９２（配列番号１９）と ＡＷ４９５（配列番号２２）を使ったＰＣＲにより更に増幅せしめた。次いで変異誘発された４１６ ｂｐ断片をＳｐｅＩとＮｓｉＩで切断し、同じくＳｐｅＩとＮｓｉＩで切断された親クローンｐＡＷ１１５中にもう一度連結せしめた。生じた変異体クローンをｐｅｘｏ−Ｐａｂと命名し、所望の変異を配列分析により確認した。
【０１５１】
同様に、同じアプローチを使ってＰｏｃ の３′→５′エキソヌクレアーゼ欠損変異体を作製した。突然変異を導入するのに使った重複プライマーは ＡＷ４８９（配列番号２４）と ＡＷ４９０（配列番号２５）である。２つの外部プライマー ＡＷ４８８（配列番号２３）と ＡＷ４９１（配列番号２６）は、それぞれアミノ酸位置３７−３９ と２６０−２６２ のユニークＸｂａＩおよびＢｓｓＨＩＩ制限部位のところに位置する。
【０１５２】
プライマーセット ＡＷ４８８（配列番号２３）／ ＡＷ４８９（配列番号２４）と ＡＷ４９０（配列番号２５）／ ＡＷ４９１（配列番号２６）を使ったＰＣＲからの生成物は、それぞれ４７６ ｂｐと２４３ ｂｐの断片であった。それらの２断片を融合せしめ、そして外部プライマー ＡＷ４８８（配列番号２３）と ＡＷ４９１（配列番号２６）を使ったＰＣＲ増幅にかけた。次いで変異誘発された断片をＸｂａＩとＢｓｓＨＩＩで切断し、親クローンｐＡＷ１１５中にもう一度連結せしめた。生じた変異体クローンをｐｅｘｏ−Ｐｏｃと命名した。
【０１５３】
不適正組合せ含有プルーフリーディングアッセイを使ってｐｅｘｏ−Ｐａｂ ＤＮＡポリメラーゼとｐｅｘｏ−Ｐｏｃ ＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性を調べた。その結果は、ｐｅｘｏ−Ｐａｂ ｐｏｌとｐｅｘｏ−Ｐｏｃ ｐｏｌの両方が３′→５′エキソヌクレアーゼ活性を欠いていることを示した。
【０１５４】
実施例８：ＰＣＲにおける Ｐａｂ ｐｏｌ ， Ｐｏｃ ｐｏｌ および Ｔａｑ ｐｏｌ の耐熱性の比較
高温菌ピロジクチウム属の増殖温度の上限は１１０ ℃である。精製された組換えＰａｂ ｐｏｌ， Ｐｏｃ ｐｏｌおよびＴａｑ ｐｏｌ のＰＣＲ法における耐熱性を試験するために、次の実験を実施した：０．１ ｐｇ， １ ｐｇおよび１０ ｐｇ のＭ１３ ＤＮＡ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｂｅｖｅｒｌｙ ＭＡ ）をＰａｂ， ＰｏｃおよびＴａｑ によるＰＣＲ分析のための鋳型として使用した。反応液を９５℃または１００ ℃の変性温度で２５， ３０， ３５および４０サイクルにかけた。プライマーとしてＢＷ３６（配列番号２７）とＢＷ４２（配列番号２８）を使うことにより、３５０ ｂｐのＰＣＲ生成物を生ぜしめた。
【０１５６】
【０１５７】
Ｐａｂ ＤＮＡポリメラーゼの１単位とＰｏｃ ＤＮＡポリメラーゼの１単位は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼと同様に、７４℃にて３０分間あたり１０ナノモルの全ｄＮＴＰｓ を酸不溶性物質中に組み込むであろう酵素の量として定義される。Ｐｏｃ およびＰａｂ ＤＮＡポリメラーゼは、反応液組成に次のような変化を伴って、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼについて米国特許第 ４，８８９，８１８号（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に記載された通りにアッセイされる。Ｐａｂ ＤＮＡポリメラーゼ：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．３ （２５ ℃）， １００ｍＭ ＫＣｌ， ５ｍＭ ＭｇＣｌ２ 。Ｐｏｃ ＤＮＡポリメラーゼ：Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０ （２５ ℃）， １０ｍＭ ＫＣｌ， ５ｍＭ ＭｇＣｌ２。
【０１５８】
Ｐａｂ 用の１×ＰＣＲ緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．４， １００ｍＭ ＫＣｌ， １．５ｍＭ ＭｇＣｌ２ 。Ｐｏｃ 用の１×ＰＣＲ緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．４， １０ｍＭ ＫＣｌ， １．０ｍＭ ＭｇＣｌ２。Ｔａｑ 用の１×ＰＣＲ緩衝液：２０ｍＭ Ｔｒｉｓ， ｐＨ ８．４， ５０ｍＭ ＫＣｌ， １．５ｍＭ ＭｇＣｌ２。増幅プロフィールは、９５℃または１００ ℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のプライマーアニーリングおよび伸長を含む。結果は、Ｐａｂ ｐｏｌ およびＰｏｃ ｐｏｌ は極端に耐熱性であり、１００ ℃までの変性温度を使用するＰＣＲにおいて効率的に機能することを示した。対照的に、Ｔａｑ ｐｏｌ は１００ ℃のそれらの条件下では全く生成物をもたらさなかった。
【０１５９】
実施例９：組換えピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼの精製
組換えピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼは次のようにして精製する。簡単に言えば、細胞を１容のＴＥ緩衝液（１ｍＭ ＤＴＴ を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ７．５，および１．０ｍＭ ＥＤＴＡ）中で解凍し、そしてプロテアーゼ阻害剤（２．４ｍＭ にＰＭＳＦ〔フェニルメチルスルホニルフルオリド〕、１μｇ／ｍｌにロイペプチン、および０．２ｍＭ にＴＬＣＫ〔（−）−１−クロロ−３−トシルアミド−７−アミノ−２−ヘプタノン塩酸塩〕）を添加する。
【０１６０】
細胞を２０，０００ ｐｓｉにてＡｍｉｎｃｏフレンチプレッシャーセル中で溶解せしめ、超音波処理して粘度を低下させる。超音波処理液をＴＥ緩衝液で希釈し、そして湿潤細胞重量の５．５ 倍にプロテアーゼ阻害剤を添加し（画分Ｉ）、０．２Ｍ硫酸アンモニウムに調整し、そして素早く８５℃に加熱して８５℃で１５分間維持する。加熱処理した上清を素早く０℃に冷却し、そして２０，０００×Ｇで３０分間の遠心の後、Ｅ．コリ細胞膜と変性タンパク質を除去する。
【０１６１】
ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼを含有する上清（画分ＩＩ）を保存する。核酸の＞９５％を沈澱せしめるのに必要なポリミンＰのレベルを試行沈澱によって決定する（通常は０．６ 〜１％ ｗ／ｖの範囲）。０℃で３０分間迅速に攪拌しながら所望量のポリミンＰをゆっくり添加し、上清を２０，０００×Ｇで３０分間遠心し、沈澱した核酸を除去する。ピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼを含有する上清（画分ＩＩＩ ）を保存する。
【０１６２】
画分ＩＩＩ を０．３ Ｍ硫酸アンモニウムに調整し、そして５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ７．５， ０．３Ｍ 硫酸アンモニウム， １０ｍＭ ＥＤＴＡ および１ｍＭ ＤＴＴ 中で平衡化されているフェニルセファロースカラムに適用する。該カラムを２〜４カラム容積の同緩衝液で洗浄し（Ａ２８０ がベースラインに達するまで）、次いで１〜２カラム容積の５０ｍＭ ＫＣｌ含有ＴＥ緩衝液で洗浄してＥ．コリ汚染タンパク質の大部分を除去する。次いで５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ７．５， ２Ｍ 尿素， ２０％（ｗ／ｖ） エチレングリコール， １０ｍＭ ＥＤＴＡ および１ｍＭ ＤＴＴ を含有する緩衝液を用いてカラムからピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼを溶出せしめ、そしてＤＮＡポリメラーゼ活性を有する画分をプールする（画分ＩＶ）。
【０１６３】
組換えピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼの最終精製は、ヘパリンセファロースクロマトグラフィー、アニオン交換クロマトグラフィー、またはＡｆｆｉｇｅｌ ブルークロマトグラフィーを使って達成される。組換えピロジクチウムＤＮＡポリメラーゼを２．５ ×貯蔵緩衝液〔５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．０， ２５０ｍＭ ＫＣｌ， ２．５ｍＭ ＤＴＴ， ０．２５ｍＭ ＥＤＴＡ， ０．５％（ｗ／ｖ） Ｔｗｅｅｎ−２０〕中に透析し、１．５ 容の無菌８０％（ｗ／ｖ） グリセロールと混合し、そして−２０℃で貯蔵することができる。
【０１６４】
実施例 １０：ピロジクチウム・オクルタムＤＮＡポリメラーゼの耐熱性
ピロジクチウム・オクルタム（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ｏｃｃｕｌｔｕｍ）ＤＮＡポリメラーゼの耐熱性は、様々な時間の長さに渡り１００ ℃でインキュベーションした後で該活性を測定することにより評価した。ＰＣＲ増幅条件を模倣するつもりであるがＤＮＡ合成が起こらないように選択された混合物中で、ＤＮＡポリメラーゼをインキュベートした。該酵素混合物は次の試薬を含んだ：
【０１６５】
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ８．０
５０ｍＭ ＫＣｌ
２００ μＭ ｄＡＴＰ
１ｍＭ ＭｇＣｌ２
０．１ μｇ の一本鎖ＤＮＡ
２０ピコモルのプライマー（３０塩基オリゴマー）
【０１６６】
活性を測定するために、インキュベートした酵素混合物５μｌ を、次の試薬から成る反応混合物４５μｌ に添加した：
１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８．０
６ｍＭ ＭｇＣｌ２
７５ｍＭ ＫＣｌ
１ｍＭ β−メルカプトエタノール
各２００ μＭ のｄＡＴＰ， ｄＴＴＰおよびｄＧＴＰ
２００ μＭ の〔α−３３Ｐ〕ｄＣＴＰ
２．５ μｇ の活性化されたサケ精子ＤＮＡ
活性は７５℃で１０分間の間に取り込まれたｄＮＭＰの量として測定された。
【０１６７】
ある実施態様では、０，１，２および４時間の間インキュベーションを実施した。４時間より少ない時間インキュベートした反応液は、全ての活性アッセイを一緒に実施するために全てのインキュベーションが間隙するまで氷上に維持しておいた。測定された活性を、各高温インキュベーション後に残存している初活性の比率として表示し、下記に与える。
【０１６８】
１００ ℃での０， １， ２， ３， ４， ６， ７ および８ 時間のインキュベーションを使って同様な実験を行った。その結果を下記に与える。
１００ ℃で８時間のインキュベーション後でさえも、検出可能な活性の低下は全く観察されなかった。ピロジクチウム・アビシィ（Ｐｙｒｏｄｉｃｔｉｕｍ ａｂｙｓｓｉ）からのＤＮＡポリメラーゼの耐熱性も同様であると予想される。
【０１７１】
実施例 １１： Ｅｘｏ − 欠失変異体
ポリメラーゼ活性を保持しながらエキソヌクレアーゼ活性を欠いているアミノ（Ｎ）末端欠失変異体ＤＮＡポリメラーゼを作製した。３６６， ３８６および４０３ アミノ酸が欠失しており、それぞれ４８， ４６および４４キロダルトン（ｋＤａ） のタンパク質を生じる３種の「小型」Ｐａｂ ＤＮＡポリメラーゼを製造した。後述の通り変異体ポリメラーゼ遺伝子を作製し発現せしめた。
【０１７２】
Ｐａｂ ＤＮＡポリメラーゼをコードする全長配列の部分配列を、下記に示すプライマーを使って発現プラスミドｐＡＷ１１５から増幅せしめた。上流プライマー ＡＷ５９４， ＡＷ５９３ およびＡＷ５７６ の各々は、ＡＴＧ開始コドンを導入し、ＡＴＧ開始コドンの前にＮｄｅＩ制限部位を導入し、そして最初の６コドンの中に幾つかの変異を導入し、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を変えずにＥ．コリのコドン用法とより適合性である配列を提供する。
【０１７３】
プライマー ＡＷ５９４はアミノ酸３６７ 位と３６８ 位の間にＡＴＧ開始コドンを導入し、３６６ アミノ酸欠失変異体をもたらす。同様に、プライマー ＡＷ５９３はアミノ酸３８７ 位と３８８ 位の間にＡＴＧ開始コドンを導入し、３８６ アミノ酸欠失変異体をもたらし、そしてプライマー ＡＷ５７６はアミノ酸 ４０４位と ４０５位の間にＡＴＧ開始コドンを導入し、４０３ アミノ酸欠失変異体をもたらす。単一の下流プライマー ＡＷ５７７は、アミノ酸４５４ 位に相当するＡｐａＩ部位を含む各増幅用に使用した。それらのプライマーの配列を５′から３′方向において下記に与える。
【０１７４】
各増幅は、鋳型として１００ ｐｇの直鎖状にしたｐＡＷ１１５を使って５０μｌ の反応容量において次の条件下で実施した：１０ピコモルの各プライマー、５０μＭ の各ｄＮＴＰ、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２ 、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ， ｐＨ ８．８ 、１０ｍＭ ＫＣｌおよび１ＵのＵｌＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ， Ｎｏｒｗａｌｋ， ＣＴ ）。増幅のための温度プロフィールは、各々が９５℃で３０秒と５５℃で３０秒とから成る２０サイクルであった。
【０１７６】
増幅生成物をＮｄｅＩとＡｐａＩで消化し、アガロースゲル電気泳動を使って精製した。精製した生成物をＮｄｅＩとＡｐａＩで消化されたｐＡＷ１１５中にサブクローニングし、それによって元の１３６４塩基の断片を２６６， ２０６または１５５ 塩基の増幅挿入断片により置換した。得られたクローンをｐＡＷ１２６（４０３ アミノ酸欠失変異体）、ｐＡＷ１２９（３８６ アミノ酸欠失変異体）、およびｐＡＷ１３０（３６６ アミノ酸欠失変異体）と命名した。置換された断片のＤＮＡ配列をＤＮＡ配列分析により確認した。
【０１７７】
得られた発現ベクターの各々を、本質的に前の実施例に記載された通りに、Ｅ．コリ中で発現せしめた。４８および４６ ｋＤａタンパク質の発現は中程度であったが、一方４４ ｋＤａタンパク質の発現は非常に高かった。熱処理した各タンパク質の粗抽出物は、実施例１０に記載の活性アッセイを使って分析するとポリメラーゼ活性を示した。
【０１７８】
ＡＴＣＣ 寄託
下記のバクテリオファージおよび菌株は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ），１２３０１ Ｐａｒｋｌａｗｎ Ｄｒｉｖｅ， Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ， Ｍａｒｙｌａｎｄ， Ｕ．Ｓ．Ａ． に寄託された。それらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブタペスト条約およびその規則（ブタペスト条約）の規定のもとに行われた。これは寄託日から３０年間に渡る生存培養物の維持を保証する。
【０１７９】
寄託生物は、ブタペスト条約の規定のもと、そして関連する米国特許および／または外国特許もしくは特許出願の刊行物の発行後の無制限の入手可能性を保証するという出願人とＡＴＣＣとの協定を条件として、ＡＴＣＣにより入手可能にされるだろう。寄託された菌株の入手可能性は、いずれかの政府の権限のもとにその特許法に従って認められる権利に反して本発明を実施するための認可であると解してはならない。
【０１８０】
上述した明細書は、当業者が本発明を実施できるのに十分であると考えられる。寄託した態様は本発明の１つの観点の例示のつもりであるため、本発明は寄託された細胞系により範囲を限定されるべきではなく、機能的に等価であるいずれの細胞系も本発明の範囲内に含まれる。材料の寄託は本明細書に書かれた記載が本発明のいずれかの観点の実施（最良の実施形態を含む）を可能にするのに不十分であるという容認を構成するものではなく、また寄託物は特許請求の範囲をそれらが表示する特定の説明に限定するものであると解釈されるべきではない。実際、上記説明から、当業者には上記のものの他に本発明の様々な変形が明白であろうし、それらは本発明の特許請求の範囲内に含まれるだろう。
【０１８２】
【配列表】
Claims (16)
- 配列番号：２または配列番号：４のＮ−末端からＣ−末端までのアミノ酸配列を有する熱安定性DNAポリメラーゼ。
- 請求項１に記載の熱安定性DNAポリメラーゼの組換え誘導体であって、配列番号：２のアミノ酸配列に対して１次構造において１〜数個のアミノ酸残基の欠失または付加による修飾を有し、この修飾が、得られる熱安定性酵素の酵素的性質を破壊せず、この酵素的性質が、
（a）ヌクレオシドトリホスフェートの結合による核酸鋳型鎖に相補的な核酸鎖の形成を触媒し；
（b）100℃以下の変性温度を用いるポリメラーゼ連鎖反応において、効果的に機能することが出来；そして
（c）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する；
である、組換え誘導体。 - 請求項１に記載の熱安定性DNAポリメラーゼの組換え誘導体であって、配列番号：４のアミノ酸配列に対して１次構造において１〜数個のアミノ酸残基の欠失または付加による修飾を有し、この修飾が、得られる熱安定性酵素の酵素的性質を破壊せず、この酵素的性質が、
（a）ヌクレオシドトリホスフェートの結合による核酸鋳型鎖に相補的な核酸鎖の形成を触媒し；
（b）100℃以下の変性温度を用いるポリメラーゼ連鎖反応において、効果的に機能することが出来；そして
（c）３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する；
である、組換え誘導体。 - 70℃と80℃との間に最適活性を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の熱安定性DNAポリメラーゼ。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の熱安定性DNAポリメラーゼをコードするDNA。
- 配列番号：１のヌクレオチド配列を有する、請求項５に記載のDNA。
- 配列番号：３のヌクレオチド配列を有する、請求項５に記載のDNA。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の熱安定性DNAポリメラーゼをコードするDNAを含んで成る組換えDNAベクター。
- pPoc4（ATCC No．69309またはpPab14（ATCC No．69310）である請求項８に記載の組換えDNAベクター。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の熱安定性DNAポリメラーゼをコードするDNA配列を含んで成るDNAベクターにより形質転換された宿主細胞。
- 請求項10に記載の宿主細胞により生産される、ピロデイクチューム（Pyrodictum）DNAポリメラーゼ活性を示すポリペプチド。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の熱安定性DNAポリメラーゼまたは請求項11に記載のポリペプチドの製造方法において、
（a）請求項１〜４のいずれか1項に記載の熱安定性DNAポリメラーゼまたは請求項11に記載のポリペプチドをコードする組換えDNAベクターにより形質転換された宿主細胞を培養し；そして
（b）培養物から、前記宿主細胞において生産された熱安定性DNAポリメラーゼを単離する；
ことを含んで成る方法。 - 請求項１〜４のいずれか１項に記載の熱安定性DNAポリメラーゼまたは請求項11に記載のポリペプチドを用いることを特徴とする、核酸の増幅方法。
- 核酸の増幅のための、請求項１〜４のいずれか１項に記載の熱安定性DNAポリメラーゼまたは請求項11に記載のポリペプチドの使用方法。
- 請求項１〜４のいずれか１項に記載の熱安定性DNAポリメラーゼもしくは請求項11に記載のポリペプチド、または１もしくは複数の非イオン性高分子界面活性剤を含有する緩衝剤中に前記ポリメラーゼを含んで成る安定な酵素組成物、を含んで成るPCR用キット。
- プライマー、プローブまたはヌクレオシドトリホスフェート前駆体を更に含む、請求項15に記載のキット。
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