KR20120021265A

KR20120021265A - Ｅ. ｃｏｌｉＯ157:Ｈ7 종 검출용 올리고뉴클레오티드 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20120021265A
Application number: KR1020110087188A
Authority: KR
Inventors: 리준; 윈덴 쳉; 제이슨 옵다이크
Original assignee: 삼성테크윈 주식회사
Priority date: 2010-08-30
Filing date: 2011-08-30
Publication date: 2012-03-08
Also published as: US20120052494A1

Abstract

E. coli O157:H7 종을 검출할 수 있는 올리고뉴클레오티드, 키트, 및 방법을 제공한다. 또한, 상기 키트를 사용하여 테스트 시료에서 E. coli O157:H7를 실시간으로 검출하는 방법을 개시한다. 상기 검출 방법에 의하면, 적은 카피 수의 대상 시료만으로도 검출 결과를 실시간으로 신속하게 확인할 수 있다.

Description

Ｅ. ｃｏｌｉＯ157:Ｈ7 종 검출용 올리고뉴클레오티드 및 그의 용도{Oligonucleotides for detecting E. coli O157:H7 strains and use thereof}

본 출원은 2010년 8월 30일에 출원된 미국 가출원 제61/378,071호로부터 주장되는 우선권의 이익을 향유하며, 상기 가출원의 내용은 그 전체로 참조로서 본 명세서에 삽입된다.

E. coli O157:H7 검출에 적합한 올리고뉴클레오티드 및 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 E. coli O157:H7 종을 검출하는 키트 및 방법을 개시한다.

E. coli O157:H7은 1982년 출혈성 대장염의 집단발병의 원인으로 처음으로 알려진 이래 일본에서 수천 명의 감염자를 내고 미국에서 매년 2만명 이상의 감염자와 250명 이상의 사망자를 내는 것으로 추정되는 등 세계적으로 널리 퍼져있는 식중독 균 중 하나이다. 또한, E. coli O157:H7은 Campylobacter 속, Salmonella 속, Shigella 속의 세균 등과 함께 출혈성 대장염의 주요 원인이 되는 균으로 알려져 있다. E. coli O157:H7은 주로 육류, 낙농제품, 식수 등 음식을 통하여 전파되므로, 음식과 같은 시료에서 E. coli O157:H7의 존재 여부를 신속하고 경제적으로 확인할 수 있는 방법이 요구된다. E. coli O157:H7을 검출하기 위한 통상적 방법은 선택적 배지에서 시료를 배양하여, E. coli O157:H7로 추측되는 균을 분리한 후, 이를 생화학적 또는 면역학적 방법으로 확인하는 것이다. 항체를 이용한 면역학적인 방법은 높은 정확도로 세균의 검출이 가능하다. 그러나, 많은 양의 시료가 필요하고, 각 진단에 항체를 요구된다.

일 구체예에서, E. coli O157:H7 종을 정확하고, 민감하고, 신속하게 검출하는데 적합하게 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 제공한다. 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 16, 3, 4, 또는 6의 서열을 포함하는 제1 프라이머일 수 있고; 서열번호 7, 8, 9, 10, 또는 11의 서열을 포함하는 제2 프라이머일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 17 또는 18의 서열을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 제1 프라이머는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 서열을 가질 수 있다. 일 구체예에서, 상기 프로브는 서열번호 12, 13, 또는 14의 서열을 가질 수 있다.

또한, 일 구체예에서, E. coli O157:H7 종을 정확하고, 민감하고, 신속하게 검출하는데 적합하게 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 서열번호 16, 3, 4, 또는 6의 서열을 포함하는 제1 프라이머를 포함할 수 있고; 서열번호 7, 8, 9, 10, 또는 11의 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 조성물은 서열번호 17 또는 18의 서열을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 제1 프라이머는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 서열을 가질 수 있다. 일 구체예에서, 상기 프로브는 서열번호 12, 13, 또는 14의 서열을 가질 수 있다.

일 구체예에서, E. coli O157:H7 종 검출용 키트를 제공한다.

상기 E. coli O157:H7 종 검출용 키트는 서열번호 16, 3, 4, 또는 6의 서열을 포함하는 제1 프라이머를 포함할 수 있고; 서열번호 7, 8, 9, 10, 또는 11의 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함할 수 있다. 상기 키트는 DNA 서열 및 RNA 서열로 구성되는 프로브를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 서열번호 17 또는 18의 서열을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 제1 프라이머는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 서열 중 하나일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 프로브는 서열번호 12, 13, 또는 14의 서열 중 하나일 수 있다.

다양한 조합의 제1 프라이머, 제2 프라이머, 및 프로브가 E. coli O157:H7의 표적 핵산 또는 그의 단편을 검풀하는데 사용될 수 있다. 상기 조합은 하기 예에 따를 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.

서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머 및 서열번호 12 내지 14의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 갖는 프로브;

서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머 및 서열번호 12 내지 14의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 갖는 프로브;

서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머 및 서열번호 12 내지 14의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 갖는 프로브;

서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머 및 서열번호 12 내지 14의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 갖는 프로브;

서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머 및 서열번호 12 내지 14의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 갖는 프로브;

서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머 및 서열번호 12 내지 14의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 갖는 프로브;

서열번호 3의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머 및 서열번호 12 내지 14의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 갖는 프로브;

서열번호 4의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머 및 서열번호 12 내지 14의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 갖는 프로브;

서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머 및 서열번호 12 내지 14의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 갖는 프로브;

서열번호 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머 및 서열번호 12 내지 14의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 갖는 프로브; 또는

서열번호 6의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 프라이머, 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머 및 서열번호 12 내지 14의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 갖는 프로브.

일 구체예에서, E. coli O157:H7 종의 검출용 키트는 하기 올리고뉴클레오티드 중 하나를 포함할 수 있다:

서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 및 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 12 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;

서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 12 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;

서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 12 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;

서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 및 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 12 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;

서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 12 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;

서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 및 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 12 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;

서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 12 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;

서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 및 서열번호 11의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 12 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;

서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 및 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 12 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브;

서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 및 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 12 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브; 또는

서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 및 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로부터 선택되는 10 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 세트 및 서열번호 12 내지 서열번호 14 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 갖는 프로브.

다른 구체예에서, 시료로부터 E. coli O157:H7 종을 검출하는 방법을 제공한다.

상기 방법은 (a) 시료 중 E. coli O157:H7의 표적 핵산을 증폭하여 상기 표적 핵산의 카피수를 증가시키는 단계로서, 상기 증폭은 서열번호 16, 3, 4, 또는 6의 염기 서열을 포함하는 제1 프라이머 및 서열번호 7, 8, 9, 10 또는 11의 염기 서열을 포함하는 제2 프라이머를 상기 시료 중에서 표적 핵산과 혼성화시켜 상기 표적 핵산 및 상기 프라이머의 혼성화된 산물을 얻고, 주형-의존성 핵산 폴리머라제를 사용하여 상기 혼성화된 산물의 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 확장하여 확장된 프라이머 산물을 생성하는 것을 포함하는 단계; (b) 상기 표적 핵산과 혼성화될 수 있는 하나 이상의 프로브 올리고뉴클레오티드와 상기 표적 핵산을 혼성화하여 표적 핵산:프로브 올리고뉴클레오티드의 혼성화 산물을 얻는 단계로서, 상기 프로브는 DNA 서열 및 RNA 서열을 포함하며, 검출가능한 표지가 연결된 것인 단계; (c) 상기 표적 핵산:프로브의 혼성화된 산물과 RNase H를 접촉시켜 상기 프로브를 절단시켜, 상기 표적 핵산으로부터 프로브 절편 분리를 야기하는 단계; 및 (d) 검출가능한 표지를 검출하는 단계를 포함한다. 상기 제1 프라이머는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 서열을 가질 수 있다. 상기 프로브 올리고뉴클레오티드는 서열번호 17 또는 18의 올리고뉴클레오티드를 가질 수 있다. 상기 프로브 올리고뉴클레오티드는 서열번호 12, 13, 14의 올리고뉴클레오티드 중 하나일 수 있다. 상기 프로브 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 쌍과 같은, 검출가능한 표지로 표지될 수 있다.

다른 구체예에서, 시료로부터 E. coli O157:H7 종의 표적 RNA 서열을 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 역전사 효소 활성 및 역방향 증폭 프라이머의 존재 하에 E. coli O157:H7 표적 RNA를 역전사하여 표적 RNA의 표적 cDNA를 생성하는 단계; (b) 시료 중 E. coli O157:H7의 표적 cDNA를 증폭하여 상기 표적 핵산의 카피수를 증가시키는 단계로서, 상기 증폭은 서열번호 16, 3, 4, 또는 6의 염기 서열을 포함하는 제1 프라이머 및 서열번호 7, 8, 9, 10 또는 11의 염기 서열을 포함하는 제2 프라이머를 상기 시료 중에서 표적 핵산과 혼성화시켜 상기 표적 핵산 및 상기 프라이머의 혼성화된 산물을 얻고, 주형-의존성 핵산 폴리머라제를 사용하여 상기 혼성화된 산물의 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 확장하여 확장된 프라이머 산물을 생성하는 것을 포함하는 단계; (c) 상기 표적 cDNA와 실질적으로 상보적인 하나 이상의 프로브 올리고뉴클레오티드와 상기 표적 핵산을 혼성화하여 표적 핵산:프로브 올리고뉴클레오티드의 혼성화 산물을 얻는 단계로서, 상기 프로브는 DNA 서열 및 RNA 서열을 포함하며, 검출가능한 표지가 연결된 것인 단계; (d) 상기 표적 핵산:프로브 올리고뉴클레오티드의 혼성화된 산물과 RNase H를 접촉시켜 상기 프로브를 절단시키는 단계; 및 (e) 상기 프로브 상의 표지로부터 신호 방출의 증가를 검출하는 단계로서, 상기 신호의 증가는 시료 중 E. coli O157:H7 RNA가 존재함을 나타내는 것인 단계를 포함한다. 상기 제1 프라이머는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 서열을 가질 수 있다. 상기 프로브 올리고뉴클레오티드는 서열번호 17 또는 18의 올리고뉴클레오티드를 가질 수 있다. 상기 프로브 올리고뉴클레오티드는 서열번호 12, 13, 14의 올리고뉴클레오티드 중 하나일 수 있다. 상기 프로브 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, FRET 쌍과 같은, 검출가능한 표지로 표지될 수 있다.

본 명세서에 개시된 구체예의 실험은, 달리 표시되어 있지 않으면, 당업계에서 알려진 통상적인 분자 생물학적 기법을 사용하였다. 이러한 기법들은 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2008) 및 Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)를 참조하였다.

본 명세서에서 달리 정의되어 있지 않다면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적, 과학적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 또한 본 명세서는 상세한 설명 및 청구항의 해석을 돕기 위해 용어의 정의를 제공한다. 결과적으로, 정의가 다른 정의와 일치하지 않으면, 상기 정의는 본 명세서에 설명되어 있는 것으로 규정될 것이다.

본 명세서에서 사용된 용어 "증폭(amplification)"은 뉴클레오티드 서열의 카피수를 증가시키기 위한 어떠한 과정을 의미한다. 핵산의 증폭은 뉴클레오티드(예를 들어, DNA 또는 RNA)가 핵산으로 통합(incorporate)되는 과정을 나타낸다.

용어 "뉴클레오티드(뉴클레오티드)"는 염기-당-인산의 조합을 의미한다. 뉴클레오티드는 예를 들어, DNA 또는 RNA와 같은 핵산의 단일체이다. 용어 "뉴클레오티드"는 rATP, rCTP, rGTP, 또는 rUTP와 같은 리보뉴클레오시드 트리포스페이트, 및 dATP, dCTP, dGTP, 또는 dTTP와 같은 디옥시-리보뉴클레오시드 트리포스페이트를 포함한다.

용어 "뉴클레오시드(nucleoside)"는 염기-당의 조합, 즉 뉴클레오티드에서 포스페이트가 결여된 조합을 의미한다. 용어 "뉴클레오시드" 및 "뉴클레오티드"는 본 기술 분야에서 혼용될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 디옥시우리딘, dUTP은 디옥시뉴클레오시드 트리포스페이트이다. 예를 들어, dUMP 또는 디옥시우리딘 모노포스페이트와 같이 DNA 모노머로 작용하여, DNA로 삽입된다. 이러한 측면에서, dUTP 모이어티가 DNA 결과물에 존재하지 않더라도, dUTP는 삽입된 것으로 고려될 수 있다.

용어 "중합효소 연쇄반응(폴리머라제 chain reaction, PCR)"은 일반적으로 시료 중에서 표적이되는 핵산(들)의 카피수를 증가시키는 증폭 방법을 의미한다. 상기 과정은 미국특허 제4,683,202호, 제4,683,195호, 제4,800,159호, 및 제4,965,188호에 상세히 기재되어 있으며, 상기 문헌의 내용은 본 명세서에 참조로써 삽입된다. 상기 시료는 단일 핵산 또는 다중 핵산을 포함할 수 있다. 일반적으로, PCR은 표적 핵산(들)을 포함하는 반응 혼합물 내에 2 이상의 확장가능한 프라이머 핵산을 포함한다. 상기 프라이머는 이중-가닥 표적 서열의 반대편 가닥과 상보적이다. 상기 반응 혼합물은 핵산 폴리머라제 및 핵산 모노머, 예를 들어, dNTP 및/또는 rNTP의 존재 하에 온도 변화 사이클링(thermal cycling)에 적용하여, 상기 프라이머의 확장에 의해 표적 핵산을 증폭한다. 일반적으로, 상기 온도 변화 사이클링은 하기 과정을 포함한다; 상기 프라이머 및 표적 핵산을 어닐링하여 혼성화시키는 단계; 핵산 폴리머라제를 사용하여 상기 프라이머를 확장시키는 단계; 및 상기 혼성화된 프라이머 확장 산물 및 표적 핵산을 변성시키는 단계. 용어 "역전사 효소-PCR(reverse transcriptase-PCR, RT-PCR)"은 RNA 주형 및 역전사 효소, 또는 역전사 효소 활성을 갖는 효소를 사용하여 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 프라이머 확장의 다중 사이클 이전에 단일 가닥의 cDNA 분자를 생성하는 PCR을 의미한다. 용어 "다중 PCR(multiplex PCR)"은 일반적으로, 2종류 이상의 프라이머 세트에 의해, 단일 반응에서 2 이상의 증폭된 표적 산물을 생산하는 PCR을 의미한다.

용어 "핵산(nucleic acid)"은 2 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 중합체를 의미한다. 용어 "핵산"은 본 명세서에서 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "올리고뉴클레오티드"와 혼용된다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함한다. 핵산의 구조는 이중-가닥 및/또는 단일-가닥일 수 있다.

용어 "핵산 유사체(nucleic acid analog)"는 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 및/또는 하나 이상의 포스페이트 에스테르 유사체 및/또는 하나 이상의 펜토스 당 유사체를 포함하는 핵산을 의미한다. 핵산 유사체의 예는 포스페이트 에스테르 및/또는 당 포스페이트 에스테르 결합이 N-(2-아미노에틸)-글리신 아미드 및 기타 아미드와 같은 종류의 결합으로 대체된 핵산을 포함한다. 핵산 유사체는 하나 이상의 뉴클레오티드 유사체 및/또는 하나 이상의 포스페이트 에스테르 유사체 및/또는 하나 이상의 펜토스 당 유사체를 포함하는 핵산일 수 있으며, 혼성화에 의해 이중 나선을 형성할 수 있다.

용어 "어닐링(annealing)" 및 "혼성화(hybridization)"는 혼용될 수 있으며, 하나의 핵산과 다른 핵산이 염기-쌍 상호작용을 하여 이중, 삼중 또는 그 이상 차수의 구조를 형성하는 것을 의미한다. 일 구체예에서, 일차 상호작용은 염기 특이적인, 예를 들어, 왓슨/클릭 및 후그스틴-타입(Hoogsteen-type)의 수소 결합에 의한 A/T 및 G/C의 반응이다. 일 구체예에서, 염기-스태킹(base-stacking) 및 소수성 상호작용이 또한 이중 나선의 안정성에 기여할 수 있다.

용어 “뉴클레오티드(nucleotide)”는 단일 가닥 또는 이중 가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드로, 특별하게 언급되어 있지 않은 한 뉴클레오티드의 유사체를 포함하는 의미로 해석된다.

용어 “프라이머(primer)”는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합 반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들어, 온도와 프라이머의 용도에 따라 차이가 있지만 전형적으로 15-30개의 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구할 수 있다. 용어 "전방향 프라이머(forward primer)" 및 "역방향 프라이머(reverse primer)"는 중합 효소 연쇄 반응에 의해 증폭되는 주형의 일정한 부위의 3'말단 및 5'말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다. 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서, 일 구체예에 따른 프라이머 세트는 주형인 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분한 것으로 해석된다. 이러한 프라이머의 디자인은 주형이 되는 폴리뉴클레오티드의 염기 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예를 들어, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다. 한편, 일 구체예에 따른 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성한다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., 등, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C.(1985)에 개시되어 있다. 예를 들면, 상기 프라이머는 상기 서열번호 1 내지 12 중 어느 하나의 염기 서열 내의 10개 이상 또는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함할 수 있으며, 상기 프라이머는 상기 서열번호 1 내지 12 중 어느 하나의 염기 서열을 갖는 뉴클레오티드일 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 3, 6-12 또는 16의 뉴클레오티드 서열 중 어느 하나를 갖는 뉴클레오티드일 수 있다. 일 구체예에서 상기 프라이머는 서열번호 1-12 중 어느 하나일 수 있다.

용어 "프로브(probe)"는 표적 핵산 서열과 상보적인 서열을 갖는 것으로, 상기 표적 핵산과 혼성화할 수 있어, 이중나선을 형성하는 핵산을 의미한다. 상기 프로브 서열은 상기 표적 핵산 서열과 완전하게 상보적일 수 있다. 상기 프로브는 상기 표적 핵산이 PCR과 동시에 검출될 수 있도록 표지될 수 있다.

용어 "표적 핵산(target nucleic acid)" 또는 "표적 서열(target sequence)"은 증폭되거나 및/또는 검출될 수 있는 표적 핵산의 전장(full length) 또는 그의 단편을 포함한다. 표적 핵산은 증폭에 사용되는 2개의 프라이머 사이에 존재할 수 있다.

용어 " 혼성 올리고뉴클레오티드(hybrid oligonucleotide)"는 단일 분자 내에 DNA 및 RNA 부분을 포함하는 올리고뉴클레오티드 분자를 의미한다. 상기 혼성 올리고뉴클레오티드는 예를 들어, DNA-RNA, RNA-DNA, 또는 DNA-RNA-DNA 올리고뉴클레오티드와 같이, 하나 이상의 DNA 부분과 하나 이상의 RNA 부분을 포함한다.

일 구체예에서, E. coli O157:H7을 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드 세트는 (i) 서열번호 16, 3, 4, 또는 6의 올리고뉴클레오티드를 갖는 제1 프라이머 (ii) 서열번호 7, 8, 9, 10, 또는 11의 올리고뉴클레오티드를 갖는 제2 프라이머를 포함한다. 상기 올리고뉴클레오티드 세트는 서열번호 17 또는 18로부터 선택되는 프로브를 더 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 제1 프라이머는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 중 어느 하나일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 프로브는 서열번호 12, 13, 또는 14 중 어느 하나일 수 있다. 일 구체예에서, 이들 올리고뉴클레오티드는 10 이상, 또는 15 이상의 연속적인 서열번호 1-12의 서열을 가질 수 있다.

일 구체예에 따른 제1 프라이머 및 제2 프라이머의 프라이머 쌍은 E. coli O157:H7의 I 절편의 일부분에 특이적이다. 상기 I 절편은 E. coli O157:H7 게놈(GenBank: AE005174.2.)의 312001-315400 위치에 존재한다. 상기 I 절편의 서열은 서열번호 15에 기재되어 있다.

일 구체예에서, 상기 프로브는 DNA-RNA-DNA 혼성체 구조를 가질 수 있다. 상기 프로브는 핵산 또는 핵산 유사체일 수 있다. 또한, 상기 프로브는 보호된 핵산일 수 있다. 예를 들어, 상기 프로브의 DNA 또는 RNA 부분은 예를 들어, RNase H와 같은 RNA-특이적 효소에 의해 분해되는 것을 방지하기 위해 부분적으로 메틸화가 되어 있을 수 있다.

상기 프로브는 변형될 수 있다. 예를 들어, 상기 프로브의 염기 부분은 일부 또는 전부 메틸화될 수 있다. 이러한 변형은 효소 또는 화학적 분해를 저해할 수 있다. 상기 핵산 프로브의 5'말단 또는 3'말단의 -OH기는 블록(block)될 수 있다. 상기 핵산 프로브의 3'말단 OH기는 블록되어, 주형-의존성 핵산 폴리머라제에 의해 확장을 불가능하도록 할 수 있다.

상기 프로브는 검출가능한 표지를 가질 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 본 기술 분야에서 알려진 어떠한 방법에 의해 검출될 수 있는 어떠한 화학적 모이어티라도 될 수 있다. 검출가능한 표지의 예는 분광(spectroscopy), 광화학(photochemistry)에 의해 또는 생화학적(biochemical), 면역학적(immunochemical) 또는 화학적 수단에 의해 검출될 수 있는 어떠한 모이어티라도 포함될 수 있다. 핵산 프로브에 표지하는 적절한 방법은 상기 표지의 종류 및 상기 표지의 위치 및 프로브에 따라 선택될 수 있다. 표지의 예는 효소, 효소 기질, 동위원소물질, 형광 다이, 발색단(chromophores), 화학발광 표지(chemiluminescent label), 전기화학적 발광 표지(electrochemical luminescent label), 특이적인 결합 파트너를 갖는 리간드, 및 서로 반응하여 검출 신호의 강도를 증가, 변형 또는 감소시킬 수 있는 기타 표지를 포함한다. 이들 표지는 PCR의 온도 변화 사이클링 동안 온도 변화를 견딜 수 있다.

상기 검출가능한 표지는 형광 공명 에너지 이동(fluorescence resonance energy transfer, FRET) 쌍일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 적절한 거리에 의해 분리되는 형광 도너(donor) 및 형광 억셉터(acceptor)를 포함하는 FRET 쌍이며, 상기 도너의 형광 방출이 상기 억셉터에 의해 퀀치(quench)된다. 그러나, 상기 도너-억셉터 쌍이 절단에 의해 분리되면, 도너의 형광 방출은 증가된다. 상기 쌍이 서로 가까운 위치에 있을 때, 도너 발색단은, 여기 상태(excited state)에서, 억셉터 발색단에 에너지를 이동시킬 수 있다. 이러한 이동은 항상 비-방사성(non-radiative)이며, 쌍극자-쌍극자 결합(dipole-dipole coupling)을 통해 발생한다. 상기 발색단 사이의 거리를 충분히 증가시키는 어떠한 과정은 도너 발색단의 방출이 방사성으로 검출될 수 있도록 FRET 효율성을 감소시킬 것이다. 도너 발색단의 예를 FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5, 및 Texas Red를 포함한다. 억셉터 발색단은 그들의 여기 스펙트럼이 상기 도너의 방출 스펙트럼과 겹치도록 선택된다. 이러한 쌍의 예는 FAM-TAMRA이다. 또한, 상기 검출가능한 표지의 예는 광범위한 도너를 퀀치할 수 있는 비-형광 억셉터이다. 적절한 도너-억셉터 FRET 쌍의 다른 예는 당업계에 잘 알려져 있다.

일 구체예에서, 상기 프로브는 용액 내에 용해된 형태 또는 부유(free) 형태로 존재할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 프로브는 고체 지지체에 고정화될 수 있다. 서로 다른 프로브가 상기 고체 지지체에 부착되어 시료 중 서로 다른 표적 서열을 동시에 검출하는데 사용될 수 있다. 서로 다른 형광 파장을 갖는 리포터 분자가 서로 다른 프로브에 사용될 수 있으며, 따라서 서로 다른 프로브가 혼성화되도록 하여 분리되어 검출될 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 고정화를 위한 고체 지지체의 바람직한 종류의 예는 폴리스티렌, 아비딘이 코팅된 폴리스티렌 비드 셀룰로즈, 나일론, 아크릴아미드 겔 및 활성화된 덱스트란, 컨트롤된 포어 글라스(controlled pore glass, CPG), 유리 플레이트 및 고 교차-결합된(cross-linked) 폴리스티렌이다. 이들 고체 지지체는 화학적 안정성, 기능화의 용이 및 정의된 표면 면적 때문에 혼성화 및 진단 연구에 많이 사용된다. 컨트롤된 포어 글라스(500 A, 1000 A) 및 비-부풀림(non-swelling) 고 교차-결합 폴리스티렌(1000 A)과 같은 고체 지지체가 올리고뉴클레오티드 합성과 호환가능하다는 측면에서 특히 바람직하다.

상기 프로브는 다양한 방법으로 상기 고체 지지체에 부착될 수 있다. 예를 들어, 상기 프로브는 상기 프로브의 3' 또는 5' 말단 뉴클레오티드이 상기 고체 지지체에 부착되도록 함으로써 상기 고체 지지체에 부착될 수 있다. 그러나, 상기 프로브는 상기 고체 지지체로부터 상기 프로브가 분리되도록 제공하는 링커에 의해 상기 고체 지지체에 부착될 수도 있다. 상기 링커는 가장 바람직하게는 30 atom 이상의 길이일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 50 atom 이상의 길이일 수 있다.

고체 지지체에 고정화된 프로브의 혼성화는 일반적으로 30 atom 이상, 더욱 바람직하게는 50 atom 이상 상기 고체 지지체로부터 분리될 것이 요구된다. 이러한 분리를 달성하기 위해, 상기 링커는 일반적으로 상기 링커 및 상기 3' 뉴클레오시드 사이에 위치하는 스페이서를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 합성을 위해, 상기 링커 암(linker arm)은 일반적으로 3' 뉴클레오시드의 3'-OH에, 염기성 시약으로 절단되어 상기 고체 지지체로부터 올리고뉴클레오티드가 유리될 수 있는 에스테르 결합에 의해 부착된다.

상기 프로브를 고체 지지체에 부착시키는데 사용될 수 있는 다양한 종류의 링커가 당업계에 알려져 있다. 상기 링커는 표적 서열과 상기 고체 지지체에 부탁된 프로브의 혼성화를 심각하게 방해하지 않는 어떠한 화합물의 형태일 수 있다. 상기 링커는 자동 합성(automated synthesis)에 의해 상기 링커가 용이하게 첨가될 수 있도록 단일 중합성(homopolymeric) 올리고뉴클레오티드의 형태일 수 있다. 대안으로, 기능화된(functionalized) 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체가 링커로 사용될 수 있다. 이러한 중합체는 상기 고체 지지체에 부탁된 프로브의 혼성화를 심각하게 방해하지 않기 때문에 단일 중합성 올리고뉴클레오티드에 비해 바람직하다. 특히, 폴리에틸렌 글리콜은 상업적으로 구입가능하며, 유기 매질 및 수용성 매질에 용해되며, 용이하게 기능화될 수 있고, 올리고뉴클레오티드 합성 및 후-합성 조건(post-synthesis condition) 하에서도 완전하게 안정하기 때문에 더욱 바람직하다.

상기 고체 지지체, 상기 링커 및 프로브 사이의 결합은 바람직하게는 높은 온도의 염기 조건 하에서 염기 보호기의 제거 동안 절단되지 않아야 한다. 바람직한 결합의 예는 카바메이트 및 아미드 결합을 포함한다. 프로브의 고정화는 당업계에 잘 알려져 있으며, 당업자자면 상기 고정화 조건을 용이하게 결정할 수 있을 것이다.

상기 방법의 일 구체예에 따르면, 상기 혼성화 프로브는 고체 지지체에 결합될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 혼성화에 적합한 조건 하에 핵산 시료와 접촉된다. 혼성화되지 않은 상태에서, 상기 형광 표지는 억셉터에 의해 퀀치되어 있다. 표적에 혼성화되면, 상기 형광 표지는 퀀쳐(quencher)로부터 분리되며, 형광 방출이 증가된다.

또한, 상기 혼성화된 프로브의 상기 고체 지지체에 대한 고정화는 상기 프로브가 혼성화된 상기 표적 서열이 용이하게 시료로부터 분리될 수 있도록 한다. 이후 단계에서, 상기 분리된 표적 서열은 상기 고체 지지체로부터 분리될 수 있으며, 연구자의 필요에 따라 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 실험에 사용될 수 있다(예를 들어, 정제, 증폭 등).

일 구체예에 따른 상기 올리고뉴클레오티드는 증폭 및 표적 핵산의 검출에 사용될 수 있다. 상기 증폭은 주형-의존성 폴리머라제를 사용하여 상기 프라이머의 확장하고, 그 결과 PCR 절편 또는 앰플리콘(amplicon)을 형성하는 과정을 포함할 수 있다. 상기 증폭은 Polymerase Chain Reaction 또는 Ligase Chain Reaction, Self-Sustained Sequence Replication, Strand Displacement Amplification, Transcriptional Amplification System, Q-Beta Replicase, Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA), Cleavage Fragment Length Polymorphism, Isothermal and Chimeric Primer-initiated Amplification of Nucleic Acid, Ramification-extension Amplification Method 또는 기타 적절한 핵산의 증폭 방법과 같은 증폭 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 증폭은 표적 핵산의 실시간 검출을 동시에 포함할 수 있다.

용어 "PCR 절편(PCR fragment)" 또는 "앰플리콘(amplicon)"은 특이적인 표적 핵산의 증폭에 따라 생성되는 폴리뉴클레오티드 분자(또는 집합적으로 다수의 분자)를 의미한다. 상기 PCR 절편은 배타적으로는 아니지만, 일반적으로 DNA PCR 절편을 의미한다. PCR 절편은 단일-가작 또는 이중-가닥, 또는 임의 농도 비율의 그의 혼합물일 수 있다. PCR 절편은 100-500 뉴클레오티드 또는 그 이상의 길이일 ㅅ수 있다.

증폭 "완충액(buffer)"은 상기 증폭 반응을 조절함으로써 상기 증폭 반응의 하나 이상의 요소의 안정성 및/또는 활성을 변형시키기 위해 첨가되는 화합물이다. 본 발명의 완충 시약은 PCR 증폭 및 RNase H 절단 활성과 호환 가능하다. 완충액의 예는 HEPES ((4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), MOPS (3-(N-morpholino)-propanesulfonic acid), 및 아세테이트 또는 포스페이트 포함 완충액 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 또한, PCR 완충액은 일반적으로 약 70 mM KCl 및 약 1.5 mM 또는 그 이상의 MgCl₂, 및 약 50-200 mM의 각각의 dATP, dCTP, dGTP and dTTP를 포함할 수 있다. 본 발명의 완충액은 RT-PCR 또는 PCR 반응을 효과적으로 최적화시키기 위한 첨가물을 포함할 수 있다.

첨가물은 상기 조성물의 하나 이상의 요소의 안정성 및/또는 활성을 변형시키기 위해 첨가되는 화합물이다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 증폭 반응 조성물이다. 일 구체예에서, 첨가물은 오염된 효소를 불활성화시키고, 단백질의 접힘을 안정화시키며, 및/또는 단백질의 응집(aggregation)을 감소시킨다. 증폭 반응에 포함될 수 있는 첨가물의 예는, 베타인, 포름아미드, KCl, CaCl₂, MgOAc, MgCl₂, NaCl, NH₄OAc, NaI, Na(CO₃)₂, LiCl, MnOAc, NMP, 트레할로스(trehalose), 디메틸술폭시드("DMSO"), 글리세롤, 에틸렌글리콜, 디티오트레이톨("DTT"), 피로포스파타제(pyrophosphatase) (Thermoplasma acidophilum의 무기 피로포스파타제("TAP")를 포함하나, 이에 한정하지는 않음), 우혈청 알부민("BSA"), 프로필렌글리콜, 글리신아미드, CHES, Percoll, 아우린트리카르복실산(aurintricarboxylic acid), Tween 20, Tween 21, Tween 40, Tween 60, Tween 85, Brij 30, NP-40, Triton X-100, CHAPS, CHAPSO, Mackernium, LDAO (N-dodecyl-N,N-dimethylamine-N-oxide), Zwittergent 3-10, Xwittergent 3-14, Xwittergent SB 3-16, Empigen, NDSB-20, T4G32, E. Coli SSB, RecA, 닉킹 엔도뉴클레아제(nicking endonuclease), 7-deazaG, dUTP, 음이온 계면활성제, 양이온 계면활성제, 비-이온성 계면활성제, zwittergent, 스테롤, 삼투조절물질(osmolyte), 양이온, 및 증폭의 효율을 변화시킬 수 있는 기타 화학물질, 단백질, 또는 보조인자를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 일 구체예에서, 증폭 반응에서 2 이상의 첨가물이 포함될 수 있다. 상기 첨가물이 RNase H의 활성을 방해하지 않는다면, 프라이머 어닐링의 선택성을 증가시키기 위해 선택적으로 첨가될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어, "열안정성(thermostable)"은, 효소에 적용되는 것으로, 증가된 온도(예를 들어, 55℃. 또는 그 이상)에서 생물학적 활성을 유지하거나, 또는 가열 및 냉각의 반복되는 사이클 과정에서 생물학적 활성을 유지할 수 있는 효소를 의미한다. 열안정성 폴리뉴클레오티드 폴리머라제는 증폭 반응에서 특별히 사용되는 것으로 발견된다.

본 명세서에서 사용된 용어 "열안정성 폴리머라제(Thermostable polymerase)"는 열에 상대적으로 안정하며 각각의 PCR 사이클 이전에 효소를 첨가할 필요를 제거해 준 효소이다. 열안정성 폴리머라제의 예는 호열성 박테리아 Thermus aquaticus (Taq 폴리머라제), Thermus thermophilus (Tth 폴리머라제), Thermococcus litoralis (Tli 또는 VENT 폴리머라제), Pyrococcus furiosus (Pfu 또는 DEEPVENT 폴리머라제), Pyrococcus woosii (Pwo 폴리머라제) 및 기타 Pyrococcus 종으로부터 분리된 폴리머라제, Bacillus stearothermophilus (Bst 폴리머라제), Sulfolobus acidocaldarius (Sac 폴리머라제), Thermoplasma acidophilum (Tac 폴리머라제), Thermus rubber (Tru 폴리머라제), Thermus brockianus (DYNAZYME 폴리머라제) Thermotoga neapolitana (Tne 폴리머라제), Thermotoga maritime (Tma) 및 Thermotoga 속의 기타 종 (Tsp 폴리머라제), 및 Methanobacterium thermoautotrophicum (Mth 폴리머라제)로부터 분리된 폴리머라제를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 상기 PCR 반응은 표적 서열의 효율적인 증폭을 유도하는 보완적인 특징을 갖는 하나 이상의 열안정성 폴리머라제 효소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 높은 진행성(processivity) (더욱 큰 뉴클레오티드 세그먼트를 카피할 수 있는 능력)을 갖는 뉴클레오티드 폴리머라제는 교정(proofreading) 능력(표적 핵산 서열을 신장하는 동안 오류를 정정하는 능력)을 갖는 다른 뉴클레오티드 폴리머라제와 보완되어, 높은 정확성(fidelity)을 갖는 긴 표적 서열을 카피할 수 있는 PCR 반응을 생성한다. 상기 열안정성 폴리머라제는 야생형의 형태로 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 폴리머라제는 상기 효소의 절편을 포함하거나 상기 PCR 반응을 증진시키는데 유리한 특징을 제공하는 돌연변이를 포함하도록 변형될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 열안정성 폴리머라제는 Taq 폴리머라제일 수 있다. 증가된 특성을 지닌 Taq 폴리머라제의 많은 변이체가 알려져 있으며, 이는 AmpliTaq, AmpliTaq Stoffel 단편, SuperTaq, SuperTaqplus, LA Taq, LApro Taq, 및 EX Taq을 포함한다.

유전자 발현을 연구하기 위해 가장 광범위하게 사용되는 기법 중 하나가 PCR에 의한 증폭을 위해 mRNA 서열(들)을 주형으로 최초-가닥 cDNA를 활용하는 것이다. 종종 PCR 또는 역전사 효소-PCR로서 해석되는, 상기 방법은 PCR 과정의 높은 민감성 및 특이성을 이용하며, RNA의 검출 및 정량에 광범위하게 사용된다.

종점(end-point) 또는 실시간 어세이로서 수행되는 상기 역전사 효소-PCR 과정은 두 단계의 분리된 분자적 합성을 포함한다: (i) RNA 주형으로부터 cDNA의 합성; 및 (ii) PCR 증폭을 통해 새로 합성된 cDNA의 복제. 역전사 효소-PCR와 종종 연관된 기술적인 문제를 처리하기 위한 시도로, 상기 과정의 3가지 기본적인 단계를 고려하여 다수의 프로코콜이 개발되었다: (a) RNA의 변성(denaturation) 및 역방향 프라이머의 혼성화; (b)cDNA의 합성; 및 (c) PCR 증폭. 소위 "연결되지 않은(uncoupled)" 역전사 효소-PCR 과정(예를 들어, 투 스텝(two step) 역전사 효소-PCR)에서 역전사는 역전사 효소 활성을 위한 최적의 완충액 조건을 사용하여 독립적인 단계로서 수행된다. cDNA 합성에 이어, 상기 반응은 Taq DNA 폴리머라제 활성에 최적인 조건으로 MgCl₂및 디옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP) 농도가 감소하도록 희석한 다음, PCR을 표준 조건(미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호를 참조한다.)에 따라 수행한다. 이에 반해, "연결된(coupled)" 역전사 효소 PCR 방법은 역전사 효소 및 Taq DNA 폴리머라제 활성을 위하여 공통의 완충액을 사용한다. 제1 버전에서, 역방향 프라이머의 어닐링은 효소의 첨가 이전 분리된 단계이며, 이후 단일 반응 용기에 첨가한다. 다른 버전에서, 역전사 효소 활성은 열안정성 Tth DNA 폴리머라제의 구성 요소이다. 어닐링 및 cDNA 합성은 Mn²⁺의 존재 하에서 수행되며, 이후 PCR은 킬레이트 시약에 의해 Mn²⁺가 제거된 후에 Mg²⁺의 존재 하에서 수행된다. 마지막으로, 상기 "연속적인(continuous)" 방법(예를 들어, 원 스텝(one step) 역전사 효소-PCR)은 상기 역전사 효소-PCR 3 단계를 성분 또는 효소 첨가를 위한 반응 튜브의 개방을 방지하는 하나의 연속적인 반응으로 통합한다. 연속적인 역전사 효소-PCR은 열안정성 Taq DNA 폴리머라제 및 Tth 폴리머라제의 역전사 효소 활성을 사용하는 단일 효소 시스템 및 시작 온도가 65℃인 AMV 역전사 효소 및 Taq DNA 폴리머라제를 사용하는 2 효소 시스템으로서 설명된다. RNA 변성 단계는 생략한다.

실시간에서 첫단계인, 역전사 PCR은 주형 특이적인 DNA 프라이머의 하나를 사용하여 상보적인 DNA 가닥을 생성한다. 전통적인 PCR 반응에서 이 생성물은 변성되고, 제2 주형 특이적인 프라이머가 상기 cDNA에 결합하여, 듀플렉스 DNA를 형성하도록 확장된다. 이 생성물은 온도 사이클링의 다음 단계에서 증폭된다. 가장 높은 민감성을 유지하기 위해, cDNA의 합성 전에 상기 RNA는 분해되지 않는 것이 중요하다. RNA:DNA 하이브리드는 RNase H의 기질이 될 수 있기 때문에 반응 완충액에서 RNase H의 존재는 상기 과정의 첫 단계에서 형성되는 RNA:DNA 하이브리드의 원하지 않는 분해를 야기할 것이다. 이러한 문제를 극복하는 2가지 주요 방법이 존재한다. 하나는 DNA 변성 단계 시작의 높은 온도 동안에 녹을 수 있는 왁스와 같은 막을 사용함으로써 역전사 반응의 나머지로부터 RNase H를 물리적으로 분리하는 것이다. 두번째 방법은 일반적으로 45-55℃인 역전사 온도에서 불활성화되도록 RNase H를 변형시키는 것이다. RNase H를 항체와 반응시키거나, 또는 가역적인 화학 변형을 포함한 여러 방법이 당업계에 알려져 있다. 상기 개시된 방법에서 사용된 다양한 RNase H는 이후 상세히 설명될 것이다.

본 발명에서 사용될 수 있는 RNAse H 효소의 예는 Walder et al.의 미국 특허 출원 제2009/0325169호에 개시되어 있으며, 상기 내용은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

원 스텝 역전사 효소-PCR는 연결되지 않은 역전사 효소-PCR에 비해 몇가지 이점을 제공한다. 원 스텝 역전사 효소-PCR은 연결되지 않은 역전사 효소-PCR(예를 들어, 두 단계의 반응 사이에서 성분 또는 효소의 첨가를 위해 반응 튜브를 여는 등)에 비해 반응 혼합물 시약 및 핵산 산물의 조작(handling)이 덜 요구되며, 따라서 노동 강도가 적고, 요구되는 시간이 줄어든다. 원 스텝 역전사 효소-PCR은 또한, 시료를 적게 요구하며, 오염의 위험을 줄일 수 있다. 원-스텝 역전사 효소-PCR의 민감성 및 특이성은 주어진 시료 또는 병원성 RNA의 검출에 있어서 하나 내지 여러 개의 유전자의 발현 수준을 연구하는데 적합하다고 증명되었다. 일반적으로, 이러한 과정은 cDNA 합성을 시작하기 위해 유전자-특이적인 프라이머의 사용을 제한한다.

이들 역전사 효소-PCR 기법과 조합된 실시간 검출에 의한 PCR 반응의 동역학을 측정하는 능력은 높은 민감도를 갖는 RNA 카피 수를 정확하고 정밀하게 결정하도록 한다. 이는 하기 설명될 5' 형광 발생 뉴클레아제 어세이(예를 들어, TaqMan) 또는 엔도뉴클레아제 어세이(예를 들어, CataCleave)와 같은, 형광 이중-표지된 혼성화 프로브 기법에 의한 증폭 과정 동안 PCR 산물의 형광 모니터링 및 측정을 통해 역전사 효소-PCR 산물을 검출함으로써 가능하다.

후-증폭된 앰플리콘의 검출은 시간과 노동이 많이 든다. 실시간 방법은 상기 PCR 과정 동안 증폭을 모니터링하기 위해 개발되었다. 이들 방법은 일반적으로 새로 합성되는 DNA에 결합하는 형광 표지된 프로브 또는 두가닥의 DNA에 인터칼레이트(intercalate)될 때 형광 방출이 증가하는 다이(dye)를 사용한다.

상기 프로브는 일반적으로 표적이 없을 경우, 두개의 발색단 사이에서 형광 공명 에너지 이동(fluorescence resonance energy transfer: FRET)에 의해 도너 방출이 소멸될 수 있도록 설계된다. 도너 발색단(donor chromophore)은 여기 상태(excited state)에서, 발색단 쌍이 가까운 거리에 위치시에 억셉터 발색단(acceptor chromophore)에 에너지를 전달한다. 이러한 전달은 항상 비-방사선으로, 쌍극자-쌍극자 결합(dipole-dipole coupling)을 통하여 일어난다. 발색단 사이의 거리를 충분히 증가시키는 모든 공정은 FRET 효율을 감소시켜서, 도너 발색단 방출을 방사능적으로 검출할 수 있게 된다. 일반적인 억셉터 발색단은 FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5, 및 Texas Red 등을 포함한다. 억셉터 발색단은 도너의 방출 스펙트럼와 여기 스펙트럼(excitation spectra)이 겹칠 수 있도록 선택된다. 예를 들어, 이러한 결합 쌍에는 FAM-TAMRA가 있다. 또한, 광범위한 도너를 퀀치(quench)하는 비형광 억셉터가 있을 수 있다. 이외에도 적합한 도너-억셉터 FRET 쌍의 다른 예들은 당업자에게 잘 알려져 있다.

PCR의 실시간 검출을 위해 사용될 수 있는 FRET 프로브의 공통적인 예는 분자 비콘 (molecular beacons), TaqMan 프로브(예를 들어, 미국 특허 제5,210,015호 및 제5,487,972호), 및 CataCleave 프로브(예를 들어, 미국 특허 제5,763,181호)를 포함한다. 분자 비콘은 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드로서, 비결합상태에서는 상기 프로브는 도너와 억셉터 발색단과 근접하여, 도너 방출을 감소시킬 수 있는 이차 구조를 형성하게끔 고안되어 있다. 적절한 반응 온도에서, 비콘은 구조가 풀어져서, 특히 앰플리콘에 결합한다. 일단 풀리게 되면, 도너와 억셉터 발색단 사이의 거리가 증가하여, FRET이 바뀌게 되고, 특별한 기기를 이용하여 도너 방출을 모니터할 수 있게 된다. TaqMan 및 CataCleave 기법은, 이용되는 FRET 프로브가 절단되어, 도너와 억셉터 발색단이 FRET을 바꾸기에 충분할 정도로 떨어지게 된다는 점에서 분자 비콘과는 다르다.

TaqMan 기법은 5' 말단에 도너 발색단으로 표지되고, 3' 말단에 억셉터 발색단으로 표지된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한다. 증폭을 위해 이용되는 상기 DNA 폴리머라제는 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성(exonuclease activity)을 가지고 있어야 한다. TaqMan 프로브는 프라이머가 결합할 때 같이 앰플리콘의 하나의 가닥에 결합한다. DNA 폴리머라제가 프라이머를 신장시키는 동안, 폴리머라제는 결국 결합된 TaqMan 프로브와 마주치게 될 것이다. 이때, 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성이 5' 말단에서 시작하여 순차적으로 TaqMan 프로브를 분해하게 될 것이다. 상기 프로브가 분해됨에 따라, 프로브를 포함하는 모노뉴클레오티드는 반응 완충액으로 나오게 된다. 도너가 억셉터로부터 확산됨에 따라, FRET은 바뀌게 된다. 도너로부터의 방출은 프로브 절단을 확인하기 위하여 모니터된다. TaqMan의 작용 때문에, 특별한 앰플리콘은 PCR의 매 사이클마다 오직 한번씩 검출될 수 있다. TaqMan 표적 부위를 통한 프라이머의 신장은 이중 가닥 산물을 생성하고, 앰플리콘이 다음 PCR 사이클에서 변성되기 전까지 TaqMan 프로브의 추가 결합을 막는다.

본 명세서에 참조로서 결합된 미국 특허 제5,763,181호의 내용은 또 다른 실시간 검출 방법(CataCleave라고 명명함)을 개시하고 있다. CataCleave 기법은 프로브의 절단이 폴리머라제 활성이 없는 2차 효소에 의해 수행된다는 점에서 TaqMan과 다르다. CataCleave 프로브는, 예를 들어 제한 효소 또는 RNase와 같은 엔도뉴클레아제의 표적 분자 내에 서열을 가지고 있다. 일 구체예에서, CataCleave 프로브는 프로브의 5' 및 3' 말단은 DNA로, 절단 부위는 RNA로 구성되어 있는, 키메릭 구조를 가지고 있다. 상기 프로브의 DNA 서열 부분은, 양말단이나 또는 내부에 FRET 쌍으로 표지된다. PCR 반응은 RNA-DNA 이중가닥의 RNA 서열 부분을 특이적으로 절단할 수 있는 RNase H 효소를 포함한다. 절단후에, 프로브의 반쪽 모두는 반응 온도에서 표적 앰플리콘에서 해리되며, 반응 용액으로 분산된다. 도너 및 억셉터가 분리될수록, FRET은 TaqMan 프로브와 같은 방법으로 바뀌게 되며, 도너 방출은 모니터 될 수 있다. 절단 및 해리는 추가적인 CataCleave 결합을 위한 부위를 재생산하게 된다. 이러한 방법으로, 프라이머가 CataCleave 프로브 결합 부위를 통하여 신장될 때까지, 단일 앰플리콘이 표적으로서 또는 프로브 절단을 여러회 반복할 수 있게 해준다.

일 구체예에서, 상기 방법에 사용된 프로브는 CataCleave 프로브이다. 적절한 CataCleave 프로브의 예는 서열번호 17 또는 18의 서열 중 하나를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 프로브는 서열번호 12, 13, 또는 14의 서열 중 하나이다.

서열번호 1-14 및 16-18의 서열을 하기 표 1에 나타내었다.

서열번호	서열	프라이머/프로브 이름
1	TTAACGAGCTGTATGTCGTGAGAAT	O157-I-F
2	AACGAGCTGTATGTCGTGAGAATC	O157-I-F1
3	CCCTCCAAATGAAATTCCAACA	O157-I-F2
4	GGCTTTGTTGCAAGGCTATG	O157-I2-F
5	CGAGCTGTATGTCGTGAGAATC	O157-I3-F
6	CAAGCCTATTCAGAGCATGG	O157-I4-F
7	ATGGATCATCAAGCTCTAAGAAAGAAC	O157-I-R
8	AGTGTCGTCTGTATGGATCATCAAG	O157-I-R1
9	CCTCAAGCGAAGATGCAAAAT	O157-I-R2
10	TGGATCATCAAGCTCTAAGAAAGAAC	O157-I-R3
11	GATTGCAACTGCTCATCAGG	O157-I2-R
12	ATAGGCTTrGrArArGCAGTGCA,상기 rG 및 9-12번째 위치는 리보뉴클레오티드일 수 있다.	O157-I-P1
13	ATAGGCTTrGrArArGCAGTGCAT,상기 rG 및 9-12번째 위치는 리보뉴클레오티드일 수 있다.	O157-I-P2
14	TCAGAGCATGrGrArArATAAAACTT, 상기 rG 및 11-14번째 위치는 리보뉴클레오티드일 수 있다.	O157-I-P3
16	X₁X₁X₂X₂CGAGCTGTATGTCGTGAGAATX₃ 상기 1 및 2번째 위치에서 X₁ 은 존재하지 않거나 T, 상기 3 및 4번째 위치에서 X₂는 존재하지 않거나 A, 2상기 6번째의 X₃는 존재하지 않거나 C이다
17	ATAGGCTTGAAGCAGTGCAX₁, 상기 X₁은 존재하지 않거나 T, 9-14번째 위치에서 3개 이상의 연속적인 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드이다.
18	TCAGAGCATGGAAATAAAACTT, 상기 10-14번째 위치에서 3개 이상의 연속적인 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드이다.

서열번호 12, 13, 14, 17 또는 18의 프로브는 5' 및 3'말단에 각각 검출가능한 표지가 결합될 수 있다. 일 구체예에서, 5'말단은 FAM (6-carboxyfluorescein)으로, 3'말단은 단파장 방출을 위한 Black Hole Quencher (BHQ)가 결합될 수 있다.

일 구체예에서, 시료 중 E. coli O157:H7를 검출하기 위한 키트는 상기 기재된 올리고뉴클레오티드를 포함한다.

상기 키트는 핵산 증폭을 위한 시약을 더 포함한다. 상기 시약은 하나 이상의 dNTP, rNTP, 핵산 폴리머라제, 우라실 N-글리코실라제(UNG) 효소, 완충액, 및 보조인자(예를 들어, Mg²⁺)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 및 역전사효소로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 열에 안정할 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 예를 들어, 95℃ 이상의 증가된 온도에서 그 활성을 유자할 수 있다. 열안정성 DNA 폴리머라제는 Thermus aquaticus, Thermus flavus, Thermus ruber, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus, Thermus lacteus, Thermus rubens, Thermotoga maritima, Thermococcus littoralis, 및 Methanothermus fervidus으로 이루어진 군으로부터 선택되는 열-저항성 박테리아로부터 분리될 수 있다. 열안정성 DNA 폴리머라제의 예는 Taq 폴리머라제이다. 상기 Taq 폴리머라제는 약 70℃에서 최적 활성을 갖는 것으로 알려져 있다.

상기 프로브가 표적 DNA와 혼성화될 때, 상기 E. coli O157:H7 검출용 키트는 DNA-RNA 혼성체의 RNA 부분을 특이적으로 절단할 수 있는 요소를 더 포함할 수 있다. 상기 절단 요소는 RNase H일 수 있다. 상기 절단 요소는 특이적 또는 비특이적으로 RNA 부분을 절단할 수 있다. 특이적인 RNA 절단 요소는 RNase HI일 수 있다. 비특이적인 RNA 절단 요소는 RNase HII일 수 있다. RNase H는 RNA-DNA 혼성체 내에서 RNA를 가수분해할 수 있다. RNase H의 활성을 위해, 2가 이온(예를 들어, Mg²⁺, Mn² ⁺)가 요구된다. RNase H는 RNA 3'-O-P 결합을 절단하여 3'-히드록실 및 5'-포스페이트 말단 산물을 생성한다. RNase H는 Pyrococcus furiosus RNase HII, Pyrococcus horikoshi RNase HII, Thermococcus litoralis RNase HI, 및 Thermus thermophilus RNase HI로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 RNase H는 열에 안정할 수 있다. 예를 들어, 상기 RNase H는 PCR에서 변성 과정 동안에 그 활성을 유지할 수 있다. 상기 절단 요소는 열안정성 RNase HII의 형태로 가역적으로 변형될 수 있으며, 이는 변형된 형태에서 불활성화되고, 변형되지 않은 형태에서 활성화되는 것으로, 상기 변형은 RNase HII와 리간드의 결합, RNase HII의 교차결합, 또는 RNase HII 내에서 아미노산 잔기의 화학적인 반응일 수 있으며, 상기 변형된 RNase HII의 효소 활성은 상기 RNase HII를 포함하는 시료의 pH를 조절하거나, 열을 가함으로써 회복될 수 있다.

DNA 서열 및 RNA 서열을 포함하는 상기 프로브의 RNA 부분은 상기 절단 요소에 의해 절단되어, 분리가 된다. 이러한 분리는 절단된 복합체의 녹는 온도(melting temperature)의 감소에 의해 자연스럽게 발생하거나 또는 온도 상승과 같은 요소에 의해 증진될 수 있다. 분리된 절편은 본 기술 분야에서 알려진 여러 방법에 의해 검출될 수 있다.

일 구체예에서, 시료 중 E. coli O157:H7를 검출하는 방법은 하기 단계를 포함한다: (a) 시료 중 E. coli O157:H7의 표적 핵산을 증폭하여 상기 표적 핵산의 카피수를 증가시키는 단계로서, 상기 증폭은 서열번호 16, 3, 4, 또는 6의 염기 서열을 포함하는 제1 프라이머 및 서열번호 7, 8, 9, 10 또는 11의 염기 서열을 포함하는 제2 프라이머를 상기 시료 중에서 표적 핵산과 혼성화시켜 상기 표적 핵산 및 상기 프라이머의 혼성화된 산물을 얻고, 주형-의존성 핵산 폴리머라제를 사용하여 상기 혼성화된 산물의 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 확장하여 확장된 프라이머 산물을 생성하는 것을 포함하는 단계; (b) 상기 표적 핵산과 혼성화될 수 있는 하나 이상의 프로브 올리고뉴클레오티드와 상기 표적 핵산을 혼성화하여 표적 핵산:프로브 올리고뉴클레오티드의 혼성화 산물을 얻는 단계로서, 상기 프로브는 DNA 서열 및 RNA 서열을 포함하며, 검출가능한 표지가 연결된 것인 단계; (c) 상기 표적 핵산:프로브의 혼성화된 산물과 RNase H를 접촉시켜 상기 프로브를 절단시켜, 상기 표적 핵산으로부터 프로브 절편 분리를 야기하는 단계; 및 (d) 검출가능한 표지를 검출하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 제1 프라이머는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 서열을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 프로브는 서열번호 12, 13, 또는 14의 서열을 포함할 수 있다.

시료 중 표적 서열의 증폭은 Polymerase Chain Reaction과 같은 핵산 증폭 방법 또는 Ligase Chain Reaction, Self-Sustained Sequence Replication, Strand Displacement Amplification, Transcriptional Amplification System, Q-Beta Replicase, Nucleic Acid Sequence Based Amplification (NASBA), Cleavage Fragment Length Polymorphism, Isothermal and Chimeric Primer-initiated Amplification of Nucleic Acid, Ramification-extension Amplification Method 또는 핵산의 증폭을 위한 적절한 증폭 방법을 사용하여 수행될 수 있다.

일 구체예에서, 상기 방법은 E. coli O157:H7의 표적 핵산 절편을 증폭하는 단계로서, 상기 증폭 단계는 서열번호 16, 3, 4, 또는 6의 제1 프라이머 및 서열번호 7, 8, 9, 10, 또는 11의 제2 프라이머를 시료 중의 표적 핵산에 혼성화시켜 혼성화된 산물을 얻는 단계; 및 주형-의존성 핵산 폴리머라제를 사용하여 상기 혼성화된 산물의 프라이머를 확장하여 확장된 프라이머 산물을 생성하는 단계; 표적 핵산 절편을 서열번호 17 또는 18의 프로브와 혼성화시켜 혼성화된 산물을 얻는 단계; 상기 표적 핵산 절편으로부터 혼성화된 산물 및 상기 프로브를 RNase H에 접촉시켜 상기 프로브를 절단하여, 상기 혼성화된 산물로부터 프로브 절편을 분리시키는 단계; 및 검출가능한 표지를 검출하는 단계를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 제1 프라이머는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 중 하나일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 프로브는 서열번호 12, 13, 또는 14 중 하나일 수 있다.

이후, 상기 방법을 더욱 상세하게 설명하도록 한다. 상기 방법은 E. coli O157:H7의 표적 핵산 절편을 증폭하는 단계로서, 상기 증폭 단계는 서열번호 16, 3, 4, 또는 6의 제1 프라이머 및 서열번호 7, 8, 9, 10, 또는 11의 제2 프라이머를 시료 중의 표적 핵산에 혼성화시켜 혼성화된 산물을 얻는 단계; 및 주형-의존성 핵산 폴리머라제를 사용하여 상기 혼성화된 산물의 프라이머를 확장하여 확장된 프라이머 산물을 생성하는 단계를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 제1 프라이머는 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6의 서열을 가질 수 있다. 일 구체예에서, 상기 프로브는 서열번호 12, 13, 또는 14의 서열을 가질 수 있다.

상기 혼성화는 액체 매질에서 수행될 수 있다. 적절한 액체 매질은 필요에 따라 선택될 수 있다. 상기 액체 매질은, 예를 들어, 물, 완충액, 또는 PCR 혼합물일 수 있다. 완충액의 예는 PBS, Tris, MOPS 및 Tricine일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 상기 혼성화는 상기 프라이머 및 표적 핵산의 결합을 향상시킬 수 있는 조건하에서 수행될 수 있으며, 예를 들어, 낮은 온도와 낮은 염 농도일 수 있다. 이들 혼성화를 향상시키는 조건은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 표적 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산일 수 있다. 예를 들어, 이중-가닥의 표적 핵산은 단일 가닥으로 분리되도록 변성될 수 있다. 상기 표적 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.

주형에 의존하는 프라이머의 확장은 중합을 의미하며, 이는 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 열안정성일 수 있다.

E. coli의 검출 방법은 표적 핵산 절편을 서열번호 17 또는 18의 프로브와 혼성화시켜 혼성화된 산물을 얻는 단계를 포함한다. 프로브는 상기 개시된 ㅍ프플프로브가 사용될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 프로브는 서열번호 12, 13, 또는 14의 서열을 갖는다. 상기 프로브는 예를 들어, 육안으로 검출가능한 표지와 같은 검출가능한 표지로 표지될 수 있다, 검출가능한 표지는 당업계에 잘 알려져 있으며, 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들어, FRET 쌍은 본 발명의 일 구체예 따른 표적 서열의 검출 목적으로 사용될 수 있다.

상기 혼성화는 액체 매질에서 수행될 수 있다. 적절한 액체 매질은 필요에 따라 선택될 수 있다. 상기 액체 매질은, 예를 들어, 물, 완충액, 또는 PCR 혼합물일 수 있다. 완충액의 예는 PBS, Tris, MOPS 및 Tricine일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 상기 혼성화는 상기 프라이머 및 표적 핵산의 결합을 향상시킬 수 있는 조건하에서 수행될 수 있으며, 예를 들어, 낮은 온도와 낮은 염 농도일 수 있다. 이들 혼성화를 향상시키는 조건은 당업계에 잘 알려져 있다. 상기 표적 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산일 수 있다. 예를 들어, 이중-가닥의 표적 핵산은, 상기 개시한 바와 같이, 단일 가닥으로 분리되도록 변성될 수 있다. 상기 표적 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.

상기 E. coli O157:H7를 검출하는 방법은 상기 표적 핵산 절편으로부터 혼성화된 산물 및 상기 프로브를 RNase H에 접촉시켜 상기 프로브를 절단하여, 상기 혼성화된 산물로부터 프로브 절편을 분리시키는 단계를 포함한다. 상기 혼성화된 산물 및 RNase H는 액체 매질에서 서로 접촉될 수 있다. 적절한 액체 매질은 필요에 따라 선택될 수 있다. 상기 액체 매질은, 예를 들어, 물, 완충액, 또는 PCR 혼합물일 수 있다. 완충액의 예는 PBS, Tris, MOPS 및 Tricine일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 상기 혼성화는 상기 프라이머 및 표적 핵산의 결합을 향상시킬 수 있는 조건하에서 수행될 수 있으며, 예를 들어, 낮은 온도와 낮은 염 농도일 수 있다.

상기 RNase H는 RNase HI 또는 RNase HII일 수 있다. RNase H는 RNA-DNA 혼성체 내에서 RNA를 가수분해할 수 있다. RNase H의 활성을 위해, 2가 이온(예를 들어, Mg² ⁺, Mn² ⁺)가 요구된다. RNase H는 RNA 3'-O-P 결합을 절단하여 3'-히드록실 및 5'-포스페이트 말단 산물을 생성한다. RNase H는 Pyrococcus furiosus RNase HII, Pyrococcus horikoshi RNase HII, Thermococcus litoralis RNase HI, 및 Thermus thermophilus RNase HI로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 RNase H는 열에 안정할 수 있다. 예를 들어, 상기 RNase H는 PCR에서 변성 과정 동안에 그 활성을 유지할 수 있다. 상기 절단 요소는 열안정성 RNase HII의 형태로 가역적으로 변형될 수 있으며, 이는 변형된 형태에서 불활성화되고, 변형되지 않은 형태에서 활성화되는 것으로, 상기 변형은 RNase HII와 리간드의 결합, RNase HII의 교차결합, 또는 RNase HII 내에서 아미노산 잔기의 화학적인 반응일 수 있으며, 상기 변형된 RNase HII의 효소 활성은 상기 RNase HII를 포함하는 시료의 pH를 조절하거나, 열을 가함으로써 회복될 수 있다.

이러한 분리는 절단에 의해 약해진 가닥의 결합력에 의해 자연스럽게 발생하거나 또는 온도의 증가와 같은 요소에 의해 향상될 수 있다. 예를 들어, 상기 PCR 혼합물은 RNA-DNA 듀플렉스의 RNA 서열 부분을 특이적으로 절단할 수 있는 RNase H 효소를 포함할 수 있다. 절단 후에, 상기 프로브의 두 부분(two halves)는 반응 온도에서 표적 앰플리콘으로부터 분리되어 반응 완충액으로 확산된다. 상기 도너와 억셉터 사이가 분리되면, FRET은 역전(reverse)되고, 도너 방출이 모니터링된다. 절단과 분리(dissociation)는 프로브가 더 결합할 수 있는 부위를 재생한다. 이러한 방법으로, 상기 프라이머가 프로브 결합 부위를 통해 확장될 때까지 단일 앰플리콘이 프로브 절단을 위한 복수회의 표적으로서 제공될 수 있다.

상기 E. coli O157:H7를 검출하는 방법은 상기 프로브 핵산 절편을 포함한다.

표적 E. coli O157:H7 서열을 검출하는 하나의 예시적인 방법은 식품 시료 또는 표면 채취물을 제공하는 단계, 시료 또는 채취물과 성장 배지를 혼합하고, 배양하여 E. coli O157:H7의 수 또는 군집을 증가시키는 단계(부유화(enrichment)), E. coli 세포를 파쇄하는 단계(용해(lysis)), 및 상기 얻은 용해물(lysate)을 표적 E. coli O157:H7 서열의 증폭 및 검출에 적용하는 단계를 포함한다. 식품 시료는 연어와 같은 생선류, 우유와 계란과 같은 낙농제품, 가금류, 과일 쥬스, 분쇄 돈육, 돈육, 분쇄 우육 또는 우육과 같은 고기류, 시금치와 같은 채소류, 또는 스테인리스 스틸, 고무, 플라스틱, 및 세라믹과 같은 자연환경의 표면을 포함할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

식품 오염에 대한 검출 한계(limit of detection, LOD)는 25 g의 고체 또는 25 ml의 액체 식품 또는 한정된 공간의 표면에서 검출될 수 있는 콜로니 형성 유니트(colony forming units, CFU)의 수에 관하여 설명된다. 정의에 의하면, 콜로니 형성 유니트는 살아있는 박테리아 수의 측정이다. 죽거나 살아있는 모든 세포를 세는 간접적인 현미경 계수법과는 다르게, CFU는 살아있는 세포를 측정한다. 1 CFU (하나의 박테리아 세포)는 성장하여 허용되는 조건 하에서 아가 플레이트 상에 하나의 콜로니를 형성한다. United States Food Testing Inspection Service에서는 최소 LOD를 고체 식품 25 g 또는 액체 식품 25 mL의 고체 식품 당 1 CFU 또는 표면 구역 당 1 CFU로 정의한다.

실제로, 1 CFU로 식품 시료 또는 표면을 반복적으로 접종하고, 부유화 과정에서 박테리아가 살아남도록 하는 것은 불가능하다. 이러한 문제는 하나 또는 여러 표적 레벨에 시료를 접종하고 최적 확수법(Most Probable Number, MPN)라고 불리는 통계적 평가를 사용하여 결과를 분석함으로서 극복될 수 있다. 예를 들어, E. coli 배양은 분광측정계에서 흡광도를 측정함으로써 구체적인 세포 밀도로 자랄 수 있다. 상기 표적의 10배 연속적 희석을 통해 아가 배지에 도말하고, 살아있는 박테리아를 계수한다. 이러한 데이터는 도말된 세포 밀도에 대한 CFU/부피에 관한 표준 곡선을 생성하는데 사용된다. MPN이 의미있기 위해서, 여러 접종 레벨에서의 시험 시료가 분석된다. 부유화 및 추출 후에 소량의 시료가 실시간 분석을 위해 제거된다. 최종 목표는 25% 내지 75% 사이(즉, CataCleave 프로브를 사용하여 역전사 효소-PCR을 이용한 어세이에서 양성 시료 테스트의 25% 내지 75% 사이로, 이는 하기에서 설명될 것이다.)의 유효화율(fractional recovery)을 달성하는 것이다. 이러한 유효화율 퍼센트를 선택하는 이유는 고체 식품의 시료 25 g, 액체 식품의 시료 25 mL, 또는 표면의 한정된 공간에 대하여 0.3 CFU 내지 1.375 CFU 사이의 MPN 값으로 변환되기 때문이다. 이들 MPN 값은 요구되는 1 CFU/시료의 LOD로 묶을 수 있다. 실제로, 이들의 유효화율을 달성하기 위해 희석된 접종원의 부피를 측정(표준 곡선에 기초)하는 것이 가능하다.

일 구체예에 따르면, 상기 키트는 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함하는 혼합물; DNA 중합 효소; RNase H Ⅱ; 및 완충 용액을 더 포함할 수 있다.

상기 DNA 중합 효소는 예를 들어, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합 효소일 수 있다. 또한, RNase H는 예를 들어, Pyrococcus furiosus RNase H II, Pyrococcus horikoshi RNase H II, Thermococcus litoralis RNase HI 또는 Thermus thermophilus RNase HI과 같은 열 안정적인 RNase H 효소를 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 완충 용액은 증폭 반응의 pH를 조절함으로써 증폭 반응의 하나 이상의 구성 요소의 안정성, 활성, 및/또는 수명을 변형시키는 증폭 반응에 첨가되는 화합물로서, 이러한 완충 용액들은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, Tris, Tricine, MOPS, 또는 HEPES일 수 있으나 이에 한정하지는 않는다. 이 외에도, 상기 키트는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 및 DNA 중합 효소 조인자를 포함할 수 있다. 상기 프라이머 세트 및 프로브는 하나의 반응 용기, 스트립 또는 마이크로 플레이트에 패키징될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법으로 패키징될 수 있다.

다른 양상은 대상 시료로부터 E. coli O157:H7의 용균액을 얻는 단계; 상기 용균액 및 상기 키트를 혼합하여 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및 상기 실시간 PCR 결과로부터 E. coli O157:H7의 존재 유무를 확인하는 단계를 포함하는 E. coli O157:H7을 검출하는 방법을 제공한다.

상기 E. coli O157:H7을 검출하는 방법을 각각의 단계별로 상세하게 설명하면 다음과 같다.

상기 방법은, 대상 시료로부터 E. coli O157:H7의 용균액을 얻는 단계를 포함할 수 있다.

일 구체예에 따른 검출 방법은 E. coli O157:H7에 오염되었을 것으로 예상되는 시료(sample)에 적용할 수 있다. 상기 시료는 예를 들어, 배양된 세포, 혈액, 타액 등의 체액 및 육류, 낙농 제품, 음료수 등과 같은 음식물을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 용균액은 E. coli O157:H7의 DNA를 포함하므로, 이후 단계의 실시간 PCR 반응의 주형으로 사용될 수 있다. 상기 용균액을 얻는 방법은, 예를 들어, 1 mg/㎖의 프로테나아제 K, 0.3125 mg/㎖의 소듐 아지드, 0.125 %의 Triton X-100, 및 12.5 mM Tris-HCl, pH 8.0을 포함하는 용액에 E. coli O157:H7를 첨가하여 용균시키는 방법을 사용할 수 있다. 또한, 상기 용균액으로부터 당업계에 공지된 방법에 따라 DNA를 추출하여 실시간 PCR 반응의 주형으로 사용할 수 있다. 상기 용균액으로부터 DNA를 추출하는 구체적인 방법은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001)에 개시되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

상기 용균액 및 상기 키트를 혼합하여 실시간 PCR을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.

일 구체예에 따르면, 상기 E. coli O157:H7 검출용 키트는 통상적인 실시간 PCR 방법 및 장치를 사용하여 실시할 수 있다. 상기 실시간 PCR 방법은 열 순환기(thermal cycler) 및 분광 형광 광도계가 일체화된 장치를 이용하여, DNA 중합 효소와 FRET의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 나타나는 형광을 검출하고 정량하는 방법이다. 이러한 방법은 특이적인 증폭 산물을 비 특이적인 증폭 산물로부터 구별하여 확인할 수 있으며, 자동화된 양상으로 분석 결과를 쉽게 입수할 수 있다. 상기 실시간 PCR 방법에 사용할 수 있는 기기로는 AB 사의 실시간 PCR 기기 7900, 7500, 7300, Stratagene 사의 Mx3000p, BioRad 사의 Chromo 4 및 Roche Lightcycler 480 기기 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. PCR 과정에서 상기 실시간 PCR 기기의 레이저는 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광 표지 인자를 감지하여 도 1과 같은 피크를 구현할 수 있다.

일 구체예에 따른 E. coli O157:H7의 검출 방법에 있어서, 실시간 PCR 반응은 당업계에 알려진 통상적인 조건으로 실시할 수 있으며, 예를 들어, 초기 변성(initial denaturation)을 95℃에서 10분 동안 수행한 후, 변성(denaturation, 95℃에서 15초), 프라이머 및 프로브의 어닐링, RNase HⅡ의 반응 및 신장(elongation, 60℃ 또는 63℃에서 20초)을 총 50 내지 60회 실시하는 조건으로 수행할 수 있다. 일 구체예에 따르면, 상기 방법에 의해 총 63종의 E. coli O157:H7를 검출할 수 있다.

상기 실시간 PCR 결과로부터 E. coli O157:H7의 존재 유무를 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 E. coli O157:H7의 존재 유무는 상기 실시간 PCR 과정에서 증폭된 PCR 산물의 프로브에 표지된 형광 표지 인자를 감지하여 나타나는 곡선으로부터, PCR 증폭 산물이 일정량 증폭되었을 때의 사이클 수인 C_p값을 계산함으로써 확인할 수 있다. C_p 값은 예를 들어, 10 내지 50, 또는 15 내지 45인 경우에 상기 E. coli O157:H7이 존재한다고 판단할 수 있다. 한편, 상기 C_p값의 계산은 상기 실시간 PCR 기기 내에 포함된 프로그램에 의해 자동으로 수행될 수 있다.

E.coli O175:H7의 검출을 위해 테스트될 수 있는 시료는 한정되지 않으나, 육류(예를 들어, 분쇄 우육을 포함한 우육), 채소(예를 들어, 시금치), 과일 주스 등이다.

상기 E. coli O157:H7 종 검출용 키트 및 상기 키트를 이용한 검출 방법에 의하면, 적은 카피 수의 대상 시료만으로도 검출 결과를 실시간으로 신속하게 확인할 수 있다.

일 구체예에 따른 E. coli O157:H7 검출 방법에 의하면, 적은 카피 수의 대상 시료만으로도 검출 결과를 실시간으로 신속하게 확인할 수 있다.

도 1a는 일 구체예에 따른 키트를 사용하여 E. coli O157:H7을 대상으로 실시간 PCR 반응에 의한 증폭 곡선을 나타낸 결과이며, 도 1b는 도 1a의 데이터로부터 결정된 Cp 값을 나타낸 것이다.
도 2는 일 구체예에 따른 키트를 사용하여 총 63종의 E. coli O157:H7 종을 대상으로 실시간 PCR 반응에 의한 증폭 곡선을 나타낸 결과이다.
도 3a 내지 도 3c는 일 구체예에 따른 키트를 사용하여 O157:H7 종과 비교한, 총 59종의 비-E. coli O157:H7 종을 대상으로 실시간 PCR 반응에 의한 증폭 곡선을 나타낸 결과로서, 일 구체예 따른 키트 및 방법이 높은 정확성을 나타냄을 보여준다. 상기 59 종은 3개의 군으로 나누어 실험하였다.
도 4a 및 도 4b는 다양한 조합의 프라이머 및 프로브를 사용하여 E. coli O157:H7 종을 대상으로 실시간 PCR 반응에 의한 증폭 곡선을 나타낸 결과로서, 도 4a는 형광 곡선을, 도 4b는 Cp 값을 나타낸다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: E. coli O157 : H7 의 실시간 검출을 위한 프라이머 및 프로브 제작

E. coli O157:H7의 실시간 검출을 위해 사용하는 프라이머는 E. coli O157:H7의 I 절편의 일부만을 증폭할 수 있는 프라이머 염기 서열임을 확인하였다. 상기 I 절편은 E. coli O157:H7 게놈(GenBank: AE005174.2.)의 312001-315400인 위치에 존재하였다. I 절편의 일부분의 폴리뉴클레오티드(1720 bp)를 일 구체예에서 사용하였으며, 이를 서열목록의 서열번호 15에 나타내었다.

상기 표 1은 일 구체예에 따라 고안된 대표적인 프라이머의 서열을 나타낸 것이다.

프로브는 상기 PCR의 대상이 되는 주형에 특이적으로 결합할 수 있는 카타클리브 프로브(Catacleave^TM probe)를 제작하여 실시간 PCR에서 실시간으로 증가하는 PCR 산물의 양을 검출할 수 있도록 하였다. 6-카르복시플루오레세인(6-carboxyfluorescein)(FAM)으로 5' 말단을 표지하였고, Black Hole Quencher(Integrated DNA Technologies, Coralville, IA)로 3' 말단을 표지하였다. 상기 결정된 프라이머 및 프로브는 Roche 사에 의뢰하여 합성하였다.

상기 표 1에 고안된 프로브의 대표적인 서열을 나타내었다. 또한, 상기 프로브 서열은 상기 뉴클레오티드에 연결된 표지를 보여준다.

실시예 2: 실시간 PCR 을 이용한 E. coli O157 : H7 의 증폭

실시간 PCR 반응에서 주형으로 사용하기 위한 E. coli O157:H7의 총 DNA는 다음과 같은 방법으로 추출하였다. 적절하게 배양시킨 E. coli O157:H7을 수확하여, 1 mg/㎖의 프로테나아제 K, 0.3125 mg/㎖의 소듐 아지드, 0.125 %의 Triton X-100, 및 12.5 mM Tris-HCl, pH 8.0을 포함하는 45 ㎕의 용균 용액에 희석시킨 다음, 상기 시료를 55℃에서 15분 동안 배양하고, 95℃에서 10분 동안 프로테나아제 K를 불활성화시킨 후, 4℃로 냉각시켰다. 상기 반응물을 원심분리하여 상층액을 얻은 다음, 이 상층액 자체, 또는 당업계에 알려진 DNA 추출 방법에 따라 상기 상층액으로부터 추출된 DNA를 실시간 PCR 반응물에 첨가하였다.

본 실시예에서 모든 실시간 PCR 반응은 1656 ㎕의 마스터 믹스 중 23 ㎕ 및 DNA 1 ㎕를 혼합하여 수행하였다. 상기 마스터 믹스는 180 ㎕의 10x I 완충액(10x I 완충액은 HEPES-포함 완충액(HEPES-KOH, MgCl₂, KCl, BSA, DMSO)임), 20 μM의 정방향 프라이머(서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4) 72 ㎕, 20 μM의 역방향 프라이머(서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 또는 서열번호 11) 72 ㎕, 25 μM의 CataCleave 프로브(서열 번호 12, 서열번호 13 또는 서열 번호 14) 14.4 ㎕, dNTP 믹스(2 mM dGTP, dCTP, dATP, dTTP) 72 ㎕, 36 ㎕의 Platinum Taq DNA 중합효소(Invitrogen), 14.4 ㎕의 RNase HⅡ(Invitrogen), 우라실 DNA N-글리코실라제 7.2 ㎕ 및 1188 ㎕의 증류수를 포함하였다.

상기 반응물은 먼저, 37℃에서 10분 및 95℃에서 10분 동안 우라실 DNA N-글리코실라아제 반응 및 변성 반응을 시킨 다음, 95℃에서 15초 동안 변성, 60℃ 또는 63℃에서 20초 동안 프라이머 및 카타클리브 프로브의 어닐링(annealing), RNase HⅡ의 반응 및 신장(elongation) 반응을 50회 반복하여 실시간 PCR 반응을 수행하였다. 상기 반복 과정이 끝난 다음, 40℃에서 10초 동안 냉각시켰다. 상기 반응은 Roche Lightcycler 480 기기를 사용하여 수행하였으며, PCR 증폭 유무는 LightCycler 480 Software v1.5.0을 이용하여 실시간으로 관찰하였다.

그 결과를 표 2 내지 표 3 및 도 4a 내지 도 4b에 나타내었다. 표 2 내지 표 3 및 도 4a 내지 도 4b에서, 프라이머는 하기 서열에 따른다:

O157-I-F: 서열번호 1

O157-I-F1: 서열번호 2

O157-I-F2: 서열번호 3

O157-I2-F: 서열번호 4

O157-I-R: 서열번호 7

O157-I-R1: 서열번호 8

O157-I-R3: 서열번호 10

O157-I2-R: 서열번호 11

카피수	Log	O157-I-F2/ O157-I-R3	O157-I2-F/ O157-I2-R	O157-I3-F/ O157-I-R	O157-I3-F/ O157-I-R3	O157-I4-F/ O157-I-R2
0.E+00
5.E+00	0.7
5.E+01	1.7	32.85	41.37	34.33	45.00	35.76
5.E+02	2.7	30.44	34.82	30.56	31.35	32.16
5.E+03	3.7	27.05	31.39	26.66	26.67	28.63
5.E+04	4.7	23.36	25.87	23.05	23.15	24.30
5.E+05	5.7	19.33	22.01	19.11	18.72	20.20
5.E+06	6.7	16.58	18.24	16.42	15.93	17.95
Slope		-3.38	-4.56	-3.64	-5.34	-3.69
Y-Intercept		39.14	48.10	40.32	49.21	42.01
PCR Efficiency		97.6	65.7	88.1	54.0	86.5

카피수	Log	O157-I-F/ O157-I-R	O157-I-F/ O157-I-R1	O157-I-F/ O157-I-R3	O157-I-F1/ O157-I-R	O157-I-F1/ O157-I-R3	O157-I-F2/ O157-I-R
0.E+00
5.E+00	0.7		37.75	35.83
5.E+01	1.7	32.26	31.41	34.09	34.14	34.23	36.00
5.E+02	2.7	30.40	29.38	29.59	31.40	30.62	31.12
5.E+03	3.7	26.14	25.87	26.70	28.06	26.66	27.49
5.E+04	4.7	22.26	21.67	21.86	23.72	23.08	23.96
5.E+05	5.7	18.16	17.68	18.01	19.80	19.06	19.82
5.E+06	6.7	15.61	14.91	15.23	17.23	16.36	17.25
Slope		-3.54	-3.70	-3.63	-3.53	-3.65	-3.75
Y-Intercept		39.00	39.22	39.34	40.56	40.31	41.68
PCR Efficiency		91.7	86.2	88.5	91.9	88.0	84.8

실시예 3: 일 구체예에 따른 프로브를 이용한 E. coli O157 : H7 의 검출

E. coli O157:H7을 대상으로, O157-I-F1(서열번호 2) 및 O157-I-R(서열번호 7)의 프라이머 세트 및 3가지 종류의 서로 다른 프로브(O157-I-P1(서열번호 12), O157-I-P2(서열번호 13) 및 O157-I-P3(서열번호 14))를 사용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 도 1a 및 도 1b는 상기 실시간 PCR 반응에 의한 증폭 곡선, 형광 기록 및 Cp 값을 나타낸 결과이다. 또한, 하기 표 4는 도 1a의 증폭 곡선으로부터 C_p값을 계산하여 나타낸 결과이다. 상기 실험에서 주형의 초기 카피 수는 5,000,000 카피였다. 하기 결과는 상기 프라이머 세트 및 O157-I-P2(서열번호 13)의 프로브를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행하였을 때, 5개의 카피만으로도 증폭이 가능함을 보여주었다. 한편, DNA 주형 대신 증류수를 첨가한 음성 대조군에서는 형광이 검출되지 않았다.

카피수	Log	O157 I-P1	O157 I-P2	O157 I-P3
0.E+00
5.E+00	0.7		37.24
5.E+01	1.7	34.76	34.43	35.28
5.E+02	2.7	30.86	30.95	32.30
5.E+03	3.7	27.44	27.60	28.68
5.E+04	4.7	23.74	23.75	24.94
5.E+05	5.7	19.85	19.92	21.06
5.E+06	6.7	16.94	16.95	18.17
Slope		-3.60	-3.47	-3.51
Y-Intercept		40.69	40.09	41.50
PCR Efficiency		89.7	94.3	92.5

실시예 4: E. coli O157 : H7 의 포괄성 테스트( inclusivity test )

하기 표 4에 나타낸 총 63 종류의 E. coli O157:H7 종을 대상으로 실시예 3에서 사용한 프라이머 세트 및 프로브를 사용하여 포괄성(inclusivity)을 테스트하였다. 본 실시예에서는 10배의 LOD(limit of detection)인 50,000 cfu/ml 농도의 DNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 수행하였다. 도 2는 상기 실시간 PCR 반응에 의한 증폭 곡선을 나타낸 결과이다. 또한, 하기 표 5는 도 2의 증폭 곡선으로부터 C_p값을 계산하여 나타낸 결과이다.

하기 결과로부터 상기 프라이머 세트(서열번호 2 및 서열번호 7) 및 O157-I-P2(서열번호 13)의 프로브를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행하였을 때, E. coli O157:H7 63종 모두에서 PCR 산물이 검출되었으며(100%의 포괄도), 평균 C_p값은 32.57이었다.

STA #	Serovar Name	Cp	RFU
0070010002	Escherichia coli O157:H7	33.47	7.095
0070010003	Escherichia coli O157:H7	33.42	7.359
0070010004	Escherichia coli O157:H7	32.72	7.722
0070010005	Escherichia coli O157:H7	32.78	7.682
0070010006	Escherichia coli O157:H7	32.64	7.389
0070010007	Escherichia coli O157:H7	32.31	7.342
0070010008	Escherichia coli O157:H7	31.74	7.543
0070010009	Escherichia coli O157:H7	32.87	7.032
0070010010	Escherichia coli O157:H7	32.06	7.373
0070010011	Escherichia coli O157:H7	32.20	7.527
0070010012	Escherichia coli O157:H7	32.27	7.800
0070010013	Escherichia coli O157:H7	32.46	8.125
0070010014	Escherichia coli O157:H7	31.87	7.713
0070010015	Escherichia coli O157:H7	31.64	8.183
0070010016	Escherichia coli O157:H7	32.16	7.659
0070010017	Escherichia coli O157:H7	32.14	7.494
0070010018	Escherichia coli O157:H7	33.23	7.254
0070010019	Escherichia coli O157:H7	32.26	7.727
0070010020	Escherichia coli O157:H7	33.07	7.766
0070010021	Escherichia coli O157:H7	32.15	7.747
0070010022	Escherichia coli O157:H7	32.43	7.924
0070010023	Escherichia coli O157:H7	32.97	7.623
0070010024	Escherichia coli O157:H7	32.98	8.065
0070010025	Escherichia coli O157:H7	32.50	7.776
0070010026	Escherichia coli O157:H7	32.52	7.003
0070010027	Escherichia coli O157:H7	32.16	7.488
0070010028	Escherichia coli O157:H7	32.26	7.518
0070010029	Escherichia coli O157:H7	32.71	7.882
0070010030	Escherichia coli O157:H7	31.79	7.802
0070010031	Escherichia coli O157:H7	32.57	7.793
0070010032	Escherichia coli O157:H7	32.54	7.716
0070010033	Escherichia coli O157:H7	32.57	7.740
0070010034	Escherichia coli O157:H7	32.64	6.956
0070010035	Escherichia coli O157:H7	33.56	7.468
0070010036	Escherichia coli O157:H7	33.66	8.055
0070010037	Escherichia coli O157:H7	32.68	7.995
0070010038	Escherichia coli O157:H7	32.77	7.776
0070010039	Escherichia coli O157:H7	32.77	8.037
0070010040	Escherichia coli O157:H7	32.62	7.587
0070010041	Escherichia coli O157:H7	32.19	7.394
0070010042	Escherichia coli O157:H7	32.63	7.140
0070010043	Escherichia coli O157:H7	32.87	7.261
0070010044	Escherichia coli O157:H7	32.54	7.772
0070010045	Escherichia coli O157:H7	32.45	8.123
0070010046	Escherichia coli O157:H7	32.46	8.123
0070010047	Escherichia coli O157:H7	32.90	7.642
0070010048	Escherichia coli O157:H7	32.47	7.667
0070010049	Escherichia coli O157:H7	32.19	7.597
0070010050	Escherichia coli O157:H7	32.92	6.996
0070010051	Escherichia coli O157:H7	32.67	7.148
0070010052	Escherichia coli O157:H7	33.00	7.598
0070010053	Escherichia coli O157:H7	31.62	7.996
0070010054	Escherichia coli O157:H7	32.85	7.610
0070010055	Escherichia coli O157:H7	32.76	7.759
0070010056	Escherichia coli O157:H7	32.33	7.615
0070010057	Escherichia coli O157:H7	32.91	7.675
0070010058	Escherichia coli O157:H7	32.53	7.092
0070010059	Escherichia coli O157:H7	32.78	7.333
0070010060	Escherichia coli O157:H7	32.62	8.023
0070010061	Escherichia coli O157:H7	32.02	8.274
0070010062	Escherichia coli O157:H7	32.21	7.933
0070010063	Escherichia coli O157:H7	32.86	7.769
0070010064	Escherichia coli O157:H7	32.70	7.782
Negative Control			0.637
Positive Control (100 copies O157 I fragment)		32.24	7.630

상기 결과는 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브가 높은 민감도로 테스트한 모든 E. coli O157:H7 종을 검출할 수 있음을 보여준다.

실시예 5: E. coli O157:H7의 배타성 테스트(exclusivity test)

하기 표 6 내지 표 8에 나타낸 총 59 종류의 비-E. coli O157:H7 종을 대상으로 실시예 3에서 사용한 프라이머 세트 및 프로브를 사용하여 포괄성(exclusivity)을 테스트하였다.

최대 밀도 배양 (약 2x10⁹ cfu/mL)로부터의 DNA를 주형으로 하여 실시간 PCR을 수행하였다. 도 3a 내지 도 3c는 각각, 하기 표 6 내지 표 8에 개시된 각각의 종에 대해 실시간 PCR 반응에 의한 증폭 곡선을 나타낸 결과이다. 또한, 하기 표 5a 내지 표 5c는 도 3a 내지 도 3c의 증폭 곡선으로부터 C_p값을 계산하여 나타낸 결과이다.

하기 결과로부터 상기 프라이머 세트(서열번호 2 및 서열번호 7) 및 O157-I-P2(서열번호 13)의 프로브를 이용하여 실시간 PCR 반응을 수행하였을 때, 58 종의 비-E. coli O157:H7 종에서 PCR 산물이 검출되지 않았다(98.3%의 배타도). 본 실시예에서 교차-반응이 나타난 E. coli O55:H7 종은, E. coli O157:H7 종로부터 유래한 것이기 때문에 상기 프라이머 세트 및 카타클리브 프로브로부터 PCR 산물이 생성된 것으로 생각된다.

		O157 I ( TYE563 )
STA #	Serovar Name	Cp	RFU
0020010001	Aeromonas caviae		0.644
0020020001	Aeromonas hydrophila		0.652
0040010001	Citrobacter amalonaticus		0.648
0040020001	Citrobacter braakii		0.614
0040030001	Citrobacter freundii		0.611
0040040001	Citrobacter youngae		0.614
0050010001	Edwardsiella tarda		0.603
0060010001	Enterobacter aerogenes		0.580
0060020001	Enterobacter cancerogenous		0.617
0060030001	Enterobacter cloacae		0.645
0060040001	Enterobacter intermedia		0.661
0060050001	Enterobacter sakazakii		0.656
0070010001	Escherichia coli		0.644
0070020001	Escherichia fergusonii		0.605
0070030001	Escherichia vulneris		0.620
0080010001	Klebsiella pneumoniae		0.619
0090010001	Morganella morganii		0.670
0100010001	Proteus hauseri		0.706
0100020001	Proteus mirabilis		0.666
0100030001	Proteus vulgaris		0.673
0110010001	Pseudomonas aeruginosa		0.634
0110020001	Pseudomonas putida		0.794
0120010001	Serratia marcescens		0.631
0130010001	Shigella dysenteriae		0.617
0130020001	Shigella flexneri		0.627
0130030001	Shigella sonnei		0.647
0140010001	Vibrio cholera		0.707
0150010001	Yersinia enterocolitica		0.652
Campylobacter jejuni genomic DNA (1 mg)			0.766
Negative control			0.651
Positive Control (1x10³ copies O157 I fragment)		28.77	5.667

		O157 I ( TYE563 )
STA #	Serovar Name	Cp	RFU
0070040001	Escherichia coli O157:H1		0.743
0070050001	Escherichia coli O157:H2		0.755
0070060001	Escherichia coli O157:H4		0.718
0070070001	Escherichia coli O157:H5		0.726
0070080001	Escherichia coli O157:H11		0.763
0070090001	Escherichia coli O157:H12		0.754
0070100001	Escherichia coli O157:H15		0.781
0070110001	Escherichia coli O157:H16		0.753
0070120001	Escherichia coli O157:H18		0.775
0070130001	Escherichia coli O157:H19		0.763
0070150001	Escherichia coli O157:H29		0.766
0070160001	Escherichia coli O157:H42		0.675
0070170001	Escherichia coli O157:H43		0.680
0070190001	Escherichia coli O157:H45		0.711
0070200001	Escherichia coli O157:HNM		0.708
0070210001	Escherichia coli O157:HN		0.707
0070230001	Escherichia coli O55:H7	17.88	6.078
0070240001	Escherichia coli O91:HNM		0.676
0070250001	Escherichia coli O111:H12		0.760
0070270001	Escherichia coli O117:H4		0.739
0070280001	Escherichia coli O103:H2		0.785
0070290001	Escherichia coli O115:HNM		0.731
0070300001	Escherichia coli O118:H12		0.704
0070310001	Escherichia coli O121:HNM		0.775
0070320001	Escherichia coli O142:HNM		0.800
0070330001	Escherichia coli O145:HNM		0.706
0070340001	Escherichia coli O146:H21		0.694
0070350001	Escherichia coli O163:H19		0.739
Negative Control			0.687
Positive Control (10000 copies O157 I fragment)		25.36	6.394

		O157 I ( TYE563 )
STA #	Serovar Name	Cp	RFU
0070220001	Escherichia coli O26:H11		0.692
0070260001	Escherichia coli O111:H8		0.633
TSB only			0.684
Positive Control (1e7 copies O157 I fragment)		17.74	6.293

상기 실시예 1 내지 5의 결과로부터 상기 프라이머 세트 및 프로브를 이용하면, 기존의 방법에 비해 더 적은 양의 시료만으로도 E. coli O157:H7을 효율적으로 검출할 수 있으며, 한 세트의 프라이머 세트 및 프로브로부터 다양한 종의 E. coli O157:H7을 한번에 검출할 수 있으므로, 검체로부터 E. coli O157:H7를 검출하는데 시간과 노력을 절감할 수 있다는 사실을 알 수 있다.

본 명세서에서 개시한 어떠한 특허, 특허 출원, 공개 또는 다른 개시 자료는 그 전체로 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 여기서 참조로서 삽입된다고 한 어떠한 자료 또는 그의 일부가 본 명세서의 정의, 진술 또는 기타 개시 자료와 모순되는 경우, 삽입된 자료와 현재 개시 자료 사이에 모순되지 않는 정도로만 삽입되는 것으로 해석된다.

<110> Samsung Techwin Corporation <120> Oligonucleotides for detecting E.coli 0157:H7 strains and use thereof <130> PN089130 <150> US 61/378,071 <151> 2010-08-30 <150> US 13/109,043 <151> 2011-05-17 <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 ttaacgagct gtatgtcgtg agaat 25 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 aacgagctgt atgtcgtgag aatc 24 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 3 ccctccaaat gaaattccaa ca 22 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 4 ggctttgttg caaggctatg 20 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 5 cgagctgtat gtcgtgagaa tc 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 6 caagcctatt cagagcatgg 20 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 7 atggatcatc aagctctaag aaagaac 27 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 8 agtgtcgtct gtatggatca tcaag 25 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 9 cctcaagcga agatgcaaaa t 21 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 10 tggatcatca agctctaaga aagaac 26 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 11 gattgcaact gctcatcagg 20 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (9)..(12) <223> ribonucleotide <400> 12 ataggcttga agcagtgca 19 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (9)..(12) <223> ribonucleotide <400> 13 ataggcttga agcagtgcat 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (11)..(14) <223> ribonucleotide <400> 14 tcagagcatg gaaataaaac tt 22 <210> 15 <211> 1720 <212> DNA <213> E. coli O157:H7 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1720) <223> I fragment of E. coli O157:H7 <400> 15 cggaaatatt gacatgggat gatgaacaat gggaggtatt tgtccatgat tggcttattg 60 tctgtaaatc agatgattac ccgtggagcg aacgtttggg aggagctgga gataaaggta 120 gagacgttgt tggatataaa tcggatccta acgtagaagg ttattcttgg gataattatc 180 aatgcaaact gtacaaaaaa agtttagggt tctctgatgt tgtagttgag tttggaaaac 240 ttatctattt tactctgaat ggtgattatc ccatccctca gaagtacttt tttgtggcac 300 cctatgattt atctactaca ttttctaatt tattgaaaaa taaaaacgag cttaaaaaag 360 cagtccttga ttcatgggat tcagcaattt caaaaaaata actaaaaaga ttgatattcc 420 attagatgat gaaataaaaa aatatattga ggattttgat tttagtattt tttactctct 480 acccttatca ttgattttaa atgatattgc aaatacacac ctttatttta agtactttaa 540 cgagctgtat gtcgtgagaa tccctccaaa tgaaattcca acatacaatt caaaaaaaga 600 gtctgtatat gttaatgcac tgcttcaagc ctattcagag catggaaata aaacttatag 660 ttctttctta gagcttgatg atccatacag acgacacttt aataatagta gaaatgattt 720 ttattttgca tcttcgcttg aggtttttgt ccgcgaagta tttaaagatg atgtattcaa 780 agcattgaaa tgttacattt catcttcaat tgaacccgtc ttttatgaag accataatta 840 tgcatttatt aggtgtaatg cagtcttgaa gcaggctgtt ctgacaccaa ttgcacattc 900 agtactatca aaaatatgtg aagcaaatga taaaaaagga atatgccatc atttggttaa 960 tgatggtgaa gtaatttgga cggtgagata atggttagaa tttataattc aagtttagaa 1020 gtggcatgtc gaatggcgaa agtgctcgtc gctatttatc cttcttcatt aagccttgaa 1080 cggcttattt gttttgattt tattttagta aatcttaagg attttttacc tgaagagatt 1140 agtcttcatc ctccaatacc ccgtagagat gctcagttag ccctaaaacg agagattgtt 1200 ttagaatcat tggctttgtt gcaaggctat gaactagcct caaaaattta tacacatcgt 1260 ggttttgtat ataaagcttc tgaaaaaaca tatgcattta caaattctct acataatgaa 1320 tatgttgcgc agatggagca taatataaat ttggtggtta agttatatag tgatattcct 1380 gatgagcagt tgcaatcaat tataaaaaat aaaattggca aatatgatat ggaatttaat 1440 tatgaatgac aattttttta cgttcagaaa aataaaggta accggattca ataaattaga 1500 tgctataatt gaatttggtt ctaaattgac tattttatat ggtggttctg actctggaaa 1560 aacatacata tattatttga ttcgatattt attagggagt gaaaaactaa aaaataaaga 1620 tatcgatcat gctcaaggtt atgatttagc ctatctggaa tttaattttc aaggtagggt 1680 aatgacaatt gagaggtctc ttcaggatag cgcccattac 1720 <210> 16 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2) <223> absence or t <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> absence or a <220> <221> misc_feature <222> (26) <223> absence or c <400> 16 nnnncgagct gtatgtcgtg agaatn 26 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> absence or t <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> deoxyribonucleotide or ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> deoxyribonucleotide or ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> deoxyribonucleotide or ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> deoxyribonucleotide or ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> deoxyribonucleotide or ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> deoxyribonucleotide or ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (9)..(14) <223> at least three consecutive residues are ribonucleotides <400> 17 ataggcttga agcagtgcan 20 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> deoxyribonucleotide or ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (11) <223> deoxyribonucleotide or ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> deoxyribonucleotide or ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> deoxyribonucleotide or ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (14) <223> deoxyribonucleotide or ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (10)..(14) <223> at least three consecutive residues are ribonucleotides <400> 18 tcagagcatg gaaataaaac tt 22

Claims

(a) 서열번호 16, 3, 4, 또는 6의 염기 서열 중 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머;
(b) 서열번호 7, 8, 9, 10 또는 11의 염기 서열 중 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머; 및
(c) E. coli . O157:H7의 표적 유전자와 실질적으로 상보적인 RNA 서열 및 DNA 서열을 포함하며, 검출가능한 표지가 연결된 프로브를 포함하는, 시료 중 E. coli O157:H7을 검출하기 위한 키트.
제1항에 있어서, 상기 E. coli . O157:H7의 표적 유전자는 서열번호 15의 염기 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 단편인 것인 키트.
제1항에 있어서, 상기 키트는,
(d) E. coli O157:H7의 PCR 단편을 생성하기 위해, 표적 DNA 서열의 PCR 증폭을 위한 증폭 활성; 및
(e) RNase H 활성을 더 포함하는 것인 키트.
제1항에 있어서, 상기 키트는 양성, 내부, 및 음성 대조군을 더 포함하는 것인 키트.
제4항에 있어서, 상기 키트는 우라실-N-글리코실라제를 더 포함하는 것인 키트.
제1항에 있어서, 상기 검출가능한 표지는 형광 표지인 것인 키트.
제1항에 있어서, 상기 프로브는 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 쌍으로 표지된 것인 키트.
제1항에 있어서, 상기 프로브는 고체 지지체에 고정화된 것인 키트.
제1항에 있어서, 상기 프로브는 용액 내에 부유 상태(free form)로 존재하는 것인 키트.
제3항에 있어서, 상기 RNase H 활성은 열안정성 RNase H 활성인 것인 키트.
제3항에 있어서, 상기 RNase H 활성은 핫 스타트(hot start) RNase H 활성인 것인 키트.
제1항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 17 또는 서열번호 18의 서열을 포함하는 것인 키트:
ATAGGCTTGAAGCAGTGCAX₁ (서열번호 17), 상기 X₁은 존재하지 않거나 T이며, 상기 서열번호 17의 염기 서열에서 9 내지 14번째 위치에 존재하는 뉴클레오티드 중 3개 이상은 리보뉴클레오티드이며,
TCAGAGCATGGAAATAAAACTT (서열번호 18), 상기 서열번호 18의 염기 서열에서 10 내지 14번째 위치에 존재하는 뉴클레오티드 중 3개 이상은 리보뉴클레오티드이다.
제1항에 있어서, 상기 프로브는 하기 서열번호 12 내지 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 키트:
ATAGGCTTrGrArArGCAGTGCA (서열번호 12), 상기 서열번호 12의 염기 서열에서 9 내지 12번째 위치에 존재하는 rG 및 rA는 각각 리보뉴클레오티드이고,
ATAGGCTTrGrArArGCAGTGCAT (서열번호 13), 상기 서열번호 13의 염기 서열에서 9 내지 12번째 위치에 존재하는 rG 및 rA는 각각 리보뉴클레오티드이며,
TCAGAGCATGrGrArArATAAAACTT (서열번호 14), 상기 서열번호 14의 염기 서열에서 11 내지 14번째 위치에 존재하는 rG 및 rA는 각각 리보뉴클레오티드이다.
(a) 시료 중 E. coli O157:H7의 표적 핵산을 증폭하여 상기 표적 핵산의 카피수를 증가시키는 단계로서, 상기 증폭은 서열번호 16, 3, 4, 또는 6의 염기 서열 중 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 및 서열번호 7, 8, 9, 10 또는 11의 염기 서열 중 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머를 상기 시료 중에서 표적 핵산과 혼성화시켜 상기 표적 핵산 및 상기 프라이머의 혼성화된 산물을 얻고, 주형-의존성 핵산 폴리머라제를 사용하여 상기 혼성화된 산물의 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 확장하여 확장된 프라이머 산물을 생성하는 것을 포함하는 단계;
(b) 상기 표적 핵산과 혼성화될 수 있는 하나 이상의 프로브 올리고뉴클레오티드와 상기 표적 핵산을 혼성화하여 표적 핵산:프로브 올리고뉴클레오티드의 혼성화 산물을 얻는 단계로서, 상기 프로브는 DNA 서열 및 RNA 서열을 포함하며, 검출가능한 표지가 연결된 것인 단계;
(c) 상기 표적 핵산:프로브 올리고뉴클레오티드의 혼성화된 산물과 RNase H를 접촉시켜 상기 프로브를 절단시키는 단계; 및
(d) 상기 프로브 상의 표지로부터 신호 방출의 증가를 검출하는 단계로서, 상기 신호의 증가는 시료 중 E. coli O157:H7 핵산이 존재함을 나타내는 것인 단계를 포함하는 시료 중 E. coli O157:H7을 검출하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 프로브 올리고뉴클레오티드는 서열번호 17 또는 서열번호 18의 올리고뉴클레오티드인 것인 방법:
ATAGGCTTGAAGCAGTGCAX₁ (서열번호 17), 상기 X₁은 존재하지 않거나 T이며, 상기 서열번호 17의 염기 서열에서 9 내지 14번째 위치에 존재하는 뉴클레오티드 중 3개 이상은 리보뉴클레오티드이며,
TCAGAGCATGGAAATAAAACTT (서열번호 18), 상기 서열번호 18의 염기 서열에서 10 내지 14번째 위치에 존재하는 뉴클레오티드 중 3개 이상은 리보뉴클레오티드이다.
제15항에 있어서, 상기 프로브 올리고뉴클레오티드는 하기 서열번호 12 내지 서열번호 14의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것인 방법:
ATAGGCTTrGrArArGCAGTGCA (서열번호 12), 상기 서열번호 12의 염기 서열에서 9 내지 12번째 위치에 존재하는 rG 및 rA는 각각 리보뉴클레오티드이고,
ATAGGCTTrGrArArGCAGTGCAT (서열번호 13), 상기 서열번호 13의 염기 서열에서 9 내지 12번째 위치에 존재하는 rG 및 rA는 각각 리보뉴클레오티드이며,
TCAGAGCATGrGrArArATAAAACTT (서열번호 14), 상기 서열번호 14의 염기 서열에서 11 내지 14번째 위치에 존재하는 rG 및 rA는 각각 리보뉴클레오티드이다,
제14항에 있어서, 상기 검출가능한 표지는 FRET 쌍인 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 증폭은 폴리머라제 Chain Reaction, Ligase Chain Reaction, Self-Sustained 서열 Replication, Strand Displacement Amplification, Transcriptional Amplification System, Q-Beta Replicase, Nucleic Acid 서열 Based Amplification, Cleavage Fragment Length Polymorphism, Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic Acid, and Ramification-extension Amplification 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법에 의한 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 a), b) 및 c) 단계는 동시에 또는 순차적으로 수행되는 것인 방법.
(a) 역전사 효소 활성 및 역방향 증폭 프라이머의 존재 하에 E. coli O157:H7 표적 RNA를 역전사하여 표적 RNA의 표적 cDNA를 생성하는 단계;
(b) 시료 중 E. coli O157:H7의 표적 cDNA를 증폭하여 상기 표적 핵산의 카피수를 증가시키는 단계로서, 상기 증폭은 서열번호 16, 3, 4, 또는 6의 염기 서열 중 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제1 프라이머 및 서열번호 7, 8, 9, 10 또는 11의 염기 서열 중 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 제2 프라이머를 상기 시료 중에서 표적 핵산과 혼성화시켜 상기 표적 핵산 및 상기 프라이머의 혼성화된 산물을 얻고, 주형-의존성 핵산 폴리머라제를 사용하여 상기 혼성화된 산물의 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 확장하여 확장된 프라이머 산물을 생성하는 것을 포함하는 단계;
(c) 상기 표적 cDNA와 실질적으로 상보적인 하나 이상의 프로브 올리고뉴클레오티드와 상기 표적 핵산을 혼성화하여 표적 핵산:프로브 올리고뉴클레오티드의 혼성화 산물을 얻는 단계로서, 상기 프로브는 DNA 서열 및 RNA 서열을 포함하며, 검출가능한 표지가 연결된 것인 단계;
(d) 상기 표적 핵산:프로브 올리고뉴클레오티드의 혼성화된 산물과 RNase H를 접촉시켜 상기 프로브를 절단시키는 단계; 및
(e) 상기 프로브 상의 표지로부터 신호 방출의 증가를 검출하는 단계로서, 상기 신호의 증가는 시료 중 E. coli O157:H7 RNA가 존재함을 나타내는 것인 단계를 포함하는 시료 중 E. coli O157:H7을 검출하는 방법.