KR20110102841A - 실시간 ｐｃｒ을 위한 핵산 주형의 제조 - Google Patents

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KR20110102841A
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Abstract

본 발명은 고속 대량 실시간 PCR 분석을 위하여 세포로부터 핵산을 효율적으로 제조하는 새로운 시약 조성을 개시한다. 상기 시약은 주형을 정제하거나 별도로 분리할 필요없이 빠르게 세포를 용해시켜 주형을 제조할 수 있다. 따라서, 상기 시약은 약 35회의 적은 회수의 PCR 증폭으로도 핵산 주형의 단일 분자까지 빠르고 민감하게 Catacleave PCR 검출을 동시에 하도록 하여 실시간 PCR 분석의 결과를 극적으로 향상시킨다.

Description

실시간 ＰＣＲ을 위한 핵산 주형의 제조{Nucleic acid template preparation for real-time PCR}
본 출원은 2010년 3월 11일에 출원된 미국 가출원 제61/312,873호로부터 주장되는 우선권의 이익을 향유하며, 상기 가출원의 내용은 그 전체로 참조로서 본 명세서에 삽입된다.
본 발명은 높은 효율의 실시간 PCR 분석을 위한 주형 핵산 제조의 완충액 및 방법을 개시한다. 일 구체예에서, 상기 완충액은 표적 핵산을 포함하는 세포의 용해에 적합하다.
고속 대량 PCR 스크리닝의 구현은 현대 생물학 및 의학의 혁신적인 변화를 야기하였다. 이러한 놀랄만한 분석 기술에 의해서, 진단, 환경 모니터링, 혈액 테스트 및 유전자형 검사(genotyping) 등의 몇몇 연구 분야는 큰 영향을 받았다. 생물정보학(bioinformatics)의 등장과 함께, 과학자들은 유사이래 매우 많은 양의 유전자 정보를 분석할 수 있다. 그럼에도, 기존의 PCR 분석방법에서 고속 대량 형태로의 전환을 위해서는, 기존의 PCR 분석 방법의 장점을 유지한 채로, PCR 단계가 가능한 효율적으로 간소화되어야 한다. 이러한 변화는 특히 원핵 병원성균(prokaryotic pathogens)과 같은 살아있는 생물로부터 추출한 표적 DNA서열을 검출할 때 잘 나타난다. 이러한 과정에서 증가된 대량 처리를 하기 위해서는, PCR 검출의 민감도를 떨어뜨리지 않고 세포 용해(cell lysis) 및 PCR 증폭을 동일한 반응 완충액에서 일어나게 할 필요성이 요구된다.
본 발명은 고속 대량 실시간 PCR 분석(high throughput real-time PCR analysis)을 위해 세포로부터 얻은 핵산 주형의 효율적인 준비를 위한, 신규한 용해 시약 제형에 근거한 것이다. 상기 시약 제형은 주형의 정제 및 분리를 할 필요 없이, 신속한 세포 용해 및 주형 준비를 가능하게 한다. 그러므로, 상기 시약은 실시간 PCR 분석의 대량 처리를 현저하게 향상시킬 수 있으며, 동시에 검출 민감성을 유지할 수 있다.
따라서, 본 발명은 PCR 증폭을 30회 보다 적은 횟수로, 한 개의 핵산 주형에 대해 신속하고 민감성이 좋은 실시간 PCR 검출을 가능하게 하는 용해 시약을 이용하여, 주형 핵산을 준비하는 신규한 방법을 제공한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 실시간 PCR 증폭을 위한 핵산 주형을 준비하는 방법을 개시하고 있다. 세포는 용해 시약에서 용해되며, 상기 용해 시약은 6 내지 9 정도의 pH를 갖는 완충액, 0.125% 내지 2% 정도의 농도를 갖는 쌍성 이온 디터전트 (zwitterionic detergent), 0.3 내지 2.5 mg/ml 정도의 농도를 갖는 아지드(azide), 및 프로테아제를 포함한다. 실질적 단백질-불포함 세포 용해물을 생산하기 위하여 상기의 세포 용해물을 약 55℃에서 15분 동안 인큐베이션한다. 그 후 프로테아제를 95℃ 10분 정도 두어 불활성화 시킨다. 실질적 단백질-불포함 세포 용해물은 혼합물로 실시간 PCR 증폭 반응을 위한 주형을 제공하는데, 상기 혼합물은 세포 용해물(cell lysate) 내에 있는 표적 DNA에 어닐링할 수 있는 증폭 프라이머 쌍과; 검출 표지, 표적 DNA의 영역에 상보적인 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브(probe); 증폭 폴리머라제 활성(amplifying polymerase activity); 및 증폭 완충액; RNase H 활성(RNase H activity)을 포함한다. 첫번째 및 두번째 증폭 프라이머 사이의 표적 DNA 증폭 후에, 상기 프로브 내에 있는 RNA 서열은, 표적 DNA와 상보적인 DNA 서열과 RNA:DNA 헤테로듀플렉스(heteroduplex)를 형성할 수 있다.
RNase H 활성은 핫 스타트(hot start) RNase H 활성 또는 열안정성 RNase 활성 또는 양쪽 모두 일 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 실시간 증폭을 위한 핵산 주형을 준비하는 방법에 대한 것이다. 세포는 용해 시약에서 용해되며, 상기 용해 시약은 6 내지 9 정도의 pH를 갖는 완충액, 0.125% 내지 2% 정도의 농도를 갖는 쌍성 이온 디터전트, 0.3 내지 2.5 mg/ml 정도의 농도를 갖는 아지드를 포함한다. 세포 용해물을 약 55 ℃에서 15분 동안 배양한 후에, 세포 용해물은, 혼합물로 실시간 PCR 증폭 반응을 위한 주형을 제공하는데, 상기 혼합물은 세포 용해물 내에 있는 표적 DNA에 어닐링할 수 있는 증폭 프라이머 쌍과; 검출 표지, 표적 DNA의 영역에 상보적인 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브; 증폭 폴리머라제 활성; 및 증폭 완충액; RNase H 활성을 포함한다. 첫번째 및 두번째 증폭 프라이머 사이의 표적 DNA 증폭 후에, 상기 프로브 내에 있는 RNA 서열은, 표적 DNA와 상보적인 DNA 서열과 RNA:DNA 헤테로듀플렉스를 형성할 수 있다.
세포 용해물의 추가는, 세포 용해물 내에 있는 단일 표적 DNA 분자의 실시간 PCR 검출시에 40회 PCR 증폭 싸이클보다 적은, 35회 PCR 증폭 싸이클보다 적은, 또는 30회 PCR 증폭 싸이클보다 적은 수를 필요로 하게 한다.
어떤 구체예에서는, 증폭 반응 혼합물은 역전사 활성(reverse transcriptase activity)을 포함할 수 있다. 상기 프로브는 형광으로 표지 될 수 있다. 상기 형광 표지는 FRET 쌍일 수 있다.
또 다른 구체예에서는, 실질적인 단백질-불포함 세포 용해물은 증폭 반응 혼합물에 의해 5 내지 15배로 희석된다.
상기 세포는 리스테리아(Listeria)와 같은 그람 양성 세균 세포(gram positive bacterial cells) 또는 대장균(E. coli) 또는 살모넬라(Salmonella)와 같은 그람 음성 세포(gram negative cells) 일 수 있다.
상기 완충액은 아세테이트(acetate) 또는 포스페이트 기반의 완충액(phosphate based buffer), 3-(N-모르폴리노)프로판 술폰산(3-(N-morpholino) propane sulphonic acid : MOPS), N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에텐 술폰산) (N-(2-hydroxyethyl) piperazine-N'- (2-ethane sulphonic acid : HEPES) 또는 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판디올 완충액(2-amino-2-hydroxymethyl -1,3-propanediol buffer : Tris)일 수 있다.
상기 쌍성이온 디터전트는 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트(3-[(3-cholamidopropyl) dimethylammonio]-1-propanesulfonate : CHAPS) 일 수 있다.
상기 프로테아제는 프로테아제 K(proteinase K)일 수 있다.
또 다른 구체예에서는, 본 발명은 용해 시약을 개시하고 있다. 상기 용해 시약은 6 내지 9 정도의 pH를 갖는 완충액, 0.125% 내지 2% 정도의 농도를 갖는 쌍성 이온 디터전트, 0.3 내지 2.5 mg/ml 정도의 농도를 갖는 아지드, 및 프로테아제를 포함하며, 이때 증폭 용액으로 시약이 약 5 내지 15배 가량 희석될 때, 증폭 폴리머라제 및 RNase H 효소 활성은 억제되지 않는다.
상기 용해 시약은 아세테이트 또는 포스페이트 기반의 완충액, 3-(N-모르폴리노)프로판 술폰산, N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에텐 술폰산) 또는 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판디올 완충액을 포함하는 완충액을 포함할 수 있다.
상기 쌍성이온 디터전트는 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트일 수 있다.
또 다른 구체예에서는, 상기 용해 시약은 6 내지 8 정도의 pH를 갖는 완충액, 0.125% 내지 2% 정도의 농도를 갖는 쌍성 이온 디터전트, 0.3 내지 2.5 mg/ml 정도의 농도를 갖는 아지드, 및 프로테아제를 포함하며, 이때 프로테아제 불활성 이 후, 증폭 용액으로 상기 시약이 약 5 내지 15배 가량 희석될 때, 증폭 폴리머라제 및 RNase H 효소 활성은 억제되지 않는다.
상기 완충액은 아세테이트 기반 완충액, 3-(N-모르폴리노)프로판 술폰산, N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에텐 술폰산) 또는 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판디올 완충액을 포함할 수 있다.
상기 쌍성이온 디터전트는 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트일 수 있다.
상기 검출 방법은 빠르고, 정확하고, 민감성이 매우 높으며, 고속 대량 적용에 적합하다.
본 명세서에 개시된 구체예의 실험은, 달리 표시되어 있지 않으면, 당업계에서 알려진 통상적인 분자 생물학적 기법을 사용하였다. 이러한 기법들은 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., NY, N.Y. (1987-2008) 및 Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)를 참조하였다.
본 명세서에서 달리 정의되어 있지 않다면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적, 과학적 용어는 당업자가 일반적으로 이해하는 의미와 동일한 의미를 갖는다. 또한 본 명세서는 상세한 설명 및 청구항의 해석을 돕기 위해 용어의 정의를 제공한다. 결과적으로, 정의가 다른 정의와 일치하지 않으면, 상기 정의는 본 명세서에 설명되어 있는 것으로 규정될 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어, "세포(cell)"는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 의미할 수 있다.
일 구체예에서, 용어, "세포"는 그람 양성 세균, 그람 음성 세균, 항산성(acid-fast)세균 등을 포함하는 미생물을 의미하나, 이에 한정하지는 않는다. 일 구체예에서, 테스트될 "세포"는 면봉을 사용하여 표면의 시료를 수득할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 "세포"는 병원성 생물을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 그람 양성 세균은 예를 들어, Actinomedurae , Actinomyces israelii , Bacillus anthracis , Bacillus cereus , Clostridium botulinum , Clostridium difficile , Clostridium perfringens , Clostridium tetani , Corynebacterium , Enterococcus faecalis , Listeria monocytogenes, Nocardia , Propionibacterium acnes , Staphylococcus aureus , Staphylococcus epiderm, Streptococcus mutans , Streptococcus pneumoniae 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
본 명세서에서 사용되는 그람 음성 세균은 예를 들어, Afipia fielis , Bacteriodes, Bartonella bacilliformis , Bortadella pertussis , Borrelia burgdorferi , Borrelia recurrentis , Brucella , Calymmatobacterium granulomatis, Campylobacter , Escherichia coli , Francisella tularensis , Gardnerella vaginalis , Haemophilius aegyptius , Haemophilius ducreyi , Haemophilius influenziae , Heliobacter pylori , Legionella pneumophila , Leptospira interrogans , Neisseria meningitidia , Porphyromonas gingivalis , Providencia sturti , Pseudomonas aeruginosa , Salmonella enteridis , Salmonella typhi, Serratia marcescens , Shigella boydii , Streptobacillus moniliformis , Streptococcus pyogenes , Treponema pallidum , Vibrio cholerae , Yersinia enterocolitica, Yersinia pestis 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
본 명세서에서 사용되는 항산성 세균은 예를 들어, Myobacterium avium , Myobacterium leprae , Myobacterium tuberculosis 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
다른 구체예에서, 상기 "세포"는 상기 3가지 카테고리에 속하지 않는 다른 세균을 의미하는 것일 수 있으며, 예를 들어, Bartonella henselae , Chlamydia psittaci, Chlamydia trachomatis , Coxiella burnetii , Mycoplasma pneumoniae , Rickettsia akari , Rickettsia prowazekii , Rickettsia rickettsii, Rickettsia tsutsugamushi , Rickettsia typhi , Ureaplasma urealyticum, Diplococcus pneumoniae, Ehrlichia chafensis , Enterococcus faecium , Meningococci 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
또 다른 구체예에서, 상기 용어 "세포"는 예를 들어, Aspergilli , Candidae , Candida albicans , Coccidioides immitis , Cryptococci, 및 그의 조합을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
다른 구체예에서, 용어 "세포"는 기생 미생물을 의미하는 것일 수 있으며, 예를 들어, Balantidium coli , Cryptosporidium parvum , Cyclospora cayatanensis , Encephalitozoa, Entamoeba histolytica , Enterocytozoon bieneusi , Giardia lamblia, Leishmaniae , Plasmodii , Toxoplasma gondii , Trypanosomae , 마름모 아메바(trapezoidal amoeba) 등을 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
다른 구체예에서, 용어 "세포"는 기생충을 의미할 수 있으며(예를 들어, 선충), 구체적으로, Nematoda (원충, 예를 들어, 편충, 십이지장충, 요충, 회충, 사상충 등), Cestoda (예를 들어, 촌충) 등일 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
본 명세서에서 사용된 용어, "쌍성이온 디터전트(zwitterionic detergent)"는 양쪽성 이온 성질을 나타내는 계면 활성제를 의미하며(예를 들어, 순 전하를 띄지 않으며, 전도도(conductivity) 및 전기영동이동도(electrophoretic mobility)가 부족하며, 이온-교환 레진(ion-exchange resins)에 결합하지 않으며, 단백질-단백질 상호 작용을 절단한다.), CHAPS, CHAPSO 및 Zwittergent®(Calbiochem, San Diego, CA) 및 Anzergent® Anatrace, Inc.; Maumee, OH)의 상표명으로 판매되는 술포베테인과 같은 베테인 유도체(betaine derivatives) 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 실시하는데 이용하기 위한, 예시적인 쌍성이온 디터전트로는 n-테트라데실-N(n-Tetradecyl-N), N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트(N- dimethyl-3-ammonio-l-propanesulfonate), n-옥틸-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트(n-Octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate), n-데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트(n-Decyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-l-propanesulfonate), 및 n-도데실-N,N-디메틸-3-암모니오-1-프로판술포네이트(n- Dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate)과 같은 화학 명칭을 갖는 Zwittergent® 및 Anzergent®의 상표명으로 판매되는 것들을 포함한다.
본 발명을 예시적인 디터전트는 예를 들면 : Anzergent 3-14, (Analytical Grade); Anzergent 3-8, Analytical Grade; Anzergent 3-10, Analytical Grade; Anzergent 3-12, Analytical Grade, 또는 zwittergent 3-8, zwittergent 3-10, zwittergent 3-12 및 zwittergent 3-14, CHAPS, CHAPSO, ApolO and Apol2 와 같은 상표명으로 된 것을 구매할 수 있다.
일 구체예에서, 쌍성이온 디터전트는, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니아]-1-프로판술포네이트(미국 특허 제4,372,888호에 상술되어 있음)의 약어인, CHAPS(CAS Number: 75621-03-3; SIGMA-ALDRICH product no. C3023-1G로 이용가능)이며, 이것은 다음과 같은 구조를 갖는다:
Figure pat00001
또 다른 구체예에서, CHAPS는 총 조성물의 0.125% 내지 2% 정도의 중량/부피(W/V)의 농도로 존재한다. 또 다른 구체예에서, CHAP는 총 조성물의 0.25% 내지 1% 정도의 W/V의 농도로 존재한다. 또한, 다른 구체예에서는, CHAP는 총 조성물의 0.4% 내지 0.7% 정도의 W/V의 농도로 존재한다.
또 다른 구체예에서, 쌍성이온 디터전트는, 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-2-히드록시-1-프로판술포네이트의 약어인, CHAPS(CAS Number: 82473-24-3; available from FLUKA, Product number 26675)이며, 이것은 다음과 같은 구조를 갖는다:
Figure pat00002
또 다른 구체예에서, CHAPS는 총 조성물의 0.125% 내지 2% 정도의 중량/부피(W/V)의 농도로 존재한다. 또 다른 구체예에서, CHAP는 총 조성물의 0.25% 내지 1% 정도의 W/V의 농도로 존재한다. 또한, 다른 구체예에서는, CHAP는 총 조성물의 0.4% 내지 0.7% 정도의 W/V의 농도로 존재한다.
본 명세서에서 사용된, 용어 "완충액(buffer)"은 pKa가 25 ℃에서 약 6 내지 약 9가 되도록, 6 내지 9의 pH를 효과적으로 유지하게 할 수 있는 조성물을 의미한다. 본 명세서에서 상기 완충액은 일반적으로 효소 활성 기능과 호환가능한, 생리적으로 호환 가능한 완충액(compatible buffer)이며, 생물학적 고분자가 이들의 정상적인 생리활성 및 생화학적인 기능을 유지할 수 있도록 한다.
예시적인 완충액은 4-2-히드록시에틸-1-피페라에텐술폰산((4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid : HEPES), 3-(N-모르폴리노)-프로판술폰산(3-(N-morpholino)-propanesulfonic acid : MOPS), N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신 산(N-tris(hydroxymethyl)methylglycine acid: Tricine), 트리스(히드록시메틸)메틸아민 산(tris(hydroxymethyl)methylamine acid : Tris), 피페라진-N,N'-비스(2-에텐술폰산)(piperazine-N,N'-bis(2-ethanesulfonic acid : PIPES) 및 아세테이트(acetate) 또는 포스페이트을 포함하는 완충액(K2HPO4, KH2PO4, Na2HPO4, NaH2PO4) 및 이와 유사한 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에서, 용어 "아지드(azide)"는 -N3의 화학식을 갖는 것을 의미한다. 일 구체예에서, 아지드는 소듐 아지드(NaN3, CAS number 26628-22-8; SIGMA-ALDRICH Product number: S2002-25G로 이용가능)이며, 이것은 그람 음성 세균에서 시토크롬 산화제(cytochrome oxidase)를 억제하여 세균 발육 저해 작용을 한다.
본 명세서에서 사용된 용어,, "프로테아제(protease)"는 펩티드 결합을 가수분해하는 효소이다(프로테아제 활성을 갖는다). 또한, 프로테아제는 예를 들어, 프로테나제(proteinase), 펩티드 히드롤라제(peptide hydrolases), 또는 단백질 분해 효소(proteolytic enzymes)로서 불린다. 본 발명의 용도를 위한 프로테아제는 폴리펩티드 사슬의 내부에 작용할 수 있는 엔도형태(endo-type)일 수 있다(엔도펩티다제(endopeptidases)). 일 구체예에서, 상기 프로테아제는 세린 프로테아제(serine protease), 프로테아제 K (EC 3.4.21.64; Roche Applied Sciences, recombinant proteinase K 50 U/ml (from Pichia pastoris) Cat. No. 03 115 887 001에서 취득가능)일 수 있다.
프로테아제 K는 핵산 준비시 단백질을 분해하여, 오염을 제거하기 위하여 사용된다. 핵산 준비시 프로테아제 K를 넣으면 뉴클레아제(nuclease)를 신속히 불활성화 시킨다. 프로테아제 K를 넣지 않으면, 정제 과정에서 DNA나 RNA를 분해시킬 수 있다. 상기 효소는 단백질을 변성시키는 화합물이 존재할 때는 활성을 가지나, 95℃ 정도에서 10분 동안 존재할 경우에는 불활성화가 되기 때문에 상기의 적용에 적합하다.
프로테아제 K는 리스테리아(Listeria), 살모넬라(Salmonella) 또는 대장균(E. coli)과 같은 그람 양성 및 그람 음성 세균의 분해시에 필요하다. 또한, 상기 효소는 일반적으로 음식이나, 환경 시료(environmental samples)에 존재하는 PCR 억제제의 일부를 제거할 수 있다.
또 다른 구체예에서, 리스테리아와 같은 그람 양성 세균의 용해시 프로테아제 K(1 mg/ml)를 포함하는 용해 시약이 필요하다. 세포 용해물에서 단백질은 15분간 55℃에서 프로테아제 K를 처리함으로써 분해되며, 프로테아제 K는 95℃에서 10분간 처리함으로써 불활성화된다. 냉각후에, 실질적인 단백질-불포함 용해물은 고 효율의 PCR 증폭에 호환 적합성이 있다.
프로테아제 K에 추가하여 또는 대체하여, 용해 시약은 트립신(trypsin), 키모트립신(chymotrypsin), 엘라스타제(elastase), 서브틸신(subtilisin), 스트렙토그리신(streptogrisin), 써미타제(thermitase), 아쿠아라이신(aqualysin), 플라스민(plasmin), 큐큐미신(cucumisin), 또는 카르복시펩티다제 A, D, C 또는 Y(carboxypeptidase A, D, C, 또는 Y)와 같은 세린 프로테아제를 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "용해물(lysate)"은 용해된 세포 잔해 및 핵산이 있는 액상을 의미한다.
본 명세서에서 사용하고 있는 용어, "실질적으로 단백질 불포함(substantially protein free)"은 대부분의 단백질이 프로테아제에 의한 단백질 가수 분해에 의해 불활성화된 용해물을 의미한다. 세포 용해 동안 프로테아제 K의 추가는 빠르게 뉴클레아제를 불활성화시킨다. 프로테아제 K를 넣지 않으면, 정제 과정에서 DNA나 RNA를 분해시킬 수 있다. 상기 실질적으로 단백질이 불포함된 용해물은 불활성인 단백질을 제거하기 위하여 처리 과정을 있을 수도, 또는 없을 수도 있다.
본 명세서에서, "증폭 폴리머라제 및 RNase H 효소 활성을 억제하지 않는다(does not inhibit said amplifying polymerase and RNase H enzymatic activities)"는 문구는 용해 시약이 증폭 폴리머라제 및 RNase H 활성을, 용해 시약이 부존재시에 증폭 폴리머라제 및 RNase 효소 활성과 비교하여 0% 또는 1% 미만, 또는 2% 미만, 또는 5% 미만, 또는 10% 미만, 또는 25% 미만으로 활성을 감소시키는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "핵산(nucleic acid)"은 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 의미하며, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드는 변형되거나, 변형된 염기를 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 2 내지 60 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드의 단일 가닥 중합체이다. 폴리뉴클레오티드는 2 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드의 중합체이다. 폴리뉴클레오티드는 제2 가닥이 제1 올리고뉴클레오티드의 역 상보적(reverse complement) 서열의 올리고뉴클레오티드와 어닐링된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 이중 가닥 DNA, 디옥시티미딘을 포함하는 단일-가닥 핵산 중합체, 단일 가닥 RNA, 이중 가닥 RNA 또는 RNA/DNA 헤테로듀플렉스를 포함하는 단일 가닥 핵산 중합체일 수 있다. 핵산은 게놈 DNA, cDNA, hnRNA, snRNA, mRNA, rRNA, tRNA, 절편화된 핵산, 미토콘드리아 또는 엽록체와 같은 세포 소기관으로부터 얻은 핵산, 및 미생물로부터 얻은 핵산 또는 생물학적 시료 내 또는 위에 존재할 수 있는 DNA 또는 RNA 바이러스를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 핵산은 예를 들어, RNA 및 DNA의 경우와 같이 한 종류의 당 모이어티(moiety)로 구성되어 있거나, 또는 예를 들어, RNA/DNA 키메라(chimera)의 경우와 같이, 서로 다른 당 모이어티의 혼합일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표지(lable)" 또는 "검출가능한 표지(detectable label)"는 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 중합체, 또는 핵산 결합 인자에 결합된 어떠한 화학적 모이어티를 의미할 수 있으며, 상기 결합은 공유 결합 또는 비공유 결합일 수 있다. 바람직하게는, 상기 표지는 검출 가능하며, 본 발명의 실험자에게 검출될 수 있는 상기 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 중합체일 수 있다. 검출가능한 표지는 발광 분자, 화학 발광 분자, 형광 색소, 형광 퀀칭제(quenching agent), 색깔 분자, 방사성 동위원소 또는 신틸런트(scintillant)를 포함한다. 검출가능한 표지는 또한, 임의의 유용한 링커 분자 (예를 들어, 비오틴, 아비딘, 스트랩트아비딘, HRP, protein A, protein G, 항체 또는 그의 단편, Grb2, 폴리히스티딘, Ni2+, FLAG 태그, myc 태그), 중금속, 효소(예를 들어. 알칼라인 포스파타제, 퍼옥시다제 및 루시퍼라제), 전자 공여체(donor)/수용체(acceptor), 아크리디늄 에스테르, 염료(dye) 및 열량 측정 기질(calorimetric substrate)를 포함한다. 또한, 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance) 검출의 경우와 같이, 질량의 변화(a change in mass)를 나타내는데 검출가능한 표지가 고려될 수 있다. 당업자는 상기 언급되지 않은 유용한 검출가능한 표지에 대해서도 용이하게 인식할 수 있을 것이며, 이들 또한 본 발명의 실시에 사용될 수 있다.
단지, 설명적인 목적을 위해, 핵산 주형 제조를 위한 용해 시약을 사용하여 병원성 세균인 살모넬라를 CataCleave PCR 또는 RT-PCR로 검출하는 방법의 내용을 하기 설명한다. CataCleave PCR은 이후 설명될 것이다.
살모넬라 표적 서열의 선택
본 명세서에서 사용된 용어, "표적(target)"핵산 서열은 검출되거나 또는 특성 파악을 위한 핵산 서열 또는 구조를 의미한다. 표적 핵산 서열은 예를 들어, 게놈 DNA 또는 게놈 RNA를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다. 일 구체예에서, "표적" 핵산 서열은 PCR 반응 또는 역전사 PCR 반응에서 증폭을 위한 주형으로 제공될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 "표적" 핵산 서열은 생물의 핵산 내에 존재하는 핵산 서열 또는 다른 종의 핵산에는 존재하지 않는, 그의 상보적인 서열을 의미할 수 있다.
일 구체예에서, DNA 증폭을 위한 표적이 되는 살모넬라 속 세균의 핵산 서열은 우선 당업계에 알려진 살모넬라 속 세균의 핵산 서열로부터 선택하였다. 본 명세서에서 사용된 용어, "살모넬라 표적 서열(Salmonella target sequence)", 또는 "살모넬라 속 세균의 표적 서열은 살모넬라 속에 속하는 박테리아의 핵산 서열을 포함하는 DNA 또는 RNA 서열을 의미한다. 이는 아종: enterica (I), salamae (II), arizonae (IIIa), diarizonae (IIIb), houtenae (IV), 및 indica (VI)을 포함하나. 이에 한정하지 않는 살모넬라 엔테리카 및 살모넬라 봉고리 종을 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 예를 들어, 아종 살모넬라 엔테리카의 혈청군 및 혈청형(serovar)은 미국 특허 제7,659,381호에서 확인할 수 있으며, 이는 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명에 따른 증폭을 위해 표적이 되는 예시적인 살모넬라 핵산 서열은 하기 문헌에 개시되어 있으며, 이는 본 명세서에 참조로서 삽입된다: Liu WQ et al., "Salmonella paratyphi C: genetic divergence from Salmonella choleraesuis and pathogenic convergence with Salmonella typhi", PLoS One, 2009;4(2):e4510; Thomson NR et al., "Comparative genome analysis of Salmonella enteritidis PT4 and Salmonella gallinarum 287/91 provides insights into evolutionary and host adaptation pathways," Genome Res, 2008 Oct;18(10):1624-37; Encheva V et al., "Proteome analysis of serovars typhimurium and Pullorum of Salmonella enterica subspecies I.", BMC Microbiol, 2005 Jul 18;5:42; McClelland M et al., "Comparison of genome degradation in Paratyphi A and Typhi, human-restricted serovars of Salmonella enterica that cause typhoid", Nat Genet, 2004 Dec;36(12):1268-74; Chiu CH et al., "Salmonella enterica serotype Choleraesuis: epidemiology, pathogenesis, clinical disease, and treatment," Clin Microbiol Rev, 2004 Apr;17(2):311-22; Deng W et al., "Comparative genomics of Salmonella enterica serovar Typhi strains Ty2 and CT18," J Bacteriol, 2003 Apr;185(7):2330-7; Parkhill J et al., "Complete genome sequence of a multiple drug resistant Salmonella enterica serovar Typhi CT18.", Nature, 2001 Oct 25;413(6858):848-52; McClelland M et al., "Complete genome sequence of Salmonella enterica serovar typhimurium LT2,"Nature, 2001 Oct 25;413(6858):852-6. Salmonella enterica subsp. enterica serovar typhimurium str. LT2의 완전한 게놈(4857432 bp)의 예시적인 뉴클레오티드 서열은 Genbank Accession No. NC_003197에서 확인할 수 있다.
일 구체예에서, 표적 살모넬라 InvA 핵산 서열에 어닐링되는 상기 증폭 프로브는 서열 번호 3의 서열을 갖는 것일 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 표적 핵산 서열은 하기 DNA 서열을 갖는 살모넬라-특이적인 InvA 유전자 핵산 서열이다:
서열 번호 4, 살모넬라 엔테리카 InvA 유전자 (GenBank Accession No.: U43272.1):
AACAGTGCTCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGTACTAATGGTGATGATCATTTCT
ATGTTCGTCATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCCTGATCGCACTGAATATCGTA
CTGGCGATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCAACG
TTTCCTGCGGTACTGTTAATTACCACGCTCTTTCGTCTGGCATTATCGATCAGTACCAGC
CGTCTTATCTTGATTGAAGCCGATGCCGGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATTCGTT
ATTGGCGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCAGTTT
ATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGCGTCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGAT
GGTATGCCCGGTAAACAGATGAGTATTGATGCCGATTTGAAGGCCGGTATTATTGATGCG
GATGCTGCGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTTTACGGTTCCTTT
GACGGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGCTATTGCCGGCATCATTATTATCTTTGTG
AACTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGGATGACCCGCCATGGTATGGATTTGTCCTCCGCT
CTGTCTACTTATACCATGCTGACCATTGGTGATGGTCTTGTCGCCCAGATCCCCGCATTG
TTGATTGCGATTAGTGCCGGTTTTATCGTGACTCGCGTAAATGGCGATAGCGATAATATG
GGGCGGAATATCATGACGCAGCTGTTGAACAACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATT
TTGACCATTTCAATGGGAACTCTGCCGGGATTCCCGCTGCCGGTATTTGTTATTTTATCG
GTGGTTTTAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACGTAGCGCCGCCAAA
CCTAAAACCAGCAAAGGCGAGCAGCCGCTTAGTATTGAGGAAAAAGAAGGGTCGTCGTTG
GGACTGATTGGCGATCTCGATAAAGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGATATTACTTGTG
CCGAAGAGCCGGCGTGAAGATCTGGAAAAAGCTCAACTTGCGGAGCGTCTACGTAGTCAG
TTCTTTATTGATTATGGCGTGCGCCTGCCGGAAGTATTGTTACGCGATGGCGAGGGCCTG
GACGATAACAGCATCGTATTGTTGATTAATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCTAT
TTTGATTTGATGCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGTCGTGTCCTTTGGTATTAATCCA
ACAATCCATCAGCAAGGTAGCAGTCAGTATTTCTGGGTAACGCATGAAGAGGGGGAGAAA
CTCCGGGAGCTTGGCTATGTGTTGCGGAACGCGCTTGATGAGCTTTACCACTGTCTGGCG
GTGACCGTGGCGCGCAACGTCAATGAATATTTCGGTATTCAGGAAACAAAACATATGCTG
GACCAACTGGAAGCGAAATTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCTCAGACATGCCACGGTA
CAACGTATATCTGAAGTTTTGCAGCGTTTATTAAGCGAACGTGTTTCCGTGCGTAATATG
AAATTAATTATGGAAGCGCTCGCATTGTGGGCGCCAAGAGAAAAAGATGTCATTAACCTT
GTAGAGCATATTCGTGGAGCAATGGCGCGTTATATTTGTCATAAATTCGCCAATGGCGGC
GAATTACGAGCAGTAATGGTATCTGCTGAAGTTGAGGATGTTATTCGCAAAGGGATCCGT
CAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTCAGCCTTGACCCGGAAGCCTCCGCTAATTTGATGGAT
CTCATTACACTTAAGTTGGATGATTTATTGATTGCACATAAAGATCTTGTCCTCCTTACG
TCTGTCGATGTCCGTCGATTTATTAAGAAA
본 명세서에서 사용된 용어, "프라이머(primer)" 또는 "증폭 프라이머(amplification primer)"는 PCR 반응에서 DNA 합성을 시작하기 위한 시작점으로서 작용하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머는 일반적으로 15 내지 35개의 뉴클레오티드이며, 상기 표적 서열에 상보적인 영역과 혼성화된다. 올리고뉴클레오티드는 적절한 방법(예를 들어, 화학적 합성)에 의해 합성되고 제작될 수 있으며, 이는 당업계에 잘 알려져 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 상업적인 출처를 통해 편리하게 입수할 수 있다.
당업자는 프라이머를 용이하게 최적화하고 확인할 수 있을 것이다. 최적의 프라이머/프로브 세트를 고안하는데 다수의 컴퓨터 프로그램(예를 들어, Primer-Express)을 용이하게 사용할 수 있다. 제공되는 핵산 정보(또는 accession number로 공중 이용 가능한 정보)에 기초하여 프라이머와 프로브를 그에 따라 제조할 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다.
일 구체예에서, 증폭 프라이머 세트(즉, 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머)는 서열 번호 1 및 2의 프라이머 세트일 수 있다.
5'-TCG TCA TTC CAT TAC CTA CC(서열 번호 1)
5'-tac tga tcg ata atg cca gac gaa(서열 번호 2)
"프라이머 이합체(primer dimer)"는 PCR에서 잠재적으로 발생할 수 있는 부산물(by-product)로서, 프라이머 내의 일련의 상보적인 염기로 인해 서로 부분적으로 혼성화되는 프라이머 분자로 구성된다. 그 결과, DNA 폴리머라제는 프라이머 이합체를 증폭하게 되고, PCR 반응액과 경쟁을 유발하므로, 따라서 잠재적으로 PCR 증폭을 위해 표적이 되는 DNA 서열의 증폭을 저해한다. 실시간 PCR에서, 프라이머 이합체는 민감도를 감소시켜 정확한 정량(quantification)을 방해한다.
살모넬라의 검출을 위한 프라이머 서열이 프라이머-이합체의 형성에 대하여 스크리닝된다. PCR 반응은 Sybr Green I의 존재 하에 정방향 및 역방향 프라이머 세트를 사용하여 수행되었다. 이 염료의 형광 방출 강도는 듀플렉스(duplex) DNA 내에 염료이 삽입될 때 증가하므로 핵산 증폭 반응에서 비-특이적인 프로브로서 제공될 수 있다. 상기 반응은 800 nM의 정방향 및 역방향 프라이머, 열안정성 DNA 폴리머라제, 및 Sybr Green I을 포함하는 적절한 반응 완충액에서 수행된다. 온도 싸이클링(cycling) 조건은 95℃에서 5 분, 이후 95℃에서 15초, 55℃에서 15초, 및 72℃에서 30초를 40회 반복한다. 실시간 데이터는 72℃ 단계에서 수집한다. 증가된 Sybr Green I 형광 방출의 결과는 Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System 또는 Biorad CFX96 real-time PCR thermocycler와 같은 적절한 장치를 사용하여 실시간으로 검출할 수 있다. 프라이머-이합체 형성은 프라이머-특이적인 주형 DNA의 존재 하에서 보이는 바와 유사한, 특징적인 s자형의 방출 프로파일을 야기한다. 본 명세서에서 용어, "어닐링(annealing)" 및 "혼성화(hybridization)"는 혼용될 수 있으며, 하나의 핵산과 다른 핵산이 염기쌍 형성 상호 작용에 의해 듀플렉스, 트리플렉스(triplex), 또는 다른 고차원 구조의 형성을 야기하는 것을 의미한다. 일 구체예에서, 일차 상호 작용은, 예를 들어, A/T 및 G/C와 같이, Watson/Crick 및 Hoogsteen-type 수소 결합에 의한 염기 특이적이다. 일 구체예에서, 또한, 염기-스태킹(base-stacking) 및 소수성 상호 작용이 듀플렉스 안정성에 기여할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "실질적으로 상보적인(substantially complementary)"은 서열 내에서 충분히 상보적인 2개의 핵산 가닥이 어닐링되고 안정적인 듀플렉스를 형성하는 것을 의미한다. 상기 상보성은 완전할 필요는 없다; 예를 들어, 2개의 핵산 사이에 염기 쌍의 미스매치(mismatch)가 몇개 정도 있을 수 있다. 그러나, 미스매치의 숫자가 너무 많아서 최소한의 엄격한 혼성화 조건에서 조차 혼성화가 일어나지 않는 경우에는, 상기 서열은 실질적으로 상보적인 서열이 아니다. 본 명세서에서 2개의 서열이 "실질적으로 상보적인" 것으로 해석되면, 상기 서열은 엄격한 혼성화 조건과 같이 선택된 반응 조건 하에서 서로가 혼성화될 수 있도록 충분히 상보적인 것을 의미한다. 특이성을 달성할 수 있는 충분한 핵산의 상보성과 혼성화의 엄격성의 관계는 당업계에 잘 알려져 있다. 2개의 실질적으로 상보적인 가닥은, 예를 들어, 완전하게 상보적이거나 또는 예를 들어, 쌍을 이루는 서열 및 쌍을 이루지 않는 서열 사이의 차이점을 충분히 허용하는 한 1 내지 다수의 미스매치를 포함할 수 있다. 따라서, "실질적으로 상보적인" 서열은 이중 가닥 구역에서 100, 95, 90, 80, 75, 70, 60, 50% 이하, 또는 상기 숫자 사이의 어떠한 %의 염기쌍 상보성을 갖는 서열을 의미할 수 있다.
당업자는 원하는 살모넬라 게놈 서열을 증폭할 수 있는 PCR 프라이머를 고안하는 방법을 알 것이다. 합성된 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 약 55℃의 Tm 을 갖는, 20 내지 26개의 염기쌍이다.
테스트 시료에서 박테리아 핵산 서열을 위한 부유화(enrichment)
표적 살모넬라 서열을 검출하는 하나의 예시적인 방법은 식품 시료 또는 표면 채취물을 제공하는 단계, 시료 또는 채취물과 성장 배지를 혼합하고, 배양하여 살모넬라의 수 또는 군집을 증가시키는 단계(부유화(enrichment)), 살모넬라 세포를 파쇄하는 단계(용해(lysis)), 및 상기 얻은 용해물(lysate)을 표적 살모넬라 서열의 증폭 및 검출에 적용하는 단계를 포함한다. 식품 시료는 연어와 같은 생선류, 우유와 계란과 같은 낙농제품, 가금류, 과일 쥬스, 분쇄 돈육, 돈육, 분쇄 우육 또는 우육과 같은 고기류, 시금치 또는 알파파 스프라우트(alfalfa sprout)와 같은 채소류, 또는 땅콩 버터와 같은 가공된 견과류를 포함할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.
식품 오염에 대한 검출 한계(limit of detection, LOD)는 25 g의 고체 또는 25 ml의 액체 식품 또는 한정된 공간의 표면에서 검출될 수 있는 콜로니 형성 유니트(colony forming units, CFU)의 수에 관하여 설명된다. 정의에 의하면, 콜로니 형성 유니트는 살아있는 박테리아 수의 측정이다. 죽거나 살아있는 모든 세포를 세는 간접적인 현미경 계수법과는 다르게, CFU는 살아있는 세포를 측정한다. 1 CFU (하나의 박테리아 세포)는 성장하여 허용되는 조건 하에서 아가 플레이트 상에 하나의 콜로니를 형성한다. United States Food Testing Inspection Service에서는 최소 LOD를 고체 식품 25 g 또는 액체 식품 25 mL의 고체 식품 당 1 CFU 또는 표면 구역 당 1 CFU로 정의한다.
실제로, 1 CFU로 식품 시료 또는 표면을 반복적으로 접종하고, 부유화 과정에서 박테리아가 살아남도록 하는 것은 불가능하다. 이러한 문제는 하나 또는 여러 표적 레벨에 시료를 접종하고 최적 확수법(Most Probable Number, MPN)라고 불리는 통계적 평가를 사용하여 결과를 분석함으로서 극복될 수 있다.
예를 들어, 살모넬라 배양은 분광측정계에서 흡광도를 측정함으로써 구체적인 세포 밀도로 자랄 수 있다. 상기 표적의 10배 연속적 희석을 통해 아가 배지에 도말하고, 살아있는 박테리아를 계수한다. 이러한 데이터는 도말된 세포 밀도에 대한 CFU/부피에 관한 표준 곡선을 생성하는데 사용된다. MPN이 의미있기 위해서, 여러 접종 레벨에서의 시험 시료가 분석된다. 부유화 및 추출 후에 소량의 시료가 실시간 분석을 위해 제거된다. 최종 목표는 25% 내지 75% 사이(즉, CataCleave 프로브를 사용하여 역전사 효소-PCR을 이용한 어세이에서 양성 시료 테스트의 25% 내지 75% 사이로, 이는 하기에서 설명될 것이다.)의 유효화율(fractional recovery)을 달성하는 것이다. 이러한 유효화율 퍼센트를 선택하는 이유는 고체 식품의 시료 25 g, 액체 식품의 시료 25 mL, 또는 표면의 한정된 공간에 대하여 0.3 CFU 내지 1.375 CFU 사이의 MPN 값으로 변환되기 때문이다. 이들 MPN 값은 요구되는 1 CFU/시료의 LOD로 묶을 수 있다. 실제로, 이들의 유효화율을 달성하기 위해 희석된 접종원의 부피를 측정(표준 곡선에 기초)하는 것이 가능하다.
핵산 주형의 제조
세포를 용해시키기 위한 시약은 pH 약 6 내지 8의 완충액; 약 0.125% 내지 약 2% 농도의 쌍성이온 디터전트(zwitterionic detergent); 약 0.3 내지 약 2.5 mg/ml 농도의 아지드를 포함할 수 있다. 살모넬라 또는 대장균과 같은 그람 음성 세균의 용해를 위해서, 상기 용해 시약은 선택적으로 프로테나제 K와 같은 프로테아제를 포함할 수 있다. 그러나, 프로테나제 K와 같은 프로테아제는 그람 양성 세균으로부터 PCR 주형 핵산을 준비하기 위해서도 요구된다.
일 구체예에서, 1x 용해 시약은 12.5 mM의 Tris 아세테이트 또는 Tris-HCl 또는 HEPES(pH = 7 내지 8), 0.25% (w/v) CHAPS, 0.3125 mg/ml 소듐 아지드를 포함하도록 제조된다. 이후, 45 ml의 1x 용해 시약을 5 ml의 부유화(enrichment) 시료에 첨가하고, 55℃에서 15분 동안 인큐베이션한다.
그람 음성 세균의 용해를 위해, 1 mg/ml의 프로테나제 K가 상기 용해 시약에 첨가될 수 있다. 55℃에서 15분 동안 인큐베이션한 후, 프로테나제 K를 95℃에서 10분 동안 불활성화시켜 높은 효율의 PCR 또는 역전사 PCR 분석에 적합한 실질적으로 단백질이 불포함된 용해물을 제조한다.
살모넬라 표적 핵산 서열의 PCR 증폭
프라이머가 선택되고, 표적 핵산을 포함하는 세포 불포함 용해물이 준비되면(실시예 참조), 핵산 증폭은 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 핵산 서열 기반 증폭 (NASBA), 리가제 연쇄 반응 (LCR), 및 롤링 서클 증폭 (RCA)을 포함한 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기 중합효소 연쇄 반응은 특이적인 표적 DNA 서열을 증폭하는데 가장 일반적으로 사용되는 방법이다.
"중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)" 또는 "PCR"은, 일반적으로 원하는 뉴클레오티드 서열을 인 비트로(in vitro)에서 증폭하는 방법을 의미한다. 상기 과정은 미국 특허 제4,683,202호, 제4,683,195호, 제4,800,159호, 및 제4,965,188호에 상세하게 설명되어 있으며, 상기 내용은 전체로서 본 명세서에 삽입된다. 일반적으로, 상기 PCR 과정은 2배 몰농도 이상 과량의, 상기 이중 가닥 표적 서열의 반대 가닥에 상보적인 올리고뉴클레오티드 프라이머를 원하는 표적 서열(들)을 포함하는 반응 혼합물에 넣는 단계로 이루어져 있다. 상기 반응 혼합물은 DNA 폴리머라제의 존재 하에 온도 싸이클링(thermal cycling) 프로그램에 적용하여, 상기 DNA 프라이머 세트 사이의 원하는 표적 서열을 증폭하도록 한다.
일 구체예에서 사용될 수 있는 살모넬라-특이적 프라이머는 서열 번호 1 또는 2의 DNA 서열을 가질 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 사용될 수 있는 프로브(때로는 "CataCleave 프로브"를 의미한다)는 하기 서열을 가질 수 있다:
5'-/FAM/CGATCAGrGrArArATCAACCAG/IABFQ) (서열 번호 3)이 서열 번호 1 및 2의 프라이머 세트와 함께 사용될 수 있다(상기 소문자 "r"은 RNA 염기를 의미한다(즉 rG는 리보구아노신이다.).
본 명세서에서 사용된 용어, "PCR 절편(PCR fragment)" 또는 "역전사 효소-PCR 절편(reverse transcriptase-PCR fragment)" 또는 "앰플리콘(amplicon)"은 특정한 표적 핵산의 증폭에 따라 생성되는 폴리뉴클레오티드 분자(또는 집합적으로 분자의 다수)를 의미한다. PCR 절편은 일반적으로, DNA PCR 절편을 의미하나, 이에 한정하는 것은 아니다. PCR 절편은 단일 가닥 또는 이중 가닥, 또는 임의의 농도비에 따른 그의 혼합물일 수 있다. PCR 절편 또는 역전사 효소-PCR 절편은 100-500개의 뉴클레오티드 또는 그 이상일 수 있다.
증폭 "완충액(buffer)"은 증폭 반응에 첨가되어 상기 증폭 반응을 조절함으로서 상기 증폭 반응의 하나 이상의 요소의 안정성, 활성, 및/또는 수명을 변형시키는 화합물이다. 본 발명의 상기 완충액은 PCR 증폭 및 RNase H 절단 활성과 양립할 수 있다. 완충액의 예는, HEPES (4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), MOPS(3-(N-모르폴리노)-프로판숲론산), 및 아세테이트 또는 포스페이트를 포함하는 완충액 등을 포함하나 이에 한정하지는 않는다. 또한, PCR 완충액은 일반적으로 약 70 mM 이하의 KCl 및 약 1.5 mM 또는 그 이상의 MgCl2, 약 50-200 uM의 각각의 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함할 수 있다. 본 발명의 완충액은 효율적인 역전사 효소-PCR 또는 PCR 반응을 최적화시키기 위해 첨가물을 포함할 수 있다.
첨가물은 상기 조성물의 하나 이상의 요소의 안정성, 활성, 및/또는 수명을 변형시키는 조성물에 첨가되는 화합물이다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 증폭 반응 조성물이다. 일 구체예에서, 첨가물은 오염된 효소의 불활성화, 단백질 접힘의 안정화, 및/또는 응집의 감소에 영향을 미친다. 증폭 반응에 포함될 수 있는 첨가물의 예는 베타인, 포름아미드, KCl, CaCl2, MgOAc, MgCl2, NaCl, NH4OAc, NaI, Na(CO3)2, LiCl, MnOAc, NMP, 트레할로스, 데미에틸술폭시드("DMSO"), 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 디티오트레이톨("DTT"), 피로포스파타제(Thermoplasma acidophilum 무기 피로포스파타제(inorganic pyrophosphatase, TAP)를 포함하나, 이에 한정하지 않는다.), 우혈청 알부민("BSA"), 프로필렌 글리콜, 글리신아미드, CHES, 퍼콜(Percoll), 아우린트리카르복실산, Tween 20, Tween 21, Tween 40, Tween 60, Tween 85, Brij 30, NP-40, Triton X-100, CHAPS, CHAPSO, Mackernium, LDAO(N-도데실-N,N-디메틸아민-N-옥시드), Zwittergent 3-10, Xwittergent 3-14, Xwittergent SB 3-16, Empigen, NDSB-20, T4G32, E. Coli SSB, RecA, 닉킹 엔도뉴클레아제(nicking endonucleases), 7-디아자G, dUTP, 음이온 디터전트(anionic detergent), 양이온 디터전트(cationic detergent), 비-이온 디터전트(non-ionic detergent), zwittergent, 스테롤, 삼투조절물질(osmolyte), 양이온, 및 증폭의 효율을 변화시킬 수 있는 기타 화합물, 단백질, 또는 보조인자를 포함하나, 이에 한정하지 않는다. 일 구체예에서, 2 이상의 첨가물이 증폭 반응에 포함된다. 상기 첨가물이 RNase H의 활성을 방해하지 않는다면, 첨가물은 프라이머 어닐링의 선택성을 향상시키기 위해 선택적으로 첨가될 수 있다.
본 명세서에서 용어, "증폭 폴리머라제 활성(amplifying polymerase activity)" 또는 "증폭 활성(amplifying activity)"은 열안정성 DNA 폴리머라제와 연관된 활성과 같이, 핵산 증폭과 관련된 효소 활성을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, 효소에 적용되는 "열안정성(thermostable)"은 상승된 온도(예를 들어, 55℃ 이상)에서 생물학적 활성을 유지하거나, 또는 가열 및 냉각의 반복된 싸이클에 따라 생물학적 활성을 유지하는 효소를 의미한다. 열안정성 폴리뉴클레오티드 폴리머라제는 특별히 PCR 증폭 반응에서 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "열안정성 폴리머라제(thermostable polymerase)"는 열에 상대적으로 안정하며, 각각의 PCR 싸이클 이전에 효소를 첨가할 필요를 제거한 효소이다. 열안정성 폴리머라제의 비-제한적인 예는 호열성 박테리아인 Thermus aquaticus (Taq 폴리머라제), Thermus thermophilus (Tth 폴리머라제), Thermococcus litoralis (Tli 또는 VENT 폴리머라제), Pyrococcus furiosus (Pfu 또는 DEEPVENT 폴리머라제), Pyrococcus woosii (Pwo 폴리머라제) 및 다른 Pyrococcus 종, Bacillus stearothermophilus (Bst 폴리머라제), Sulfolobus acidocaldarius (Sac 폴리머라제), Thermoplasma acidophilum (Tac 폴리머라제), Thermus rubber (Tru 폴리머라제), Thermus brockianus (DYNAZYME 폴리머라제) Thermotoga neapolitana (Tne 폴리머라제), Thermotoga maritime (Tma) 및 Thermotoga 속의 다른 종(Tsp 폴리머라제), 및 Methanobacterium thermoautotrophicum (Mth 폴리머라제)로부터 분리한 폴리머라제를 포함할 수 있다. 상기 PCR 반응은 더욱 효율적인 표적 서열의 증폭을 야기하는 상보적인 성질을 갖는 하나 이상의 열안정성 폴리머라제 효소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 높은 진행성(processivity)(넓은 뉴클레오티드 구획을 카피할 수 있는 능력)을 갖는 뉴클레오티드 폴리머라제는 교정 능력(proofreading capability)(표적 핵산 서열의 신장 동안 실수를 바르게 수정할 수 있는 능력)을 갖는 다른 뉴클레오티드 폴리머라제와 상호 보완될 수 있으므로, 높은 피델리티(fidelity)를 갖는 긴 표적 서열을 복제할 수 있는 PCR 반응을 생성할 수 있다. 상기 열안정성 폴리머라제는 야생형으로 사용될 수 있다. 대안으로, 상기 폴리머라제는 상기 효소의 절편을 포함하거나 또는 상기 PCR 반응을 증진시킬 수 있는 유리한 특징을 제공하는 돌연변이를 포함하도록 변형될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 열안정성 폴리머라제는 Taq 폴리머라제일 수 있다. AmpliTaq, AmpliTaq Stoffel fragment, SuperTaq, SuperTaq plus, LA Taq, LApro Taq, 및 EX Taq를 포함하는, 향상된 특징을 가진 Taq 폴리머라제의 다양한 변형체가 알려져 있다.
살모넬라 RNA 표적 핵산 서열의 역전사 효소-PCR 증폭
유전자 발현을 연구하기 위해 가장 광범위하게 사용되는 기법 중 하나가 PCR에 의한 증폭을 위해 mRNA 서열(들)을 주형으로 최초-가닥 cDNA를 활용하는 것이다. 종종 PCR 또는 역전사 효소-PCR로서 해석되는, 상기 방법은 PCR 과정의 높은 민감성 및 특이성을 이용하며, RNA의 검출 및 정량에 광범위하게 사용된다.
본 명세서에서 사용된 용어, "역전사 효소 활성(reverse transcriptase activity)"는 단일 가닥 RNA 주형으로부터 상보적인 DNA 가닥 또는 cDNA의 합성을 촉매하는 RNA-의존성 DNA 폴리머라제와 관련된 활성을 의미한다.
종점(end-point) 또는 실시간 어세이로서 수행되는 상기 역전사 효소-PCR 과정은 두 단계의 분리된 분자적 합성을 포함한다: (i) RNA 주형으로부터 cDNA의 합성; 및 (ii) PCR 증폭을 통해 새로 합성된 cDNA의 복제. 역전사 효소-PCR와 종종 연관된 기술적인 문제를 처리하기 위한 시도로, 상기 과정의 3가지 기본적인 단계를 고려하여 다수의 프로코콜이 개발되었다: (a) RNA의 변성(denaturation) 및 역방향 프라이머의 혼성화; (b)cDNA의 합성; 및 (c) PCR 증폭. 소위 "연결되지 않은된(uncoupled)" 역전사 효소-PCR 과정(예를 들어, 투 스텝(two step) 역전사 효소-PCR)에서 역전사는 역전사 효소 활성을 위한 최적의 완충액 조건을 사용하여 독립적인 단계로서 수행된다. cDNA 합성에 이어, 상기 반응은 Taq DNA 폴리머라제 활성에 최적인 조건으로 MgCl2 및 디옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트(dNTP) 농도가 감소하도록 희석한 다음, PCR을 표준 조건(미국 특허 제4,683,195호 및 제4,683,202호를 참조한다.)에 따라 수행한다. 이에 반해, "연결된(coupled)" 역전사 효소 PCR 방법은 역전사 효소 및 Taq DNA 폴리머라제 활성을 위하여 공통의 완충액을 사용한다. 제1 버전에서, 역방향 프라이머의 어닐링은 효소의 첨가 이전 분리된 단계이며, 이후 단일 반응 용기에 첨가한다. 다른 버전에서, 역전사 효소 활성은 열안정성 Tth DNA 폴리머라제의 구성 요소이다. 어닐링 및 cDNA 합성은 Mn2 +의 존재 하에서 수행되며, 이후 PCR은 킬레이트 시약에 의해 Mn2 +가 제거된 후에 Mg2 +의 존재 하에서 수행된다. 마지막으로, 상기 "연속적인(continuous)" 방법(예를 들어, 원 스텝(one step) 역전사 효소-PCR)은 상기 역전사 효소-PCR 3 단계를 성분 또는 효소 첨가를 위한 반응 튜브의 개방을 방지하는 하나의 연속적인 반응으로 통합한다. 연속적인 역전사 효소-PCR은 열안정성 Taq DNA 폴리머라제 및 Tth 폴리머라제의 역전사 효소 활성을 사용하는 단일 효소 시스템 및 시작 온도가 65℃인 AMV 역전사 효소 및 Taq DNA 폴리머라제를 사용하는 2 효소 시스템으로서 설명된다. RNA 변성 단계는 생략한다.
실시간에서 첫단계인, 역전사 PCR은 주형 특이적인 DNA 프라이머의 하나를 사용하여 상보적인 DNA 가닥을 생성한다. 전통적인 PCR 반응에서 이 생성물은 변성되고, 제2 주형 특이적인 프라이머가 상기 cDNA에 결합하여, 듀플렉스 DNA를 형성하도록 확장된다. 이 생성물은 온도 싸이클링의 다음 단계에서 증폭된다. 가장 높은 민감성을 유지하기 위해, cDNA의 합성 전에 상기 RNA는 분해되지 않는 것이 중요하다. RNA:DNA 하이브리드는 RNase H의 기질이 될 수 있기 때문에 반응 완충액에서 RNase H의 존재는 상기 과정의 첫 단계에서 형성되는 RNA:DNA 하이브리드의 원하지 않는 분해를 야기할 것이다. 이러한 문제를 극복하는 2가지 주요 방법이 존재한다. 하나는 DNA 변성 단계 시작의 높은 온도 동안에 녹을 수 있는 왁스와 같은 막을 사용함으로써 역전사 반응의 나머지로부터 RNase H를 물리적으로 분리하는 것이다. 두번째 방법은 일반적으로 45-55℃인 역전사 온도에서 불활성화되도록 RNase H를 변형시키는 것이다. RNase H를 항체와 반응시키거나, 또는 가역적인 화학 변형을 포함한 여러 방법이 당업계에 알려져 있다. 예를 들어, 본 발명에서 사용된 핫 스타트(hot start) RNase H 활성은 RNAse H를 알칼라인 조건 하에서 시스-아코니틱 안하이드리드와 반응시킨 후 생성된 가역적인 화학 변형을 갖는 RNase H일 수 있다. 변형된 효소가 Tris 기반의 완충액과 함께 반응에서 사용될 때, 온도를 95℃로 올리고, 용액의 pH를 낮추면, RNase H 활성은 회복된다. 이 방법은 역전사의 시작 전에 반응 혼합물 내에 RNase H를 포함되도록 한다.
본 발명에서 사용될 수 있는 RNAse H 효소 및 핫 스타트 RNAse H 효소의 추가적인 예는 Walder et al.의 미국 특허 출원 제2009/0325169호에 개시되어 있다.
원 스텝 역전사 효소-PCR는 연결되지 않은 역전사 효소-PCR에 비해 몇가지 이점을 제공한다. 원 스텝 역전사 효소-PCR은 연결되지 않은 역전사 효소-PCR(예를 들어, 두 단계의 반응 사이에서 성분 또는 효소의 첨가를 위해 반응 튜브를 여는 등)에 비해 반응 혼합물 시약 및 핵산 산물의 조작(handling)이 덜 요구되며, 따라서 노동 강도가 적고, 요구되는 시간이 줄어든다. 원 스텝 역전사 효소-PCR은 또한, 시료를 적게 요구하며, 오염의 위험을 줄일 수 있다. 원-스텝 역전사 효소-PCR의 민감성 및 특이성은 주어진 시료 또는 병원성 RNA의 검출에 있어서 하나 내지 여러 개의 유전자의 발현 수준을 연구하는데 적합하다고 증명되었다. 일반적으로, 이러한 과정은 cDNA 합성을 시작하기 위해 유전자-특이적인 프라이머의 사용을 제한한다.
이들 역전사 효소-PCR 기법과 조합된 실시간 검출에 의한 PCR 반응의 동역학을 측정하는 능력은 높은 민감도를 갖는 RNA 카피 수를 정확하고 정밀하게 결정하도록 한다. 이는 하기 설명될 5' 형광 발생 뉴클레아제 어세이(Taq-Man) 또는 엔도뉴클레아제 어세이(CataCleave)와 같은, 형광 이중-표지된 혼성화 프로브 기법에 의한 증폭 과정 동안 PCR 산물의 형광 모니터링 및 측정을 통해 역전사 효소-PCR 산물을 검출함으로써 가능하다.
CataCleave 프로브를 이용한 살모넬라 표적 핵산 서열의 실시간 PCR
증폭 후 앰플리콘(amplicon) 검출은 PCR 과정 동안 증폭을 모니터하기 위하여 개발되었다. 이러한 방법은 일반적으로 형광 표지 프로브를, 새롭게 합성된 DNA 또는 이중가닥 DNA 사이에 삽입되어 형광 방출이 증가되는 염료(dyes)에 결합시킨다.
상기 프로브는 일반적으로 표적이 없을 경우, 두개의 발색단 사이에서 형광 공명 에너지 이동(fluorescence resonance energy transfer: FRET)에 의해 공여체 방출이 소멸될 수 있도록 설계된다. 공여체 발색단(donor chromophore)은 여기 상태(excited state)에서, 발색단 쌍이 가까운 거리에 위치시에 수용체 발색단(acceptor chromophore)에 에너지를 전달한다. 이러한 전달은 항상 비-방사선으로, 쌍극자-쌍극자 결합(dipole-dipole coupling)을 통하여 일어난다. 발색단 사이의 거리를 충분히 증가시키는 모든 공정은 FRET 효율을 감소시켜서, 공여체 발색단 방출을 방사능적으로 검출할 수 있게 된다. 일반적인 수용체 발색단은 FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5, 및 Texas Red 등을 포함한다. 수용체 발색단은 공여체의 방출 스펙트럼와 여기 스펙트럼(excitation spectra)이 겹칠 수 있도록 선택된다. 예를 들어, 이러한 결합 쌍에는 FAM-TAMRA가 있다. 또한, 광범위한 공여체를 퀀치(quench)하는 비형광 수용체가 있을 수 있다. 이외에도 적합한 공여체-수용체 FRET 쌍의 다른 예들은 당업자에게 잘 알려져 있다.
PCR의 실시간 검출을 위해 사용될 수 있는 FRET 프로브의 공통적인 예는 분자 비콘 (molecular beacons), Taq-Man 프로브(예를 들어, 미국 특허 제5,210,015호 및 제5,487,972호), 및 CataCleave 프로브(예를 들어, 미국 특허 제5,763,181호)를 포함한다. 분자 비콘은 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드로서, 비결합상태에서는 상기 프로브는 공여체와 수용체 발색단과 근접하여, 공여체 방출을 감소시킬 수 있는 이차 구조를 형성하게끔 고안되어 있다. 적절한 반응 온도에서, 비콘은 구조가 풀어져서, 특히 앰플리콘에 결합한다. 일단 풀리게 되면, 공여체와 수용체 발색단 사이의 거리가 증가하여, FRET이 바뀌게 되고, 특별한 기기를 이용하여 공여체 방출을 모니터할 수 있게 된다. Taq-Man 및 CataCleave 기법은, 이용되는 FRET 프로브가 절단되어, 공여체와 수용체 발색단이 FRET을 바꾸기에 충분할 정도로 떨어지게 된다는 점에서 분자 비콘과는 다르다.
Taq-Man 기법은 5' 말단에 공여체 발색단으로 표지되고, 3' 말단에 수용체 발색단으로 표지된 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한다. 증폭을 위해 이용되는 상기 DNA 폴리머라제는 5'->3' 엑소뉴클레아제 활성(exonuclease activity)을 가지고 있어야 한다. Taq-Man 프로브는 프라이머가 결합할 때 같이 앰플리콘의 하나의 가닥에 결합한다. DNA 폴리머라제가 프라이머를 신장시키는 동안, 폴리머라제는 결국 결합된 Taq-Man 프로브와 마주치게 될 것이다. 이때, 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성이 5' 말단에서 시작하여 순차적으로 Taq-Man 프로브를 분해하게 될 것이다. 상기 프로브가 분해됨에 따라, 프로브를 포함하는 모노뉴클레오티드는 반응 완충액으로 나오게 된다. 공여체가 수용체로부터 확산됨에 따라, FRET은 바뀌게 된다. 공여체로부터의 방출은 프로브 절단을 확인하기 위하여 모니터된다. Taq-Man의 작용 때문에, 특별한 앰플리콘은 PCR의 매 싸이클마다 오직 한번씩 검출될 수 있다. Taq-Man 표적 부위를 통한 프라이머의 신장은 이중 가닥 산물을 생성하고, 앰플리콘이 다음 PCR 싸이클에서 변성되기 전까지 Taq-Man 프로브의 추가 결합을 막는다.
본 명세서에 참조로서 결합된 미국 특허 제5,763,181호의 내용은 또 다른 실시간 검출 방법(CataCleave라고 명명함)을 개시하고 있다. CataCleave 기법은 프로브의 절단이 폴리머라제 활성이 없는 2차 효소에 의해 수행된다는 점에서 Taq-Man과 다르다. CataCleave 프로브는, 예를 들어 제한 효소 또는 RNase와 같은 엔도뉴클레아제의 표적 분자 내에 서열을 가지고 있다. 일 구체예에서, CataCleave 프로브는 프로브의 5' 및 3' 말단은 DNA로, 절단 부위는 RNA로 구성되어 있는, 키메릭 구조를 가지고 있다. 상기 프로브의 DNA 서열 부분은, 양말단이나 또는 내부에 FRET 쌍으로 표지된다. PCR 반응은 RNA-DNA 이중가닥의 RNA 서열 부분을 특이적으로 절단할 수 있는 RNase H 효소를 포함한다. 절단후에, 프로브의 반쪽 모두는 반응 온도에서 표적 앰플리콘에서 해리되며, 반응 용액으로 분산된다. 공여체 및 수용체가 분리될수록, FRET은 Taq-Man 프로브와 같은 방법으로 바뀌게 되며, 공여체 방출은 모니터 될 수 있다. 절단 및 해리는 추가적인 CataCleave 결합을 위한 부위를 재생산하게 된다. 이러한 방법으로, 프라이머가 CataCleave 프로브 결합 부위를 통하여 신장될 때까지, 단일 앰플리콘이 표적으로서 또는 프로브 절단을 여러회 반복할 수 있게 해준다.
살모넬라-특이적인 CataCleave 프로브의 표지
용어, "프로브(probe)"는 예를 들어, 표적 핵산 서열과 같은 특이적인 핵산 서열의 상보적인 영역을 갖는 서열-특이적인 방법으로 혼성화되도록 고안된 특이적인 부분을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 15 내지 60개의 뉴클레오티드 범위이다. 더욱 바람직하게는, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 18 내지 30개의 뉴클레오티드 범위이다. 본 발명의 올리고뉴클레오티드 프로브의 정확한 서열 및 길이는 상기 프로브가 결합하는 표적 폴리뉴클레오티드의 성질에 따라 부분적으로 달라진다. 결합 위치 및 길이는 특정한 구체예에서 적절한 어닐링 및 변성되는 특성을 이루기 위하여 다양할 수 있다. 이러한 고안 선택을 위한 지침은 Taq-man 어세이 또는 CataCleave를 개시하는 문헌, 미국 특허 제5,763,181호, 제6,787,304호, 및 제7,112,422호에서 발견될 수 있으며, 상기 내용은 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입된다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "표지(label)" 또는 "검출가능한 표지(detectable lebel)"는 공유 결합 또는 비공유 결합에 의해 프로브에 결합된 형광 색소 화합물을 포함하는 CataCleave 프로브의 임의의 표지를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "형광 색소(fluorochrome)"는 방출되는 빛보다 더 짧은 파장의 빛에 의해 여기(excitation)되는 빛을 방출하는 형광 화합물을 의미한다. 용어, "형광 공여체(fluorescent donor 또는 or fluorescence donor)"는 본 발명에 개시된 어세이에서 측정되는 빛을 방출하는 형광 색소를 의미한다. 더욱 구체적으로, 형광 공여체는 형광 수용체(acceptor)에 의해 흡수되는 빛을 제공한다. 용어, "형광 수용체(fluorescent acceptor 또는 fluorescence acceptor)"는 형광 공여체로부터 방출되는 에너지를 흡수하는 제2 형광 색소 또는 퀀칭(quencing) 분자를 의미한다. 제2 형광 색소는 형광 공여체로부터 방출되는 에너지를 흡수하며, 형광 공여체에 의해 방출되는 빛보다 더 긴 파장의 빛을 방출한다. 퀀칭 분자는 형광 공여체에 의해 방출된 에너지를 흡수한다.
어떠한 발광 분자, 바람직하게는 형광 색소 및/또는 형광 퀀쳐(quencher)라도 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 상기 발광 분자는 예를 들어, Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 430, Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 532, Alexa Fluor 546, Alexa Fluor 568, Alexa Fluor 594, Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647, Alexa Fluor 660, Alexa Fluor 680, 7-디에틸아미노카우마린-3-카르복실산, 플루오레세인, Oregon Green 488, Oregon Green 514, 테트라메틸로다민, 로다민 X, 텍사스 레드 염료, QSY 7, QSY33, Dabcyl, BODIPY FL, BODIPY 630/650, BODIPY 6501665, BODIPY TMR-X, BODIPY TR-X, 디알킬아미노코우마린, Cy5.5, Cy5, Cy3.5, Cy3, DTPA(Eu3+)-AMCA 및 TTHA(Eu3+)AMCA를 포함하나, 이에 한정하지는 않는다.
일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 3' 말단 뉴클레오티드는 차단되어 있거나 또는 핵산 폴리머라제에 의해 확장되지 못하도록 되어 있다. 이러한 차단은 상기 프로브의 말단 3' 지역에 리포터(reporter) 또는 퀀쳐 분자를 부착함으로서 편리하게 수행될 수 있다.
일 구체예에서, 리포터 분자는 연결 모이어티를 통해 상기 프로브의 3' 말단 또는 5' 말단의 끝에 부착을 위해 유래된 형광 유기 염료이다. 바람직하게는, 퀀쳐 분자는 본 발명의 구체예에 따라 형광 또는 형광이 아닐 수 있는, 유기 염료이다. 예를 들어, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 퀀쳐 분자는 비-형광이다. 일반적으로 퀀쳐 분자가 형광이거나 또는 비-방사성의 분해에 의해 리포터로부터 전달되는 에너지를 단순히 방출한다면, 상기 퀀쳐의 흡수 밴드는 상기 리포터 분자의 형광 방출의 흡수 밴드와.실질적으로 겹치게 될 것이다. 본 명세서에서, 여기된 리포터 분자로부터 흡수되지만, 방사성의 에너지를 방출시키지 않는 비-형광 퀀쳐 분자를 발색성 분자(chromogenic molecule)로 해석되어진다.
리포터-퀀쳐 쌍은 예를 들어, 플루오레세인 및 로다민 염료를 포함하는 잔텐 염료(xanthene dye)들로부터 선택될 수 있다. 올리고뉴클레오티드의 결합을 위한 결합 부위로서 또는 결합 기능성(functionality)으로서 사용될 수 있는 페닐 모이어티 상에 치환기를 갖는, 이들 화합물의 다양한 적절한 형태를 널리 상업적으로 입수할 수 있다. 형광 화합물의 다른 그룹은 알파 또는 베타 위치에 아미노기를 갖는 나프틸아민이다. 상기 나프틸아미노 화합물은 1-디메틸아미노나프틸-5-술포네이트, 1-아닐리노-8-나프탈렌 술포네이트 및 2-p-토우리디닐-6-나프탈렌 술포네이트와 같은 화합물을 포함한다. 다른 염료는 3-페닐-7-이소시아나토코우마린, 9-이소티오시아나토아크리딘 및 아크리딘 오렌지과 같은 아크리딘; N-(p-(2-벤조옥사졸릴)페닐)말레이미드; 벤조옥사디아졸, 스틸벤(stilbene), 피렌(pyrene) 등을 포함한다.
일 구체예에서, 리포터 및 퀀쳐 분자는 플루오레세인 및 비-형광 퀀쳐 염료로부터 선택된다.
올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단에 리포터 또는 퀀쳐 분자를 부착하는 다양한 링킹 모이어티(linking moiety) 및 방법론은 하기 참고 문헌에 예시되어 있다: Eckstein, editor, Oligonucleotide and Analogues: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 1991); Zuckerman et al., Nucleic Acid Research, 15: 5305-5321 (1987) (3' thiol group on oligonucleotide); Sharma et al., Nucleic Acid Research, 19: 3019 (1991) (3' sulfhydryl); Giusti et al., PCR Method and Applications, 2: 223-227 (1993) and Fung et al., 미국 특허 제4,757,141호 (5' phosphoamino group via Aminolink. II available from Applied Biosystems, Foster City, Calif.) Stabinsky, 미국 특허 제4,739,044호 (3' aminoalkylphosphoryl group); Agrawal et al., Tetrahedron Letters, 31: 1543-1546 (1990) (attachment via phosphoramidate linkages); Sproat et al., Nucleic Acid Research, 15: 4837 (1987) (5' mercapto group); Nelson et al., Nucleic Acid Research, 17: 7187-7194 (1989) (3' amino group) 등.
로다민 및 비-형광 퀀쳐 염료는 또한 고체상 합성의 시작 단계에서 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 편리하게 부착될 수 있다, 예를 들어, Woo et al., 미국 특허 제5,231,191호; 및 Hobbs, Jr., 미국 특허 제4,997,928호를 참조한다.
고체 지지체에의 살모넬라-특이적 CataCleave 프로브의 부착
본 발명의 일 구체예에서, 올리고뉴클레오티드 프로브는 고체 지지체에 부착될 수 있다. 상이한 프로브들은 고체 지지체에 부착될 수 있고 시료 내의 상이한 표적 서열을 동시에 검출하는데 사용될 수 있다. 상이한 형광 파장을 갖는 리포터 분자는 상이한 프로브에 사용될 수 있고, 따라서 상이한 프로브에 대한 혼성화가 별개로 검출되는 것을 가능하게 한다.
올리고뉴클레오티드 프로브의 고정을 위한 고체 지지체의 바람직한 형태의 예는 폴리스티렌, 아비딘 코팅된 폴리스티렌 비드 셀룰로즈, 나일론, 아크릴아미드 겔 및 활성화된 덱스트란, 통제된 공극 유리(controlled pore glass: CPG), 유리 플레이트 및 고 교차-결합(highly cross-linked) 폴리스티렌을 포함한다. 이러한 고체 지지체들은 그들의 화학적 안정성, 기능화(functionalization)의 용이함 및 잘 규정된 표면 면적 때문에 혼성화 및 진단 연구에서 바람직하다. 통제된 공극 유리 (500 Å, 1000 Å) 및 비-팽창 고 교차-결합 폴리스티렌 (1000 Å)과 같은 고체 지지체가 올리고뉴클레오티드 합성과의 그들의 친화성(compatibility) 때문에 특히 바람직하다.
올리고뉴클레오티드 프로브는 고체 지지체에 다양한 방식으로 부착될 수 있다. 예를 들면, 상기 프로브는 상기 프로브의 3' 또는 5' 말단 뉴클레오티드를 상기 고체 지지체에 부착하는 것에 의해 상기 고체 지지체에 부착될 수 있다. 그러나, 상기 프로브는 상기 프로브를 상기 고체 지지체로부터 거리를 두도록 하는 링커에 의해 상기 고체 지지체에 부착될 수 있다. 상기 링커는 가장 바람직하게는 30 원자 길이 이상, 더 바람직하게는 50 원자 길이 이상이다.
고체 지지체에 고정된 프로브의 혼성화는 일반적으로 상기 프로브가 30 원자 이상, 더 바람직하게는 50 원자 이상에 의해 상기 고체 지지체로부터 분리되는 것을 필요로 한다. 이러한 분리를 성취하기 위해서, 링커는 일반적으로 상기 링커 및 3' 뉴클레오시드 사이에 위치한 스페이서(spacer)를 포함한다. 올리고뉴클레오티드 합성을 위해, 상기 링커 팔(arm)은 보통 염기성 시약으로 절단되어 올리고뉴클레오티드를 상기 고체 지지체로부터 자유롭게 할 수 있는 에스테르 결합에 의해 3' 뉴클레오시드의 3'-OH에 부착된다.
올리고뉴클레오티드 프로브를 고체 지지체에 부착하는데 사용할 수 있는 다양한 종류의 링커가 당업계에 알려져 있다. 링커는 표적 서열이 고체 지지체에 부착된 프로브에 혼성화되는 것을 현저하게 방해하지 않는 임의의 화합물로 형성될 수 있다. 링커는 자동화된 합성에 의해 링커에 쉽게 첨가될 수 있는 동종중합체 올리고뉴클레오티드로 형성될 수 있다. 대안적으로, 기능화된 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리머가 상기 링커로서 사용될 수 있다. 이러한 폴리머는 그들이 프로브의 표적 올리고뉴클레오티드에의 혼성화를 현저하게 방해하지 않기 때문에 동종중합체 올리고뉴클레오티드에 비해 바람직하다. 폴리에틸렌 글리콜은 그것이 상업적으로 구입 가능하고, 유기 및 수성 배지 모두에 용해 가능하고, 기능화하기 편리하고, 및 올리고뉴클레오티드 합성 및 합성-후 상태 하에서 완전히 안정하기 때문에 특히 바람직하다.
고체 지지체, 링커 및 프로브 간의 결합은 높은 온도에서의 염기 조건 하에서 염기 보호기의 제거 동안 바람직하게는 절단되지 않는다. 바람직한 결합의 예는 카르바메이트 및 아미드 결합을 포함한다. 프로브의 고정(immobilization)은 당업계에 잘 알려져 있고, 업계의 통상의 기술자는 고정 조건을 결정할 수 있다.
본 방법의 일 구체예에 따르면, 혼성화 프로브는 고체 지지체 상에 고정된다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 혼성화에 유리한 조건 하에서 핵산의 시료과 접촉된다. 리포터 분자의 형광 신호는 시료과의 접촉 전후에 측정된다. 표적 서열에 혼성화 되었을 때 프로브 상의 리포터 분자가 더 큰 형광신호를 나타냈기 때문에, 프로브가 시료과 접촉된 후의 형광 신호의 증가는 프로브가 시료 안의 표적 서열에 혼성화된 것을 나타낸다. 비혼성화 상태에서는, 형광 표지는 퀀쳐(quencher)에 의해 억제된다. 표적과 혼성화되면, 형광 표지는 퀀쳐로부터 분리되어 형광을 발한다.
또한 고체 지지체에의 혼성화 프로브의 고정은 프로브에 혼성화된 표적 서열을 시료로부터 쉽게 분리될 수 있게 한다. 그 후의 단계에서, 분리된 표적 서열을 고체 지지체에서 분리하여 연구자의 특별한 필요에 따라, 당업계에 잘 알려진 방법으로 가공(예를 들어, 정제, 증폭)될 수 있다.
CataCleave 프로브를 사용한 Salmonella 표적 핵산 서열의 실시간 검출.
상기 표지된 올리고뉴클레오티드 프로브는 시료 내에서 살모넬라 표적 핵산 서열의 실시간 검출을 위한 프로브로서 사용될 수 있다.
CataCleave 올리고뉴클레오티드 프로브는 먼저 선택된 살모넬라 표적 서열을 포함하는 PCR 엠플리콘 내에서 발견되는 서열과 상보적인 DNA 및 RNA 서열로 합성된다. 일 구체예에서, 상기 프로브는 FRET 쌍, 예를 들면 프로브의 한 쪽 말단은 플루오레세인 분자로 및 다른 말단은 비-형광 퀀쳐 분자로 표지된다. 따라서, 상기 프로브가 PCR 엠플리콘과 혼성화 되었을 때, RNase H 활성에 의해 절단될 수 있는 RNA:DNA 헤테로듀플렉스 형태가 형성된다.
RNase H는 RNA-DNA 혼성체에서 RNA를 가수분해한다. 이 효소는 처음 소의 가슴샘에서 확인되었으나 그 후 다양한 생물에서 발견되었다. RNase H 활성은 진핵생물 및 박테리아에 편재하여(ubiquitous) 나타난다. 비록 RNase H가 다양한 분자량 및 핵 용해 활성의 단백질 패밀리로 구성되나, 기질 필요물은 다양한 동형(isotype) 간에 유사하게 나타난다. 예를 들면, 지금까지 연구된 대부분의 RNase H는 엔도뉴클레아제로서 기능을 하고 5' 포스페이트 및 3' 히드록실 말단을 갖는 절단 생산물을 생산하기 위해 2가 양이온(예를 들면, Mg2 +, Mn2 +)을 필요로 한다.
E. coli 유래의 RNase HI는 RNase H 패밀리 중 가장 잘 알려져 있다. RNase HI외에도, 2번째의 E. coli RNase H, RNase HII가 클로닝되고 특성이 확인되었다 (Itaya, M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87, 8587-8591). RNase HI은 155개의 아미노산으로 이루어져 있는데 비해, 이는 213개의 아미노산으로 이루어져 있다. E. coli RNase HII는 E. coli RNase HI과 단지 17%의 상동성(homology)를 나타낸다. S. 티피무리움으로부터 클로닝된 RNase H는 E. coli RNase HI와 단지 11개의 위치에서 상이하고 155개의 아미노산으로 이루어져 있다 (Itaya, M. and Kondo K., Nucleic Acids Res., 1991, 19, 4443-4449).
RNase H 활성을 나타내는 단백질이 클로닝되고 여러 개의 바이러스, 다른 박테리아 및 효모로부터 정제되었다 (Wintersberger, U. Pharmac. Ther., 1990, 48, 259-280). 많은 경우에 있어서, RNase H 활성을 갖는 단백질들이 RNase H가 다른 효소, 보통 DNA 또는 RNA 폴리머라제의 아미노 또는 카르복시 말단에 융합된 융합 단백질로 나타난다. RNase H 도메인은 대장균 RNase HI과 높은 상동성이 있는 것으로 지속적으로 밝혀졌으나 다른 도메인이 실질적으로 다양하여, 융합 단백질의 분자량 및 다른 특성이 매우 다양하다.
고등 진핵 생물에서 RNase H의 2개 클래스는 분자량, 2가 양이온의 효과, 술프히드릴(sulfhydryl) 시약에 대한 감수성 및 면역학적 교차-반응성의 차이에 기초하여 정의되어 왔다(Busen et al., Eur. J. Biochem., 1977, 74, 203-208). RNase HI 효소는 68-90 kDa 범위의 분자량을 가지고, Mn2 + 또는 Mg2 +에 의해 활성화되고 및 술프히드릴 시약에 무감수성인 것으로 보고되었다. 반대로, RNase H II 효소는 31-45 kDa 범위의 분자량을 갖고, Mg2 +를 필요로하고, 술프히드릴 시약에 고감수성을 보이고, Mn2+에 의해 억제되는 것으로 보고되었다(Busen, W., and Hausen, P., Eur. J. Biochem., 1975, 52, 179-190; Kane, C. M., Biochemistry, 1988, 27, 3187-3196; Busen, W., J. Biol. Chem., 1982, 257, 7106-7108.).
RNase HII 특성을 갖는 효소가 인간 태반으로부터 거의 균질하게 정제되었다 (Frank et al., Nucleic Acids Res., 1994, 22, 5247-5254). 이 단백질은 약 33kDa의 분자량을 갖고 6.5-10의 pH 범위에서 활성화되고 최적 pH가 8.5-9인 것으로 보고된다. 상기 효소는 Mg2 +를 필요로 하고 Mn2 +및 n-에틸 말레이미드에 의해 억제되는 것으로 보고되었다. 절단 반응의 생성물은 3' 히드록실 및 5' 포스페이트 말단을 갖는다.
일 구체예에 따르면, 실시간 핵산 증폭은 열안정성 핵산 폴리머라제, RNase H 활성, 살모넬라 표적 폴리뉴클레오티드에 혼성화될 수 있는 PCR 증폭 프라이머 쌍, 및 표지된 CataCleave 올리고뉴클레오티드 프로브의 존재 하에 표적 폴리뉴클레오티드에서 수행된다. 실시간 PCR 반응 동안, RNase H에 의한 프로브의 절단은 형광 퀀쳐로부터 형광 공여체를 분리시켜 시료 내의 살모넬라 표적 DNA 서열의 실시간 검출에 따라 프로브의 형광이 실시간으로 증가하게 한다.
일 구체예에서, 실시간 핵산 증폭은 약 40회 이하의 PCR 증폭 싸이클에서 단일 표적 DNA 분자의 실시간 검출을 가능하게 한다.
키트
본 발명은 또한 시료 내의 Salmonella 표적 핵산 서열의 실시간 검출을 위한 하나 이상의 반응 시약을 갖는 포장 단위를 포함하는 키트 형태를 제공한다. 또한 상기 키트는 하나 이상의 하기의 품목을 포함할 수 있다: 완충액, 사용설명서, 및 양성 또는 음성 대조군. 키트는 본 명세서에 기술된 방법을 수행하기 위해 적절한 비율로 함께 혼합된 반응 시약들의 용기들을 포함할 수 있다. 반응 시약 용기들은 바람직하게는 상기 방법을 수행할 때 측정하는 단계를 생략할 수 있도록 단위 수량의 반응 시약을 포함한다.
상기 키트는 pH 약 6 내지 8의 완충액; 약 0.125% 내지 약 2% 농도의 쌍성이온 디터전트(zwitterionic detergent); 약 0.3 내지 약 2.5 mg/ml 농도의 아지드를 포함하는 용해 시약을 포함할 수 있다. 그람 양성 세균의 용해를 위해, 상기 키트는 프로테아제, 예를 들면, 100 mg의 동결 건조된 프로테나제 K 및 프로테나제 K 용액의 재구성(reconstitution)을 위한 일정량의 완충액을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 1x 용해 시약은 12.5 mM Tris 아세테이트(pH 8.0) 또는 Tris-HCl (pH 8.0) 또는 HEPES (pH=7.8), 0.25% (w/v) CHAPS, 및 0.3125 mg/ml 소듐 아지드를 포함한다.
키트는 또한, 이에 한정하지는 않으나, 열안정 폴리머라제, 열안정 RNase H, 살모넬라 핵산 표적 서열을 증폭시키기 위해 선택된 프라이머 및 실시간 PCR 산물에 어닐링되는 표지된 CataCleave 올리고뉴클레오티드 프로브를 포함하는 실시간 PCR을 위한 반응 시약을 포함하고, 본 명세서에 기술된 방법론에 따라 살모넬라 표적 핵산 서열의 검출을 가능하게 한다. 키트는 2개 이상의 살모넬라 표적 핵산 서열의 검출을 위한 반응 시약을 포함할 수 있다. 키트 반응 시약은 또한 적용할 수 있는 RT-PCR 분석을 위한 반응 시약을 포함할 수 있다.
특정 구체예에서, 상기 증폭 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2의 서열을 갖는다.
다른 구체예에서, 상기 CataCleave 올리고뉴클레오티드 프로브는 서열번호 3의 서열을 갖는다.
도 1은 CataCleave 프로브 기법을 나타낸 개략도이다.
도 2는 PCR 증폭 산물의 실시간 CataCleave 프로브 검출을 나타낸 개략도이다.
도 3a는 서로 다른 용해 시약(CZ1-7 & 0.125x TZ)의 존재 하에 CataCleave 프로브를 사용하여 살모넬라 DNA를 검출한 실시간 PCR 반응 결과이다.
도 3b는 서로 다른 농도의 용해 시약의 존재 하에 CataCleave 프로브를 사용하여 리스테리아 DNA를 검출한 실시간 PCR 반응 결과이다.
도 4는 서로 다른 농도의 용해 시약을 사용하여 얻어진 리스테리아 세포 용균물 내에서 CataCleave 프로브를 사용하여 표적 DNA 서열을 검출한 실시간 PCR 반응 결과이다.
도 5는 바람직한 용해 시약 용액과 CataCleave 프로브를 사용하여 낮은 농도의 리스테리아 세포를 검출한 실시간 PCR 반응 결과이다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 상세히 설명될 것이며, 이는 어떠한 방법으로든 한정되는 것으로 해석되지 않는다.
실시예 1: 살모넬라의 용해
5 ㎕의 분쇄 우육 부유물(enrichment)(살모넬라가 접종됨)을 2.5 ㎕의 프로테나제 K(20.1 mg/ml)가 포함된 42.5 ㎕의 용해 완충액에 희석시켰다. 상기 시료를 55℃에서 15분 동안 인큐베이션시킨 다음, 95℃에서 10분 동안 열을 가한 후 냉각시켰다. 이후, 2 ㎕의 용해물을 각각의 PCR-CataCleave 반응에 첨가하였다.
실시예 2: 서로 다른 용해 시약의 존재 하에 그람 음성 병원균인 살모넬라의 InvA 유전자 서열의 실시간 검출
8 종류의 완충액을 테스트하였다:
1. CZ1: 1% CHAPS, 1 mg/mL 소듐 아지드, 20 mM HEPES-KOH (pH 8)
2. CZ2: 2% CHAPS, 1 mg/mL 소듐 아지드, 20 mM HEPES-KOH (pH 8)
3. CZ3: 0.5% CHAPS, 1 mg/mL 소듐 아지드, 20 mM HEPES-KOH (pH 8)
4. CZ4: 1% CHAPS, 0.5 mg/mL 소듐 아지드, 20 mM HEPES-KOH (pH 8)
5. CZ5: 1% CHAPS, 2.5 mg/mL 소듐 아지드 20 mM HEPES-KOH (pH 8)
6. CZ6: 1% CHAPS, 1 mg/mL 소듐 아지드, 20 mM HEPES-KOH (pH 8)
7. CZ7: 1% CHAPS, 1 mg/mL 소듐 아지드, 100 mM HEPES-KOH (pH 8)
8. 0.125 TZ (1X TZ: 2% Triton-X, 5 mg/ml 소듐 아지드, 0.2 M Tris pH=8)
각각의 반응 믹스는 증폭 완충액(32 mM HEPES-KOH, pH 7.8, 100 mM 포타슘 아세테이트, 4 mM 마그네슘 아세테이트, 0.11 % 우혈청 알부민, 1% 디메틸술폭시드), 800 nM Salmonella-정방향 프라이머(서열 번호 1), 800 nM Salmonella-역방향 프라이머(서열 번호 2), 200 nM Salmonella CataCleave 프로브(서열 번호 3), dUTP/NTP 믹스 (80 μM의 dGTP, dCTP, dATP 및 160 μM dUTP), 2.5 유니트의 Thermus aquaticus DNA 폴리머라제, 1 유니트의 Pyrococcus furiosis RNase HII, 및 0.1 유니트의 우라실-N-글리코실라제 및 용해물을 포함하였다. 이를 하기 표 1에 나타내었다.
성분 ㎕/25 ㎕ rxn
10X ICAN 완충액 2.5
Forward primer (20 μM) (서열 번호1) 1
Reverse primer (20 μM) (서열 번호2) 1
CC probe2 (5 μM) 서열 번호 3) 1
Fermentas dN/UTP (2/4 mM) 1
Taq 폴리머라제 (5 units/㎕) 0.5
UNG (1 unit/㎕) 0.1
RNaseH II (희석하지 않음) 0.2
용해물 2
증류수 15.70
상기 Salmonella 정방향 및 역방향 프라이머는 살모넬라 침습 유전자(invA) 내에 포함된 180 bp의 절편을 증폭한다.
프라이머 및 프로브의 서열은 다음과 같다:
Salmonella-Forward primer: 5'-TCGTCATTCCATTACCTACC (서열 번호 1)
Salmonella-Reverse primer: 5'-TACTGATCGATAATGCCAGACGAA (서열 번호 2)
Salmonella CataCleave Probe: 5'-/FAM/CGATCAGrGrArArATCAACCAG/IABFQ) (서열 번호 3), 상기 소문자 "r"은 RNA 염기를 의미한다(즉 rG는 리보구아노신이다.)
약어: FAM: 6-카르복시플루오레세인; IABHQ: Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)사의 단파장 방출을 위한 Iowa Black Hole Quencher.
상기 반응은 하기 싸이클링 프로토콜에 따라 Roche Lightcycler 480에서 수행하였다: 37℃에서 10분; 95℃에서 10분; 이후, 95℃에서 15초, 60℃에서 20초로 50회의 증폭.
FAM 방출은 60℃ 단계에서 모니터 되었다. 하기 표 2는 각각의 용해 용액을 사용하여 제조된 살모넬라의 용해물로 실시간 PCR을 수행한 검출 결과를 Cp 값으로 나타낸 것이다.
용해 용액 Cp 값
Sample 1 Sample 2 Sample 3 Sample 4 Average Std. Dev.
CZ1 22.75 24.68 27.59 24.31 24.83 2.02
CZ2 24.84 22.5 22.65 22.44 23.11 1.16
CZ3 21.7 21.32 21.59 21.24 21.46 0.22
CZ4 21.78 21.25 22.21 21.63 21.72 0.40
CZ5 20:99 20.78 22.74 20.46 21.24 1.02
CZ6 22.5 2219 21.64 20.87 21 80 0.71
CZ7 22.33 21.3 21.38 23.47 22.12 1.01
0.125 TZ 24.69 24.13 22.89 23.53 23.81 0.77
CataCleave-PCR 반응으로부터 나온 미가공 데이터(raw data)를 하기 표 3에 나타내었으며, 그 결과를 도 3a와 같이 그래프로 도시하였다. 상기 데이터는 1% CHAPS, 2.5 mg/mL 소듐 아지드, 20 mM HEPES-KOH (pH 8)의 조성을 갖는 CZ5를 반응 시약으로 사용하였을 때, 살모넬라에 대한 용해물로 가장 우수하였음을 나타낸다.
싸이클 CZ1 CZ2 CZ3 CZ4 CZ5 CZ6 CZ7 0.125TZ
1 -0.08154 -0.09244 -0.05896 -0.04498 -0.10026 0.030734 0.016633 0.178897
2 -0.07685 -0.10636 -0.12648 -0.11248 -0.12293 -0.10865 -0.08756 -0.01857
3 -0.04483 -0.08342 -0.03209 -0.05401 -0.08242 -0.03213 -0.01948 0.013627
4 0.00545 -0.00534 0.009023 0.032326 0.012591 -0.02692 -0.04169 -0.01835
5 0.019136 0.072026 0.031688 0.037257 0.062187 0.022705 0.089992 0.023036
6 0.097085 0.123095 0.117864 0.096901 0.130574 0.144992 0.058736 0.000253
7 0.177513 0.204047 0.125566 0.195065 0.174667 0.179802 0.147994 0.044226
8 0.172929 0.291726 0.230032 0.317836 0.243302 0.212258 0.198652 0.076716
9 0.190175 0.341907 0.277584 0.30071 0.275392 0.295689 0.242447 0.090809
10 0.294218 0.388214 0.312682 0.368852 0.400216 0.35688 0.273848 0.156082
11 0.303147 0.458994 0.403599 0.468707 0.408784 0.359638 0.397402 0.176273
12 0.399191 0.568061 0.483419 0.497775 0.507604 0.457151 0.503886 0.182145
13 0.426819 0.642242 0.476088 0.589057 0.554182 0.485509 0.487134 0.228228
14 0.531843 0.666417 0.597656 0.648716 0.66686 0.625004 0.564568 0.297067
15 0.550579 0.71383 0.635124 0.695916 0.678137 0.680414 0.592924 0.343377
16 0.553993 0.784529 0.730735 0.775432 0.783645 0.722468 0.661443 0.383786
17 0.679825 0.848647 0.822861 0.864222 0.864627 0.796843 0.764974 0.436247
18 0.783385 0.931565 0.902821 0.938836 1.045031 0.876742 0.825718 0.549604
19 0.868623 0.985159 1.107218 1.136308 1.277782 0.973095 0.958003 0.53401
20 0.982322 1.037124 1.303273 1.328404 1.577683 1.178779 1.085447 0.611222
21 1.223783 1.170961 1.804095 1.802496 2.311713 1.436557 1.444375 0.788485
22 1.702211 1.292586 2.638172 2.581344 3.568213 2.007969 2.029346 0.944042
23 2.5548 1.476628 4.154548 4.096577 5.483647 2.943923 3.111926 1.211587
24 4.013654 1.858811 6.359547 6.21857 7.984221 4.719766 4.836151 1.704385
25 6.081173 2.474708 9.050079 8.879296 10.64475 7.042473 7.2701 2.54843
26 8.551142 3.639417 11.74029 11.71534 13.14147 9.776291 10.01877 3.939979
27 11.01239 5.423345 14.13767 14.13073 15.23003 12.31559 12.59921 5.805114
28 13.18915 7.738084 16.17515 16.13436 16.94118 14.54964 14.70885 7.907165
29 14.90454 10.35151 17.55021 17.73585 18.20445 16.26643 16.38684 10.0476
30 16.27942 12.81626 18.74827 18.93951 19.17664 17.61682 17.61324 11.90648
31 17.30468 14.97469 19.50474 19.67647 19.77973 18.61543 18.53871 13.51757
32 18.04819 16.72144 20.09251 20.26322 20.24134 19.36482 19.29415 14.68205
33 18.57037 18.11762 20.45045 20.70313 20.59991 19.81153 19.69791 15.58446
34 18.99748 19.14734 20.80625 20.98621 20.87407 20.14976 20.01172 16.22407
35 19.24264 19.93486 20.94883 21.23648 20.97173 20.35536 20.25518 16.68062
36 19.49887 20.61664 21.04906 21.31941 21.11706 20.54549 20.46469 17.0095
37 19.5599 20.99288 21.16099 21.4392 21.24616 20.66692 20.48752 17.2748
38 19.59202 21.34552 21.23124 21.53726 21.22707 20.809 20.61203 17.46193
39 19.74449 21.62384 21.32697 21.53409 21.3944 20.83262 20.69034 17.56837
40 19.88076 21.76631 21.45043 21.62984 21.42751 20.94741 20.67901 17.63186
41 19.95014 21.97456 21.46702 21.65637 21.45355 21.01768 20.79471 17.67184
42 19.86931 22.02938 21.45856 21.80003 21.51671 20.93735 20.81414 17.75785
43 19.92241 22.11995 21.53903 21.77299 21.53429 21.0898 20.84013 17.83786
44 19.99976 22.23208 21.60527 21.76697 21.56429 21.08399 20.95278 17.8511
45 20.03796 22.22859 21.59181 21.87152 21.59639 21.13316 20.99259 17.86885
46 20.10243 22.31951 21.65495 21.79059 21.6503 21.15118 20.97432 17.90577
47 20.0785 22.29531 21.57693 21.89247 21.68029 21.22666 21.01418 17.86363
48 20.0465 22.38894 21.64096 21.87723 21.64618 21.25395 21.0039 17.9207
49 20.11833 22.40702 21.6494 21.86813 21.73593 21.30748 21.03016 17.96406
50 20.14951 22.47681 21.74513 21.88302 21.70553 21.25817 20.99817 17.92005
실시예 3: 서로 다른 용해 시약의 존재 하에 그람 양성 병원균인 리스테리아 의 InlA 유전자 서열의 실시간 검출
1) 서로 다른 농도의 용해 시약의 존재 하에 대조군의 CataCleave PCR
먼저, 대조군의 CataCleave PCR은 하기 농도의 용해 시약에 재현탁된 정제된 표적 DNA로 테스트하였다:
1x ZAC, 0.5x ZAC, 0.25x ZAC, 0.125x ZAC 및 0.125x TZ 용해 시약.
(1x ZAC은 100 mM Tris-아세테이트(pH 8.0), 1% (w/v) CHAPS, 2.5 mg/mL 소듐 아지드를 포함한다.)
5 ㎕의 분쇄 우육 부유물(enrichment)(리스테리아가 접종됨)을 2.5 ㎕의 프로테나제 K(20 mg/ml)가 포함된 42.5 ㎕의 용해 완충액에 희석시키고, 상기 시료를 55℃에서 15분 동안 인큐베이션시킨 다음, 95℃에서 10분 동안 열을 가하였다. 이후, 2 ㎕의 용해물을 각각의 PCR-CataCleave 반응에 첨가하였다. 각각의 반응 믹스는 1x ICAN 증폭 완충액(32 mM HEPES-KOH, pH 7.8, 4 mM 마그네슘 아세테이트, 1% DMSO 및 0.11 % BSA), 400 nM LmonC3-정방향 프라이머(서열 번호 5), 400 nM LmonC3-역방향 프라이머(서열 번호 6), 200 nM Salmonella CataCleave 프로브(서열 번호 7), dUTP/NTP 믹스(80 μM의 dGTP, dCTP, dATP 및 160 μM dUTP), 2.5 유니트의 Thermus aquaticus DNA 폴리머라제, 1 유니트의 Pyrococcus furiosis RNase HII, 및 0.1 유니트의 우라실-N-글리코실라제를 포함하였다. 이를 하기 표 4에 나타내었다.
성분 ㎕/25 ㎕ rxn
10X ICAN 완충액 2.5
Forward primer (20 μM) (서열 번호 5) 1
Reverse primer (20 μM) (서열 번호 6) 1
CC probe2 (5 μM) 서열 번호 7) 1
Fermentas dN/UTP (2/4 mM) 1
Taq 폴리머라제 (5 units/㎕) 0.5
UNG (1 unit/㎕) 0.1
RNaseH II (희석되지 않음) 0.2
용해물 2
증류수 15.70
Lmon C3F: ACGAGTAACGGGACAAATGC (서열 번호 5)
Lmon C3R: TCCCTAATCTATCCGCCTGA (서열 번호 6)
Lmon CC C3B: 5'-/FAM/-CGAATGTAArCAGACACGGTCTCA/IABFQ/ (서열 번호: 7), 상기 소문자 "r"은 RNA 염기를 의미한다(즉 rC는 리보시티딘이다.).
약어: FAM: 6-카르복시플루오레세인; IABFQ: Integrated DNA Technologies (Coralville, IA)사의 단파장 방출을 위한 Iowa Black Hole Quencher.
상기 반응은 하기 싸이클링 프로토콜에 따라 Roche Lightcycler 480에서 수행하였다: 37℃에서 10분; 95℃에서 10분; 이후, 95℃에서 15초, 60℃에서 20초로 50회의 증폭. FAM 방출은 60℃ 단계에서 모니터 되었다. 하기 표 5는 각각의 용해 용액을 사용하여 제조된 대조군의 실시간 PCR을 수행한 검출 결과를 Cp 값으로 나타낸 것이다.
번호 용해 용액 Cp 값
Sample 1 Sample 2 Sample 3 Average Standard Dev.
1 lx ZAC 19.57 19.67 19.58 19.61 0.06
2 0.5x ZAC 19.58 19.53 19.57 19.56 0.03
3 0.25x ZAC 20.52 20.3 20.5 20.44 0.12
4 0.125x ZAC 20.87 20.83 20.81 20.84 0.03
5 0.125x TZ 20.38 20.33 20.37 20.36 0.03
CataCleave-PCR 반응으로부터 나온 미가공 데이터(raw data)를 하기 표 6에 나타내었으며, 그 결과를 도 3b와 같이 그래프로 도시하였다. 상기 결과는 용해 시약이 PCR CataCleave 반응을 저해하지 않음을 나타낸다.
싸이클 1x ZAC 0.5x ZAC 0.25x ZAC 0.125x ZAC 0.125x TZ
1 -0.09699 -0.20486 -0.04833 -0.046765 -0.22664
2 -0.085 -0.13655 -0.03629 -0.022209 -0.01704
3 -0.02587 -0.03728 -0.10074 -0.019208 -0.07463
4 0.00056 -0.0285 -0.00117 -0.001508 0.015169
5 0.0778 0.115301 0.06912 0.0278657 0.044441
6 0.032514 0.087024 0.069083 0.01506 0.032053
7 0.039257 0.122798 0.171074 0.0491612 0.128023
8 0.140482 0.159938 0.178193 0.1194157 0.158038
9 0.039735 0.150653 0.183067 0.0859022 0.07635
10 0.089369 0.15579 0.242615 0.1943173 0.21943
11 0.192583 0.252248 0.306922 0.1791263 0.155111
12 0.202327 0.233666 0.263268 0.2653596 0.239119
13 0.218244 0.289311 0.273896 0.1981817 0.308735
14 0.313254 0.351079 0.386994 0.2811802 0.365395
15 0.395791 0.429523 0.475952 0.3283648 0.375094
16 0.350384 0.514369 0.449122 0.3794401 0.387435
17 0.561825 0.627345 0.636219 0.4688326 0.49885
18 0.95195 0.992367 0.767161 0.6579472 0.694401
19 1.54081 1.529315 1.141115 0.8110075 0.979063
20 2.850468 2.853095 1.696852 1.3423953 1.629341
21 5.207561 5.171507 3.180452 2.314101 2.830532
22 8.435477 8.562555 5.596482 4.3173407 4.92332
23 12.00507 12.23999 8.913068 7.1185897 7.537452
24 15.45744 15.6843 12.47505 10.421369 10.52937
25 18.28514 18.49821 16.00331 13.795113 13.19183
26 20.59036 20.78405 18.81848 16.754367 15.56513
27 22.08714 22.37038 21.06715 19.095436 17.54934
28 23.25291 23.51495 22.66854 21.010111 18.99617
29 23.99131 24.20761 23.73872 22.454993 20.2352
30 24.4453 24.70114 24.59113 23.410153 21.08687
31 24.74259 25.10525 25.19888 24.131386 21.6994
32 24.98374 25.26109 25.57421 24.554191 22.09661
33 25.1141 25.44124 25.70583 24.961664 22.34253
34 25.2959 25.63672 25.92781 25.134607 22.64692
35 25.29523 25.72392 25.97292 25.383184 22.73857
36 25.37572 25.78538 26.13833 25.439108 22.80516
37 25.48673 25.8027 26.32687 25.490986 22.94251
38 25.44637 25.83597 26.33189 25.598071 23.10812
39 25.41595 25.96416 26.29354 25.625749 23.02327
40 25.5418 26.02565 26.48576 25.720063 23.10226
41 25.61236 25.94986 26.45389 25.740586 23.27089
42 25.70811 26.09443 26.48187 25.843527 23.22228
43 25.5923 26.08531 26.51365 25.835689 23.23941
44 25.68285 26.18423 26.56709 25.784539 23.26417
45 25.87408 26.29419 26.59244 25.873232 23.33746
46 25.71791 26.28914 26.65421 25.881053 23.29554
47 25.82871 26.25173 26.61916 25.949872 23.38694
48 25.84879 26.35676 26.73319 25.969801 23.50514
49 25.87907 26.31227 26.75596 26.054909 23.40214
50 25.9747 26.46187 26.79372 26.092099 23.53663
2) 서로 다른 농도의 용해 시약의 존재 하에 CataCleave PCR
5 ㎕의 분쇄 우육 부유물(enrichment)(리스테리아가 접종됨)을 2.5 ㎕의 프로테나제 K(20.1 mg/ml)가 포함된 42.5 ㎕의 용해 완충액에 희석시켰다. 상기 시료를 55℃에서 15분 동안 인큐베이션시킨 다음, 95℃에서 10분 동안 열을 가한 후 냉각하였다. 이후, 17.7 ㎕의 용해물을 각각의 PCR-CataCleave 반응에 첨가하였다. 각각의 반응 믹스는 1x ICAN 증폭 완충액, 400 nM LmonC3-정방향 프라이머(서열 번호 5), 400 nM LmonC3-역방향 프라이머(서열 번호 6), 200 nM Salmonella CataCleave 프로브(서열 번호 7), dUTP/NTP 믹스(80 μM의 dGTP, dCTP, dATP 및 160 μM dUTP), 2.5 유니트의 Thermus aquaticus DNA 폴리머라제, 1 유니트의 Pyrococcus furiosis RNase HII, 및 0.1 유니트의 우라실-N-글리코실라제를 포함하였다. 이를 하기 표 7에 나타내었다.
성분 ㎕/25 ㎕ rxn
10X ICAN 완충액 2.5
Forward primer (20 μM) (서열 번호 5) 1
Reverse primer (20 μM) (서열 번호 6) 1
CC probe2 (5 μM) 서열 번호 7) 1
Fermentas dN/UTP (2/4 mM) 1
Taq 폴리머라제 (5 units/㎕) 0.5
UNG (1 unit/㎕) 0.1
RNaseH II (희석되지 않음) 0.2
용해액 17.7
상기 반응은 하기 싸이클링 프로토콜에 따라 Roche Lightcycler 480에서 수행하였다: 37℃에서 10분; 95℃에서 10분; 이후, 95℃에서 15초, 60℃에서 20초로 50회의 증폭. FAM 방출은 60℃ 단계에서 모니터 되었다. 하기 표 8는 각각의 용해 용액을 사용하여 제조된 리스테리아 용해물로의 실시간 PCR을 수행한 검출 결과를 Cp 값으로 나타낸 것이다.
번호 용해 용액 Cp values
Sample 1 Sample 2 Average
1 lx ZAC NONE NONE NONE
2 0.5x ZAC. NONE NONE NONE
3 0.425x ZAC 28.96 28.76 28.86
4 0.125x ZAC 20.35 20.29 20.32
5 0.125x TZ 20.82 20.69 20.76
CataCleave-PCR 반응으로부터 나온 미가공 데이터를 하기 표 9에 나타내었으며, 그 결과를 도 4와 같이 그래프로 도시하였다.
Cycles 1x ZAC 0.5x ZAC 0.25x ZAC 0.125x ZAC 0.125x TZ
1 0.077614 -0.09822 -0.05824 -0.039748 -0.09959
2 -0.03404 -0.13232 -0.00703 -0.100784 0.066153
3 -0.07487 -0.04901 -0.09185 -0.087871 -0.07367
4 -0.05262 0.075592 -0.02352 -0.038116 -0.05526
5 0.117787 0.078861 0.077598 0.0742302 0.054152
6 0.043737 0.026881 0.044799 0.152541 0.008622
7 0.077526 0.022978 0.187436 0.1637657 0.112786
8 0.23646 0.241467 0.328947 0.2833491 0.121347
9 0.140016 0.272779 0.211355 0.2334887 0.269803
10 0.218573 0.223797 0.261582 0.2504744 0.244063
11 0.277291 0.279521 0.266299 0.2861633 0.15492
12 0.325077 0.376643 0.342292 0.3586809 0.300062
13 0.337346 0.3866 0.316482 0.3344478 0.402511
14 0.328943 0.362677 0.361522 0.4397371 0.424708
15 0.340467 0.407566 0.435755 0.6362615 0.464939
16 0.395245 0.425083 0.519306 0.7470641 0.554457
17 0.322656 0.337854 0.581441 0.9482706 0.678852
18 0.41911 0.514666 0.731707 1.4212851 0.894617
19 0.473856 0.618876 0.700168 2.1270433 1.256995
20 0.500158 0.521623 0.85323 2.9946251 1.612553
21 0.555743 0.538892 1.000079 4.5298777 2.401413
22 0.470761 0.597689 1.251074 6.6204294 3.288291
23 0.470764 0.684364 1.463146 8.9550019 4.441369
24 0.53713 0.729281 1.898393 11.845772 5.753559
25 0.633628 0.697884 2.211707 14.716878 7.153089
26 0.515491 0.777439 2.678923 17.346757 8.789131
27 0.589652 0.655625 3.382994 19.665968 10.00318
28 0.522429 0.71433 4.224791 21.546949 11.20419
29 0.54479 0.804143 5.128984 23.008661 12.27092
30 0.68912 0.800002 6.551109 24.193586 13.25283
31 0.567998 0.806274 8.019011 25.092138 13.84691
32 0.642153 0.840272 9.626144 25.62439 14.50004
33 0.733879 0.822179 11.39364 25.988348 15.0229
34 0.752335 0.925394 13.34431 26.347945 15.52392
35 0.830317 1.101518 15.39789 26.650391 15.74119
36 0.767902 0.98976 17.1333 26.697465 16.02925
37 0.760112 0.999464 18.82938 26.826817 16.24723
38 0.733766 0.974613 20.14765 27.003224 16.64739
39 0.697606 1.043593 21.32038 27.124584 16.59615
40 0.845917 0.973702 22.30455 27.186933 16.74812
41 0.831268 1.046317 23.03147 27.145089 16.78345
42 0.841024 1.039061 23.56877 27.215777 16.80936
43 0.845868 1.059781 23.99401 27.201881 16.9304
44 0.908314 1.083918 24.17477 27.37329 16.91534
45 0.930744 1.069932 24.36045 27.441536 16.90511
46 0.834135 1.11848 24.56825 27.451427 17.03681
47 0.921012 1.18106 24.77539 27.401951 17.12249
48 0.917058 1.246983 24.75345 27.553276 17.05662
49 0.984415 1.292196 24.85161 27.601327 17.19329
50 0.943401 1.288641 24.92833 27.454465 17.15786
용해 시약 0.125x ZAC가 리스테리아 inlA 유전자의 검출을 위한 결합된(combined) 용해 및 PCR CataCleave 어세이에 최적임을 보여준다. 또한, 상기 결과는 0.125x ZAC 용해 시약이 0.125x TZ 용해 시약(A. Abolmaaty, C. Vu, J. Oliver and R. E. Levin. 2000. Microbio . 101:181-189)보다 우수함을 보여준다.
L. monocytogenes 세포를 밤샘 배양하고, 1 mg/ml의 프로테나제 K를 포함한 0.125x ZAC에 희석하여 용해시킨 다음, 2 ㎕의 상기 용해 결과물을 1x ICAN 증폭 완충액, 400 nM LmonC3-정방향 프라이머(서열 번호 5), 400 nM LmonC3-역방향 프라이머(서열 번호 6), 200 nM CataCleave 프로브(서열 번호 7), dUTP/NTP 믹스(80 μM dGTP, dCTP, dATP 및 160 μM dUTP), 2.5 유니트의 Thermus aquaticus DNA 폴리머라제, 1 유니트의 Pyrococcus furiosis RNase HII, 및 0.1 유니트의 우라실-N-글리코실라제(UNG)를 포함하는 각각의 반응 믹스에 첨가하였다.
CataCleave-PCR 반응으로부터 나온 미가공 데이터를 하기 표 10에 나타내었으며, 그 결과를 도 5와 같이 그래프로 도시하였다.
싸이클 0 1 cfu 10 cfu 100 cfu 1000 cfu
1 -0.11808 -0.07851 0.011936 -0.1002 -0.149646
2 -0.1098 0.003651 -0.02279 -0.06284 -0.112043
3 -0.01988 -0.05519 -0.02283 -0.10594 -0.011233
4 0.007606 -0.02763 -0.02418 0.007649 -0.01242
5 0.052517 0.001732 0.048378 0.021996 0.0163366
6 0.069563 0.077441 0.021426 0.139137 0.1193596
7 0.202102 0.134554 0.107333 0.195385 0.1326588
8 0.122608 0.130704 0.162061 0.192022 0.143822
9 0.203919 0.196126 0.139583 0.256238 0.1360514
10 0.197324 0.278507 0.279323 0.178584 0.2604398
11 0.285288 0.276271 0.320686 0.320353 0.3302772
12 0.34955 0.265818 0.354215 0.367903 0.3346809
13 0.409585 0.339478 0.383226 0.353521 0.3779658
14 0.31933 0.325381 0.369886 0.4411 0.3648694
15 0.463041 0.452131 0.436999 0.507587 0.5183386
16 0.516756 0.430724 0.415665 0.572943 0.4536356
17 0.508156 0.510388 0.421196 0.5928 0.4157136
18 0.490867 0.567845 0.565665 0.678261 0.5302937
19 0.568158 0.629019 0.61154 0.593995 0.6192954
20 0.654098 0.581062 0.666687 0.619606 0.5439232
21 0.716346 0.701349 0.712583 0.693985 0.6762826
22 0.697079 0.727242 0.825988 0.806229 0.7020741
23 0.791554 0.686499 0.814547 0.780522 0.6617171
24 0.772265 0.756716 0.840472 0.835031 0.8032904
25 0.746493 0.731636 0.801291 0.839517 0.8802225
26 0.735729 0.750853 0.849585 0.901836 0.8558568
27 0.69271 0.812199 0.939329 0.932909 0.9448982
28 0.832536 0.860932 0.987634 0.951846 1.0363242
29 0.886423 0.929087 1.025976 0.946459 1.2048764
30 0.957345 0.880115 1.064964 1.100577 1.5764367
31 0.922819 0.949534 1.045366 1.254494 2.4399511
32 0.916497 1.032466 1.199845 1.508678 4.1145568
33 0.950909 1.036871 1.276579 1.98907 6.4652948
34 1.051973 1.120949 1.41659 3.254214 9.2675224
35 1.086415 1.258398 1.799451 5.12161 12.081736
36 1.114276 1.35919 2.52539 7.588028 14.654087
37 1.178774 1.717959 3.988458 10.29468 16.990934
38 1.099043 2.468438 6.102741 13.08499 18.978338
39 1.197297 3.791223 8.676799 15.53072 20.586421
40 1.147104 5.919055 11.36327 17.60143 21.764495
41 1.167417 8.422044 13.9765 19.43553 22.75955
42 1.278476 11.18254 16.35152 20.87847 23.423068
43 1.275322 13.66453 18.30331 21.84246 23.924492
44 1.363122 15.96467 19.97683 22.73543 24.356174
45 1.379675 18.01129 21.35352 23.28908 24.751311
46 1.338259 19.60333 22.29651 23.76055 24.904724
47 1.328765 20.9489 23.15507 24.10402 25.016177
48 1.406084 21.91518 23.77248 24.22374 25.20868
49 1.36055 22.65522 24.1517 24.46912 25.324137
50 1.498334 23.25163 24.41868 24.64672 25.357267
도 5에서 나타난 결과는 상기 어세이가 L. monocytogenes의 1 cfu 또는 1 카피의 게놈을 검출할 수 있음을 증명한다.
본 명세서에서 개시한 어떠한 특허, 특허 출원, 공개 또는 다른 개시 자료는 그 전체로 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 여기서 참조로서 삽입된다고 한 어떠한 자료 또는 그의 일부가 본 명세서의 정의, 진술 또는 기타 개시 자료와 모순되는 경우, 삽입된 자료와 현재 개시 자료 사이에 모순되지 않는 정도로만 삽입되는 것으로 해석된다.
<110> SAMSUNG TECHWIN Corp. <120> NUCLEIC ACID TEMPLATE PREPARATION FOR REAL-TIME PCR <150> US61/312,873 <151> 2010-03-11 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tcgtcattcc attacctacc 20 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 tactgatcga taatgccaga cgaa 24 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CataCleave probe <220> <223> CataCleave probe <220> <221> misc_difference <222> (1) <223> 6-carboxyfluorescein donor chromophore <220> <221> misc_difference <222> (1)..(6) <223> DNA sequence <220> <221> misc_difference <222> (7)..(11) <223> RNA sequence <220> <221> misc_difference <222> (12)..(19) <223> DNA sequence <220> <221> misc_difference <222> (19) <223> Iowa Black Hole Quencher <400> 3 cgatcaggaa atcaaccag 19 <210> 4 <211> 1950 <212> DNA <213> Salmonella enterica <400> 4 aacagtgctc gtttacgacc tgaattactg attctggtac taatggtgat gatcatttct 60 atgttcgtca ttccattacc tacctatctg gttgatttcc tgatcgcact gaatatcgta 120 ctggcgatat tggtgtttat ggggtcgttc tacattgaca gaatcctcag tttttcaacg 180 tttcctgcgg tactgttaat taccacgctc tttcgtctgg cattatcgat cagtaccagc 240 cgtcttatct tgattgaagc cgatgccggt gaaattatcg ccacgttcgg gcaattcgtt 300 attggcgata gcctggcggt gggttttgtt gtcttctcta ttgtcaccgt ggtccagttt 360 atcgttatta ccaaaggttc agaacgcgtc gcggaagtcg cggcccgatt ttctctggat 420 ggtatgcccg gtaaacagat gagtattgat gccgatttga aggccggtat tattgatgcg 480 gatgctgcgc gcgaacggcg aagcgtactg gaaagggaaa gccagcttta cggttccttt 540 gacggtgcga tgaagtttat caaaggtgac gctattgccg gcatcattat tatctttgtg 600 aactttattg gcggtatttc ggtggggatg acccgccatg gtatggattt gtcctccgct 660 ctgtctactt ataccatgct gaccattggt gatggtcttg tcgcccagat ccccgcattg 720 ttgattgcga ttagtgccgg ttttatcgtg actcgcgtaa atggcgatag cgataatatg 780 gggcggaata tcatgacgca gctgttgaac aacccatttg tattggttgt tacggctatt 840 ttgaccattt caatgggaac tctgccggga ttcccgctgc cggtatttgt tattttatcg 900 gtggttttaa gcgtactctt ctattttaaa ttccgtgaag caaaacgtag cgccgccaaa 960 cctaaaacca gcaaaggcga gcagccgctt agtattgagg aaaaagaagg gtcgtcgttg 1020 ggactgattg gcgatctcga taaagtctct acagagaccg taccgttgat attacttgtg 1080 ccgaagagcc ggcgtgaaga tctggaaaaa gctcaacttg cggagcgtct acgtagtcag 1140 ttctttattg attatggcgt gcgcctgccg gaagtattgt tacgcgatgg cgagggcctg 1200 gacgataaca gcatcgtatt gttgattaat gagatccgtg ttgaacaatt tacggtctat 1260 tttgatttga tgcgagtggt aaattattcc gatgaagtcg tgtcctttgg tattaatcca 1320 acaatccatc agcaaggtag cagtcagtat ttctgggtaa cgcatgaaga gggggagaaa 1380 ctccgggagc ttggctatgt gttgcggaac gcgcttgatg agctttacca ctgtctggcg 1440 gtgaccgtgg cgcgcaacgt caatgaatat ttcggtattc aggaaacaaa acatatgctg 1500 gaccaactgg aagcgaaatt tcctgattta cttaaagaag tgctcagaca tgccacggta 1560 caacgtatat ctgaagtttt gcagcgttta ttaagcgaac gtgtttccgt gcgtaatatg 1620 aaattaatta tggaagcgct cgcattgtgg gcgccaagag aaaaagatgt cattaacctt 1680 gtagagcata ttcgtggagc aatggcgcgt tatatttgtc ataaattcgc caatggcggc 1740 gaattacgag cagtaatggt atctgctgaa gttgaggatg ttattcgcaa agggatccgt 1800 cagacctctg gcagtacctt cctcagcctt gacccggaag cctccgctaa tttgatggat 1860 ctcattacac ttaagttgga tgatttattg attgcacata aagatcttgt cctccttacg 1920 tctgtcgatg tccgtcgatt tattaagaaa 1950 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 acgagtaacg ggacaaatgc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tccctaatct atccgcctga 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CataCleave probe <220> <223> CataCleave probe <220> <221> misc_difference <222> (1) <223> 6-carboxyfluorescein donor chromophore <220> <221> misc_difference <222> (1)..(9) <223> DNA sequence <220> <221> misc_difference <222> (10) <223> RNA sequence <220> <221> misc_difference <222> (11)..(23) <223> DNA sequence <220> <221> misc_difference <222> (23) <223> Iowa Black Hole Quencher <400> 7 cgaatgtaac agacacggtc tca 23

Claims (41)

  1. pH 6 내지 9의 완충액; 0.125% 내지 2% 농도의 쌍성이온 디터전트(zwitterionic detergent); 0.3 내지 2.5 mg/ml 농도의 아지드; 및 프로테아제를 포함하는 용해 시약 내에서 세포를 용해시키는 단계;
    수득된 세포 용해물을 55℃에서 15분 동안 인큐베이션하여 실질적으로 단백질-불포함(protein-free) 세포 용해물을 생성하는 단계;
    95℃에서 10 분 동안 상기 프로테아제를 불활성화시키는 단계; 및
    상기 단백질-불포함 세포 용해물을 실시간 PCR 증폭 반응 혼합물에 직접 첨가하는 단계로서, 상기 혼합물은, 상기 세포 용해물 중의 표적 DNA와 어닐링할 수 있는 증폭 프라이머 세트; 검출가능한 표지 및 상기 표적 DNA의 영역과 실질적으로 상보적인 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브; 증폭 폴리머라제 활성; 증폭 완충액 및 RNase H 활성을 포함하고, 제1 및 제2 증폭 프라이머 사이의 표적 DNA의 증폭 후에, 상기 프로브 내의 RNA 서열은 상기 표적 DNA 중의 상보적인 DNA 서열과 RNA:DNA 헤테로듀플렉스를 형성할 수 있는 것인 단계를 포함하는, 실시간 PCR 증폭을 위한 핵산 주형을 제조하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 세포 용해물의 첨가는 상기 세포 용해물 내에서 단일 표적 DNA 분자의 실시간 PCR 검출을 가능하게 하는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단일 표적 DNA 분자의 실시간 PCR 검출은 50회 미만의 PCR 증폭 싸이클을 요구하는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 증폭 반응 혼합물은 역전사 효소 활성을 더 포함하는 것인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 프로브는 FRET 쌍으로 표지된 것인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 단백질-불포함 세포 용해물은 상기 증폭 반응 혼합물에 의해 5 내지 15배 희석되는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 세포는 그람-양성 및 그람-음성 세균 세포인 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 그람-양성 세균 세포는 리스테리아(Listeria)인 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 상기 완충액은 아세테이트 또는 포스페이트 완충액, Tris, 3-(N-모르폴리노) 프로판 술폰산, N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄 술폰산) 또는 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판디올 완충액을 포함하는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 쌍성이온 디터전트는 3-[(3-콜아미도프로필) 디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트인 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 프로테아제는 프로테나제 K인 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 증폭 활성은 열안정성 증폭 활성을 포함하는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 RNase H 활성은 열안정성 RNase H 활성을 포함하는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 RNase H 활성은 핫 스타트(hot start) RNase H 활성인 것인 방법.
  15. pH 6 내지 9의 완충액; 0.125% 내지 2% 농도의 쌍성이온 디터전트; 및 0.3 내지 2.5 mg/ml 농도의 아지드를 포함하는 용해 시약 내에서 세포를 용해시키는 단계;
    세포 용해물을 55℃에서 15 분 동안 인큐베이션하는 단계;
    상기 세포 용해물을 증폭 반응 혼합물에 직접 첨가하는 단계로서, 상기 혼합물은, 상기 세포 용해물 내에서 표적 DNA와 어닐링할 수 있는 증폭 프라이머 세트; 검출가능한 표지 및 상기 표적 DNA의 영역과 실질적으로 상보적인 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브; 증폭 폴리머라제 활성; 증폭 완충액 및 RNase H 활성을 포함하고, 제1 및 제2 증폭 프라이머 사이의 표적 DNA의 증폭 후에, 상기 프로브 내의 RNA 서열은 상기 표적 DNA 내의 상보적인 DNA 서열과 RNA:DNA 헤테로듀플렉스를 형성할 수 있는 것인 단계를 포함하는, 실시간 PCR 증폭을 위한 핵산 주형을 제조하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 증폭 반응 혼합물은 역전사 효소 활성을 더 포함하는 것인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 프로브는 FRET 쌍으로 표지된 것인 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 세포 용해물은 상기 증폭 반응 혼합물에 의해 5 내지 15배 희석되는 것인 방법.
  19. 제15항에 있어서, 상기 세포 용해물의 첨가는 상기 세포 용해물 내에서 단일 표적 DNA 분자의 실시간 PCR 검출을 가능하게 하는 것인 방법.
  20. 제15항에 있어서, 상기 단일 표적 DNA 분자의 실시간 PCR 검출은 50회 미만의 PCR 증폭 싸이클을 요구하는 것인 방법.
  21. 제15항에 있어서, 상기 세포는 그람-음성 세균 세포인 것인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 그람-음성 세균 세포는 살모넬라(Salmonella) 또는 대장균(E. coli)인 것인 방법.
  23. 제15항에 있어서, 상기 완충액은 아세테이트 또는 포스페이트 완충액, Tris, 3-(N-모르폴리노) 프로판 술폰산, N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄 술폰산) 또는 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판디올 완충액을 포함하는 것인 방법.
  24. 제15항에 있어서, 상기 쌍성이온 디터전트는 3-[(3-콜아미도프로필) 디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트인 것인 방법.
  25. 제15항에 있어서, 상기 증폭 활성은 열안정성 증폭 활성을 포함하는 것인 방법.
  26. 제15항에 있어서, 상기 RNase H 활성은 열안정성 RNase H 활성을 포함하는 것인 방법.
  27. 제15항에 있어서, 상기 RNase H 활성은 핫 스타트 RNase H 활성인 것인 방법.
  28. pH 6 내지 9의 완충액;
    0.125% 내지 2% 농도의 쌍성이온 디터전트, 및
    0.3 내지 2.5 mg/ml 농도의 아지드를 갖는 용해 시약으로서,
    상기 시약의 2배 희석액을,
    세포 용해물 내의 표적 DNA와 어닐링할 수 있는 증폭 프라이머 세트;
    검출가능한 표지 및 상기 표적 DNA의 영역과 실질적으로 상보적인 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브;
    증폭 폴리머라제 활성,
    증폭 완충액, 및
    RNase H 활성을 포함하는, 증폭 반응 혼합물에 직접 첨가하는 것은 상기 증폭 폴리머라제 및 RNase H 효소 활성을 저해하지 않는 것인 용해 시약.
  29. 제28항에 있어서, 상기 완충액은 아세테이트 또는 포스페이트 완충액, Tris, 3-(N-모르폴리노) 프로판 술폰산, N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄 술폰산) 또는 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판디올 완충액을 포함하는 것인 용해 시약.
  30. 제28항에 있어서, 상기 쌍성이온 디터전트는 3-[(3-콜아미도프로필) 디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트인 것인 용해 시약.
  31. 제28항에 있어서, 상기 증폭 반응 혼합물은 역전사 효소 활성을 더 포함하는 것인 용해 시약.
  32. 제28항에 있어서, 상기 증폭 활성은 열안정성 증폭 활성을 포함하는 것인 용해 시약.
  33. 제28항에 있어서, 상기 RNase H 활성은 열안정성 RNase H 활성을 포함하는 것인 용해 시약.
  34. 제28항에 있어서, 상기 RNase H 활성은 핫 스타트 RNase H 활성인 것인 용해 시약.
  35. pH 6 내지 9의 완충액;
    0.125% 내지 2% 농도의 쌍성이온 디터전트,
    0.3 내지 2.5 mg/ml 농도의 아지드, 및
    프로테아제를 갖는 용해 시약으로서,
    상기 프로테아제의 불활성화 후에, 상기 시약의 2배 희석액을
    상기 세포 용해물 내에서 표적 DNA와 어닐링할 수 있는 증폭 프라이머 세트;
    검출가능한 표지 및 상기 표적 DNA의 영역과 실질적으로 상보적인 DNA 및 RNA 핵산 서열을 포함하는 프로브;
    증폭 폴리머라제 활성,
    증폭 완충액, 및
    RNase H 활성을 포함하는, 증폭 반응 화합물에 직접 첨가하는 것은 상기 증폭 폴리머라제 및 RNase H 효소 활성을 저해하지 않는 것인 용해 시약.
  36. 제35항에 있어서, 상기 완충액은 아세테이트 또는 포스페이트 완충액, Tris, 3-(N-모르폴리노) 프로판 술폰산, N-(2-히드록시에틸) 피페라진-N'-(2-에탄 술폰산) 또는 2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판디올 완충액을 포함하는 것인 용해 시약.
  37. 제35항에 있어서, 상기 쌍성이온 디터전트는 3-[(3-콜아미도프로필) 디메틸암모니오]-1-프로판술포네이트인 것인 용해 시약.
  38. 제35항에 있어서, 상기 증폭 반응 혼합물은 역전사 효소 활성을 더 포함하는 것인 용해 시약.
  39. 제35항에 있어서, 상기 증폭 활성은 열안정성 증폭 활성을 포함하는 것인 용해 시약.
  40. 제35항에 있어서, 상기 RNase H 활성은 열안정성 RNase H 활성을 포함하는 것인 용해 시약.
  41. 제35항에 있어서, 상기 RNase H 활성은 핫 스타트 RNase H 활성인 것인 용해 시약.
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