JP2008500054A - 診断用rnaの直接検出方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願明細書の一部を形成する以下の詳細な説明および付随する配列説明から、本発明をより完全に理解できるであろう。
配列番号:1は、Lis−Fプライマーの配列である。
配列番号:2は、Lis−Rプライマーの配列である。
配列番号:3は、16S−373Fプライマーの配列である。
配列番号:4は、16S−436−Rプライマーの配列である。
配列番号:5は、16S−394Tタグの配列である。
配列番号:6は、16S−2455Fプライマーの配列である。
配列番号:7は、16S−2523Rプライマーの配列である。
配列番号:8は、16S−2479Tプライマーの配列である。
配列番号:9は、16S−1108Fプライマーの配列である。
配列番号:10は、16S−1169Rプライマーの配列である。
配列番号:11は、16S−1125Tプライマーの配列である。
ここでの用法では、「細菌細胞」という用語は、分析または検出に適したRNAを有するあらゆる原核生物細胞を意味する。本発明の細菌細胞は、生きていても、死んでいても、または破損していても、すなわち細胞壁または細胞膜に中断があってもよい。細菌は、そのあらゆる生活環形態、例えば栄養、静止、または胞子形態にあることができる。
本発明は、多様なサンプルに適用してもよい、細菌細胞検出のための改善された方法およびキットを提供する。細菌細胞は、生物学的、実験的、医療、農業、工業、環境、食品、または食品前駆物質起源のタイプのサンプル中に検出されてもよい。この一覧は例示的であり網羅的ではない。特に本発明は、疾患の原因物質であるまたはそれであることもある汚染物質または病原体の検出に応用してもよい。食品供給における細菌病原体の拡散および汚染の特別の懸念であることから、食品の加工、取り扱い、および調製領域サンプルが好ましい。
診断用標的RNAとしてアッセイされてもよいRNAタイプとしては、細菌細胞のrRNA、mRNA、転移−RNA(tRNA)、またはその他のRNAポリヌクレオチドが挙げられる。rRNA種としては、一群の関連細菌に特徴的な1つもしくはそれ以上の部分配列を含有してもよい5S、16S、および23Sポリヌクレオチドが挙げられる。特徴的な部分配列の存在はサンプル中の関心のある細菌タイプを同定し、すなわち検出する。特徴的配列の検出能は変化し、アッセイで検出される細菌の関連性のレベルに左右される。例えばサンプル中のあらゆるリステリア(Listeria)種の検出は、その部分配列がリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のみを検出するのに必要な程度の微細な検出能を有さない、特徴的な部分配列に依存することもある。したがって特徴的な部分配列は、サンプル中の細菌全含有物に対してどの細菌が検出されるかで変化する同定能を有してもよい。このため本方法は広い適応性を有し、診断用標的RNAのための特定の同定能、または標的として使用されるあらゆるタイプのRNAに限定されない。
本方法では、逆転写単独によって、または逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応によって、細菌細胞の診断用標的RNAの存在が試験される。共に使用される場合、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応は、二段階で逐次に、または全反応組成物試薬を細菌細胞サンプルに添加して一段階で共に実施してもよい。
本発明は検出法に関して限定されず、RTまたはRT−PCR反応の生成物を検出するあらゆる方法によって使用されてもよい。
RT反応のcDNA生成物を直接に検出する方法は、当業者によく知られており、cDNA生成物に組み込むか、または付着する標識を利用する。使用してもよいシグナル発生標識は当該技術分野でよく知られており、例えば蛍光部分、化学発光部分、粒子、酵素、放射性タグ、または発光部分または分子が挙げられる。
RT−PCR生成物検出の方法は、ゲル電気泳動分離および臭化エチジウム染色、または生成物中の組み込まれた蛍光標識または放射標識の検出を含む。増幅生成物の検出に先だって分離ステップを必要としない方法もまた、使用してもよい。これらの方法は一般に、リアルタイムPCRまたは均質な検出と称される。ほとんどのリアルタイム法は、サーモサイクリング中に蛍光変化をモニタリングして、増幅生成物の形成を検出する。これらの方法としては、カリフォルニア州フォスターシティ94404のアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems(Foster City,CA 94404))からのタクマン(TaqMan)(登録商標)二重標識プローブ、ティヤギ(Tyagi)Sおよびクレイマー(Kramer)FR(1996年)著、Nat Biotechnol 14:303〜308頁の分子ビーコン、およびオレゴン州ユージーン97402−0469のモレキュラー・プローブ(Molecular Probes,Inc(Eugene,OR 97402−0469))からのSYBR(登録商標)グリーン染料が挙げられるが、これに限定されるものではない。これらの該均一法のいくつかは、増幅生成物の終点検出にも使用できる。このタイプの方法の例は、SYBR(登録商標)グリーン染料解離曲線分析である。解離曲線分析では、蛍光モニタリングと組合わせた、概して約60℃〜90℃の温度での最後の緩慢な傾斜から、融点、ひいては増幅生成物の存在を検出できる(リリー(Ririe)ら(1997年)Anal.Biochem.245:154〜60)。
実施例で使用される標準リコンビナントDNAおよび分子クローン化技術は当該技術分野で良く知られており、Jサムブルック(Sambrook)、EFフリッチュ(Fritsch)、およびTマニアティス(Maniatis)「分子クローン化:実験室マニュアル(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)」;Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor,NY、1989年、TJシルハビー(Silhavy)、MLベンナン(Bennan)およびLWエンクイスト(Enquist)「遺伝子融合実験(Experiments with Gene Fusions)」Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor,NY、1984年、およびFMオースベル(Ausubel)ら「分子生物学現代プロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」グリーン Publishing Assoc.and Wiley−Interscience、NY、1987年で述べられている。細菌培養の維持および生育に適した材料および方法もまた、当該技術分野で良く知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、以下で述べられる。「一般微生物学方法マニュアル(Manual of Methods for General Bacteriology」、Pゲアハルト(Gerhardt)、RGEマレー(Murray)、RNコスティロウ(Costilow)、EWネスター(Nester)、WAウッド(Wood)、NRクリーグ(Krieg)、およびGBフィリップス(Phillips)編、米国微生物学会、Washington,D.C.、1994年、またはTDブロック(Brock)著「バイオテクノロジー:工業微生物学テキストブック(Biotechnology:A Textbook of Industrial Microbiology)」第2版、Sinauer Associates,Inc.、Sunderland,MA、1989年。
カリフォルニア州フォスター・シティのアプライド・バイオシステムズ(ABI)(Applied Biosystems(Foster City,CA)):マルチスクライブ(Multiscribe)逆転写酵素(カタログ番号4311235)、RNアーゼ阻害物質(20U/μL)(カタログ番号N808−0119)、ジーンアンプ(GeneAmp10× PCR緩衝液II(100mMトリス−HCl pH8.3、500mM KCl)(カタログ番号N808−0190)、25mM MgCl2(カタログ番号N808−0190)。
インディアナ州インディアナポリスのロシュ・アプライド・サイエンス(Roche Applied Science(Indianapolis,IN)):ファストスタート(FastStart)Taq DNAポリメラーゼ(カタログ番号2032937)、25mM MgCl2(カタログ番号2032937)。
テキサス中ウッドランドのシグマ・ジェノシス(Sigma Genosys(The Woodlands,TX)):オリゴヌクレオチド。
カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ(Invitrogen Life Technologies(Carlsbad,CA)):2%二重CombアガロースE−ゲル(Cat#G6018−02)、2%単一CombアガロースE−ゲル(カタログ番号G5018−02)、E−ゲル低量範囲定量的DNAラダー(カタログ番号12373−031)。
カリフォルニア州バレンシアのキアゲン(Qiagen(Valencia,CA)):RNアーゼ−フリーDNA分解酵素セット(カタログ番号79254)。
ミズーリ州セントルイスのシグマ−アルドリッチ(Sigma−Aldrich(St.Louis,MO):ウシ血清アルブミン(BSA)(カタログ番号A3294)、ジメチルスルホキシド(DMSO)(カタログ番号D8418)、カーボワックス(Carbowax)(カタログ番号P5413)、トレハロース(カタログ番号T9531)。
ニュージャージー州フランクリン・レイクスのベクトン・ディキンソン(Becton Dickinson(Franklin Lakes,NJ)):トリプチケースソイ寒天(TSA)(カタログ番号221293)、トリプチケースソイブロス(TSB)(カタログ番号297811)、リン酸緩衝液(カタログ番号292786)、脳心臓浸出物培地(BHI)(カタログ番号220837)、ディフコ(Difco)TMフレーザー・ブロス・ベース(カタログ番号211767)、ディフコ(Difco)TMUVM変性リステリア(Listeria)増菌ブロス(カタログ番号222330)、ディフコ(Difco)TMパルカム(PALCAM)培地ベース(カタログ番号263620)、ディフコ(Difco)TMオックスフォード培地ベース(カタログ番号222530)、ディフコ(Difco)TMフレーザー・ブロス・サプリメント(カタログ番号211742)、ディフコ(Difco)TMオックスフォード抗菌剤サプリメント(カタログ番号211763)、ディフコ(Difco)TMD/E中和ブロス(カタログ番号B01256)。
ニューヨーク州のオグデンズバーグのオキソイド(Oxoid(Ogdensburg,NY)):パルカム(PALCAM)プラス・ブロス。
リステリア・イノキュア(Listeria innocua)細胞培養物およびcfu判定
リステリア・イノキュア(Listeria innocua)(菌株CLIP 11262)(ATCC#BAA−680、)はバージニア州マナッサスの米国微生物系統保存機関から得た。リステリア・イノキュア(Listeria innocua)をBHI培地で水分補給した。リステリア・イノキュア(Listeria innocua)の培養物をTSA上に播種して35℃で生育させ、次に4℃で保存した。
リアルタイムRT−PCRを使用したリステリア・イノキュア(Listeria innocua)ホールセルサンプル中の16S rRNA標的の直接検出
この実施例では、細菌細胞上で前溶解ステップなしに、リステリア・イノキュア(Listeria innocua)16S rRNA標的配列の単一ステップRT−PCRアッセイを実施した。
1)10mMトリス−HCl pH8.3、50mM KClのジーンアンプ(GeneAmp)1×PCR緩衝液II
2)2mM MgCl2
3)200μMヌクレオチド
4)24μg BSA
5)DMSO(最終濃度1%)中のオレゴン州ユージーンのモレキュラー・プローブ(Molecular Probes,Inc(Eugene,OR))からのSYBRグリーン(10,000×、カタログ番号S7567)の1:10,000希釈物
6)600nMの順方向プライマーLis−F(5’AGCTTGCTCTTCCAAAGT3’、配列番号:1)および2μMの逆方向プライマーLis−R(5’AAGCAGTTACTCTTATCCT3’、配列番号:2)。プライマー配列はゾマー(Somer)およびカシ(Kashi)(2003年J.Food Prot.66:1658〜1665頁)からのもの。
7)2.5単位のファストスタート(FastStart)Taq DNAポリメラーゼおよび1.25単位のマルチスクライブ(Multiscribe)逆転写酵素(Rt)
8)1.86mMのカーボワックス(Carbowax)
9)360.5mMのトレハロース
10)20単位のRNアーゼ阻害物質
PCR反応では、Rt酵素を添加しなかったこと以外はRT−PCRミックスと同様にして、第2の反応ミックス(B)を調製した。
50℃で10分間(RTステップ)、
95℃で6分間(Taq活性化ステップ)、
95℃で30秒間(変性させるステップ)、
66℃で1分間(アニールおよび延長ステップ)、
変性およびアニールステップの反復34回、
66℃で5分間、
解離プロトコル(融解曲線)。
サーモサイクリング中に、反応生成物形成のCT値を判定した。反応に続いて、融解曲線分析およびアガロース・ゲル電気泳動法による分離の双方を使用して、生成物形成を分析した。ドイツ国のワットマン・バイオメトラ(Whatman Biometra(Germany))からの低電圧電源(モデル250EX)に接続され、60Vで20分作動する、カリフォルニア州カールスバッドのインビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ(Invitrogen Life Technologies(Carlsbad,CA))からのE−ゲルベース中の2%単一CombアガロースE−ゲル(カタログ番号G5100−01)上で、サンプルを泳動した。ニューヨーク州ロチェスターのコダック・デジタル・サイエンス(Kodak Digital Science(Rochester,NY))からのコダック(Kodak)イメージ・ステーション440CF上でE−ゲル画像をキャプチャして、次に観察し正しいサイズのRT−PCR生成物(402bp)の存在または不在を判定した。
リアルタイムRT−PCRを使用したリステリア・イノキュア(Listeria innocua)のホールセルサンプルにおける16S rRNA標的検出の再現性
実施例1同様にリステリア・イノキュア(Listeria innocua)培養物を一晩生育させて処理した。細胞サンプルを実施例2と全く同じ条件下で、2つの追加的実験で(異なる日に)試験した。
リアルタイムRT−PCRを使用したリステリア・イノキュア(Listeria innocua)ホールセルサンプル中の16S rRNA標的の直接検出のための前処理
実施例1と同様にリステリア・イノキュア(Listeria innocua)細胞を調製した。実施例2と同様に細胞サンプルを遠心分離して、RNアーゼ阻害物質を含有する水に再懸濁した。この実施例では、50μLあたり105〜100細胞の濃度範囲に及ぶ3組の細胞サンプルを調製した。1つの組は前処理なし対照として、試験に先だって氷上に保持した。第2のサンプルの組は、ペンシルベニア州ウェストチェスターのVWRサイエンティフィック・プロダクツ(VWR Scientific Products(West Chester,PA))からの50℃熱ブロックに5分間のせて、次に試験に先だって氷上に保持した。第3のサンプルの組は、95℃熱ブロックに1分間にのせて次に氷にのせた。この組を使用して細胞の高温熱処理の効果を評価した。実施例2と同様にRT−PCR試薬反応ミックス(Rtあり)およびPCR試薬反応ミックス(Rtなし)を調製した。各試験組からの5μLをRT−PCR試薬反応ミックスに添加して、各試験組からの追加的5μLをPCR試薬反応ミックスに添加した。RT−PCRおよびPCR反応を三連で実施した。次に実施例2と同様に、試験反応をABIプリズム(PRISM)7000内でサーマルサイクルにかけた。
RT−PCRにおける直接16S rRNA標的検出と単離RNA標的検出との比較
実施例1および2と同様にリステリア・イノキュア(Listeria innocua)細菌細胞を調製して希釈した。次にキアジェン(Qiagen)RNイージー(RNeasy)ミニ・キット(RNイージー(RNeasy)ミニ・ハンドブック、28頁、56〜60頁)RNA抽出キットを使用して、これらの細胞からのRNAを単離した。具体的には、ニューヨーク州ウェストベリーのブリンクマン・エッペンドルフ(Brinkmann Eppendorf(Westbury,NY))からのエッペンドルフ(Eppendorf)5415D遠心分離器内で、各細胞サンプル希釈物からの1mLを10分間遠心分離(13,200rpm)した。リン酸緩衝液を除去し、次にキアジェン(Qiagen)プロトコル(RNイージー(RNeasy)ミニ・ハンドブック)に従って細菌細胞を10分間溶解した。次に溶解サンプルをカラム内のキット・シリカ−ゲルベースの膜に添加して、RNAを結合させた。任意のDNA分解酵素処理は実施しなかった。50μLの水をカラムに添加して、RNAを膜から溶出した。溶出剤を再適用して膜から溶出し、溶液中のRNAを濃縮した。次にこの回収されたRNAを試験まで氷にのせた。
直接標的RNA検出のための熱前処理細胞サンプルに対するRNアーゼ阻害物質の効果
実施例1と同様にリステリア・イノキュア(Listeria innocua)細胞を生育させ、リン酸緩衝液中で1:10000に希釈した。実施例2と同様に希釈細胞の1mLアリコート14個を取り出して調製し、サンプルの半数を45:5の水:RNアーゼ阻害物質(100U)ミックス50μLに再懸濁し、もう半数はRNアーゼ阻害物質添加なしの水50μLのみに再懸濁した。全サンプルをボルテックスした。
リアルタイムRT−PCRを使用したリステリア・イノキュア(Listeria innocua)ホールセル溶解産物中の16S rRNA標的の直接検出
菌株および培地
ニューヨーク州オグデンズバーグのオキソイド(Oxoid,Ltd.(Ogdensburg,NY))からの0.3%グルコース添加デミ−フレーザー培地プラス(カタログ番号CM0153)中でリステリア・イノキュア(Listeria innocua)細胞を37℃で生育させた。カリフォルニア州ホリスターのテクノヴァ(Teknova,Inc.(Hollister,CA))からのBHI寒天プレート(カタログ番号B1010)上でプレートカウントを実施した。
10mlの0.3%グルコース添加デミ−フレーザー培地にリステリア・イノキュア(Listeria innocua)を接種して、37℃で一晩インキュベートした。100μlの一晩培養物を新鮮な培地に移し、ニュージャージー州ピスカタウェイのファルマシア・バイオテック(Pharmacia Biotech(Piscataway,NJ))からのウルトラ・スペック(Ultra Spec)3000を使用してOD650を測定した。培養物をOD650が0.5(対数中期)に達するまで37℃でインキュベートして、33μlの培養物をテキサス州オースティンのアンビオン(Ambion、Inc.(Austin,TX))からの967μlの氷冷PBS(アンビオン・セル・トゥcDNA(Ambion Cell to cDNA)キット、カタログ番号1722)に移した。ノースカロライナ州アシュビルのケンドロ・ラボラトリー・プロダクツ(Kendro Laboratory Products(Asheville,NC))からのヘレウス・バイオフュージ・ピコ(Heraeus Biofuge Pico)内において、13,000rpmで1分の遠心分離によって細胞をペレット化して、次に100μlの氷冷PBSに再懸濁した。細胞を氷冷PBS中で1:10に希釈し、次にテキサス州オースティンのアンビオン(Ambion、Inc.(Austin,TX))からのアンビオン(Ambion)溶菌性緩衝液(アンビオン・セル・トゥcDNA(Ambion Cell to cDNA)キット、カタログ番号1722)中で最終濃度およそ102細胞/mlに連続1:10希釈を作成した。
ペレット化した細胞を最初に1:10でなく1:5に希釈し、次に上のように最終濃度およそ2×102細胞/mlに1:10連続希釈したこと以外は、上述のように培養物を生育させ調製した。同一培養物を使用して双方の希釈物および溶解産物の組を調製したので、双方の溶解法で上のプレートカウントを使用した。0.5ml薄肉PCRチューブ内のデラウェア州ウィルミントンのデュポン・クアリコン(DuPont Qualicon(Wilmington,DE))からの100μlのBAX溶菌性緩衝液(リステリア(Listeria)属スクリーニング用BAXシステムPCRアッセイ、カタログ番号17710610)に、およそ2×106細胞/ml〜2×103細胞/mlを含有するPBS中の各希釈物から5μlの希釈細胞を添加した。カリフォルニア州フォスターシティのPEアプライド・バイオシステムズ(PE Applied Biosystems(Foster City,CA))からのジーンアンプ(GeneAmp)PCRシステム9700内で、細胞を55℃で1時間、次に95℃で10分間インキュベートした。得られた細胞サンプル溶解産物を下のRT−PCR反応で即座に使用した。
米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems(Foster City,CA,USA)からの配列検出システム(SDS)装置(モデル7900)上、でリアルタイム逆転写−PCR(RT−PCR)を実施した。米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems(Foster City,CA,USA)からのプライマー・エクスプレスv2.0ソフトウェアを使用して、標準設定を使用して、リアルタイムプライマーおよびプローブをデザインした。逆転写酵素ありまたはなし(+または−Rt)の双方で、次のように20μl反応をセットアップした。米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems(Foster City,CA,USA))からの10μlのタクマン(TaqMan)ユニバーサルPCR 2×マスター・ミックス(#4324018、AmpliTaq Gold(登録商標)DNAポリメラーゼ含有)、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems(Foster City,CA,USA))からの0.4μlのRNアーゼ阻害物質(#N808−0119、20U/μl)、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems(Foster City,CA,USA))からの0.01μlのマルチスクライブ(Multiscribe)逆転写酵素(#4311235)、米国テキサス州ウッドランズのシグマ・ジェノシス(Sigma Genosys、Woodlands、Texas,USA))からの0.1μlの16S−373F 100μMプライマー(5’TCCGCAATGGACGAAAGTCT:配列番号:3)、米国テキサス州ウッドランズのシグマ・ジェノシス(Sigma Genosys、Woodlands、Texas,USA))からの0.2μlの16S−436R 100μMプライマー(5’TTACGATCCGAAAACCTTCTTCA:配列番号:4)、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems(Foster City,CA,USA))からの0.05μlの16S−394T 100μMタクマン(TaqMan)TAMRAプローブ(#450025、6FAM−ACGGAGCAACGCCGCGTG:配列番号:5)、ドイツ国ハンブルグのエッペンドルフAG(Eppendorf AG(Hamburg,Germany))からの7.24μlの分子生物学等級水#0032006.302)、および2μlのサンプル溶解産物。全反応を三連で実施した。Rtなしで反応を実施し、溶解産物中に存在する検出可能量のDNAを判定した。2つの最高濃度溶解産物のみをRtなしで使用した。
リアルタイムRT−PCRを使用したリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)のホールセル溶解産物中の16S rRNA標的の直接検出
菌株および培地
ニューヨーク州オグデンズバーグのオキソイド(Oxoid,Ltd.(Ogdensburg,NY))からの0.3%グルコース添加デミ−フレーザー培地プラス(カタログ番号CM0153)中でリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)株DD1288細胞を37℃で生育させた。DD1288はデラウェア州ウィルミントンのデュポン・クアリコン(DuPont Qualicon(Wilmington,DE))から得られた株であり、調理済み七面鳥から単離され、クック(Cook),L.V.著(「USDA/FSIS微生物学試験室ガイドブック(Microbiology Laboratory Guidebook)」)2002年、第3版、3次改訂、USDA/FSIS;http://www.fsis.usda.gov/Frame/FrameRedirect.asp?main=op/ophs/ophshome.htm)で述べられるように、異なる寒天上でのその生育パターン、および生化学試験におけるその特性によってL.モノサイトゲネス(L.monocytogenes)株として同定された。この実施例で述べられるように、その他のL.モノサイトゲネス(L.monocytogenes)株を使用して、ホールセル溶解産物中の16S rRNA標的の直接検出を実証してもよい。カリフォルニア州ホリスターのテクノヴァ(Teknova,Inc.(Hollister,CA))からのBHI寒天プレート(カタログ番号B1010)上で、実施例1で述べられるようなプレートカウントを実施した。
実施例7でアンビオン(Ambion)溶解法について述べたように、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)細胞を生育させ、収穫し、希釈して、プレートカウントを行った。およそ105細胞/ml〜102細胞/mlを含有するアンビオン(Ambion)溶菌性緩衝液中の各希釈物から、90μlの希釈細胞を0.5ml薄肉PCRチューブに移した。カリフォルニア州フォスターシティのPEアプライド・バイオシステムズ(PE Applied Biosystems(Foster City,CA))からのジーンアンプ(GeneAmp)PCRシステム9700内において75℃で10分間、細胞をインキュベートした。
反応あたり2μlのリステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)細胞溶解産物サンプルを使用して、実施例7で述べられるようにしてリアルタイム逆転写−PCR(RT−PCR)を実施した。全反応を三連で実施した。
リアルタイムRT−PCRを使用した大腸菌(エシェリキア(Escherichia) coli)ホールセル溶解産物中の16S rRNA標的の直接検出
菌株および培地
大腸菌(E.coli)ATCC25922はバージニア州マナッサスの米国微生物系統保存機関から得た。細胞をカリフォルニア州ホリスターのテクノヴァ(Teknova,Inc.(Hollister,CA))からのBHI培地(カタログ番号B9994)上で37℃で生育させた。カリフォルニア州ホリスターのテクノヴァ(Teknova,Inc.(Hollister,CA))からのBHI寒天プレート(カタログ番号B1010)上で、プレートカウントを実施した。
10mlのBHIに大腸菌(E.coli)を接種し、37℃で一晩インキュベートした。推定開始濃度3×109細胞/mlに基づいて、BHI培地中で最終濃度およそ102細胞/mlに連続1:10希釈を作成した。
米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems(Foster City,CA,USA)からの配列検出システム(SDS)装置(モデル7900)上でリアルタイム逆転写−PCR(RT−PCR)を実施した。逆転写酵素ありまたはなし(+または−Rt)の双方で、次のように20μl反応をセットアップした。米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems(Foster City,CA,USA))からの10μlのタクマン(TaqMan)ユニバーサルPCR 2×マスター・ミックス(#4324018)、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems(Foster City,CA,USA))からの0.4μlのRNアーゼ阻害物質(#N808−0119、20U/μl)、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems(Foster City,CA,USA))からの0.01μlのマルチスクライブ(Multiscribe)逆転写酵素(#4311235)、米国テキサス州ウッドランズのシグマ・ジェノシス(Sigma Genosys、Woodlands、Texas,USA))からの0.1μlの16S−2455F 100μMプライマー(5’GCTGATACCGCCCAAGAGTTC:配列番号:6)、米国テキサス州ウッドランズのシグマ・ジェノシス(Sigma Genosys、Woodlands、Texas,USA))からの0.2μlの16S−2523R 100μMプライマー(5’CAGGATGTGATGAGCCGACAT:配列番号:7)、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems(Foster City,CA,USA))からの0.05μlの16S−2479T 100μM タクマン(TaqMan) TAMRAプローブ(#450025、6FAM−TCGACGGCGGTGTTTGGCAC:配列番号:8)、ドイツ国ハンブルグのエッペンドルフAG(Eppendorf AG(Hamburg,Germany))からの7.24μlの分子生物学等級水#0032006.302)、および2μlのサンプル溶解産物。全反応を三連で実施した。
リアルタイムRT−PCRを使用したメチロモナス(Methylomonas)種16Aのホールセル溶解産物中の16S rRNA標的の直接検出
菌株および培地
メチロモナス(Methylomonas)種16a ATCC PTA−240は、バージニア州マナッサスの米国微生物系統保存機関から得た。液体アンモニウム「BTZ」増殖培地中でメタンを炭素源として、細胞を30℃で生育させた(表18および19参照)。イリノイ州ウィートンのウィートン・サイエンティフィック(Wheaton Scientific(Wheaton,IL))からの共栓付きウィートン(Wheaton)ボトル内で、少なくとも8:1の気体/液体比を使用して(すなわち総容積80mLのウィートン(Wheaton)ボトル内に10mLの液体アンモニウム「BTZ」増殖培地)、血清中でメチロモナス(Methylomonas)種16aを生育させた。培養のための標準気相は、空気中に25%メタンを含有した。
10mlのBTZ培地にメチロモナス(Methylomonas)種16Aを接種し、30℃で一晩インキュベートした。推定開始濃度3×109細胞/mlに基づいて、最終濃度およそ105細胞/mlにBTZ培地中で一連の1:10希釈を作成した。
米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems(Foster City,CA,USA)からの配列検出システム(SDS)装置(モデル7900)上でリアルタイム逆転写−PCR(RT−PCR)を実施した。逆転写酵素ありまたはなし(+または−RT)の双方で、次のように20μl反応をセットアップした。米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems(Foster City,CA,USA))からの10μlのタクマン(TaqMan)ユニバーサルPCR 2×マスター・ミックス(#4324018)、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems(Foster City,CA,USA))からの0.4μlのRNアーゼ阻害物質(#N808−0119、20U/μl)、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems(Foster City,CA,USA))からの0.01μlのマルチスクライブ(Multiscribe)逆転写酵素(#4311235)、米国テキサス州ウッドランズのシグマ・ジェノシス(Sigma Genosys、Woodlands、Texas,USA))からの0.1μlの16S−1108F 100μMプライマー(5’TTGCCAGCGCGTCATG:配列番号:9)、米国テキサス州ウッドランズのシグマ・ジェノシス(Sigma Genosys、Woodlands、Texas,USA))からの0.2μlの16S−1169R 100μMプライマー(5’CCACCTTCCTCCGGTTTATCA:配列番号:10)、米国カリフォルニア州フォスターシティのアプライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems(Foster City,CA,USA))からの0.05μlの16S−1125T 100μM タクマン(TaqMan) TAMRAプローブ(#450025、6FAM−CGGGAACTCTAGGGAGACTGCCG:配列番号:11)、ドイツ国ハンブルグのエッペンドルフAG(Eppendorf AG(Hamburg,Germany))からの7.24μlの分子生物学等級水#0032006.302)、および2μlのサンプル溶解産物。全反応を三連で実施した。
リアルタイムRT−PCRを使用したその他の細菌および牛挽肉存在下におけるリステリア・イノキュア(Listeria innocua)のホールセル溶解産物中の16S rRNA標的の直接検出
この実施例は、食品微小細菌叢およびマトリックス物質を含む、食品加工工場において遭遇する接触面をシミュレートする物質表面のリステリア・イノキュア(Listeria innocua)CLIP11262(ATCCBAA−680)の存在の検出を実証する。
逆転写のみを使用した細菌のホールセル溶解産物中の16S rRNA標的の直接検出
PCRステップを施さずにRT反応生成物を検出した。
実施例2で述べられるL.イノキュラ(L.innocua)をこの目的で使用する。細胞をカリフォルニア州ホリスターのテクノヴァ(Teknova,Inc.(Hollister,CA))からのBHI培地(カタログ番号B9994)中で37℃で生育させる。カリフォルニア州ホリスターのテクノヴァ(Teknova,Inc.(Hollister,CA))からのBHI寒天プレート(カタログ番号B1010)上で、プレートカウントを実施する。
10mlのBHIにL.イノキュラ(L.innocua)を接種して、37℃で一晩インキュベートする。推定開始濃度3×109細胞/mlに基づいて、BHI培地中で最終濃度およそ102細胞/mlに連続1:10希釈を作成する。
逆転写を次の条件下で実施する。
1.RTのための特異的プライマー(1〜6μg)を細胞溶解産物に添加する(5〜20μl)。リステリア・イノキュア(Listeria innocua)16S rRNAの検出のためのプライマーとしてLis−Rプライマー(配列番号:2)を使用する。RNアーゼおよびDNA分解酵素を含まない水で容積を25μlに調節する。
2.14μlの標識混合物を添加する。この混合物は、8μlの5×酵素緩衝液、4μlのDTT(0.1M)、および2μlの20×染料混合物を含有する。染料混合物は、それぞれ2mMのdATP、dGTP、およびdTTP、ImMのdCTP、そして1mMのCy3−dCTPまたはCy5−dCTPを含有する。
3.混合物をアニーリングのために室温で10分間インキュベートする。
4.1または1.4μl(200〜300単位)の逆転写酵素を添加して、使用酵素に適した温度で反応をインキュベートする。例えばスーパースクリプト(Superscript)II酵素では、インキュベーション温度は42℃である。
5.DNA精製キットでcDNA精製を実施する。この目的のために、例えばキアジェン(Qiagen)PCRキットを使用してもよい。代案としては蛍光標識プライマーをRT反応で使用して、未標識のdCTPのみを添加する。
いくつかの方法の一つによって、蛍光染料で標識されたcDNART生成物を検出する。それは分光光度計で測定できる。例えばCy3標識DNA分子は、吸光係数150,000M−1で波長550nmで日常的に測定される一方、Cy5標識DNAは吸光係数250,000M−1で650nmで測定される。標識DNAを直接検出するより感度の良い方法は、ナイロン膜またはガラススライドなどのマトリックスに固定化された標的DNA配列分子に生成物をハイブリダイズすることである。次にハイブリダイゼーション後のシグナルは、レーザースキャナーで適切にフィルターリングしてスキャンし、使用した特定の染料を検出できる。この方法は、当該技術分野、特にDNAマイクロアレイ技術でよく知られている。
Claims (22)
- a)診断用標的RNAを含んでなる少なくとも1つの細菌細胞の少なくとも一部を含んでなるサンプルを提供するステップと、
b)サンプルとRT−PCR組成物とを接触させてRT−PCR反応混合物を形成するステップと、
c)RT−PCR反応混合物をサーモサイクリングすることによって、診断用標的DNA生成物が増幅されるステップと、
d)(c)の増幅された診断用標的DNA生成物を検出するステップと
を含んでなるが、ただしいずれのステップもRNA精製を含まない、細菌から診断用標的RNAを直接検出するための方法。 - a)診断用標的RNAを含んでなる少なくとも1つの細菌細胞の少なくとも一部を含んでなるサンプルを提供するステップと、
b)診断用DNA生成物がRNAから転写される条件下で、サンプルとRT反応組成物とを接触させてRT反応混合物を形成するステップと、
c)診断用標的DNA生成物を検出するステップと
を含んでなるが、ただしいずれのステップもRNA精製を含まない、細菌から診断用標的RNAを直接検出するための方法。 - ステップ(b)の後に、
診断用DNA生成物とPCR組成物とを接触させてPCR反応混合物をもたらすステップと、
得られたPCR反応混合物をサーモサイクリングによって、診断用標的DNA生成物が増幅されるステップをさらに含んでなる請求項2に記載の方法。 - 検出が、標識を診断用標的DNA生成物に組み込むか、または付着させることを含んでなる請求項2に記載の方法。
- 標識が、蛍光部分、化学発光部分、粒子、酵素、放射性タグ、および発光部分よりなる群から選択される請求項3に記載の方法。
- サンプルと溶菌剤とを接触させるステップをさらに含んでなる請求項1、2または3のいずれか一項に記載の方法。
- 溶菌剤が溶菌性緩衝液および高温よりなる群から選択される請求項6に記載の方法。
- 溶菌剤が、化学薬品、酵素、および物理的剪断よりなる群から選択される請求項6に記載の方法。
- 酵素が、リゾチーム、グルコラーゼ、ザイモロース、リチカーゼ、プロテイナーゼK、プロテイナーゼE、およびウィルス性エンドリシンよりなる群から選択される請求項8に記載の方法。
- ウィルス性エンドリシンが、バクテリオファージまたはプロファージからのエンドリシン、およびこれらの組合わせよりなる群から選択される請求項9に記載の方法。
- ウィルス性エンドリシンが、リステリア(Listeria)バクテリオファージA118およびPLY118からのエンドリシン、バクテリオファージPM2からのエンドリシン、枯草菌(B.subtilis)バクテリオファージPBSXからのエンドリシン、乳酸桿菌(Lactobacillus)プロファージLj928、Lj965、およびバクテリオファージピアダ(Phiadh)からのエンドリシン、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)バクテリオファージCp−1からのエンドリシン(Cpl−1)、ストレプトコッカス・アガラクティー(Streptococcus agalactiae)バクテリオファージB30からの二官能性ペプチドグリカンリシン、スタフィロコッカス・ワーネリー(Staphylococcus warneri)MファージvarphiWMYの二成分細胞溶解遺伝子holWMYおよびlysWMY、およびこれらの組合わせよりなる群から選択される請求項9に記載の方法。
- 物理的剪断がジルコニア−シリカビーズまたはフレンチプレスによって生じる請求項8に記載の方法。
- 少なくとも1つのRNアーゼ阻害物質をサンプルに添加するステップをさらに含んでなる請求項1、2または3のいずれか一項に記載の方法。
- 少なくとも1つのRNアーゼ阻害物質が、
(i)胎盤リコンビナント50kDタンパク質、
(ii)ブタリコンビナントタンパク質胎盤RNアーゼ、
(iii)ブタRNアーゼ、
(iv)抗RNアーゼ抗体、
(v)イソチオシアン酸グアニジニウム、
(vi)ピロ炭酸ジエチル、および
(vii)ヒト胎盤リボヌクレアーゼ阻害物質
の1つもしくはそれ以上を含んでなる請求項13に記載の方法。 - サンプルが約50℃〜約100℃未満の範囲の温度に加熱される請求項1、2または3のいずれか一項に記載の方法。
- 診断用標的RNAが、mRNA、rRNA、tRNA、および小型RNA種よりなる群から選択される請求項1、2または3のいずれか一項に記載の方法。
- rRNAが、5S RNA、16S RNA、および23 SRNAよりなる群から選択される請求項16に記載の方法。
- 少なくとも1つの細菌細胞が、リステリア(Listeria)、エシェリキア(Escherichia)、サルモネラ(Salmonella)、カンピロバクター(Campylobacter)、クロストリジウム(Clostridium)、ヘリコバクター(Helicobacter)、マイコバクテリウム(Mycobacterium)、ブドウ球菌(Staphylococcus)、カンプロバクター(Camplobacter)、腸球菌(Enterococcus)、バシラス(Bacillus)、ナイセリア(Neisseria)、赤痢菌(Shigella)、連鎖球菌(Streptococcus)、ビブリオ(Vibrio)、エルシニア(Yersinia)、ボルデテラ(Bordetella)、ボレリア(Borrelia)、およびシュードモナス(Pseudomonas)よりなる群から選択される属のメンバーである請求項1、2または3のいずれか一項に記載の方法。
- サンプルが、食品、肉、生鮮食品、乳製品、果物、牛挽肉およびこれらの組合わせよりなる群から選択される請求項1、2、3または4のいずれか一項に記載の方法。
- サンプルが、食品加工状況から採取されるサンプルおよび医学的状況から採取されるサンプルよりなる群から選択される請求項1、2、3または4のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1に記載の方法を記述する説明書、およびRT−PCR組成物を含んでなり、
RT−PCR組成物が、診断用標的RNAと相補的な少なくとも1つのプライマー、熱活性化された熱安定性ポリメラーゼ、逆転写酵素、dNTP、適切な緩衝液、RNアーゼ阻害物質の要素の少なくとも1つを含んでなる細菌から診断用標的RNAを直接検出するためのキット。 - 請求項2、3または4のいずれか一項に記載の方法を記述する説明書、および
RT反応組成物を含んでなり、
RT組成物が、診断用標的RNAと相補的な少なくとも1つの核酸プライマー、逆転写酵素、dNTP、適切な緩衝液、検出染料、検出プローブ、RNアーゼ阻害物質の要素の少なくとも1つを含んでなる細菌から診断用標的RNAを直接検出するためのキット。
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