CN102260735A - 使用可分解嵌合探针实时检测食物中的沙门氏菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于实时检测食物中和表面上的沙门氏菌的方法和试剂盒。在分析之前，在培养基中富集沙门氏菌以提高它们的密度。在叠氮化钠、蛋白酶K和清洁剂的存在下通过溶解来回收DNA。使用基因特异引物和可分解嵌合荧光探针在PCR反应中执行沙门氏菌种的实时检测。该方法还描述了内部对照以确定核酸扩增和检测的效率。该方法适用于介质和高批量分析。
Description
本申请要求于2010年3月11日提交的第61/312,873号美国临时专利申请的优先权，该申请的内容通过引用全部包含于此。
技术领域
本公开描述了用于实时检测食物中和表面上的沙门氏菌种的方法和试剂盒。
背景技术
沙门氏菌是杆状的革兰氏阴性肠杆菌。沙门氏菌严格属于埃希氏菌属，并在世界范围内在温血动物、冷血动物和人类中被发现。它们在人类和许多动物中引起诸如伤寒、副伤寒、食物传染疾病和沙门氏菌病的疾病。许多被沙门氏菌感染的人在被感染12小时至72小时之后发展为腹泻、发热、呕吐和腹绞痛。通常通过培养粪便试样来诊断感染。该疾病通常持续4至7天。虽然多数人未经过治疗就康复，但更严重的感染可能发生。婴幼儿、老年人和免疫系统弱的人比其它人更容易发展成严重的疾病。当严重的感染发生时，沙门氏菌会从肠道扩散到血流然后扩散到身体其它部位，除非使用抗生素迅速地治疗病人，否则可能导致病人死亡。
目前，存在两种公认的沙门氏菌种：肠道沙门氏菌(S.enterica)和邦戈尔沙门氏菌(S.bongori)，肠道沙门氏菌和邦戈尔沙门氏菌具有六种主要血清型：enterica(I)(肠道(I))、salamae(II)(萨拉姆(II))、arizonae(IIIa)(亚利桑那(IIIa))、diarizonae(IIIb)(双亚利桑那(IIIb))、houtenae(IV)(豪顿(IV))和indica(VI)(因迪卡(VI))。编码各种毒力因子的多个致病岛(PAI)的存在允许沙门氏菌入侵并感染宿主生物。存在两种重要的PAI，即，编码两种不同的类型III分泌系统的沙门氏菌致病岛1和2(SPI-1和SPI-2)，该分泌系统使效应分子进入到宿主细胞中，导致将系统扩散的细菌的内化。邦戈尔沙门氏菌是爬虫类特异的并很少在人类感染中发现。肠道沙门氏菌特异的血清型导致诸如伤寒的更多严重的疾病。各种食物和表面的沙门氏菌污染物被美国农业部食物安全检验局(FSIS)认为是主要的健康危害。沙门氏菌不被冷冻破坏。
传统上，通过执行经典的微生物化验来检测食物中和表面上的沙门氏菌，经典的微生物鉴定耗时、劳动强度高、不灵敏、昂贵且难以自动化。随着DNA扩增技术的出现，现在通过表面刮拭试验或者对原料和处理过的食物试样进行核酸分析来对沙门氏菌进行常规检测。现在，大多政府机构选择采用核酸化验作为监控食物加工厂和配送中心的方法。核酸分析不仅进行沙门氏菌的检测、血清型的鉴定还对沙门氏菌的爆发进行跟踪。这样的监控通过监督医院和医药团体改善了公共健康和安全，也允许污染源的快速鉴定和隔离。
例如，在2009年，FDA宣布它们已跟踪到鼠伤寒沙门氏菌在美国花生公司(PCA)在佐治亚州的布莱克利拥有的工厂中爆发，并敦促人们推迟食用商业制备或生产的含花生酱的产品和供应该机构的花生酱。据报道，在美国的46个州的至少343个食品公司中的至少3862个花生酱类产品(诸如饼干、能量棒和花生酱曲奇)中发现了沙门氏菌。狗粮也受到影响。超过46个州中的至少691人产生疾病，并夺去了至少9条生命。由PCA生产的花生酱和花生糊被分发给数以百计的公司，用作诸如曲奇、饼干、谷类食品、糖果和冰激凌的数以千计的不同产品中的成分，这些产品全部被召回。也有一些产品在零售店中被直接地销售给客户。因此，沙门氏菌爆发的围堵政策呈现给政府部门艰巨任务和后勤任务。
对沙门氏菌爆发的快速和完全的响应无疑节省了资金，抑制蔓延的疾病，甚至拯救了生命。然而，PCR扩增方法易于出现假阳性(如在WO 95/33854中所述)检测和假阴性(如在WO 92/01056、WO 95/00664、WO 92/01056、WO 93/04202中所述)检测。由于前述的原因，对测试样品中的沙门氏菌核酸序列的准确和可靠的实时检测在本领域中的需求仍未得到满足。
发明内容
根据实施例，结合PCR和CataCleave技术来设计通过把沙门氏菌种特异侵入基因作为目标来实时检测食物中和表面上的沙门氏菌的试剂盒。根据另一方面，描述了用于监控实时检测反应的方法，以使用核酸序列与沙门氏菌种不相关的内部对照来确定质量控制问题。
在一个实施例中描述了用于实时检测样本中沙门氏菌的方法，该方法包括以下步骤：提供要被检测的具有沙门氏菌基因目标DNA的样本；提供扩增引物对，该引物对可以退火得到沙门氏菌目标DNA；提供包含可检测标记的探针及与沙门氏菌目标DNA基本上互补的DNA核酸序列和RNA核酸序列；在扩增聚合酶活性、扩增缓冲液的存在下扩增第一扩增引物与第二扩增引物之间的PCR片段，RNAse H活性和探针以及在RNA序列在探针内的情况下RNA序列能够与沙门氏菌目标DNA的PCR片段中的互补DNA序列形成RNA:DNA异源双链体；检测来自探针上的标记的发射信号的实时增加，其中，信号的增加表示在样本中存在沙门氏菌目标DNA。
一方面，来自探针上的标记的发射信号的实时增加由在探针与PCR片段的一条链之间形成的异源双链体的RNAse H切割产生。
沙门氏菌目标DNA序列可以包含InvA基因。
探针中的DNA序列和RNA序列可以彼此共价连接。探针上的可检测标记可以是诸如FRET对的荧光标记。扩增缓冲液可以是HEPES缓冲液。探针或PCR片段可以连接到固体载体。扩增聚合酶活性可以是热稳定DNA聚合酶的活性，RNAse H活性可以是热稳定RNAse H的活性。RNAse H可以是位点非特异性的或位点特异性的。在实施例中，RNAse H是RNAse H II。在另一实施例中，RNAse H II来自于Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、Pyrococcus horikoshi或Thermococus litoralis。样本可包括食物样本或表面刮拭样本。可以使用尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)处理样本中的模板核酸，在PCR扩增之前使尿嘧啶-N-糖基化酶失活以防止遗留物污染。
一方面，探针具有SEQ ID NO：7、13或14的序列。
另一方面，扩增引物对可以是SEQ ID NO：1和2的引物对、SEQ ID NO：3和4的引物对和SEQ ID NO：5和6的引物对。
另一实施例公开了一种实时检测样本中沙门氏菌的方法，该方法包括以下步骤：提供要被检测的具有沙门氏菌目标RNA的样本；提供正向扩增引物和反向扩增引物的引物对，该引物对可以退火得到沙门氏菌invA目标核酸序列；在反转录酶活性和反转录扩增引物的存在下反转录沙门氏菌invA目标RNA来产生cDNA序列；在扩增聚合酶活性存在下扩增第一扩增引物与第二扩增引物之间的目标cDNA序列以产生PCR片段；提供包含可检测标记的探针及与PCR片段基本上互补的DNA核酸序列和RNA核酸序列，在RNA序列在探针内的条件下的RNAse H活性能够形成RNA:DNA异源双链体，其中，在PCR片段中存在互补序列；检测来自探针上的标记的发射信号的实时增加，其中，信号的增加表示在样本中存在沙门氏菌目标RNA。
一方面，来自探针上的标记的发射信号的实时增加由在探针的RNA序列与沙门氏菌目标RNA的cDNA之间形成的RNA:DNA异源双链体的RNAseH切割产生。
一方面，扩增引物对可以是SEQ ID NO：1和2的引物对、SEQ ID NO：3和4的引物对或者SEQ ID NO：5和6的引物对。
在另一实施例中，公开了用于实时检测样本中沙门氏菌的试剂盒，该试剂盒包括：扩增引物对，该引物对可以退火得到沙门氏菌目标DNA序列；包含可检测标记的探针、DNA核酸序列和RNA核酸序列，DNA核酸序列和RNA核酸序列与沙门氏菌目标DNA序列基本上互补；扩增聚合酶活性；扩增缓冲液；RNAse H活性。
在另一实施例中，本公开教导了一种用于实时检测样本中沙门氏菌的试剂盒，该试剂盒包括：反转录酶活性，用于反转录目标沙门氏菌invA RNA序列以产生目标cDNA序列；扩增引物对，该引物对可以退火得到目标cDNA序列，其中，扩增引物对选自于由SEQ ID NO：1和2的引物对、SEQ ID NO：3和4的引物对和SEQ ID NO：5和6的引物对组成的组中；扩增活性，用于扩增引物对之间的目标cDNA序列的PCR扩增以产生沙门氏菌invA PCR片段；包含可检测标记的探针及与PCR片段内的DNA序列基本上互补的DNA核酸序列和RNA核酸序列；RNAse H活性。
试剂盒还可包括阳性内部对照、阴性内部对照以及尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)。沙门氏菌目标DNA可以包括InvA基因。
在试剂盒的一方面，探针具有DNA序列-RNA序列-DNA序列的结构，探针的DNA序列和RNA序列可以共价连接，探针上的可检测标记可以是荧光标记。在另一实施例中，可以用FRET对标记探针。探针或PCR片段可以连接到固体载体。扩增缓冲液可以是HEPES。扩增聚合酶活性可以是热稳定DNA聚合酶的活性，RNAse H活性可以是热稳定RNAse H的活性。
在试剂盒的另一方面，探针可包括具有SEQ ID NO：7、13或14的序列的探针，扩增引物对可以是SEQ ID NO：1和2的引物对、SEQ ID NO：3和4的引物对或SEQ ID NO：5和6的引物对。
前述实施例具有包括实时检测样本中的沙门氏菌核酸序列的能力在内的许多优点。该检测方法快速、准确并适合批量应用。还描述了用于检测食物中或表面上的沙门氏菌的方便、容易操作且可靠的诊断试剂盒。
附图说明
图1是CataCleave探针技术的示意图。
图2是PCR扩增产物的实时CataCleave探针检测的示意图。
图3是使用CataCleave探针和SEQ ID NO：1和2的扩增引物来检测鲑鱼中的乙型副伤寒沙门菌(Salmonella paratyphi B)的实时PCR反应的结果。
图4a是在存在内部扩增对照质粒的情况下使用沙门氏菌特异CataCleave探针检测鼠伤寒沙门氏菌污染物的实时PCR反应的结果。
图4b是使用内部扩增对照特异CataCleave探针和内部扩增对照质粒模板的实时PCR反应的结果。
图5是使用CataCleave探针和具有SEQ ID NO：3和4的DNA序列的扩增引物对33来检测鼠伤寒沙门氏菌DNA序列的实时PCR反应的结果。
图6是使用CataCleave探针和具有SEQ ID NO：5和6的DNA序列的扩增引物对34来检测鼠伤寒沙门氏菌DNA序列的实时PCR反应的结果。
图7示出了实时PCR反应和通过不同的扩增引物对形成的引物二聚物的结果。
图8示出了通过使用CataCleave探针和SEQ ID NO：1和2的扩增引物对的实时PCR的鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA的单分子的检测。
图9示出了通过使用CataCleave探针和SEQ ID NO：1和2的扩增引物对的实时PCR的迪卡特沙门氏菌(Salmonella decatur)的基因组DNA的单分子的检测。
图10描述了使用CataCleave实时PCR的八对沙门氏菌InvA基因引物的检测灵敏度的对比。
图11描述了在对沙门氏菌InvA DNA序列的实时PCR检测中的两种不同的CataCleave探针的效力的对比。
图12描述了对沙门氏菌InvA基因DNA的从1至100000复制的实时PCR检测中的另一探针(CataCleave inv-CC-Probe 3)的效力。
具体实施方式
除非另外表示，否则这里描述的实施例的实践使用本领域内的传统的分子生物学技术。这样的技术对技术人员是公知的，并被文献充分地解释。参见例如，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.，NY，N.Y.(1987-2008)，包括全部的附录；Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)。
除非另外定义，否则这里使用的全部的技术和科学术语具有与本领域的技术人员通常理解的意思相同的意思。说明书也提供了对术语的定义来帮助理解本申请的公开和权利要求。在定义与在别处定义不一致的情况下，将参照本申请中提出的定义。
如这里所使用的，术语“核酸”指寡核苷酸或多核苷酸，其中，所述寡核苷酸或多核苷酸可以变型或可包括变型的碱基。寡核苷酸是包括2至60个核苷酸的核苷酸的单链聚合物。多核苷酸是包括两个或更多个核苷酸的核苷酸的聚合物。多核苷酸可以是双链DNA、包含脱氧胸甘的单链核酸聚合物、单链RNA、双链RNA或RNA/DNA异双链核酸分子中的任一一种，双链DNA包括退火的寡核苷酸，其中，第二条链是具有第一条寡核苷酸的反向互补序列的寡核苷酸。核酸包括基因组DNA、cDNA、hnRNA、snRNA、mRNA、rRNA、tRNA、片段化的核酸、从诸如线粒体或叶绿体的细胞器得到的核酸以及从微生物得到的核酸或者可以存在于生物试样上或生物试样中的DNA病毒或RNA病毒，但不限于此。核酸可由单一类型的糖基(sugar moiety)(例如，在RNA和DNA的情况下)或不同糖基的混合物(例如，在RNA/DNA嵌合体的情况下)组成。
“目标DNA”或“目标RNA”或“目标核酸”或“目标核酸序列”指DNA扩增的目标核酸。目标核酸序列在PCR反应或逆转录PCR反应中用作用于扩增的模板。目标核酸序列可以包括自然产生的分子或合成的分子。示例性目标核酸序列包括基因组DNA或基因组RNA，但不限于此。
如这里所使用的，“标记”或“可检测标记”可以指附着到核苷酸、核苷酸聚合物或核苷酸结合因子的任何化学成分，其中，附着可以是共价的或非共价的。优选地，标记是可检测的并使所述核苷酸或核苷酸聚合物对本发明的实施者来说可检测。可检测的标记包括发光分子、化学发光分子、荧光素、荧光淬灭剂(fluorescent quenching agents)、着色分子、放射性同位素或闪烁体。可检测标记还包括任何有用的连接分子(诸如生物素、亲和素、链霉亲和素、HRP、蛋白质A、蛋白质B、抗体或它们的片段、Grb2、多组氨酸、Ni2+、FLAG标记、myc标记)、重金属、酶(示例包括碱性磷酸酶、过氧化物酶和荧光素酶)、电子供体/受体、吖啶酯、染料和量热基质(calorimetricsubstrates)。也将预想到，在表面等离子体共振检测的情况下，质量的改变可被认为是可检测的标记。技术人员将容易地认识到可在本发明的操作中使用上面未提到的有用的可检测标记。
沙门氏菌目标序列的选择
首先从本领域公知的沙门氏菌核酸序列中选择作为DNA扩增目标的沙门氏菌核酸序列。如这里所使用的，术语“沙门氏菌目标序列”指包含沙门氏菌属的细菌的核酸序列的DNA序列或RNA序列。它包括但不限于肠道沙门氏菌种和邦戈尔沙门氏菌种，肠道沙门氏菌种和邦戈尔沙门氏菌种包括但不限于亚种：enterica(I)(肠道(I))、salamae(II)(萨拉姆(II))、arizonae(IIIa)(亚利桑那(IIIa))、diarizonae(IIIb)(双亚利桑那(IIIb))、houtenae(IV)(豪顿(IV))和因indica(VI)(迪卡(VI))。亚种肠道沙门氏菌的示例性血清组和血清型可以在第7,659,381号美国专利中找到，该申请的全部内容通过引用包含于此。
下面的出版物讲授了根据本发明的可作为扩增目标的示例性沙门氏菌核酸序列：Liu WQ等，“Salmonella paratyphi C：genetic divergence fromSalmonella choleraesuis and pathogenic convergence with Salmonella typhi”，PLoS One，2009，4(2)：e4510；Thomson NR等，“Comparative genome analysisof Salmonella enteritidis PT4 and Salmonella gallinarum 287/91 provides insightsinto evolutionary and host adaptation pathways”，Genome Res，2008 Oct，18(10)：1624-37；Encheva V等，“Proteome analysis of serovars typhimurium andPullorum of Salmonella enterica subspecies I.”，BMC Microbiol，2005Jul 18，5：42；McClelland M等，“Comparison of genome degradation in Paratyphi A andTyphi，human-restricted serovars of Salmonella enterica that cause typhoid”，NatGenet，2004 Dec，36(12)：1268-74；Chiu CH等，“Salmonella enterica serotypeCholeraesuis：epidemiology，pathogenesis，clinical disease，and treatment”，ClinMicrobiol Rev，2004 Apr，17(2)：311-22；Deng W等，“Comparative genomics ofSalmonella enterica serovar Typhi strains Ty2 and CT18”，J Bacteriol，2003 Apr，185(7)：2330-7；Parkhill J等，“Complete genome sequence of a multiple drugresistant Salmonella enterica serovar Typhi CT18”，Nature，2001 Oct 25，413(6858)：848-52；McClelland M等，“Complete genome sequence ofSalmonella enterica serovar typhimurium LT2”，Nature，2001 Oct 25，413(6858)：852-6，它们的内容通过引用包含于此。可使用基因库登录号为NC_003197的肠道沙门氏菌亚种的鼠伤寒沙门氏菌LT2血清型的全部4857432bp基因组的示例性核苷酸序列。
在实施例中，退火为目标沙门氏菌的invA核酸序列的扩增探针可以是SEQ ID NO：7、13或14。
在另一实施例中，目标核酸序列是具有下面的DNA序列的沙门氏菌特异InvA基因核酸序列。
SEQ ID NO：12，肠道沙门氏菌InvA基因(基因库登录号：U43272.1)：
AACAGTGCTCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGTACTAATGGTGATGATCATTTCTATGTTCGTCATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCCTGATCGCACTGAATATCGTACTGGCGATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCAACGTTTCCTGCGGTACTGTTAATTACCACGCTCTTTCGTCTGGCATTATCGATCAGTACCAGCCGTCTTATCTTGATTGAAGCCGATGCCGGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATTCGTTATTGGCGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCAGTTTATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGCGTCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGATGGTATGCCCGGTAAACAGATGAGTATTGATGCCGATTTGAAGGCCGGTATTATTGATGCGGATGCTGCGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTTTACGGTTCCTTTGACGGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGCTATTGCCGGCATCATTATTATCTTTGTGAACTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGGATGACCCGCCATGGTATGGATTTGTCCTCCGCTCTGTCTACTTATACCATGCTGACCATTGGTGATGGTCTTGTCGCCCAGATCCCCGCATTGTTGATTGCGATTAGTGCCGGTTTTATCGTGACTCGCGTAAATGGCGATAGCGATAATATGGGGCGGAATATCATGACGCAGCTGTTGAACAACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATTTTGACCATTTCAATGGGAACTCTGCCGGGATTCCCGCTGCCGGTATTTGTTATTTTATCGGTGGTTTTAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACGTAGCGCCGCCAAACCTAAAACCAGCAAAGGCGAGCAGCCGCTTAGTATTGAGGAAAAAGAAGGGTCGTCGTTGGGACTGATTGGCGATCTCGATAAAGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGATATTACTTGTGCCGAAGAGCCGGCGTGAAGATCTGGAAAAAGCTCAACTTGCGGAGCGTCTACGTAGTCAGTTCTTTATTGATTATGGCGTGCGCCTGCCGGAAGTATTGTTACGCGATGGCGAGGGCCTGGACGATAACAGCATCGTATTGTTGATTAATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCTATTTTGATTTGATGCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGTCGTGTCCTTTGGTATTAATCCAACAATCCATCAGCAAGGTAGCAGTCAGTATTTCTGGGTAACGCATGAAGAGGGGGAGAAACTCCGGGAGCTTGGCTATGTGTTGCGGAACGCGCTTGATGAGCTTTACCACTGTCTGGCGGTGACCGTGGCGCGCAACGTCAATGAATATTTCGGTATTCAGGAAACAAAACATATGCTGGACCAACTGGAAGCGAAATTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCTCAGACATGCCACGGTACAACGTATATCTGAAGTTTTGCAGCGTTTATTAAGCGAACGTGTTTCCGTGCGTAATATGAAATTAATTATGGAAGCGCTCGCATTGTGGGCGCCAAGAGAAAAAGATGTCATTAACCTTGTAGAGCATATTCGTGGAGCAATGGCGCGTTATATTTGTCATAAATTCGCCAATGGCGGCGAATTACGAGCAGTAATGGTATCTGCTGAAGTTGAGGATGTTATTCGCAAAGGGATCCGTCAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTCAGCCTTGACCCGGAAGCCTCCGCTAATTTGATGGATCTCATTACACTTAAGTTGGATGATTTTTGATTGCACATAAAGATCTTGTCCTCCTTACGTCTGTCGATGTCCGTCGATTTATTAAGAAA。
如这里所使用的，术语“寡核苷酸”有时与“引物”或“多核苷酸”替换使用。术语“引物”指在PCR反应中用作DNA合成的起始点的寡核苷酸。引物通常是长度为大约15至大约35个的核苷酸，引物杂交到与目标序列互补的区域。
在特定的实施例中，一对扩增引物(即，正向引物和反向引物)可以是SEQ ID NO：1和2的引物对、SEQ ID NO：3和4的引物对或SEQ ID NO：5和6的引物对。
“引物二聚体”是在PCR中的潜在的副产物，引物二聚体由引物分子组成，引物分子在引物中因一系列互补的碱基而部分地彼此杂交。结果，DNA聚合酶扩增引物二聚体，导致与PCR反应物的竞争，从而潜在地抑制了作为PCR扩增的目标DNA序列的扩增。在实时PCR中，引物二聚体会通过降低灵敏度来影响准确定量。
图7示出了对于形成引物二聚体如何筛选用于检测沙门氏菌的引物序列。在Sybr Green I存在的情况下，使用正向引物和反向引物对来执行PCR反应。当该染料插入到双链DNA中时，该染料的荧光发射强度增加，因此，可在核酸扩增反应中用作非特异性探针。在示例3中所描述的包含40nM的正向引物和反向引物、耐热DNA聚合酶和Sybr Green I的合适的反应缓冲液中执行该反应。温度循环条件为95℃维持5分钟，接下来按如下条件循环40次：95℃维持15秒、55℃维持15秒和72℃维持30秒。在72℃阶段过程中收集实时数据。使用诸如Applied Biosystems 7500Fast Real-Time PCR System或Biorad CFX96 real-time PCR thermocycler的合适设备可实时检测SybrGreen I荧光发射的增加结果。引物二聚体的形成导致与前面特异引物模板DNA所看到的相似的特有的S型发射分布。附图示出了34对引物中的32对引物产生了明显的引物二聚体，这32对引物从进一步的分析中排除。引物对33和34形成最少的引物二聚体并用于在图5和图6中描述的化验。
通过本领域内公知的任何合适的方法(诸如化学合成)可合成并制备寡核苷酸。也可通过商业途径方便地得到寡核苷酸。
术语“退火”和“杂交”被互换地使用，并表示导致双链、三链或其它更高序列结构形成的一个核酸与另一个核酸的碱基对反应。在特定实施例中，主要反应是通过沃森/克里克和Hoogsteen类型氢键而碱基特异的，例如A/T和G/C。在特定的实施例中，碱基堆积和疏水作用也可有助于双链稳定。
如这里所使用的，术语“基本互补”指序列基本上互补的两个核酸链退火并形成稳定的双链。互补不需要精确，可存在任何数量的例如在两个核酸之间的碱基对错配。然而，如果错配的数量大得使即使在最不严格的杂交条件下也不会发生杂交，则该序列不是基本互补的序列。当这里将两个序列称作“基本上互补”时，它表示所述序列是彼此充分地互补的以在选择的反应条件下杂交。核酸互补与足以获得特异性的杂交的严格性之间的关系在本领域内是公知的。两个基本上互补的链可以例如完全互补，或者只要杂交条件足以允许例如区分成对序列与未成对序列，则两个基本上互补的链可以包含1至多个错配。因此，“基本上互补的”序列可以指在双链区域中具有100％、95％、90％、80％、75％、70％、60％、50％或更小或它们之间的任何数量的碱基互补的序列。
本领域的技术人员将知道如何设计在目标沙门氏菌基因组序列侧面的PCR引物。合成的寡核苷酸的长度通常在20和26个碱基对之间，融化温度TM通常在55度左右。
试样中细菌核酸序列的富集
用于检测目标沙门氏菌序列的示例性方案包括以下步骤：提供食物样本或表面刮拭物(surface wipe)，将样本或刮拭物与生长培养基混合并进行培养以增加沙门氏菌的数量或种群(“富集”)，将沙门氏菌细胞分解(“裂解”)，处理得到的裂解物来对目标沙门氏菌序列进行扩增和检测。食物样本可以包括诸如鲑鱼的鱼、诸如牛奶的牛奶制品、蛋、家禽、果汁、肉(诸如猪肉糜、猪肉、牛肉或牛肉糜)、蔬菜(菠菜或苜蓿芽)或诸如花生酱的处理过的坚果。
根据在25克固体或25mL液体食物中或限定区域的表面上可以检测的菌落形成单位(CFU)的数量来描述对于食物污染检测限(LOD)。通过定义，菌落形成单位是存活细菌数量的量度。不同于计数全部的细胞(死细胞和活细胞)的间接显微镜计数，CFU测量活细胞。在许可的条件下，一个CFU(一个细菌细胞)在琼脂平板上将生长形成单独的菌落。美国食品检验检查部门将最低的LOD定义为1CFU/25g固体食物或1CFU/25mL液体食物，或者1CFU/表面面积。
在实践中，不可能反复地用单独的CFU接种食物样本或表面并确保细菌在富集过程中存活。通过以一个或几个目标浓度接种样本并使用最可能数(MPN)统计估计污染来分析结果。作为示例，通过在分光光度计中测量吸光率使沙门氏菌培养基生长成为特定的细胞密度。在培养基上涂板十倍连续稀释的目标，并对活细菌进行计数。该数据用于构建CFU/涂板体积与细胞密度的标准曲线。为了使MPN有意义，分析多个接种水平的试样。最终的目标是为了获得在25％和75％之间的碎片回收率(fractional recovery)(即，在使用CataCleave探针的反转录PCR的化验中的25％和75％之间的阳性样本测试，将在下面对此进行解释)。选择这些碎片回收百分比的原因在于，对于25g固体食物样本、25mL液体食物样本或表面的限定区域，它们转换成0.3CFU和1.375CFU之间的MPN值。这些MPN值包括1CFU/样本的所需的LOD。根据实践，能够(根据标准曲线)估计稀释的接种体的体积来获得这些碎片回收率。
沙门氏菌目标核酸序列的PCR扩增
一旦选择了引物并制备了试样中的核酸(见示例)，就可通过各种方法完成核酸的扩增，所述各种方法包括聚合酶链式反应(PCR)、依赖核酸序列扩增(NASBA)、连接酶链式反应(LCR)和滚环扩增(RCA)。聚合酶链式反应(PCR)是扩增特异目标DNA序列的最常用的方法。
“聚合酶链式反应”或“PCR”通常指用于扩增期望核苷酸序列体外方法。第4,683,202号、第4,683,195号、第4,800,159号和第4,965,188号美国专利详细地描述了该方法，这些申请的全部内容通过引用包含于此。通常PCR工艺包括将两摩尔以上或超过两摩尔以上的可延伸寡核苷酸引物放入包含期望的目标序列的混合物中，所述引物与双链目标序列的相对链互补。在DNA聚合酶存在的情况下，对反应混合物进行热循环的程序，从而通过侧面的DNA引物使期望目标序列扩增。
可用在实施例中的引物可具有SEQ ID NO 1-6的DNA序列。
可用在本申请实施例中的探针(有时称作“CataCleave探针”)可具有序列5’-/FAM/CGATCAGrGrArArATCAACCAG/IABFQ)(SEQ ID NO：7)(其中，小写字母“r”表示RNA碱基(即，rG是鸟嘌呤))，或可具有序列5’-/FAM/AGGTAACCrGrArArAACAAGCC/3IABlk_FQ)(SEQ ID NO：8)。
如这里所使用的，术语“PCR片段”或“反转录PCR片段”或“扩增子”指通过下面的特定目标核酸的扩增产生的多聚核苷酸分子(或统称为多个分子)。PCR片段通常是DNA PCR片段，但不排除其它情况。PCR片段可以是单链、双链或它们的任意浓度比的混合物。PCR片段或反转录PCR片段的长度可以是100-500个核苷酸或更多的核苷酸。
扩增“缓冲液”是被添加到扩增反应的化合物，缓冲液通过控制扩增反应来调节扩增反应的一个或多个组分的稳定性、活性和/或寿命。本发明的缓冲剂与PCR扩增和RNase H的切割活性相适应。缓冲液的示例包括HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)、MOPS(3-(N-吗啉基)丙烷磺酸)和包含缓冲剂的醋酸或磷酸等。另外，PCR缓冲液通常可包含达大约70mM的KCl和大约1.5mM或更高的MgCl2，且包含的dATP、dCTP、dGTP和dTTP均达大约50μM-200μM。本发明的缓冲液可包含添加剂以使有效的反转录PCR或PCR反应最优化。
添加剂是被添加到组成物的化合物，调节组成物的一个或多个组分的稳定性、活性和/或寿命。在特定的实施例中，所述组合物是扩增反应组合物。在特定的实施例中，添加剂灭活污染物酶、稳定蛋白质折叠和/或减少聚合(aggregation)。可包括在扩增反应中的示例性添加剂包括甜菜碱、甲酰胺、KCl、CaCl2、MgOAc、MgCl2、NaCl、NH4OAc、NaI、Na(CO3)2、LiCl、MnOAc、NMP、海藻糖、二甲亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇、二硫苏糖醇(DTT)、焦磷酸酶(包括嗜酸热源体无机焦磷酸酶(TAP)，但不限于此)、牛血清白蛋白(BSA)、丙二醇、甘氨酰胺、CHES、Percoll、金精三羧酸、Tween 20、Tween 21、Tween 40、Tween 60、Tween 85、Brij 30、NP-40、Triton X-100、CHAPS、CHAPSO、Mackernium、LDAO(N-dodecyl-N，N-dimethylamine-N-oxide，N-十二烷基-N，N-二甲胺-N-氧化物)、Zwittergent 3-10、Xwittergent 3-14、Xwittergent SB 3-16、Empigen、NDSB-20、T4G32、E.Coli SSB、RecA、nicking核酸内切酶、7-deazaG、dUTP、阴离子去污剂、阳离子去污剂、非离子去污剂、两性洗涤剂、固醇、渗透剂(osmolyte)、阳离子以及可改变扩增效率的任何其它化学药品、蛋白质或辅因子。在特定的实施例中，扩增反应中包括两种或更多种添加剂。倘若添加剂不影响RNase H的活性，则可以任选地添加添加剂以改善退火引物的选择性。
如这里所使用的，应用于酶的术语“热稳定”指在高温下(例如，在55℃或更高的温度下)保持其生物活性，或指在接下来的反复的加热和冷却循环下保持其生物活性。热稳定多核苷酸聚合酶在PCR扩增反应中特别有用。
如这里所使用的，“热稳定聚合酶”是对热相对稳定的酶，因此，省略了在每个PCR循环之前加酶的需要。热稳定聚合酶的非限制性示例包括从如下嗜热细菌中分离出的聚合酶：栖热水生菌(Taq聚合酶)、嗜热栖热菌(Tth聚合酶)、栖热球菌(Tli或VENT聚合酶)、强烈火球菌(Pfu或DEEPVENT聚合酶)、Pyrococcus woosii(Pwo聚合酶)或其它热球菌种、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bst聚合酶)、嗜酸热硫化叶菌(Sac聚合酶)、嗜酸热源体菌(Tac聚合酶)、红色栖热菌(Tru聚合酶)、布氏栖热菌(DYNAZYME聚合酶)、阿波罗栖热袍菌(Tne聚合酶)、海栖热袍菌(Tma)和栖热袍菌属的其它种(Tsp聚合酶)以及热自养甲烷杆菌(Mth聚合酶)。PCR反应可包含多于一个的具有互补特性的热稳定聚合酶来引导目标序列的更充分的扩增。例如，具有高持续合成能力(复制大量核苷酸片段的能力)的核苷酸聚合酶可与具有校正能力(在目标核酸序列延长过程中纠正错误的能力)的另一核苷酸聚合酶互补，从而建立可以复制具有高保真度的长目标序列的PCR反应。热稳定聚合酶可以以其野生型形式使用。可选择地，可对聚合酶进行改性使其包含酶的片段或包含提供便于PCR反应的有益的特性的变异(mutation)。在一个实施例中，热稳定酶可以是Taq聚合酶。具有提高的特性的Taq聚合酶的许多变型是公知的并包括AmpliTaq、AmpliTaq Stoffel片段、SuperTaq、SuperTaqplus、LA Taq、LApro Taq和EX Taq。
沙门氏菌RNA目标核酸序列的反转录PCR扩增
研究基因表达的最为广泛使用的技术之一使用对于mRNA序列的第一链cDNA作为用于通过PCR扩增的模板。该方法通常被称作PCR或反转录PCR，该方法利用PCR方法的高灵敏度和特异性且该方法被广泛地用于RNA的检测和定量。
执行为终点化验或实时化验的反转录PCR程序涉及两个单独的分子合成：(i)从RNA模板合成cDNA；(ii)通过PCR扩增复制新合成的cDNA。为了尝试解决通常与反转录PCR有关的技术问题，考虑到程序的以下三个基本步骤已开发了数个方案：(a)RNA的变性和反向引物的杂交；(b)cDNA的合成；(3)PCR扩增。在所谓的“分开的(uncoupled)”反转录PCR程序(例如，两步反转录PCR)中，将反转录执行为使用对反转录活性起到最佳缓冲液条件的两个单独的步骤。接下来合成cDNA，稀释反应来将MgCl2和脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)的浓度降低到对于Taq DNA聚合酶的最佳条件，并根据标准条件(参见第4,683,195号和第4,683,202号美国专利)执行PCR。相比之下，“分开的”反转录PCR方法使用对于反转录酶和Taq DNA聚合酶活性来说普通的缓冲液。在一种情况下，反向引物的退火是在添加酶之前的单独步骤，所述酶然后被加入到单独的反应容器中。在另一种情况下，反转录活性是热稳定Tth DNA聚合酶的成分。在Mn2+的存在下执行退火和cDNA合成，然后在通过螯合剂去除Mn2+之后在Mg2+的存在下执行PCR。最终，“连续”方法(例如，一步反转录PCR)将三个反转录PCR步骤整合成避免了反应管为组分或酶的添加而打开的单一连续的反应。连续反转录PCR已被描述为利用耐热Taq DNA聚合酶和Tth聚合酶的反转录活性的单一酶系统，以及其中初始温度为65℃的利用AMV反转录酶和Taq DNA聚合酶的双酶系统。RNA变性的步骤被省略。
实时反转录PCR的第一步是使用模板特异DNA引物中的一个来产生互补DNA链。在传统的PCR反应中，该产物被变性，第二模板特异引物结合到cDNA，并延伸形成双链DNA。该产物在随后的多次温度循环中扩增。为了维持最高的灵敏度，重要的是在cDNA合成之前RNA未降解。由于RNA:DNA杂交可作为酶的底物，所以在反应缓冲液中RNase H的存在将导致在方法的第一步中形成的RNA:DNA杂交不期望地降解。克服该问题主要有两种方法。一种方法是使用诸如石蜡的阻碍物将RNase H从剩余的反转录反应物中物理地分离出来，其中，石蜡在最初的高温DNA变性步骤过程中将熔化。第二种方法是修饰RNase H使得RNase H在反转录温度(通常为45℃-55℃)下失活。多种方法在本领域内是公知的，这些方法包括RNase H与抗体反应或可逆的化学修饰。例如，在这里使用的热启动RNAse H活性可以是在碱性条件下在RNAse H与顺乌头酸酐反应后产生的具有可逆化学修饰的RNAse H。当修饰酶用在具有三种碱基的缓冲液的反应中且温度升高至95℃时，溶液的pH下降且RNase H的活性恢复。该方法允许在反转录开始之前将RNase H包含在反应混合物中。
在Walder等的第2009/0325169号美国专利申请中描述了本发明中可使用的RNAse H酶和热启动RNAse H酶的另外的示例。
一步反转录PCR相对分开的反转录PCR具有多处优点。一步反转录PCR比分开的反转录PCR(例如，反应管的用于在两个反应步骤之间添加成分或酶的开口)对反应混合试剂盒核酸产物的处理更少，因此，劳动强度更小，减少了所需的工时量。另外，一步反转录PCR需要更少的样本，并降低了污染的危险。一步反转录PCR的灵敏度和特异性已被证明适合于研究给定样本中的一个至几个基因的表达水平或适合于检测病原体RNA。典型地，该程序已不限于使用基因特异性引物来启动cDNA合成。
通过结合这些反转录PCR技术的实时检测来测量PCR反应的动力学的能力使能够以高灵敏度来准确且精确地确定RNA的拷贝数。通过荧光监测来检测反转录PCR产品和在扩增工艺中通过下面描述的荧光双标记杂交探针技术(诸如5′荧光核酸酶检验(Taq-Man)或核酸内切酶检验(CataCleave))使准确且精确地确定RNA的拷贝数变得可能。
使用CataCleave探针的沙门氏菌目标核酸序列的实时PCR
扩增后扩增子检测是费力和费时的。已经发展了实时方法，从而在PCR过程中监控扩增。这些方法通常采用结合到新合成的DNA的荧光标记的探针或染料，当荧光标记的探针或染料插入到双螺旋DNA中时，它们的荧光发射增大。
探针通常设计为使得供体发射在没有目标的情况下由于两个发色团之间的荧光共振能量转移(FRET)而淬灭。当供体发色团和受体发色团极为靠近时，供体发色团在其激发状态下可以将能量转移到受体发色团。这种转移总是非辐射的，并通过偶极-偶极耦合而发生。足以增大发色团之间的距离的任何过程将减小FRET效率，从而可以辐射地检测到供体发色团发射。一般的供体发色团包括FAM、TAMRA、VIC、JOE、Cy3、Cy5和Texas Red。选择受体发色团，使得它们的激发光谱与供体的发射光谱重叠。这样的一对发色团的示例是FAM-TAMRA。还存在将淬灭宽范围的供体的非荧光受体。适当的供体-受体FRET对的其它示例对于本领域技术人员来说将是已知的。
可以用于PCR实时检测的FRET探针的一般示例包括分子信标、TaqMan探针(例如，第5,210,015号和第5,487,972号美国专利)和CataCleave探针(例如，第5,763,181号美国专利)。分子信标是单链寡核苷酸，所述单链寡核苷酸设计为使得在非束缚状态下探针形成供体发色团和受体发色团极为靠近的二级结构，并减小了供体发射。在适当的反应温度下，信标打开(unfold)，并特异地结合到扩增子。一旦打开，供体发色团和受体发色团之间的距离就增大，从而FRET转换，并且可以使用专门的仪器来监控供体发射。TaqMan和CataCleave技术与分子信标的不同之处在于，所采用的FRET探针被切割，使得供体发色团和受体发色团变得充分分离，以转换FRET。
TaqMan技术采用在具有供体发色团的5′端和具有受体发色团的3′端进行标记的单链寡核苷酸探针。用于扩增的DNA聚合酶必须含有5′→3′核酸外切酶活性。在引物结合的同时，TaqMan探针结合到扩增子的一个链。随着DNA聚合酶延伸引物，聚合酶将最终遇到结合的TaqMan探针。此时，聚合酶的核酸外切酶活性将顺序地使得在5′端开始的TaqMan探针降解。随着探针被消化，含有探针的单核苷酸释放到反应缓冲液中。供体扩散离开受体，并且FRET被转换。监控来自供体的发射，以识别探针切割。由于TaqMan起作用的方式，所以可以在PCR的每个循环内仅检测到特定的扩增子一次。引物通过TaqMan目标位点的延伸产生双链产物，双链产物进一步防止TaqMan探针的结合，直到扩增子在下一个PCR循环内变性为止。
第5,763,181号美国专利(通过引用将其内容并入本文)描述了另一种实时检测方法(称作“CataCleave”)。CataCleave技术与TaqMan的不同之处在于，探针的切割由不具有聚合酶活性的第二种酶来完成。CataCleave探针在分子内具有作为核酸内切酶(例如，限制性酶或RNAase)的目标的序列。在一个示例中，CataCleave探针具有嵌合结构，其中，探针的5′端和3′端由DNA构成，并且切割位点含有RNA。探针的DNA序列部分在端部或者内部由FRET对标记。PCR反应包括RNase H酶，RNase H酶将特定地切割RNA-DNA双链(duplex)的RNA序列部分。在切割之后，探针的两半在反应温度下与目标扩增子分离，并扩散到反应缓冲液中。随着供体和受体分离，FRET按照与TaqMan探针相同的方式转换并且供体发射可被监控。切割和分离使进一步用于CataCleave结合的位点再生。这样，单个扩增子可以用作目标或多轮探针切割，直到引物延伸通过CataCleave探针结合位点为止。
沙门氏菌特异的CataCleave探针的标记
术语“探针”是指含有特异部分的多核苷酸，所述特异部分设计为以序列特异的方式与特定的核酸序列(例如，目标核酸序列)的互补区域杂交。在一个实施例中，寡核苷酸探针在长度为15-60个核苷酸的范围内。更优选地，寡核苷酸探针在长度为18-30个核苷酸的范围内。本发明的寡核苷酸探针的精确序列和长度部分地取决于其所结合的目标多核苷酸的性质。对于特定的实施例，可以改变结合位置和长度，以实现适当的退火和熔化性能。用于做出这种设计选择的指导可以在描述Taq-man检验或CataCleave的许多参考文献中查阅到，如在第5,763,181号、第6,787,304号和第7,112,422号美国专利中描述的，通过引用将上述美国专利的内容全部并入本文。
如这里使用的，术语“标记”或“可检测的标记”可以指含有通过共价或非共价方式附于探针的荧光染料化合物的任何CataCleave标记。
如这里使用的术语“荧光染料”是指基于波长比所发射的光的波长短的光的激发而发光的荧光化合物。术语“荧光供体”(fluorescent donor或fluorescence donor)是指发光的荧光染料，所述光由在本发明中描述的检验中测量。更具体地说，荧光供体提供由荧光受体吸收的光。术语“荧光受体”(fluorescent acceptor或fluorescence acceptor)是指吸收荧光供体发射的能量的第二种荧光染料或淬灭分子。第二种荧光染料吸收荧光供体发射的能量，并发射波长比荧光供体发射的光的波长长的光。淬灭分子吸收荧光供体发射的能量。
可以在本发明的实施中使用任何发光分子，优选地使用荧光染料和/或荧光淬灭剂，其包括例如Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 430、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor633、Alexa Fluor 647、Alexa Fluor 660、Alexa Fluor 680、7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸、荧光素、Oregon Green 488、Oregon Green 514、四甲基若丹明、若丹明X、Texas Red染料、QSY 7、QSY33、Dabcyl、BODIPY FL、BODIPY630/650、BODIPY 6501665、BODIPY TMR-X、BODIPY TR-X、二烷基氨基香豆素(dialkylaminocoumarin)、Cy5.5、Cy5、Cy3.5、Cy3、DTPA(Eu3+)-AMCA和TTHA(Eu3+)AMCA。
在一个实施例中，寡核苷酸探针的3′端核苷酸被封闭或者被迫使不能使核酸聚合酶延伸。这种封闭通过将报告分子或淬灭分子结合到探针的3′端位置来方便地实现。
在一个实施例中，报告分子是荧光有机染料，所述荧光有机染料被衍生以用于经由连接部分结合到探针的3′端或5′端。优选地，淬灭分子也是有机染料，根据本发明的实施例，所述有机染料可以是荧光的，也可以不是荧光的。例如，在本发明的优选实施例中，淬灭分子是非荧光的。通常，不管淬灭分子是荧光的，还是仅通过非辐射衰减释放来自报告分子的传递能量，淬灭分子的吸收带应当基本上与报告分子的荧光发射带重叠。吸收来自激发的报告分子的能量但不辐射地释放能量的非荧光淬灭分子在应用中称作发色分子。
示例性的报告分子-淬灭分子对可以选自于氧杂蒽染料，包括荧光素和若丹明染料。这些化合物中的许多适当形式的化合物可以广泛地通过商业渠道获得的，其中取代基位于它们的苯基部分上，所述苯基部分可以作为用于结合的位点，或者作为用于结合到寡核苷酸的结合功能。荧光化合物的另一基团是萘胺，所述萘胺在α位或β位具有氨基。这样的萘氨基化合物包括1-二甲基氨基萘基-5-磺酸盐、1-苯胺基-8-萘磺酸盐和2-对甲苯胺基6-萘磺酸盐。其它染料包括3-苯基-7-异氰酸基香豆素、吖啶(例如9-异硫氰酸基吖啶和吖啶橙)、N-(对(2-苯并噁唑基)苯基)马来酰亚胺、苯并二唑、二苯乙烯、芘等。
在一个实施例中，报告分子和淬灭分子选自于荧光素和非荧光淬灭染料。
有许多连接部分和方法用于将报告分子或淬灭分子连接到寡核苷酸的5′端或3′端，如由下面的参考文献所举例说明的：Eckstein，editor，Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach(IRL Press，Oxford，1991)；Zuckerman等人，Nucleic Acids Research，15：5305-5321(1987)(3′thiolgroup on oligonucleotide)；Sharma等人，Nucleic Acids Research，19：3019(1991)(3′sulfhydryl)；Giusti等人，PCR Methods and Applications，2：223-227(1993)，以及Fung等人，第4,757,141号美国专利(5′phosphoamino group via Aminolink..II available from Applied Biosystems，Foster City，Calif.)Stabinsky，第4,739,044号美国专利(3′aminoalkylphosphoryl group)；Agrawal等人，TetrahedronLetters，31：1543-1546(1990)(attachment via phosphoramidate linkages)；Sproat等人，Nucleic Acids Research，15：4837(1987)(5′mercapto group)；Nelson等人，Nucleic Acids Research，17：7187-7194(1989)(3′amino group)等。
若丹明和非荧光淬灭染料还在固相合成开始时方便地结合到寡核苷酸的3′端，例如：Woo等人，第5,231,191号美国专利；以及Hobbs，Jr.，第4,997,928号美国专利。
沙门氏菌特异的CataCleave探针结合到固体载体
在本发明的一个示例中，寡核苷酸探针可以结合到固体载体。不同的探针可以结合到固体载体，并可以用于同时检测样品中的不同目标序列。具有不同荧光波长的报告分子可以用在不同的探针上，因此能够使与不同的探针的杂交被单独地检测。
用于固定寡核苷酸探针的优选类型的固体载体的示例包括聚苯乙烯、抗生物素蛋白包覆的聚苯乙烯珠体纤维素、尼龙、丙烯酰胺凝胶和活化的右旋糖酐、可控孔度玻璃(CPG)、玻璃板和高度交联的聚苯乙烯。这些固体载体由于其化学稳定性、易于功能化和明确定义的表面积，所以对于杂交和诊断研究来说是优选的。诸如可控孔度玻璃(
)和不膨胀的高度交联的聚苯乙烯
之类的固体载体由于其与寡核苷酸合成的相容性，所以是特别优选的。
寡核苷酸探针可以以各种方式结合到固体载体。例如，探针可以通过探针的3′或5′端核苷酸结合到固体载体而结合到固体载体。然而，探针可以通过连接物结合到固体载体，所述连接物用于使探针与固体载体隔开。连接物最优选地在长度上为至少30个原子，更优选地在长度上为至少50个原子。
固定到固体载体的探针的杂交通常需要探针与固体载体隔开至少30个原子，更优选地至少50个原子。为了实现这种隔开，连接物通常包括位于连接物和3′核苷之间的间隔臂(spacer)。对于寡核苷酸合成，连接物臂通常通过酯链结合到3′核苷的3′-OH，所述酯链可以使用碱性试剂而切割开，从而使寡核苷酸离开固体载体。
可以用于将寡核苷酸探针结合到固体载体的各种连接物在本领域中是已知的。连接物可以由不显著妨碍目标序列杂交到结合至固体载体的探针的任何化合物形成。连接物可以由均聚合寡核苷酸形成，所述均聚合寡核苷酸可以通过自动合成而容易地加到连接物上。可选地，诸如功能化聚乙二醇的聚合物可以用作连接物。这样的聚合物相对于均聚合寡核苷酸是优选的，因此它们不显著妨碍探针杂交到目标寡核苷酸。聚乙二醇是特别优选的，因为它可以通过商业渠道获得，可溶于有机介质和水介质中，易于功能化，并且在寡核苷酸合成和后合成的条件下是完全稳定的。
固体载体、连接物和探针之间的连接优选地不是在高温下在碱性条件下在碱性保护基团的去除期间切割。优选的连接的示例包括氨基甲酸酯和酰胺连接。探针的固定是众所周知的，并且本领域技术人员可以确定固定条件。
根据该方法的一个实施例，将杂交探针固定在固体载体上。寡核苷酸探针在有利于杂交的条件下与核酸的样品接触。在未杂交的状态下，荧光标记被淬灭剂淬灭。在杂交到目标的情况下，荧光标记便于淬灭剂分离，从而产生荧光。
杂交探针固定到固体载体还能够使杂交到探针的目标序列容易地与样品分离。在随后的步骤中，可以将分离的目标序列与固体载体分离，并基于研究者的特定需要，根据在本领域中众所周知的方法进行处理(例如，净化、扩增)。
使用CataCleave探针的沙门氏菌目标核酸序列的实时检测
被标记的寡核苷酸探针可以作为用于对样品中的沙门氏菌目标核酸序列进行实时检测的探针。
首先，将CataCleave寡核苷酸探针与DNA和RNA序列进行合成，所述DNA和RNA序列与在包括选择的沙门氏菌目标序列的PCR扩增子内发现的序列互补。在一个实施例中，探针用FRET对进行标记，例如，在探针的一端标记荧光素分子，在另一端标记非荧光淬灭分子。因此，一旦探针与PCR扩增子杂交，RNA:DNA异源双链形成可以通过RNase H活性切割的双链。
RNase H水解RNA-DNA杂交体中的RNA。该酶首先在小牛胸腺中发现，但随后在各种生物体中被鉴别出来。RNase H活性似乎普遍存在于真核细胞和细菌中。虽然RNase Hs构成分子量和溶核活性不同的一族蛋白质，但是底物要求对于各种同型来说似乎是类似的。例如，到目前为止研究的大多数RNase H’s起到核酸内切酶的作用，并需要二价阳离子(例如，Mg2+、Mn2+)，以产生5′磷酸(phosphate)端和3′羟基端的切割产物。
来自E.coli的RNase HI是RNase H家族的最有特征性的成员。除了RNaseHI之外，第二种E.coli RNase H(即，RNase HII)已经被克隆并被鉴定(Itaya，M.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1990，87，8587-8591)。RNase H是由213个氨基酸组成，而RNase HI的长度为155个氨基酸。E.coli RNase HIM与E.coliRNase HI仅显示出17％同源性。由S.typhimurium克隆的RNase H与E.coliRNase HI的不同之处仅在于11个位置，且长度为155个氨基酸(Itaya，M.和Kondo K.，Nucleic Acids Res.，1991，19，4443-4449)。
显示出RNase H活性的蛋白质已经被克隆，并从许多种病毒、其它细菌和酵母中提纯出来(Wintersberger，U.Pharmac.Ther.，1990，48，259-280)。在许多情况下，具有RNase H活性的蛋白质似乎是融合蛋白质，其中，RNase H融合到另一种酶(通常为DNA或RNA聚合酶)的氨基端或羧基端。已经一致地发现RNase H域与E.coli RNase HI高度同源，但是由于其它域显著不同，所以融合蛋白质的分子量和其它特性有很大差异。
在更高等的真核细胞中，已经基于分子量的差异、二价阳离子的作用、对巯基试剂的敏感性和免疫学交叉反应性定义了两类RNase H(Busen等人，Eur.J.Biochem.，1977，74，203-208)。报道了RNase HI酶具有在68-90kDa范围内的分子量，由Mn2+或Mg2+激活，并且对巯基试剂不敏感。相反，已经报道了RNase H II酶具有范围为31-45kDa的分子量，需要Mg2+以对巯基试剂高度敏感，并由Mn2+抑制(Busen，W.，和Hausen，P.，Eur.J.Biochem.，1975，52，179-190；Kane，C.M.，Biochemistry，1988，27，3187-3196；Busen，W.，J.Biol.Chem.，1982，257，7106-7108)。
具有RNase HII特性的酶已经被提纯，以接近人体胎盘素的均质性(Frank等人，Nucleic Acids Res.，1994，22，5247-5254)。报道了该蛋白质具有大约33kDa的分子量，并且在6.5-10的pH范围内(最佳的pH为8.5-9)是有活性的。报道了该酶需要Mg2+，并由Mn2+和n-乙基马来酰亚胺来抑制。切割反应的产物具有3′羟基端和5′磷酸端。
根据实施例，在热稳定性的核酸聚合酶、RNase H活性、能够杂交到沙门氏菌目标多核苷酸的一对PCR扩增引物以及被标记的CataCleave寡核苷酸探针的存在下对目标多核苷酸进行实时核酸扩增。在实时PCR反应期间，通过RNase H的探针的切割使得荧光供体与荧光淬灭分子分离，并且使得与样品中的沙门氏菌目标DNA序列的实时检测对应的探针的荧光实时增加。
在特定实施例中，在少于大约40个PCR扩增循环中，实时核酸扩增允许单个目标DNA分子的实时检测，如图7中所示。
试剂盒
这里的公开内容还提供了包括包装单元(package unit)的试剂盒形式，所述包装单元具有一种或多种试剂，以用于对样品中的沙门氏菌目标核酸序列进行实时检测。试剂盒还可以包含下面的项中的一项或多项：缓冲液；说明书；阳性或阴性对照物。试剂盒可以包括试剂容器，所述试剂以适当的比例混合，以用于执行这里描述的方法。试剂容器优选地含有单位量的试剂，当执行主体方法时，单位量的试剂省去测量步骤。
试剂盒还可以含有用于实时PCR的试剂，所述试剂包括、但不限于热稳定的聚合酶、热稳定的RNase H、被选择用于扩增沙门氏菌核酸目标序列的引物以及退火以获得实时PCR产物的被标记的CataCleave寡核苷酸探针，根据这里描述的方法，所述试剂允许检测沙门氏菌目标核酸序列。试剂盒可以包括用于检测两种或更多种沙门氏菌目标核酸序列的试剂。在其它实施例中，试剂盒试剂还包括用于从生物样本中提取基因组DNA或RNA的试剂。在适用情况下，试剂盒试剂还可以包括用于RT-PCR分析的试剂。
在特定实施例中，扩增引物对的序列可具有SEQ ID NO：1和2或者3和4或者5和6的序列。
在其它实施例中，CataCleave寡核苷酸探针具有SEQ ID NO：7或8或13或14的序列。
对样本中的沙门氏菌InvA基因序列进行示例性实时检测
参照示例1，示例1是在食物样本(固态或液态)中或表面上的沙门氏菌种的富集的实施例。将食物样本放入塑料袋子并在接近样本的自然贮藏温度的温度下进行培养以进行24-48小时的检验。这模拟了在商业过程中或在家里的厨房内正常地获得样本的处理并允许细菌污染自然死亡或生长。为了示出性的目的，利用Salmonella paratyphi B(乙型副伤寒沙门氏菌)人工地接种示例1中的鲑鱼来模拟污染的样本。正常地，将像从生产企业获得样本一样地处理该样本。样本的表面为4英尺×4英尺或1英尺×1英尺。对于4英尺×4英尺的样本，利用限定尺寸的在10mL的Dey-Engley肉汤中浸湿的棉球刮拭表面样本，或对于1英尺×1英尺的样本，利用在Dey-Engley肉汤中润湿的药签来刮拭表面样本。将棉球和药签放置在单独的塑料袋子中。表面样本不经过24-48小时的最初贮藏时期。在最初贮藏时期之后，根据样本的母体，进一步地将食物样本细分为多个25g或25mL部分。在富集之前将这些部分放置在单独的塑料袋子中。
在225mL的胰蛋白胨大豆肉汤中富集表面样本或部分食物样本。将肉汤添加到每个塑料袋子中，密封袋子，并在匀质装置中处理容纳物以将富集肉汤分配给全部的样本。然后在大约35℃至大约42℃的温度下培养样本18-24小时。在该培养期间，沙门氏菌将在内容物已经污染的任何样本袋子中繁殖。富集确保在污染样本中的沙门氏菌的浓度足够高使得可回收用于分析的足够的核酸。
参照示例2，实施例描述了溶解富集的样本来回收核酸。样本富集的一小部分在包含叠氮化钠、蛋白酶K和清洁剂Triton X-100的Tris-HCl缓冲溶液中溶解。蛋白酶K和Triton X-100分解细菌细胞壁，使得核酸被释放出来。对叠氮化钠的作用认识不足，但叠氮化钠可能用作还原剂来增加溶解剂的效力。在溶解之后，将样本加热到95℃以使蛋白酶K失活。
参照图2，图2示出了对食物中或表面上的沙门氏菌的结合PCR/CataCleave探针检测检验的实施例。特异地用于具有SEQ ID NO：1和2的特异侵入基因的沙门氏菌种的部分的扩增的PCR引物与CataCleave探针结合，CataCleave可以用于扩增子的实时检测。在包含热稳定RNase H、热稳定DNA聚合酶和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)的示例3中描述的合适的反应缓冲液中执行该反应。在反应循环过程中，首先在37℃培养样本使得尿嘧啶-N-糖基化酶可以切割任何经前面的检验的含有尿嘧啶的核酸。该材料是将导致沙门氏菌的假阳性检测的污染物。由于UNG含有胸腺嘧啶脱氧核苷而不含尿嘧啶，所以UNG不影响从细菌溶解物回收核酸。在培养之后，在高温下使从溶解物回收的核酸变性并使UNG失活。随着温度的降低，侵入基因特异引物和CataCleave探针杂交获得任何沙门氏菌种特异扩增子。在杂交之后，通过RNase H的作用可以切割CataCleave探针，RNase H切割RNA/DNA双链的RNA部分。一旦被切割，探针片段从它们目标分离出来，并扩散到反应缓冲溶液中。利用荧光供体和淬灭剂标记CataCleave探针，使得在完整的状态下，来自供体的荧光极大地减少。探针片段的扩散增大了供体和淬灭剂之间的距离，使得荧光不再减弱。可使用诸如Applied Biosystems 7500FastReal-Time PCR System或Biorad CFX96 real-time PCR thermocycler的合适的设备实时检测供体荧光发射的增加结果。在探针片段从目标分离出来之后，另一CataCleave探针可在相同的位置杂交，并重复切割反应。由于单独的扩增子可用作用于切割多个CataCleave探针的模板，所以该循环工艺导致信号扩增。在该时间内，基因特异引物在核苷三磷酸的存在下通过DNA聚合酶延伸。一旦引物延伸到用于CataCleave探针结合的位点，则切割不再发生。在延伸之后，完成了扩增和检测的循环，扩增子的数量加倍。然后，这些新合成的扩增子在接下来的扩增/检测循环中用作模板。
参照图3，图3示出了利用乙型副伤寒沙门氏菌人工接种的鲑鱼的实时PCR CataCleave反应的结果的实施例。该图示出了从接种的鲑鱼样本回收的核酸可用作用于检验的模板。在包含足量的DNA模板的检验中，荧光发射强度迹线(trace)具有与指数的目标扩增相关的特征形状。由于一些反应物变得有限，所以强度值最后达到稳定的水平。与使用模拟富集的阴性对照检验(已知的所有组分都无菌)相比，未被沙门氏菌接种的样本的荧光发射未表现出任何显著的增加。
参照图4a和图4b，图4a和图4b示出了使用内部对照来使实时PCRCataCleave反应的组分生效的实施例。即使反应物在试剂盒生产时满足质量控制规格，但是在实时检验中使用的一种或多种反应物将劣化的可能性也存在。在这些条件下，已受影响的检验将失败并产生假阴性结果。可通过包括在实时反应中的内部对照来检测该情形，在实时反应中的内部对照是公知的在存在或不存在沙门氏菌种特异模板的情况下产生阳性结果。这样的内部对照的一个示例是包含长度与沙门氏菌扩增子的长度相似的短的随机的DNA序列，但具有不同的引物和探针结合位点。被包括的序列和CataCleave探针与沙门氏菌种必须不具有任何同源性，或不得具有任何近缘生物。示例4包括这样类型的内部对照。将内部对照的复制的数量限制为不影响鼠伤寒沙门氏菌的有效扩增。
参照图5，图5示出了用于检测沙门氏菌基因组DNA的1至106拷贝数的结合PCR/CataCleave探针检验的实施例。特异地用于具有SEQ ID NO：3和4的特异侵入基因的沙门氏菌种的部分的扩增的PCR引物与SEQ ID NO：13CataCleave探针结合，这可用于实时检测扩增子。
引物和探针位置33。
该位置扩增1409-1564，探针在1473-1489处结合(参照Inv基因序列U43273)。
引物：
5’-ACG CGC TTG ATG AGC TTT AC(SEQ ID NO：3)
5’-GTT GTA CCG TGG CAT GTC TG(SEQ ID NO：4)
探针：
5，-/FAM/CGG TAT T rCrArGrG AAA CAA/IaBlkFQ/(SEQ ID NO：13)
字母“r”表示探针中的RNA。供体为FAM，淬灭剂为Iowa Black FQ。
在包含热稳定RNase H、热稳定DNA聚合酶和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)的示例3中描述的合适的反应缓冲液中执行该反应。在反应循环过程中，首先在37℃培养样本使得尿嘧啶-N-糖基化酶可以切割任何经前面的检验的含有尿嘧啶的核酸。该材料是将导致沙门氏菌的假阳性检测的污染物。由于UNG含有胸腺嘧啶脱氧核苷而不含尿嘧啶，所以UNG不影响从细菌溶解物回收核酸。在培养之后，在高温下使从溶解物回收的核酸变性并使UNG失活。随着温度的降低，侵入基因特异引物和CataCleave探针杂交获得任何沙门氏菌种特异扩增子。在杂交之后，通过RNase H的作用可以切割CataCleave探针，RNase H切割RNA/DNA双链的RNA部分。一旦被切割，探针片段从它们目标分离出来，并扩散到反应缓冲液中。利用荧光供体和淬灭剂标记CataCleave探针，使得在完整的状态下，来自供体的荧光极大地减少。探针片段的扩散增大了供体和淬灭剂之间的距离，使得荧光不再减弱。可使用诸如Applied Biosystems 7500Fast Real-Time PCR System或BioradCFX96real-time PCR thermocycler的合适的设备实时检测供体荧光发射的增加结果。在探针片段从目标分离出来之后，另一CataCleave探针可在相同的位置杂交，并重复切割反应。由于单独的扩增子可用作用于切割多个CataCleave探针的模板，所以该循环工艺导致信号扩增。在该时间内，基因特异引物在核苷三磷酸的存在下通过DNA聚合酶延伸。一旦引物延伸到用于CataCleave探针结合的位点，则切割不再发生。在延伸之后，完成了扩增和检测的循环，扩增子的数量加倍。然后，这些新合成的扩增子在接下来的扩增/检测循环中用作模板。
图5示出了与SEQ ID NO：13的Catacleave探针结合的SEQ ID NO：3和4的引物对能够在40次或更少的扩增循环内检测沙门氏菌基因组DNA的信号复制。
参照图6，图6示出了用于检测沙门氏菌基因组DNA的1至106拷贝数的结合PCR/CataCleave探针化验的实施例。特异地用于具有SEQ ID NO：5和6的特异侵入基因的沙门氏菌种的部分的扩增的PCR引物与SEQ ID NO：14CataCleave探针结合，这可用于实时检测扩增子。
引物和探针位置34。
该位置扩增1492-1609，探针在1530-1551处结合(参照Inv基因序列U43273)。
引物：
5’-CATATG CTG GAC CAA CTG GA(SEQ ID NO：5)
5’-CGG AAA CAC GTT CGC TTAAT(SEQ ID NO：6)
探针：5’-/FAM/ATG TCT GAG rCrArCrU TCT TTA AGT/IaBlkFQ/(SEQID NO：14)
字母“r”表示探针中的RNA。供体为FAM，淬灭剂为Iowa Black FQ。
在包含热稳定RNase H、热稳定DNA聚合酶和尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG)的示例3中描述的合适的反应缓冲液中执行该反应。在反应循环过程中，首先在37℃培养样本使得尿嘧啶-N-糖基化酶可以切割任何经前面的检验含有尿嘧啶的核酸。该材料是将导致沙门氏菌的假阳性检测的污染物。由于UNG含有胸腺嘧啶脱氧核苷而不含尿嘧啶，所以UNG不影响从细菌溶解物回收核酸。在培养之后，在高温下使从溶解物回收的核酸变性并使UNG失活。随着温度的降低，侵入基因特异引物和CataCleave探针杂交获得任何沙门氏菌种特异扩增子。在杂交之后，通过RNase H的作用可以切割CataCleave探针，RNase H切割RNA/DNA双链的RNA部分。一旦被切割，探针片段从它们目标分离出来，并扩散到反应缓冲液中。利用荧光供体和淬灭剂标记CataCleave探针，使得在完整的状态下，来自供体的荧光极大地减少。探针片段的扩散增大了供体和淬灭剂之间的距离，使得荧光不再减弱。可使用诸如Applied Biosystems 7500Fast Real-Time PCR System或Biorad CFX96real-time PCR thermocycler的合适的设备实时检测供体荧光发射的增加结果。在探针片段从目标分离出来之后，另一CataCleave探针可在相同的位置杂交，并重复切割反应。由于单独的扩增子可用作用于切割多个CataCleave探针的模板，所以该循环工艺导致信号扩增。在该时间内，基因特异引物在核苷三磷酸的存在下通过DNA聚合酶延伸。一旦引物延伸到用于CataCleave探针结合的位点，则切割不再发生。在延伸之后，完成了扩增和检测的循环，扩增子的数量加倍。然后，这些新合成的扩增子在接下来的扩增/检测循环中用作模板。
图6示出了与SEQ ID NO：14的Catacleave探针结合的SEQ ID NO：5和6的引物对能够在40次或更少的扩增循环内检测沙门氏菌基因组DNA的信号复制。
示例
现在将通过下面的示例示出本发明，下面的示例将不以任何限制的方式进行考虑。
示例1：鲑鱼中乙型副伤寒沙门氏菌的富集
利用乙型副伤寒沙门氏菌以每300g四个菌落形成单元(CFU)的浓度接种鲑鱼。将沙门氏菌菌落接种到5mL的胰蛋白胨大豆肉汤中并在35℃利用摇动培养过夜。将培养菌稀释到1X磷酸盐缓冲液(PBS)中并在胰蛋白胨大豆琼脂上通过平板计数检测来确定沙门氏菌的浓度。称重鲑鱼片并利用在1XPBS中的稀释的乙型副伤寒沙门氏菌通过使用移液器将细菌均匀地分布在鱼片的表面上来接种鲑鱼片。将经处理的鲑鱼放在塑料袋中并用手按揉经处理的鲑鱼来使接种体分布均匀。将塑料袋密封并在4℃下培养48小时。
使用无菌刀将样本细分为多个25g部分并将这些部分放入到单独的塑料袋中。将每份样本悬浮在225mL的胰蛋白胨大豆肉汤中并使用匀质装置(Stomacher 400循环器)以250rpm使其匀质化。
示例2：在富集之后溶解乙型副伤寒沙门氏菌
将一部分沙门氏菌富集(5uL)稀释在45μL的pH为8.0的包含1mg/mL的蛋白酶K、0.3125mg/mL叠氮化钠、0.125％Triton X-100和12.5mM Tris-HCl的裂解溶液中。在55℃培养样本15分钟，然后在95℃维持10分钟以使蛋白酶K失活，然后冷却到4℃。
示例3：实时检测鲑鱼中的乙型副伤寒沙门氏菌
实时反应物包含2μL的溶解产物和23μL的PCR反应混合物。PCR反应混合物包含pH为7.8的32mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)-KOH、100mM醋酸甲、4mM醋酸镁、0.11％牛血清白蛋白、1％二甲亚砜、800μM沙门氏菌正向引物、800μM沙门氏菌反向引物、200μM沙门氏菌CataCleave探针、dUTP/NTP混合物(80μM dGTP、dCTP、dATP和160μM dUTP)、2.5单位Thermus aquaticus DNA聚合酶、1单位Pyrococcus furiosis RNase HII和0.1单位Uracil-N-Glycosylase。
沙门氏菌正向引物和沙门氏菌反向引物扩增包含在沙门氏菌侵入基因中的180个碱基对片段。
引物和探针的序列为：
沙门氏菌正向引物：5’-TCGTCATTCCATTACCTACC(SEQ ID NO：1)
沙门氏菌反向引物：5’-TACTGATCGATAATGCCAGACGAA(SEQ IDNO：2)。
沙门氏菌CataCleave探针：5’-/FAM/CGATCAGrGrArArATCAACCAG/IABFQ)(SEQ ID NO：7)，其中，小写字母“r”表示RNA碱基(即，rG为鸟嘌呤脱氧核糖核苷)。
缩写FAM为6-羧基荧光素；缩写IABHQ为来自Integrated DNATechnologies(Coralville，IA)的用于短波长发射的Iowa黑洞淬灭剂(Black HoleQuencher)。
在室温下混合反应物并使用下面的方案运行Roche Lightcycler 480：在37℃维持10分钟；在95℃维持10分钟；然后对扩增进行50次循环；在95℃维持15秒，在60℃维持20秒。
在60℃的步骤过程中监控FAM发射。得到的实时FAM信号在图3中被示出。结果示出了11个样本中的对乙型副伤寒沙门氏菌污染检测呈阳性的9个样本。阴性对照反应包含除溶解产物之外的全部反应组分，2μL水用于代替溶解产物。数据的MPN分析示出了检测灵敏度为0.75CFU/g。
示例4：实时PCR扩增反应的质量控制确认
将鼠伤寒沙门氏菌接种到胰蛋白胨大豆肉汤中并在35℃利用摇动培养过夜至最大细胞密度。将一部分富集物(5uL)稀释在45μL的pH为8.0的包含1mg/mL的蛋白酶K、0.3125mg/mL叠氮化钠、0.125％Triton X-100和12.5mM Tris-HCl的裂解溶液中。在55℃培养样本15分钟，然后在95℃维持10分钟以使蛋白酶K失活，然后冷却到4℃。
实时反应物包含2μL的溶解产物和23μL的PCR反应混合物。PCR反应混合物包含pH为7.8的32mM HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸)-KOH、100mM醋酸甲、4mM醋酸镁、0.11％牛血清白蛋白、1％二甲亚砜、800μM沙门氏菌正向引物、800μM沙门氏菌反向引物、200μM沙门氏菌CataCleave探针、200μM内部扩增对照CataCleave探针、15个拷贝数的内部扩增对照质粒、dUTP/NTP混合物(80μM dGTP、dCTP、dATP和160μM dUTP)、2.5单位Thermus aquaticus DNA聚合酶、1单位Pyrococcus furiosis RNase HII和0.1单位Uracil-N-Glycosylase。内部扩增对照是包含在沙门氏菌正向引物和反向引物的结合位点的侧面的随机的DNA序列。
引物和探针的序列为：
沙门氏菌正向引物：5’-TCGTCATTCCATTACCTACC(SEQ ID NO：1)
沙门氏菌反向引物：5’-TACTGATCGATAATGCCAGACGAA(SEQ IDNO：2)
沙门氏菌CataCleave探针：
5’-/FAM/CGATCAGrGrArArATCAACCAG/IABFQ/(SEQ ID NO：7)
沙门氏菌内部扩增对照正向引物：
5’-CTCGCGCGTAGATTGCCATGCGTAGAGC(SEQ ID NO：9)
沙门氏菌内部扩增对照反向引物：
5’-GTGAACCCACTTGCCTTTGCGTCTTAAT(SEQ ID NO：10)
沙门氏菌内部扩增对照探针：
5’-/TYE665/AGGTAACCrGrArArAACAAGCC-/IABFQ/(SEQ ID NO：11)
小写字母“r”表示RNA碱基(即，rG为鸟嘌呤脱氧核糖核苷)。
缩写FAM为6-羧基荧光素；缩写TYE 665为来自Integrated DNATechnologies(Coralvile，IA)的Cy5的变异体；缩写IABHQ为来自IntegratedDNA Technologies(Coralville，IA)的用于短波长发射的黑洞淬灭剂(BlackHole Quencher)；缩写LABRQ为来自Integrated DNA Technologies(Coralville，IA)的用于长波长发射的黑洞淬灭剂。
在室温下混合反应物并使用下面的循环方案运行Roche Lightcycler 480：在37℃维持10分钟；在95℃维持10分钟；然后对扩增进行50次循环；在95℃维持15秒，在60℃维持20秒。
在60℃的步骤过程中监控FAM和TYE 665(以Cy5途径)发射。得到的实时FAM(鼠伤寒沙门氏菌)信号和TYE 665(内部扩增对照)信号在图4a和图4b中被示出。结果显示可同时检测沙门氏菌和内部扩增对照，而在途径之间不产生串扰。在沙门氏菌存在下呈阳性的样本在FAM途径中显示反曲特征实时扩增信号。同时以CY5途径监控内部对照，该信号在内部扩增对照质粒存在下也呈阳性。该信息被用于验证反应混合物全部的组分在质量控制规范之内且以FAM途径获得的数据有用。
示例5：引物和探针(1)的相容性
通过下面与示例3的程序基本相同的程序，测验了全部116个标准沙门氏菌血清型以检测它们的目标核酸。
在本示例中，从马里兰健康与心理卫生部(Maryland Department of Healthand Mental Hygiene)得到六十(60)个沙门氏菌血清型，这些沙门氏菌血清型使用了与在示例3中所使用的引物/探针位置相同的引物/探针位置来进行用于检测的测验。对于该部分，将示例3的程序修改为：在45μl的裂解缓冲液(2％Triton-X、5mg/ml叠氮化钠和0.2M Tris，pH＝8；A.Abolmaaty，C.Vu，J.Oliver和R.E.Levin Microbios 101，181-1892000)中提取5ul测验细胞悬浮液，在95℃维持10分钟，并将2μl得到的溶解产物用作模板。全部的血清型被有效地检测到。结果在下面的表1中被示出。
表1
在表1中，每个单元的第一行是沙门氏菌菌株的名称(血清型)，第二行是菌株号或登录号，第三行是Cp。
示例6：引物和探针的相容性
通过下面与示例5的程序基本相同的程序，从马纳萨斯州(USA)的美国标准菌种保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)购得五十四(54)种沙门氏菌血清型，这些沙门氏菌血清型使用了与在示例3中所使用的引物/探针位置相同的引物/探针位置来进行用于检测的测验。全部的血清型被有效地检测到。该结果在下面的表2中示出。
表2
在表2中，每个单元的第一行是沙门氏菌菌株的名称(血清型)，第二行是菌株号和登录号，第三行是Cp。
示例7：食物样本的测验
通过下面与示例5的程序基本相同的程序，利用表3中的不同的沙门氏菌血清型接种各种食物样本。结果在下面的表3中示出。在表3中，应注意到，通过接种水平得到的阳性分数比被美国分析化学家组织(AOACInternational)(美国，马里兰州，蒙哥马利)认识是有效的。
表3
示例8：INVA基因引物对的对比
从下面的出版物中选择Inva基因引物：
HoorfarJ.等，J.Clin.Micro.38(2000)，pp.3429-3435
(1)Salmonella-F1：5′-TCG TCA TTC CAT TAC CTA CC (SEQ ID NO：1)
(2)Salmonella-R：5′-AAA CGT TGA AAA ACT GAG GA(SEQ ID NO：18)
Trafny EA等，Lett.Appl.Micro.43(2006)，pp.673-679.
(1)Sal-invF：5′-ACA GTG CTC GTT TAC GAC CTG AAT(SEQ ID NO：15)
(2)Sal-invR：5′-AGA CGG CTG GTA CTG ATC GAT AAT(SEQ ID NO：19)
Fey A.等.App.Env.Micro.70(2004)，pp.3618-3623.
(1)Sal-InvA2-F1：5′GAT TCT GGTACTAAT GGT GAT GAT C(SEQ ID NO：16)
(2)Sal-InvA2-R1：5′GCC AGG CTA TCG CCA ATA AC(SEQ ID NO：20)
(3)Sal-InvA2-F2：5′-GAT TCT GGT ACT AAT GGT GAT GAT CAT TTCT (SEQ ID NO：17)
(4)Sal-InvA2-R2：5′-GCC AGG CTA TCG CCA ATA ACG (SEQ ID NO：27)
对这些引物进行修饰来产生新的独特的引物：
(1)InvA-S1：5’TGA TTC TGG TAC TAA TGG TGA TG (SEQ ID NO：21)
(2)InvA-S2：5’CTA TGT TCG TCA TTC CAT TAC CTA C (SEQ ID NO：22)
(3)InvA-S3：5’CCG TGG TCC AGT TTATCG (SEQ ID NO：23)
(4)InvA-A1：5’AAC TGA GGA TTC TGT CAA TGT AG(SEQ ID NO：24)
(5)InvA-A2：5’AAA AAC TGA GGA TTC TGT CAA TGT AG(SEQ IDNO：25)
(6)InvA-A3：5’GGC ATC CGC ATC AATAATAC(SEQ ID NO：26)
(7)Sal-InvR2：5’TAC TGA TCG ATA ATG CCA GAC GAA(SEQ ID NO：2)
INVA基因候选引物：
在基质中筛选全部的15种引物以确定沙门氏菌检测灵敏度以及引物-二聚体(来自引物的扩增子也作为引物之间的模板)的产生。在分析之后，发现8对在不形成大量的引物二聚体的情况下能够检测10和1000之间的拷贝数的目标。这些对(pair)是引物号1-5、1-7、3-14、4-5、4-7、8-5、9-5和4-15。在图10中绘制了这些引物对中的一些引物对的代表数据。
结果显示与其它引物对相比，引物对4-15(对应于SEQ ID NO：1和2；粗黑线)表现出许多更优异的性能，在每个浓度处的Cp值在多次循环后低于使用其它引物对的相同浓度的对应值。
示例9：沙门氏菌INVA基因CATACLEAVE探针对比
合成了三种不同的探针并测验了它们的功效。
(1)Inv-CC-探针1：5’CTG GTT GArT rTrTrC CTG ATC G (SEQ ID NO：28)
(2)Inv-CC-探针2：5’CGA TCA GrGrA rArAT CAA CCA G (SEQ ID NO：30)
(3)Inv-CC-探针3：5’CAG TTT TTC rArArC rGTT TCC TGC(SEQ IDNO：29)
结果在图11(Inv-CC-探针1和2)和图12(Inv-CC-探针3)中示出。对比探针1、探针2和探针3，结果显示探针2在减小的Cp值和活性范围方面被证明具有更优异的性能。如图12中所示，探针3在检验中不能被切割。这些结果显示根据本申请实施例的Inv-CC-探针2显示出了比其它对比探针更优异的功效。
因此，通过引用将在说明书中指出的任何专利、专利申请、公布或其它公开材料全部并入本文。被称作通过引用并入本文但与现有的定义、表述或这里阐述的其它公开材料冲突的任何材料或其一部分仅在并入的材料和本公开材料之间不产生冲突的程度上被并入。
Claims (54)
1.一种实时检测样本中沙门氏菌的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供将要被检测的具有沙门氏菌invA基因目标DNA的样本；
b)提供扩增引物对，该引物对能够退火得到沙门氏菌invA基因目标DNA，其中，扩增引物对选自于由SEQ ID NO：1和2的引物对、SEQ ID NO：3和4的引物对和SEQ ID NO：5和6的引物对组成的组中；
c)提供包含能够检测的标记的探针及与沙门氏菌目标DNA基本上互补的DNA核酸序列和RNA核酸序列；
d)在扩增聚合酶活性、扩增缓冲液的存在下扩增第一扩增引物与第二扩增引物之间的PCR片段，RNAse H活性和探针以及在RNA序列在探针内的情况下，RNA序列能够与沙门氏菌目标DNA的PCR片段内的互补DNA序列形成RNA:DNA异源双链体；
e)检测来自探针上的所述标记的发射信号的实时增加，其中，信号的增加表示在样本中存在沙门氏菌目标DNA。
2.如权利要求1所述的方法，其中，来自探针上的所述标记的发射信号的实时增加由在探针与PCR片段的一条链之间形成的异源双链核酸分子的RNAse H切割产生。
3.如权利要求1所述的方法，其中，探针的DNA和RNA共价连接。
4.如权利要求1所述的方法，其中，探针上的能够检测的标记是荧光标记。
5.如权利要求1所述的方法，其中，探针用荧光共振能量转移对标记。
6.如权利要求1所述的方法，其中，扩增缓冲液还包含Tris醋酸。
7.如权利要求1所述的方法，其中，PCR片段连接到固体载体。
8.如权利要求1所述的方法，其中，扩增聚合酶活性是热稳定DNA聚合酶的活性。
9.如权利要求1所述的方法，其中，RNAse H活性是热稳定RNAse H的活性。
10.如权利要求1所述的方法，其中，RNAse H活性是热启动RNAse H活性。
11.如权利要求1所述的方法，其中，样本包括食物样本。
12.如权利要求1所述的方法，其中，样本包括表面刮拭样本。
13.如权利要求1所述的方法，其中，使用尿嘧啶-N-糖基化酶预处理样本中的核酸。
14.如权利要求13所述的方法，其中，在PCR扩增之前使尿嘧啶-N-糖基化酶失活。
15.如权利要求1所述的方法，其中，探针包含SEQ ID NO：7、13或14的序列。
16.一种实时检测样本中沙门氏菌的方法，该方法包括以下步骤：
a)提供将要被检测的具有沙门氏菌invA基因目标RNA的样本；
b)提供正向扩增引物和反向扩增引物的引物对，该引物对能够退火得到沙门氏菌invA目标核酸序列，其中，扩增引物对选自于由SEQ ID NO：1和2的引物对、SEQ ID NO：3和4的引物对和SEQ ID NO：5和6的引物对组成的组中；
c)提供包含能够检测标记的探针及与沙门氏菌目标RNA的cDNA基本上互补的DNA核酸序列和RNA核酸序列；
d)在反转录酶活性和反转录扩增引物的存在下反转录沙门氏菌invA目标RNA来产生目标cDNA序列；
e)在目标cDNA序列、扩增聚合酶活性和扩增缓冲液的存在下扩增正向扩增引物与反向扩增引物之间的PCR片段，RNAse H活性和探针以及在RNA序列在探针内的情况下，RNA序列能够与PCR片段内的互补序列形成RNA:DNA异源双链体；
f)检测来自探针上的所述标记的发射信号的实时增加，信号的增加表示在样本中存在沙门氏菌目标RNA。
17.如权利要求16所述的方法，其中，来自探针上的所述标记的发射信号的实时增加由在探针的RNA序列与沙门氏菌目标RNA的cDNA之间形成的RNA:DNA异源双链体的RNAse H切割产生。
18.如权利要求16所述的方法，其中，探针的DNA序列和RNA序列共价连接。
19.如权利要求16所述的方法，其中，探针上的可检测标记是荧光标记。
20.如权利要求16所述的方法，其中，探针用荧光共振能量转移对标记。
21.如权利要求16所述的方法，其中，扩增缓冲液还包含Tris醋酸。
22.如权利要求16所述的方法，其中，PCR片段连接到固体载体。
23.如权利要求16所述的方法，其中，扩增聚合酶活性是热稳定DNA聚合酶的活性。
24.如权利要求16所述的方法，其中，RNAse H活性是热稳定RNAse H的活性。
25.如权利要求16所述的方法，其中，RNAse H活性是热启动RNAse H活性。
26.如权利要求16所述的方法，其中，样本包括食物样本。
27.如权利要求16所述的方法，其中，样本包括表面刮拭样本。
28.如权利要求16所述的方法，其中，使用尿嘧啶-N-糖基化酶预处理样本中的核酸。
29.如权利要求28所述的方法，其中，在PCR扩增之前使尿嘧啶-N-糖基化酶失活。
30.如权利要求16所述的方法，其中，探针包含SEQ ID NO：7、13或14的序列。
31.一种用于实时检测样本中沙门氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)扩增引物对，该引物对可以退火得到沙门氏菌invA基因目标DNA序列，其中，扩增引物对选自于由SEQ ID NO：1和2的引物对、SEQ ID NO：3和4的引物对和SEQ ID NO：5和6的引物对组成的组中；
b)包含能够检测的标记的探针及与沙门氏菌目标DNA序列基本上互补的DNA核酸序列和RNA核酸序列；
c)扩增聚合酶活性；
d)RNAse H活性。
32.如权利要求31所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括阳性内部对照和阴性内部对照。
33.如权利要求31所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括尿嘧啶-N-糖基化酶。
34.如权利要求31所述的试剂盒，其中，探针的DNA序列和RNA序列共价连接。
35.如权利要求31所述的试剂盒，其中，其中，探针上的能够检测的标记是荧光标记。
36.如权利要求31所述的试剂盒，其中，探针用荧光共振能量转移对标记。
37.如权利要求31所述的试剂盒，其中，探针或PCR片段连接到固体载体。
38.如权利要求31所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括扩增缓冲液。
39.如权利要求31所述的试剂盒，其中，扩增聚合酶活性是热稳定DNA聚合酶的活性。
40.如权利要求31所述的试剂盒，其中，RNAse H活性是热稳定RNAseH的活性。
41.如权利要求31所述的试剂盒，其中，RNAse H活性是热启动RNAseH活性。
42.如权利要求31所述的试剂盒，其中，探针包含SEQ ID NO：7、13或14的序列。
43.一种用于实时检测样本中沙门氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括：
a)反转录酶活性，用于反转录目标沙门氏菌invA RNA序列以产生目标cDNA序列；
b)扩增引物对，该引物对能够退火得到目标cDNA序列，其中，扩增引物对选自于由SEQ ID NO：1和2的引物对、SEQ ID NO：3和4的引物对和SEQ ID NO：5和6的引物对组成的组中；
c)扩增活性，用于扩增引物对之间的目标cDNA序列的PCR扩增以产生沙门氏菌invA PCR片段；
d)包含能够检测的标记的探针及与PCR片段内的DNA序列基本上互补的DNA核酸序列和RNA核酸序列；
e)RNAse H活性。
44.如权利要求43所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括阳性内部对照和阴性内部对照。
45.如权利要求43所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括尿嘧啶-N-糖基化酶。
46.如权利要求43所述的试剂盒，其中，探针的DNA序列和RNA序列共价连接。
47.如权利要求43所述的试剂盒，其中，探针上的可检测标记是荧光标记。
48.如权利要求43所述的试剂盒，其中，探针用荧光共振能量转移对标记。
49.如权利要求43所述的试剂盒，其中，探针或PCR片段连接到固体载体。
50.如权利要求43所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括扩增缓冲液。
51.如权利要求43所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包括扩增聚合酶活性。
52.如权利要求43所述的试剂盒，其中，RNAse H活性是热稳定RNAseH的活性。
53.如权利要求43所述的试剂盒，其中，RNAse H活性是热启动RNAseH活性。
54.如权利要求43所述的试剂盒，其中，探针包含SEQ ID NO：7、13或14的序列。
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