JPH05505105A - 高温度逆転写酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （ｂ）熱活性ポリメラーゼ； （ｃ）逆転写酵素用緩衝溶液；および （ｄ）ＭｎＣＩ！ｚ溶液 を含んでなるキット。

３２．４種の異なるデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの各々を更に含 んでなる請求の範囲第３１項に記載のキット。

３３、前記熱活性ポリメラーゼが、ｎＴａｑ、ｎＴｔｈ、９４ｋＤａ　ｒＴａｑ 、５ｔｏｆｆｅｌ断片、およびｒＴｔｈからなる群から選択される請求の範囲第 ３１項に記載のキット。

３４、前記Ｍ　ｎ　Ｃｌ　！が、約０．８および１．４ｍＭＭｎＣｌ！ｔの間の 最終濃度を与えるべく、逆転写反応において使用するために好適な量をもって存 在する請求の範囲第３１項に記載のキット。

３５、ＰＣＲ実施のための緩衝溶液を更に含んでなる請求の範囲第３２項に記載 のキット。

３６８正の対照ＲＮＡおよび正の対照ＲＮＡ逆転写用プライマを更に含んでなる 請求の範ｒＭＩ！３２項に記載のキット。

３７．前記逆転写緩衝溶液が、約５０−１０５０−１Ｏ０の間の最終濃度を与え るべく逆転写反応において使用するために好適な量をもってＫＣｊ７を更に含有 してなる請求の範囲第３４項に記載のキット。

３８、ＰＣＲ実施のための前記緩衝溶液が、ＥＧＴＡを含むキレート形成緩衝溶 液として好適なものである請求の範囲第３５項に記載のキット。

３９、溶液中にＭｇＣ１ｘを更に含んでなる請求の範囲第３８項に記載のキット 。

４０、前記成分か、下記の最終濃度： ０．２−２ｍＭ　ＥＧＴＡ １−１０％　グリセロール ５０−１２５ｍＭ　ＫＣｆ １　３ｍＭ　ＭｇＣｌ２ を与えるべく　ＰＣＲ反応における使用に適した量をもって存在する請求の範囲 第３８項に記載のキット。

明　細　書 高温度逆転写酵素 本発明は、分子生物学の分野に関連し、リボ核酸（ＲＮＡ）配列の複写および増 幅のための改良された方法を提供するものである。好ましい実施態様において、 本発明は、熱活性（ｔｈｅｒｍｏａｃ　ｔ　１ｖｅ）ＤＮＡポリメラーゼを使用 するＲＮＡテンプレートからの相補的複写物の合成方法を提供する。別の側面に おいて、本発明は、熱活性ＤＮＡポリメラーゼを使用するＲＮＡテンプレートか らのＤＮＡ分節の増幅方法を提供する。

「逆転写酵素」なる用語は、ＲＮＡ−依存性ＤＮＡポリメラーゼとして特徴付け られるポリメラーゼの種類を記述するものである。公知のすべての逆転写酵素は 、ＲＮＡテンプレートからＤＮＡ転写物を合成するためにプライマを必要とする 。歴史的には、逆転写酵素は、初期においてｍ　ＲＮ　ＡをｃＤＮＡに転写する ために使用され、このｃＤＮＡは、更に操作するためのベクター中にクローン化 され得る。

トリ筋芽細胞腫ウィルス（ＡＭＶ）逆転写酵素が、最初に広く使用されたＲＮＡ −依存性ＤＮＡポリメラーゼであった（ＶｅｒｍａＳ　１９７７、Ｂｉｏｃｈｅ ｍ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　４７３：１）。核酵素は、５−−３−ＲＮＡ一方向 性ＤＮＡポリメラーゼ活性、５−−３”ＤＮＡ一方向性ＤＮＡポリメラーゼ活性 、およびＲＮａｓｅＨ活性を有している。ＲＮａｓｅＨは、ＲＮＡ−ＤＮＡハイ ブリッドのＲＮＡｍ１に対して特異的な前進的５゛および３′リボヌクレアーゼ である公知のウィルス性逆転写酵素は、校正に必要な３′→５′エキソヌクレア ーゼ活性を欠いているために、転写における誤りを逆転写酵素により正すことは できない（Ｓａｕｎｄｅｒｓおよび５ａｕｎｄｅｒｓ、１９８７、Ｃｒｏｏｍ　 Ｈｅ１ｍ、Ｌｏｎｄｏｎ）ｏ　ＡＭＶ逆転写酵素の活性およびそれに伴われるＲ ＮａｓｅＨ活性の詳細な研究は、Ｂｅｒｇｅｒらの、１９８３、Ｂｉｏｃｈｅｍ ｉｓｔｒｙ　２２：２３６５−２３７２によって示されている。

Ｂｅｒｇｅｒらは、ＲＮＡ転写における律速段階か、付加的ヌクレチオド類の連 続する重合よりむしろ転写反応の開始にあることを見出した。この制限を克服す るために、触媒量よりむしろ化学量論的量の逆転写酵素の使用がしばしば推奨さ れている（Ｂｕｅｌｌらの、Ｃｈｅｍ、２５３　：２４８３−２４９５　；Ｙｏ ｏらの、０１ｃａ７ａｍａおよびＢｅｒｇの、１９８２、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１． 　Ｂｉｏｌ、２：１６１−１７０）　。

しかしなから、化学量論的量の逆転写酵素を使用した場合、低水準のＲＮａ　ｓ 　ｅＨ活性が育意なものとなって、断片化ｃＤＮＡの原因となり制限されたｃＤ ＮＡ収率をもたらすであろう。Ｃｈｒ　ｉｓ　ｔｏｐｈｅｒらの１９８０、Ｅｕ ｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｉｌｌ：４１９０−４２３１、およびＭｉｃｈｅｌｓ ｏｎらの、１９８３、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０： ４７２−４７６は、ｃＤＮＡ反応物中にＲＮａ　ｓ　ｅ阻害剤を含めることで、 この問題が緩和されることを示唆した。

Ｅ、ｃａｌｉ等の中温微生物から単離されたＤＮＡポリメラーゼは、広く研究さ れている（例えば、Ｃｈｅｍ、２４１　：５４１９−５４２７参照）。

Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｐｏｌ　Ｉ）は、ニック−トランスレー ション反応、ＤＮＡ配列決定、インビトロ変異生成、第２鎖ｃＤＮＡ合成、ポリ メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびリンカ連結のための平滑末端形成等を含む数 多くの応用に作用である（Ｍａｎｉａｔｉｓらの、１９８２、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ 、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）。

いくつかの研究室は、ある種のＤＮＡポリメラーゼはインビトロにおけるＲＮＡ の逆転写か可能であることを示している（Ｋａｒｋａｓの、１９７３、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７１　：ｌ０３５−１０３９；ならびにＷ ｉｔｔｉｇおよびＷｉｔｔｉｇの、１９７８、Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、５： １１６５−１１７８）。Ｇｕｌａｔｉらは、Ｅ、ｃｏｌｊＰａｌ　Ｉか、オリゴ （ｄＴ）、。をプライマとして使用してＱβウィルス性ＲＮＡを転写するために 使用され得ることを見出した。Ｗ　ｉ　ｔ　ｔ　ｉ　ｇおよびＷｉｔｔｉｇは、 Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｐｏｌ　Ｉが、オリゴ（ｄＡ）を用いて酵素的に延長されたｔＲ ＮＡを逆転写するために使用され得ることを示した。しかしながら、Ｇｕｌａｔ ｉらか示したように、必要な酵素量および小さいｃＤＮＡ生成物は、Ｅ、ｃｏｌ ｉ　Ｐａｌ　Ｉの逆転写酵素活性か実際的な価値をほとんど持たないことを示唆 している。

存在する核酸配列を、その最初に存在する量に比へ大量に増幅するための熱安定 性酵素の使用は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）工程が記述されている米国特 許第４．６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号に記載されている。こ れらの特許を、ここに参考として組入れる。プライマ類、テンプレート、ヌクレ オシドトリホスフェート類、適当な緩衝液および反応条件、ならびにポリメラー ゼか、ＰＣＲ工程においては使用され、これは標的ＤＮＡの変性、プライマ類の ハイブリッド形成、および相補鎖の合成を含む。各プライマの伸長生成物は、所 望の核酸配列の生成のためのテンプレートになる。これらの特許には、使用され るポリメラーゼが熱安定性酵素である場合に、熱によって該ポリメラーゼ活性か 破壊されないことから、各変性工程の後にポリメラーゼを追加する必要がないこ とが開示されている。

熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、例えばＰＣＲによるＤＮＡ増幅の実施における ような短時間について、９３−９５°Ｃに加熱された場合にも恒久的に不活性化 されることはない。これと対照的に、この昇温下では、Ｅ。

ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　Ｐａｌ　Ｉおよび従来記述されている逆転写酵素は、不活性 化される。

Ｔｈｅｒｍｕｓ　ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）由来の熱安定性ＤＮＡポリメラ ーゼは、ここに参考として組入れるＬａｗｙｅｒらの１９８９、Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２４６：６４２７−６４３７ならびに米国特許第４，８８９，８１８ 号および同時に係属する１９８８年１月１２日出願の出願番号第１４３，４４１ 号に記述されているように、クローン化され、発現され、組換え細胞から精製さ れている。Ｔ、ａｑｕａｔｉｃｕｓから単離された粗製のＤＮＡポリメラーゼ活 性調製物は、他にも記述かある（Ｃｈｉｅｎらの、１９７６、ＬＢａｃｔｅｒｉ ｏｌ、１２７：１５５０−１５５７およびＫａｌｅｄｉｎらの、１９８０、Ｂｉ ｏｋｙｍｉｙａ４５：６４４−６５１）。

Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ　（Ｔｔｈ）由来の熱安定性ＤＮＡ ポリメラーゼも精製され、ここに参考として組入れる１９８９年１２月２０日出 願の、本願と共通して誼渡された係属中の出願番号第４５５，９６７号に記述さ れている。該′９６７特許出願には、Ｔｈｅｒｍｕｓ　ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉ ｓ由来のＴｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードする遺伝子か同定され、クロ ーン化されたことも記述されている。組換えＴｔｈは、熱安定性酵素の調製につ いて別法を提供する。Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ　ｍａｒｉｔｉｍａ由来の熱安定性 ＤＮＡポリメラーゼは、ここに参考として組入れる１９９０年８月１３日出願の 同時係属中の代理人整理番号第２５７０号に記述されている。

ＰＣＲは、増幅のために核酸テンプレートおよび適当なプライマ類を必要とする 。増幅されるべきＤＮＡは、プラスミド中に含まれるか、または不均質試料中に 含まれる合成的または遺伝子的なものであってもよい。増幅されるべきヌクレオ チド配列かＲＮＡである場合には、該核酸分子は最初にプライマの存在下で逆転 写酵素により処理され、増幅のためのｃＤＮＡテンプレートか与えられる。本発 明以前においては、ＲＮＡの増幅は、例えばモロニーネズミ白血病ウィルス逆転 写酵素（Ｍ。

ＭｕＬＶ　ＲＴ）またはＡＭＶ−ＲＴ等を用いた逆転写工程を必要とし、次いで 得られた単＠　ｃ　Ｄ　Ｎ　ＡのＤＮＡポリメラーゼを用いた処理か行われた。

ＲＮＡの増幅は、単一の酵素を用いたＲＮＡの逆転写およびＤＮＡの増幅のため の方法か利用可能であることによりかなり単純化され得る。

本発明は、この要求に向けられたもので、熱活性ＤＮＡポリメラーゼによる高温 度ｃＤＮＡ合成を提供する。

本発明は、また唯一つの酵素である熱安定性ＤＮＡポリメラーゼのみを必要とす るＲＮＡ配列の効率的増幅方法を提供する。これらの方法は、現在知られている 方法より単純かつ増大した特異性をもたらす。

−側面において、本発明は、ＲＮＡテンプレートの逆転写方法を提供するもので 、該方法は、前記ＲＮＡテンプレートを含む試料を、前記ＲＮＡテンプレートに 対してこれにハイブリッドするために充分に相補的であるオリゴヌクレオチドプ ライマ、および熱活性ＤＮＡポリメラーゼと共に、４種のデオキシリポヌクレオ シドトリホスフェート類の存在下、適切な緩衝溶液中において、前記プライマか 前記ＲＮＡテンプレートにハイブリッドし、かつ前記熱活性ＤＮＡポリメラーゼ が前記デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの重合反応に対して触媒作用 して前記ＲＮＡテンプレートの配列に対して泪補的なｃＤＮＡ配列を形成するた めに充分な温度にて処理することを含んでなる。

別の面において、本発明は、ＲＮＡテンプレートの増幅方法を提供するもので、 該方法は、（ａ）試料を、標的ＲＮＡに対してこれにハイブリッドするために充 分に相補的である第１のプライマ、および熱活性ＤＮＡポリメラーゼと共に、４ 種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート類の存在下、適切な緩衝溶液中 において、前記第１のプライマが前記標的ＲＮＡにハイブリッドし、かつ前記熱 活性ＤＮＡポリメラーゼが前記デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの重 合反応に対して触媒作用して前記標的ＲＮＡの配列に対して相補的なｃＤＮＡ配 列を形成するために充分な温度にて処理し：　〜（ｂ）工程ｆａ）で形成された 前記ｃＤＮＡを処理して単鎖ｃＤＮＡを与え；（Ｃ）工程（ｂｌで形成された前 記単鎖ｃＤＮＡを、少なくとも一つの単鎖ｃＤＮＡ分子にハイブリッド可能であ り、かつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在下、二重鎖ｃＤＮＡ分子の生成に適 切な条件のもとに伸長生成物の合成開始を可能とする第２のプライマと共に処理 し：ならびに（ｄｌ工程（Ｃ）の二重＠　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ分子をポリメラーゼ連 鎖反応により増幅することを含んでなる。

また別の面において、本発明は、生物学的試料中の特定の標的ＲＮＡ配列の検出 方法を提供するもので、該方法は、（ａｌ前記試料を、前記標的ＲＮＡに対して これにハイブリッドするために充分相補的であるプライマ、および熱活性ＤＮＡ ポリメラーゼと共に、４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート類の存 在下、適切な緩衝溶液中において、前記プライマが前記標的ＲＮＡにハイブリツ ドし、かつ前記熱活性ＤＮＡポリメラーゼが前記デオキシリボヌクレオシドトリ ホスフェートの重合反応に対して触媒作用して前記標的ＲＮＡ配列に対して相補 的なｃＤＮＡ配列を形成するために充分な温度にて処理し；（ｂ）工程（ａｌで 形成されたｃＤＮＡを処理して単鎖ｃＤＮＡおよびＲＮＡテンプレートを与え： ならびに（Ｃ）前記ｃＤＮＡの存在を検出することを含んでなる。

本発明の別の側面において、７ｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼが、組換え宿主細胞か ら精製される。該精製蛋白質は、一般的にはＤＮＡポリメラーゼとして機能し、 また好ましい実施態様において逆転写酵素として機能する。

図１は、ＭｇＣｚｔおよびＭ　ｎ　ＣＩ！！緩衝溶液中における、Ｅ、ｃｏｌｉ 　Ｐｏｌ！　Ｉ、ＴａｑおよびＭ　ｏ　ＭｕＬＶ逆転写酵素の逆転写酵素活性の 比較を示すグラフである。

図２は、Ｔｔｈポリメラーゼ、９４ｋＤａ　ｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、およ びＡｍｐ　１１Ｔａｑ”ＤＮＡポリメラーゼ、５ｔｏｔｔｅｌ断片（６２ｋＤａ ｒＴａｑとも称される）により触媒作用を受ける、種々のＭｎ’＋濃度における ＲＮＡテンプレートの逆転写を比較するグラフである。

図３は、例Ｖに記述される結合ＲＴ／ＰＣＲアッセイの結果を示す図である。

図４は、種々の量の全細胞ＲＮＡを使用した例■に記述される結合ＲＴ／ＰＣＲ アッセイの結果を示す図である。

図５は、ＲＴおよびＰＣＲアッセイに別の熱安定性酵素を使用したＲＴ／ＰＣＲ アッセイの結果を示す図である。

本発明は、ＲＮＡを効率的に転写し、増幅する改良された方法を提供するもので ある。これらの改良は、熱活性ＤＮＡポリメラーゼの従来未知であった性質の発 見および応用によって達成される。該方法は、任意の所望のＲＮＡ標的の逆転写 および増幅について単−酵素法を提供するもので、一種より多い酵素を必要とす る従来方法に取って替わるものである。

該方法は、前記ＲＮＡテンプレートを含む試料を、前記ＲＮＡテンプレートに対 してこれにハイブリッドするために充分相補的であるプライマ、および熱活性Ｄ ＮＡポリメラーゼと共に、４種すべてのデオキシリボヌクレオキシドトリホスフ ェート類の存在下、適切な緩衝溶液中において、前記プライマが前記ＲＮＡテン プレートにハイブリッドし、かつ前記熱活性ＤＮＡポリメラーゼが前記デオキシ リボヌクレオシドトリホスフェートの重合反応に対して触媒作用して前記ＲＮＡ テンプレートの配列に対して相補的なｃＤＮＡ配列を形成するために充分な温度 にて処理することを含んでなる。本発明に従うと、該ＤＮＡポリメラーゼは、熱 活性であると共に熱安定性であることかできる。

別の面において、ＲＮＡテンプレートへのアニール化に適したプライマは、ＰＣ Ｒによる増幅にも好適である。

ＰＣＲのために、逆転写されたｃＤＮＡ鎖に相補的な第２のプライマは、伸長生 成物の合成の開始部位を与える。

周知のように、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡテンプレート上にてこの 伸長反応に対して触媒作用可能である。しかしながら、本発明以前においては、 該酵素がＲＮＡ依存性逆転写反応にも触媒作用をし得ることを何人も認識しなか った。

熱活性ＤＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ分子の増幅においては、最初の伸長反応 はＲＮＡテンプレートを使用する逆転写であって、ＤＮＡ鎖が生成される。ＤＮ Ａテンプレートを使用する第２の伸長反応は、二重ＭＤＮＡ分子を生成する。か くして、熱活性ＤＮＡポリメラーゼによるＲＮＡテンプレートからの相補的ＤＮ Ａ鎖の合成は、増幅のための出発材料を与える。

本発明の別の面において、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、結合された、−酵素 の逆転写／増幅反応において使用され得る。

本発明は、試料中のＲＮＡ標的分子検出のための単純化され、かつ改良された方 法を提供する。これらの方法は、逆転写、第２１１　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ合成、およ び所望によりＰＣＲにより増幅について触媒作用されるために熱安定性ＤＮＡポ リメラーゼを使用する。かくして本発明は、従来方法か２種類必要としていた酵 素をｌｆｌ類のみ必要とする方法を提供する。従来方法は、各工程に異なった酵 素を使用することにより必要とされる２組の熟成条件をも要した。本発明の方法 は、従来のＲＮＡクローニングおよび診断方法に比へ、特異性か有意に増大し、 かつ工程かより少ないＲＮＡの転写および増幅方法を提供する。これらの方法は 、研究室または臨床分析のためのキットにおける使用にも適用できる。

本発明は、多くの供給源由来のＲＮＡの転写および増幅に好適である。ＲＮＡテ ンプレートは、例えばウィルスまたは細菌核酸調製物等の生物由来の核酸調製物 中に含まれてもよい。該調製物は、細胞破砕物、およびその他の成分、精製全Ｒ ＮＡまたは精製ｍＲＮＡを含んでもよい。ＲＮＡテンプレートは、試料中の異種 ＲＮＡ分子の母集団または特定の標的ＲＮＡ分子であってよい。

本発明方法における使用に適したＲＮＡは、特定の標的ＲＮＡを含むと予想され る生物学的試料に含まれていてもよい。該生物学的試料は、例えば血液試料また は生組織試料等のＲＮＡか試料の微少部分であるような異種的試料であってもよ い。従って、該方法は、臨床的検出および診断のために有用である。該ＲＮＡ標 的は、特定の疾患または感染性物質の指示物質であってもよい。

ＲＮＡは、種々の方法により調製され、その選択は試料供給源および利用可能性 に依存するであろう。ＲＮＡの調製方法は、Ｄａｖｉｓらの、１９８６、Ｂａ５ ｉｃ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ。

Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ＮＹ、第１１章；Ａｕ５ｕｂｅｌらの、１９８７、Ｃｕｒｒ ｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉａｌｏｇｙ、第４ 章、Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ、ＮＹ；Ｋａｗａｓａｋｉおよび Ｗａｎｇの１９８９、ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｅｒｌ　ｉｃｈ編、５ｔｏ ｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ　ＮＹ；Ｋａｗａｓａｋｉの１９９０、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ。

Ｉｎｎ１ｓら編、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ。

Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ＋　ならびにＷ　ａ　ｎ　ｇおよびＭａｒｋの、１９９０、 ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄＡ ｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎ１ｓら編。

Ａｃａｄｅｍｉｃ　ＰｒｅｓｓｌＳａｎ　Ｄｉｅｇｏに記述されており、これら をここに参考として組入れる。

例示的実施態様において、ＲＮＡテンプレートは、インビトロでＴ７ＲＮＡポリ メラーゼ転写によりＤＮＡテンプレートから合成された。ｃＲＮＡと称される得 られたＲＮＡテンプレートは、ゲル電気泳動またはすりゴ（ｃｌＴ）クロマトグ ラフィー等を含む種々の手段により精製され得る（ここに参考として組入れる、 Ｗ　ａ　ｎ　ｇらの、ｌ９８９、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

８６：９７１７、および共通して膿渡されている係属中の米国特許出願第４１３ ．６２３号（１９８９年９月２８日出願）を参照）。

本発明方法の第１の工程は、ＲＮＡテンプレートか適切なプライマと結合するこ とを必要とする。ここで使用されているように、「プライマ」なる用語は、プラ イマ伸長生成物の合成か開始される条件下、すなわち、４種の異なるヌクレオシ ドトリホスフェートおよび熱安定性酵素の存在下で適切な緩衝溶液（「緩衝溶液 」は、ｐＨ、イオン強度、補因子等を含む）中、適切な温度において、核酸テン プレートにアニール化した場合にＤＮＡ合成の開始点として作用し得るオリゴヌ クレオチドを指す。開示される方法の工程（ａ）において好適なプライマは、Ｒ ＮＡテンプレートにハイブリットし得る。特定のＲＮＡ標的分子に対して充分に 相補的な配列を存するプライマは、もし存在する場合には、特定の標的ＲＮＡ分 節に対して相補的な第１のｃＤＮＡ鎖の合成開始のために使用され得る。該プラ イマは、熱安定性酵素の存在下、伸長生成物の合成を開始するために充分な長さ を有する。該プライマは、オリゴ（ｄＴ）等のオリゴデオキシリボヌクレオチド であってもよい。

オリゴ（ｄＴ）は、ｍＲＮＡ類のポリアデニル化（ポリＡ）配列にハイブリット し、ｍＲＮＡ類の異種的母集団からのｃＤＮＡ合成のプライマを提供する。はと んとの真核性ｍＲＮＡは、３″末端にポリＡ配列を含むため、オリゴ（ｄＴ）プ ライマは、本発明方法において一般的な用途、例えばｃＤＮＡライブラリの１ｌ ｌｌ！等における用途を有している。

該プライマは、典型的には１０−３５個のヌクレオチドを含むが、厳密な個数は 、本方法の成功裏の応用について臨界的なものではない。短いプライマ分子は、 テンプレートと充分安定なハイブリッド複合体を形成するためにはより低温度を 必要とする。オリゴ（ｄＴ）プライマについては、開示された方法に従うと、高 温度ｃＤＮＡ調製のためには長さ１６−２１個のヌクレオチドのものか好適であ るが、プライマーテンプレート二重体に増大した安定性を与えてオリゴ（ｄＴ） プライマを伸長するために、準至適温度において初期熟成に付すことが好ましい てあろう。例えば、高温度に対して好ましい方法においては、オリゴ（ｄＴ）１ ｓ、ｔ＋を用いる逆転写は、室温での１０分間の熟成、続いて４２°Ｃでの１０ 分間、最終的に７０℃での２５分間の熟成を含む。別法として、低温度の熟成を 、鎖長を増大したオリゴ（ｄＴ）（すなわちオリゴ（ｄＴ）ｓｉ−４寥）を使用 することにより避けることができる。本発明の例において、プライマ類は、ヒト サイトカイン類インターロイキン−１−アルファ（ＩＬ−１α）またはインター ロイキンー２−ベータ（ＩＬ−１β）をコードするｍＲＮＡ分子の一部分に相補 的なりＮＡである。いくつかの例において、該ｃＤＮＡプライマは、合成ＲＮＡ テンプレート（ｃＲＮＡ）にハイブリッドする。

合成オリゴヌクレオチドは、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉらの１９８１、Ｊ、Ａｍ、Ｃｈ ｅｍ、Ｓｏｃ、１０３：３１８５−３１９１のトリエステル法を使用して調製さ れ得る。別法として、例えばシアンエチルホスホラミダイト化学を用いるＢｉｏ ｓｅａｒｃｈ　８７００ＤＮＡ合成装置による自動合成か好ましい。

プライマ伸長が起こるためには、このプライマがＲＮＡテンプレートにアニール しなければならない。逆転写が起こるために、該プライマのすべてのヌクレオチ ドがテンプレートにアニールする必要はない。該プライマ配列は、テンプレート の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非相補的断片をプライマの５′末 端に結合し、該プライマの残部がＲＮＡに相補的であるようにしてもよい。別法 として、該プライマ配列が、ハイブリッドが起こり、かつ相補的ＤＮＡ鎖の合成 を許容するために充分にＲＮＡテンプレートに相補的である限り、該プライマ中 に非相補的塩基を散在させることができる。

ｃＤＮＡ調製の従来方法は、プレアニール化工程を必要とした。該ＲＮＡテンプ レートの２次および３次構造の不安定化が、該プライマのＲＮＡへのハイブリッ ドを許容するために必要であろう。一般にアニール化は、種種の手段により達成 され、アニール緩衝溶液の存在下で常法により行われる。Ｍａｎｉａｔｉｓら（ 前出文献）は、アニール緩衝溶液の例を与えている。アニール化方法は、限定さ れるものではないか、高温度で短時間、ＲＮＡ／プライマ混合物を熟成し、次い で段階的に冷却するか、またはドライアイス／エタノール浴中て該混合物を急冷 することを含む。鎖の２次構造相互作用がｃＤＮＡ合成またはプライマのアニー ル化に干渉することを防止するために、逆転写に先立って使用される低温度にお いて、ある研究者らは、ＲＮＡテンプレートをメチル水銀ヒドロキシド等の化学 変性剤により処理することにより修飾した（ＢａｉｌｙおよびＤａｖｉｄｓｏｎ の、１９７６、Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、７０ニア５）。しかしながら、この ような変性剤は一般に極めて有毒な発癌性化合物であり、また酵素阻毒を避ける ために注意深く除去しなければならない。

本発明によれば、逆転写を起こさせるために該プライマはテンプレートにアニー ル化しなければならないが、別個のアニール化工程は必要でない。熱活性逆転写 酵素活性は、厳密なアニール化に好適な高温度においても不可逆的に変性される ことがないため、該ポリメラーゼ酵素の添加に先立って、変性されたテンプレー トの急冷または段階的冷却を行なう必要がない。従来方法は、加熱され、変性さ れたＲＮＡを酵素活性と両立する条件、通常３７°Ｃ−４２℃を与えるために、 温度低減中にアニール化プライマーテンプレート構造か維持されるように冷却す る必要かあった。本発明は、ＲＮＡの高温度逆転写方法ヲ提供し、プレーアニー ル化工程および化学的変性剤の使用を除くものである。本発明のこの側面は、例 Ｖ−■に例示される。

本発明方法では、アニール化プライマーＲＮＡテンプレートの逆転写か、熱活性 または熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにより触媒作用を受ける。ここにおいて使用 される「熱安定性ポリメラーゼ」なる用語は、熱安定性または熱耐性であり、デ オキシリボヌクレオチドの重合化に触媒作用して、核酸鎖に相補的なプライマ伸 長生成物を形成する酵素を指す。ここで作用な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ類は 、ＰＣＲ増幅において単鎖核酸の不安定化または二重鎖核酸の変性を生じさせる ために必要な時間、上昇温度に付した場合にも不可逆的に不活性化されない。

酵素の不可逆的変性とは、酵素活性の実質的欠損を指す。

熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、好ましくは重合条件下、約９０−１００℃にお いて不可逆的に変性しないであろう。

本発明の別の面において、高温逆転写のためのＤＮＡポリメラーゼか熱活性であ ることのみが本質的である。

ここにおいて使用される「熱活性ポリメラーゼ」なる用語は、６０℃以上の温度 においてデオキシリボヌクレオチドの重合反応に触媒作用して、核酸テンプレー ト鎖に相補的なプライマ伸長生成物を形成することかできる酵素を指す。本発明 によると、逆転写について熱活性ポリメラーゼは５０°Ｃ以上で最大活性を有す る。該熱活性ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡ不安定化およびプライマアニール化 の条件下で、５０℃−８０℃の温度において不可逆的に変性しない。示される例 において、熱活性ＤＮＡポリメラーゼは熱安定性でもある。しかしながら、熱活 性の非熱安定性酵素も本発明の実施のために適している。ＲＮＡテンプレートか らのｃＤＮＡの調製は、上昇された温度における反復する変性サイクルを含まな いため、該方法に有用な酵素が熱活性であることに加えて熱安定性であることは 本質的でない。

開示される方法は、一つのＲＮＡのテンプレートから多くのｃＤＮＡ転写物を調 製するために有用である。このような用途のためには、熱安定性ＤＮＡポリメラ ーゼが好ましい。加えて、高温度逆転写のための開示される方法が、ＰＣＲと結 合される場合には、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ類が好ましい。

加熱条件は、緩衝溶液、塩濃度、および変性される核酸に依存するであろう。当 然であるが、ｍＲＮＡの逆転写については、該テンプレート分子が一般に単鎖で あり、従って高温度変性工程が不要であることが認識されるであろう。しかしな がら、二重鎖ＲＮＡも記述される逆転写／増幅方法のために好適なテンプレート を提供する。

二重鎖ＲＮＡテンプレートは、例えばしオウイルス、ブルータングウィルス、コ ロラドチック熱ウィルス、および殺酵母因子を含む。

ＲＮＡ不安定化の温度は、典型的には５０−８０°Ｃの範囲にある。プライマ伸 長の第１サイクルは、前述した変性および増幅のために好適な二重鎖テンプレー トを与える。核酸変性のための温度は、核酸長、塩基成分および試料中に存在す る単鎖配列間の相補性に依存し、典型的には０．５−４分間である変性か起こる ために充分な時間について、典型的には約９０−約１０５°Ｃの範囲にある。

熱安定性または熱活性ＮＤＡポリメラーゼは、約４０℃以上、例えば６０−８０ ℃の温度に至適活性を存することが好ましい。４２°Ｃよりかなり高温度におい ては、熱安定性または熱活性ＤＮＡポリメラーゼ以外のＤＮＡおよびＲＮＡ−依 存性ポリメラーゼは、不活性化される。

Ｓｈｉｍｏｍａｖｅおよび５ａｌＶａｔＯの、ｌ９８９、Ｇｅｎｅ　Ａｎａｌ、 Ｔｅｃｈｎ、６；２５−２８は、ＡＭＶ−ＲＴか４２°Ｃで最高の活性を有する ことを記述している。該酵素は、５０°Ｃにおいて５０％の活性を有し、また５ ５°ＣにてＡＭＶ−ＲＴは活性の至適水準のわずか１０％を維持する。かくして 、ＡＭＶ−ＲＴは、ＲＮＡテンプレートを使用する高温度重合反応の触媒には不 適当である。本発明方法のみか熱活性ＤＮＡポリメラーゼを用いる高温度逆転写 方法を提供する。

プライマのテンプレートへのハイブリット形成は、プライマの成分および長さに 加え、塩濃度に依存する。熱安定性または熱活性ポリメラーゼを使用する場合、 ハイブリッド形成は、ブライミングの増大した選択性および／またはより高い厳 格性のために好ましい高温度（例えば４５−７０”Ｃ）にて起こり得る。該ポリ メラーゼ酵素に対する高温度の至適条件は、ＲＮＡ転写および引続く増幅か、プ ライマハイブリッド形成の選択性のためより高い選択性をもって進行することを 可能とする。好ましくは、ＲＮＡ逆転写の至適温度は、約５５−７５°Ｃ１更に 好ましくは６５−７０℃の範囲にある。

本発明は、増大したプライマ依存特異性を存する、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ により触媒作用を受けるＲＮＡテンプレートの逆転写方法を提供する。開示され るこの方法は、従来方法に対してＲＮＡの逆転写について改良されている。これ らの方法は、ＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッド中間体分子を介してＲＮＡ分節の増 幅を与える。該ハイブリッド分子は、ＰＣＲによる増幅のためのテンプレートと して好適である。かくして逆転写と増幅反応とか結合される。従来のＲＮＡ増幅 方法は、増幅反応開始に先立って、逆転写酵素の存在下、３７°Ｃ−４２°Ｃに おいてＲＮＡ／プライマ混合物の熟成を必要とする。本発明によってのみＲＮＡ 増幅の酵素的工程のすべてか、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにより触媒作用を受 ける。Ｔａｑポリメラーゼの商業的入手可能性、および開示された７ｔｈポリメ ラーゼの調製方法によってＰＣＲにもたらされた優位点は、ここに開示される方 法によって、逆転写、ＲＮＡ検出、ｃＤＮＡ調製および結合されたＲＮＡの逆転 写／ｑＤＮＡ増幅に適用可能である。

ＰＣＲによるＤＮＡ増幅方法は、知られており、また米国特許第４．６８３．２ ０２号に記述されている。本発明により与えられる優位点の理解を容易にするた めに、ＰＣＲの要点を示す。ＰＣＲは、増幅すべき二重＃Ｉ標的核酸配列にハイ ブリッドする２つのプライマを要する。

ＰＣＲにおいて、この二重鎖標的配列は変性され、一つのプライマか変性標的の 各鎖にアニール化される。該プライマ類は、標的核酸の互いに離れた部位に、プ ライマの伸長生成物かその相補体から分離された場合に他方のプライマとハイブ リダイズ可能となる配向をもってアニール化する。一旦、所定のプライマが標的 配列にハイブリッドした後は、該プライマがＤＮＡポリメラーゼの作用により伸 長される。次いで、該伸長生成物か、標的配列から変性され、そして工程か反復 される。

この工程のＨ！続プサイクルおいて、先のサイクルで生成された伸長生成物は、 ＤＮＡ合成のプライマとして作用する。第２サイクルの開始において、増幅生成 物の対数的速度での蓄積か始まる。増幅生成物は、第１のプライマの配列を含み 、最終的に第２のプライマに相補的な配列となる第１の鎖、および該第１の鎖に 相補的な第２の鎖とを含んでなる。

ＰＣＲ工程によって莫大な増幅か可能であることから、高いＤＮＡ水準の試料由 来の少量水準のＤＮＡ、正の対照テンプレートまたは先行する増幅由来のＤＮＡ は、合目的的に添加されるテンプレートＤＮＡか存在しない場合にも、ＰＣＲ生 成物を生し得る。可能であれば、すべての反応混合物は、ＰＣＲ生成物分析およ び試料ＷＲ製から隔離された領域に設定される。専用の、または使い捨ての容器 、溶液およびピペット（好ましくは正の置換ピペット）のＲＮＡ／ＤＮＡ調製、 反応物混合および試料分析における使用は、交差的夾雑を最小にするであろう。

ＨｉｇｕｃｈｉおよびＫｗｏｋの、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３３９　：　２３ ７−２３８　；ならびにＫｗｏｋおよびＯｒｒｅｇｏのＩｎｎ１ｓら編、Ｐｒｅ ｓｓ、Ｉｎｃ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、ＣＡも参考となり、これらをここに参考と して組入れる。

核酸増幅の交差的夾雑効果の最小化方法は、ここに参考として組入れる米国特許 出願番号第６０９，１５７号に記述されている。該方法は、増幅生成物へのｄＵ ＴＰ等の非慣用的塩基の導入を含み、残留生成物を酵素的および／または物理的 −化学的処理に付して該生成りＮＡを継続する増幅のテンプレートとして機能し 得ないようにすることを含む。例えば、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼは、こ の塩基を含むＰＣＲ生成物からウラシル残基を除去するであろう。該酵素処理は 、夾雑する残留ＰＣＲ生成物の分解を生じ、増幅反応の「滅菌」作用をする。

増幅の標的は、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子であることもできる。該標的は 、単鎖または二重鎖核酸であり得る。上述したＰＣＲ処理は、二重鎖標的を仮定 したが、これは必須ではない。単鎖ＤＮＡ標的の最初の増幅サイクル後、該反応 混合物は、単鎖標的および新たに合成された相補鎖からなる二重鎖ＤＮＡ分子を 含む。同様にして、ＲＮＡ／ｃＤＮＡ標的の第１の増幅サイクル後、該反応混合 物は、二重＃ＪＩｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ分子および元のＲＮＡ／ｃＤＮＡ標的の複製物 を含む。この点において、増幅の継続するサイクルは、上述のようにして進行す る。本　−発明方法において、増幅の標的は、単ｆｔＪｉＲＮＡてあり、第１の 増幅サイクルは逆転写工程である。別法として、出発テンプレートか二重＠ＲＮ Ａである場合、初期の高温度変性工程が単＠ＲＮＡテンプレート調製のために使 用されてもよい。

ここにおいて使用されるｒｃＤＮＡＪなる用語は、リボ核酸！！　（ＲＮＡ）を テンプレートとして使用して合成される相補的ＤＮＡ分子を指す。該ＲＮＡは、 ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、または他のウィルス性ＲＮＡ等の形態であって よい。該ｃＤＮＡは、単鎖もしくは二重鎖、またはＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッ ドのように相補的ＲＮＡに水素結合していてもよい。

本発明の方法は、所望のＲＮＡテンプレートからのＣＤＮＡの人手手段を提供し 、これにおいては、所望の最終生成物は従来方法より高い特異性をもって生成さ れる。

更に、本発明は、ｃＤＮＡ合成をＰＣＲによる増幅と結合することを可能とする 。これらの方法は、熱活性ＤＮＡポリメラーゼの従来未知であった性質を取入れ る。開示される実施態様において、ＴａｑおよびＴｔｈポリメラーゼを逆転写に 使用する方法か提供される。これらの実施態様は、本発明を限定すると解釈され るへきものではない。

熱安定性ポリメラーゼは、多くの供給源から入手可能である。該酵素は、天然ま たは組換え蛋白質のいずれでラーゼである（同時係属中の米国特許出願第４５５ ，９６７号参照。これを、ここに参考として組入れる）。別法として、Ｔｔｈは 、ここに記述されｒ７ｔｈと称されるように組換え宿主細胞から精製される。同 様に本発明で商業的に入手可能である（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ） 。ここにおいて使用されるよ本発明の重要な一側面は、核酸の逆転写および増幅 のためのＴｔｈＤＮＡポリメラーゼに関する。この酵素をコードする遺伝子は、 Ｔ、ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのゲノムＤＮＡからクローン化されている。７ｔ ｈポリメラーゼは、推定されたアミノ酸配列に基づき、予想された約９４　ｋＤ ａの分子量を有している。７ｔｈポリメラーゼの完全コード配列（〜２．５ｋｂ ）は、プラスミドｐＢＳＭ：Ｔｔｈの〜３．７キロ塩基（ｋｂ）のＨｉｎｄｌ［ ｌ−Ｂｓ　ｔＥＩＩ制限断片として容易に得ることができ、但しこの〜３．７ｋ ｂ断片は内部にＨｉｎｄｌＩ［制限酵素部位を含んでいる。Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１ ２ＤＧＩＯＩ株中のｐＢＳＭ：Ｔｔｈの特定単離物は、単離され、ｐＢＳＭ：Ｔ ｔｈｌＯと称されている。このプラスミドは、アメリカンタイプカルチャコレク ション（ＡＴＣＣ）に、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＤＧＩＯＩ株中において１９８ ９年１２月２１日にＡＴＣＣ受託番号６８１９５のもとに寄託されている。Ｔｔ ｈＤＮＡポリメラーゼ遺伝子配列の入手可能性は、当業者に組換えＴｔ　ｈＤＮ Ａポリメラーゼを調製するための種々の宿主系に適用可能な任意の数の発現ベク ターの調製用の出発材料を提供する。同様にして、ＤＮＡポリメラーゼ活性を維 持するポリメラーゼの変異形態を調製してもよい。

多くのＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ発現ベクターが、同時係属中の出願番号４５５ ．９６７に記述され、これらは本発明で使用するための組換え精製Ｔｔｈの製造 に好適であり、この出願をここに参考として組入れる。これらの発現ベクターの うち、プラスミドｐＬＳＧ３３Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ１２　ＤＧ１１６株を組換えＴ ｔｈの供給源として使用した。プラスミドｐＬＳＧ３３において、Ｔｔｈポリメ ラーゼをコードする遺伝子の発現は、λＰＬプロモータにより制御される。ｐＬ ＳＧ３３の構築は、同時係属中の出願番号４５５，９６７に詳細に記述され、こ れをここに参考として組入れる。その記述中、ｐＢＳＭ：ＴｔｈはＴｔｈ遺伝子 の供給源として使用さ発現された後は、該酵素は、ここに開示される方法にて精 製され、使用され得る。精製方法は、１９８９年１２月２２日出願の出願番号４ ５５，６１１および１９８８年１月１２日出願の出願番号１４３，４４１に、天 然のＴｔｈならびに天然および組換えＴａｑについて記述されており、これらの 開示をここに参考として組入れる。

組換えＴｔｈポリメラーゼの精製は、一般的に同様であって、先に記述された方 法が適している。しかしながら、精製スキームより単純である。非天然宿主細胞 は、天然ヌクレアーゼ除去の工程を必要としない。

本発明は、ＴａｑおよびＴ　ｔ　ｈＤＮＡＤＮＡポリメラーゼて例示されている か、本発明はこの記述に限定されるものではない。文献中に報告されている他の 熱安定性ポリメラーゼも、ここに記述される方法の実施に有用性か見出されるで あろう。これらの例は、好熱性細菌てあメラーゼを含む。加えて、好熱性古ｗ菌 から単離される。

熱安定性ポリメラーゼは、例えば、 含む。

修飾された熱安定性ポリメラーゼは、蛋白質分解により、または切断された遺伝 子から産生されてもよい。これらの蛋白質類は、それらかＲＮＡテンプレートを 使用してデオキシリボヌクレオシドトリホスフェ−１・の重合に機能する限り、 本発明の実施にも有用である。

Ｔａｑポリメラーゼは、９４ｋＤａおよび６１　ｋＤａ酵素の両者として調製さ れ得る。該６１ｋＤａ酵素は、従来６２ｋＤａ酵素と称されており（例えば米国 特許第４．８８９，８１８号参照）、５ｔｏｆｆｅｌ断片とも称される。しかし ながら、Ｔａｑ６１ｋＤａ、６２ｋＤａ、および５ｔｏｆｆｅ！断片酵素は、す べて同じ実体を指している。該５ｔｏｆｆｅｌ断片は、９４ｋＤａ酵素のＮ−末 端領域を蛋白質分解的に切断した結果生じる一処理形態である。別法として、該 ５ｔｏｆｆｅｌ断片酵素は、組換え蛋白質として直接的に生成し得る。該５ｔｏ ｆｆｅｌ断片酵素は、完全長蛋白質のカルボキシ末端部分のおよそ３分の２から なる。

酵素のいずれの形態も、ここに記述したようにＲＮＡの逆転写に作用するであろ う。Ｎ−末端除去に加えて、個々のアミノ酸残基を酸化、還元または他の誘導方 法により修飾してもよく、また該蛋白質を切断して活性を保持した断片を得ても よい。

従って、翻訳の間に配列に組入れられるアミノ酸の削除、付加、または変更によ るその一次構造の修飾は、該蛋白質の高温度ＤＮＡポリメラーゼ活性を破壊する ことな（行ない得る。このような置換または池の変更は、本発明の方法に有用な 蛋白質を生しる。これらの配列をコートするＤＮＡの入手可能性は、フトン配列 を修飾して、やはり逆転写活性を有している変異蛋白質形態を生成する機会を提 供する。

ここに例示されるように、Ｔｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼは、高い逆転写酵素活性 を存している。しかしながら、Ｔａｑポリメラーゼに加えて、Ｔｔｈポリメラー ゼは、３”−５＝エキソヌクレアーゼ様の校正活性を欠いている。この３″−５ ′エキソヌクレアーゼ活性は、新たに合成された核酸配列中の誤って組込まれ、 合致しない塩基の除去か可能であるため、一般に望ましいものである。

校正活性の欠如は、酵素の正確さに影響を与えることから、校正エキソヌクレア ーゼの存在は、逆転写酵素の新規かつ可能性ある有用性を与える。

リメラーゼＩ　（Ｔｍａ　ｐａｆ）は、３−−５−エキソヌクレアーゼ活性を有 している。ここに参考として組入れる１９９０年８月Ｉ３日出願の米国特許出願 ５６７゜２４４は、Ｔｍａポリメラーゼの単離および産生方法を提供する。その 特許出願は、Ｔｍａ　ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸および核酸配列を与え、５ −−３−エキソヌクレアーゼ活性に加えて］’−５’エキソヌクレアーゼ活性を 含む種々の酵素活性についてアミノ酸領域を記述している。

従って、領域の位置変更またはキメラＤＮＡポリメラーゼの構築は、新規な性質 を有する熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを与えるために使用され得る。例えば、Ｔ ｔｈポリメラーゼに組込まれたＴｍａポリメラーゼの３−一５′エキソヌクレア ーゼ領域を存する熱安定性キメラＤＮＡポリメラーゼは、「重複Ｊ　ＰＣＲ（Ｈ ｉｇｕｃｈｉの１９８９、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、前出文献）を使用して構築され得る。この方法において 、所望の連結配列は、ＰＣＲプライマ（それらの５′末端）中に設計される。各 個別の領域の最初の増幅後、種々の生成物か希釈され（約１００−１．０００倍 ）、合せられ、変性され、アニール化され、伸長され、次いて最終的な前進およ び逆行プライマか標準的ＰＣＲに添加される。

特定的には、Ｔｔｈポリメラーゼのポリメラーゼ領域（アミノ酸４１５−８３４ ）が、Ｔｍａポリメラーゼの５−−３−および３−−５−エキソヌクレアーゼ領 域（アミノ酸！−４７５）に連結される。例えば、Ｔｔｈポリメラーゼ発現ベク ターおよびＴｍａポリメラーゼをコードする遺伝子の一部は、次のように結合さ れる。発現ベクターｐＬＳＧ３３は、同時係属中の特許比Ｎ４５５．９６７に記 述されており、Ｔｔｈをコードする遺伝子を含んでいる。プラスミドｐＴＭＡ５ ’Ｎｄｅ＃３（以下、ｐＴｒｎａ０６と称す）は、ここに参考として組入れる１ ９９０年８月１３日出願の特許出願５６７．２４４に記述され、Ｔｍａポリメラ ーゼをコートする遺伝子の５゛部分を含んでいる。重複ＰＣＲのためのプラスミ ドを調製するために、ｐＬＳＧ３３およびｐＴｍａ０６をＮｄｅＩにより線形化 し、そしてＴｍａポリメラーゼに対してプライマＡおよびＢを、また７ｔｈポリ メラーゼに対してプライマＣおよびＤを用いた２つの別個のＰＣＲ増幅に使用し た。プライマの配列は。

Ａ　５’−ＧＧＣＡＴＡＴＧＧＣＴＡＧＡＣＴＡＴＴＴＣＴＴＴＴＴＧ−３゜Ｂ 　３−ＧＴＣＴＧＴＡＧＴＧＧＡＴＧＴＣＴＧＡＡＧＴＡＧＣＣＴＴＧＧＡ−５ ’Ｃ５−ＣＴＡＣＡＧＡＣＴＴＣＡＴＣＧＧＡＡＣＣＴＣＣＴＴＡＡＧＣＧ−３ ′Ｄ　３’−ＧＧＡＡＧＣＡＣＣＧＧＣＴＣＣＧＣＣＣＡＡＣＣ−５’プライマ Ａは５゛−末端に組込まれたＮｄｅＩ部位を有する。プライマＤは、Ｔｔｈのポ リメラーゼ領域の部分に対応し、７ｔｈ遺伝子の３′領域内のＢａｍＨＩ部位に 直接的に隔離する。ＰＣＲの第１回目は、ＡＢ（１４４１ｂｐ）生成物およびＣ Ｄ（５８６ｂｐ）生成物を生成する。各領域の最初の増幅に続いて、反応物をお よそ１００〜１０００倍に希釈し、合せ、変性し、アニール化させ、そして最終 的な進行および逆行プライマ（それぞれプライマＡおよびＤ）を使用して伸長さ せる。最終生成物ＡＤを、ＮｄｅｌおよびＢａｍＨＩにて消化して２００６ｂｐ の生成物を与える。次いてこの生成物を、発現ベクター（ベクターｐＬＳＧ３３ をＮｄｅｌとＢａｍＨＩとで消化した後）に連結して戻し、適当な宿主中に形質 転換する。該キメラ蛋白質は、８９５個のアミノ酸残基を含むであろう。

Ｔｔｈ、Ｔａｑ、およびＴｍａ　ＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮａ　ｓ　ｅＨ活性 を発現し得る５−−３−エキソヌクレアーゼ活性をも育している。５−−１エキ ソヌクレアーゼ活性の、例えば部位特異的変異生成による除去または低減は、ｃ ＤＮＡ合成に好ましい熱安定性ポリメラーゼを提供するであろう。Ｅ、ｃｏｌｉ のｐｏｆ！Ａ遺伝子のアミノ酸番号１０３のグリシン残基をグルタミン酸に置換 することで、５−−３−エキソヌクレアーゼ活性を欠いたポリペプチドが生成す ることが示されている（ＫｉｎｇｓｂｕｒｙおよびＨｅ１ｉｎｓｋｉの１９７３ 、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１４４：１１１６−１１２４；　０１ｉｖｅｒａお よびＢｏｎｈｏ　ｔ　ｔ　ｅ　ｒの、１９７４、Ｎａｔｕｒｅ　２５０：５１３ −５１４：ならびにＪｏｙｃｅらの、１９８５、Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ。１８６：２８３−２９３）。同類のアミノ酸が、７ｔｈポリメラーゼ 中に保持されている（アミノ酸番号１０８）。正常コドンＧＧＧが、ＰＣＲによ ってＧＡＡコドンに変異され、ＲＮＡの逆転写について改善された特性をもった 新規な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが提供される。別法として、Ｔｔｈのアミノ 酸番号４６をグリシンからアスパラギン酸に変更することで、新規酵素を与える ５”−１”エキソヌクレアーゼ活性に影響を与え得る。

ＡＭＶ−ＲＴおよびＭｏＭｕＬＶ−ＲＴ等のウィルス性逆転写酵素の正確さか、 直接アッセイ方法によって熱活性逆転写酵素と比較される。プラスミ）”ＢＳ＋ （Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）か、このようなアッセイに使用される。該プラスミド は、α−相補β−ガラクトシダーゼ活性をコードし、ＮｄｅＩによって線形化さ れ得る。

Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼか、αドナー領域のｃＲＮＡ転写物の調製に使用される 。ＲＮａｓｅ−非含有ＤＮａｓｅによるｃＲＮＡの処理およびｃＲＮＡの単離後 、該ｃＲＮＡは、逆転写／増幅反応のためのテンプレートとして使用される。そ の５′末端に、ＮｄｅＩ配列を含むｃＤＮＡの３′末端に相補的な逆転写プライ マ、および５′末端にＰａｔＩ配列を含む上流ＰＣＲプライマは、７５２ｂｌ） ＰＣＲ生成物を与える。次いで、該ＰＣＲ生成物およびｐＢＳ＋ＢＳ＋−は、Ｎ ｄｅＩおよびＰｓｔＩにより消化され、引続き該ＰＣＲ生成物が、ベクター中に 連結され、適当な宿主中に形質転換される。

白色コロニの存在は、ＲＴまたはＰＣＲ増幅の間に変異が起きたことを示してい る。該アッセイは、種々の逆転写酵素活性の正確さの相対値を与える手段を提供 する。

特定の変異は、配列分析により検出され得る。

高温度逆転写方法は、試料中の特定ＲＮＡの検出の新規手段を提供する。この方 法は、例えばＡＩＤＳ被害者として生まれた子供のレトロウィルス感染の監視、 または診断的蛋白質の発現の監視のための臨床的状況に官用である。逆転写、ま たは増幅生成物の検出は、多くの公知の手段のいずれによっても行ない得る。こ のような手段は、限定されるものではないが、ドツトプロットまたは電気泳動的 様式において、同位体的もしくは非同位体的に標識されたプローブによるハイブ リッド形成を含む。

検出様式は、固体担体およびアビジン−ビオチン標識等の捕捉工程を含んでもよ い。ここに参考として組入れる同時係属中の１９９０年８月６日の出願の特許出 願５６３．７５８は、核酸ポリメラーゼの５−−３”ヌクレアーゼ活性の使用方 法を記述している。該方法に従うと、標識オリゴヌクレオチドおよび漂的オリゴ ヌクレオチドからなるハイブリッド二重体中の標識核酸プローブが分解される。

次いで、原識断片が検出される。検出は、例えば、感染または治療法に対する応 答の進展を監視するために定量分析を含んでもよい。別法として、検出は細胞型 特定の目的であってもよい。

プライマは、その５′末端またはその近傍に都合良い制限酵素認識部位を有して 設計され得る。ｃＤＮＡ転写物の形成において、３′末端プライマが標的配列に 水素結合している限り、得られた二重鎖ｃ、　Ｄ　Ｎ　Ａ分子は、特定の制限酵 素認識配列を含む。ｃＤＮＡをテンプレートとして使用する増幅に続いて、制限 部位は、例えばクローニング等の他の処理を容易にするために使用することがで きる。

ＲＮＡの熱活性または熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによる転写に続いて、該ＲＮ ＡはＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドから熱変性または、アルカリ、熱もしくは酵 素処理等の他の多くの公知方法により除去され得る。酵素処理は、例えばＲＮＡ ／ｃＤＮＡハイブリッドのＲＮａｓｅＨ処理からなるものでもよい。ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖分子においてＲＮＡ鎖に特異的である。Ｔｔｈおよ びＴａｑポリメラーゼは、共にＲＮａｓｅＨ活性を含んでおり、従って、第２の ＤＮＡ鎖のｍＲＮＡ依存的ｃＤＮＡ合成およびｍＲＮＡ配列増幅のためのプライ マ伸長に加えて、ＲＮＡテンプレートの加水分解を促進し得る。

ＲＮＡテンプレート鎖の除去または融解に続いて、残留するｃＤＮＡ鎖は、自己 相補鎖の重合のためのテンプレートとして機能し、更なる増幅、検出または他の 操作に好適な二重Ｒｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ分子を与える。第２鎖の合成もプライマを必 要とする。配列特異的なプライマを、第２鎖合成を開始させるために反応混合物 に導入し得る。別法として、二重鎖アダプターリンカをｃＤＮＡに連結してもよ く、またはｃＤＮＡを末端トランスフェラーゼ活性により延長してもよい。該第 ２鎖プライマは、特定のｃＤＮＡ配列よりむしろ尾部末端にハイブリッドするこ とのみを必要とする（例えば、ＦｒｏｈｍａｎのＩｎｎ　Ｉ　ｓらの前出文献中 の記述参照）。開示される方法の実施において、プライマの第１の組を特定ｃ　 ＤＮＡの合成に使用し、プライマの第２のはまり込む組を所望のｃＤＮＡ分節の 増幅に使用することか望ましい。これらの反応すべてか、同じ熱安定性ＤＮＡポ リメラーゼにより触媒作用を受けてもよい。

ＤＮＡポリメラーゼは、触媒活性のために２価陽イオンを必要とする。Ｔａｂｏ ｒとＲｉｃｈａｒｄｓｏｎの、１９８９、Ｐｒｏｃ、ＮａｔＪ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｊ。

ＵＳＡ　８６：４０７６−４０８０は、ＤＮＡ配列決定方法においてＭｇ！“を Ｍｎ”に代え得ることか報告されている。これらの方法は、ＤＮＡテンプレート およびＴ７ＤＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼＩを必要とする。

Ｍ　ｎ　”　”、Ｍ　ｇ　ｔ　”またはＣｏ　”のいずれもがＴａｑ。

ＴｔｈおよびＴｍａＤＮＡポリメラーゼを活性化し得る。

しかしながら、本発明方法ではＭｎ”か好ましい。本発明の開示される実施態様 において、緩衝溶液は、ＲＮＡテンプレートからの核酸逆転写のためにＭ　ｎ　 ”＋を含んで与えられる。これらの緩衝溶液は、従来の逆転写緩衝溶液より改善 され、増大したｃＤＮＡ収率を生じる。

本発明に従うと、逆転写について、プライマーテンプレート混合物は、適切な重 合条件下で熱活性または熱安定性ポリメラーゼと共にインキュベートされる。こ れらの条件は、２価陽イオン、１価陽イオン、４種すべてのデオキシリボヌクレ オチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）および緩衝剤を含む緩衝溶液によって与え られる。本願実施態様において、逆転写のために供給される２価陽イオンは、Ｍ ｇＣ１ｘ　、ＭｇＯＡｃ、またはＭ　ｎ　Ｃｌ　ｚであって、ＭｎＣ７？ｚにつ いて０．５ｒｎＭ−２，５ｍＭ、またＭｇＣ１ｘ　ｎ　ｉついて０．５５−１Ｏ ｒｎの範囲で供給される。好ましくは、２価陽イオンは、０．８−２ｍＭの間の 濃度におけるＭ　ｎ　Ｃｌ　２である。１価陽イオンは、ＫＯＡｃ、ＮａＣ１、 またはＫＣＡによって供給され得る。ＫＣｊ？については、濃度は１−２００ｍ Ｍであり、好ましくは５０−１００ｍＭの間である。至適逆転写酵素活性は、５ ０−７５ｍＭ　ＫＣＩ！の間で観察される。しかしながら増大した「完全長Ｊ　 ＣＤＮＡ生成は、ＫＣｆ濃度を１００ｍＭまで増大した場合に観察される。

デオキシリボヌクレオチドトリホスフェートは、ｄＡＴＰＳｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ およびｄＴＴＰ（ｄＮＴＰ）の、ジナトリウムまたはリチウム塩等の塩の溶液と して添加される。本願方法において、各々１−８００μＭの範囲の最終濃度が好 適であり、１００−６００μＭか好ましい。より長い生成物、すなわち１５００ ｂｐ程度については、各ｄＮＴＰ５００μＭおよび２ｍＭのＭ　ｎ　Ｃｌ　２が 好ましい。

好適な緩衝剤は、トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８，３であるが、ｐＨは８．０−８．８ の範囲でもよい。トリス−ＨＣ／の濃度は、５−５０ｍＭであるが、１０　２０ ｍＭか最も好ましい。加えて、０．５ｍＭ未満のＥＤＴＡが、逆転写反応混合物 中に存在してもよい。Ｔｗｅｅｎ−２０ＴＭおよびＮｏｉ：ｄｅｔＴ′Ｐ−０等 の洗浄剤か酵素希釈緩衝溶液中に存在する。約Ｏ）％またはそれ以下の非イオン 性洗浄剤の最終濃度か適当であるか、０．０５％−０，０１％か好ましく、ポリ メラーゼ活性を妨害しないてあろう。同様に、グリセロールかしばしば酵素調製 物中に存在し、一般的には反応混合物中で１−１０％の濃度に希釈される。鉱油 の被覆を、蒸発防止のために加えてもよい。

本願方法は、試料中にＲＮＡか存在することのみを必要とする。例において、Ｔ ７ブロモータを含むプラスミドを用いて調製された合成ＲＮＡか、本発明の方法 により逆転写され、増幅される。別の例において、全細胞ＲＮＡの異種的母集団 か、特定のｍＲＮＡの逆転写および増幅のために使用される。試料中に存在する ＲＮＡの量は、好ましくは８０ｐｇ−１μｇの範囲内である。必要量および結果 は、試料ＲＮＡの複雑さに依存して変化するであろう。高温度逆転写反応の特異 性故に、マイクログラム量のＰＣＲ生成物を与えるために１００分子程度の少量 の標的ＲＮＡで充分である。開示される例のいくつかにおいて、増幅生成物は、 全反応混合物の５％のゲル電気泳動後に、エチジウムブロマイド染色により視認 可能である。従って、必要な標的の量は、生成物アッセイの別法を使用した場合 に、実質的に減少するであろう。例えば、電気泳動ＰＣＲ生成物の検出に適した 同位体的漂識ＤＮＡプローブは、検出感度を増大させ、従って、必要な出発材料 の量か減少する。

好ましくは、逆転写反応中に存在するＲＮＡの量は、０．１１−５００ｎ、最も 好ましくは０．４４−３００ｎである。この好ましい範囲において、■−ＩＯ単 位の熱活性ＤＮＡポリメラーゼは、完全長ｃＤＮＡ生成物を与えるために充分で ある。試料か３００ｎｇ以上のＲＮＡを含む場合には、ＲＮＡテンプレートから の完全量ｃＤＮＡ生成物の転写を確実にするために、追加の酵素を含ませること が好ましいであろう。しかしなから、逆転写反応かＰＣＲと結合される場合、Ｐ ＣＲ反応における高い酵素濃度の影響を考慮する必要かある。例えば、熱活性ポ リメラーゼとしてＴａｑが使用される場合、高い酵素濃度は、非特異的ＰＣＲ生 成物および低減した収　−率を生じる可能性かある（ＳａｉｋｉのＰＣＲＴｅｃ ｈｎｏｌｏｇｙＳＥｒｌｉｃｈ編、１９８９．５ｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ参 照）。高い酵素濃度から起こり得る問題は、しかしながら、熱活性ＤＮＡポリメ ラーゼを、逆転写反応と増幅反応との間に失活させることにより容易に回避でき る。不活性化は、ｃＤＮＡ合成反応混合物を、９９°Ｃにて３〜１０分間インキ ュベートすることにより達成される。次いで適切な量の熱安定性ＤＮＡポリメラ ーゼを反応混合物に再度添加し、ＰＣＲを通常とおり行なう。この方法は、例■ に例示したように異なる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを２つの反応についてそれ ぞれ使用する場合にも適している。

ＲＮＡを含む試料か一旦調製され、適当なプライマおよび塩類か添加されたなら ば、該反応物は、熱活性ＤＮＡポリメラーゼと共に１−６０分間インキュベート される。しかしながら、通常は反応時間は２〜３０分間か適当である。比較的短 い（〜３００ヌクレオチド）標的分子については、逆転写反応物は、好ましくは 約２−５分間インキュベートされる。標的分子か長い場合、または標的ＲＮＡに 対する全ＲＮＡの比か、例えば標的ＲＮＡの１００個のコピーが２５０ｎＨの全 ＲＮＡの存在下にある場合等のように高い場合には、１０−３０分間のインキュ ベート時間が好ましい。

本質的ではないが、プライマおよびＲＮＡテンプレートの両者が添加された後に 、該逆転写反応混合物に熱活性ＤＮＡポリメラーゼを添加することが好ましい。

別法として、例えば、酵素およびプライマを最後に添加するか、または、Ｍ　ｎ 　Ｃｆ　２　、あるいはテンプレートとＭｎＣ１ｘ　とを最後に添加する。一般 に、重合に必須の少なくとも１成分を、プライマとテンプレートか両者共に存在 し、また所望のブライマーテンプレート基質に酵素か結合して伸長し得るまで、 存在させないことか望ましい（ここに参考として組入れる１９９０年２月１６日 出願の米国特許出願４８１，５０１参照）。

本願方法の実施において、該反応物は４０℃以上でインキュベートされるが、好 ましい温度は、５５°Ｃ−７５°Ｃである。この温度において、プライマーテン プレートアニール化の特異性は、低温度のアニール化特異性より向上し、また熱 活性酵素は上昇された温度で高い活性を有する。上昇された温度は、切断された 天然の核酸、および誤まったプライマーテンブレートハイブリツド化は、非特異 的開始を減少させる。

逆転写に続いて、ＲＮＡテンプレートは、ｃＤＮＡ生成物から変性され、しかし て続く逆転写のためのテンプレートを与え、過剰量の単＠　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ分子 を生じる。この過剰の単鎖ｃＤＮＡは、標準的プローブ／Ｓイブリ、ソド化技術 により検出可能である。従って、本発明は、標的分節の直接検出手段を提供する 。生じた核酸生成物は、多くの電気泳動的またはクロマトグラフ的手段により検 出可能である。放射標識トリホスフェートの使用は、反応の程度、形成される生 成物の大きさ等の監視のために有用であるか、このことは本発明の本質的な部分 ではない。

逆転写反応生成物は、ＰＣＲによる増幅のためのテンプレートとして好適である 。高温度の逆転写インキュベーションに続いて、逆転写酵素反応物をＰＣＲ緩衝 溶液条件に調節し、第２のプライマの添加に引き続いて増幅反応か開始される。

ＰＣＲ緩衝溶液が、適切な緩衝容量、ｐＨ，１価陽イオン濃度、およびｄＮＴＰ 類の濃度を各ｄＮＴＰについて２０−２００ｎＭの範囲に希釈するために添加さ れる。Ｍ　ｇ　Ｃｊ’　！は、最終濃度１−３ｍＭまで添加される。好ましくは 、逆転写酵素およびＰＣＲ反応混合物の両者におけるｄＮＴＰの濃度は、衡合い をとられる。Ｍｎ”＋は、ＲＮＡおよび多分ＤＮＡの加水分解を誘導するため、 本発明の好ましい実施態様においてはＭ　ｎ　２”″はＰＣＲ増幅の前にキレー ト化される。多量のＭｎ”＋の存在は、増幅の正確さを低減するが、Ｍ　ｎ　２ ”″のキレート化かこの問題を回避させる。従って、逆転写反応に続いて、Ｍｎ ”＋をキレート化するために、Ｍｎ”＋のモル濃度の約１−１０倍の濃度でＥＧ ＴＡを添加することが好ましい。Ｍｇ″２およびＭ　ｎ　’″＊の両者の存在に おいて、ＥＧＴＡはＭｎ”に優先的に結合する。グリセロールおよび非イオン性 洗浄剤（例えばＴｗｅｅｎ−２０”）を、酵素の安定性増大のためにそれぞれ最 終濃度１−１０％、および０．０５％−０，０１％まで添加してもよい。

ここに提供される方法は、特に分子生物学および医学的診断の分野において多く の応用を存している。記述される逆転写酵素活性は、ＲＮＡテンプレートからｃ ＤＮＡ転写物を与える。ＲＮＡ分子からのＤＮＡ分節の生成および増幅方法は、 ＲＮＡ分子が全ＲＮＡ母集団の一構成物、または生物学的試料中に少量存在する 場合に好適である。試料中に存在する特定のＲＮＡ分子の検出は、ここに記述さ れる方法で使用される熱活性または熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによって高度に 促進される。特定のＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子の全母集団は、ここに記述され るように熱活性または熱安定性酵素を使用して増輻され、定量され、単離され、 また所望によりクローン化され、そして配列決定される。

本発明の方法および組成物は、ＲＮＡをＤＮＡ生成物に逆転写する従来方法に比 べて大きい改善である。

ＲＮＡテンプレートから出発する場合、これらの方法は向上された特異性を存し 、従来利用可能であった方法によるよりも効率的に生成されるＰＣＲ増幅のため のテンプレートを提供する。本発明は、感染性疾患、遺伝子的異常または細胞異 常等に関連する特異的リポ核酸配列の検出および特徴付けのために、より特異的 であり、従ってより正確である手段を提供する。

当業者は、本発明の組成物かキット中に組込まれ得ることを認識するであろう。

従って、本発明は、熱活性　−ＤＮＡポリメラーゼ、ならびにこれをＲＮＡの逆 転写に使用する方法を記述する指示書を含んでなるキットに関するものである。

−実施懇様において、このようなキットは、試料中の少なくとも１種の特定標的 ＲＮＡ配列の検出に関連する。このようなキットは、上記の要素に加えて特定標 的ＲＮＡ配列に対し、これにハイブリットするに充分相補的な配列を含むプライ マを含んでなる。試料中の少なくとも１種の特定ＲＮＡ配列の増幅および検出用 診断キットは、第２のｃＤＮＡＭＤＮＡ生成物合成された第１のｃＤＮＡ鎖とハ イブリットするＲＮＡ標的に充分に同等な配列を存するプライマを含んでもよい 。

キットは、示した成分に加えて、４種のデオキシリボヌクレオチド１−リポスフ １．−１〜、ここに記述されるような好適な緩衝溶液、オリゴ（ｄＴ）　、ＲＮ ａ　ｓ　ｅＨ，りｌ′：７−ン化のためのりシカ、ならびに１種以上の制限酵素 を含んでもよい。

以下の例は、単に例示のために提供されるもので、いかなる方法においても本発 明を限定する、ことを意図するものと解釈されるへきではない。

ＲＮＡは、インビトロにおいてＴ７　ＲＮＡポリメラーゼおよび合成テンブレー ｈｐＡＷ１０６を使用して合成された。該テンプレートｐＡＷ１０６は、合成的 に調製されたＤＮＡ分節に隣接してＴ７ブロモータを含み、ポリアデニル化配列 に続く。生成された該ＲＮＡは、ここにおいてｃＲＮＡと称され、オリゴ（ｄＴ ）クロマトグラフィにより精製された。長さｌ０６０塩基の該精製物は、インタ ーロイキンｌβ（ＩＬ−１β）ｍＲＮＡ配列の部分を含んでいる。該ＲＮＡ濃度 は、０．１βｇ／μ！であり、〜０．　２８６　ｐｍｏ　１　ｅ／ｕ　ｌに等価 であった。別法として、ｐＡＷｌ　０９　（ＡＴＣＣ階６８１５２）を、長さ９ ６３塩基のｃＲＮＡの調製のためにテンプレートとして使用した。ｐＡＷＩ０６ またはｐＡＷ１０９ｃＲＮＡのいずれを使用した場合にも、該ｃ　ＲＮＡはＷ　 ａ　ｎ　ｇらの前出文献に従って調製され、定量された。

いくつかの例（二おいては、ｐＡＷＩ　Ｏ９ｃＲＮ、八はテンプレート分子数を 限定するために希釈され、そしてＥ。

ｃｏｌｉリホソームＲＮＡ　（Ｂｏｅｈｒ　ｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ）を、 反応物あたり全ＲＮＡを６０ｎｇとした。

Ｐｈ１ｌａｄｅｌｐｈｉａ−クロモシーム正細胞株であるに５６２　（Ｌｏｚｚ ｉｏおよびＬｏｚｚｉｏの、１９７５、ＢＩｏｏｄ４５：３２１−３３４、なら びにＫａｗａｓａｋｉらの、１９８８、Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　Ｉ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８５：５６９８−５７０２）を、全細胞ＲＮＡの供 給源として使用した。該ＲＮＡを、に従って精製した。

Ｂ、ＤＮＡ ＤＮＡテンプレートを、ＤＮＡポリメラーゼ活性の監視のための対照として提供 した。活性化サケ精子ＤＮＡを、ｌ０ｍＭトリス−Ｈ（１、ｐＨ８，３，５ｍＭ ＫＣｌ！および５０μＭ　ＥＤＴＡ中に、２５μｇ／μ！の濃度で調製した。１ 反応物は、６２５μｇのサケ精子ＤＮＡテンブレー１−（２，５μ！りを含んで いた。

ある例においては、ｐＡＷＩ０９を、テンプレート分子の数を制限するために希 釈し、Ｅ、ｃｏｌｉリポソームＲＮＡ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉ ｍ）を全ＲＮＡ６０ｎｇ／反応物となるように添加した。

■、オリゴヌクレオチドプライマ ＤＭ１５６を、ｐＡＷ［０６ｃＲＮＡテンプレートを使用するｃＤＮＡ合成の開 始に使用した。該プライマ配列は、ヒトＩＬ−１β遺伝子の部分に対応し、ヒト Ｉ■、−１βｍＲＮＡに相補的である。該プライマ濃度は１００１００ｐ／μｆ てあった。

ＤＭ１５２およびＤＭ１５１は、ヒトＩＬ−１α遺伝子の部分に対応し、ＩＬ− １αｍＲＮＡ　（例えば、Ｋ５６２細胞由来）をテンプレートとして使用した場 合に４２０塩基対分節を増幅する。３０８塩基対分節か、ｐＡＷ＋０９ｃＲＮＡ から生成される。ＤＭ１５２は、ｐＡＷｌ　０９　ｃＲＮ、ＡまたはＴ　Ｌ−１ ａｍＲＮＡにハイブリッドし、ｃＤＮＡ合成のプライマとして機能する。

ＤＭ１５１は、教卓１１ｃＤＮＡに「上流」増幅プライマとしてハイブリッドす る。

ＴＭＯＩは、ｐＡＷ１０９ｃＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡ分子を合成するた めの「下流」プライマして使用され、ヒトＩＬ−１αｍＲＮＡの３′非翻訳領域 にハイブリッドし得る。ＤＭ１５１およびＴＭＯＩは、ｐＡＷ１０９の７３６塩 基対分節を増幅する。

ＤＭ１５６５’−ＴＧＧＡＧＡＡＣＡＣＣＡＣＴＴＧＴＴＧＣＴＣＣＡＤＭ１５ ］　５’−ＧＴＣＴＣＴＧＡＡＴＣＡＧＡＡＡＴＣＣＴＴＣＴＡＴＣＤＭＩ５２ ５−ＣＡＴＧＴＣＡＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＣＴＭＯＩ　５−ＧＣ ＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＴＡＴＧＡＣＴＧＡＴＡＡＣＡＣＴＣ■ 　デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート形成される逆転写（ＲＴ）生成物 の量を、α３２ＰｄＣＴＰの取込みにより監視した。従って、ｄＮＴＰマイナス Ｃ保存物を、２ｍＭ　ｄＡＴＰ、２ｍＭｄＴＴＰ、および２ｍＭ　ｄＧＴＰを含 んで調製した。

３３０μｆの１ｍＭ　ｄＣＴＰ溶液を、１００μｃｉα”Ｐ　ｄＣＴＰ（Ｎｅｗ 　ＥｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）を含めて調製した。従って、約６．６Ｘ１０ ’ｃｐｍは、］０”ｐｍＯｌｅのｄＣＴＰ取込を表わす。ｄＮＴＰマイナスＣお よびｄＣＴＰ溶液を合せて、１ｍＭ　ｄＡＴＰｌ　１ｍＭ　ｄＴＴＰ、１ｍＭｄ ＧＴＰおよび２５０μＭα”Ｐ　ｄＣＴＰを含む５×　−ｄＮＴＰ保存混合物を 調製した。別法として、放射標識トリホスフェートを使用しない場合には、４種 すべてのｄＮＴＰを、逆転写反応物に２００μＭにて含有させた。

便宜のため、ｄＡＴＰｌｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴｍＭをＨ２０，ｐＨ７， ０に含む溶液を、ＩＯＸ保存溶液として調製した。別に、逆転写／ＰＣＲ生成物 を、アガロースゲル電気泳動およびエチジウムブロマイド染色により監視した。

１０×保存アニール緩衝溶液を、１００ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ８，３，５０ ０ｍＭ　ＫＣ１！および１ｍＭＥＤＴＡを含有させて調製した。

Ｂ、修飾Ｐｏ１Ｔ　ＩＯＸ緩衝溶液 １０ＸＰｏｌＩ緩衝溶液を、ＭｇＣｆｚを含め、または含めずに、ｌｏｏｍＭ） リス−ＨＣ１，ｐＨ８，３，５００ｍＭ　ＫＣｆ、１０ｍＭ　ＤＴＴ、および存 在する場合に６０ｍＭのＭｇＣ１ｔを含有させて調製した。

１０ｘＴａｑ緩衝溶液を、１００ｍＭトリス−ＨＣｆｐＨ８，３および５００ｍ Ｍ　ＫＣＩ！を含有させて調製した。

Ｄ、ｌＯＸ低塩緩衝溶液（ＬＳＢ） １０ＸＬＳＢを、１００ｍＭ）リス−ＨＣｌ！、ｐＨ８，３および５０ｍＭ　Ｋ ＣＩを含有させて調製した。

Ｅ、ｌｏＸＲＴ反応緩衝溶液 １０　ＸＲＴ緩衝溶液を、１００ｍＭトリス−Ｈ（１（ｐＨ８，３）および９０ ０ｍＭ　Ｋ（ｌを含有させて調製した。

Ｆ、ＭｏＭｕＬＶ−ＲＴＩＯｘ緩衝溶液１０　ｘＭｏＭｕＬＶ−ＲＴ緩衝溶液を 、６０ｍＭＭ　ｇ　ＣＡ’　２を添加して上記Ｃと同様に調製した。

Ｇ、ｌ０ＸＰＣＲ緩衝溶液 １０　ＸＰＣＲ緩衝溶液を、１００ｍＭｈリスーＨＣｌ！ｐＨ８，３、ＩＭ　Ｋ ＣＩ、１８．７５ｍＭ　ＭｇＣｌ、、７．５ｍＭ　ＥＧＴＡおよび５０％グリセ ロール（ｖ／Ｖ）を含有させて調製した。

Ｈ，１ｏｘＴａｑ　ＰＣＲ緩衝溶液 １０ＸＴａｑ　ＰＣＲ緩衝溶液は、１００ｍＭｈリスーＨＣｆ、（ｐＨ８，３） 　、　３００ｍＭ　ＫＣｌおよび２５　ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　ｔを含む。

１、Ｔａｑ希釈剤 Ｔａｑ希釈緩衝溶液を、２５ｍＭ）リス−ＨｅｌｐＨ８，８，１００ｍＭ　ＫＣ Ｉ！、０．１ｍＭ　ＥＤＴＡ。

０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０”、０．５％Ｎｏｎ１ｄｅｔ”Ｐ−４０および５００ μｇ／μｌゼラチンを含有させて調製した。

／ａ１．の濃度をもってＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｓ、Ｂｅｔ ｈｅｓｄａ。

Ｍａｒｙｌａｎｄから入手した。該酵素を、１１５の濃度のＴｗｅｅｎ−２０” およびＮｏｎ１ｄｅｔ”Ｐ−４０を含むＴａｑ希釈剤中に希釈して、４．０．４ ．０゜０４、および ０．００４ｕ／μＩ！調製物を与えた。

Ｂ、Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｐｏ１Ｉは、濃度ＩＯ単位／ｕｌのものをＮｅｗ　Ｅｎｇｌ ａｎｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。

濃度をもってＰｅｒｋｉｎ−Ｅ１ｍｅｒ／Ｃｅｔｕｓから提供された。比活性は 、約２４０，０００単位／■であった。濃度をＩＯ単位／μｌに低下させるため にＴａｑ希釈剤を使用した。

Ｄ、ｒＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、５ｔｏｆｆｅｌ断片 Ｔａｑポリメラーゼの５ｔｏｆｆｅｌ断片は、３２ｋＤａのアミノ末端配列か除 去された９４ｋＤａＴａｑの切断形態である。該酵素は、６１ｋＤａの大きさを 有するが、従来６２ｋＤａ　ＴａＱと称されていたものである。該酵素は、ここ に参考として組入れる同時係属中の出願番号１４３．４４１に記述されているよ うに組換え宿主細胞中に産生され、それから精製され得る。

５ｔｏｆｆｅｌ断片は、Ｐｅｒｋｉｎ　ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ　Ｉｎｓｔｒｕｍ ｅｎｔｓからＡｍｐ　１　ｉＴａｇＴＭＤＮＡポリメラーゼ、５ｔｏｆｆｅｌ断 片として商業的に入手可能である。

Ｅ、７ｔｈポリメラーゼ 天然７ｔｈポリメラーゼは、ＦｉｎｎｚｙｍｅＣｏ、、フィンランドおよびＴｏ ｙｏｂｏ　Ｃｏ、日本から商業的に入手可能である。９４ｋＤａ天然ＴｔｈＤＮ Ａポリメラーゼの精製、ならびに組換え９４　ｋＤａＴｔｈの産生および精製方 法は、ここに参考として組入れる１９８９年１２月２２日出願の共通して譲渡さ れ同時係属中の出願番号４５５，９６７中に、発明者Ｄａｖｉｄ　Ｇｅ１ｆａｎ ｄ、５ｕｓａｎＳｔｏｆｆｅｌおよびＦｔａｎｃｅｓ　Ｌａｗｙｅｒによって記 述されている。本願の例において使用するために、組換えＴｔｈ（ｒＴｔｈ）は 下記のように精製された。

Ｔｔｈは、プラスミドｐＬＳＧ３３を含むＥ、ｃｏ　ｌ　１ＤＧｌ　１６株から ｆＲ製された。米国特許出願４５５，９６７の明細書第４６頁に記述されている ように、ｐＬＳＧ３３は、ｐＬＳＧ２４のＮｄｅｌ−ＢａｍＨＩ制限断片を、発 現ベクターｐＤ０１７８中に連結することにより調製された。得られたプラスミ ドはアンピシリン耐性であり、また完全長のＴｔｈ遺伝子を発現可能である。１ ０リツトル培養のための接種フラスコは、ト・リブトン（２０ｇ／Ｊ）、酵母抽 出物（１０ｇ／ｌ）、ＮａＣｊ’　（１０ｇ／ｌ）および０．００５％のアンビ ンリンを入れである。該接種フラスコに、寒天プレートからのコロニーを接種し たか、あるいは凍結グリセロール培養保存物も使用し得る。該接種物を０．５〜 １．０　０．Ｄ、（Ａ６８０）の間まで育生した。該培養中に接種される種培養 物の体積は、細菌の最終濃度か、１■乾燥重量／リットルどなるように計算した 。１０リツトルの育生培地は、２５ｍＭ　Ｋ８２ＰＯ，，２８ｍＭ　（ＮＨ４） 　２　Ｓ　Ｏａ　、４　ｍＭ　クエン酸ナトリウム、０．４ｍＭ　ＦｅＣｌ２． ０．０４ｍＭ　ＺｎＣｌ２．０．０３ｍＭ　ＣｏＣ１ｚ、０．０３ｍＭ　ＣｕＣ Ｉｚおよび０．０３ｍＭ　Ｈ２８ｏｚを含有していた。以下の滅菌成分か添加さ れた：　４１　ｍＭ　Ｍｇ　Ｓ　０４．７５　ｇ／ｌグルコースおよび２０■／ ｉ！チアミン−ＨＣｌ。

ｐＨは、ＮａＯＨにより６−８に調節され、培養の闇、添加されるＮＨ，ＯＨに より調節された。発泡は、必要に応じて、消泡剤としてプロピレングリコールの 添加により調節した。溶解酸素濃度は、４０％に維持した。

該培養物は上述のように接種され、３０゛Ｃにて光学密度２１（Ａ６８０）に達 するまで育生された。次いで、温度を３７°Ｃに上昇させ、ｒＴｔｈポリメラー ゼ合成を誘発させた。誘発後、育生を８時間継続し、次いで、細胞を交差流濾過 を用いて濃縮し、続いて遠心分離して採取した。得られた細胞ペーストを一７０ ℃にて凍結し、約５００ｇの細胞ペーストを得た。別途水さない限り、すべての 精製工程は、４°Ｃにて行なわれた。

約２８０グラムの冷凍（−７０°Ｃ）Ｅ、ｃｏｌｉＫＩ２　ＤＧ１１６株（プラ スミドｐＬＳＧ３３を保有する）を−２０″Ｃにて一夜温めた。該細胞ベレット に次の試薬を添加した。■体積の２ＸＴＥ　（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ ７，５，２ｍＭ　ＥＤＴＡ）　、５ｍｇ／ｍ／ロイペプチンおよび５０■／ｍＪ ＰＭｓＦ、最終濃度は、ロイペプチンについて０．５μｇ／ｒｄ、ＰＭＳＦにつ いて０．６２５μｇ／ｄてあった。好ましくは、ＴＥ中に最終濃度５ｍＭ２−Ｍ ｅを与えるようにベーターメルカプトエタノール（２−Ｍ　ｅ　）か含まれる。

該混合物を、ブレンタ中、低速度でホモジ尤イズした。す・＼てのガラス器具は 、使用前に焼成し、また可能であれば、精製に使用される溶液は使用前にオート クレーブにかけた。細胞を、 １０．０００ｐｓｉにおいて Ｍｉｅｒｏｆ　Ｉｕｉｄｉｚｅｒを２回通して溶菌させた。

該溶菌物を、５ｍＭの２　・−Ｍ　ｅを含むｌ　ＸＴＥよって、５．５ＸＸ細胞 型量の最終体積となるように希釈した。

ロイペプチンを０．５μｇ　／　ｒｄまで添加し、またＰＭＳＦを０．６２５μ ｇ／ｄまで添加した。最終体積（分画■）は、約１５４０−であった。

硫酸アンモニウムを、０．２Ｍ（２６，４ｇ／ｌ）まで徐々に加え、溶菌物を攪 拌した。硫酸アンモニウムの添加により形成された沈澱は、ポリエチレンイミン （ＰＥ　Ｉ）沈澱工程の前に下記のように除去した。硫酸アンモニウム沈澱を、 ＪＡ−１４０−タ中で１５，０００−２０，０００ｘｇにて２０分間、懸濁物を 遠心分離することにより除去した。上澄をデカントして保持した。

次いで硫酸アンモニウム上澄を加熱プレート上で、該上澄か７５°Ｃになるまで 攪拌し、次いで７７°Ｃ浴中に置き、時々攪拌しつつ１５分間保持した。次いで 該上澄を水浴中で２０°Ｃまで冷却し、ＰＩｌｉｌ＊定のためにＩＯ−の分別量 を取出した。

ＰＥＩ滴定およびアガロースゲル電気泳動を、０３％ＰＥＩ（ＢＤＨからＰｏｌ ｙｍｉｎＰとして商業的に入手可能）か、巨大分子ＤＮＡおよびＲＮＡの２９０ ％を沈澱させること、すなわちＰＥＩによる処理後、エチジウムブロマイド染色 したアガロースゲルにＤＮＡバンドか見られないことを示すために使用した。Ｐ ＥＴを攪拌しつつ徐々に０．３％−１０％まで保存溶液に加えた。

ＰＥＩ処理した上澄を、ＪＡ−１４０−タ中でｌＯ２０１０２０００ＲＰ、００ ０ｘｇ）にて２０分間遠心分離した。上澄をデカントして保存した。体Ｍ（分画 ■）は、約１３４０１ｎｌであった。

分画■を、カラム体積の６−１０倍の、０．２Ｍ硫酸アンモニウムを含むＴＥに より平衡化した２、６Ｘ１３゜３ａｎ（７１ｒｎｌ）のフェニルセファ０−スＣ Ｌ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃ　１ａ−ＬＫＢ）カラムに負荷した。次いで、分画■ を１０ａｎ／時の直線的流速にて負荷した。

流速は、０４９ｄ／分てあった。該カラムを、カラム体積の３倍の平衡化緩衝溶 液、次いでカラム体積の２倍のＴＥにより洗浄し、非−７ｔｈ　ＤＮＡポリメラ ーゼ蛋白質を除去した。次いでカラムを、カラム体積の２倍のＴＥ中の２０％エ チレングリコールにより洗浄して更に夾雑蛋白質を除去した。組換えＴｔｈを、 ２０％エチレングリコールを含むＴＥ中の２．５Ｍ尿素のカラム体積の４倍量を 用いて溶出させた。ＤＮＡポリメラーゼを含む画分を、光学的吸収（Ａ！、。） および５ＤＳ−ＰＡＧＥにより標準的方法に従って同定した。ピーク画分を集め 、０．２ミクロン滅菌減圧濾過装置で濾過した。

体積（分画■）は約１９５−であった。樹脂は、製造者の推奨に従って平衡化し 再使用した。

２．６Ｘ１．７５０（９３Ｊ）のヘパリンセファロースＣＬ−６Ｂカラム（Ｐｈ ａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ−ＬＫＢ）を、カラム体積の６−１０倍の０．１５Ｍ　 ＫＣｊ！、５０ｍＭ）リス−ＨＣｆ、ｐＨ７，５，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡおよび ０．２％Ｔｗｅｅｎ２０”を用いて、１時間あたり１力ラム体積の流速で平衡化 した。該緩衝溶液は、好ましくは５ｍＭの２−Ｍｅを含む。該カラムを、カラム 体積の３倍の平衡化緩衝溶液で洗浄した。７ｔｈポリメラーゼを、カラム体積の １０倍の同緩衝溶液中の１５０−７５０ｍＭ　ＫＣｆの直線勾配を用いて溶出さ せた。

両分（カラム体積の１０分の１）を滅菌試験管に集め、　〜ビークを画分■につ いて測定した。組換え７ｔｈポリメラーゼは、０．３３Ｍ　ＫＣＩ！にピークを もって溶出した。ピーク画分を集めて貯留した（分画■、１７７ｄ）。

分画■を、Ａｍ１ｃｏｎ　ＹＭ３０膜上で１０１ｎＩまで濃縮した。緩衝溶液交 換のために、２．５×保存緩衝溶液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ　ｐＨ７，５，２ ５０ｍＭＫＣｆ、０．２５ｍＭ　ＥＤＴＡ、２．５ｍＭ　ＤＴＴおよび０．５％ Ｔｗｅｅｎ−２０”）を用いて、濃縮器を２０−で満たし、各回ともｌ〇−まで 濃縮することを５回行なうダイアフィルトレージョンを行なった。濃縮器を空に し、１０ｍ１の２，５×保存緩衝溶液ですすぎ、これを濃縮分と合わせ分画■と した。

残留ＤＮＡを除去するために陰イオン交換クロマトグラフィを使用した。該処理 は、生物学的に安全なフード内にて滅菌技術を用いて行なわれた。０．２ミクロ ン滅菌使い捨てシリンジチップフィルタユニットを備えたＷａｔｅｒ　５ｅｐ− Ｐａｋ　ｐｌｕｓ　ＱＭＡカートリッジを、３０ｒｄの２．５×保存緩衝溶液に より、シリンジを用いて毎秒約５１１１の速度で平衡化した。使い捨てシリンジ を用いて分画Ｖを約１ｍ／秒でカートリッジを通し、滅菌試験管に集めた。該カ ートリッジを、５ｍｌの２．５×保存緩衝溶液により洗い出し、空気で押し出し 乾燥させた。溶出液を、８０％グリセロールによって１゜５×に希釈し、−２０ ℃にて保存した。得られた最終分画■貯留物は、１６．１ｘｌＯ＠単位の活性を 含んでいた。

■、アニール化処理 例■、■および■について、ｃＲＮＡテンプレートおよびＤＭ１５６ブライマは 、１０ｍＭトリス−ＨＣ１！、ｐＨ８，３，５０ｍＭ　ＫＣｆ、０．１ｍＭ　Ｅ ＤＴＡアニール化緩衝溶液中において、２０：１のプライマ：テンプレート比で アニール化された。ピペット誤差の低減および試験管変位の除去のために、８０ 反応のための材料を与える主混合物を作製した。

アニール化は次のように実施した＝８０反応主混合物を８５−８７°Ｃにて４分 間加熱し、次いで７０℃の水浴中に５分間置き、続いて６０°Ｃの水浴に５分間 置き、最後に室温に平衡させた。アニール化混合物を、次いて４”Ｃ（または別 法として一２０°Ｃ）にて後の使用のために保存した。各反応について、０．５ ｐｍｏｌ（０，１７５μｇ）のｃＲＮＡテンプレートおよび１０ｐｍｏ、ｆ７の プライマを含む２．５μｌの主混合物を使用した。別法として、アニール化をＲ Ｔ反応のインキュベーションの間に７０℃にて行なった。

■、α”ＰｄＣＴＰ取込みの測定 逆転写生成物中の同位体取込み量は、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）による核酸沈澱 にて測定した。この方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓらの、１９８２、Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒＣｌｏｎｉｎｇｌＣｏｌｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏ ｒｙ、４７３頁に記述逆転写に好適なテンプレートとしてのＡＷ１０６ｃＲＮＡ の分析 アニール化ＡＷ１０６ｃＲＮＡ・ＤＭ１５６混合物を、商業的に入手可能な逆転 写酵素を用いて、逆転写のためのテンプレートとして使用し、ＡＷ１０６ｃＲＮ Ａがテンプレートとして適当であるか試験した。

６×反応混合物を、Ｍ　ｇ　Ｃｌ　！を加えたｌ×Ｐｏ１ｌＲＴ緩衝溶液、ＩＸ ｄＮＴＰ保存溶液、および６０　ｐｍｏ　１プライマにアニール化された３ｐｍ ｏｌのテンプレートを含有させて調製した。この混合物を、６本の試験管に分別 した。すへての反応を０°Ｃにて設定した。対照として、■反応物をテンプレー トを含まず、ＩＯ単位のＭｏＭｕＬＶ−ＲＴを含めて設定した。他の一つの反応 物は、酵素を含めなかった。他の反応物については、ＭｏＭｕＬＶ−ＲＴを次の とおり添加した＝ｌＯ単位、１単位、０．１単位および０．０１単位。

すべての反応物を、３７°Ｃにて２０分間インキュベートした。反応を、０°Ｃ の氷水浴中に置き、ＥＤＴＡを最終濃度１０ｍＭをもって添加することにより停 止させた。

α”ＰｄＣＴＰの取込みを、ＴＣＡ沈澱可能な計数により測定した。

結果は、ＡＷＩ０６ｃＲＮＡが、ＭｏＭｕＬＶ−ＲＴを用いたｃＤＮＡ合成に適 したテンプレートであること例■の結果を標準として使用し、Ｅ、ｃｏｌｉＰｏ ｌ　ＩおよびｎＴａｑポリメラーゼを、逆転写酵素活性についてＡＷＩ０６ｃＲ ＮＡをテンプレートとしてアッセイした。正の対照として、１組の反応物におい てｃＲＮＡテンプレートをＤＮＡテンプレートに置換した。

結果は、例■と同様にα”ＰｄＣＴＰの取込み測定により定量化した。

＋２ｘＰｏｌ　Ｉ主混合物を、ＭｇＣｌ！２を含まないＰａｌ　ＩＲＴ緩衝溶液 、ｄＮＴＰ保存溶液および１２単位のＰｏｌ　Ｉ酵素を含有させて調製した。同 様に、１２ＸＴａｑ主混合物を、Ｔａｑ緩衝溶液、ｄＮＴＰ保存溶液、および１ ２単位の天然Ｔａｑ酵素とＴａｑ希釈剤を含存させて調製した。該Ｐｏ１．Ｉお よびＴａｑ主混合物を、ＲＮＡテンプレート（０，５μｍｏ　Ｉ　ｅｃＲＮＡ／ １０ｐｍｏｌｅ　ＤＭ１５６）に対して６つの反応物、ＤＮＡテンプレート（６ ，２５μｇ）について２つの反応物、およびテンプレートを含まない２つの対照 反応物を与えるように分割した。

ＲＮＡテンプレートについては、ｃＲＮＡ／ＤＭ１５６を加えたＰｏ１Ｉ主混合 合物含む６つの分別量にＭ　ｎ　Ｃｌ　ｔまたはＭ　ｇ　Ｃｌ　２を加え、塩濃 度０，０．５゜ｍＭ　ＭｎＣｆｚ　、０．７ｍＭ　ＭｎＣｆ２．１．０ｍＭ　Ｍ ｎＣ１！ｚ　、２．０ｍＭ　ＭｎＣ１！ｚおよび６ｍＭ　ＭｇＣｌ２とした。ｃ ＲＮＡ／ＤＭｌ　５６を加えたＴａｑ主混合物を含む６つの分別量に、ＭｎＣ！ ！、またはＭ　ｇ　ＣＩｔ　２を供給して、最終塩濃度か０１０５ｍＭ　ＭｎＣ １ｚ　、０．７ｍＭ　ＭｎＣ１ｘ、１０ｍＭ　ＭｎＣ１！ｚ　、２．、ＯｍＭ　 ＭｎＣ１！ｚまたは２ｍ　Ｍ　Ｍ　ｎ　ＣＩｔ　１　となるようにした。

ＤＮＡテンプレートについては、２つの分別量はＰｏ１ｌ混合物から取出し、一 つの反応物については最終濃度０　、　７　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｎ　Ｃｌ　２を与え、 他方については６　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃｅ　２を与えるように塩を添加した。２ つの分別量をＴａｑ混合物から取出し、一つの反応物については最終濃度０　、 　７　ｍＭ　Ｍｎ　Ｃｌ　２を与え、他方については２　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ 　ｘを与えるように塩を添加した。　負の対照として、Ｐｏ１ｌおよびＴａｑの 各々についてテンプレートを欠いている２つの反応混合物を調製した。これらの 反応物は、１２ＸＰｏｌＩおよび１２ＸＴａｑ主混合物の分別量を用いて集めら れ、テンプレートに代えてｌ×アニール化緩衝溶液を加えた。

Ｐｏ１ｌについては、０　、　７　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｎ　Ｃｌ　２または６ｍ　Ｍ　 Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２のいずれかを与えるように塩を加えた。

Ｔａｑについては、０．７ｍＭ　ＭｎＣｆｚまたは２ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２の いずれかを与えるように塩を加えた。

すべての反応物は、氷上にて混合され、次いでＰｏ１ｌを３７°Ｃ，Ｔａｑを６ ５℃にてインキュベートした。２０分後に反応物を氷上（０°Ｃ）で急冷し、Ｅ ＤＴＡを各反応物に最終濃度１０ｍＭまで添加した。

α”ＰｄＣＴＰ取込みを測定するために各反応物から試料を取出した。

この実験結果は表１に示されている。すべての値は、背景について補正して示さ れている。

表■ ＲＮＡ　テンプレート＋　６ｄ　ＭｇＣ１ｚ　−７６０表■に示されたデータは 、図１にグラフ的に示されている。

この実験は、Ｔ　ａ　ｑか逆転写酵素活性を有することを示している。１単位の Ｔａｑは、ＲＮＡテンプレートからのＤＮＡ転写物へのα”ＰｄＣＴＰの取込量 について、１単位のＭ　ｏ　Ｍ　ｕ　Ｌ　Ｖ逆転写酵素と等価である。

Ｅ、ｃｏｌｉＰｏｌｌも逆転写酵素活性を示した。

・Ｔａｑ反応は、３７°Ｃではなく６５“Ｃにて行なわれるため、該Ｔａｑ反応 はＰｏ１ｌまたはＭｏＭｕＬＶ逆転写酵素のいずれと比へても特異性が向上して いる。

髭 ９４ｋＤａｒＴａｑ、６２ＫＤａｒＴａｑおよびＴ　ｔ　ｈ工１１．−−一、― 、−−−陣画一一一一１−一―ゆ閥−１陶−一１１−画一トー神雫←瞥−−峰　 −１Ｗ−１師−−ポリメラーゼの逆転写酵素活性の比較 例■において観察された逆転写酵素活性か他の熱安定性ポリメラーゼに共通する ものであるか決定するために、９４ｋＤａｒＴａｑポリメラーゼ、５ｔｏｆｆｅ ｌ断片（従来６２ｋＤａｒＴａｑと称されていた）、および天然Ｔｔｈの逆転写 活性を比較した。Ｔａｇのいずれの形態も組換え手段により製造された。

９４ｋＤａＴａｑの２μＭ希釈物を、９４μｇ／ｎｍｏ　ｌ　ｅと仮定して２３ ．４μＭ保存溶液から調製した。５ｔｏｆｆｅｌ断片の希釈物も、Ｔａｑ希釈物 を使用して同様に調製した。

９４　ｋＤａおよび５ｔｏｆｆｅｌ断片希釈物は、両者ともに、３６μｍｏｌｅ ／、１８μｍを含んでいた。

７ｔｈポリメラーゼは、比活性８０，０００単位／■をもって２７単位／μｌの 溶液として精製された。従って、ｏ、ｌμｐは、０．３６ｐｍｏｌｅ　（２，７ 単位の酵素）を含んでいた。反応物を、最終塩濃度６０ｍＭＫＣｆ（Ｈ３Ｂ）ま たは１５ｍＭＫＣｊ７　（ＬＳＢ）をもって設定した。

０°Ｃにおいて、３つの１５Ｘ主混合物を、ｄＮＴＰ保存溶液、酵素希釈溶液、 ５．４μｍａｌｅ酵素（Ｔｔｈ、９４ｋＤａＴａｑ、または５ｔｏｆｆｅｌ断片 ）を含有させて調製した。各１５Ｘ主混合物から６つの分別量をＨ３ＢまたはＬ ＳＢのいずれかと合わせ、６つの反応混合物を、それぞれＴｔ　ｈ／Ｈ３Ｂ、Ｔ ｔ　ｈ／ＬＳＢ、９４ｋＤａ　Ｔａｑ／Ｈ３Ｂ、９４ｋＤａ　Ｔａｑ／ＬＢＳ、 ５ｔｏｆ　ｆｅｌ断片／ＨＢＳおよび５ｔｏｆｆｅｌ断片／ＬＳＢとして与えた 。

６つの反応混合物の各々について、２つの別個の分別量を、負のテンプレート、 正の酵素の対照反応物のために１×アニール緩衝溶液を容れた試験管に取出した 。

反応混合物として有用な残る５つの反応物に、ｃＲＮＡ／ＤＭ１５６アニ一ル化 混合物（３ｐｍｏ　ｌ　ｅのテンプレートおよび６０ｐｍｏｌｅのプライマ）を 添加した。該６系列の各々から４つの分別量を個々の試験管に取出した。なおも Ｏ″Ｃのまま、Ｍ　ｎ　Ｃｌ　ｘを表■に示される最終塩濃度を与えるように添 加した。

背景水準を測定するために、負−酵素、負−テンプレート対照を、ＩＸｃｌＮＴ Ｐ保存溶液、■×アニール化緩衝溶液、および０．ＩｘＴａｑ希釈溶液を含有さ せて調製した。塩は、次のように調節した：Ｈ３Ｂおよび０．６ｍＭまたは１． ２ｍＭの最終Ｍ　ｎ　ＣＩ！　ｘ濃度、ならびにＬＳＢおよび０．６ｍＭまたは １．２ｍＭの最終Ｍ　ｎ　Ｃ１，２濃度。

すべての反応混合物を、６５°Ｃにて１５分間インキュベートした。次いて試験 管を水浴中で急冷し、ＥＤＴＡを各試験管に［ＯｍＭの最終濃をもって加えた。

αコ２ＰｄＣＴＰ取込量はＴＣＡ沈澱により測定した。結果を表■に示す。

表■ 負酵素・負テンプレート反応物　リ■ 各反応物への１２ｐの入力は、１．２３Ｘ１０’　ｃｐｍであった。すへての数 値は、３７Ｃｐｍの平均背景について補正しである。数値は、１２５μｌの各反 応物あたりに組込まれたｃｐｍを反映している。取込みの全ｐｍｏ　ｌ　ｅは、 ａ”Ｐ−ｄＣＴＰ保存溶液からｆｆ２ｐの計数により測定された９　８４　ｃ　 ｐｍ／ｐｍｏ　ｌ　ｅに基づいて計算された。

これらの結果は、図２にグラフ的に示され、また試験したすべての熱安定性ＤＮ Ａポリメラーゼが逆転写酵素活性を有していることを示している。

例■および■は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、上昇された温度においてＲＮ Ａテンプレートを使用しｃＤＮＡ分子を生成する能力を有することを示している 。

この実験においては、逆転写反応か、ＰＣＲによるｃＤＮＡ増幅に結合される。

組換えＴｔｈが、逆転写反応およびＰＣＲの両者に対する熱安定性ポリメラーゼ として使用された。プラスミドｐＡＷ１０９から調製されたｃＲＮＡテンプレー トは、例１　（Ａ）に記述されている。本発明のこの実施態様は、例■に記述さ れ、例■および■で使用された前駆−アニール化工程は除いである。

ｃＲＴ反応のための成分は、以下の順序をもって室温にて合された＝９４μｊ’ 、ＨｚＯ；２μｌｌ０ＸＲＴ反応緩衝溶液（１００ｍＭトリス−ＨＣｆ、（ｐＨ ８゜３）、　９００ｍＭ、ＫＣｆ）　；　２１１１．　１０ｍＭＭ　ｎ　Ｃ１２ ２；　Ｉ　、６　ｕ　ｌ　、　ｄ　Ｎ　Ｔ　Ｐ溶液（２，５ｍＭの各ｄＡＴＰ、 ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰのＨ２Ｏ中の溶液ｐＨ７，０’）　；および２μ ｌ、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ　［ｐＨ７，５）、 １００ｍＭ　ＫＣＩ！、　０．　１ｍＭ　ＥＤＴＡＳ　１ｍＭＤＴＴＳ　Ｏ，２ ％Ｔｗｅｅｎ２０７Ｍ（ＰｉｅｒｃｅＳｕｒｆａｃｔａｍｐｓ）および５０％グ リセロール（ｖ　／　ｖ　）を含むＩ×酵素保存緩衝溶液中に２．５単位／μｌ ）。示された体積は、反応物あたりについてであるが、一貫性およびピペット誤 差を回避するために、ＲＴ反応混合物を２５×主混合物として調製した。該２５ ×反応主混合物は、４２５μｆ（１７μｌ／反応）を含む。

ＲＴ−プライマ混合物は、各々以下のように調製された。１８７μｌのＲＴ混合 物を、２５　ＸＲＴ主混合物から取出し、「下流」プライマと合わせた。この量 は、１１のＲＴ反応について充分であった。２つのＲＴ−プライマ混合物を、そ れぞれ、１８７μＩ！ＲＴ反応混合物および、■５μＭＤＭＩ５２（水中）二ま たは１５ｐＭＴＭＯＩ（水中）のいずれかの１１μｌ（反応物あたりｌμ！りを 含有させて調製した。１８μＥの０Ｍ１５２ＲＴ−プライマ混合物を含む分別量 を、１−８の番号を付した試験管に取出した。同様に、ＴＭＯＩ　ＲＴ−プライ マ混合物の！８μｌの分別量を、９−１６の番号を付した試験管に取出した。

テンブレー）ＡＷ１０９ｃＲＮＡを、例■に記述したよう（二調製し、希釈し、 下記のようにＴＥ（１０ｍＭトリス−ＨＣｆ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ）中の２１１１ テンプレート溶液として添加した。該テンプレート溶液は、担体として３０ｎｇ ／μ！のｒＲＮＡを含んでいた。

反応試験管２−８および１０−１６を、ＤＭ＋５２については２．５分間、また ＴＭＯＩ試料については７゜５分間、７０°Ｃにてインキュベートした。試験管 １および９を、氷上に保持してＲＴ反応か負の対照とし、後にＰＣＲテンプレー トとして作用する夾雑プラスミドＤＮＡの存在を検出のために用意した。７０℃ でのインキュベート後、反応を、試験管を氷上に置くことによって停止させた。

ＰＣＲアッセイ混合物を、１９×主混合物として室温にてｇ４復した。示された 体積は、反応あたりの体積を意図するものである・７１μｉ’Ｈ２０；８μｌ　 ｌｏＸＰＣＲ反応緩衝溶液（１００ｍＭトリス−Ｈ（、ｊ’［ｐＨ８３］　、ｌ 〜Ｉ　ＫＣＡ；１８．７５ｍＭ　ＭｇＣｌ２　；７５ｍＭ　ＥＧＴＡ：５０％グ リセロール［ｖ　／　ｖコ）およびｌμｆ、１５μＭＤＭ１５１　（ｒＰＣＲ上 流プライマ」）。全体積は、反応あたり８０μｌてあった。

ＰＣＲ増幅を、８０μｉ！ＰｃＲアッセイ混合物を２０μｒの逆転写酵素反応物 に添加することにより開始させた。鉱油の覆（７５μｉ）を蒸発防止のために加 え、次いて微量遠心装置で約２０秒間遠心して油層を反応混合物と分離した。Ｐ ＣＲを、Ｐｅｒｋｉｎ　ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｔｈ ｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒおよび以下の４種の連結したファイルを使用して行なっ た： ファイル１−ステップサイクル ９５℃にて２分間を１サイクル ファイル２−ステップサイクル ９５℃にて１分間、および６０℃にて１分間を３５サイクル ファイル３−ステップサイクル ６０°Ｃにて７分間を１サイクル ファイル４−浸漬４°Ｃ ＰＣＲに続いて、各試料から５μｌの分別量を取り出し、５μｌの試料染料（３ ０％　ｗ　／　ｖ　ショ糖、０゜１％　ｗ／ｖ　ブロモフェノールブルー、１０ ｍＭＥＤＴＡ）と合せ、アガロースゲル（２％　ＮｕＳｉｅｖｅ”　ＧＴＧ　ア ガロース［ＦＭＣコ、１％５ｅａｋｅｎ”　ＭＥ　アガロース［ＦＭＣコ）にて 分析した。電気泳動に続いて、該ケルをエチジウムブロマイトにより染色し、写 真操影した（図３参照）。すへての生成物の長さを、Ｉｋｂ　ＢＲＬ　分子量標 準（レーンは示していない）に対して相対的に決定した。図中、レーン番号は試 験管番号に対応している。期待された３０８ｂｐの長さの生成物は、反応物あた り１００コピーのＡＷ１０９　ｃＲＮＡの位置に見られた。ＴＭＯＩを７３０塩 基対の転写／増幅生成物の生成のために使用した場合には、反応物あたり１００ 分子のテンプレートの位置に正しい大きさのバンドか見られた。負の対照反応物 にはＰＣＲ生成物か検出されなかった。

例■ 全細胞ＲＮＡを使用する結合逆転写／増幅に５６２細胞株を、全細胞ＲＮＡの供 給源として使用した。該ＲＮＡを、例Ｉに記載したと同様に精製した。

この実験の目的は、天然に生じる異種的ＲＮＡ組成物を使用して、結合ＲＴ／Ｐ ＣＲ方法の感度を試験することであった。一般に、反応物あたりの２５０ｎｇの 全ＲＮＡは、約２５，０００個の細胞を表わすと推定され得る。

各細胞は、およそＩ−１０個のＩＬ−１ａ　ｍＲＮＡのコピーを含む。従って、 ２５０ｎｇのに５６２の全ＲＮＡは、概略２５，０００〜２５０，０００個のＩ Ｌ−１α標的ｍＲＮＡを含む。かくして、ＰＣＲ生成物の特異性および量は、例 Ｖの合成ｃＲＮＡテンプレートを使用して生成させた生成物の特異性および量と 比較され得る。

反応条件は、例■に記述したＤＭＩ５１およびＤ〜１１５２を使用するものと同 様であるか、以下の若干の変更を伴う。この実験においてはＩＩＩ類の下流プラ イマのみ使用するため、ＤＭ１５２をＲＴ反応混合物に直接に添加した。ｌｏＸ ＲＴ反応主混合物を、各反応物について９μｊ７Ｈ，ｏ；２μｆ　ｌｏＸＲＴ反 応緩衝溶液、２ｕｌ　１０ｍＭ　Ｍｎ（、ｊ？２　；　２μ（！　ｄＮＴＰ　（ 水中に、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ　：　ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ各々の２ｍＭ、ｐＨ ７，０）および１ｕｌ　ＤＭ１５２（水中に１５μＭ）を含有させて調製した。

該ＲＴ主混合物を室温で調製し、１６μ！の分別量を１−９の番号を付した下記 のＲＮＡを容れた試験管に分配した。

全テンプレート溶液は、ＴＥ（１０ｍＭ　トリス−ＨＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ） 中に調製した。２μＥのテンプレート溶液および２μｌのＴｔｈポリメラーゼ（ ＩＸ酵素保存緩衝溶液中、２．５単位／μｔりを各試験管に加えた。

すべての試料を、７０″Ｃにて２．５分間インキュベートしたが、例外として試 験管Ｉは、後にＰＣＲテンプレートとして作用するのであろう夾雑ＤＮＡの存在 を試験するために、負のＲＴ対照として氷上に保持した。反応を、氷上に置くこ とにより停止させた。

ＰＣＲアッセイ混合物を調製し、反応を例■に記述されると全く同様に行なった 。ＲＴ／ＰＣＲの結果を、例Ｖと同様にして分析し、結合を図４に示しである。

ＰＣＲ生成物のバンドは、レーン２−７に見られる。結果は、図４に示されるよ うに、本発明に従うと、８０ピコグラムはどの少量の全細胞ＲＮＡ　（ＲＮＡの ８−８０個の細胞当量に対応する）でも特異的かつ効率的な高温度逆転写および 増幅のための優れたテンプレートとして作用することを示している。

例■は、ｃＤＮＡ調製については７ｔｈポリメラーゼがＴａｑポリメラーゼより 優れているであろうことを示唆している。しかしながら、Ｔａｑポリメラーゼは 、ＰＣＲにおいてしばしば使用されている。従って、７ｔｈポリメラーゼかＲＴ 反応にて触媒作用し、ＴａｑポリメラーゼがＰＣＲにて触媒作用する方法を開発 した。以下の方法は、２つの反応か異なる熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにより触 媒作用される場合、またはＲＴ反応におけるポリメラーゼ量が、ＰＣＲのために 減少される場合に適している。

例示のため、以下の実験を行なった。全般に、ＲＴ反応は例Ｖと同様に行なわれ るが、反応試験管の半数にっいては、Ｔｔｈを加熱して失活させ、ＰＣＲのため にＴａｑて置換した。

特定のプロトコールは次のとおりてあった。ＲＴ主混合物を、ＤＭ１５２を使用 して例■に記述されるのと全く同様にして調製した。該ＲＴ主混合物を、９ｘ混 合物として作成した。１６μｌの分別量を、下記のようにＡＷ１０９ｃＲＮＡま たはｐＡＷｌ　０９ＤＮＡを含むｌ−８の番号を付した試験管に取った。

テンプレート溶液は、例Ｖと同様にすべてＴＥ中の２μｌの試料として調製した 。２μｌのｒＴｔｈを各試験管１−８　（ＩＸ酵素保存緩衝溶液中に２．５単位 ／μｌ）に加え、該Ｒ７反応物を試験管１．２．５および６を別として７０°Ｃ にて２．５分間インキュベートした。他の試験管は、ＲＴ反応の負の対照として 氷上に保持した。

反応を、試験管を氷上に置くことにより停止させた。下記表は、各試験管につい て反応条件を要約している。

室温において２つのＰＣＲ主混合物を調製した。

ＲＣＲフイナスＴａｑは、反応物あたり、７１１ｔｌ！Ｈ，Ｏ１８μｌ　ｌｏＸ ＰＣＲ反応緩衝溶液（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ！、ｐＨ８，３：　ＩＭ　ＫＣ ｆ　：　ｆ　８゜７５ｍＭ　ＭｇＣｌ！ｔ　；７．　５ｍＭ　ＥＧＴＡ；５０％ グリセロール［ｗ／ｖコ）およびＬｔｔｌ　ＤＭ１５１（水中に１５μＭ）を含 んでいた。該ＰＣＲマイナスＴａｑ混合物は、５×溶液として調製された。ＰＣ ＲプラスＴａｑ主混合物を、５×溶液として、反応物あたり６８．５μｍ７　Ｈ ２Ｏ；８μｉ　ｌ０ｘＴａｑ−ＰＣＲ反応緩衝溶液（１００ｍＭトリス−ＨＣ１ ’、ｐＨ８，３；３００ｍＭ　ＫＣｊ’　；　２５ｍＭ　ＭｇＣ１ｘ　）、ＩＭ ｌＤＭ１５１．および０．５μｌ　Ａｍｐｌｉ　Ｔａｑ”（５単位／μｌ）を含 存させて調製した。

８０μｌのＰＣＲマイナスＴａｑ主混合物を、試験管１−４に加えた。ＥＧＴＡ 　（２ａｌ！の３０ｍＭ保存溶液）を試験管５−８に加えた。次いで鉱油をすべ ての試験管に入れた（７５μｌ／試験管）。試験管５−８を９９°Ｃにて４分間 加熱し、７８μｌのＰＣＲプラスＴａｑ反応混合物をこれらの試験管のみに加え た（油の下側）。すべての試験管を微量遠心装置にて２０秒間遠心し、例Ｖに記 述されている４つの結合ファイルを使用してサーモサイクル中でインキュベート した。該ＲＴ／ＰＣＲ増幅物を、増幅−記述されているように電気泳動により分 析し、ゲルを写真撮影した（図■）。図Ｖは、ＰＣＲ工程におけるｒＴｔｈのＡ ｍｐｌｉ　Ｔａｑ”による置換か、生成物の収率に影響しないことを示している 。

例■ 好ましい逆転写／ＰＣＲプロトコール Ａ、逆転写反応 ０．５ｍｌのポリプロピレン微量遠心試験管に、９．４μ！滅菌蒸留水、２μｉ ’　１０ＸｒＴｔｈ逆転写酵素緩衝溶液；　２μＡ”　ＭｎＣｌ２　（１０ｍＭ ）；　０゜４ｔ、ｔｌのｄＧＴＰＳｄＡＴＰ、ｄＴＴＰおよびｄＣＴＰのそれぞ れ（各１０ｍＭ）：２μｌ　ｒＴｔｈポリメラーゼ２゜５μｌμｍ１μｌのプラ イマＤＭ１５２（１５μＭ）（または、別の「下流」プライマ）、および２μｌ の正の対照ＲＮＡまたは≦２５０ｎｇ全ＲＮＡを含む実験試料を合せる。　この 実施態様において正の対照ＲＮＡは、ＤＭＩ５２のテンプレートとして機能する 。対照ＲＮＡ濃度は、好ましくは〜１０４コピー／２０μ！である。

例えば、対照ＲＮＡは、１０ｍＭｈリスーＨＣ１！、ｐＨ８゜０．１ｍＭ　ＥＤ ＴＡおよび１０ｍＭ　ＮａＣ１中において、３０ａｇ／ｄのＥ、ｃｏｌｉ　ｒＲ ＮＡ中でｐＡＷ１０９から転写されたＲＮＡであってもよい。

全逆転写反応体積は、試料あたり２０μｌとすべきである。

蒸発または還流を低減するために、混合物を５０−１００μｌの鉱油で覆う。

該試験管を、浸漬ファイルニア０°Ｃにて５−１５分間、を使用してＰｅｒｋｉ ｎ−Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅｔｕｓ　ＤＮＡサーモサイクラ−中でインキュベートする 。反応を、必要となるまで試験管を氷上に置くことにより停止する。

各試料について、次のように最小８０μｌのＲＣＲ主混合物を調製する。８μｌ 　１０×キレート化緩衝溶液、６−１０ｕｌの２５　ｍ　Ｍ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２ ．１μｆのプライマＤＭ１５１（１５μＭ）または実験的な「上流」プライマお よび滅菌蒸留水。水、Ｍ　ｇ　Ｃｌ　！および「上流」プライマ体積の任意の組 合せを、該主混合物の全体積か試料あたり８０μｌである限り使用できる。

至適Ｍ　ｇ　Ｃｆ　２濃度は、全ｄＮＴＰ濃度、および使用するプライマとテン プレートに依存して変化するであろう。はとんとの場合において、反応混合物中 １．５−２゜５ｍＭの範囲のＭｇＣｌ！、の最終濃度は優れた結果を与えるであ ろう。使用されるテンプレートが正の対照ｐＡＷＩ０９である場合、６ａｌ　（ １，５ｍＭ）のＭ　ｇ　Ｃｉ　！か好ましい。

８０μ！のＲＣＲ主混合物を、各逆転写反応試験管に分配する。試料の持越しを 避けるために、添加間でピペットチップを交換する。試験管を微量遠心装置で〜 ３゜秒間遠心する。

ｐＡＷＩ　Ｏ９ＲＮＡ正対照の増幅のために、Ｐｅｒｋｉｎ　Ｅｌｍｅｒ　Ｃｅ ｔｕｓ　ＤＮＡサーモサイクラは、次のように４つの結合ファイルにてプログラ ムされる・ ステップサイクル、９５℃にて２分間を１サイクル、ステップサイクル：９５° Ｃにて１分間および６０°Ｃにて１分間を３５サイクル、 ステップサイクル、６０°Ｃにて７分間を１サイクル浸漬　：４・Ｃ ＰＣＲ増幅試料は、次の分析まで凍結保存することかできる。

アニール−伸長温度について６０°Ｃの選択は、正対照ｃＤＮＡの増幅に対して 至適である。他のプライマーテンプレート対に対しては、該アニール−伸長温度 の低下または上昇が必要でありうる。より高いアニール−伸長温度は、一般に特 異的生成物を生じる（Ｓａｉｋｉらの、１９８８．５ｃｉｅｎｃｅ　２３９：４ ８７−４９Ｉ参照）、至適状態は、５°Ｃにて試験を行なうか、あるいはより小 さい増大分について、最大の特異性および生成物の収率が達成されるまで試験し て経験的に決定し得る。

ＰＣＲ増幅のための至適塩化マグネシウム濃度は、各プライマの組について１． ５〜２．５ｒｎＭ塩化マグネシウムの濃度を試験することにより経験的に決定し 得る。

過少または過多の塩化マグネシウムは、増幅効率に影響するであろう。塩化マグ ネシウム濃度を、試料ＲＮＡ、ｄＮＴＰ、ｃＤＮＡおよびＤＮＡの濃度の実質的 変化に並行して調節することが好ましい。

多量の２次構造を含むことか知られているテンプレートについては、「ホットス タート」プロトコールが好ましい。逆転写反応のために２種類の反応混合物が調 製される。混合物Ａ：９．４μ！滅菌蒸留水、２μｌ　１０ＸｒＴｔｈ逆転写酵 素緩衝溶液、Ｉμｌ「下流プライマ」、２μｒ試料ＲＮＡ　（＜　２５０ｍｇの 全ＲＮＡ）　。混合物Ｂ　：　２ｕｌのｌ　ＯｍＭ　Ｍｎ　Ｃｌ　２溶液：０４ μ／　ｄＧＴＰ；０．４μｌ　ｄＡＴＰ；０．４μ１ｄＣＴＰ；０．４μｆ　ｄ ＴＴＰ；２μｊ７　ｒＴｔｈポリメラーゼ。

再反応混合物を室温にて調製する。混合物Ａを７０°Ｃにて５分間インキュベー トし、反応物に混合物Ｂを加え（反応混合物Ａを７０°Ｃに保ったまま）、先に 「逆転写反応」の節で記述されているように７０゛Ｃにて５−１５分間インキュ ベートする。ＰＣＲ反応は、上述のように行なわれる。

Ｃ：試薬 好ましいプロトコールは、以下の試薬類を使用する：ｒＴｔｈポリメラーゼ　２ ．５単位／　ｕ　ｌプライマＤＭ１５２　１５μＭ プライマＤＭ１５１　１５μＭ 正対照ＲＮＡ　５Ｘ１０’コピー／μ１ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　 ｄＴＴＰ　各］、０ｍＭ１０Ｘ逆転写酵素緩衝溶液　１００ｍＭトリス−ＨＣｌ 、ｐＨ８，３，９００ｍＭ　Ｋ　Ｃ１ ｔＯＸキレート緩衝溶液　５０％グリセロール（ｖ／ｖ）１００ｍＭ）リス−Ｈ Ｃ１ ｐＨ８，３、ＩＭ　ＫＣＩ！、 ７．５ｍＭ　ＥＧＴＡ。

０．５％ＴＷｅｅｎ２０ Ｍ　ｎ　Ｃｌ　２溶液　１０ｍ　Ｍ Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２溶液　２５ｍＭ これらの成分は、高温度逆転写用キットとして組合されてもよい。キットの変形 も本発明の開示の範囲内にある。

例えば、ＭｎＣ１，は、逆転写酵素緩衝溶液中に含まれ、また、Ｍ　ｇ　Ｃｌ　 ２はキレート緩衝溶液中に含まれてもよい。しかしながら、反応の至適化のため に、Ｍ　ｎ　Ｃｌ　２およびＭ　ｇ　Ｃｌ　ｚは、別個の試薬として提供される 。本質的ではないが、正の対照の使用は、発明の商業的実施には好ましい。

培養物の寄託 培養物は、Ｃｅｔｕｓ　Ｍａｓｔｅｒ Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　（ＣＭＣＣ）１４００、Ｆｉｆｔｙ− Ｔｈｉｒｄ　５ｔｒｅｅｔ、Ｅｍｅｒｙｕｉｌｌｅ、ＣＡ９４６０８、ＵＳＡに 寄託され、また、Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉｏｎ　（ＡＴＣＣ）、１２３０１、Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒｏｃｋ ｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ、ＵＳＡに受託された。ＣＭＣＣおよびＡＴＣＣ に受託番号、およびＡＴＣＣ寄託日を下記に示す。

培養物　ＡＴＣＣ番号　寄託口 １）ＢＳＭ：Ｔｔｈｌｏ　６８１９５　１２／２１／８９ｐＡＷＩ　０９　６８ 　＋　５２　１０／２７／８９これらの寄託は、ブダペスト条約に基づいてブダ ペスト条約の国際寄託当局に行なわれている。このことは、寄託臼から３０年間 の生き７こ培養の維持か保証される。

該寄託は、ブダペスト条約の規定に基づいてＡＴＣＣにより、入手可能とされ、 また関連する米国特許の発行によって永久的かつ無制限の入手可能性を保証する 出願人とＡＴＣＣとの間の契約を与える。譲渡者は、ここに、寄託培養物が適切 な条件で培養された場合に死滅し、失なわれ、破壊された場合には、それが通知 のもとに直ちに同じ培養物の生きた試料に置換されることに同意するものである 。寄託の入手可能性は、特許法に基づいて政府の権限のもとに与えられた権利に 反して、発明の実施許諾と解釈されるべきではない。

これらの寄託は、関連する公衆の便宜のためになされたもので、記述が発明の実 施を可能とするに充分でないことを認めるものではなく、また発明をこれらの特 定の構築物に限定することを意図するものでもない。ここに与えらたものは、当 業者が寄託された構築物を複製し、請求された発明の実施を可能とするＤＮＡの 別の形態またはそれを含む生物を構築することを可能ならしめる完全なる記述で ある。

本発明か詳細に記述されたが、ここに添付する請求の範囲の精神および範囲内に て変更および修飾か可能であることは理解されるであろう。

図３ 図４ 図５ 要　約　書 熱活性ＤＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ配列の複写および増幅方法か提供される 。ＲＮＡの逆転写は、例えば、９４ｋＤａ　Ｔａｑ、６２ｋＤａ　Ｔａｑ、ｎＴ ｔｈおよび組換えＴｔｈ　ＤＮＡポリメラーゼにより触媒作用を受ける。逆転写 が、熱安定性ポリメラーゼを使用する一酵素処理においてＰＣＲ増幅と結合され る。

手　続　ネ…　正　書防珂 平成５年３月１８日 ］−事件の表示 ２−発明の名称 高温度逆転写酵素 エフ、ホフマン　−　ラ　ロシュ　アープ−５−補正命令の日１寸　平成５年２ 月１６日６−ネ甫正により増力口する請求項の数７−補正の対象 図面の翻訳文 名義変更届 国際調査報告 ｌｌＩｍ＠１＾−・ｋａＩｗ　ＩＩＩＰＣＴ／ＵＳ　９０１０７６４１国際調査 報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＲＮＡテンプレートの逆転写に際し：前記ＲＮＡテンプレートを含む試料を 、前記ＲＮＡテンプレートに対してこれにハイブリッドするために充分に相補的 であるオリゴヌクレオチドプライマ、および熱活性ＤＮＡポリメラーゼと共に、 ４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート類の存在下、適切な緩衝溶液 中において、前記プライマが前記ＲＮＡテンプレートにハイブリッドし、かつ前 記熱活性ＤＮＡポリメラーゼが前記デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート の重合反応に対して触媒作用して前記ＲＮＡテンプレートの配列に対して相補的 なｃＤＮＡ配列を形成するために充分な温度にて処理することを含んでなる逆転 写方法。 ２．前記熱活性ＤＮＡポリメラーゼが、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼである請求 の範囲第１項に記載の方法。 ３．前記熟成温度が、５０℃および８０℃の間である請求の範囲第１項に記載の 方法。 ４．前記試料がヒトの生物学的試料である請求の範囲第１項に記載の方法。 ５．前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、ｎＴａｑ、ｎＴｔｈ、９４ｋＤａ　ｒ Ｔａｑ、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、およびｒＴｔｈからなる群から選択される請求の 範囲第２項に記載の方法。 ６．前記緩衝溶液が、Ｍｇ２＋およびＭｎ２＋からなる群がら選択される二価陽 イオンを含んでなる請求の範囲第３項に記載の方法。 ７．前記プライマが、特定のＲＮＡ標的分子に相補的である請求の範囲第４項に 記載の方法。 ８．前記二価陽イオンが、約０．５および２．５ｍＭの間の濃度であるＭｎ２＋ である請求の範囲第６項に記載の方法。 ９．前記特定のＲＮＡ標的分子が、遺伝子性または感染性疾患の診断用である請 求の範囲第７項に記載の方法。 １０．前記ｃＤＮＡ形式後に前記試料に更にＥＧＴＡを添加することを含む請求 の範囲第８項に記載の方法。 １１．前記ＥＧＴＡが、Ｍｎ２＋のモル濃度の約１−１０倍の間の濃度で存在す る請求の範囲第１０項に記載の方法。 １２．前記重合反応が、約２．５および１５分間の間の時間をもって行なわれる 請求の範囲第８項に記載の方法。 １３．前記緩衝溶液が、該反応混合物に約５０−１２５ｍＭの間の濃度を与える ＫＣｌを更に含んでなる請求の範囲第８項に記載の方法。 １４．特定の標的ＲＮＡ分子を含むと予想される試料中の前記特定の標的ＲＮＡ 分子の検出に際し：（ａ）前記試料を、前記ＲＮＡテンプレートに対してこれに ハイブリッドするために充分相補的であるプライマ、および熱活性ＤＮＡポリメ ラーゼと共に、４種のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート類の存在下、 適切な緩衝溶液中において、前記プライマが前記標的ＲＮＡにハイブリッドし、 かつ前記熱活性ＤＮＡポリメラーゼが前記デオキシリボヌクレオシドトリホスフ ェートの重合反応に対して触媒作用して前記標的ＲＮＡの配列に対して相補的な ｃＤＮＡ配列を形成するために充分な温度にて処理し； （ｂ）工程（ａ）にて形成された前記ｃＤＮＡを処理して、単鎖ｃＤＮＡおよび ＲＮＡテンプレートを与え：ならびに （ｃ）前記ｃＤＮＡの存在を検出する工程を含んでなる特定の標的ＲＮＡ分子の 検出方法。 １５．工程（ｃ）に先立って、工程（ａ）および（ｂ）を少なくとも１回反復す ることを更に含む請求の範囲第１４項に記載の方法。 １６．前記特定のＲＮＡ標的分子が、遺伝子性または感染性疾患の診断用である 請求の範囲第１４項に記載の方法。 １７．試料中に存在することが予想される標的ＲＮＡ分子の増幅に際し： （ａ）前記試料を、前記標的ＲＮＡに対してこれにハイブリッドするために充分 相補的である第１のプライマ、および熱活性ＤＮＡポリメラーゼと共に、４種の デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート類の存在下、適切な緩衝溶液中にお いて、前記第１のプライマが前記標的ＲＮＡにハイブリッドし、かつ前記熱活性 ＤＮＡポリメラーゼが前記デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの重合反 応に対して触媒作用して前記標的ＲＮＡの配列に対して相補的なｃＤＮＡ配列を 形成するために充分な温度にて処理し： （ｂ）工程（ａ）にて形成された前記ｃＤＮＡを処理して単鎖ｃＤＮＡを与え； （ｃ）工程（ｂ）にて形成された前記単鎖ｃＤＮＡを、少なくとも一つの単鎖ｃ ＤＮＡ分子にハイブリッド可能であり、かつ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの存在 下、二重鎮ｃＤＮＡの生成に適切な条件下で伸長生成物の合成開始を可能とする 第２のプライマと共に処理し；ならびに （ｄ）工程（ｃ）の二重鎖ｃＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応により増幅する、 工程を含んでなる標的ＲＮＡ分子の増幅方法。 １８．前記熱活性ＤＮＡポリメラーゼが熱安定性である請求の範囲第１７項に記 載の方法。 １９．工程（ａ）の温度が、５０℃および８０℃の間にある請求の範囲第１７項 に記載の方法。 ２０．前記標的ＲＮＡ分子が、遺伝子性または感染性疾患の診断用である請求の 範囲第１７項に記載の方法。 ２１．工程（ａ）および工程（ｃ）が、同じ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼにより 触媒作用を受ける請求の範囲第１８項に記載の方法。 ２２．前記熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが、ｎＴａｑ、ｎＴｔｈ、９４ｋＤａ　 ｒＴａｑ、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、およびｒＴｔｈからなる群から選択される請求 の範囲第２１項に記載の方法。 ２３．工程（ａ）における前記適切な緩衝溶液が、Ｍｎ２＋である二価陽イオン を含む請求の範囲第１９項に記載の方法。 ２４．工程（ｃ）における前記適切な条件が、Ｍｇ２＋である二価陽イオンを含 む緩衝溶液を有してなる請求の範囲第２３項に記載の方法。 ２５．工程（ａ）の後で工程（ｂ）の前に、ＥＧＴＡが前記試料に添加される請 求の範囲第２３項に記載の方法。 ２６．工程（ｃ）における前記適切な条件が、ＥＧＴＡを含むＰＣＲ緩衝溶液を 有してなる請求の範囲第２３項に記載の方法。 ２７．工程（ａ）が、２．５および１５分間の間の時間をもって行なわれる請求 の範囲第２３項に記載の方法。 ２８．前記ＰＣＲ緩衝溶液が、ＰＣＲにおいて約５−１０％の濃度で与えられる ためのグリセロールを含んでなる請求の範囲第２６項に記載の方法。 ２９．前記ＥＧＴＡが、前記ＰＣＲ緩衝溶液中に、Ｍｎ２＋濃度の１−１０倍の 間の最終ＥＧＴＡ濃度を与えるべく仔在する請求の範囲第２６項に記載の方法。 ３０．前記ＰＣＲ緩衝溶液が、約５０−１２５ｍＭの間の濃度においてＫＣｌを 更に含む請求の範囲第２８項に記載の方法。 ３１．パッケージされた形態において：（ａ）逆転写反応における熱活性ポリメ ラーゼの使用に対する指示書； （ｂ）熱活性ポリメラーゼ； （ｃ）逆転写酵素用緩衝溶液；および （ｄ）ＭｎＣｌ２溶液 を含んでなるキット。 ３２．１種の異なるデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの各々を更に含 んでなる請求の範囲第３１項に記載のキット。 ３３．前記熱活性ポリメラーゼが、ｎＴａｑ、ｎＴｔｈ、９４ｋＤａ　ｒＴａｑ 、Ｓｔｏｆｆｅｌ断片、およびｒＴｔｈからなる群から選択される請求の範囲第 ３１項に記載のキット。 ３４．前記ＭｎＣｌ２が、約０．８および１．４ｍＭＭｎＣｌ２の間の最終濃度 を与えるべく、逆転写反応において使用するために好適な量をもって存在する請 求の範囲第３１項に記載のキット。 ３５．ＰＣＲ実施のための緩衝溶液を更に含んでなる請求の範囲第３２項に記載 のキット。 ３６．正の対照ＲＮＡおよび正の対照ＲＮＡ逆転写用プライマを更に含んでなる 請求の範囲第３２項に記載のキット。 ３７．前記逆転写緩衝溶液が、約５０−１００ｍＭＫＣ４の間の最終濃度を与え るべく逆転写反応において使用するために好適な量をもってＫＣｌを更に含有し てなる請求の範囲第３４項に記載のキット。 ３８．ＰＣＲ実施のための前記緩衝溶液が、ＥＧＴＡを含むキレート形成緩衝溶 液として好適なものである請求の範囲第３５項に記載のキット。 ３９．溶液中にＭｇＣｌ２を更に含んでなる請求の範囲第３８項に記載のキット 。 ４０．前記成分が、下記の最終濃度： ０．２−２ｍＭＥＧＴＡ Ｉ−１０％グリセロール ５０−１２５ｍＭＫＣｌ １−３ｍＭＭｇＣｌ２ を与えるべくＰＣＲ反応における使用に適した量をもって存在する請求の範囲第 ３８項に記載のキット。