JPH04141098A - Ｒｎａ検出用試薬及びそれを用いたｒｎａの検出方法 - Google Patents
Ｒｎａ検出用試薬及びそれを用いたｒｎａの検出方法Info
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- JPH04141098A JPH04141098A JP2262457A JP26245790A JPH04141098A JP H04141098 A JPH04141098 A JP H04141098A JP 2262457 A JP2262457 A JP 2262457A JP 26245790 A JP26245790 A JP 26245790A JP H04141098 A JPH04141098 A JP H04141098A
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-
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は、ＲＮＡが持つ特定の塩基配列を増もさせるこ
とにより該ＲＮＡが存在しているか否尤を検出する方法
に関する。
とにより該ＲＮＡが存在しているか否尤を検出する方法
に関する。
［従来の技術］
ＰＣＲ法に代表される遺伝子増幅法は、特定幼基配列を
持った核酸を短時間で特異的に検出する目的において優
れた方法である。遺伝子増幅は、５ａｉｋｉらが、開発
したＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉ
。
持った核酸を短時間で特異的に検出する目的において優
れた方法である。遺伝子増幅は、５ａｉｋｉらが、開発
したＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉ
。
法（以下、略してＰＣＲ法： ５ｃｉｅｎｃｅ、２３
０．１３５０＜１９８５））がある、しかし、ＰＣＲ法
での遺伝子増幅の鋳型となる核酸は、ＤＮＡの形で提供
されなくてはならず、本発明が対象とするＲＮＡ試料で
は、直接、遺伝子増幅を行わせることができない従って
、ＲＮＡをＰＣＲ法により検出するなめにはＲＮＡが持
つ遺伝情報をＤＮＡ上に移してやる必要がある。遺伝情
報のＲＮＡからＤＮＡへの変換には逆転写酵素を用いる
。実１ＩＩＩ室レベルでは、逆転写反応を行う際、遺伝
子増幅に働＜ＰＣＲ反応とは別々の反応容器において逆
転写酵素用緩衝液を用い反応を行っており、したがって
、次のＰＣＲ反応のために反応液の組成変更のため試薬
を調製し直しなり、容器を移し替えなければならない、
これらの操作は長時間を要し繁雑で人の手作業に頼るほ
か手段がなかった。特に反応液組成の変更には通常行わ
れているフェノール処理、クロロホルム処理、エタノー
ル沈澱などのＤＮＡ精製作業を伴い繁雑で時間のかがる
作業である。
０．１３５０＜１９８５））がある、しかし、ＰＣＲ法
での遺伝子増幅の鋳型となる核酸は、ＤＮＡの形で提供
されなくてはならず、本発明が対象とするＲＮＡ試料で
は、直接、遺伝子増幅を行わせることができない従って
、ＲＮＡをＰＣＲ法により検出するなめにはＲＮＡが持
つ遺伝情報をＤＮＡ上に移してやる必要がある。遺伝情
報のＲＮＡからＤＮＡへの変換には逆転写酵素を用いる
。実１ＩＩＩ室レベルでは、逆転写反応を行う際、遺伝
子増幅に働＜ＰＣＲ反応とは別々の反応容器において逆
転写酵素用緩衝液を用い反応を行っており、したがって
、次のＰＣＲ反応のために反応液の組成変更のため試薬
を調製し直しなり、容器を移し替えなければならない、
これらの操作は長時間を要し繁雑で人の手作業に頼るほ
か手段がなかった。特に反応液組成の変更には通常行わ
れているフェノール処理、クロロホルム処理、エタノー
ル沈澱などのＤＮＡ精製作業を伴い繁雑で時間のかがる
作業である。
［問題を解決するための手段および作用］逆転写反応と
ＰＣＲ反応において、それぞれ機能する逆転写酵素と耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）
がともに活性を維持し人為的に両酵素活性を制御できる
環境をつくる必要がある。さらに、画反応の切り替えを
簡便にするため、逆転写酵素とＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼを反応液中に同時に存在させてきておき、温度コント
ロールのみで反応が切り替わるようにする。
ＰＣＲ反応において、それぞれ機能する逆転写酵素と耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼ（ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ）
がともに活性を維持し人為的に両酵素活性を制御できる
環境をつくる必要がある。さらに、画反応の切り替えを
簡便にするため、逆転写酵素とＴａｑＤＮＡポリメラー
ゼを反応液中に同時に存在させてきておき、温度コント
ロールのみで反応が切り替わるようにする。
逆転写反応およびＤＮＡポリメラーゼによる遺伝子増幅
反応はともにプライマー延長反応でありそれぞれの酵素
は基質に４種のデオキシヌクレオチド３リン＊（ｄＡＴ
’Ｐ、ｄＧＴＰ−ｄＣＴＰ、ＴＴＰ）を利用する。また
両酵素は最大活性を得るための至適水素イオン濃度や１
価あるいは２価陽イオンの至適濃度も近似しており、反
応用緩衝液は兼用し得る。水素イオン濃度についてはｐ
Ｈ８、０〜９．０の範囲にあればよい、また、１価陽イ
オンについて、例えば１価陽イオンとしてに°を用いた
場合２０〜８０ｍＭがよい、また、 ２価陽イオンとし
てＭｇ ２−を用いた場合１．５〜３ｍＭがよい０両酵
素について大きく異なるのは至適温度であり逆転写酵素
は３７〜４２℃、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは７０〜７
５℃である。この違いを利用すれば逆転写反応がら、遺
伝子増幅反応への切り替えは反応室の温度をｍｍするの
みでよい、実際、遺伝子増幅反応は、熱変性、アニリン
グ、プライマーがらの鎖長反応とから成っており、熱変
性時の温度（９０〜９６℃）で逆転写酵素は失活させら
れる。したがって遺伝子増幅反応に移行した時点で不要
となった逆転写酵素活性は除去されることになる。一方
、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは逆転写反応中は至適温度
よりがなり低い９−で活性は低下しているが、その間に
不可逆的に失活させられることはなく、遺伝子増幅反応
に移行することでＤＮＡポリメラーゼ活性を発揮する。
反応はともにプライマー延長反応でありそれぞれの酵素
は基質に４種のデオキシヌクレオチド３リン＊（ｄＡＴ
’Ｐ、ｄＧＴＰ−ｄＣＴＰ、ＴＴＰ）を利用する。また
両酵素は最大活性を得るための至適水素イオン濃度や１
価あるいは２価陽イオンの至適濃度も近似しており、反
応用緩衝液は兼用し得る。水素イオン濃度についてはｐ
Ｈ８、０〜９．０の範囲にあればよい、また、１価陽イ
オンについて、例えば１価陽イオンとしてに°を用いた
場合２０〜８０ｍＭがよい、また、 ２価陽イオンとし
てＭｇ ２−を用いた場合１．５〜３ｍＭがよい０両酵
素について大きく異なるのは至適温度であり逆転写酵素
は３７〜４２℃、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼは７０〜７
５℃である。この違いを利用すれば逆転写反応がら、遺
伝子増幅反応への切り替えは反応室の温度をｍｍするの
みでよい、実際、遺伝子増幅反応は、熱変性、アニリン
グ、プライマーがらの鎖長反応とから成っており、熱変
性時の温度（９０〜９６℃）で逆転写酵素は失活させら
れる。したがって遺伝子増幅反応に移行した時点で不要
となった逆転写酵素活性は除去されることになる。一方
、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは逆転写反応中は至適温度
よりがなり低い９−で活性は低下しているが、その間に
不可逆的に失活させられることはなく、遺伝子増幅反応
に移行することでＤＮＡポリメラーゼ活性を発揮する。
これら反応は同一反応容器内で全て進行し途中に試料の
分注、試薬の添加は伴わず容器外からの加熱、冷却のみ
で行われる。そのためコンピューターにより温度や時間
を任意のプログラムによって制御できる恒温槽があれば
途中、入手を要する部分はない。
分注、試薬の添加は伴わず容器外からの加熱、冷却のみ
で行われる。そのためコンピューターにより温度や時間
を任意のプログラムによって制御できる恒温槽があれば
途中、入手を要する部分はない。
本発明における逆転写反応から増幅反応に至る工程を述
べる。まず試料中に検出されるべき配列を持ったＲＮＡ
分子が存在すれば、オリゴヌクレオチドがプライマーと
なりＲＮＡを鋳型として逆転写酵素が相補的ＤＮＡ［を
合成する。この反応でプライマーとして機能するオリゴ
マーは、後のＰＣＢ反応による遺伝子増幅でプライマー
となる特定配列にアニーリングする配列を持ったオリゴ
マーを用いてもよいし、または、ＲＮＡｇ上、不特定の
箇所からプライミングを行わせるような６１体前後のラ
ンダムプライマーを逆転写反応時に用いてもよい、逆転
写反応は、ＰＣＲ反応によって増幅される領域の鋳型と
なる相補的ＤＮＡが生成すればよいので、増幅反応で検
出されうる必要量の標的配列のコピー数が得られるよう
に調節し過剰な逆転写酵素の添加による逆転写反応は、
後に統（Ｔａｑポリメラーゼによる増幅反応を阻害する
から避けるべきである。逆転写反応終了後、増幅反応の
最初のステップである熱変性の工程に入る。この工程で
は反応系の温度を９４℃戸で上昇させ、新生ＤＮＡＭが
１＊鎖とし、増幅反応に利用されるプライマーのアニー
リング準備をする。
べる。まず試料中に検出されるべき配列を持ったＲＮＡ
分子が存在すれば、オリゴヌクレオチドがプライマーと
なりＲＮＡを鋳型として逆転写酵素が相補的ＤＮＡ［を
合成する。この反応でプライマーとして機能するオリゴ
マーは、後のＰＣＢ反応による遺伝子増幅でプライマー
となる特定配列にアニーリングする配列を持ったオリゴ
マーを用いてもよいし、または、ＲＮＡｇ上、不特定の
箇所からプライミングを行わせるような６１体前後のラ
ンダムプライマーを逆転写反応時に用いてもよい、逆転
写反応は、ＰＣＲ反応によって増幅される領域の鋳型と
なる相補的ＤＮＡが生成すればよいので、増幅反応で検
出されうる必要量の標的配列のコピー数が得られるよう
に調節し過剰な逆転写酵素の添加による逆転写反応は、
後に統（Ｔａｑポリメラーゼによる増幅反応を阻害する
から避けるべきである。逆転写反応終了後、増幅反応の
最初のステップである熱変性の工程に入る。この工程で
は反応系の温度を９４℃戸で上昇させ、新生ＤＮＡＭが
１＊鎖とし、増幅反応に利用されるプライマーのアニー
リング準備をする。
それと同時に逆転写酵素は失活し、耐熱性ＤＮＡポリメ
ラーゼの活性のみとなる０次に反応系の温度を低下させ
（３７〜６５℃）プライマーのアニーリングの工程には
いる。この工程は、新生ＤＮＡ上の特定塩基配列とプラ
イマーが二本鎖ハイブリッドを形成させるステップで増
幅領域の両端をはさむように形成させる。そして、Ｔａ
ｑポリメラーゼの至適活性温度（７２℃）まで温度を上
昇させプライマーからのＤＮＡ鎖の鎖長反応が開始され
る。これら３つの工程をこの順番で繰り返すことで増幅
反応が進む。
ラーゼの活性のみとなる０次に反応系の温度を低下させ
（３７〜６５℃）プライマーのアニーリングの工程には
いる。この工程は、新生ＤＮＡ上の特定塩基配列とプラ
イマーが二本鎖ハイブリッドを形成させるステップで増
幅領域の両端をはさむように形成させる。そして、Ｔａ
ｑポリメラーゼの至適活性温度（７２℃）まで温度を上
昇させプライマーからのＤＮＡ鎖の鎖長反応が開始され
る。これら３つの工程をこの順番で繰り返すことで増幅
反応が進む。
試料中に不純物として存在するＲＮＡ分解酵素により試
料ＲＮＡが分解されることを避けるため、反応液にリボ
ヌクレアーゼインヒビターを添加しておくことが望まし
い、リボヌクレアーゼインヒビターとしては、バナジル
リボヌクレオシドコンプレックス、ジエチルピロカーボ
ネート、ヒト胎磐由来りボヌクレアーゼインヒビター（
ＲＮａｓｉｎ）などがあるが、バナジルリボヌクレオシ
ドコンプレ・／クスとジエチルピロカーボネートはＴａ
ｑポリメラーゼの＃素活性をｖＡＷするのでＲＮａｓｆ
ｎを用いるとよい。
料ＲＮＡが分解されることを避けるため、反応液にリボ
ヌクレアーゼインヒビターを添加しておくことが望まし
い、リボヌクレアーゼインヒビターとしては、バナジル
リボヌクレオシドコンプレックス、ジエチルピロカーボ
ネート、ヒト胎磐由来りボヌクレアーゼインヒビター（
ＲＮａｓｉｎ）などがあるが、バナジルリボヌクレオシ
ドコンプレ・／クスとジエチルピロカーボネートはＴａ
ｑポリメラーゼの＃素活性をｖＡＷするのでＲＮａｓｆ
ｎを用いるとよい。
また、試料としては精製されたＲＮＡが望ましいが、、
＊ａ中の特定ＲＮＡ、あるいはウィルスゲノムＲＮＡを
検出するなめに、ｍ胞そのもの、あるいはウィルス粒子
そのものを反応液に直接添加してもよい、この際、ＲＮ
Ａが遊離されやすくするため反応液にＮｏｎ１ｄｅｔ
Ｐ−４０，７ｗｅｅ ｎ２０などの非イオン性界面活
性剤を添加しておくとよい。
＊ａ中の特定ＲＮＡ、あるいはウィルスゲノムＲＮＡを
検出するなめに、ｍ胞そのもの、あるいはウィルス粒子
そのものを反応液に直接添加してもよい、この際、ＲＮ
Ａが遊離されやすくするため反応液にＮｏｎ１ｄｅｔ
Ｐ−４０，７ｗｅｅ ｎ２０などの非イオン性界面活
性剤を添加しておくとよい。
［実施例コ
（実施例１）
次のヌクレオチド配列を有する２０塩基対配列５’ −
ＧＡＴＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＣＡＣＧＡＡＴ−３” ３” −ＣＣＧＡＧＡＣＴＡＴＴＧＡＣＡＧＴＧＧＴ−
５’ （センダイウィルスのＦタンパクをコードする遺伝子（
Ｍｉｕｒａ、Ｎ、 ｅｔ−ａｌ Ｇｅｎｅ ３８，２７
１−２７４ （１９８５）に含まれる）をＤＮＡ自動合
成装置により合成した。なお、ＰＣＲ反応下、上記プラ
イマーによって増幅され生成するＤＮＡ断片の大きさは
１７３塩基対である。試料は、センダイウィルスを含む
細胞培養上清よりＣａｎｔｅｌらの方法（Ｃａｎｔｅｌ
。
ＧＡＴＡＧＣＴＧＧＡＴＣＣＣＡＣＧＡＡＴ−３” ３” −ＣＣＧＡＧＡＣＴＡＴＴＧＡＣＡＧＴＧＧＴ−
５’ （センダイウィルスのＦタンパクをコードする遺伝子（
Ｍｉｕｒａ、Ｎ、 ｅｔ−ａｌ Ｇｅｎｅ ３８，２７
１−２７４ （１９８５）に含まれる）をＤＮＡ自動合
成装置により合成した。なお、ＰＣＲ反応下、上記プラ
イマーによって増幅され生成するＤＮＡ断片の大きさは
１７３塩基対である。試料は、センダイウィルスを含む
細胞培養上清よりＣａｎｔｅｌらの方法（Ｃａｎｔｅｌ
。
Ｋ、 ｅｔ−ａｌ、Ｍｅｔｈｏｄ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙ＋ｗｏｌｏｇｙ、７８．２９９ （１９８１））によ
り調製し、ＲＮａｓｉｎ（終濃度４００ ｕ ／ ｍｌ
）を添加し、ＳＤＳ （終濃度１％）をさらに添加し混
和した０次に同容量のフェノール、クロロホルム混合液
（混合比１：１）を添加し、攬はん後、遠心（５０００
Ｘｇ、 １０分ｍ）Ｌｒ、：、 遠心後、上溝を回
収し２容、７．５Ｍ酢酸アンモニウム、２．５容冷エタ
ノールを添加し、−２０℃２時間放置した。そして、遠
心（１２０００Ｘｇ１５分）して沈澱物を回収し、それ
をセンダイウィルス精製ＲＮＡとした。このＲＮＡを用
い次のように反応液を構成した。
ｙ＋ｗｏｌｏｇｙ、７８．２９９ （１９８１））によ
り調製し、ＲＮａｓｉｎ（終濃度４００ ｕ ／ ｍｌ
）を添加し、ＳＤＳ （終濃度１％）をさらに添加し混
和した０次に同容量のフェノール、クロロホルム混合液
（混合比１：１）を添加し、攬はん後、遠心（５０００
Ｘｇ、 １０分ｍ）Ｌｒ、：、 遠心後、上溝を回
収し２容、７．５Ｍ酢酸アンモニウム、２．５容冷エタ
ノールを添加し、−２０℃２時間放置した。そして、遠
心（１２０００Ｘｇ１５分）して沈澱物を回収し、それ
をセンダイウィルス精製ＲＮＡとした。このＲＮＡを用
い次のように反応液を構成した。
５０ｍＭＫＣｌ、１０ｍＭＴｒ ｉ ｓ −ＨＣｌＰＨ
９，０，１，５ｍＭＭｇＣ１＊、０．０１％（Ｗ／Ｖ）
ゼラチン、 ０． ４ｍＭｄＡＴＰ、 ０．４ｍＭｄＧ
ＴＰ、０．４ｍＭｄＣＴＰ、０．４ｍＭＴＴＰ、 ２
０ｐＭ 上記各オリゴヌクレオチド、４０ユニツトＲ
Ｎａｓｉｎ（東洋紡（株））、 １９０ｐＭランダムヘ
キサマー（Ｐｈａｒｍａｅｉａ）、２００ユニットＭ−
ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎ ｓ ｃ ｒ
ｉ ｐ ｔ ａ ｓ ｅ （Ｂｅｔｂｅｓｄａ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ Ｌａｂ。
９，０，１，５ｍＭＭｇＣ１＊、０．０１％（Ｗ／Ｖ）
ゼラチン、 ０． ４ｍＭｄＡＴＰ、 ０．４ｍＭｄＧ
ＴＰ、０．４ｍＭｄＣＴＰ、０．４ｍＭＴＴＰ、 ２
０ｐＭ 上記各オリゴヌクレオチド、４０ユニツトＲ
Ｎａｓｉｎ（東洋紡（株））、 １９０ｐＭランダムヘ
キサマー（Ｐｈａｒｍａｅｉａ）、２００ユニットＭ−
ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎ ｓ ｃ ｒ
ｉ ｐ ｔ ａ ｓ ｅ （Ｂｅｔｂｅｓｄａ Ｒｅ５
ｅａｒｃｈ Ｌａｂ。
ｒｘｔｏｒ ｉｅｓ ＞、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラー
ゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｒｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を２．５
ユニツト、そして前記ＲＮＡを添加し全容量３０μＩと
した。ＲＮＡの添加量はセンダイウィルスゲノムが１０
’、１０’、１０′、１０２．０コピー存在するように
して反応系をそれぞれ調整した。また、対照実験として
前記反応液組成からＭ−ＭＬＶ ＲｅｖｅｒｓｅＴｒ
ａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅのみ除いた反応液も構成した。
ゼ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｒｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を２．５
ユニツト、そして前記ＲＮＡを添加し全容量３０μＩと
した。ＲＮＡの添加量はセンダイウィルスゲノムが１０
’、１０’、１０′、１０２．０コピー存在するように
して反応系をそれぞれ調整した。また、対照実験として
前記反応液組成からＭ−ＭＬＶ ＲｅｖｅｒｓｅＴｒ
ａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅのみ除いた反応液も構成した。
なお、この原品のＲＮＡ量は波長２６０ｎｍのＵＶ吸収
より定量しその値からウィルスゲノムのコピー数に換算
した。
より定量しその値からウィルスゲノムのコピー数に換算
した。
この液を４２℃で４０分間加熱し、 Ｍ−ＭＬＶＲｅ
ｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｃｒｉｐｔａｓｅの作用で逆転
写反応を行わせ、続いて下記の反復プログラムで３５サ
イクルの増幅を行った７９４℃、１分間 ５０℃、１分間 ７２℃、１分間。
ｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｃｒｉｐｔａｓｅの作用で逆転
写反応を行わせ、続いて下記の反復プログラムで３５サ
イクルの増幅を行った７９４℃、１分間 ５０℃、１分間 ７２℃、１分間。
なお、これら加熱冷却操作は逆転写反応も含めプログラ
ムインキュベーター（ＤＮＡ Ｔｈｅｒｓ＋ａｌ Ｃｙ
ｃｌｅｒ：Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）内
で全て行った。
ムインキュベーター（ＤＮＡ Ｔｈｅｒｓ＋ａｌ Ｃｙ
ｃｌｅｒ：Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）内
で全て行った。
反応液より１０μｍのアリコートを４０ｍＭトリスアセ
テート緩衝液、 ２ｍＭ ＥＤＴＡ、０゜５μｇ／ｍ
ｌ臭化エチジウム中で３％アガロースゲルに添加した、
ゲルを１２ボルト／ ｃ ｍで２０分間泳動させポラロ
イドカメラでＵＶによる核酸バンドの蛍光パターンを撮
影した。 （第１図参照）レーン１は標準分子量マーカ
ー、レーン２は上記反応基当り１０”分子相当のセンダ
イウィルスＲＮＡを加えたもの、同様にレーン３は１０
’、レーン４は１０’、レーン５は１０２、レーン６は
０分子、レーン７から１１は前記対照実験で、センダイ
ウィルスＲＮＡ量はレーン７は１０−、レーン８はｌＯ
６、レーン９は１０′、レーン１０は１０２、レーン１
１は０分子である。
テート緩衝液、 ２ｍＭ ＥＤＴＡ、０゜５μｇ／ｍ
ｌ臭化エチジウム中で３％アガロースゲルに添加した、
ゲルを１２ボルト／ ｃ ｍで２０分間泳動させポラロ
イドカメラでＵＶによる核酸バンドの蛍光パターンを撮
影した。 （第１図参照）レーン１は標準分子量マーカ
ー、レーン２は上記反応基当り１０”分子相当のセンダ
イウィルスＲＮＡを加えたもの、同様にレーン３は１０
’、レーン４は１０’、レーン５は１０２、レーン６は
０分子、レーン７から１１は前記対照実験で、センダイ
ウィルスＲＮＡ量はレーン７は１０−、レーン８はｌＯ
６、レーン９は１０′、レーン１０は１０２、レーン１
１は０分子である。
検出されたバンドの移動位置をレーンｌの分子量マーカ
ー（φＸ１７４／Ｈｉｎｃｌｌ ）と比較し塩基対の長
さを推定すると、理論長の１７３塩基対と一致し、セン
ダイウィルスのＦタンパクをコードする遺伝子を正しく
増幅してきたことがわかる。 （第１図矢印のライン）
また検出限界はレーン５の１０２分子まで検出できてお
り、ＤＮＡを直接ＰＣＲで検出する通常反応の場合と比
較しても検出感度の点において遜色がないことがわかる
。なお、Ｍ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓ
ｃｒｉｐｔａｓｅのみ除いた反応液では増幅バンドは確
認できないことからセンダイウィルスＲＮＡが逆転写反
応によってＤＮＡに変換されてからでないと遺伝子の増
幅が起こらないことを示している。 （レーン７〜１１
） （実施例２） ＲＮＡ標品の代わりにセンダイウィルス粒子そのままを
反応系に加えて実施例１と同様に実験を行った。センダ
イウィルス粒子は１０日ふらん鶏卵に種ウィルスを接種
し増殖したウィルスを超遠心処理により精製してきたも
ので前記Ｃａｎｔｅｌらの方法によっている。このサン
プルを用い次のように反応液を構成した。
ー（φＸ１７４／Ｈｉｎｃｌｌ ）と比較し塩基対の長
さを推定すると、理論長の１７３塩基対と一致し、セン
ダイウィルスのＦタンパクをコードする遺伝子を正しく
増幅してきたことがわかる。 （第１図矢印のライン）
また検出限界はレーン５の１０２分子まで検出できてお
り、ＤＮＡを直接ＰＣＲで検出する通常反応の場合と比
較しても検出感度の点において遜色がないことがわかる
。なお、Ｍ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓ
ｃｒｉｐｔａｓｅのみ除いた反応液では増幅バンドは確
認できないことからセンダイウィルスＲＮＡが逆転写反
応によってＤＮＡに変換されてからでないと遺伝子の増
幅が起こらないことを示している。 （レーン７〜１１
） （実施例２） ＲＮＡ標品の代わりにセンダイウィルス粒子そのままを
反応系に加えて実施例１と同様に実験を行った。センダ
イウィルス粒子は１０日ふらん鶏卵に種ウィルスを接種
し増殖したウィルスを超遠心処理により精製してきたも
ので前記Ｃａｎｔｅｌらの方法によっている。このサン
プルを用い次のように反応液を構成した。
５０ｍＭＫＣＩ、 １０ｍＭＴｒ ｉ ｓ −ＨＣ１ｐ
Ｈ９，０、１，５ｍＭＭｇＣ１ｇ、’０．０１％（Ｗ／
Ｖ）ゼラチン、 ０． ４ｍＭｄＡＴＰ、 ０．４ｍＭ
ｄＧＴＰ、 ０． ４ｍＭｄＣＴＰ、 ０．
４ｍＭＴＴＰ、 ２０ｐＭ 前記各オリゴヌクレオ
チド、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０．０．０５％Ｎｏｎ
１ｄｅｔ Ｐ−４０，４０ユニツトＲＮａｓｉｎ（東
洋紡（株））、２００ユニットＭ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅ
ｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ （Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
）、２．５ユニツ）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ
ｅｒｋｉｎ Ｅｒｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）、そして前記サ
ンプルを添加し全容量３０μ】としな、センダイウィル
ス粒子数が１０ｊ、１０６．１０４．１０２．０個存在
するようにして反応系をそれぞれ調整した。また、コン
トロールとして前記反応液組成からＭ−ＭＬＶ Ｒｅ
ｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅのみ除いた
反応液も構成した。なお、この標品のウィルス粒子数は
この標品を用いて実施例１に示した方法で抽出できたＲ
ＮＡから逆１してウィルス粒子数を１出した。
Ｈ９，０、１，５ｍＭＭｇＣ１ｇ、’０．０１％（Ｗ／
Ｖ）ゼラチン、 ０． ４ｍＭｄＡＴＰ、 ０．４ｍＭ
ｄＧＴＰ、 ０． ４ｍＭｄＣＴＰ、 ０．
４ｍＭＴＴＰ、 ２０ｐＭ 前記各オリゴヌクレオ
チド、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０．０．０５％Ｎｏｎ
１ｄｅｔ Ｐ−４０，４０ユニツトＲＮａｓｉｎ（東
洋紡（株））、２００ユニットＭ−ＭＬＶ Ｒｅｖｅ
ｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ （Ｂｅｔｈｅ
ｓｄａ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ
）、２．５ユニツ）Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐ
ｅｒｋｉｎ Ｅｒｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）、そして前記サ
ンプルを添加し全容量３０μ】としな、センダイウィル
ス粒子数が１０ｊ、１０６．１０４．１０２．０個存在
するようにして反応系をそれぞれ調整した。また、コン
トロールとして前記反応液組成からＭ−ＭＬＶ Ｒｅ
ｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅのみ除いた
反応液も構成した。なお、この標品のウィルス粒子数は
この標品を用いて実施例１に示した方法で抽出できたＲ
ＮＡから逆１してウィルス粒子数を１出した。
この液を４２℃で４０分間加熱し、 Ｍ−ＭＬＶＲｅ
ｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｃｒｉｐｔａｓｅの作用で逆転
写反応を行わせ、続いて下記の反復プログラムで３５サ
イクルの増幅を行った：９４℃、１分間 ５０℃、１分間 ７２℃、 １分間。
ｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｃｒｉｐｔａｓｅの作用で逆転
写反応を行わせ、続いて下記の反復プログラムで３５サ
イクルの増幅を行った：９４℃、１分間 ５０℃、１分間 ７２℃、 １分間。
なお、これら加熱冷却操作は逆転写反応も含めプログラ
ムインキュベーター（ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃ
ｌｅｒ：Ｐｅｒｋｊｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）内で
全て行った。
ムインキュベーター（ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃ
ｌｅｒ：Ｐｅｒｋｊｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）内で
全て行った。
反応液より１０μｌのアリコートを４０ｍＭトリスアセ
テート緩衝液、 ２ｍＭ ＥＤＴＡ、０゜５μｇ ／
ｍ ＋臭化エチジウム中で３％アガロースゲルに添加
した、ゲルを１２ボルト／ ｃ ｍで２０分間泳動させ
ポラロイドカメラでＵＶによる核酸バンドの蛍光パター
ンを撮影した。 （第２図参照）レーン１は標準分子量
マーカー（φＸ１７４／ＨｉｎｃｌＩ）、レーン２は反
応系当り３Ｘ１０’個のウィルス粒子を加えたもの、同
様にレーン３は３Ｘ１０５個、 レーン４はＸ１０３個
、 レーン５は３００個、レーン６は０個である。
テート緩衝液、 ２ｍＭ ＥＤＴＡ、０゜５μｇ ／
ｍ ＋臭化エチジウム中で３％アガロースゲルに添加
した、ゲルを１２ボルト／ ｃ ｍで２０分間泳動させ
ポラロイドカメラでＵＶによる核酸バンドの蛍光パター
ンを撮影した。 （第２図参照）レーン１は標準分子量
マーカー（φＸ１７４／ＨｉｎｃｌＩ）、レーン２は反
応系当り３Ｘ１０’個のウィルス粒子を加えたもの、同
様にレーン３は３Ｘ１０５個、 レーン４はＸ１０３個
、 レーン５は３００個、レーン６は０個である。
実施例１で用い・た精製ＲＮＡに比べると検出感度は劣
るものの第２図レーン３の矢印ラインに示したバンドが
確認できることから３Ｘ１０”個のレベルのウィルス粒
子戸では検出できていることがわかる。ウィルス粒子内
のＲＮＡはタンパク質や脂質二重膜等の構造体に包すれ
でおりその１１ではプライマーが接近することができず
逆転写反応は起こらない、しかし実施例２で用いた反応
液には界面活性荊であるＴｗｅｅｎ２０とＮｏｎ１ｄｅ
ｔＰ−４０が添加してあり、これらがウィルス粒子内の
ＲＮＡを反応可能な形で遊離させる効果があるものと思
われる。
るものの第２図レーン３の矢印ラインに示したバンドが
確認できることから３Ｘ１０”個のレベルのウィルス粒
子戸では検出できていることがわかる。ウィルス粒子内
のＲＮＡはタンパク質や脂質二重膜等の構造体に包すれ
でおりその１１ではプライマーが接近することができず
逆転写反応は起こらない、しかし実施例２で用いた反応
液には界面活性荊であるＴｗｅｅｎ２０とＮｏｎ１ｄｅ
ｔＰ−４０が添加してあり、これらがウィルス粒子内の
ＲＮＡを反応可能な形で遊離させる効果があるものと思
われる。
［発明の効果コ
本発明により、ＲＮＡを遺伝子増幅法で検出する際に必
要な逆転写反応をＰＣＲ反応と同一の反応溶液内で行わ
せることができるようになる。このため、反応液からの
液の出し入れ、バッファー系の変更が必要となくなり反
応容器の加熱、冷却のみで最終産物である増幅ＤＮＡ断
片を生成させることができるようになる。これにより、
検出操作が大幅に簡略化され検出までの時間が短縮でき
る。特に反応温度のみを経時的にコントロールすればよ
いので、コンピューターを用いあらかじめ入力しておい
たプログラムに基き温度の上げ下げする自動機器に応用
しやすくなる。跋な、ウィルス粒子そのまｔ添加しても
検出できるなど、検体前処理において相当な簡略化が期
待できることから検体の大量処理に有利である。そのた
め、本発明をＲＮＡウィルス等の検出を目的とした臨床
検査に利用する場合、特に有効なものとなる。
要な逆転写反応をＰＣＲ反応と同一の反応溶液内で行わ
せることができるようになる。このため、反応液からの
液の出し入れ、バッファー系の変更が必要となくなり反
応容器の加熱、冷却のみで最終産物である増幅ＤＮＡ断
片を生成させることができるようになる。これにより、
検出操作が大幅に簡略化され検出までの時間が短縮でき
る。特に反応温度のみを経時的にコントロールすればよ
いので、コンピューターを用いあらかじめ入力しておい
たプログラムに基き温度の上げ下げする自動機器に応用
しやすくなる。跋な、ウィルス粒子そのまｔ添加しても
検出できるなど、検体前処理において相当な簡略化が期
待できることから検体の大量処理に有利である。そのた
め、本発明をＲＮＡウィルス等の検出を目的とした臨床
検査に利用する場合、特に有効なものとなる。
第１図は、実施例の核酸バンドの蛍光パターンを撮影し
た図、第２図は、実施例２の核酸バンドの蛍光パターン
を撮影した図である。 特許出願人 株式会社 島津製作所
た図、第２図は、実施例２の核酸バンドの蛍光パターン
を撮影した図である。 特許出願人 株式会社 島津製作所
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １、少なくとも逆転写酵素と耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
の両方を含むことを特徴とするＲＮＡ検出用試薬。 ２、試薬中に含まれるＲＮＡの特定の塩基配列を増幅す
ることにより該ＲＮＡを検出する方法であって、前記塩
基配列および該相補鎖に対し二本鎖形成可能なオリゴヌ
クレオチド、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ及
び逆転写酵素、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが同時に存在
する反応液組成下において、 （ａ）逆転写反応により前記試料中に存在するＲＮＡを
ＤＮＡに変換し、こうして生成したＤＮＡは同反応液下
でＤＮＡポリメラーゼによる遺伝子増幅反応のための鋳
型として機能することができ （ｂ）段階（ａ）において生成したＤＮＡを鋳型として
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼおよび前記オリゴヌクレオチ
ドによる遺伝子増幅反応が行われるようにし、前記特定
配列が存在すれば、該配列の増幅をもたらし；そして、 （ｃ）増幅された塩基配列を検出することにより前記試
料中に目的とするＲＮＡが存在するか否かを決定するこ
とから成る方法。
Priority Applications (2)
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|---|---|---|---|
| JP2262457A JPH04141098A (ja) | 1990-09-29 | 1990-09-29 | Ｒｎａ検出用試薬及びそれを用いたｒｎａの検出方法 |
| EP91116550A EP0479158A1 (en) | 1990-09-29 | 1991-09-27 | Reagent for RNA detection and RNA detection method using it |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2262457A JPH04141098A (ja) | 1990-09-29 | 1990-09-29 | Ｒｎａ検出用試薬及びそれを用いたｒｎａの検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04141098A true JPH04141098A (ja) | 1992-05-14 |
Family
ID=17376052
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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| JP2262457A Pending JPH04141098A (ja) | 1990-09-29 | 1990-09-29 | Ｒｎａ検出用試薬及びそれを用いたｒｎａの検出方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0479158A1 (ja) |
| JP (1) | JPH04141098A (ja) |
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Families Citing this family (6)
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- 1990-09-29 JP JP2262457A patent/JPH04141098A/ja active Pending
-
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| JP2012034705A (ja) * | 2004-05-27 | 2012-02-23 | E I Du Pont De Nemours & Co | 診断用ｒｎａの直接検出方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0479158A1 (en) | 1992-04-08 |
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