KR20120021264A - 리스테리아 종을 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드들 및 그의 용도 - Google Patents

리스테리아 종을 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드들 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

리스테리아 종에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드, 및 그를 이용하여 시료 중의 리스테리아 종을 효율적으로 검출을 하는 키트 및 방법을 제공한다.

Description

리스테리아 종을 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드들 및 그의 용도{Oligonucleotides for detecting Listeria species and use thereof}
관련출원의 참조
본 출원은 원용에 의하여 그 내용이 여기에 포함되어지는, 2010.8.30일자로 출원된 미국 가특허출원 61/378,100으로부터의 이익을 주장한다.
분야
리스테리아 종을 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드 세트, 키트 및 그를 이용한 시료 중의 리스테리아 종을 검출하는 방법이 제공된다.
리스테리아 종에 속하는 박테리아는 그람 양성, 비포자 형성, 및 운동성 간균이며, 약 -4℃ 내지 약 45℃ 넓은 범위의 온도 및 약 ≤5.5 내지 약 9.5의 넓은 pH 범위에 걸쳐서 성장할 수 있다. 리스테리아 속에는 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 리스테리아 이노쿠아(L.innocua), 리스테리아 웰시메리 (L.welshimeri), 리스테리아 세엘리게리 (L. seeligeri), 리스테리아 이바노비 (L.ivanovii), 및 리스테리아 그라이 (L. grayi)가 포함한, 6개 종이 포함된다. 이들 중 L.모노사이토게네스가 인간 리스테리아증 발병 (listeriosis case)의 대부분의 원인이며, 면역약화된 개체, 임산부, 노인 및 신생아는 감염에 대하여 더 민감하다. 리스테리아증의 가장 일반적 증상은 패혈증, 수막염 및 유산이다.
오염된 식품의 소비는 리스테리아 감염의 주요 원인이다. 밀균되지 않은 우유, 오염된 치즈, 콜슬로 (coleslaw) 등과 같은 오염된 식품의 소비에 의하여 야기된 다양한 리스테리아-유도된 감염의 유행이 있었다. 그러므로, 식품, 표면 와이프 (wipe), 또는 의료 시료와 같은, 시료 중의 리스테리아의 빠르고, 예민하고, 및 정확한 검출 방법에 대한 증가되고 있는 요구가 있다.
요약
리스테리아 종의 빠르고, 예민하고, 및 정확한 검출에 적합한, 조성물이 제공된다. 상기 조성물은 서열번호 1 ((TTGCGAAAGAAGTAGGTATTGAG)의 서열을 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드, 서열번호 2(CAGGATTACTCGTTGATTGAATAAC) 또는 서열번호 3(GTTCCATTAAATTCTGGTTTACAGG)의 서열을 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
일 구체예에 따르면, 상기 조성물은 DNA 서열 및 RNA 서열을 포함하고, 표적 핵산에 실질적으로 상보적인 프로브 올리고뉴클레오티드를 더 포함할 수 있다. 상기 제1 및 제2 올리고뉴클레오티드 쌍은 각각 표적 핵산의 맞은편 가닥에 상보적인 서열을 가진 서열로서, 프라이머 쌍으로 사용될 수 있으며, 길이 3000bp의 표적 핵산을 정의할 수 있다. 상기 프라이머 쌍은 리스테리아 종의 독성 유전자 클러스터 (virulence gene cluster) 내의 prs 유전자에 상보적이어서, prs 유전자 내의 표적 핵산을 특이적으로 증폭하는데 사용될 수 있다. prs 유전자는 954bp를 포함하고 prfA로부터 48bp 상류에서 끝나는 오픈리딩프레임 (ORF)이다. ORF는 318개 아미노산 잔기를 코딩하며 추론된 아미노산 서열은 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 에세리키아 콜리 (Escherichia coli), 살모넬라 티피뮤리움 (Salmonella typhimurium), 인간 및 랫트의 포스포리보실 피로포스페이트 (phosphoribosyl pyrophosphate: PRPP) 신테타제와 서열 상동성이다. 프라이머 쌍을 주의 깊게 설계함으로써, 프로브와 프라이머 올리고뉴클레오티드의 조합은 리스테리아 종의 표적 핵산 서열을 증폭 및 검출할 수 있으나, 비-리스테리아 미생물의 상기 표적 핵산 서열은 증폭 및 검출할 수 없다. 구체예에 따른 상기 프라이머 쌍 및 프로브의 상기 조합은 높은 민감도로 리스테리아 종의 표적 핵산을 특이적으로 증폭 및 검출할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 프로브는 서열번호 10의 서열을 포함한다: ACAACCACGGAX1ACTTTCTTATACTTTCTTCAATG, 여기서 12 위치의 X1은 T 또는 U이고, 8-13 위치의 하나 이상의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드이다. 상기 프로브는 서열번호 6 또는 7의 서열을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 프로브 올리고뉴클레오티드는 DNA 서열 및 RNA 서열을 갖고, 서열번호 4-8의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상이다:
ACAACCArCrGrGrATACTTTCTTCAATG (서열번호 4), 여기서 각각 8, 9, 10 및 11 위치의 "rC", "rG","rG",and "rA"는 리보뉴클레오티드이고,
ACAACCACGrGATACTTTCTTCAATG (서열번호 5), 여기서 10 위치의 "rG"는 리보뉴클레오티드이고,
CATTGAArGrArArAGTATCCGTGGTTGT (서열번호 6), 여기서 각각 8, 9, 10 및 11 위치의 "rG", "rA", "rA", 및 "rA"는 리보뉴클레오티드이고,
GAAGAAAGTATCCrGrUrGrGTTGTCATG (서열번호 7), 여기서 각각 14, 15, 16, 및 17 위치의 "rG", "rU", "rG", 및 "rG"는 리보뉴클레오티드이고,
ACAACCACGrGrArUrACTTTCTTCAATG (서열번호 8), 여기서 각각 10, 11, 12, 및 13 위치의 "rG","rA","rU" 및 "rA"는 리보뉴클레오티드이다.
상기 프로브 올리고뉴클레오티드는 검출가능한 마커, 예를 들면 형광 공명 에너지 전달 (fluorescence resonance energy transfer: FRET) 쌍에 의하여 표지되어 있다.
또 다른 구체예에서, 상기 조성물을 포함하는, 시료 중의 리스테리아 종을 검출하기 위한 키트가 제공된다. 상기 키트는 증폭 활성 (amplifying activity) 및 RNase H 활성을 더 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 키트는 표적 리스테리아 종 RNA 서열의 역전사를 위한 역전사 효소 활성을 더 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 시료 중의 리스테리아 종을 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) 시료 중의 리스테리아 종의 표적 핵산을 증폭하여 상기 표적 핵산의 카피의 증가된 수를 생성하는 단계로서, 상기 증폭은 서열번호 1의 제1 프라이머 및 서열번호 2 또는 3의 제2 프라이머를 시료 중의 표적 핵산에 혼성화시켜 상기 표적 핵산과 프라이머들의 혼성화된 산물을 얻는 단계; 및 주형-의존적 핵산 폴리머라제를 이용하여 상기 혼성화된 산물의 제1 및 제2 프라이머를 연장시켜 연장된 프라이머 산물을 생성시키는 단계를 포함하는 것인 단계, (b) 상기 표적 핵산을 상기 표적 핵산에 혼성화될 수 있는 하나 이상의 프로브 올리고뉴클레오티드에 혼성화시켜 상기 표적 핵산: 프로브 올리고뉴클레오티드의 혼성화된 산물을 얻는 단계로서, 상기 프로브는 DNA 서열 및 RNA 서열을 포함하고, 검출가능한 마커에 결합되어 있는 것인 단계; (c) 상기 표적 핵산: 프로브 올리고뉴클레오티드의 혼성화된 산물을 RNase H와 접촉시켜 상기 프로브를 절단하여, 상기 표적 핵산으로 프로브 단편을 해리시키는 단계; 및 (d) 상기 검출가능한 마커를 검출하는 단계를 포함한다. .
다른 구체예에서, 시료 중의 리스테리아 종의 표적 RNA 서열을 검출하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) 역전사 효소 활성 및 리버스 증폭 프라이머의 존재하에서 리스테리아 종 표적 RNA를 역전사하여 상기 표적 RNA의 표적 cDNA를 생성하는 단계; (b) 상기 표적 cDNA 서열을 증폭하여 상기 표적 핵산의 증가된 카피 수를 생성하는 단계로서, 상기 증폭은 서열번호 1의 제1 프라이머 및 서열번호 2 또는 3의 제2 프라이머를 표적 cDNA에 혼성화시켜 상기 표적 핵산과 상기 프라이머들의 혼성화된 산물을 얻는 단계, 및 주형-의존적 핵산 폴리머라제를 이용하여 상기 혼성화된 산물의 제1 프라이머 제2 프라이머를 연장시켜 연장된 프라이머 산물을 생성하는 단계를 포함하는 것인 단계; (c) 상기 표적 핵산을 상기 표적 cDNA에 실질적으로 상보적인 하나 이상의 프로브 올리고뉴클레오티드에 혼성화시켜 상기 표적 핵산:프로브 올리고뉴클레오티드의 혼성화된 산물을 얻는 단계로서, 상기 프로브는 DNA 서열 및 RNA 서열을 포함하고, 검출가능한 마커에 결합되어 있는 것인 단계; (d) 상기 표적 핵산 : 프로브 올리고뉴클레오티드의 혼성화된 산물을 RNase H와 접촉시켜 상기 프로브를 절단하는 단계; 및 (e) 상기 프로브 상의 상기 검출가능한 마커로부터 신호 방출의 증가를 검출하는 단계로서, 상기 신호의 증가는 상기 시료 중의 상기 리스테리아 종 표적 RNA의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함한다.
상기 방법에 사용될 수 있는 상기 프로브 올리고뉴클레오티드는 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 상기 프로브 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4-8의 올리고뉴클레오티드 중 하나일 수 있다. 상기 프로브 올리고뉴클레오티드는 검출가능한 마커, 예를 들면, 형광공명에너지전달쌍 (fluorescence resonance energy transfer pair)으로 표지된 것일 수 있다
시료 중의 표적 서열의 증폭은, 폴리머라제 연쇄 반응 (미국특허 4,683,195, 4,683,202, 및 4,800,159)와 같은 임의의 핵산 증폭 방법을 사용함으로써 또는 리가제 연쇄 반응 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:189-193), 자가-지속된 서열 증폭 (Self-Sustained Sequence Replication)(Guatelli et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874-1878), 가닥 치환 증폭 (미국특허 5,270,184 및 5,455,166), 전사 증폭 시스템 (Kwoh et al., Proc. Natl.Acad. Sci. USA 86:1173-1177), Q-베타 레플리카제 (Lizardi et al., 1988, Bio/Technology 6:1197), 핵산서열기반증폭 (NASBA), 절단단편길이다형 (미국특허 5,719,028), 등온 및 키메라 프라이머-개시된 핵산 증폭 (미국특허 6,951,722), 분지-연장증폭방법 (Ramification-extension Amplification Method) (미국특허 5,719,028 및 5,942,391) 또는 핵산증폭을 위한 다른 적합한 방법을 수행함으로써 수행될 수 있다.
상기 증폭, 혼성화, 및 접촉 단계는 동시 또는 순차적으로 수행될 수 있다.
일 구체예에서, 리스테리아 종을 포함하는 상기 시료는 상기 리스테리아 종의 성장을 촉진하기 위하여, 증폭 전에 강화 배지 (enrichment medium) 중에서 배양될 수 있다. 그러한 강화 배지는 증류수 1L에 대하여, 트립틱 소이 브로쓰 (TSB: tryptic soy broth) 약 10 내지 약 40g, 효모 추출물 (YE: yeast extract) 약 1 내지 약 10g 및 리튬 클로리드 약 1 내지 약 10g을 포함할 수 있다. 상기 강화 배지는 비프 추출물 (beef extract: BE) 약 1 내지 약 10g 및/또는 리보플라빈 약 0.01 내지 약 0.5mg/L, 티아민 약 0.5 내지 약 1.5 mg/L 및 비오틴 약 0.01 내지 약 1.5mg/L을 포함하는 비타민 믹스; 피루베이트 또는 그의 염 약 1 내지 약 5g/L 및 페릭 암모늄 시트레이트 약 0.01 내지 약 1g을 더 포함할 수 있다. 상기 강화 배지는 버퍼 화합물, 예를 들면, 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산 (MOPS) 유리산 및 그의 소듐 염을 더 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 강화 배지는 증류수 1L 당, 아크리플라빈 약 1 내지 약 10mg, 폴리믹신 B 약 5 내지 약 15mg 및 세프타지딤 약 10 내지 약 30mg을 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 강화 배지는 증류수 1L에 대하여, 트립틱 소이 브로쓰(TSB) 약 10 내지 약 40g, 효모 추출물(YE) 약 1 내지 약 10g 및 리튬 클로리드 약 1 내지 약 10g; 비프 추출물(BE) 약 1 내지 약 10g 및/또는 리보플라빈 약 0.01 내지 약 0.5mg/L, 티아민 약 0.5 내지 약 1.5 mg/L 및 비오틴 약 0.01 내지 약 1.5mg/L을 포함하는 비타민 믹스; 피루베이트 또는 그의 염 약 1 내지 약 5g/L; 페릭 암모늄 시트레이트 약 0.1 내지 약 1g; MOPS 유리산 약 4g 및 소듐 MOPS 약 7.1g; 및 아크리플라빈 약 1 내지 약 10mg, 폴리믹신 B 약 5 내지 약 15mg 및 세프타지딤 약 10 내지 약 30mg을 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 강화 배지는 에스쿨린 또는 펩톤 중 하나, 또는 둘 모두를 포함하지 않는다.
다른 구체예에서, 상기 강화 배지는 증류수 1L 당, 트립틱 소이 브로쓰(TSB) 약 30g, 효모 추출물(YE) 약 6g; 리튬 클로리드 약 1 내지 약 10g; 비프 추출물(BE) 약 5g 및/또는 리보플라빈 약 0.1mg/L, 티아민 약 1.0 mg/L 및 비오틴 약 1.0mg을 포함하는 비타민 믹스; 소듐 피루베이트 약 2g; 페릭 암모늄 시트레이트 약 0.2 g; MOPS 유리산 약 4g 및 소듐 MOPS 약 7.1g; 및 아크리플라빈 약 5mg, 폴리믹신 B 약 10mg 및 세프타지딤 약 20mg을 포함할 수 있다.
다른 구체예에서, 상기 강화 배지는 BHI (brain-heart infusion) 브로쓰 또는 0.6% 효모 추출물을 포함하는 TSB일 수 있다.
위에서 논의된 강화 배지는 수성 배지, 예를 들면 물에 기초될 것일 수 있다.
리스테리아 종의 검출에 시험될 수 있는 상기 시료는 식품 시료, 의료 시료 또는 표면 와이프일 수 있다.
상세한 설명
달리 언급이 없으면, 본 명세서에 언급된 구체예의 실시는 당업계의 통상적 분자 생물학적 기법이 이용된다. 그러한 기법은 숙련된 작업자에게 잘 알려져 있으며, 문헌에 완전하게 설명되어 있다. 참조, 예를 들면, 모든 부속편 (supplements)을 포함한, Ausubel, et al., ed., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., N.Y. (1987-2008); Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989).
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 같은 의미를 갖는다. 명세서는 또한 이 출원의 개시내용 및 청구범위의 해석을 돕기 위하여 용어의 정의를 제공한다. 정의가 다른 부분의 정의와 일관되지 않는 경우, 이 출원에 개시된 상기 정의가 통제할 것이다.
본 명세서에 사용된 용어, "증폭 (amplification)"이란 뉴클레오티드 서열의 카피 수를 증가시키는 임의의 과정을 나타낸다. 핵산 증폭은 뉴클레오티드의 핵산 예를 들면, DNA 또는 RNA 내로 삽입되는 과정을 기술한다.
본 명세서에 사용된 용어, "뉴클레오티드 (nucleotide)"란 염기-당 포스페이트 조합을 나타낸다. 뉴클레오티드는 핵산 예를 들면, DNA 또는 RNA의 모노머이다. 상기 용어 뉴클레오티드는 rATP, rCTP, rGTP, 또는 rUTP와 같은 리보뉴클레오시드 트리포스페이트 및 dATP, dCTP, dGTP, 또는 dTTP와 같은 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트를 포함한다.
본 명세서에 사용된 용어, "뉴클레오시드 (nucleoside)"란 염기-당 조합 즉, 포스페이트 모이어티가 없는 뉴클레오티드를 나타낸다. 용어 뉴클레오시드와 뉴클레오티드는 당업계에서 상호교환가능성 (interchangeability) 있게 사용되는 예가 있다. 예를 들면, dUTP는 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트이며, DNA에 삽입된 후, DNA 모노머 즉, dUMP 또는 데옥시우리딘 모노포스페이트로서 역할을 한다. 이 경우 얻어진 DNA에는 dUTP가 없을 지라도 dUTP가 DNA에 삽입되었다고 표현할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction: PCR)"이란 일반적으로 시료 중의 표적 핵산의 카피 수를 증가시키기 위한 증폭방법을 나타낸다. 상기 과정은 그 전체로서 그 내용이 본 명세서에 통합되어지는 미국특허 4,683,202, 4,683,195, 4,800,159, 및 4,965,188에 상세하게 기술되어 있다. 상기 시료는 단일 핵산 또는 복수 개의 핵산을 포함할 수 있다. 일반적으로 PCR 과정은 2이상의 연장가능한 프라이머 핵산을 표적 핵산을 포함하는 반응 혼합물에 도입하는 것을 포함한다. 상기 프라이머는 2중가닥 표적 서열의 맞은편 가닥에 상보적이다. 상기 반응 혼합물에 대하여 핵산 폴리머라제 및 핵산 모노머, 예를 들면 dNTP 및 rNTP의 존재하에서 열순환 (thermal cycling)을 수행하여, 상기 프라이머로부터 연장된 표적 핵산을 증폭한다. 상기 열순환은 일반적으로 프라이머와 표적 핵산을 혼성화시키는 어닐링, 핵산 폴리머라제에 의한 상기 프라이머의 연장 및 혼성화된 프라이머 연장 산물과 표적 핵산을 변성하는 과정을 포함할 수 있다. 용어 "역전사-PCR (reverse transciptase-PCR: RT-PCR)"은 RNA 주형 및 역전사 효소, 또는 역전사 활성을 가진 효소를 사용하여 다수회의 DNA-의존성 DNA 폴리머라제 프라이머 연장 이전에 단일가닥 DNA 분자를 생성하는 PCR이다. 용어 "다중 PCR (multiplex PCR)"은 일반적으로 단일반응 중에 2 이상의 프라이머를 포함시켜, 단일 반응에서 2이상의 증폭산물을 생성하는 PCR이다.
본 명세서에 사용된 용어, "핵산 (nucleic acid)"은 2이상의 뉴클레오티드를 포함하는 중합체를 의미한다. 상기 핵산은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드와 교환가능하게 사용된다. 상기 핵산은 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 핵산은 이중가닥 및/또는 단일가닥의 형태를 갖는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "핵산 아날로그 (nucleic acid analog)"는 하나이상의 뉴클레오티드 아날로그 및/또는 하나이상의 포스페이트 에스테르 아날로그 및/또는 하나이상의 펜토즈 당 아날로그를 포함하는 분자를 나타낸다. 핵산 아날로그의 예는 포스페이트 에스테르 및/또는 당 포스페이트 에스테르 결합이 다른 형태의 결합, 예를 들면 N-(2-아미노에틸)-글리신 아미드 및 다른 아미드 결합으로 치환된 것을 포함할 수 있다. 또한, 상기 핵산 아날로그는 하나이상의 뉴클레오티드 아날로그 및/또는 하나이상의 포스페이트 에스테르 아날로그 및/또는 하나이상의 펜토즈 당 아날로그를 포함하는 분자이면서, 혼성화에 의하여 이중가닥을 형성할수 있는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "어닐링 (annealing)" 및 "혼성화 (hybridization)"는 교환가능하게 사용되며, 이중가닥, 삼중가닥 또는 더 고차 구조를 생성하게 하는 한 핵산과 다른 핵산 사이의 염기쌍 상호작용 (base-pairing interaction)을 의미한다. 상기 상호작용의 일 예는 왓슨/크릭 (Watson/Crick) 및 후스틴 (Hoogsteen)-타입 수소 결합에 의한 염기 특이적 일차 상호작용, 예를 들면 A/T, 및 G/C 상호작용일 수 있다. 또한, 염기-스택킹 및 소수성 결합은 이중가닥 안정성에 또한 기여할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "프로브 (probe)"는 표적 핵산 영역 중의 서열과의 서열 상보성으로 인하여 표적핵산과 이중가닥 (duplex)을 형성할 수 있는 핵산을 나타낸다. 상기 상보성은 부분 또는 완전 상보성일 수 있다. 상기 프로브는 PCR 반응과 동시에 표적 핵산을 검출하기 위하여 표지되어 있는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, "표적 핵산 (target nucleic acid)" 또는 "표적 서열 (target sequence)"은 증폭되거나 및/또는 검출될 표적핵산의 전장 길이 또는 단편을 포함한다. 표적 핵산은 증폭을 위하여 사용되는 두 개 프라이머의 사이에 존재할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어, 올리고뉴클오티드와 관련하여 "하이브리드 올리고뉴클오티드 (hybrid oligonucleotide)"는 단일 분자 내에 DNA 및 RNA 부분을 포함하는 올리고뉴클오티드 분자를 의미한다. 상기 하이브리드 올리고뉴클오티드는 하나의 DNA 부분 및 하나의 RNA 부분 이상, 예를 들면, DNA-RNA, RNA-DNA, 또는 DNA-RNA-DNA 올리고뉴클오티드를 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 리스테리아 종을 검출하기 위한 올리고뉴클레오티드 세트는 서열번호 1의 서열을 포함하는 제1 프라이머; 서열번호 2 또는 3의 서열을 포함하는 하나 이상의 제2 프라이머; 및 서열번호 10의 서열을 프로브를 포함한다. 다른 구체예에서, 상기 프로브는 서열번호 6 또는 7의 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 10의 서열은 서열번호 4, 5, 및 8의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 서열을 포함할 수 있다.
포워드 프라이머 및 리버스 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍은 표적 핵산의 각 맞은편 가닥에 실질적으로 상보적인 서열을 갖고, 표적 핵산을 정의할 수 있다. 상기 프라이머 쌍은 리스테리아 종의 prs 유전자에 실질적으로 상보적이고, prs 유전자 내의 표적 핵산을 특이적으로 증폭하는데 사용될 수 있다. prs 유전자는 954bp를 포함하고 prfA로부터 48bp 상류에서 끝나는 오픈리딩프레임 (ORF)이다.
구체예에 따르면, 프로브는 표적 핵산에 완전하게 상보적인 서열 및 특이적인 혼성화를 저해하지 않는 실질적으로 상보적인 서열을 포함할 수 있다. 혼성화에 적합한 조건은 아래에 기술되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "실질적으로 상보적인 (substantially complementary)"은 혼성화되어 안정한 이중가닥체 (duplex)를 형성하기에 충분하게 서열이 상보적인 두 핵산 가닥을 나타낸다. 상기 상보성 (complementarity)은 완벽할 필요는 없다. 예를 들면, 두 핵산 가닥 사이에 많은 수의 염기쌍 미스매치가 있을 수 있다. 그러나, 미스매치의 수는 너무 커서 최소한의 엄격한 조건 (least stringent conditions)에서 일지라도 혼성화가 일어나지 않으면, 그 서열은 실질적으로 상보적 서열이 아니다. 두 서열이 여기서 "실질적으로 상보적인"으로 나타내어지는 경우, 그것은 그 서열들이 서로 충분히 상보적이어서 선택된 반응 조건하에서 혼성화한다는 것을 의미한다. 핵산 상보성과 특이성을 달성하기에 충분한 혼성화의 엄격성의 관계는 당업계에 잘 알려져 있다. 두 실질적으로 상보적인 가닥들은 예를 들면, 완벽하게 상보적일 수 있고, 상기 혼성화 조건이 예를 들면, 특이적 쌍 서열 (pairing sequence)과 비특이적 쌍 서열 사이의 구별이 될 수 있도록 하기에 충분한 한, 0 내지 많은 미스매치를 포함할 수 있다. 따라서, "실질적으로 상보적인" 서열은 이중가닥 쌍 영역 (pairing region) 중에서, 100, 95, 90, 80, 75, 70, 60, 50 이하, 또는 그 사이의 임의의 수의 염기쌍 상보성을 갖는 서열을 나타낼 수 있다.
본 명세서에 사용된, "실질적으로 상보적인 서열 (substantially complementary sequence)"은 당업계에서 알려진 엄격한 조건하에서 주형 폴리뉴클레오티드와 혼성화할 수 있는 서열이다. 본 명세서에서 사용된 "엄격한 조건 (stringent conditions)"은 Joseph Sambrook 등, Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes,B.D.등, Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press,Washington, D.C.(1985)에 기술되어 있으며, 온도, 이온강도 (버퍼 용액의 농도), 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재를 조절함으로써 결정될 수 있다. 예를 들면, 상기 엄격한 조건은 a) 50℃에서 0.015 M 소듐 클로리드/0.0015 M 소듐 시트레이트/0.1% 소듐 도데실 술페이트 용액의 존재하에서 인큐베이션, 또는 b) 55℃에서 50% 포름아미드, 2xSSC 및 10% 덱스트란 술페이트를 포함하는 혼성화 버퍼 중에서 혼성화 및 55℃에서 EDTA-함유 0.1xSSC에서 세척에 의하여 얻어질 수 있다.
일 구체예에서, 상기 프로브는 DNA-RNA-DNA의 구조를 가질 수 있다. 상기 프로브는 핵산 또는 핵산 아날로그일 수 있다. 또한, 상기 프로브는 보호된 핵산일 수 있다. 상기 프로브는 예를 들면, 상기 DNA 부분 또는 RNA 부분의 일 부분이 메틸화되어 있어, RNA 특이적 분해 효소 (예, RNase H)에 대하여 분해저항성인 것일 수 있다.
상기 프로브는 변형된 것일 수 있다. 예를 들면, 그 염기 부분이 부분적으로 또는 전체적으로 메틸화될 수 있다. 이러한 변형에 의하여 효소 또는 화학적 분해가 저해될 수 있다. 또한, 상기 프로브 핵산의 5' 말단 또는 3' 말단 -OH기는 차단되어 있는 것일 수 있다. 상기 프로브 핵산의 3' 말단의 OH 기는 차단되어 있어 주형 의존적 핵산 폴리머라제에 의한 프라이머 연장이 될 수 없도록 된 것일 수 있다.
상기 프로브는 검출가능한 표지를 가질 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 당업계에 알려진 검출 방법에 의하여 검출될 수 있는 화학적 모이어티일 수 있다. 예를 들면, 상기 검출가능한 표지는 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적, 또는 화학적 수단에 의하여 검출가능한 모이어티일 수 있다. 상기 핵산 프로브에 표지를 도입하는 방법은 표지의 타입 및 표지와 프로브의 위치에 따라 달라질 수 있다. 상기 표지는 효소, 효소 기질, 방사능 물질, 형광 염료, 발색소 (chromophore), 화학발광 표지, 전기화학발광표지, 특정 결합 파트너를 갖는 리간드, 및 서로 상호작용하여 신호를 증가, 변화 또는 감소시키는 다른 표지로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 표지는 PCR의 열순환 과정에서 생존할 수 있는 것일 수 있다.
상기 검출가능한 표지는 FRET 쌍인 것일 수 있다. 상기 검출가능한 표지는 적절한 거리에 의하여 이격되어 있는 형광 도너 및 형광 수용자를 포함하고 도너 형광 발광이 수용자에 의하여 억제되어 있는 FRET 쌍일 수 있다. 그러나, 도너-수용자 쌍은 절단에 의하여 해리되는 경우, 도너 형광 방출이 증진된다. 상기 프로브는 절단이 없는 경우 두 발색소 사이에 FRET에 의하여, 도너 발광은 수용자 발색소에 의하여 억제되어 있도록 일반적으로 설계된다. 쌍이 근접하여 있는 경우, 여기 상태의 도너 발색소는 수용자 발색소로 에너지를 전달할 수 있다. 이 전달은 항상 비방사적 (non-radiative)이며 쌍극자-쌍극자 커플링을 통하여 일어날 수 있다. 상기 발색소 사이의 거리를 충분하게 증가시키는 임의의 과정은 FRET 효율을 감소시켜 도너 발색소 발광이 방사적으로 검출될 수 있을 것이다. 도너 발색소는 FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5 및 Texas Red를 포함할 수 있다. 수용자 발색소는 그들의 여기 스펙트라가 도너의 발광 스펙트럼과 겹치도록 선택될 수 있다. 그러한 쌍의 예는 FAM-TAMRA이다. 또한, 상기 표지는 넓은 범위의 도너를 억제 (quenching)하는 비형광 수용자일 수 있다. 도너-수용자 FRET 쌍의 다른 예는 당업계에 알려져 있다.
일 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 용액 중에 유리된 형태 또는 유래 형태로 존재할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 고체 지지체에 부착되어 있을 수 있다. 다른 프로브들이 상기 고체 지지체에 부착되어 있을 수 있고 시료 중의 다른 표적 서열을 동시에 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 다른 형광 파장을 가진 리포터 분자가 상기 다른 프로브들 상에서 사용될 수 있고, 그에 따라 상기 다른 프로브들에 대한 혼성화가 개별적으로 검출될 수 있도록 한다.
상기 올리고뉴클레오티드 프로브의 고정화를 위한 고체 지지체의 바람직한 타입의 예는 폴리스티렌, 아비딘 코팅된 폴리스티렌 비드 셀룰로즈, 나일론, 아크릴아미드 겔 및 활성화된 덱스트란, 조절된 공극 유리 (CPG), 유리 플레이트 및 고도로 가교된 폴리스티렌을 포함한다. 이들 고체 지지체는 그들의 화학적 안정성, 관능화의 용이, 및 잘 정의된 표면적으로 인하여 혼성화 및 진단 연구에 바람직하다. 조절된 공극 유리 (500Å, 1000Å) 및 비-부풀림 (non-swelling) 고도 가교- 폴리스티렌 (1000Å)은 올리고뉴클레오티드 합성과의 적합성의 관점에서 특히 바람직하다.
상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 다양한 방식으로 상기 고체 지지체에 부착되어 있을 수 있다. 예를 들면, 상기 프로브는 상기 고체 지지체에 상기 프로브의 3' 또는 5' 말단 뉴클레오티드의 부착에 의하여 상기 고체 지지체에 부착되어 있을 수 있다. 그러나, 상기 프로브는 상기 고체 지지체로부터 상기 프로브를 분리하는 역할을 하는 링커에 의하여 상기 고체 지지체에 부착되어 있을 수 있다. 상기 링커는 가장 바람직하게는 길이 30 원자 이상이고, 더 바람직하게는 길이 50 원자 이상이다.
일반적으로 고체 지지체에 고정화된 프로브의 혼성화는 상기 프로브가 상기 고정화로부터 30 원자 이상, 더 바람직하게는 길이 50 원자 이상에 의하여 분리되어 있을 것을 필요로 한다. 이 분리를 달성하기 위하여, 상기 링커는 상기 링커와 3' 뉴클레오시드 사이에 위치한 스페이서를 일반적으로 포함한다. 올리고뉴클레오티드 합성을 위하여, 상기 링커 암은 염기성 시약에 의하여 절단되어 상기 고체 지지체로부터 상기 올리고뉴클레오티드를 유리시킬 수 있는 에스테르 결합에 의하여 상기 3' 뉴클레오시드의 3'-OH에 보통 부착되어 있다.
상기 올리고뉴클레오티드를 상기 고체 지지체에 부착하기 위하여 사용될 수 있는 다양한 링커가 당업계에 알려져 있다. 상기 링커는 상기 고체 지지체에 부착된 상기 프로브에 상기 표적 서열의 혼성화를 유의하게 (significantly) 간섭하지 않는 임의의 화합물로 형성될 수 있다. 상기 링커는 자동화된 합성에 의하여 상기 링커에 용이하게 부가될 수 있는 호모폴리머성 올리고뉴클레오티드로 형성될 수 있다. 대안적으로, 관능화된 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리머가 상기 링커로서 사용될 수 있다. 그러한 폴리머는 상기 표적 올리고뉴클레오티드에 프로브의 혼성화를 유의하게 간섭하지 않기 때문에 호모폴리머성 올리고뉴클레오티드에 비하여 더 바람직하다. 폴리에틸렌 글리콜은 상업적으로 이용가능하고, 유리 및 수성 매질에 가용성이고, 관능화하기 쉽고, 올리고뉴클레오티드 합성 및 합성 후 조건 하에서 완전하게 안정하기 때문에 특히 바람직하다.
상기 고체 지지체, 링커 및 상기 프로브 사이의 결합 (linkage)은 고온에서 염기성 조건에서 염기 보호기의 제거 동안 절단되지 않는 것이 바람직하다. 바람직한 결합의 예는 카르바메이트 및 아미드 결합을 포함한다. 프로브의 고정화는 당업계에 잘 알려져 있으며 당업자는 상기 고정화 조건을 결정할 수 있을 것이다.
상기 방법의 일 구체예에 따르면, 상기 혼성화 프로브는 고체 지지체 상에 고정되어 있다. 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 혼성화에 유리한 조건하에서 핵산 시료와 접촉된다. 혼성화되지 않은 상태에서, 형광 표지는 상기 수용자에 의하여 억제되어 있다. 상기 표적에 혼성화는 경우, 상기 형광 표지는 상기 억제자로부터 분리되고 상기 형광 방출이 증진된다.
상기 고체 지지체에 상기 혼성화 프로브의 고정화는 또한 상기 프로브에 혼성화된 상기 표적 서열이 상기 시료로부터 용이하게 분리될 수 있도록 한다. 이후 단계에서, 상기 분리된 표적 서열은 상기 고체 지지체로부터 분리될 수 있고 연구자의 특정 필요에 따라 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 처리 (예, 정제, 증폭)될 수 있다.
일 구체예에서, 리스테리아 종을 검출하는데 적합한 상기 올리고뉴클레오티드 세트는 서열번호 1의 제1 프라이머; 서열번호 2의 제2 프라이머; 및 서열번호 5의 프로브를 포함할 수 있다.
상기 올리고뉴클레오티드 세트는 표적 핵산의 증폭 및 검출에 사용될 수 있다. 상기 증폭은 PCR 단편 또는 암플리콘이 형성되게 하는, 주형 의존적 폴리머라제를 사용하여 상기 프라이머를 연장하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응, 리가제 연쇄 반응, 자가-지속된 서열 증폭, 가닥 치환 증폭, 전사 증폭 시스템, Q-베타 레플리카제, 핵산서열기반증폭 (NASBA), 절단단편길이다형, 등온 및 키메라 프라이머-개시된 핵산 증폭, 분지-연장증폭방법 또는 핵산증폭을 위한 다른 적합한 방법으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 방법에 의하여 달성될 수 있다. 상기 증폭은 표적 핵산의 동시적 실시간 검출을 포함할 수 있다.
상기 용어 "PCR 단편 (PCR fragment)" 또는 "암플리콘 (amplicon)"은 특정 표적 핵산의 증폭 후 생산된 폴리뉴클레오티드 분자 (또는 집합적으로 복수의 분자들)를 나타낸다. PCR 단편은 일반적으로, 그러나 배타적이지는 않는, DNA PCR 단편이다. PCR 단편은 단일가닥 또는 이중가닥, 또는 임의의 농도 비율의 이들의 혼합물일 수 있다. PCR 단편은 길이 100-500 뉴클레오티드 이상일 수 있다.
증폭 "버퍼 (buffer)"는 상기 증폭 반응을 조절함으로써 증폭 반응의 하나 이상의 성분의 안정성 및/또는 활성을 변경하는 증폭 반응에 첨가된 화합물이다. 본 발명의 상기 버퍼제 (buffering agent)는 PCR 증폭 및 RNase H 활성과 적합하다 (compatible). 버퍼의 예는 HEPES ((4-(2-히드록시에틸)-1-피페라진에탄술폰산), MOPS (3-(N-모르폴리노)프로판술폰산), 및 아세테이트 또는 포스페이트 함유 버퍼 등을 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 더욱이, PCR 버퍼는 일반적으로 약 70 mM 이하의 KCl 및 약 1.5 mM 또는 그 보다 높은 MgCl2, 및 약 50-200 μM의 각 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP를 포함할 수 있다. 본 발명의 상기 버퍼는 첨가제 (additive)를 포함하여 효율적인 역전사 효소-PCR 또는 PCR 반응을 최적화할 수 있다.
첨가제는 상기 조성물의 하나 이상의 성분의 안정성 및/또는 활성, 및/또는 수명 (longevity)을 변경하는 조성물에 첨가된 화합물이다. 특정 구체예에서, 상기 첨가제는 오염 효소를 불활성화하고, 단백질 접힘을 안정화하고, 및/또는 응집을 감소시킨다. 증폭 반응에 포함될 수 있는 예시적 첨가제는 베타인, 포름아미드, KCl, CaCl2, MgOAc, MgCl2, NaCl, NH4OAc, NaI, Na(CO3)2, LiCl, MnOAc, NMP, 트레할로즈, 디메틸술폭시드 ("DMSO"), 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 디티오트레이톨 ("DTT"), (터모플라즈마 아씨도필룸 (Thermoplasma acidophilum) 무기 피로포스파타제 ("TAP"))를 포함하나, 이들 한정되지는 않는) 피로포스파타제, 소혈청알부민 ("BSA"), 프로필렌 글리콜, 글리신아미드, CHES, 페르콜 (Percoll), 아우린트리카르복실산 (aurintricarboxylic acid), Tween 20, Tween 21, Tween 40, Tween 60, Tween 85, Brij 30, NP-40, Triton X-100, CHAPS, CHAPSO, Mackernium, LDAO (N-도데실-N,N-디메틸아민-N-옥시드), Zwittergent 3-10, Xwittergent 3-14, Xwittergent SB 3-16, Empigen, NDSB-20, T4G32, 대장균 SSB, RecA, 니킹 엔도뉴클레아제, 7-deazaG, dUTP, 음이온성 계면활성제, 양이온성 계면활성제, 비이온성 계면활성제, 양쪽성계면활성제 (zwittergent), 스테롤, 오스몰라이트 (osmolytes), 양이온, 및 증폭의 효율을 변경시킬 수 있는 임의의 다른 화학물질, 단백질, 또는 보조인자를 포함하나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다. 특정 구체예들에서, 2 이상의 첨가제들이 증폭 반응에 포함된다. 첨가제들은 상기 첨가제가 RNase H의 활성을 간섭하지 않는 한 프라이머 어닐링의 선택성을 개선하기 위하여 선택적으로 부가될 수 있다.
본 명세서에 사용되고, 효소에 적용되는, 용어 "열안정성 (thermostable)"은 상승된 온도 (예, 55℃ 또는 그보다 높은 )에서 생물학적 활성을 보유하는, 또는 가열 및 냉각의 반복된 주기 후 생물학적 활성을 보유하는 효소를 나타낸다. 열안정성 폴리뉴클레오티드 폴리머라제는 PCR 증폭 반응에 특히 유용하다.
본 명세서에 사용된, "열안정성 폴리머라제 (thermostable polymerase)"는 열에 상대적으로 안정하고 각 PCR 주기 전에 효소를 부가할 필요를 제거하는 효소이다. 열안정성 폴리머라제의 비한정적 예는 호열성 박테리아 터무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus)(Taq 폴리머라제), 터무스 터모필루스 (Thermus thermophilus) (Tth 폴리머라제), 터모코쿠스 리토랄리스 (Thermococcus litoralis) (Tli 또는 VENT 폴리머라제), 피로코쿠스 푸리오수스 (Pyrococcus furiosus) (Pfu 또는 DEEPVENT 폴리머라제), 피로코쿠스 우우시이 (Pyrococcus woosii) (Pwo 폴리머라제) 및 다른 피로코쿠스 종, 바실루스 스테아로터모필루스 (Bacillus stearothermophilus) (Bst 폴리머라제), 술폴로부스 아씨도칼다리우스 (Sulfolobus acidocaldarius) (Sac 폴리머라제), 터모플라즈마 아씨도필룸 (Thermoplasma acidophilum) (Tac 폴리머라제), 터무스 루베르 (Thermus rubber) (Tru 폴리머라제), 터무스 브로키아누스 (Thermus brockianus) (DYNAZYME 폴리머라제), 터모토가 네아폴리타나 (Thermotoga neapolitana) (Tne 폴리머라제), 터모토가 마리티메 (Thermotoga maritime)(Tma) 및 터모토가 속 (Tsp 폴리머라제)의 다른 종, 및 메타노박테리움 터모아우토트로피쿰 (Methanobacterium thermoautotrophicum) (Mth 폴리머라제)로부터 분리된 폴리머라제를 포함할 수 있다. 상기 PCR 반응은 표적 서열의 더 효율적인 증폭을 유도하는 상보적 특성을 가진 하나 이상의 열안정성 폴리머라제를 포함할 수 있다. 예를 들면, 높은 가공성 (processivity) (큰 뉴클레오티드 세그멘트를 복사할 수 있는 능력)을 가진 뉴클레오티드 폴리머라제가 교정 능력 (proofreading capability) (표적 핵산 서열의 신장 동안 오류를 교정하는 능력)을 가진 다른 뉴클레오티드 폴리머라제에 의하여 보완될 수 있고, 그에 따라 높은 신뢰도 (fidelity)로 긴 표적 서열을 복사할 수 있는 PCR 반응을 생성할 수 있다. 상기 열안정성 폴리머라제는 야생형 형태로 사용될 수 있다. 대안적으로, 상기 폴리머라제는 변형되어 PCR 반응을 촉진하기 위한 이로운 특성을 제공하는 효소의 단편을 포함하거나, 또는 돌연변이를 포함할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 열안정성 폴리머라제는 Taq 폴리머라제일 수 있다. 증진된 특성을 갖는 Taq 폴리머라제의 많은 변이체는 알려져 있으며, AmpliTaq, AmpliTaq Stoffel 단편, SuperTaq, SuperTaq plus, LA Taq, LApro Taq, 및 EX Taq을 포함한다.
유전자 발현을 연구하기 위하여 가장 널리된 사용된 기법 중의 하나는 상기 PCR에 의한 증폭을 위한 주형으로서 mRNA 서열에 대한 제1 가닥 cDNA를 이용한다. 종종 역전사 효소-PCR로 불리는, 이 방법은 PCR 과정의 높은 민감도 및 특이도를 이용하고, RNA의 검출 및 정량화를 위하여 널리 사용되고 있다.
종말점 (end-point) 또는 실시간 분석으로서 수행된, 상기 역전사 효소-PCR 과정은 2개의 분리된 분자적 합성을 포함한다: (i) RNA 주형으로부터 cDNA의 합성; 및 (ii) PCR 증폭을 통한 새로 합성된 cDNA의 복제. 역전사 효소-PCR과 종종 연관된 기술적 문제점을 해결하기 위한 시도를 위하여, 상기 과정의 하기 3개 기본 단계를 고려하여 많은 프로토콜이 개발되었다: (a) RNA의 변성 및 리버스 프라이머의 혼성화; (b) cDNA의 합성; 및 (c) PCR 증폭. 소위 "결합되지 않은 (uncoupled)" 역전사 효소-PCR 과정 (예, 2 단계 역전사 효소-PCR)에서, 역전사는 역전사 효소 활성을 위한 최적 버퍼 조건을 사용한 독립적 단계로서 수행된다. cDNA 합성 후, 상기 반응물은 희석되어 MgCl2를 감소시키고, 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트 (dNTP) 농도를 Taq DNA 폴리머라제 활성에 대한 최적 조건이 되게 하고, PCR이 표준 조건 (참조 미국특허 4,683,195 및 4,683,202)에 따라 수행된다.
대조적으로, "결합된 (coupled)" 역전사 효소-PCR 방법은 역전사 효소 및 Taq DNA 폴리머라제 활성을 위한 통상 버퍼를 사용한다. 일 버전에서, 리버스 프라이머의 어닐링은 효소의 첨가 전의 분리된 단계이고, 다음으로 효소가 단일 반응 용기에 첨가된다. 다른 버전에서, 역전사 효소 활성은 열안정성 Tth DNA 폴리머라제의 성분이다. 어닐링 및 cDNA 합성은 Mn2 +의 존재하에서 수행되고, 다음으로 PCR은 킬레이트제에 의한 Mn2 +의 제거 후 Mg2 +의 존재하에서 수행된다. 마지막으로, "연속적 (continuous)" 방법 (예, 일 단계 역전사 효소-PCR)은 상기 3개 역전사 효소-PCR 단계를 성분 또는 효소 첨가를 위하여 반응 튜브의 개봉을 회피하는, 단일연속반응으로 통합한다. 연속적 역전사 효소-PCR은 열안정성 Taq DNA 폴리머라제 및 Tth 폴리머라제의 역전사 효소 활성을 사용한 단일 효소 시스템으로서 및 초기 65℃ RNA 변성 단계가 생략된 AMV 역전사 효소 및 Taq DNA 폴리머라제를 사용한 2개 효소 시스템으로서 기술된 바 있다.
실시간, 역전사-PCR에서 첫 단계는 주형 특이적 DNA 프라이머 중 하나를 사용하여 상보적 DNA 가닥을 생성하는 것이다. 전통적 PCR 반응에 있어서, 이 산물은 변성되고, 제2 주형 특이적 DNA 프라이머가 상기 cDNA에 결합하고, 연장되어 이중가닥체 DNA를 형성한다. 이 산물은 온도 주기화의 다음 회에서 증폭된다. 가장 높은 민감도를 유지하기 위하여, cDNA의 합성 전에 RNA가 분해되지 않는 것이 중요하다. 반응 버퍼 중의 RNase H의 존재는 이 효소의 기질로 작용할 수 있는, 상기 과정의 첫 단계에서 형성된 RNA:DNA 하이브리드의 원하지 않는 분해를 야기할 것이다. 이 문제를 해결하기 위한 2개 주요 방법들이 있다. 하는 초기 높은 온도 DNA 변성 단계 동안 녹을 왁스와 같은 장벽을 사용하여 상기 역전사 반응의 나머지로부터 RNase H를 물리적으로 분리하는 것이다. 제2 방법은 RNase H를 변형시켜, 역전사 온도, 보통 45-55℃에서 불활성이도록 하는 것이다. RNase H의 항체와의 반응, 또는 가역적 화학적 변형을 포함하는, 여러 방법이 당업계에 알려져 있다.프로브 예를 들면, 본 명세서에 사용된, 핫 스타트 RNase H 활성은 상기 RNase H와 알칼리 조건하에서 시스-아코니트산 무수물 (cis-aconitic anhydride)의 반응 후 생성된 가역적 화학 변형을 갖는 RNase H일 수 있다. 상기 변형된 효소가 Tris 기반 버퍼를 가진 반응물에 사용되고 온도가 95℃까지 상승되는 경우, 상기 용액의 pH는 떨어지고 RNase H 활성은 회복된다. 이 방법은 역전사의 개시 전에 반응 혼합물 중에 RNase H를 포함할 수 있도록 한다.
본 발명에 이용될 수 있는 RNase H 효소 및 핫 스타트 RNase H 효소의 추가적 예는 그 내용이 전체로서 본 명세서에 포함되어지는, Walder 등의 미국 특허출원 공개 2009/0325169에 기술되어 있다.
일 단계 역전사 효소-PCR은 결합되지 않은 역전사 효소-PCR에 비하여 여러 잇점을 제공한다. 일 단계 역전사 효소-PCR은 결합되지 않은 역전사 효소-PCR (예, 2개 반응 단계 사이에 성분 또는 효소 첨가를 위하여 반응 튜브의 개봉) 보다 반응 혼합물 시약 및 핵산 산물의 감소된 취급을 요구하고, 따라서 덜 농도 집약적이어서 필요한 노동시간을 감소시킨다. 일 단계 역전사 효소-PCR은 또한 오염의 위험을 감소시킨다. 일 단계 역전사 효소-PCR의 민감도 및 특이도는 주어진 시료에서 하나 내지 여러 유전자의 발현 수준을 연구하는데 또는 병원체 RNA의 검출에 아주 적합한 것으로 증명되었다. 일반적으로 이 과정은 cDNA 합성을 개시하기 위하여 유전자-특이적 프라이머의 사용에 한정되었다.
이들 역전사 효소-PCR 기법과 조합된 실시간 검출에 의한 PCR 반응의 속도론 (kinetics)을 측정하기 위한 능력은 높은 민감도로 RNA 카피 수를 정확하고 정밀하게 결정하는 것을 가능하게 하였다. 이것은 형광 모니터링을 통한 상기 역전사 효소-PCR 산물을 검출하고 하기하는, 5' 형광 뉴클레아제 분석 ("TaqMan") 또는 엔도뉴클레아제 분석 (때때로 "CataCleave"라 함)과 같은 형광 이중-표지된 혼성화 프로브 기술 (dual-labeled hybridization technology)에 의한 증폭 과정 동안 PCR 산물의 측정에 의하여 가능하게 되었다.
증폭 후 암플리콘 검출은 노동이 많이 들고 시간 소비적이다. 실시간 방법은 PCR 과정 동안 증폭을 모니터링하기 위하여 개발되었다. 이들 방법들은 일반적으로 새로 합성된 DNA에 결합하는 형광적으로 표지된 프로브 또는 이중가닥 DNA에 끼어드는 경우 형광 방출이 증가되는 염료를 이용한다.
상기 프로브들은 일반적으로 두 개 발색소 사이의 형광공명에너지전달 (FRET)에 의하여 표적이 없는 경우 (in the absence of target) 도너 발광이 억제되어 있도록 설계되어 있다. 도너 발색소와 수용자 발색소가 서로 가깝게 위치하여 있는 경우, 여기 상태에 있는, 도너 발색소는 수용자 발색소에 에너지를 전달할 수 있다. 이 전달은 항상 비방사적이며 쌍극자-쌍극자 커플링을 통하여 일어날 수 있다. 상기 발색소 사이의 거리를 충분하게 증가시키는 임의의 과정은 FRET 효율을 감소시켜 도너 발색소 발광이 방사적으로 검출될 수 있을 것이다. 통상의 도너 발색소는 FAM, TAMRA, VIC, JOE, Cy3, Cy5 및 Texas Red를 포함한다. 수용자 발색소는 그들의 여기 스펙트라가 도너의 발광 스펙트럼과 겹치도록 선택될 수 있다. 그러한 쌍의 예는 FAM-TAMRA이다. 또한, 넓은 범위의 도너를 억제하는 비형광 수용자가 있다. 도너-수용자 FRET 쌍의 다른 예는 당업계에 알려져 있다.
PCR의 실시간 검출에 사용될 수 있는 FRET 프로브의 통상의 예는 분자 비콘 (molecular beacons) (예, 미국특허 5,925,517), TaqMan 프로브 (예, 미국특허 5,210,015 및 5,487,972), 및 CataCleave 프로브 (예, 미국특허 5,763,181)를 포함한다. 상기 분자 비콘은 결합되지 않은 상태에서 상기 프로브는 도너 및 수용자 발색소가 근접하여 있고 도너 발광이 감소된 2차 구조를 형성하도록 설계된 단일가닥 올리고뉴클레오티드이다. 적당한 반응 온도에서, 상기 비콘은 접힘이 풀어지고 (unfold) 상기 암플리콘에 특이적으로 결합한다. 일단 풀어지면, 도너 및 수용자 발색소 사이의 거리는 증가되어 FRET이 역전되고 도너 발광이 특화된 기구를 사용하여 모니터링되도록 된다. TaqMan 및 CataCleave 기술은 이용된 FRET 프로브가 절단되어 도너 및 수용자 발색소가 충분히 분리되어 FRET이 역전된다는 점에서 상기 분자 비콘과 다르다.
TaqMan 기술은 5' 말단에 도너 발색소가 표지되어 있고 3' 말단에 수용자 발색소가 표지되어 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용한다. 증폭에 사용된 DNA 폴리머라제는 5'-> 3' 엑소뉴클레아제 활성을 포함하여야만 한다. 상기 TaqMan 프로브는 프라이머가 결합하는 동시에 암플리콘의 한 가닥에 결합한다. 상기 DNA 폴리머라제가 상기 프라이머를 연장함에 따라 상기 폴리머라제는 결합된 TaqMan 프로브와 결국 만나게 될 것이다. 이 때 상기 폴리머라제의 엑소뉴클레아제 활성은 5' 말단으로부터 시작하여 TaqMan 프로브를 순차적으로 분해할 것이다. 상기 프로브가 분해됨에 따라, 상기 프로브를 포함하는 모노뉴클레오티드들이 반응 버퍼 중으로 방출된다. 상기 도너는 상기 수용자로부터 확산되어 멀어지고 FRET는 역전된다. 도너로부터의 발광은 모니터링되어 프로브 절단을 확인한다. TaqMan이 작용하는 방식으로 인하여, 특이적 암플리콘이 매 PCR 사이클에 대하여 한번만 검출될 수 있다. TaqMan 표적 부위를 통한 상기 프라이머의 연장은 다음 PCR 사이클에서 상기 암플리콘이 변성될 때까지 TaqMan 프로브의 추가적 결합을 방지하는 이중가닥 산물을 생성한다.
원용에 의하여 그 내용이 본 명세서에 포함되어지는, 미국특허 5,763,181는 또다른 실시간 검출 방법 ("CataCleave"라 칭함)을 기술한다. CataCleave 기술은 상기 프로브의 절단이 폴리머라제 활성을 가지지 않은 제2 효소에 의하여 달성된다는 점에서 TaqMan과 다르다. 상기 CataCleave 프로브는, 제한 효소 또는 RNase와 같은, 엔도뉴클레아제의 표적인 분자의 서열을 가지고 있다. 일 예에서, 상기 CataCleave 프로브는 상기 프로브의 5' 및 3' 말단은 DNA로 되어 있고 절단 부위는 RNA를 포함하는 키메라 구조를 갖는다. 상기 프로브의 DNA 서열 부분은 말단 또는 내부적으로 FRET 쌍으로 표지된다. PCR 반응물은 RNA-DNA 이중가닥체의 RNA 서열 부분을 특이적으로 절단할 RNase H 효소를 포함한다. 절단 후, 상기 프로브의 양 반쪽 (two halves)은 반응 온도에서 상기 표적 암플리콘으로부터 해리되고 반응 버퍼 중으로 확산된다. 도너 및 수용자가 분리됨에 따라 FRET은 TaqMan 프로브에서 동일한 방식으로 역전되고 도너 발광이 모니터링된다. 절단 및 해리는 추가적 CataCleave 프로브 결합을 위한 부위를 재생한다. 이런 방식으로 단일 암플리콘이 상기 프라이머가 상기 CataCleave 프로브 결합 부위를 통하여 연장될 때까지 프로브 절단의 표적 또는 복수 회 표적 (multiple rounds)로서 역할을 한다.
구체예들에서, 상기 방법에 사용된 프로브는 위에서 설명된 CataCleave 프로브이다. 적합한 CataCleave 프로브들의 예는 서열번호 10의 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 구체예들에서, 상기 CataCleave 프로브는 서열번호 4-8의 올리고뉴클레오티드를 포함하나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
구체예들에서, 시료 중의 리스테리아 종을 검출하기 위한 키트는 상기한 올리고뉴클레오티드들을 포함한다.
상기 키트는 핵산 증폭에 필요한 시약을 더 포함할 수 있다. 상기 시약은 dNTP, rNTP, 핵산 폴리머라제, UNG (uracil N-glycosylase) 효소, 버퍼 및 보조인자 (예, Mg2 + 등)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나이상을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 및 역전사 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 열안정성인 것일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는, 예를 들면 95℃이상의 온도에 노출된 경우에는 그 활성을 유지할 수 있는 것일 수 있다. 열안정성 DNA 폴리머라제는 예를 들면, 터무스 아쿠아티쿠스 (Thermus aquaticus), 터무스 플라부스 (Thermus flavus), 터무스 루베르 (Thermus ruber), 터무스 터모필루스 (Thermus thermophilus), 바실루스 스테아로터모필루스 (Bacillus stearothermophilus), 터무스 락테우스 (Thermus lacteus), 터무스 루벤스 (Thermus rubens), 터모토가 마리티마 (Thermotoga maritima), 터모코쿠스 리톨랄리스 (Thermococcus littoralis), 및 메타노터무스 페르비두스 (Methanothermus fervidus)로 이루어진 군으로부터 선택된 내열성 박테리아로부터 분리된 것일 수 있다. 열안정성 DNA 폴리머라제는 예를 들면, Taq 폴리머라제일 수 있다. Taq 폴리머라제는 약 70℃에서 최적 활성을 갖는 것으로 알려져 있다.
상기 리스테리아 종 검출 키트는 상기 프로브가 표적 DNA와 혼성화되는 경우, DNA-RNA 하이브리드의 RNA 부분을 특이적으로 절단하는 인자를 더 포함하는 것일 수 있다. 상기 인자는 RNase H일 수 있다. 또한, 상기 인자는 상기 RNA 부분을 특이적으로 또는 비특이적으로 절단하는 것일 수 있다. 상기 특이적 인자는 RNase HI일 수 있다. 상기 비특이적 인자는 RNase HII일 수 있다. RNase H는 RNA-DNA 하이브리드에서 RNA를 가수분해할 수 있다. RNase H 활성은 2가 양이온 (예, Mg2 +, Mn2+)을 필요로 하며, RNA 3'-O-P 결합을 절단하여 3'-히드록시기 및 5'-포스페이트 말단 산물을 생성할 수 있다. 상기 RNase H는 예를 들면, 피로코쿠스 푸리오수스 (Pyrococcus furiosus) RNase HII, 피로코쿠스 호리코시 (Pyrococcus horikoshi) RNase HII, 터모코쿠스 리토랄리스 (Thermococcus litoralis) RNase HI, 및 터무스 터모필루스 (Thermus thermophilus) RNase HI로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 피로코쿠스 푸리오수스 RNase HII는 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 RNase H는 열안정한 것일 수 있다. 예를 들면, PCR 과정의 변성과정에서도 그 활성을 유지하는 것일 수 있다. 상기 인자는 가역적으로 변형된 열안정성 RNase HII로서, 변형된 형태에서는 불활성이고 변형되지 않은 상태에서는 활성이고, 상기 변형은 RNase HII를 리간드에 결합시키는 것, RNase HII의 가교화, 또는 RNase HII의 아미노산 잔기의 화학반응에 의하여 이루어지는 것이고 상기 변형된 RNase HII 효소 활성은 가열 또는 그를 포함하는 시료의 pH 조절에 의하여 회복되는 것일 수 있다.
DNA 서열 및 RNA 서열을 포함하는 상기 프로브의 RNA 부분이 상기 절단 인자에 의하여 절단되는 경우, 해리될 수 있다. 상기 해리는 상기 절단된 복합체의 용융 온도의 감소에 의하여 자연적으로 해리되는 것이거나 온도 상승과 같은 인자에 의하여 촉진될 수 있다. 상기 해리된 단편은 당업계에 알려진 방법에 의하여 검출될 수 있다.
구체예들에서, 시료 중의 리스테리아 종을 검출하는 방법은 (a) 시료 중의 리스테리아 종의 표적 핵산을 증폭시켜 상기 표적 핵산의 증가된 카피수를 생성하는 단계로서, 상기 증폭은 서열번호 1의 제1 프라이머 및 서열번호 2 또는 3의 제2 프라이머를 시료 중의 표적핵산과 혼성화시켜 표적핵산과 프라이머들의 혼성화된 산물을 얻는 단계; 및 주형-의존적 핵산 폴리머라제를 이용하여 상기 혼성화 산물의 제1 및 제2 프라이머를 연장시켜 연장된 프라어머 산물을 생성시키는 단계;를 포함하는 것인 단계; (b) 상기 표적 핵산을 상기 표적 핵산에 혼성화될 수 있는 하나 이상의 프로브 올리고뉴클레오티드에 혼성화시켜 표적 핵산: 프로브 올리고뉴클레오티드의 혼성화된 산물을 얻는 단계로서, 상기 프로브는 RNA 서열과 DNA 서열을 포함하고, 검출가능한 마커에 결합되어 있는 것인 단계; (c) 상기 표적 핵산:프로브의 혼성화 산물을 RNase H와 접촉시켜 상기 프로브를 절단하여 프로브 단편을 상기 표적 핵산으로부터 해리시키는 단계; 및 (d) 상기 검출가능한 마커를 검출하는 단계;를 포함한다.
시료 중의 표적 서열의 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응, 리가제 연쇄 반응, 자가-지속된 서열 증폭, 가닥 치환 증폭, 전사 증폭 시스템, Q-베타 레플리카제, 핵산서열기반증폭 (NASBA), 절단단편길이다형, 등온 및 키메라 프라이머-개시된 핵산 증폭, 분지-연장증폭방법 또는 핵산증폭을 위한 다른 적합한 방법으로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 핵산 증폭 방법에 의하여 달성될 수 있다.
다른 구체예들에서, 상기 방법은 상기 시료에 대하여 역전사를 수행하여 리스테리아 종의 표적 RNA의 cDNA를 생성하는 단계 및 상기한 (a)-(d) 단계들을 수행하는 단계를 더 포함한다.
일 구체예에서, 상기 방법은 리스테리아 종의 표적 핵산 단편을 증폭하는 단계로서, 상기 증폭은 서열번호 1의 제1 프라이머 및 서열번호 2 또는 3의 제2 프라이머를 시료 중의 표적핵산과 혼성화시켜 혼성화된 산물을 얻는 단계; 및 주형-의존적 핵산 폴리머라제를 이용하여 상기 혼성화 산물의 프라이머들을 연장시켜 연장된 프라어머 산물을 생성시키는 단계;를 포함하는 것인 단계; 상기 표적 핵산 단편을 서열번호 4-8의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 프로브에 혼성화시켜 혼성화된 산물을 얻는 단계; (c) 상기 표적 핵산 단편 및 프로브의 혼성화 산물을 RNase H와 접촉시켜 상기 프로브를 절단하여 프로브 단편을 상기 혼성화 산물로부터 해리시키는 단계; 및 상기 검출가능한 마커를 검출하는 단계;를 포함한다.
이하 상기 방법을 보다 상세하게 설명한다. 상기 방법은 서열번호 1의 제1 프라이머 및 서열번호 2 또는 3의 제2 프라이머를 시료 중의 표적핵산과 혼성화시켜 혼성화된 산물을 얻는 단계; 및 주형-의존적 핵산 폴리머라제에 의하여 상기 혼성화 산물의 프라이머를 주형 의존적으로 연장시켜 연장된 프라어머 산물을 생성시키는 단계;를 포함하는 리스테리아 종 중의 표적 핵산 단편을 증폭시키는 단계를 포함한다.
상기 혼성화는 액체 매질 중에서 이루어질 수 있다. 상기 액체 매질은 필요에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 액체 매질은 예를 들면, 물, 버퍼 및 PCR 반응 혼합물일 수 있다. 상기 버퍼의 비한정적인 예는 PBS, Tris, MOPS 및 Tricine을 포함한다. 상기 혼성화는 상기 프라이머와 표적 핵산의 결합을 촉진하는 조건 예를 들면, 낮은 온도 및 낮은 염 농도에서 이루어질 수 있다. 상기 조건은 당업계에 알려져 있다. 상기 표적 핵산은 단일가닥 또는 2중가닥 핵산일 수 있다. 2중가닥 핵산인 경우, 상기 표적 핵산은 단일가닥으로 분리되도록 변성된 것일 수 있다. 상기 표적 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.
상기 표적 핵산이 RNA 분자인 경우, 상기 방법은 상기 표적 RNA 분자를 역전사하여 cDNA를 생성하는 것을 더 포함할 수 있다. 그렇게 얻어진 cDNA는 증폭되어지고 프로브와 혼성화된 후, 절단된 프로브의 검출이 수행될 수 있다. RNA 분자의 역전자는 당업계에 잘 알려져 있다. 리스테리아 종의 표적 RNA를 검출하기에 적합한 키트는 역전사 효소 활성을 포함한다.
프라이머를 주형 의존적으로 연장시키는 단계는 중합반응에 의한 중합을 의미하는 것으로 당업계에 알려져 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 열안정일 수 있다.
리스테리아 종을 검출하는 상기 방법은 상기 표적 핵산 단편을 서열번호 10, 6, 또는 7의 서열을 포함하는 하나이상의 프로브와 혼성화시켜 혼성화된 산물을 얻는 단계를 포함한다. 상기 프로브는 서열번호 4-8 중 하나의 서열을 가질 수 있다. 상기 프로브는 검출가능한 마커, 예를 들면, 광학적으로 검출가능한 마커에 의하여 표지될 수 있다. 검출가능한 마커는 당업계에 알려져 있고 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, FRET 쌍이 본 발명의 일 구체예에서 표적 서열을 검출하기 위한 목적으로 사용될 수 있다.
상기 혼성화는 액체 매질 중에서 이루어질 수 있다. 상기 액체 매질은 필요에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 액체 매질은 예를 들면, 물, 버퍼 및 PCR 반응 혼합물일 수 있다. 상기 버퍼는 PBS, Tris 및 Tricine으로 이루어진 군으로부터 선택된 버퍼일 수 있다. 상기 혼성화는 상기 단일가닥 프로브 핵산과 표적 핵산의 결합을 촉진하는 조건 예를 들면, 낮은 온도 및 낮은 염 농도에서 이루어질 수 있다. 상기 조건은 당업계에 알려져 있다. 상기 표적 핵산은 단일가닥 또는 2중가닥 핵산일 수 있다. 2중가닥 핵산인 경우, 상기 표적 핵산은 단일가닥으로 분리되도록 변성된 것일 수 있다. 변성에 대하여는 상기한 바와 같다. 상기 표적 핵산은 DNA 또는 RNA일 수 있다.
상기 리스테리아 종 검출 방법은 상기 표적 핵산 단편과 프로브의 혼성화 산물을 RNase H와 접촉시켜 상기 프로브를 절단하여 프로브 단편을 해리시키는 단계를 포함한다. 상기 접촉은 액체 매질 중에서 이루어질 수 있다. 상기 액체 매질은 필요에 따라 적절하게 선택할 수 있다. 상기 액체 매질은 예를 들면, 물, 버퍼 및 PCR 반응 혼합물일 수 있다. 상기 버퍼는 PBS, Tris 및 Tricine 버퍼로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 또한, 상기 접촉 조건은 PCR 반응 조건에서 또는 PCR 반응물 중에서와 실질적으로 동일한 조건하에서 이루어지는 것일 수 있다.
상기 RNase H는 RNase HI 또는 RNase HII일 수 있다. RNase H는 RNA-DNA 하이브리드에서 RNA를 가수분해할 수 있다. RNase H 활성은 2가 양이온 (예, Mg2 +, Mn2+)을 필요로 하며, RNA 3'-O-P 결합을 절단하여 3'-히드록시기 및 5'-포스페이트 말단 산물을 생성할 수 있다. 상기 RNase H는 피로코쿠스 푸리오수스 (Pyrococcus furiosus) RNase HII, 피로코쿠스 호리코시 (Pyrococcus horikoshi) RNase HII, 터모코쿠스 리토랄리스 (Thermococcus litoralis) RNase HI, 및 터무스 터모필루스 (Thermus thermophilus) RNase HI로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 피로코쿠스 푸리오수스 RNase HII는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 RNase H는 열안정한 것일 수 있다. 예를 들면, PCR 과정의 변성과정에서도 그 활성을 유지하는 것일 수 있다. 상기 RNase H는 가역적으로 변형된 열안정성 RNase HII로서, 변형된 형태에서는 불활성이고 변형되지 않은 상태에서는 활성이고, 상기 변형은 RNase HII를 리간드에 결합시키는 것, RNase HII의 가교화, 또는 RNase HII의 화학적 변형, 예를 들면, Rase HII의 아미노산 잔기의 화학적 변형에 의하여 이루어지는 것이고 상기 변형된 RNase HII 효소 활성은 가열 또는 그를 포함하는 시료의 pH 조절에 의하여 회복되는 것일 수 있다.
상기 해리는 상기 절단에 의하여 약화된 가닥과 가닥 사이의 결합력에 의하여 자연적으로 해리되는 것이거나 온도 상승과 같은 인자에 의하여 촉진될 수 있다. 예를 들면, PCR 반응 혼합물은 RNA-DNA 이중가닥체 (즉, 표적 핵산 및 프로브의 혼성화된 산물)의 RNA 부분을 특이적으로 절단할 RNase H를 포함할 수 있으며, PCR 과정 중 절단 후, 상기 프로브의 두개 단편 (halves)은 반응 온도에서 상기 표적 암플리콘으로부터 해리되고 반응액 내로 확산될 수 있다. 상기 도너와 수용체가 분리됨에 따라, FRET는 억제되고 도너 발광이 모니터링될 수 있다. 절단과 해리는 추가적인 프로브 결합을 위한 자리를 재생한다. 이러한 방식으로, 프라이머가 프로브 결합 자리를 지나 연장될 때까지, 단일 암플리콘은 복수회의 프로브 절단을 위한 표적으로서 작용할 수 있다.
상기 리스테리아 종 검출 방법은 상기 절단된 프로브 또는 해리된 프로브 단편을 검출하는 단계를 포함한다. 상기 프로브의 검출은 다양한 방법에 의하여 이루어질 수 있으며 또한 상기 검출가능한 머커에 따라 적절하게 선택된다. 명세서 전반에 있어서, 용어 "검출가능한 마커 (a detectable marker)"와 "검출가능한 표지 (a detectable label)"는 교환가능하게 사용된다. 예를 들면, 반응 산물에 대하여 크기 분석을 수행함으로써 상기 표지된 프로브 단편을 검출할 수 있다. 상기 프로브 핵산 단편의 크기 분석은 알려진 방법, 예를 들면, 겔 전기영동, 구배에서 침강, 크기 배제 크로마토그래피 및 호모크로마토그래피에 의하여 이루어질 수 있다. 또한, 상기 검출가능한 표지가 FRET 쌍인 경우, 상기 표지된 프로브 단편은 분광학적 방법에 의하여 상기 단편의 크기 분석이 없이도 인 시튜로 이루어질 수 있다. 따라서, 실시간으로 상기 표지된 프로브 단편을 검출할 수 있다.
상기 방법은 상기 증폭 단계 전에 리스테리아 종을 포함하는 시료를 리스테리아 종 강화 배지 중에서 배양하여 리스테리아 종을 강화시키는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 배양에 사용되는 상기 강화 배지는 다음의 특성을 갖는 것일 수 있다. 상기 배지는 에스쿨린 및 펩톤 중 하나, 또는 둘 다를 포함하지 않는 배지일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 강화 배지는, 본 발명의 구체예에 따라 수행된 임의의 단계, 예를 들면, 표적 서열의 증폭 또는 상기 표지된 프로브를 절단하고 상기 절단된 프로브를 검출함으로써 상기 표적 서열을 검출하는 것을 간섭하지 않는 한, 에스쿨린을 포함할 수 있다. 상기 강화 배지는 트립틱 소이 브로쓰 약 10 내지 약 40g/L, 효모 추출물 약 1 내지 약 15g/L (예, 약 1 내지 약 10g/L), 및 리튬 클로리드 약 1 내지 약 10g/L를 포함하는 리스테리아 종 성장을 강화시키기 위한 배지인 것일 수 있다. 또한, 상기 배지는 비프 추출물 약 1 내지 약 10g/L 또는 리보플라빈 약 0.01 내지 약 0.5mg/L, 티아민 약 0.5 내지 약 1.5mg/L 및 비오틴 약 0.01 내지 약 1.5mg/L을 포함하는 비타민 믹스; 피루베이트 또는 그의 염 약 1 내지 약 5g/L; 및 페릭 암모늄 시트레이트 약 0.01g 내지 약 1.0g/L로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나이상의 성분이 더 포함된 배지인 것일 수 있다. 상기 배지는 버퍼 화합물을 더 포함하는 배지인 것일 수 있다. 상기 버퍼 화합물은 MOPS 유리산 및 소듐 염을 포함하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 배지는 MOPS 유리산 약 4g/L 및 소듐 MOPS 약 7.1g/L를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 배지는 아크리플라빈 약 1 내지 약 10mg/L, 폴리믹신 B 약 5 내지 약 15mg/L, 세프타지딤 약 10 내지 약 30mg/L 및 날리딕산 약 10 내지 약 60mg/L을 포함하는 것일 수 있다.
상기 배지는 트립틱 소이 브로쓰 약 10 내지 약 40g/L, 효모 추출물 약 1 내지 약 10g/L, 리튬 클로리드 약 1 내지 약 10g/L; 비프 추출물 약 1 내지 약 10g/L 및/또는 리보플라빈 약 0.01 내지 약 0.5mg/L, 티아민 약 0.5 내지 약 1.5mg/L 및 비오틴 약 0.01 내지 약 1.5mg/L을 포함하는 비타민 믹스; 피루베이트 또는 그의 염 약 1 내지 약 5g/L; 페릭 암모늄 시트레이트 약 0.01 내지 약 1g/L; MOPS 유리산 약 4g/L 및 소듐 MOPS 약 7.1g/L; 및 아크리플라빈 약 1 내지 약 10mg/L, 폴리믹신 B 약 5 내지 약 15mg/L 및 세프타지딤 약 10 내지 30mg/L를 포함하는 배지인 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 강화 배지는 트립틱 소이 브로쓰 약 30g/L, 효모 추출물 약 6g/L, 에스쿨린 1g/L, 리튬 클로리드 10g/L; 소듐 비루베이트 2g/L, 페릭 암모늄 시트레이트 0.1g/L, MOPS 유리산 8g/L, MOPS 소듐 14.2g/L, 비프 추출물 약 5g/L 및 리보플라빈 약 0.1mg/L, 티아민 약 1.0mg/L 및 비오틴 약 1.0mg/L을 포함하는 비타민 믹스를 포함하는 배지; 또는 트립틱 소이 브로쓰 약 30g/L, 효모 추출물 약 6g/L, 리튬 클로리드 약 1 내지 약 10g/L; 비프 추출물(BE) 5g/L, 및/또는 리보플라빈 약 0.1mg/L, 티아민 약 1.0mg/L 및 비오틴 약 1.0mg/L을 포함하는 비타민 믹스; 소듐 피루베이트 2g/L; 페릭 암모늄 시트레이트 약 0.1g/L; MOPS 유리산 약 4g/L 및 소듐 MOPS 약 7.1g/L; 및 아크리플라빈 약 5mg/L, 폴리믹신 B 약 10mg/L 및 세프타지딤 약 20mg/L을 포함하는 배지 (때때로, A2.2 배지라고 함)는 일 수 있다. 이러한 배지를 사용함으로써 배양물 중의 PCR 저해인자를 없애거나 감소시키고, 배경 미생물군 (microflora)의 성장은 저해하면서 리스테리아의 성장을 촉진하여, 시료 중의 리스테리아 종의 검출을 효율적으로 할 수 있도록 한다.
강화 배지는 그대로 사용되거나 또는 소듐 클로리드 및/또는 디소듐 포스페이트와 같은 미량 성분이 보충된, BHI (brain heart infusion)일 수 있다. BHI는 BACTO, BBL, Difco와 같은 여러 상표명으로, 여러 출처로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 강화 배지는 또한, 0.6% 효모 추출물로 보충되거나 보충되지 않은, 트립틱 소이 브로쓰 (TSB)일 수 있다.
표적 리스테리아 종 서열을 검출하기 위한 예시적인 프로토콜은 식품 시료 또는 표면 와이프를 제공하는 단계, 상기 시료 또는 와이프를 성장 배지와 혼합하고 인규베이션하여 리스테리아의 수 또는 집단을 증가시키는 단계 ("강화 (enrichment)"), 리스테리아 세포를 분해 (disintegrate)시키는 단계 ("용해 (lysis)"), 및 얻어진 용해물에 대하여 증폭을 수행하는 단계 및 표적 리스테리아 서열을 검출하는 단계를 포함한다. 식품 시료는, 훈제된 연어와 같은 어류, 우유 및 치즈와 같은 낙농 제품 (dairy products), 및 액체 난, 가금 (poultry), 과일 쥬스, 다진 포크, 포크, 다진 비프, 또는 비프, 또는 델리 고기와 같은 고기, 시금치와 같은 채소, 또는 스텐레스 스틸, 고무, 플라스틱 및 세라믹과 같은 환경 표면을 포함할 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다.
식품 오염에 대한 검출 한계 (limit of detection: LOD)는 고체 25g 중 또는 액체 25ml 중 또는 정의된 면적의 표면상에서 검출될 수 있는 콜로니 형성 단위 (CFU)의 수로 기술된다. 정의에 의하여, 콜로니 형성 단위는 생존가능한 박테리아 수의 척도이다. 죽은 및 살아 있는, 모든 세포가 계수되는 직접적 현미경 계수와 달리, CFU는 생존가능한 세포 (viable cell)를 측정한다. 한 CFU (한 박테리아 세포)는 허용 조건하에서 아가 플레이트 상에서 성장하여 하나의 콜로니를 형성할 것이다. 미국식품시험조사 서비스 (United States Food Testing Inspection Service)는 고체 식품 25g 중 당 1CFU 또는 액체 식품 25ml 당 1CFU 또는 표면 면적 당 1CFU로서 최소 LOD를 정의한다.
실제로, 한 CFU로 식품 시료 또는 표면을 재현가능하게 접종하는 것 및 박테리아가 강화 과정을 견딜 것이라는 것을 보증하는 것은 불가능하다. 이 문제는 시료를 하나 또는 여러 표적 수준으로 접종하고 최대근접수 (most probable number: MPN)라 불리는 오염의 통계적 추정치를 사용하여 결과를 분석함으로써 극복될 수 있다. 예로서, 리스테리아 배양물은 분광기 (spectrophotometer)로 흡광도를 측정함으로써 특정 세포 밀도까지 성장될 수 있다. 표적물의 10-배 연속 희석물이 아가 배지 상에 도말되고, 생존가능한 세포의 수가 세어진다. 이 데이터는 도말된 부피 당 CFU를 세포 밀도에 상관 짖는 표준곡선을 구성하는데 사용된다. MPN이 유의하기 위하여는, 여러 접종 수준의 시험 시료가 분석된다. 강화 및 추출 후, 작은 부피의 시료를 취하여 실시간 분석을 한다. 궁극적 목적은 25% 내지 75%의 분획 회수 (fractional recovery)를 달성하는 것이다 (즉, 아래에서 설명될, CataCleave 프로브를 사용한 RT-PCR을 이용한 분석에서 시험 시료 중의 25% 내지 72%의 양성). 이들 분획 회수 백분율을 선택하는 이유는, 이들이 고체 식품 25g 또는 액체 식품 25ml 또는 표면에 대한 정의된 면적에 대하여 0.3 CFU 내지 1.375 CFU의 MPN 값으로 전환하는 것이다. 이들 MPN 값은 요구된 LOD 1 CFU/시료를 끼고 있다. 실제는, 이들 분획 회수를 달성하기 위하여 (표준곡선에 기초하여) 희석된 접종물의 부피를 추정하는 것은 가능하다.
도 1은 95개 리스테리아 스트레인이 실시간-PCR에 의하여 시험된 포함 시험 결과를 나타내는 도면이다.
도 2는 23개 비 리스테리아 스트레인이 실시간-PCR에 의하여 시험된 배제 시험 결과를 나타내는 도면이다.
도 3은 리스테리아 prs 유전자의 표적 서열을 포함하는 플라스미드의 카피 수에 따른 실시간 PCR 증폭 결과를 나타내는 도면이다.
도 4는 prs 유전자의 RNA 산물의 카피 수에 대한 실시간 PCR 결과를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예1 : 리스테리아 종의 실시간 PCR 증폭
서열번호1 및 2의 프라이머 쌍 및 서열번호 5의 프로브가 실시간 PCR 증폭에 따라 시료 중의 리스테리아 종의 표적 핵산을 증폭 및 검출하기 위하여 사용되었다.
(1) 포함 시험 ( inclusivity test )
포함 시험을 위하여, 모든 6개 리스테리아 종을 대표하는 92개 리스테리아 스트레인을 35℃에서 BHI 배지 중에서 밤샘 배양하였다. 5μL 시험 세포 현탁액을 45μL CZ 용해 용액 (0.3125 mg/ml NaN3, 12.5mM Tris (pH8), 0.25% CHAPS 및 1mg/ml 프로테나제 K) 중에서 55℃에서 15 분 후 95℃에서 10분으로 추출하였다. 그 결과 얻어진 용해물 2μL를 주형으로 하였다.
리스테리아 DNA 주형은 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍 및 서열번호 5의 프로브의 존재하에서 실시간 PCR을 사용하여 증폭되었다. PCR 결과는 확인되었다.
PCR 조건 및 PCR 혼합물의 조성은 다음과 같다.
PCR 조건: 37℃에서 10분 동안 UNG 인큐베이션 (1회), 변성: 95℃에서 10분 동안 UNG 불활성화 및 초기 변성 (1회),95℃에서 15초 동안 변성 및 어닐링 및 60℃에서 20초 동안 어닐링 및 연장 (50회) 표 1: 각 웰당(㎕) 반응 혼합물.
성분 양 (25μL 반응당 μL)
10x ICAN 2.5
포워드 프라이머(20μM) 1
리버스 프라이머(20μM) 1
CataCleave probe (5μM) 1
dN/UTP (Fermentas, 2/4mM) 1
Taq 폴리머라제 (5 유닛/μL) 0.5
UNG (10 유닛/μL) 0.1
Pfu RNase HII(5 유닛/) 0.2
주형 DNA 2
물 15.70
표 1에서, 1xICAN 버퍼는 320mM HEPES (pH 7.8, 농축 KOH로 적정됨), 4mM 마그네슘 아세테이트, 100mM 포타슘 아세테이트, 1% DMSO, 0.11% BSA을 포함하는 버퍼이며, 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머는 서열번호 1 및 2의 프라이머를 나타내며, CataCleave 프로브는 각각 5' 말단이 FAM으로 표지되고 3' 말단이 Iowa BFQ (Black Hole Quencher)로 표지된 서열번호 5의 프로브이다. 주형으로서 배양물 용해물이 PCR 혼합물에 직접 첨가되었다. Pfu RNase HII는, 피로코쿠스 푸리오수스 유래의 RNA-특이적 열안정성 효소를 나타낸다.
총 95종의 다른 리스테리아 종이 사용되었고, 그 중 일부 목록은 아래 표 2에 나타내었다. 표 2. 포함 시험에 사용된 스트레인의 목록
리스테리아 종 혈청형 스트레인
L.모노사이토게네스 1/2c CDL 36
L.모노사이토게네스 1/2c CDL 37
L.모노사이토게네스 1/2c CDL 38
L.모노사이토게네스 3a CDL 39
L.모노사이토게네스 3a CDL 41
L.모노사이토게네스 3b CDL 42
L.모노사이토게네스 3b CDL 43
L.모노사이토게네스 3b CDL 45
L.모노사이토게네스 3c CDL 47
L.모노사이토게네스 3c CDL 48
L.모노사이토게네스 3c CDL 49
L.모노사이토게네스 3c CDL 50
L.모노사이토게네스 4a CDL 51
L.모노사이토게네스 4a CDL 111
L.모노사이토게네스 1/2b CDL 112
L.모노사이토게네스 1/2c CDL 113
L.모노사이토게네스 3b CDL 114
L.모노사이토게네스 3b CDL 115
L.모노사이토게네스 1/2a CDL 116
L.모노사이토게네스 4a CDL 117
L.모노사이토게네스 4b CDL 118
L.모노사이토게네스 4d/e CDL 120
L.모노사이토게네스 7 CDL 122
L.모노사이토게네스 4b CDL 123
L.모노사이토게네스 1/2b CDL 125
L.모노사이토게네스 1/2b CDL 128
L.모노사이토게네스 1/2b CDL 131
L.모노사이토게네스 1/2b CDL 132
L.모노사이토게네스 4b CDL 136
L.모노사이토게네스 4b CDL 137
L.모노사이토게네스 4b CDL 138
L.모노사이토게네스 4b CDL 139
L.모노사이토게네스 4b CDL 140
L.모노사이토게네스 1/2b CDL 142
L.모노사이토게네스 1/2b CDL 143
L.모노사이토게네스 1/2a CDL 144
L.모노사이토게네스 1/2a CDL 145
L.모노사이토게네스 1/2b CDL 147
L.모노사이토게네스 3b CDL 149
L.모노사이토게네스 1/2c ATCC 19112, CWD 106
L.모노사이토게네스 4c ATCC 19116, CWD 108
L.모노사이토게네스 4b CWD 1559
L.모노사이토게네스 3b CWD 1591
L.모노사이토게네스 1/2b CWD 1597
L.모노사이토게네스 3b CWD 1600
L.모노사이토게네스 1/2a CWD 1609
L.모노사이토게네스 4b ATCC 51414, CWD 104
L.모노사이토게네스 4d ATCC 19117, CWD 109
L.모노사이토게네스 4e ATCC 19118, CWD 110
L.모노사이토게네스 1/2a CWD 72
L.이노쿠아 6a CWD 191
L.이노쿠아 4ab CWD 192
L.이노쿠아 6b CWD 236
L.이노쿠아 6a CWD 237
L.이노쿠아 6a CWD 240
L.이노쿠아 6b CWD 241
L.이노쿠아 4ab CWD 259
L.이노쿠아 L80/22
L.이노쿠아 L80/22
L.이노쿠아 L80/24
L.이노쿠아 L80/14
L.이노쿠아 L80/16
L.이노쿠아 L80/18
L.이노쿠아 6a DA-20, CWD 181
L.웰시메리 6a CDL 209
L.웰시메리 6b CDL 243
L.웰시메리 L82/2, LFD 5121
L.웰시메리 L82/10, LFD 5125
L.웰시메리 L21/44, LFD 782
L.웰시메리 L21/46, LFD 783
L.웰시메리 L21/40, LFD 860
L.웰시메리 6a ATCC 35897, CWD 114
L.세엘리게리 1/2b CDL 84
L.세엘리게리 4c CDL 98
L.세엘리게리 1/2b ATCC 35967, CWD 166
L.이바노비 5 L45/74, LFD 2949
L.이바노비 L24/6
L.이바노비 L24/22, LFD 891
L.이바노비 5 ATCC 19119, CWD 164
L.그라이 ATCC 25400, CWD 671
L.그라이 ATCC 25401, CWD 673
L.그라이 ATCC 25402, CWD 20
L.그라이 ATCC 25403, CWD 672
L.그라이 ATCC 19120, CWD 2091
도 1은 95개 리스테리아 스트레인에 대한 PCR 결과를 나타내는 도면이다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 실험에 사용된 모든 95개 리스테리아 스트레인이 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍 및 서열번호 5의 프로브를 사용한 실시간 PCR 분석에 의하여 성공적으로 검출되었다. 프라이머들과 표적 핵산 서열 사이의 미스매치들로 인하여 L.그라이 (L.grayi)의 5 스트레인에 대하여, 지연된 Ct 값이 관찰되었다.
(2) 배제 시험 ( exclusivity test )
배제 시험을 위하여, 23개 비-리스테리아 종이 BHI 배지 중에서 최대 밀도까지 배양되었다. 5μL 시험 세포 현탁액을 45μL CZ 용해 용액 (0.3125 mg/ml NaN3, 12.5mM Tris (pH8), 0.25% CHAPS 및 1mg/ml 프로테나제 K) 중에서 55℃에서 15 분 후 95℃에서 10분으로 추출하였다. 그 결과 얻어진 용해물 2μL를 주형으로 하였다. 실시간-PCR은 상기한 바와 같은 동일한 PCR 조건하에서 동일한 PCR 혼합물 조성을 사용하여 수행되었다.
실험에 사용된 비-리스테리아 종은 다음을 포함한다. 바실루스 미코이데스 (Bacillus mycoides), 브로코트릭스 캄페스트리스 (Brochothrix campestris), 카르나박테리움 디베르겐스 (Carnobacterium divergens), 카르나박테리움 말라로마 (Carnobacterium malaroma), 엔테로박터 아에로게네스 (Enterobacter aerogenes), 엔테로박터 칸세로게누스 (Enterobacter cancerogenus), 엔테로박터 클로아카에 (Enterobacter cloacae), 엔테로박터 인테르메디아 (Enterobacter intermedia), 엔테로박터 사카자키 (Enterobacter sakazakii), 에세리키아 콜리 (Escherichia coli), 에세리키아 콜리 O157:H7 (Escherichia coli O157:H7), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 쿠르티아 조피 (Kurthia zopfii), 락토코쿠스 락티스 (Lactococcus lactis), 프로테우스 하우세리 (Proteus hauseri), 프로테우스 미라빌리스 (Proteus mirabilis), 프로테우스 불가리스 (Proteus vulgaris), 로도코쿠스 아쿠이 (Rhodococcus aqui), 스타필로코쿠스 아우레스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 사프로피티쿠스 (Staphylococcus saprophyticus), 스트렙토코쿠스 아갈락티아에 (Streptococcus agalactiae), 스트렙토코쿠스 디스아갈락티아에 (Streptococcus dysgalactiae), 및 스트렙토코쿠스 산귀니스 (Streptococcus sanguinis)이었다. 표적 유전자 (prs 유전자) 단편을 포함한 플라스미드 단편이 양성 대조군으로서 사용되었다. 표 3은 배제 시험에 대하여 시험된 개체의 목록을 나타낸다.
개체 출처 기원 온도(℃)
바실루스 미코이데스 ATCC10206 미지 30
브로코트릭스 캄페스트리스 ATCC43754 토양 26
카르나박테리움 디베르겐스 ATCC35677 비프 30
카르나박테리움 갈리나룸
(Carnobacterium gallinarum)		 ATCC49517 닭 26
카르나박테리움 말타로마티쿰
(Carnobacterium maltaromaticum) 		ATCC43224 비프 26
엔테로박터 아에로게네스 ATCC 13048 타액 37
엔테로박터 칸세로게누스 ATCC 35317 사람 37
엔테로박터 클로아카에 ATCC 13047 척수액 37
엔테로박터 인테르메디아 ATCC 33110 물 37
엔테로박터 사카자키 ATCC BAA-894 사람 37
에리시펠로트릭스 루시오파티애
(Erysipelothrix rhusiopathiae)		 ATCC19414 돼지 37
에세리키아 콜리 ATCC 11303 　 37
에세리키아 콜리 O157:H7 ATCC 43895 고기 37
클렙시엘라 뉴모니아 ATCC 13883 　 37
쿠르티아 조피 ATCC33403 칠면조 26
락토바실루스 카제이
(Lactobacillus casei)		 ATCC393 치즈 37
락토바실루스 플란타룸
(Lactobacillus plantarum)		 ATCC10012 미지 37
락토코쿠스 락티스 ATCC11454 미지 37
미크로코쿠스 아우란티아쿠스
(Micrococcus aurantiacus)		 ATCC11731 미지 37
프로피오니박테리움 프레우덴라이키
(Propionibacterium freudenreichii)		 ATCC13673 미지 37
프로테우스 하우세리 ATCC 13315 37
프로테우스 미라빌리스 ATCC 35659 37
프로테우스 불가리스 ATCC 33420 임상분리체 37
로도코쿠스 에쿠이
(Rhodococcus equi) 		ATCC10146 말 37
스타필로코쿠스 아우레스 ATCC10832 미지 37
스타필로코쿠스 에피데르미디스
(Staphylococcus epidermidis)		 ATCC12228 미지 37
스타필로코쿠스 사프로피티쿠스 ATCC15305 뇨 37
스트렙토코쿠스 아갈락티아에 ATCC12386 미지 37
스트렙토코쿠스 디스아갈락티아에 ATCC12388 사람 37
스트렙토코쿠스 산귀니스 ATCC10556 사람 37
도 2는 비-리스테리아 스트레인에 대한 실시간-PCR 결과를 나타내는 도면이다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 실험에 사용된 비-리스테리아 스트레인이 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍 및 서열번호 5의 프로브를 사용한 실시간 PCR 분석에서 모두 검출되지 않았으나, 양성 대조군 시료로부터 "양성" 신호는 상기 분석 수행의 질을 나타낸다. 이들 결과는 본 발명의 구체예에 따른, 상기 프라이머들 및 프로브가 리스테리아 종에 대하여 고도로 특이적이라는 것을 나타낸다.
(3) 검출한계 시험
표적 DNA를 포함하는 세포의 농도에 대한 실시간-PCR 증폭 산물의 상관관계가 확인되었다.
prs 유전자가 포함된 플라스미드 DNA가 광학 밀도에 대하여 정량되고, 그의 알려진 분자량에 의하여 카피 농도로 전환되었다. 스탁 플라스미드 DNA의 부분을 10 mM Tris (pH 8.0)를 사용하여 희석하여 2.5 카피/μL에서 2.5x106 카피/μL가 되게 하였다. 2μL의 각 플라스미드 희석액을 반응 주형으로서 사용하였다. 실시간-PCR은 상기한 바와 같은 동일한 PCR 조건하에서 동일한 PCR 혼합물 조성을 사용하여 수행되었다.
도 3은 리스테리아 prs 유전자의 표적 서열을 포함하는 플라스미드의 카피 수에 따른 실시간 PCR 증폭 결과를 나타내는 도면이다. 상기 분석은 단일 반응 중 prs 유전자의 5 카피를 검출할 수 있었다.
이상의 결과는 본 발명의 구체예에 따른 상기 프라이머 및 상기 프로브를 사용한 실시간-PCR은 시료 중의 리스테리아 종의 존재 및 양을 검출하는데 있어서 높은 민감도 및 높은 특이도를 갖는다는 것을 뒷받침한다.
실시예 2: 리스테리아 종의 실시간 RT PCR 검출
L.모노사이토게네스를 0.5% 탈지유로 희석하여 16 cfu/100μL가 되도록 하였다. 80μL 현탁물을 세라믹 타일 10 x 1 inch2 표면에 접종하고, 밤새 실온에서 공기 건조시켰다. 각 시료 표면상의 오염물을 PBS 또는 DE-적셔진 스폰지로 회수하고, 8ml의 미리 데워진 BHI 배지에서 35℃에서 6시간 동안 배양하였다. 다음으로, 1mL 배양 산물을 9mL의 미리 데워진 A2.2 배지 (TSB 30g/L, 효모 추출물 6g/L, 에스쿨린 1g/L, LiCl 10 g/L, 소듐 피루베이트 2g/L, 페릭 암모늄 시트레이트 0.1g/L, MOPS 산 4g/L, MOPS 소듐 7.1g/L, 비프 추출물 5g/L, 리보플라빈 약 0.1mg/L, 티아민 약 1.0mg/L 및 비오틴 약 1.0mg/L을 포함하는 비타민 믹스 1%, 아크리플라빈 약 5mg/L, 폴리믹신 B 10mg/L 및 세프타지딤 20mg/L을 포함하는 사유 제형 (propriety formulation))에 접종하고, 35℃에서 24시간 동안 더 배양하였다.
A2.2 배지 중의 2차 강화로부터의 배양 산물을 역전사 효소 (RT) 반응 (700μL 강화된 배양 산물 + 100μL 1xZAC (1% CHAPS, 2.5mg/mL 소듐 아지드, 및 100mM Tris (pH 8) + 10 μL 프로테나제 K)을 위하여 사용하였다. TZ 용해 버퍼 (1mL 0.1M Tris-HCl 버퍼 당 2.0% Triton X-100 및 2.5mg 소듐 아지드, pH 8.0)가 다른 시료를 위하여 사용되었다.
역전사 반응은 다음과 같이 유도되었다. 7.9㎕의 DEPC-물, 0.1㎕의 20μM 포워드 및 리버스 프라이머, 1㎕의 10mM dNTP 및 1㎕의 용해물 (lysate)이 혼합되었다. 상기 포워드 및 리버스 프라이머는 각각 서열번호 1 및 3이었다. 상기 혼합물을 65℃에서 5분 동안 인큐베이션한 다음, 2 분 동안 얼음 상에 두었다. 2㎕의 10xRT 버퍼, 4㎕의 25mM MgCl2, 2㎕의 0.1M DTT, 1㎕의 RNase HII (40U/ml) 및 1㎕의 Superscript III (1U/㎕, 역전사 효소)가 상기 혼합물에 첨가되었다. 50℃에서 50분 동안 인큐베이션한 후, 상기 혼합물은 85℃에서 5분 동안 더 인큐베이션된 후 4℃로 냉각되었다. RT 산물 2㎕를 PCR을 위하여 PCR 혼합물과 혼합하였다. 표 4. 반응 혼합물 조성.
성분 μL/25μL 반응
10x ICAN PCR버퍼 2.5
포워드 프라이머 (20μM) 0.5
리버스 프라이머 (20μM) 0.5
CataCleave 프로브(5μM) 1
dN/UTP, 2/4 mM) 1
Taq 폴리머라제 (5 유닛/μL) 0.5
UNG (10 유닛/μL) 0.1
RNaeH II(5 유닛/μL) 0.2
cDNA 주형 2
물 16.70
표 4에서, 1xICAN은 32 mM HEPES (pH 7.8, 농축 KOH에 의하여 적정됨), 100 mM 포타슘 아세테이트, 4 mM 마그네슘 아세테이트, 1% DMSO, 및 0,11% BSA를 포함하는 버퍼를 나타낸다. 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머는 서열번호 1 및 3의 프라이머를 나타낸다. CataCleave 프로브는 단파장 방출을 위하여 5' 말단이 FAM으로 표지되고 3' 말단이 Iowa Black FQ (Black Hole Quencher)로 표지된 서열번호 7의 프로브를 나타낸다. 역전사 반응으로부터의 합성된 cDNA 주형은 PCR 주형으로 사용되었다. Pfu RNase HII는, 피로코쿠스 푸리오수스로부터 유래된 RNA-특이적 열안정성 RNase HII 효소를 나타낸다. 표 5. 반응 조건
단계 온도(℃) 시간(초) 반복
UNG 인큐베이션 37 600 1
Taq 활성화/UNG 불활성화/초기 변성 95 600 1
PCR 95 15 50
60 20
도 4는 prs 유전자의 RNA 산물의 카피 수에 따른 실시간 PCR 결과를 나타낸 그래프이다. 상기 분석은 prs RNA의 5 카피를 검출할 수 있다.
이상의 결과는 역전사와 본 발명의 구체예에 따른 상기 프라이머 및 상기 프로브를 사용한 실시간-PCR의 조합이 시료 중의 살아 있는 리스테리아 종의 존재 및 양을 검출하는데 있어서 높은 민감도 및 높은 특이도를 갖는다는 것을 뒷받침한다.
본 명세서에서 확인된 임의의 특허, 특허출원, 공개 또는 다른 개시물은 원용에 의하여 그 전체로 본 명세서에 포함되어진다. 원용에 의하여 포함되어지지만, 본 명세서에 개시된 존재하는 정의, 선언, 또는 다른 개시물과 충돌하는 임의의 물질, 또는 그의 부분은 상기 포함되어진 물질과 본 개시물 사이에 충돌이 일어나지 않는 범위 내에서만 포함되어진다.
<110> Samsung Techwin Corporation <120> Oligonucleotides for detecting Listeria spp. and use thereof <130> PN089129 <150> 61/378,100 <151> 2001-08-30 <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 1 ttgcgaaaga agtaggtatt gag 23 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 caggattact cgttgattga ataac 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 3 gttccattaa attctggttt acagg 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (8)..(11) <223> ribonucleotide <400> 4 acaaccacgg atactttctt caatg 25 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10) <223> ribonucleotide <400> 5 acaaccacgg atactttctt caatg 25 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (8)..(11) <223> ribonucleotide <400> 6 cattgaagaa agtatccgtg gttgt 25 <210> 7 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (14)..(17) <223> ribonucleotide <400> 7 gaagaaagta tccguggttg tcatg 25 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (10)..(13) <223> ribonucleotide <400> 8 acaaccacgg auactttctt caatg 25 <210> 9 <211> 224 <212> PRT <213> Pyrococcus furiosus <400> 9 Met Lys Ile Gly Gly Ile Asp Glu Ala Gly Arg Gly Pro Ala Ile Gly 1 5 10 15 Pro Leu Val Val Ala Thr Val Val Val Asp Glu Lys Asn Ile Glu Lys 20 25 30 Leu Arg Asn Ile Gly Val Lys Asp Ser Lys Gln Leu Thr Pro His Glu 35 40 45 Arg Lys Asn Leu Phe Ser Gln Ile Thr Ser Ile Ala Asp Asp Tyr Lys 50 55 60 Ile Val Ile Val Ser Pro Glu Glu Ile Asp Asn Arg Ser Gly Thr Met 65 70 75 80 Asn Glu Leu Glu Val Glu Lys Phe Ala Leu Ala Leu Asn Ser Leu Gln 85 90 95 Ile Lys Pro Ala Leu Ile Tyr Ala Asp Ala Ala Asp Val Asp Ala Asn 100 105 110 Arg Phe Ala Ser Leu Ile Glu Arg Arg Leu Asn Tyr Lys Ala Lys Ile 115 120 125 Ile Ala Glu His Lys Ala Asp Ala Lys Tyr Pro Val Val Ser Ala Ala 130 135 140 Ser Ile Leu Ala Lys Val Val Arg Asp Glu Glu Ile Glu Lys Leu Lys 145 150 155 160 Lys Gln Tyr Gly Asp Phe Gly Ser Gly Tyr Pro Ser Asp Pro Lys Thr 165 170 175 Lys Lys Trp Leu Glu Glu Tyr Tyr Lys Lys His Asn Ser Phe Pro Pro 180 185 190 Ile Val Arg Arg Thr Trp Glu Thr Val Arg Lys Ile Glu Glu Ser Ile 195 200 205 Lys Ala Lys Lys Ser Gln Leu Thr Leu Asp Lys Phe Phe Lys Lys Pro 210 215 220 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic construct <220> <221> misc_feature <222> (8)..(13) <223> at least one of nucleotides at positions 8, 8, 9, 10, 11, 12,13 is a ribonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> n is t or u <400> 10 acaaccacgg anactttctt caatg 25

Claims (23)

  1. 서열번호 1 (TTGCGAAAGAAGTAGGTATTGAG)의 서열을 포함하는 제1 올리고뉴클레오티드, 및 서열번호 2(CAGGATTACTCGTTGATTGAATAAC) 또는 서열번호 3(GTTCCATTAAATTCTGGTTTACAGG)의 서열을 포함하는 제2 올리고뉴클레오티드를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서, DNA 서열 및 RNA 서열을 포함하는 제3 올리고뉴클레오티드를 더 포함하고, 상기 제3 올리고뉴클레오티드는 서열번호 10의 서열을 포함하는 것인 조성물:
    ACAACCACGGAX1ACTTTCTTATACTTTCTTCAATG (서열번호 10) (여기서 12 위치의 X1은 T 또는 U이고, 8-13 위치의 하나 이상의 뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드임).
  3. 제2항에 있어서, 제3 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4-8의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 조성물:
    ACAACCArCrGrGrATACTTTCTTCAATG (SEQ ID NO. 4), 여기서 각각 8, 9, 10 및 11 위치의 "rC", "rG","rG",and "rA"는 리보뉴클레오티드이고,
    ACAACCACGrGATACTTTCTTCAATG (서열번호 5), 여기서 10 위치의 "rG"는 리보뉴클레오티드이고,
    CATTGAArGrArArAGTATCCGTGGTTGT (서열번호 6), 여기서 각각 8, 9, 10 및 11 위치의 "rG", "rA", "rA", 및 "rA"는 리보뉴클레오티드이고,
    GAAGAAAGTATCCrGrUrGrGTTGTCATG (서열번호 7), 여기서 각각 14, 15, 16, 및 17 위치의 "rG", "rU", "rG", 및 "rG"는 리보뉴클레오티드이고,
    ACAACCACGrGrArUrACTTTCTTCAATG (서열번호 8), 여기서 각각 10, 11, 12, 및 13 위치의 "rG","rA","rU" 및 "rA"는 리보뉴클레오티드이다.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 제3 올리고뉴클레오티드는 검출가능한 마커로 표지된 것인 조성물.
  5. (a) 서열번호 1의 서열을 포함하는 제1 프라이머,
    (b) 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열을 포함하는 제2 프라이머, 및
    (c) 표적 리스테리아 유전자에 실질적으로 상보적이고 검출가능한 표지에 결합된 DNA 서열 및 RNA 서열을 포함하는 프로브로서, 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드인 프로브를 포함하는, 시료 중의 리스테리아 종을 검출하기 위한 키트.
  6. 제5항에 있어서, (d) 리스테리아 종 PCR 단편을 생성하기 위한 표적 DNA 서열의 PCR 증폭을 위한 증폭 활성 (amplifying activity); 및 (e) RNase H 활성을 더 포함하는 것인 키트.
  7. 제6항에 있어서, (f) 리스테리아 종의 표적 핵산의 역전사를 위한 역전사 효소 활성을 더 포함하는 것인 키트.
  8. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브는 3' 말단 및 5' 말단 모두에 검출가능한 표지에 결합되어 있는 것인 키트.
  9. 제8항에 있어서, 상기 검출가능한 표지는 FRET 쌍인 것인 키트.
  10. 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 RNase H 활성은 열안정성인 것인 키트.
  11. 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 4-8의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 키트.
  12. 시료 중의 리스테리아 종을 검출하는 방법으로서,
    (a) 시료 중의 리스테리아 종의 표적 핵산을 증폭하여 상기 표적 핵산의 카피의 증가된 수를 생성하는 단계로서, 상기 증폭은 서열번호 1의 제1 프라이머 및 서열번호 2 또는 3의 제2 프라이머를 시료 중의 표적 핵산에 혼성화시켜 상기 표적 핵산과 프라이머들의 혼성화된 산물을 얻는 단계; 및 주형-의존적 핵산 폴리머라제를 이용하여 상기 혼성화된 산물의 제1 및 제2 프라이머를 연장시켜 연장된 프라이머 산물을 생성시키는 단계를 포함하는 것인 단계,
    (b) 상기 표적 핵산을 상기 표적 핵산에 혼성화될 수 있는 하나 이상의 프로브 올리고뉴클레오티드에 혼성화시켜 상기 표적 핵산: 프로브 올리고뉴클레오티드의 혼성화된 산물을 얻는 단계로서, 상기 프로브는 DNA 서열 및 RNA 서열을 포함하고, 검출가능한 마커에 결합되어 있고 서열번호 10의 서열을 포함하는 것인 단계;
    (c) 상기 표적 핵산: 프로브 올리고뉴클레오티드의 혼성화된 산물을 RNase H와 접촉시켜 상기 프로브를 절단하는 단계; 및
    (d) 상기 프로브상의 상기 검출가능한 마커로부터의 신호 방출의 증가를 검출하는 단계로서, 상기 신호의 증가는 상기 시료 중의 리스테리아 종 표적 핵산의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함하는 방법.
  13. 시료 중의 리스테리아 종의 표적 RNA 서열을 검출하는 방법으로서,
    (a) 역전사 효소 활성 및 리버스 증폭 프라이머의 존재하에서 리스테리아 종 표적 RNA를 역전사하여 상기 표적 RNA의 표적 cDNA를 생성하는 단계;
    (b) 상기 표적 cDNA 서열을 증폭하여 상기 표적 핵산의 증가된 카피 수를 생성하는 단계로서, 상기 증폭은 서열번호 1의 제1 프라이머 및 서열번호 2 또는 3의 제2 프라이머를 표적 cDNA에 혼성화시켜 상기 표적 핵산과 상기 프라이머들의 혼성화된 산물을 얻는 단계, 및 주형-의존적 핵산 폴리머라제를 이용하여 상기 혼성화된 산물의 제1 프라이머 제2 프라이머를 연장시켜 연장된 프라이머 산물을 생성하는 단계를 포함하는 것인 단계;
    (c) 상기 표적 핵산을 상기 표적 cDNA에 실질적으로 상보적인 하나 이상의 프로브 올리고뉴클레오티드에 혼성화시켜 상기 표적 핵산:프로브 올리고뉴클레오티드의 혼성화된 산물을 얻는 단계로서, 상기 프로브는 DNA 서열 및 RNA 서열을 포함하고, 검출가능한 마커에 결합되어 있고 서열번호 10의 서열을 포함하는 것인 단계;
    (d) 상기 표적 핵산 : 프로브 올리고뉴클레오티드의 혼성화된 산물을 RNase H와 접촉시켜 상기 프로브를 절단하는 단계; 및
    (e) 상기 프로브 상의 상기 검출가능한 마커로부터 신호 방출의 증가를 검출하는 단계로서, 상기 신호의 증가는 상기 시료 중의 상기 리스테리아 종 표적 RNA의 존재를 나타내는 것인 단계를 포함하는 것인 방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 프로브는 서열번호 4-8의 올리고뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것인 방법.
  15. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 검출가능한 마커는 FRET 쌍이고, 하는 상기 프로브의 3' 말단에 결합되어 있고 다른 하나는 상기 프로브의 5' 말단에 결합되어 있는 것인 방법.
  16. 제12항 또는 제13항에 있어서, 상기 증폭 단계 전에 리스테리아 종을 포함하는 시료를 리스테리아 종 강화 배지 중에서 배양하여 리스테리아 종의 성장을 강화시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  17. 제16항에 있어서, 상기 강화배지는 트립틱 소이 브로쓰 약 10 내지 약 40g/L, 효모 추출물 약 1 내지 약 10g/L, 및 리튬 클로리드 약 1 내지 약 10g/L을 포함하는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 강화 배지는 비프 추출물 약 1 내지 약 10g/L 및/또는 리보플라빈 약 0.01 내지 약 0.5mg/L, 티아민 약 0.5 내지 약 1.5mg/L 및 비오틴 약 0.01 내지 약 1.5mg/L을 포함하는 비타민 믹스; 피루베이트 또는 그의 염 약 1 내지 약 5g/L; 및 페릭 암모늄 시트레이트 약 0.01g 내지 약 1.0g/L으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나이상의 성분을 더 포함하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 배지는 버퍼 화합물을 더 포함하고, 상기 버퍼 화합물은 3-(N-모르폴리노)프로판술폰산 (MOPS) 유리산 및 소듐 염을 포함하는 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 상기 배지는 아크리플라빈 약 1 내지 약 10mg/L, 폴리믹신 B 약 5 내지 약 15mg/L 및 세프타지딤 약 10 내지 약 30mg/L을 포함하는 것인 방법.
  21. 제16항에 있어서, 상기 배지는 트립틱 소이 브로쓰 약 10 내지 약 40g/L, 효모 추출물 약 1 내지 약 10g/L, 리튬 클로리드 약 1 내지 약 10g/L; 비프 추출물 약 1 내지 약 10g/L 및/또는 리보플라빈 약 0.01 내지 약 0.5mg/L, 티아민 약 0.5 내지 약 1.5mg/L 및 비오틴 약 0.01 내지 약 1.5mg/L을 포함하는 비타민 믹스; 피루베이트 또는 그의 염 약 1 내지 약 5g/L; 페릭 암모늄 시트레이트 약 0.1 내지 약 1g/L; MOPS 유리산 약 4g/L 및 소듐 MOPS 약 7.1g/L; 및 아크리플라빈 약 1 내지 약 10mg/L, 폴리믹신 B 약 5 내지 약 15mg/L 및 세프타지딤 약 10 내지 약 30mg/L을 포함하는 배지인 것인 방법.
  22. 제16항에 있어서, 상기 강화 배지는 트립틱 소이 브로쓰 약 30 g/L, 효모 추출물 약 6 g/L, 리튬 클로리드 약 1 내지 약 10g/L; 비프 추출물 약 5 g/L 및/또는 리보플라빈 약 0.1 mg/L, 티아민 약 1.0mg/L 및 비오틴 약 1.0mg/L을 포함하는 비타민 믹스; 피루베이트 또는 그의 염 약 2g/L; 페릭 암모늄 시트레이트 약 0.2 g/L; MOPS 유리산 약 4g/L 및 소듐 MOPS 약 7.1g/L; 및 아크리플라빈 약 5 mg/L, 폴리믹신 B 약 10 mg/L 및 세프타지딤 약 20 mg/L을 포함하는 배지인 것인 방법.
  23. 제16항에 있어서, 상기 강화 배지는 에스쿨린 및 펩톤으로부터 선택된 하나 이상을 포함하지 않는 것인 방법.
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