CN102242189A - 用于实时pcr的核酸模板制备 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了用于高吞吐量实时PCR分析的来自细胞的核酸模板的有效制备的新的试剂配方。所述试剂允许快速的细胞裂解和模板制备，而不需要模板纯化和分离。因此，所述试剂显著地提高了实时PCR分析的吞吐量，同时在PCR扩增的少至约35个循环内允许单分子核酸模板的快速的且灵敏的实时Catacleave PCR检测。

Description

用于实时PCR的核酸模板制备
相关申请的交叉引用
本申请要求于2010年3月11日提交的第61/312,873号美国临时专利申请的优先权，故通过引用将上述申请的全部内容并入本文。
技术领域
本公开描述了一种缓冲液和用于高效实时PCR分析的模板核酸制备的方法。在实施例中，所述缓冲液适合于含有目标核酸的细胞的裂解。
背景技术
高吞吐量PCR筛选的实施已经使现代生物和医学发生了革命性变化。诊断、环境监控、验血和基因型分析仅是由该卓越的分析工具发挥作用的少数研究领域。随着生物信息学的出现，科学家现在能够在记录时间内分析大量的遗传信息。然而，传统的PCR分析向高吞吐量格式的转变必然需要PCR过程现代化以尽可能地提高效率，同时保留传统的分析PCR的优点。这种挑战在试图检测从活生物体例如原核病原体提取的目标DNA序列时是尤其明显的，其中，对提高的吞吐量的需要要求细胞裂解和PCR扩增在相同的反应缓冲液中发生，而不影响PCR检测的灵敏度。
发明内容
本发明基于用于高吞吐量实时PCR分析的来自细胞的核酸模板的有效制备的新的裂解试剂配方。所述试剂的配方允许快速的细胞裂解和模板制备，而不需要模板纯化和分离。因此，所述试剂显著地提高了实时PCR分析的吞吐量，同时保留了检测的灵敏度。
因此，本发明提供了用于使用裂解试剂来制备模板核酸的新的方法，所述裂解试剂在PCR扩增的少至30个循环内允许单分子核酸模板的快速的且灵敏的实时PCR检测。
在一方面，本发明提出了一种制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法。在裂解试剂中裂解细胞，所述裂解试剂包含pH为大约6至大约9的缓冲液、浓度为大约0.125％至大约2％的两性离子洗涤剂、浓度为大约0.3mg/ml至大约2.5mg/ml的叠氮化物以及蛋白酶。在使所产生的细胞裂解物在大约55℃孵育大约15分钟以产生基本上无蛋白质的细胞裂解物之后，使所述蛋白酶在大约95℃失活大约10分钟。所述基本上无蛋白质的细胞裂解物在混合物中提供了用于实时PCR扩增反应的模板，所述混合物包括：一对扩增引物，能够退火以在所述细胞裂解物中获得目标DNA序列；包括可检测的标记的探针以及与目标DNA的区域基本上互补的DNA和RNA核酸序列；扩增聚合酶活性；扩增缓冲液；RNase H活性。在所述目标DNA在第一扩增引物和第二扩增引物之间扩增之后，所述探针内的RNA序列能够与所述目标DNA中的互补的DNA序列形成RNA:DNA异源双链体。
所述RNase H活性可以是热启动RNase H活性(即，仅在暴露于非常高的温度之后才被激活)或热稳定的RNase H活性或者这两者。
在另一方面，本发明涉及一种制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法。在裂解试剂中裂解细胞，所述裂解试剂包括pH为大约6至大约9的缓冲液、浓度为大约0.125％至大约2％的两性离子洗涤剂、浓度为大约0.3mg/ml至大约2.5mg/ml的叠氮化物。在使所产生的细胞裂解物在大约55℃孵育大约15分钟之后，所述细胞裂解物在混合物中提供用于实时PCR扩增反应的模板，所述混合物包括：一对扩增引物，能够退火以在所述细胞裂解物中获得目标DNA序列；包括可检测的标记的探针以及与目标DNA的区域基本上互补的DNA和RNA核酸序列；扩增聚合酶活性；扩增缓冲液；RNase H活性。在所述目标DNA在第一扩增引物和第二扩增引物之间扩增之后，所述探针内的RNA序列能够与所述目标DNA中的互补的DNA序列形成RNA:DNA异源双链体。
所述细胞裂解物的加入允许对所述细胞裂解物中的单个目标DNA分子进行实时PCR检测，所述实时PCR检测需要少于40个的PCR扩增循环、少于35个的PCR扩增循环或少于30个的PCR扩增循环。
在特定实施例中，所述扩增反应混合物可以包括逆转录活性。所述探针可以用荧光标记。荧光标记可以是FRET对。
在另一实施例中，所述基本上无蛋白质的细胞裂解物由所述扩增反应混合物稀释5-15倍。
所述细胞可以是革兰氏阳性细菌细胞(例如，Listeria)或革兰氏阴性细胞(例如，E.coli或Salmonella)。
所述缓冲液可以是醋酸盐或磷酸盐类缓冲液、3-(N-吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙烷磺酸)(HEPES)或2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇缓冲液(Tris)。
所述两性离子洗涤剂可以是3-[(3-胆汁氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)。
所述蛋白酶可以是蛋白酶K。
在另一实施例中，本发明公开了一种裂解试剂，所述裂解试剂包括pH为大约6至大约8的缓冲液、浓度为大约0.125％至大约2％的两性离子洗涤剂和浓度为大约0.3mg/ml至大约2.5mg/ml的叠氮化物，其中，大约5-15倍稀释的试剂与扩增反应混合物一起存在不抑制扩增聚合酶和RNase H酶活性。
所述裂解试剂可以含有缓冲液，所述缓冲液具有醋酸盐或磷酸盐类缓冲液、3-(N-吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙烷磺酸)(HEPES)或2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇缓冲液(Tris)。
所述两性离子洗涤剂可以是3-[(3-胆汁氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐(CHAPS)。
在另一实施例中，所述裂解试剂包括pH为大约6至大约8的缓冲液、浓度为大约0.125％至大约2％的两性离子洗涤剂、浓度为大约0.3mg/ml至大约2.5mg/ml的叠氮化物以及蛋白酶，其中，在使所述蛋白酶失活之后，大约5-15倍稀释的试剂与扩增反应混合物一起存在不抑制扩增聚合酶和RNase H酶活性。
所述缓冲液可以包括醋酸盐类缓冲液、3-(N-吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙烷磺酸)(HEPES)或2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇缓冲液。
所述两性离子洗涤剂可以是3-[(3-胆汁氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐。
前面描述的实施例具有许多优点，包括在不需要模板纯化和分离的情况下执行细胞裂解和实时PCR的能力。该检测方法快速、精确、灵敏且适合于高吞吐量应用。
附图说明
图1是CataCleave探针技术的示意图。
图2是PCR扩增产物的实时CataCleave探针检测的示意图。
图3A是在不同的裂解试剂(CZ1-7&0.125×TZ)的存在下使用CataCleave探针来检测Salmonella(沙门氏菌)DNA的实时PCR反应的输出。
图3B在不同浓度的裂解试剂的存在下使用CataCleave探针来检测Listeria(李斯特菌)DNA的实时PCR反应的输出。
图4是使用CataCleave探针来检测使用不同浓度的裂解试剂所获得的Listeria细胞裂解物中的目标DNA序列的实时PCR反应的输出。
图5是使用CataCleave探针来检测使用优选裂解溶液的低浓度Listeria细胞的实时PCR反应的输出。
具体实施方式
除非另外表示，否则这里描述的实施例的实践使用本领域内的传统的分子生物学技术。这样的技术对技术人员是公知的，并被文献充分地解释。参见例如，Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley &Sons，Inc.，NY，N.Y.(1987-2008)，包括全部的附录；Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)。
除非另外定义，否则这里使用的全部的技术和科学术语具有与本领域的技术人员通常理解的意思相同的意思。说明书也提供了对术语的定义来帮助理解本申请的公开和权利要求。在定义与在别处定义不一致的情况下，将参照本申请中提出的定义。
如这里使用的，术语“细胞”可以指原核或真核细胞。
在一个实施例中，术语“细胞”可以指微生物，例如细菌，所述细菌包括、但不限于革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、耐酸细菌等。在特定的实施例中，将被测试的“细胞”可以使用表面的拭子采样来收集。在其它实施例中，“细胞”可以指致病生物体。
如这里使用的，革兰氏阳性细菌包括、但不限于Actinomedurae、Actinomyces israelii(衣氏放线菌)、Bacillus anthracis(炭疽杆菌)、Bacilluscereus(蜡样芽胞杆菌)、Clostridium botulinum(肉毒杆菌)、Clostridium difficile(艰难梭状芽胞杆菌)、Clostridium perfringens(产气荚膜梭状芽胞杆菌)、Clostridium tetani(破伤风梭菌)、Corynebacterium(棒杆菌)、Enterococcusfaecalis(粪肠球菌)、Listeria monocytogenes(单核细胞增生李斯特氏菌)、Nocardia(诺卡氏菌)、Propionibacterium acnes(痤疮丙酸杆菌)、Staphylococcusaureus(金黄色葡萄球菌)、Staphylococcus epiderm(表皮葡萄球菌)、Streptococcus mutans(变形链球菌)、Streptococcus pneumoniae(肺炎链球菌)等。
如这里使用的，革兰氏阴性细菌包括、但不限于Afipia fielis、Bacteriodes(类杆菌)、Bartonella bacilliformis(杆菌状巴通体)、Bortadella pertussis(百日咳博德特氏菌)、Borrelia burgdorferi(包柔氏螺旋体菌)、Borrelia recurrentis(回归热包柔氏螺旋体)、Brucella(布鲁氏菌)、Calymmatobacteriumgranulomatis(肉芽肿荚膜杆菌)、Campylobacter(弯曲杆菌属)、Escherichiacoli(大肠杆菌)、Francisella tularensis(土拉热弗朗西丝氏菌)、Gardnerellavaginalis(阴道加德菌)、Haemophilius aegyptius(埃及嗜血菌)、Haemophiliusducreyi(杜克雷氏嗜血杆菌)、Haemophilius influenziae(嗜血流感杆菌)、Heliobacter pylori(幽门螺旋菌)、Legionella pneumophila(嗜肺性军团病杆菌)、Leptospira interrogans(肾脏钩端螺旋体)、Neisseria meningitidia(脑膜炎奈瑟菌)、Porphyromonas gingivalis(牙龈卟啉单胞菌)、Providencia sturti(斯氏普罗威登斯菌)、Pseudomonas aeruginosa(绿脓假单胞菌)、Salmonellaenteridis(肠炎沙门菌)、Salmonella typhi(伤寒沙门氏菌)、Serratia marcescens(灵杆菌)、Shigella boydii(波伊德氏志贺氏菌)、Streptobacillus moniliformis(念珠状链杆菌)、Streptococcus pyogenes(酿脓链球菌)、Treponema pallidum(梅毒螺旋菌)、Vibrio cholerae(霍乱弧菌)、Yersinia enterocolitica(小肠结肠炎耶尔森氏菌)、Yersinia pestis(鼠疫耶氏菌)等。
如这里使用的，耐酸细菌包括、但不限于Myobacterium avium(鸟分枝杆菌)、Myobacterium leprae(麻风分支杆菌)、Myobacterium tuberculosis(结核杆菌)等。
在其它实施例中，“细胞”可以指没有落到其它三类中的其它细菌，其包括、但不限于Bartonella henselae(汉赛巴尔通体)、Chlamydia psittaci(鹦鹉热衣原体)、Chlamydia trachomatis(沙眼衣原体)、Coxiella burnetii(贝纳特氏立克次体)、Mycoplasma pneumoniae(肺炎支原体)、Rickettsia akari(小蛛立克次氏体)、Rickettsia prowazekii(普氏立克次氏体)、Rickettsia rickettsii(立氏立克次氏)、Rickettsia tsutsugamushi(恙虫热立克次氏体)、Rickettsia typhi(地方性斑疹伤寒立克次氏体)、Ureaplasma urealyticum(尿素分解尿素原体)、Diplococcus pneumoniae(肺炎双球菌)、Ehrlichia chafensis(埃里希体)、Enterococcus faecium(屎肠球菌)、Meningococci(脑膜炎球菌)等。
在另一实施例中，术语“细胞”可以指真菌，真菌包括、但不限于Aspergilli(曲霉)、Candidae(念珠菌)、Candida albicans(白色念珠菌)、Coccidioidesimmitis(粗球孢子菌)、Cryptococci(隐球菌)和它们的组合。
在另一实施例中，术语“细胞”可以指寄生微生物，寄生微生物包括、但不限于Balantidium coli(结肠小袋虫)、Cryptosporidium parvum(小球隐孢子虫)、Cyclospora cayatanensis(卡曼环孢子球虫)、Encephalitozoa(脑炎微胞子虫)、Entamoeba histolytica(痢疾内变形虫)、Enterocytozoon bieneusi(比氏肠胞虫)、Giardia lamblia(肠兰伯式鞭毛虫)、Leishmaniae(热带利什曼虫)、Plasmodii(疟原虫)、Toxoplasma gondii(弓形虫)、Trypanosomae(锥虫)、trapezoidal amoeba(梯形变形虫)等。
在另一实施例中，术语“细胞”可以指寄生虫，寄生虫包括蠕虫(例如，肠虫)，尤其是寄生蠕虫，寄生蠕虫包括、但不限于Nematoda(线虫)(圆虫，例如鞭虫、钩虫、蛲虫、蛔虫、丝虫等)、Cestoda(绦虫)(例如，带虫)等。
如这里使用的，“两性离子洗涤剂”指展现出两性离子性质(例如，不具有净电荷、电导率和电泳迁移率不足、不结合离子交换树脂、破坏蛋白质-蛋白质相互作用)的洗涤剂，该洗涤剂包括、但不限于CHAPS、CHAPSO和甜菜碱衍生物，例如优选地为以商品名
Figure BSA00000453868200061
(Calbiochem，San Diego，CA)和
Figure BSA00000453868200062
(Anatrace，Inc.；Maumee，OH)出售的硫代甜菜碱。
用于实施本发明的示例性的两性离子洗涤剂包括以具有以下化学名称的商品名
Figure BSA00000453868200063
和
Figure BSA00000453868200064
出售的两性离子洗涤剂：正十四基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐、正辛基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐、正癸基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐和正十二基-N，N-二甲基-3-氨基-1-丙磺酸盐。
本发明的示例性的洗涤剂可以在例如以下商品名下购得：分别为Anzergent 3-14，分析级；Anzergent 3-8，分析级；Anzergent 3-10，分析级；Anzergent 3-12，分析级；或者两性洗涤剂3-8、两性洗涤剂3-10、两性洗涤剂3-12和两性洗涤剂3-14、CHAPS、CHAPSO、ApolO和Apol2。
在一个实施例中，两性离子洗涤剂是CHAPS(CAS号：75621-03-3；获自于SIGMA-ALDRICH，产品号C3023-1G)，其是具有以下结构的34(3-胆汁氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐的缩写(在第4,372,888号美国专利中更详细地进行了描述)：
Figure BSA00000453868200071
在其它实施例中，以总组成的重量/体积(w/v)计算，CHAPS以大约0.125％至大约2％的浓度存在。在其它实施例中，以总组成的w/v计算，CHAPS以大约0.25％至大约1％的浓度存在。在又一实施例中，以总组成的w/v计算，CHAPS以大约0.4％至大约0.7％的浓度存在。
在另一实施例中，两性离子洗涤剂是CHAPSO(CAS号：82473-24-3；获自于FLUKA，产品号26675)，其是3-[(3-胆汁氨丙基)二甲基氨基]-2-羟基-1-丙磺酸盐的缩写并具有以下结构：
Figure BSA00000453868200072
在其它实施例中，以总组成的w/v计算，CHAPSO以大约0.125％至大约2％的浓度存在。在其它实施例中，以总组成的w/v计算，CHAPSO以大约0.25％至大约1％的浓度存在。在又一实施例中，以总组成的w/v计算，CHAPSO以大约0.4％至大约0.7％的浓度存在。
如这里使用的，术语“缓冲液”是指在25℃时pKa为大约6至大约9的条件下能够有效地将pH值保持在6和9之间的组合物。这里描述的缓冲液通常是生理相容的缓冲液，其可与酶活性的作用相容，并能够使生物大分子保持其正常的生理和生物化学作用。
缓冲液的示例包括、但不限于HEPES((4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)-丙烷磺酸)、N-三(羟甲基)甲基甘氨酸(Tricine)、三(羟甲基)甲氨酸(Tris)、哌嗪-N，N′-二(2-乙烷磺酸)(PIPES)和含有缓冲液的醋酸盐或磷酸盐(K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4、NaH2PO4)等。
如这里使用的术语“叠氮化物”由式-N3表示。在一个实施例中，叠氮化物是叠氮化钠NaN3(CAS号26628-22-8；获自于SIGMA-ALDRICH，产品号：S2002-25G)，叠氮化钠NaN3作为普通的抑菌剂。
如这里使用的术语“蛋白酶(protease)”是水解肽键的酶(具有蛋白酶活性)。蛋白酶还被称作例如肽酶、朊酶(proteinase)、肽水解酶或解蛋白酶。根据本发明使用的蛋白酶可以是在多肽链(内肽酶)内部发挥作用的内切类型。在一个实施例中，蛋白酶可以是丝氨酸蛋白酶、蛋白酶K(EC 3.4.21.64；获自于Roche Applied Sciences，重组蛋白酶K 50U/ml(来自于Pichia pastoris(毕赤酵母)商品目录号03 115 887 001)。
蛋白酶K用于消化蛋白质和去除来自核酸制备的污染物。核酸制备中添加蛋白酶K快速地使核酸酶失活，所述核酸酶可以在纯化过程中另外使DNA或RNA分解。因为酶在使蛋白质变性的化学品的存在下是活性的，并且可以使酶在大约95℃的温度下失活大约10分钟，所以其非常适合于这种应用。
在一个实施例中，革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌(例如，Listeria(李斯特菌)、Salmonella(沙门氏菌)或E.coli(大肠杆菌))的裂解需要裂解试剂包括蛋白酶K(1mg/ml)。细胞裂解物中的蛋白质由蛋白酶K在55℃下消化15分钟，然后使蛋白酶K在95℃下失活10分钟。在冷却之后，基本上无蛋白质的裂解物可与高效率PCR扩增相容。
除了蛋白酶K之外或者代替蛋白酶K，裂解试剂可以包含丝氨酸蛋白酶，例如胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、streptogrisin(链阳性菌素)、thermitase(热酶)、aqualysin(分解酵素)、胞浆素、cucumisin(黄瓜素)或羧肽酶A、D、C或Y。除了丝氨酸蛋白酶之外，裂解溶液可以包含：半胱氨酸蛋白酶，例如木瓜蛋白酶、钙蛋白酶或梭菌蛋白酶；酸蛋白酶，例如胃蛋白酶、凝乳酶或组织蛋白酶；或者金属蛋白酶，例如链霉蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、胶原酶、分散酶、氨基肽酶或羧肽酶A、B、E/H、M、T或U。蛋白酶K在宽的pH范围(pH 4.0-10.0)内是稳定的，并且在具有两性离子洗涤剂的缓冲液中是稳定的。
如这里使用的，术语“裂解物”是指具有裂解的细胞碎片和核酸的液相。
如这里使用的，术语“基本上无蛋白质”是指大部分蛋白质通过蛋白酶经过溶蛋白性裂解而失活的裂解物。蛋白酶可以包括蛋白酶K。在细胞裂解期间添加蛋白酶K使得可以另外分解目标核酸的核酸酶快速失活。“基本上无蛋白质”的裂解物可以经过也可以不经过处理，以便去除失活的蛋白质。
如这里使用的，措词“不抑制所述扩增聚合酶和RNase H酶活性”是指与在没有裂解试剂的情况下扩增聚合酶和RNase H酶活性相比，裂解试剂的存在将扩增聚合酶和RNase H酶活性减小了0％或小于大约1％或小于大约2％或小于大约5％或小于大约10％或小于大约25％。
如这里所使用的，术语“核酸”指寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述寡核苷酸或多核苷酸可以变型或可包括变型的碱基。寡核苷酸是包括2至60个核苷酸的核苷酸的单链聚合物。多核苷酸是包括两个或更多个核苷酸的核苷酸的聚合物。多核苷酸可以是双链DNA、包含脱氧胸甘的单链核酸聚合物、单链RNA、双链RNA或RNA/DNA异双链核酸分子中的任一种，双链DNA包括退火的寡核苷酸，其中，第二条链是具有第一条寡核苷酸的反向互补序列的寡核苷酸。核酸包括基因组DNA、cDNA、hnRNA、snRNA、mRNA、rRNA、tRNA、片段化的核酸、从诸如线粒体或叶绿体的细胞器得到的核酸以及从微生物得到的核酸或者可以存在于生物试样上或生物试样中的DNA病毒或RNA病毒，但不限于此。核酸可由单一类型的糖基(sugar moiety)(例如，在RNA和DNA的情况下)或不同糖基的混合物(例如，在RNA/DNA嵌合体的情况下)组成。
如这里所使用的，术语“标记”或“可检测标记”可以指结合到核苷酸、核苷酸聚合物或核苷酸结合因子的任何化学成分，其中，结合可以是共价的或非共价的。优选地，标记是可检测的并使所述核苷酸或核苷酸聚合物对本发明的实施者来说可检测。可检测的标记包括发光分子、化学发光分子、荧光素、荧光淬灭剂(fluorescent quenching agent)、着色分子、放射性同位素或闪烁体。可检测标记还包括任何有用的连接分子(诸如生物素、亲和素、链霉亲和素、HRP(辣根过氧化物酶)、蛋白质A、蛋白质B、抗体或它们的片段、Grb2、多组氨酸、Ni2+、FLAG标记、myc标记)、重金属、酶(示例包括碱性磷酸酶、过氧化物酶和荧光素酶)、电子供体/受体、吖啶酯、染料和量热基质(calorimetric substrate)。也将预想到，在表面等离子体共振检测的情况下，质量的改变可被认为是可检测的标记。本领域技术人员将容易地认识到可在本发明的操作中使用的上面未提到的有用的可检测标记。
仅为了举例说明的目的，下面在细菌病原体Salmonella的CataCleavePCR或RT-PCR检测的上下文中描述了使用用于核酸模板制备的裂解试剂的方法。在下文中将解释CataCleave PCR。
Salmonella目标序列的选择
如这里使用的，术语“目标”核酸序列是指将被检测或表征的核酸序列或结构。示例性的目标核酸序列包括、但不限于基因组DNA或基因组RNA。在一个实施例中，“目标”核酸序列可以在PCR反应或逆转录PCR反应中作为用于扩增的模板。在一个实施例中，“目标”核酸序列可以指存在于生物体的核酸中的核酸序列或者不存在于其它物种的核酸中的与其互补的序列。
在一个实施例中，首先从本领域公知的沙门氏菌核酸序列中选择作为DNA扩增目标的Salmonella核酸序列。如这里所使用的，术语“Salmonella目标序列”指包含基因Salmonella的细菌的核酸序列的DNA序列或RNA序列。它包括但不限于S.enterica菌种和S.bongori菌种，其包括但不限于亚种：enterica(I)(肠道(I))、salamae(II)(萨拉姆(II))、arizonae(IIIa)(亚利桑那(IIIa))、diarizonae(IIIb)(双亚利桑那(IIIb))、houtenae(IV)(豪顿(IV))和indica(VI)(因迪卡(VI))。Salmonella enterica亚菌种的示例性血清组和血清型可以在第7,659,381号美国专利中找到，该申请的全部内容通过引用包含于此。
下面的出版物讲授了根据本发明的可作为扩增目标的示例性Salmonella核酸序列：Liu WQ等人，“Salmonella paratyphi C：genetic divergence fromSalmonella choleraesuis and pathogenic convergence with Salmonella typhi”，PLoS One，2009，4(2)：e4510；Thomson NR等人，“Comparative genomeanalysis of Salmonella enteritidis PT4 and Salmonella gallinarum 287/91providesinsights into evolutionary and host adaptation pathways”，Genome Res，2008 Oct，18(10)：1624-37；Encheva V等人，“Proteome analysis of serovars typhimuriumand Pullorum of Salmonella enterica subspecies I.”，BMC Microbiol，2005 Jul18，5：42；McClelland M等人，“Comparison of genome degradation in ParatyphiA and Typhi，human-restricted serovars of Salmonella enterica that causetyphoid”，Nat Genet，2004Dec，36(12)：1268-74；Chiu CH等人，“Salmonellaenterica serotype Choleraesuis：epidemiology，pathogenesis，clinical disease，andtreatment”，Clin Microbiol Rev，2004 Apr，17(2)：311-22；Deng W等人，“Comparative genomics of Salmonella enterica serovar Typhi strains Ty2 andCT18”，J Bacteriol，2003 Apr，185(7)：2330-7；Parkhill J等人，“Completegenome sequence of a multiple drug resistant Salmonella enterica serovar TyphiCT18”，Nature，2001 Oct 25，413(6858)：848-52；McClelland M等人，“Completegenome sequence of Salmonella enterica serovar typhimurium LT2”，Nature，2001Oct 25，413(6858)：852-6，它们的内容通过引用包含于此。可使用基因库登录号为NC_003197的Salmonella enterica亚菌种的鼠伤寒沙门氏菌LT2(entericaserovar typhimurium str.LT2)血清型的全部4857432bp基因组的示例性核苷酸序列。
在一个实施例中，具有序列SEQ ID NO：3的扩增探针退火以获得目标Salmonella invA核酸序列。
在另一实施例中，目标核酸序列是在具有以下DNA序列的Salmonella特异的invA基因核酸序列内发现的区域：
SEQ ID NO：4，Salmonella enterica InvA基因(基因库登录号：U43272.1)：
AACAGTGCTCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGTACTAATGGTGATGATCATTTCTATGTTCGTCATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCCTGATCGCACTGAATATCGTACTGGCGATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCAACGTTTCCTGCGGTACTGTTAATTACCACGCTCTTTCGTCTGGCATTATCGATCAGTACCAGCCGTCTTATCTTGATTGAAGCCGATGCCGGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATTCGTTATTGGCGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGCGTCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGGTATGCCCGGTAAACAGATGAGTATTGATGCCGATTTGAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGCTGCGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTTTACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGCTATTGCCGGCATCATTATTATCTTTGTGAACTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGGATGACCCGCCATGGTATGGATTTGTCCTCCGCTCTGTCTACTTATACCATGCTGACCATTGGTGATGGTCTTGTCGCCCAGATCCCCGCATTGTTGATTGCGATTAGTGCCGGTTTTATCGTGACTCGCGTAAATGGCGATAGCGATAATATGGGGCGGAATATCATGACGCAGCTGTTGAACAACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATTTTGACCATTTCAATGGGAACTCTGCCGGGATTCCCGCTGCCGGTATTTGTTATTTTATCGGTGGTTTTAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACGTAGCGCCGCCAAACCTAAAACCAGCAAAGGCGAGCAGCCGCTTAGTATTGAGGAAAAAGAAGGGTCGTCGTTGGGACTGATTGGCGATCTCGATAAAGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAGCCGGCGTGAAGATCTGGAAAAAGCTCAACTTGCGGAGCGTCTACGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGCGTGCGCCTGCCGGAAGTATTGTTACGCGATGGCGAGGGCCTGGACGATAACAGCATCGTATTGTTGATTAATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCTATTTTGATTTGATGCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGTCGTGTCCTTTGGTATTAATCCAACAATCCATCAGCAAGGTAGCAGTCAGTATTTCTGGGTAACGCATGAAGAGGGGGAGAAACTCCGGGAGCTTGGCTATGTGTTGCGGAACGCGCTTGATGAGCTTTACCACTGTCTGGCGGTGACCGTGGCGCGCAACGTCAATGAATATTTCGGTATTCAGGAAACAAAACATATGCTGGACCAACTGGAAGCGAAATTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCTCAGACATGCCACGGTACAACGTATATCTGAAGTTTTGCAGCGTTTATTAAGCGAACGTGTTTCCGTGCGTAATATGAAATTAATTATGGAAGCGCTCGCATTGTGGGCGCCAAGAGAAAAAGATGTCATTAACCTTGTAGAGCATATTCGTGGAGCAATGGCGCGTTATATTTGTCATAAATTCGCCAATGGCGGCGAATTACGAGCAGTAATGGTATCTGCTGAAGTTGAGGATGTTATTCGCAAAGGGATCCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTCAGCCTTGACCCGGAAGCCTCCGCTAATTTGATGGATCTCATTACACTTAAGTTGGATGATTTATTGATTGCACATAAAGATCTTGTCCTCCTTACGTCTGTCGATGTCCGTCGATTTATTAAGAAA
如这里使用的，术语“引物”或“扩增引物”是指在PCR反应中作为DNA合成的开始点的寡核苷酸。引物通常在长度上为大约15个至大约35个核苷酸，并且杂交到与目标序列互补的区域。寡核苷酸可以通过任何适当的方法(例如化学合成)来合成和制备，这在本领域中是已知的。寡核苷酸也可以是通过商业来源方便地获得的。
本领域普通技术人员将容易地使引物最优化和识别引物。许多计算机程序(例如，Primer-Express)可容易地用于设计最优的引物/探针组。对于本领域技术人员将明显的是，可以相应地制备基于提供的(或用登录号可公开获得的)核酸信息的引物和探针。
在一个实施例中，一对扩增引物(即，正向引物和反向引物)可以是SEQID NO：1和SEQ ID NO：2的一对引物。
5′-TCG TCA TTC CAT TAC CTA CC  (SEQ ID NO：1)
5’TAC TGA TCG ATA ATG CCA GAC GAA(SEQ ID NO：2)
“引物二聚体”是在PCR中的潜在的副产物，引物二聚体由引物分子组成，引物分子在引物中因一系列互补的碱基而部分地彼此杂交。结果，DNA聚合酶扩增引物二聚体，导致与PCR反应物竞争，从而潜在地抑制了作为PCR扩增的目标DNA序列的扩增。在实时PCR中，引物二聚体会通过降低灵敏度来影响准确定量。
筛选用于检测Salmonella的引物序列，以形成引物二聚物。在SYBRGreen I的存在下使用一对正向引物和反向引物来进行PCR反应。当该染料变为插入到双螺旋DNA中时，该染料的荧光发射强度增大，因此可以在核酸扩增反应中用作非特异的探针。这些反应在所描述的含有800nM正向引物和反向引物、热稳定的DNA聚合酶和SYBR Green I的适当反应缓冲液中进行。可以使用适当的器械(例如，Applied Biosystems 7500Fast Real-Time PCRSystem或Biorad CFX96实时PCR热循环器)实时检测SYBR Green I荧光发射所发生的增大。引物二聚物的形成产生与在引物特异的模板DNA的存在下看见的发射轮廓类似的特有的S形发射轮廓。术语“退火”和“杂交”可互换使用，并表示导致双链、三链或其它更高序列结构形成的一个核酸与另一个核酸的碱基对反应。在特定实施例中，主要反应是通过Watson/Crick和Hoogsteen类型氢键而碱基特异的，例如A/T和G/C。在特定的实施例中，碱基堆积和疏水作用也可有助于双链稳定。
如这里所使用的，术语“基本上互补的”指序列基本上互补的两个核酸链退火并形成稳定的双链。互补不需要精确，可存在任何数量的例如在两个核酸之间的碱基对错配。然而，如果错配的数量大得使即使在最不严格的杂交条件下也不会发生杂交，则该序列不是基本互补的序列。当这里将两个序列称作“基本上互补的”时，它表示所述序列是彼此充分地互补的以在选择的反应条件(例如严格的杂化条件)下杂交。核酸互补与足以获得特异性的杂交的严格性之间的关系在本领域内是公知的。两个基本上互补的链可以例如完全互补，或者只要杂交条件足以允许例如区分成对序列与未成对序列，则两个基本上互补的链可以包含1至多个错配。因此，“基本上互补的”序列可以指在双链区域中具有100％、95％、90％、80％、75％、70％、60％、50％或更小或它们之间的任何数量的碱基互补的序列。
本领域技术人员将知道如何设计在目标沙门氏菌基因组序列侧面的PCR引物。合成的寡核苷酸的长度通常在20和26个碱基对之间，熔化温度TM通常在55度左右。
在测试样品中富集细菌核酸序列
用于检测目标沙门氏菌序列的示例性方案包括以下步骤：提供食物样本或表面刮拭物(surface wipe)，将样本或刮拭物与生长培养基混合并进行培养以增加Salmonella的数量或种群(“富集”)，将Salmonella细胞分解(“裂解”)，处理得到的裂解物，以对目标Salmonella序列进行扩增和检测。食物样本可以包括诸如鲑鱼的鱼、诸如牛奶的牛奶制品、蛋、家禽、果汁、肉(诸如猪肉糜、猪肉、牛肉或牛肉糜)、蔬菜(菠菜或苜蓿芽)或诸如花生酱的处理过的坚果。
根据在25克固体或25mL液体食物中或限定区域的表面上可以检测的菌落形成单位(CFU)的数量来描述对于食物污染物的检测限(LOD)。通过定义，菌落形成单位是存活细菌数量的量度。不同于计数全部细胞(死细胞和活细胞)的间接显微镜计数，CFU测量活细胞。在许可的条件下，一个CFU(通常为一个细菌细胞)在琼脂平板上将生长形成单独的菌落。美国食品检验检查部门将最低的LOD定义为1CFU/25g固体食物或者1CFU/25液体食物，或者1CFU/表面面积。
在实践中，不可能反复地用单独的CFU接种食物样本或表面并确保细菌在富集过程中存活。通过以一个或几个目标浓度接种样本并使用最可能数(MPN)统计估计污染来分析结果。作为示例，通过在分光光度计中测量吸光率使Salmonella培养基生长成为特定的细胞密度。在培养基上涂板十倍连续稀释的目标，并对活细菌进行计数。该数据用于构建CFU/涂板体积与细胞密度的标准曲线。为了使MPN有意义，分析多个接种水平的试样。最终的目标是为了获得在25％和75％之间的碎片回收率(fractional recovery)(即，在使用CataCleave探针的反转录PCR的化验中的25％和75％之间的阳性样本测试，将在下面对此进行解释)。选择这些碎片回收百分比的原因在于，对于25g固体食物样本、25mL液体食物样本或表面的限定区域，它们转换成0.3CFU和375CFU之间的MPN值。选择这些MPN值，因为它们包括1CFU/样本的所需的LOD。根据实践，能够(根据标准曲线)估计稀释的接种体的体积来获得这些碎片回收率。
核酸模板制备
用于裂解细胞的试剂可以包括pH为大约6至大约8的缓冲液、浓度为大约0.125％至大约2％的两性离子洗涤剂和浓度为大约0.3mg/ml至大约2.5mg/ml的叠氮化物。对于革兰氏阴性细菌(例如，Salmonella或E.coli)的裂解，裂解试剂可以可选地包括蛋白酶，例如蛋白酶K。然而，需要蛋白酶(例如，蛋白酶K)来从革兰氏阳性细菌制备PCR模板核酸。
在一个实施例中，制备1×裂解试剂，其含有12.5mM Tris醋酸盐(Trisacetate)或Tris-HCl或HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷硫酸)(pH＝7-8)，0.25％(w/v)CHAPS，0.3125mg/ml叠氮化钠。然后将45μl1×裂解试剂加入到5μl富集样品中，并在55℃下孵育15分钟。
对于革兰氏阴性细菌的裂解，可以将多至1mg/ml的蛋白酶K加入到裂解试剂中。在55℃下孵育15分钟之后，使蛋白酶K在95℃下失活10分钟，以产生与高效率PCR或逆转录PCR分析相容的基本上无蛋白质的裂解物。
Salmonella目标核酸序列的PCR扩增
一旦选择了引物并制备了含有目标核酸的不含细胞的裂解物(见示例)，就可通过各种方法完成核酸扩增，所述方法包括聚合酶链式反应(PCR)、依赖核酸序列扩增(NASBA)、连接酶链式反应(LCR)和滚环扩增(RCA)。聚合酶链式反应(PCR)是扩增特异目标DNA序列的最常用的方法。
“聚合酶链式反应”或“PCR”通常指用于体外扩增期望核苷酸序列的方法。第4,683,202号、第4,683,195号、第4,800,159号和第4,965,188号美国专利详细地描述了该方法，这些申请的全部内容通过引用包含于此。通常PCR工艺包括将两摩尔以上或超过两摩尔的可延伸寡核苷酸引物放入包含期望的目标序列的混合物中，所述引物与双链目标序列的相对链互补。在DNA聚合酶存在的情况下，对反应混合物进行热循环的程序，从而通过侧面的DNA引物使期望目标序列扩增。
在一方面，可以在实施例中使用的Salmonella特异的引物可以具有SEQID NO：1-2的DNA序列。
可用在本申请的实施例中的探针(有时称作“CataCleave探针”)可具有以下序列：
5’-/FAM/CGATCAGrGrArArATCAACCAG/IABFQ)(SEQ ID NO：3)，其将与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的引物对一起使用(其中，小写字母“r”表示RNA碱基(即，rG是核糖鸟嘌呤核苷(riboguanosine))。
如这里所使用的，术语“PCR片段”或“扩增子”指通过下面的特定目标核酸的扩增产生的多聚核苷酸分子(或统称为多个分子)。PCR片段通常是DNA PCR片段，但不排除其它情况。PCR片段可以是单链、双链或它们的任意浓度比的混合物。PCR片段的长度可以是大约100个至大约500个核苷酸或更多个核苷酸。
扩增“缓冲液”是被添加到扩增反应的化合物，缓冲液通过控制扩增反应来调节扩增反应的一个或多个组分的稳定性、活性和/或寿命。本发明的缓冲剂与PCR扩增和RNase H的切割活性相适应。缓冲液的示例包括HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉代)丙烷磺酸)和包含缓冲剂的醋酸或磷酸等。另外，PCR缓冲液通常可包含达大约70mM的KCl和大约1.5mM或更高的MgCl2，且包含的dATP、dCTP、dGTP和dTTP均达大约50μM-200μM。本发明的缓冲液可包含添加剂以使有效的反转录PCR或PCR反应最优化。
添加剂是被添加到组成物的化合物，调节组成物的一个或多个组分的稳定性、活性和/或寿命。在特定的实施例中，所述组合物是扩增反应组合物。在特定的实施例中，添加剂使污染物酶失活、稳定蛋白质折叠和/或减少聚合(aggregation)。可包括在扩增反应中的示例性添加剂包括甜菜碱、甲酰胺、KCl、CaCl2、MgOAc、MgCl2、NaCl、NH4OAc、NaI、Na(CO3)2、LiCl、MnOAc、NMP、海藻糖、二甲亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇、二硫苏糖醇(DTT)、焦磷酸酶(包括嗜酸热源体(Thermoplasma acidophilum)无机焦磷酸酶(TAP)，但不限于此)、牛血清白蛋白(BSA)、丙二醇、甘氨酰胺、CHES、Percoll、金精三羧酸、Tween 20、Tween 21、Tween 40、Tween 60、Tween 85、Brij 30、NP-40、Triton X-100、CHAPS、CHAPSO、Mackernium、LDAO(N-十二烷基-N，N-二甲胺-N-氧化物)、Zwittergent 3-10、Xwittergent 3-14、Xwittergent SB3-16、Empigen、NDSB-20、T4G32、E.Coli SSB、RecA、切口核酸内切酶(nickingendonucleases)、7-deazaG、dUTP、阴离子去污剂、阳离子去污剂、非离子去污剂、两性洗涤剂、固醇、渗透剂(osmolyte)、阳离子以及可改变扩增效率的任何其它化学药品、蛋白质或辅因子。在特定的实施例中，扩增反应中包括两种或更多种添加剂。倘若添加剂不影响RNase H的活性，则可以任选地添加添加剂以改善退火引物的选择性。
如这里使用的，“扩增聚合酶活性”或“扩增活性”是指与核酸扩增相关的酶活性，例如与热稳定的DNA聚合酶相关的活性。
如这里所使用的，应用于酶的术语“热稳定的”指在高温下(例如，在55℃或更高的温度下)保持其生物活性，或指在接下来的反复的加热和冷却循环下保持其生物活性。热稳定多核苷酸聚合酶在PCR扩增反应中特别有用。
如这里所使用的，“热稳定的聚合酶”是对热相对稳定的酶，因此，省略了在每个PCR循环之前加酶的需要。热稳定的聚合酶的非限制性示例包括从如下嗜热细菌中分离出的聚合酶：Thermus aquaticus(栖热水生菌)(Taq聚合酶)、Thermus thermophilus(嗜热栖热菌)(Tth聚合酶)、Thermococcuslitoralis(栖热球菌)(Tli或VENT聚合酶)、Pyrococcus furiosus(强烈火球菌)(Pfu或DEEPVENT聚合酶)、Pyrococcus woosii(Pwo聚合酶)或其它Pyrococcus(热球菌)种、Bacillus stearothermophilus(嗜热脂肪芽孢杆菌)(Bst聚合酶)、Sulfolobus acidocaldarius(嗜酸热硫化叶菌)(Sac聚合酶)、Thermoplasma acidophilum(嗜酸热源体菌)(Tac聚合酶)、Thermus rubber(红色栖热菌)(Tru聚合酶)、Thermus brockianus(布氏栖热菌)(DYNAZYME聚合酶)、Thermotoga neapolitana(阿波罗栖热袍菌)(Tne聚合酶)、Thermotogamaritime(海栖热袍菌)(Tma)和其它种的Thermotoga基因(栖热袍菌)(Tsp聚合酶)以及Methanobacterium thermoautotrophicum(热自养甲烷杆菌)(Mth聚合酶)。PCR反应可包含多于一个的具有互补特性的热稳定聚合酶来引导目标序列的更充分的扩增。例如，具有高持续合成能力(复制大量核苷酸片段的能力)的核苷酸聚合酶可与具有校正能力(在目标核酸序列延长过程中纠正错误的能力)的另一核苷酸聚合酶互补，从而建立可以复制具有高保真度的长目标序列的PCR反应。热稳定的聚合酶可以以其野生型形式使用。可选择地，可对聚合酶进行改性使其包含酶的片段或包含提供便于PCR反应的有益的特性的变异(mutation)。在一个实施例中，热稳定的酶可以是Taq聚合酶。具有提高的特性的Taq聚合酶的许多变型是公知的并包括AmpliTaq、AmpliTaq Stoffel片段、SuperTaq、SuperTaq plus、LA Taq、LApro Taq和EXTaq。
逆转录-SalmonellaRNA目标核酸序列的PCR扩增
研究基因表达的最为广泛使用的技术之一使用对于mRNA序列的第一链cDNA作为用于通过PCR扩增的模板。该方法通常被称作PCR或反转录PCR，该方法利用PCR方法的高灵敏度和特异性且该方法被广泛地用于RNA的检测和定量。
如这里使用的，“逆转录酶活性”是指与对互补的DNA链或者来自单链RNA模板的cDNA的合成进行催化的依赖于RNA的DNA聚合酶相关的活性。
执行为终点化验或实时化验的反转录PCR程序涉及两个单独的分子合成：(i)从RNA模板合成cDNA；(ii)通过PCR扩增复制新合成的cDNA。为了尝试解决通常与反转录PCR有关的技术问题，考虑到程序的以下三个基本步骤已开发了数个方案：(a)RNA的变性和反向引物的杂交；(b)cDNA的合成；(3)PCR扩增。在所谓的“分开的(uncoupled)”反转录PCR程序(例如，两步反转录PCR)中，将反转录执行为使用对反转录活性起到最佳缓冲液条件的两个单独的步骤。接下来合成cDNA，稀释反应来将MgCl2和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的浓度降低到对于Taq DNA聚合酶的最佳条件，并根据标准条件(参见第4,683,195号和第4,683,202号美国专利)执行PCR。相比之下，“分开的”反转录PCR方法使用对于反转录酶和Taq DNA聚合酶活性来说的普通的缓冲液，具有活性。在一种情况下，反向引物的退火是在添加酶之前的单独步骤，所述酶然后被加入到单独的反应容器中。在另一种情况下，反转录活性是热稳定的Tth DNA聚合酶的成分。在Mn2+的存在下执行退火和cDNA合成，然后在通过螯合剂去除Mn2+之后在Mg2+的存在下执行PCR。最终，“连续的”方法(例如，一步反转录PCR)将三个反转录PCR步骤整合为单个连续反应，从而避免了为组分或酶的添加而打开反应管。连续反转录PCR已被描述为利用耐热Taq DNA聚合酶和Tth聚合酶的反转录活性的单一酶系统，以及其中初始温度为65℃的利用AMV反转录酶和Taq DNA聚合酶的双酶系统。RNA变性的步骤可被省略。
实时反转录PCR的第一步是使用模板特异DNA引物中的一个来产生互补DNA链。在传统的PCR反应中，该产物被变性，第二模板特异引物结合到cDNA，并延伸形成双链DNA。该产物在随后的多次温度循环中扩增。为了维持最高的灵敏度，重要的是在cDNA合成之前RNA未降解。由于RNA:DNA杂交可作为酶的底物，所以在反应缓冲液中RNase H的存在将导致在工艺的第一步中形成的RNA:DNA杂交不期望地降解。克服该问题主要有两种方法。一种方法是使用诸如石蜡的阻碍物将RNase H从剩余的反转录反应物中物理地分离出来，其中，石蜡在最初的高温DNA变性步骤过程中将熔化。第二种方法是修饰RNase H使得RNase H在反转录温度(通常为45℃-55℃)下失活。多种方法在本领域内是公知的，这些方法包括RNase H与抗体反应或可逆的化学修饰。例如，在这里使用的热启动RNAse H活性可以是在碱性条件下在RNAse H与顺式乌头酸酐反应后产生的具有可逆化学修饰的RNAse H。当修饰酶用在具有三种碱基的缓冲液的反应中且温度升高至95℃时，溶液的pH下降且RNase H的活性恢复。该方法允许在反转录开始之前将RNase H包含在反应混合物中。
在Walder等的第2009/0325169号美国专利申请中描述了可在本发明中使用的RNAse H酶和热启动RNAse H酶的其它示例。
一步反转录PCR相对分开的反转录PCR具有多处优点。一步反转录PCR比分开的反转录PCR(例如，反应管的用于在两个反应步骤之间添加成分或酶的开口)对反应混合试剂盒核酸产物的处理更少，因此，劳动强度更小，减少了所需的工时量。另外，一步反转录PCR需要更少的样本，并降低了污染的危险。一步反转录PCR的灵敏度和特异性已被证明适合于研究给定样本中的一个至几个基因的表达水平或适合于检测病原体RNA。典型地，该程序已不限于使用基因特异性引物来启动cDNA合成。
通过结合这些反转录PCR技术的实时检测来测量PCR反应的动力学的能力使能够以高灵敏度来准确且精确地确定RNA的复制数。通过荧光监测来检测反转录PCR产品和在扩增工艺中通过下面描述的荧光双标记杂交探针技术(诸如5′荧光核酸酶检验(Taq-Man)或核酸内切酶检验(CataCleave))使准确且精确地确定RNA的复制数变得可能。
使用CataCleave探针的Salmonella目标核酸序列的实时PCR
已经发展了扩增后扩增子检测，从而在PCR过程中监控扩增。这些方法通常采用结合到新合成的DNA的荧光标记的探针或染料，当荧光标记的探针或染料插入到双螺旋DNA中时，它们的荧光发射增大。
探针通常设计为使得供体发射在没有目标的情况下由于两个发色团之间的荧光共振能量转移(FRET)而淬灭。当供体发色团和受体发色团极为靠近时，供体发色团在其激发状态下可以将能量转移到受体发色团。这种转移总是非辐射的，并通过偶极-偶极耦合而发生。足以增大发色团之间的距离的任何过程将减小FRET效率，从而可以辐射地检测到供体发色团发射。一般的供体发色团包括FAM、TAMRA、VIC、JOE、Cy3、Cy5和Texas Red。选择受体发色团，使得它们的激发光谱与供体的发射光谱重叠。这样的一对发色团的示例是FAM-TAMRA。还存在将淬灭宽范围的供体的非荧光受体。适当的供体-受体FRET对的其它示例对于本领域技术人员来说将是已知的。
可以用于PCR实时检测的FRET探针的一般示例包括分子信标、TaqMan探针(例如，第5,210,015号和第5,487,972号美国专利)和CataCleave探针(例如，第5,763,181号美国专利)。分子信标是单链寡核苷酸，所述单链寡核苷酸设计为使得在非束缚状态下探针形成供体发色团和受体发色团极为靠近的二级结构，并减小了供体发射。在适当的反应温度下，信标打开，并特异地结合到扩增子。一旦打开，供体发色团和受体发色团之间的距离就增大，从而FRET转换，并且可以使用专门的仪器来监控供体发射。TaqMan和CataCleave技术与分子信标的不同之处在于，所采用的FRET探针被切割，使得供体发色团和受体发色团变得充分分离，以转换FRET。
TaqMan技术采用在具有供体发色团的5’端和具有受体发色团的3’端进行标记的单链寡核苷酸探针。用于扩增的DNA聚合酶必须含有5’→3’核酸外切酶活性。在引物结合的同时，TaqMan探针结合到扩增子的一个链。随着DNA聚合酶延伸引物，聚合酶将最终遇到结合的TaqMan探针。此时，聚合酶的核酸外切酶活性将顺序地使得在5’端开始的TaqMan探针降解。随着探针被消化，含有探针的单核苷酸释放到反应缓冲液中。供体扩散离开受体，并且FRET被转换。监控来自供体的发射，以识别探针切割。由于TaqMan起作用的方式，所以可以在PCR的每个循环内仅检测到特定的扩增子一次。引物通过TaqMan目标位点的延伸产生双链产物，双链产物进一步防止TaqMan探针的结合，直到扩增子在下一个PCR循环内变性为止。
第5,763,181号美国专利(通过引用将其内容并入本文)描述了另一种实时检测方法(称作“CataCleave”)。CataCleave技术与TaqMan的不同之处在于，探针的切割由不具有聚合酶活性的第二种酶来完成。CataCleave探针在分子内具有作为核酸内切酶(例如，限制性酶或RNAase)的目标的序列。在一个示例中，CataCleave探针具有嵌合结构，其中，探针的5’端和3’端由DNA构成，并且切割位点含有RNA。探针的DNA序列部分在端部或者内部由FRET对标记。PCR反应包括RNase H酶，RNase H酶将特定地切割RNA-DNA双链(duplex)的RNA序列部分。在切割之后，探针的两半在反应温度下与目标扩增子分离，并扩散到反应缓冲液中。随着供体和受体分离，FRET按照与TaqMan探针相同的方式转换并且供体发射可被监控。切割和分离使进一步用于CataCleave结合的位点再生。这样，单个扩增子可以用作目标或多轮探针切割，直到引物延伸通过CataCleave探针结合位点为止。
Salmonella特异的CataCleave探针的标记
如这里使用的术语“探针”是指含有特异部分的多核苷酸，所述特异部分设计为以序列特异的方式与特定的核酸序列(例如，目标核酸序列)的互补区域杂交。在一个实施例中，寡核苷酸探针在长度为15-60个核苷酸的范围内。更优选地，寡核苷酸探针在长度为18-30个核苷酸的范围内。本发明的寡核苷酸探针的精确序列和长度部分地取决于其所结合的目标多核苷酸的性质。对于特定的实施例，可以改变结合位置和长度，以实现适当的退火和熔化性能。用于做出这种设计选择的指导可以在描述Taq-man检验或CataCleave的许多参考文献中查阅到，如在第5,763,181号、第6,787,304号和第7,112,422号美国专利中描述的，通过引用将上述美国专利的内容全部并入本文。
如这里使用的，术语“标记”或“可检测的标记”可以指能够通过光学或化学手段检测的任何标记。例如，在一个实施例中，CataCleave探针的标记或可检测的标记可以包括通过共价方式或非共价手段结合到探针的荧光染料化合物。
如这里使用的术语“荧光染料”是指基于波长比所发射的光的波长短的光的激发而发光的荧光化合物。术语“荧光供体”(fluorescent donor或fluorescence donor)是指发光的荧光染料，所述光由在本发明中描述的检验中测量。更具体地说，荧光供体提供由荧光受体吸收的光。术语“荧光受体”(fluorescent acceptor或fluorescence acceptor)是指吸收荧光供体发射的能量的第二种荧光染料或淬灭分子。第二种荧光染料吸收荧光供体发射的能量，并发射波长比荧光供体发射的光的波长长的光。淬灭分子吸收荧光供体发射的能量。
可以在本发明的实施中使用任何发光分子，优选地使用荧光染料和/或荧光淬灭剂，其包括例如Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸、荧光素、Oregon Green 488、Oregon Green 514、四甲基若丹明、若丹明X、Texas Red染料、QSY 7、QSY33、Dabcyl、BODIPY FL、BODIPY630/650、BODIPY 6501665、BODIPY TMR-X、BODIPY TR-X、二烷基氨基香豆素(dialkylaminocoumarin)、Cy5.5、Cy5、Cy3.5、Cy3、DTPA(Eu3+)-AMCA和TTHA(Eu3+)AMCA。
在一个实施例中，寡核苷酸探针的3′端核苷酸被封闭或者被迫使不能使核酸聚合酶延伸。这种封闭通过将报告分子或淬灭分子结合到探针的3′端位置来方便地实现。
在一个实施例中，报告分子是荧光有机染料，所述荧光有机染料被衍生以用于经由连接部分结合到探针的3′端或5′端。优选地，淬灭分子也是有机染料，根据本发明的实施例，所述有机染料可以是荧光的，也可以不是荧光的。例如，在本发明的优选实施例中，淬灭分子是非荧光的。通常，不管淬灭分子是荧光的，还是仅通过非辐射衰减释放来自报告分子的传递能量，淬灭分子的吸收带应当基本上与报告分子的荧光发射带重叠。吸收来自激发的报告分子的能量但不辐射地释放能量的非荧光淬灭分子在应用中称作发色分子。
示例性的报告分子-淬灭分子对可以选自于氧杂蒽染料，包括荧光素和若丹明染料。这些化合物中的许多适当形式的化合物可以广泛地通过商业渠道获得的，其中取代基位于它们的苯基部分上，所述苯基部分可以作为用于结合的位点，或者作为用于结合到寡核苷酸的结合功能。荧光化合物的另一基团是萘胺，所述萘胺在α位或β位具有氨基。这样的萘氨基化合物包括1-二甲基氨基萘基-5-磺酸盐、1-苯胺基-8-萘磺酸盐和2-对甲苯胺基6-萘磺酸盐。其它染料包括3-苯基-7-异氰酸基香豆素、吖啶(例如9-异硫氰酸基吖啶和吖啶橙)、N-(对(2-苯并噁唑基)苯基)马来酰亚胺、苯并二唑、二苯乙烯、芘等。
在一个实施例中，报告分子和淬灭分子选自于荧光素和非荧光淬灭染料。
有许多连接部分和方法用于将报告分子或淬灭分子连接到寡核苷酸的5′端或3′端，如由下面的参考文献所举例说明的：Eckstein，editor，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach(IRL Press，Oxford，1991)；Zuckerman等人，Nucleic Acids Research，15：5305-5321(1987)(3′thiolgroup on oligonucleotide)；Sharma等人，Nucleic Acids Research，19：3019(1991)(3′sulfhydryl)；Giusti等人，PCR Methods and Applications，2：223-227(1993)，以及Fung等人，第4,757,141号美国专利(5′phosphoamino group via Aminolink..II available from Applied Biosystems，Foster City，Calif.)Stabinsky，第4,739,044号美国专利(3′aminoalkylphosphoryl group)；Agrawal等人，TetrahedronLetters，31：1543-1546(1990)(attachment via phosphoramidate linkages)；Sproat等人，Nucleic Acids Research，15：4837(1987)(5′mercapto group)；Nelson等人，Nucleic Acids Research，17：7187-7194(1989)(3′amino group)等。
若丹明和非荧光淬灭染料还在固相合成开始时方便地结合到寡核苷酸的3′端，例如：Woo等人，第5,231,191号美国专利；以及Hobbs，Jr.，第4,997,928号美国专利。
Salmonella特异的CataCleave探针结合到固体载体
在本发明的一个示例中，寡核苷酸探针可以结合到固体载体。不同的探针可以结合到固体载体，并可以用于同时检测样品中的不同目标序列。具有不同荧光波长的报告分子可以用在不同的探针上，因此能够使与不同探针的杂交被单独地检测。
用于固定寡核苷酸探针的优选类型的固体载体的示例包括聚苯乙烯、抗生物素蛋白包覆的聚苯乙烯珠体纤维素、尼龙、丙烯酰胺凝胶和活化的右旋糖酐、可控孔度玻璃(CPG)、玻璃板和高度交联的聚苯乙烯。这些固体载体由于其化学稳定性、易于功能化和明确定义的表面积，所以对于杂交和诊断研究来说是优选的。诸如可控孔度玻璃(
Figure BSA00000453868200231
)和不膨胀的高度交联的聚苯乙烯
Figure BSA00000453868200232
之类的固体载体由于其与寡核苷酸合成的相容性，所以是特别优选的。
寡核苷酸探针可以以各种方式结合到固体载体。例如，探针可以通过探针的3′或5′端核苷酸结合到固体载体而结合到固体载体。然而，探针可以通过连接物(linker)结合到固体载体，所述连接物用于使探针与固体载体隔开。连接物最优选地在长度上为至少30个原子，更优选地在长度上为至少50个原子。
固定到固体载体的探针的杂交通常需要探针与固体载体隔开至少30个原子，更优选地至少50个原子。为了实现这种隔开，连接物通常包括位于连接物和3′核苷之间的间隔臂(spacer)。对于寡核苷酸合成，连接物臂通常通过酯链结合到3′核苷的3′-OH，所述酯链可以使用碱性试剂而切割开，从而使寡核苷酸离开固体载体。
可以用于将寡核苷酸探针结合到固体载体的各种连接物在本领域中是已知的。连接物可以由不显著妨碍目标序列杂交到结合至固体载体的探针的任何化合物形成。连接物可以由均聚合寡核苷酸形成，所述均聚合寡核苷酸可以通过自动合成而容易地加到连接物上。可选地，诸如功能化聚乙二醇的聚合物可以用作连接物。这样的聚合物相对于均聚合寡核苷酸是优选的，因此它们不显著妨碍探针杂交到目标寡核苷酸。聚乙二醇是特别优选的，因为它可以通过商业渠道获得，可溶于有机介质和水介质中，易于功能化，并且在寡核苷酸合成和后合成的条件下是完全稳定的。
固体载体、连接物和探针之间的连接优选地不是在高温下在碱性条件下在碱性保护基团的去除期间切割。优选的连接的示例包括氨基甲酸酯和酰胺连接。探针的固定是众所周知的，并且本领域技术人员可以确定固定条件。
根据该方法的一个实施例，将杂交探针固定在固体载体上。寡核苷酸探针在有利于杂交的条件下与核酸的样品接触。在报告分子与样品接触之前和之后，测量报告分子的荧光信号。因为探针上的报告分子在杂交到目标序列时展现出更大的荧光信号，所以在探针与样品之后，荧光信号的增大表明探针杂交到样品中的目标序列。在未杂交的状态下，荧光标记由淬灭剂淬灭。一旦杂交到目标，荧光标记便与淬灭剂分离，从而产生荧光。
杂交探针固定到固体载体还能够使杂交到探针的目标序列容易地与样品分离。在随后的步骤中，可以将分离的目标序列与固体载体分离，并基于研究者的特定需要，根据在本领域中众所周知的方法进行处理(例如纯化、扩增)。
使用CataCleave探针的Salmonella目标核酸序列的实时检测
被标记的寡核苷酸探针可以作为用于对样品中的Salmonella目标核酸序列进行实时检测的探针。
首先，将CataCleave寡核苷酸探针与DNA和RNA序列进行合成，所述DNA和RNA序列与在包括选择的Salmonella目标序列的PCR扩增子内发现的序列互补。在一个实施例中，探针用FRET对进行标记，例如，在探针的一端标记荧光素分子，在另一端标记非荧光淬灭分子。因此，一旦探针与PCR扩增子杂交，RNA:DNA异源双链形成可以通过RNase H活性切割的双链。
RNase H水解RNA-DNA杂交体中的RNA。该酶首先在小牛胸腺中发现，但随后在各种生物体中被鉴别出来。RNase H活性似乎普遍存在于真核细胞和细菌中。虽然RNase Hs构成分子量和溶核活性不同的一族蛋白质，但是底物要求对于各种同型来说似乎是类似的。例如，到目前为止研究的大多数RNase H’s起到核酸内切酶的作用，并需要二价阳离子(例如，Mg2+、Mn2+)，以产生5′磷酸(phosphate)端和3′羟基端的切割产物。
来自E.coli的RNase HI是RNase H家族的最有特征性的成员。除了RNaseHI之外，第二种E.coli RNase H(即，RNase HII)已经被克隆并被鉴定(Itaya，M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，87，8587-8591)。RNase HI由213个氨基酸组成，而RNase HI的长度为155个氨基酸。E.coli RNase HIM与E.coliRNase HI仅显示出17％同源性。由S.typhimurium克隆的RNase H与E.coliRNase HI的不同之处仅在于11个位置，且长度为155个氨基酸(Itaya，M.和Kondo K.，Nucleic Acids Res.，1991，19，4443-4449)。
显示出RNase H活性的蛋白质已经被克隆，并从许多种病毒、其它细菌和酵母中提纯出来(Wintersberger，U.Pharmac.Ther.，1990，48，259-280)。在许多情况下，具有RNase H活性的蛋白质似乎是融合蛋白质，其中，RNase H融合到另一种酶(通常为DNA或RNA聚合酶)的氨基端或羧基端。已经一致地发现RNase H域与E.coli RNase HI高度同源，但是由于其它域显著不同，所以融合蛋白质的分子量和其它特性有很大差异。
在更高等的真核细胞中，已经基于分子量的差异、二价阳离子的作用、对巯基试剂的敏感性和免疫学交叉反应性定义了两类RNase H(Busen等人，Eur.J.Biochem.，1977，74，203-208)。报道了RNase HI酶具有在68-90kDa范围内的分子量，由Mn2+或Mg2+激活，并且对巯基试剂不敏感。相反，已经报道了RNase H II酶具有范围为31-45kDa的分子量，需要Mg2+以对巯基试剂高度敏感，并由Mn2+抑制(Busen，W.，和Hausen，P.，Eur.J.Biochem.，1975，52，179-190；Kane，C.M.，Biochemistry，1988，27，3187-3196；Busen，W.，J.Biol.Chem.，1982，257，7106-7108)。
具有RNase HII特性的酶已经被提纯，以接近人体胎盘素的均质性(Frank等人，Nucleic Acids Res.，1994，22，5247-5254)。报道了该蛋白质具有大约33kDa的分子量，并且在6.5-10的pH范围内(最佳的pH为8.5-9)是有活性的。报道了该酶需要Mg2+，并由Mn2+和n-乙基马来酰亚胺来抑制。切割反应的产物具有3′羟基端和5′磷酸端。
根据实施例，在热稳定的核酸聚合酶、RNase H活性、能够杂交到Salmonella目标多核苷酸的一对PCR扩增引物以及被标记的CataCleave寡核苷酸探针的存在下对目标多核苷酸进行实时核酸扩增。在实时PCR反应期间，通过RNase H的探针的切割使得荧光供体与荧光淬灭分子分离，并且使得与样品中的Salmonella目标DNA序列的实时检测对应的探针的荧光实时增加。
在特定实施例中，在少于大约40个PCR扩增循环中，实时核酸扩增允许单个目标DNA分子的实时检测。
试剂盒
这里的公开内容还提供了包括包装单元(package unit)的试剂盒形式，所述包装单元具有一种或多种试剂，以用于对样品中的Salmonella目标核酸序列进行实时检测。试剂盒还可以包含下面的项中的一项或多项：缓冲液；说明书；阳性或阴性对照物。试剂盒可以包括试剂容器，所述试剂以适当的比例混合，以用于执行这里描述的方法。试剂容器优选地含有单位量的试剂，当执行主体方法时，单位量的试剂省去测量步骤。
试剂盒可以含有裂解试剂，所述裂解试剂包括pH为大约6至大约9的缓冲液、浓度为大约0.125％至大约2％的两性离子洗涤剂和浓度为大约0.3mg/ml至大约2.5mg/ml的叠氮化物。对于革兰氏阳性细菌的裂解，试剂盒可以包括蛋白酶(例如，100mg冻干的蛋白酶K)和等分的缓冲液，以便重构蛋白酶K溶液。在一个实施例中，1×裂解试剂含有12.5mM Tris醋酸盐(pH8.0)或Tris-HCl(pH 8.0)或HEPES(pH＝7.8)、0.25％(w/v)CHAPS和0.3125mg/ml叠氮化钠。
试剂盒还可以含有用于实时PCR的试剂，所述试剂包括、但不限于热稳定的聚合酶、热稳定的RNase H、被选择用于扩增Samonella核酸目标序列的引物以及退火以获得实时PCR产物的被标记的CataCleave寡核苷酸探针，根据这里描述的方法，所述试剂允许检测Salmonella目标核酸序列。试剂盒可以包括用于检测两种或更多种Salmonella目标核酸序列的试剂。在适用情况下，试剂盒试剂还可以包括用于RT-PCR分析的试剂。
在特定实施例中，扩增引物对的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
在其它实施例中，CataCleave寡核苷酸探针的序列为SEQ ID NO：3。
示例
现在将通过下面的示例对本发明进行举例说明，下面的示例不应当视为具有任何方式的限制性。
示例1：Salmonella的裂解
将5μL碎牛肉富集物(浸有Salmonella)稀释为含有2.5μL蛋白酶K(20.1mg/ml)的42.5μL裂解缓冲液。将样品在55℃孵育15分钟，然后在冷却之前加热至95℃且持续10分钟。然后将2μL裂解物加入到每个PCR-CataCleave反应。
示例2：在不同裂解试剂的存在下实时检测革兰氏阴性病原体SalmonellaInvA基因序列
测试八种裂解缓冲液：
1、CZ1：1％CHAPS，1mg/mL叠氮化钠，20mM HEPES-KOH(pH 8)
2、CZ2：2％CHAPS，1mg/mL叠氮化钠，20mM HEPES-KOH(pH 8)
3、CZ3：0.5％CHAPS，1mg/mL叠氮化钠，20mM HEPES-KOH(pH 8)
4、CZ4：1％CHAPS，0.5mg/mL叠氮化钠，20mM HEPES-KOH(pH 8)
5、CZ5：1％CHAPS，2.5mg/mL叠氮化钠，20mM HEPES-KOH(pH 8)
6、CZ6：1％CHAPS，1mg/mL叠氮化钠，20mM HEPES-KOH(pH 8)
7、CZ7：1％CHAPS，1mg/mL叠氮化钠，100mM HEPES-KOH(pH 8)
8、0.125TZ(1X TZ：2％Triton-X，5mg/ml叠氮化钠，0.2M Tris pH＝8)
每种反应混合物含有扩增缓冲液(32mM HEPES((4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)-KOH，pH 7.8，100mM醋酸钾，4mM醋酸镁，0.11％牛血清白蛋白，1％二甲亚砜)、800nM Salmonella-正向引物(SEQ ID NO.1)、800nMSalmonella-反向引物(SEQ ID NO.2)、200nM Salmonella CataCleave探针(SEQID NO.3)、dUTP/NTP混合物(80μM dGTP，dCTP，dATP和160μM dUTP)、2.5单位的Thermus aquaticus(嗜热水生菌)DNA聚合酶、1单位的Pyrococcusfuriosis(超嗜热菌)RNase HII和0.1单位的Uracil-N-Glycosylase(尿嘧啶DNA糖基化酶)和裂解物。
  组分  μl/25μl rxn
  10X ICAN缓冲液   2.5
  正向引物(20μM)(SEQ ID NO：1)   1
  反向引物(20μM)(SEQ ID NO：2)   1
  CC探针2(5μM)(SEQ ID NO：3)   1
  Fermentas(限制酶)dN/UTP(2/4mM)   1
  Taq聚合酶(5单位/μl)   0.5
  UNG(1单位/μl)   0.1
  RNaseH II(未稀释的)   0.2
  裂解物   2
  水   15.70
Salmonella正向引物和反向引物扩增包含在Salmonella入侵基因(invA)内的180碱基对片段。
引物和探针的序列是：
Salmonella-正向引物：5’-TCGTCATTCCATTACCTACC(SEQ ID NO：1)
Salmonella-反向引物：5’-TACTGATCGATAATGCCAGACGAA(SEQ IDNO：2)
Salmonella CataCleave探针：5’-/FAM/CGATCAGrGrArArATCAACCAG/IABFQ(SEQ ID NO：3)，其中，小写字母“r”表示RNA碱基(即，rG是riboguanosine(核糖鸟嘌呤核苷))
缩写词：FAM：6-羧基荧光素；IABHQ：来自Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)的用于短波长发射的Iowa黑洞淬灭剂(Black HoleQuencher)。
使用下面的循环方案在Roche Lightcycler 480上进行反应：37℃持续10分钟；95℃持续10分钟；然后50个扩增循环；95℃持续15秒，60℃持续20秒。
在60℃步骤期间监测FAM发射。
结果：
Figure BSA00000453868200281
Figure BSA00000453868200291
来自CataCleave-PCR反应的原始数据在表I中示出，并且如图3A中的输出曲线图所示。数据示出CZ5是用于Salmonella的最佳裂解物试剂，其中，CZ5的组成为：1％CHAPS，2.5mg/mL叠氮化钠，20mM HEPES-KOH(pH 8)。
表I
Figure BSA00000453868200292
Figure BSA00000453868200301
示例3：在不同裂解试剂的存在下实时检测革兰氏阳性病原体ListeriainlA基因序列
(1)在不同浓度的裂解试剂的存在下的对照CataCleave PCR
首先对以下面的裂解试剂浓度再悬浮的纯化后的目标DNA测试对照CataCleave PCR：
1×ZAC，0.5×ZAC，0.25×ZAC，0.125×ZAC和0.125×TZ裂解试剂。
(1×ZAC含有100mM Tris-醋酸盐(pH 8.0)、1％(w/v)CHAPS、2.5mg/mL叠氮化钠)
首先将5微升碎牛肉富集物(浸有Listeria)加入到42.5μl裂解试剂和2.5μl蛋白酶K(20mg/ml)中，并在55℃孵育15分钟。在95℃失活10分钟之后，将2μl裂解物加入到每种反应混合物中，每种反应混合物含有：1×ICAN扩增缓冲液(32mM HEPES-KOH，pH 7.8；4mM醋酸镁；1％DMSO；0.11％BSA)，400nM LmonC3-正向引物(SEQ ID NO.5)，400nM LmonC3-反向引物(SEQ ID NO.6)，200nM CataCleave探针(SEQ ID NO.7)，dUTP/NTP混合物(80μM dGTP，dCTP，dATP和160μM dUTP)，2.5单位的Thermus aquaticus(嗜热水生菌)DNA聚合酶、1单位的Pyrococcus furiosis(超嗜热菌)RNaseHII和0.1单位的Uracil-N-Glycosylase(尿嘧啶DNA糖基化酶，UNG)。
  组分  μl/25μl rxn
  10×ICAN缓冲液   2.5
  正向引物(20μM)(SEQ ID NO：1)   1
  反向引物(20μM)(SEQ ID NO：2)   1
  CC探针2(5μM)SEQ ID NO：3)   1
  Fermentas(限制酶)dN/UTP(2/4mM)   1
  Taq聚合酶(5单位/μl)   0.5
  UNG(1单位/μl)   0.1
  RNaseH II(未稀释的)   0.2
  裂解物   2
  水   15.70
Lmon C3F：ACGAGTAACGGGACAAATGC(SEQ ID NO.：5)
Lmon C3R：TCCCTAATCTATCCGCCTGA(SEQ ID NO.：6)
Lmon CC C3B：5’-/FAM/-CGAATGTAArCAGACACGGTCTCA/IABFQ/(SEQ ID NO.：7)，其中，小写字母“r”表示RNA碱基(即，rC是ribocytidine(核糖胞啶))。
使用下面的循环方案在Roche Lightcycler 480上进行反应：37℃持续10分钟；95℃持续10分钟；然后50个扩增循环；95℃持续15秒，60℃持续20秒。在60℃步骤期间监测FAM发射。
结果
Figure BSA00000453868200311
Figure BSA00000453868200321
来自CataCleave-PCR反应的原始数据在表II中示出，并且如图3B中的输出曲线图所示。结果显示出裂解试剂不抑制PCR CataCleave反应。
表II
  循环   1×ZAC   0.5×ZAC   0.25×ZAC   0.125×ZAC   0.125×TZ
  1   -0.09699   -0.20486   -0.04833   -0.046765   -0.22664
  2   -0.085   -0.13655   -0.03629   -0.022209   -0.01704
  3   -0.02587   -0.03728   -0.10074   -0.019208   -0.07463
  4   0.00056   -0.0285   -0.00117   -0.001508   0.015169
  5   0.0778   0.115301   0.06912   0.0278657   0.044441
  6   0.032514   0.087024   0.069083   0.01506   0.032053
  7   0.039257   0.122798   0.171074   0.0491612   0.128023
  8   0.140482   0.159938   0.178193   0.1194157   0.158038
  9   0.039735   0.150653   0.183067   0.0859022   0.07635
  10   0.089369   0.15579   0.242615   0.1943173   0.21943
  11   0.192583   0.252248   0.306922   0.1791263   0.155111
  12   0.202327   0.233666   0.263268   0.2653596   0.239119
  13   0.218244   0.289311   0.273896   0.1981817   0.308735
  14   0.313254   0.351079   0.386994   0.2811802   0.365395
  15   0.395791   0.429523   0.475952   0.3283648   0.375094
  16   0.350384   0.514369   0.449122   0.3794401   0.387435
  17   0.561825   0.627345   0.636219   0.4688326   0.49885
  18   0.95195   0.992367   0.767161   0.6579472   0.694401
  19   1.54081   1.529315   1.141115   0.8110075   0.979063
  20   2.850468   2.853095   1.696852   1.3423953   1.629341
  21   5.207561   5.171507   3.180452   2.314101   2.830532
  22   8.435477   8.562555   5.596482   4.3173407   4.92332
  23   12.00507   12.23999   8.913068   7.1185897   7.537452
  24   15.45744   15.6843   12.47505   10.421369   10.52937
  25   18.28514   18.49821   16.00331   13.795113   13.19183
  26   20.59036   20.78405   18.81848   16.754367   15.56513
  27   22.08714   22.37038   21.06715   19.095436   17.54934
  28   23.25291   23.51495   22.66854   21.010111   18.99617
  29   23.99131   24.20761   23.73872   22.454993   20.2352
  30   24.4453   24.70114   24.59113   23.410153   21.08687
  31   24.74259   25.10525   25.19888   24.131386   21.6994
  32   24.98374   25.26109   25.57421   24.554191   22.09661
  33   25.1141   25.44124   25.70583   24.961664   22.34253
  34   25.2959   25.63672   25.92781   25.134607   22.64692
  35   25.29523   25.72392   25.97292   25.383184   22.73857
  36   25.37572   25.78538   26.13833   25.439108   22.80516
  37   25.48673   25.8027   26.32687   25.490986   22.94251
  38   25.44637   25.83597   26.33189   25.598071   23.10812
  39   25.41595   25.96416   26.29354   25.625749   23.02327
  40   25.5418   26.02565   26.48576   25.720063   23.10226
  41   25.61236   25.94986   26.45389   25.740586   23.27089
  42   25.70811   26.09443   26.48187   25.843527   23.22228
  43   25.5923   26.08531   26.51365   25.835689   23.23941
  44   25.68285   26.18423   26.56709   25.784539   23.26417
  45   25.87408   26.29419   26.59244   25.873232   23.33746
  46   25.71791   26.28914   26.65421   25.881053   23.29554
  47   25.82871   26.25173   26.61916   25.949872   23.38694
  48   25.84879   26.35676   26.73319   25.969801   23.50514
  49   25.87907   26.31227   26.75596   26.054909   23.40214
  50   25.9747   26.46187   26.79372   26.092099   23.5366
(2)在不同浓度的裂解试剂的存在下的CataCleave PCR
将5μL碎牛肉富集物(浸有Listeria)稀释为42.5μL裂解试剂，所述裂解试剂含有2.5μl蛋白酶K(20.1mg/ml)。将样品在55℃孵育15分钟，然后加热到95℃且持续10分钟，然后冷却。
然后，将17.7μl裂解物加入到每种反应混合物中，每种反应混合物含有：扩增缓冲液1×ICAN缓冲液，400nM LmonC3-正向引物(SEQ ID NO.5)，400nM LmonC3-反向引物(SEQ ID NO.6)，200nM CataCleave探针(SEQ IDNO.7)，dUTP/NTP混合物(80μM dGTP，dCTP，dATP，160μM dUTP)，2.5单位的Thermus aquaticus(嗜热水生菌)DNA聚合酶、1单位的Pyrococcusfuriosis(超嗜热菌)RNase HII和0.1单位的Uracil-N-Glycosylase(尿嘧啶DNA糖基化酶，UNG)。
  组分  μl/25μl rxn
  10×ICAN缓冲液   2.5
  正向引物(20μM)(SEQ ID NO：1)   1
  反向引物(20μM)(SEQ ID NO：2)   1
  CC探针2(5μM)SEQ ID NO：3)   1
  Fermentas(限制酶)dN/UTP(2/4mM)   1
  Taq聚合酶(5单位/μl)   0.5
  UNG(1单位/μl)   0.1
  RNaseH II(未稀释的)   0.2
  裂解物   17.7
使用下面的循环方案在Roche Lightcycler 480上进行反应：37℃持续10分钟；95℃持续10分钟；然后50个扩增循环；95℃持续15秒，60℃持续20秒。在60℃步骤期间监测FAM发射。
结果
Figure BSA00000453868200341
来自CataCleave-PCR反应的原始数据在表III中示出，并且如图4中的输出曲线图所示。
表III
  循环   1×ZAC   0.5×ZAC   0.25×ZAC   0.125×ZAC   0.125×TZ
  1   0.077614   -0.09822   -0.05824   -0.039748   -0.09959
  2   -0.03404   -0.13232   -0.00703   -0.100784   0.066153
  3   -0.07487   -0.04901   -0.09185   -0.087871   -0.07367
  4   -0.05262   0.075592   -0.02352   -0.038116   -0.05526
  5   0.117787   0.078861   0.077598   0.0742302   0.054152
  6   0.043737   0.026881   0.044799   0.152541   0.008622
  7   0.077526   0.022978   0.187436   0.1637657   0.112786
  8   0.23646   0.241467   0.328947   0.2833491   0.121347
  9   0.140016   0.272779   0.211355   0.2334887   0.269803
  10   0.218573   0.223797   0.261582   0.2504744   0.244063
  11   0.277291   0.279521   0.266299   0.2861633   0.15492
  12   0.325077   0.376643   0.342292   0.3586809   0.300062
  13   0.337346   0.3866   0.316482   0.3344478   0.402511
  14   0.328943   0.362677   0.361522   0.4397371   0.424708
  15   0.340467   0.407566   0.435755   0.6362615   0.464939
  16   0.395245   0.425083   0.519306   0.7470641   0.554457
  17   0.322656   0.337854   0.581441   0.9482706   0.678852
  18   0.41911   0.514666   0.731707   1.4212851   0.894617
  19   0.473856   0.618876   0.700168   2.1270433   1.256995
  20   0.500158   0.521623   0.85323   2.9946251   1.612553
  21   0.555743   0.538892   1.000079   4.5298777   2.401413
  22   0.470761   0.597689   1.251074   6.6204294   3.288291
  23   0.470764   0.684364   1.463146   8.9550019   4.441369
  24   0.53713   0.729281   1.898393   11.845772   5.753559
  25   0.633628   0.697884   2.211707   14.716878   7.153089
  26   0.515491   0.777439   2.678923   17.346757   8.789131
  27   0.589652   0.655625   3.382994   19.665968   10.00318
  28   0.522429   0.71433   4.224791   21.546949   11.20419
  29   0.54479   0.804143   5.128984   23.008661   12.27092
  30   0.68912   0.800002   6.551109   24.193586   13.25283
  31   0.567998   0.806274   8.019011   25.092138   13.84691
  32   0.642153   0.840272   9.626144   25.62439   14.50004
  33   0.733879   0.822179   11.39364   25.988348   15.0229
  34   0.752335   0.925394   13.34431   26.347945   15.52392
  35   0.830317   1.101518   15.39789   26.650391   15.74119
  36   0.767902   0.98976   17.1333   26.697465   16.02925
  37   0.760112   0.999464   18.82938   26.826817   16.24723
  38   0.733766   0.974613   20.14765   27.003224   16.64739
  39   0.697606   1.043593   21.32038   27.124584   16.59615
  40   0.845917   0.973702   22.30455   27.186933   16.74812
  41   0.831268   1.046317   23.03147   27.145089   16.78345
  42   0.841024   1.039061   23.56877   27.215777   16.80936
  43   0.845868   1.059781   23.99401   27.201881   16.9304
  44   0.908314   1.083918   24.17477   27.37329   16.91534
  45   0.930744   1.069932   24.36045   27.441536   16.90511
  46   0.834135   1.11848   24.56825   27.451427   17.03681
  47   0.921012   1.18106   24.77539   27.401951   17.12249
  48   0.917058   1.246983   24.75345   27.553276   17.05662
  49   0.984415   1.292196   24.85161   27.601327   17.19329
  50   0.943401   1.288641   24.92833   27.454465   17.15786
示出了裂解试剂0.125×ZAC对于组合的裂解和PCR CataClsave化验来说是最佳的，以检测inlA Listeria基因。结果还示出0.125×ZAC裂解试剂优于0.125×TZ裂解试剂(A.Abolmaaty，C.Vu，J.Oliver和R.E.Levin.2000.Microbio.101：181-189)。
将L.monocytogenes(单核细胞增生李斯特菌)细胞的隔夜培养物在具有1mg/ml蛋白酶K的0.125×ZAC中稀释和裂解，并将2μl的所得裂解物加入到每种反应混合物中，每种反应混合物含有：1×ICAN扩增缓冲液，400nMLmonC3-正向引物(SEQ ID NO.5)，400nM LmonC3-反向引物(SEQ ID NO.6)，200nM CataCleave探针(SEQ ID N0.7)，dUTP/NTP混合物(80μM dGTP，dCTP，dATP，160μM dUTP)，2.5单位的Thermus aquaticus(嗜热水生菌)DNA聚合酶、1单位的Pyrococcus furiosis(超嗜热菌)RNase HII和0.1单位的Uracil-N-Glycosylase(尿嘧啶DNA糖基化酶，UNG)。
来自CataCleave-PCR反应的原始数据在表IV中示出，并描绘为图5中的输出曲线图。
表IV
  循环   0   1cfu   10cfu   100cfu   1000cfu
  1   -0.11808   -0.07851   0.011936   -0.1002   -0.149646
  2   -0.1098   0.003651   -0.02279   -0.06284   -0.112043
  3   -0.01988   -0.05519   -0.02283   -0.10594   -0.011233
  4   0.007606   -0.02763   -0.02418   0.007649   -0.01242
  5   0.052517   0.001732   0.048378   0.021996   0.0163366
  6   0.069563   0.077441   0.021426   0.139137   0.1193596
  7   0.202102   0.134554   0.107333   0.195385   0.1326588
  8   0.122608   0.130704   0.162061   0.192022   0.143822
  9   0.203919   0.196126   0.139583   0.256238   0.1360514
  10   0.197324   0.278507   0.279323   0.178584   0.2604398
  11   0.285288   0.276271   0.320686   0.320353   0.3302772
  12   0.34955   0.265818   0.354215   0.367903   0.3346809
  13   0.409585   0.339478   0.383226   0.353521   0.3779658
  14   0.31933   0.325381   0.369886   0.4411   0.3648694
  15   0.463041   0.452131   0.436999   0.507587   0.5183386
  16   0.516756   0.430724   0.415665   0.572943   0.4536356
  17   0.508156   0.510388   0.421196   0.5928   0.4157136
  18   0.490867   0.567845   0.565665   0.678261   0.5302937
  19   0.568158   0.629019   0.61154   0.593995   0.6192954
  20   0.654098   0.581062   0.666687   0.619606   0.5439232
  21   0.716346   0.701349   0.712583   0.693985   0.6762826
  22   0.697079   0.727242   0.825988   0.806229   0.7020741
  23   0.791554   0.686499   0.814547   0.780522   0.6617171
  24   0.772265   0.756716   0.840472   0.835031   0.8032904
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  26   0.735729   0.750853   0.849585   0.901836   0.8558568
  27   0.69271   0.812199   0.939329   0.932909   0.9448982
  28   0.832536   0.860932   0.987634   0.951846   1.0363242
  29   0.886423   0.929087   1.025976   0.946459   1.2048764
  30   0.957345   0.880115   1.064964   1.100577   1.5764367
  31   0.922819   0.949534   1.045366   1.254494   2.4399511
  32   0.916497   1.032466   1.199845   1.508678   4.1145568
  33   0.950909   1.036871   1.276579   1.98907   6.4652948
  34   1.051973   1.120949   1.41659   3.254214   9.2675224
  35   1.086415   1.258398   1.799451   5.12161   12.081736
  36   1.114276   1.35919   2.52539   7.588028   14.654087
  37   1.178774   1.717959   3.988458   10.29468   16.990934
  38   1.099043   2.468438   6.102741   13.08499   18.978338
  39   1.197297   3.791223   8.676799   15.53072   20.586421
  40   1.147104   5.919055   11.36327   17.60143   21.764495
  41   1.167417   8.422044   13.9765   19.43553   22.75955
  42   1.278476   11.18254   16.35152   20.87847   23.423068
  43   1.275322   13.66453   18.30331   21.84246   23.924492
  44   1.363122   15.96467   19.97683   22.73543   24.356174
  45   1.379675   18.01129   21.35352   23.28908   24.751311
  46   1.338259   19.60333   22.29651   23.76055   24.904724
  47   1.328765   20.9489   23.15507   24.10402   25.016177
  48   1.406084   21.91518   23.77248   24.22374   25.20868
  49   1.36055   22.65522   24.1517   24.46912   25.324137
  50   1.498334   23.25163   24.41868   24.64672   25j57267
在图5中示出的结果显示出，该化验能够检测1cfu或者一个基因拷贝的L.monocytogenes。
因此，通过引用将在说明书中指出的任何专利、专利申请、公布或其它公开材料全部并入本文。被称作通过引用并入本文但与现有的定义、表述或这里阐述的其它公开材料冲突的任何材料或其一部分仅在并入的材料和本公开材料之间不产生冲突的程度上被并入。

Claims (41)

1.一种制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，所述方法包括以下步骤：
在裂解试剂中裂解细胞，所述裂解试剂包括pH为大约6至大约9的缓冲液、浓度为大约0.125％至大约2％的两性离子洗涤剂、浓度为大约0.3mg/ml至大约2.5mg/ml的叠氮化物以及蛋白酶，
使所产生的细胞裂解物在大约55℃孵育大约15分钟，以产生基本上无蛋白质的细胞裂解物，
使所述蛋白酶在大约95℃失活大约10分钟，
将所述无蛋白质的细胞裂解物直接加入到实时PCR扩增反应混合物中，所述实时PCR扩增反应混合物包括：一对扩增引物，能够退火以在所述细胞裂解物中获得目标DNA；包括能够检测的标记的探针以及与所述目标DNA的区域基本上互补的DNA和RNA核酸序列；扩增聚合酶活性；扩增缓冲液；RNase H活性，
其中，在所述目标DNA在第一扩增引物和第二扩增引物之间扩增之后，所述探针内的RNA序列能够与所述目标DNA中的互补的DNA序列形成RNA:DNA异源双链体。
2.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述细胞裂解物的加入允许对所述细胞裂解物中的单个目标DNA分子进行实时PCR检测。
3.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，单个目标DNA分子的实时PCR检测需要少于大约50个的PCR扩增循环。
4.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述扩增反应混合物还包括逆转录活性。
5.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述探针用荧光共振能量转移对来标记。
6.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述无蛋白质的细胞裂解物由所述扩增反应混合物稀释5-15倍。
7.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述细胞是革兰氏阳性细菌细胞和革兰氏阴性细菌细胞。
8.根据权利要求7所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述革兰氏阳性细菌细胞是Listeria。
9.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述缓冲液包括醋酸盐或磷酸盐缓冲液、Tris、3-(N-吗啉代)丙烷磺酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙烷磺酸)或者2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇缓冲液。
10.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述两性离子洗涤剂是3-[(3-胆汁氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐。
11.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述蛋白酶是蛋白酶K。
12.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，扩增活性包括热稳定的扩增活性。
13.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述RNase H活性包括热稳定的RNase H活性。
14.根据权利要求1所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述RNase H活性是热启动RNase H活性。
15.一种制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，所述方法包括以下步骤：
在裂解试剂中裂解细胞，所述裂解试剂包括pH为大约6至大约9的缓冲液、浓度为大约0.125％至大约2％的两性离子洗涤剂和浓度为大约0.3mg/ml至大约2.5mg/ml的叠氮化物，
使细胞裂解物在大约55℃孵育大约15分钟，
将所述细胞裂解物直接加入到扩增反应混合物中，所述扩增反应混合物包括：一对扩增引物，能够退火以在所述细胞裂解物中获得目标DNA；包括能够检测的标记的探针以及与所述目标DNA的区域基本上互补的DNA和RNA核酸序列；扩增聚合酶活性；扩增缓冲液；RNase H活性，
其中，在所述目标DNA在第一扩增引物和第二扩增引物之间扩增之后，所述探针内的RNA序列能够与所述目标DNA中的互补的DNA序列形成RNA:DNA异源双链体。
16.根据权利要求15所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述扩增反应混合物还包括逆转录活性。
17.根据权利要求15所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述探针用荧光共振能量转移对来标记。
18.根据权利要求15所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述细胞裂解物由所述扩增反应混合物稀释小于5-15倍。
19.根据权利要求15所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述细胞裂解物的加入允许对所述细胞裂解物中的单个目标DNA分子进行实时PCR检测。
20.根据权利要求15所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，在少于大约50个的PCR扩增循环中对所述细胞裂解物中的单个目标DNA分子进行实时PCR检测。
21.根据权利要求15所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述细胞是革兰氏阴性细菌细胞。
22.根据权利要求21所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述革兰氏阴性细菌细胞是沙门氏菌细胞或大肠杆菌细胞。
23.根据权利要求15所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述缓冲液包括醋酸盐或磷酸盐缓冲液、Tris、3-(N-吗啉代)丙烷磺酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙烷磺酸)或者2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇缓冲液。
24.根据权利要求15所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述两性离子洗涤剂是3-[(3-胆汁氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐。
25.根据权利要求15所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，扩增活性包括热稳定的扩增活性。
26.根据权利要求15所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述RNase H活性包括热稳定的RNase H活性。
27.根据权利要求15所述的制备用于实时PCR扩增的核酸模板的方法，其中，所述RNase H活性是主热启动RNase H活性。
28.一种裂解试剂，所述裂解试剂具有：
缓冲液，所述缓冲液的pH为大约6至大约9；
两性离子洗涤剂，所述两性离子洗涤剂的浓度为大约0.125％至大约2％，
叠氮化物，所述叠氮化物的浓度为大约0.3mg/ml至大约2.5mg/ml，
其中，向扩增反应混合物直接加入大约两倍稀释的所述试剂不抑制扩增聚合酶活性和RNase H酶活性，所述扩增反应混合物包括：一对扩增引物，能够退火以在所述细胞裂解物中获得目标DNA；包括能够检测的标记的探针以及与所述目标DNA的区域基本上互补的DNA和RNA核酸序列；所述扩增聚合酶活性；扩增缓冲液；RNase H活性。
29.根据权利要求28所述的裂解试剂，其中，所述缓冲液包括醋酸盐或磷酸盐缓冲液、Tris、3-(N-吗啉代)丙烷磺酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙烷磺酸)或者2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇缓冲液。
30.根据权利要求28所述的裂解试剂，其中，所述两性离子洗涤剂是3-[(3-胆汁氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐。
31.根据权利要求28所述的裂解试剂，其中，所述扩增缓冲液还包括逆转录活性。
32.根据权利要求28所述的裂解试剂，其中，扩增活性包括热稳定的扩增活性。
33.根据权利要求28所述的裂解试剂，其中，所述RNase H活性包括热稳定的RNase H活性。
34.根据权利要求28所述的裂解试剂，其中，所述RNase H活性是热启动RNase H活性。
35.一种裂解试剂，所述裂解试剂具有：
缓冲液，所述缓冲液的pH为大约6至大约9；
两性离子洗涤剂，所述两性离子洗涤剂的浓度为大约0.125％至大约2％，
叠氮化物，所述叠氮化物的浓度为大约0.3mg/ml至大约2.5mg/ml，
蛋白酶，
其中，在使所述蛋白酶失活之后，向扩增反应混合物直接加入大约两倍稀释的所述试剂不抑制扩增聚合酶活性和RNase H酶活性，所述扩增反应混合物包括：一对扩增引物，能够退火以在所述细胞裂解物中获得目标DNA；包括能够检测的标记的探针以及与所述目标DNA的区域基本上互补的DNA和RNA核酸序列；所述扩增聚合酶活性；扩增缓冲液；RNase H活性。
36.根据权利要求35所述的裂解试剂，其中，所述缓冲液包括醋酸盐或磷酸盐缓冲液、Tris、3-(N-吗啉代)丙烷磺酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙烷磺酸)或者2-氨基-2-羟甲基-1，3-丙二醇缓冲液。
37.根据权利要求35所述的裂解试剂，其中，所述两性离子洗涤剂是3-[(3-胆汁氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸盐。
38.根据权利要求35所述的裂解试剂，其中，所述扩增缓冲液还包括逆转录活性。
39.根据权利要求35所述的裂解试剂，其中，扩增活性包括热稳定的扩增活性。
40.根据权利要求35所述的裂解试剂，其中，所述RNase H活性包括热稳定的RNase H活性。
41.根据权利要求35所述的裂解试剂，其中，所述RNase H活性是热启动RNase H活性。
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