KR20150005511A - 개선된 dna 중합효소 활성 분석 및 생육성 미생물의 검출을 가능하게 하는 방법 - Google Patents

개선된 dna 중합효소 활성 분석 및 생육성 미생물의 검출을 가능하게 하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20150005511A
KR20150005511A KR1020147021867A KR20147021867A KR20150005511A KR 20150005511 A KR20150005511 A KR 20150005511A KR 1020147021867 A KR1020147021867 A KR 1020147021867A KR 20147021867 A KR20147021867 A KR 20147021867A KR 20150005511 A KR20150005511 A KR 20150005511A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
dna polymerase
activity
assay
sample
pcr
Prior art date
Application number
KR1020147021867A
Other languages
English (en)
Inventor
숀 마크 오하라
다니엘 스바이칙
Original Assignee
제우스 사이언티픽, 아이엔씨.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제우스 사이언티픽, 아이엔씨. filed Critical 제우스 사이언티픽, 아이엔씨.
Publication of KR20150005511A publication Critical patent/KR20150005511A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
    • C12Q2521/101—DNA polymerase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/91—Transferases (2.)
    • G01N2333/912—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general
    • G01N2333/91245—Nucleotidyltransferases (2.7.7)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

활성 DNA 중합효소를 함유하는 샘플 바탕질 안에서 미생물의 존재 또는 양의 검출을 위한 진단 분석을 수행하는 방법이 개시된다. 이 방법은 DNA 중합효소 연장 활성의 측정을 활용하며, 여기서 상기 분석은 샘플 바탕질 안의 DNA 중합효소를 선택된 적합한 기질과 함께 인큐베이션하는 단계, 및 선택된 적합한 핵산 프로브를 통해 PCR 사이클링 및 검출을 수행하는 단계를 포함하며, 이로써 상기 미생물의 존재 또는 양의 표시로서 샘플 바탕질 안의 내인성 DNA 중합효소 연장 활성을 검출할 수 있다.

Description

개선된 DNA 중합효소 활성 분석 및 생육성 미생물의 검출을 가능하게 하는 방법{Improved DNA Polymerase Activity Assays and Methods Enabling Detection of Viable Microbes}
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 정규 출원으로서, 본원에 참고자료로 포함하는 2012년 1월 5일자 제출된 미국 가 출원 제61/583,568호의 우선권을 주장한다.
본 부문과 본 명세서를 통틀어서 사용된 참조 번호들은 본원에서 "참고자료" 부문에 제시된 문헌들을 말한다.
DNA 중합효소 활성은 모든 생물학적 영역에 걸쳐서 게놈 복제 및 유기체 증식에 필수 불가결하다(1-3). 그것의 초기 특성화(4) 이래로 DNA 중합효소 활성을 시험관내 이용하는 능력은 분자생물학 연구 분야에서 기초 도구가 되었다(5). 연구에서의 확립된 중요성을 훨씬 초월해서 DNA 중합효소의 시험관내 측정은 잠재적으로 제약 및 임상 환경 안에서 수많은 유용한 용도를 제공한다. 예를 들어, 박테리아 DNA 중합효소는 새로운 항균제의 개발에서 활발히 표적화되고 있기 때문에(6, 7) DNA 중합효소 활성을 측정할 수 있는 신속하며 민감한 분석이 바람직하다. 또한, DNA 중합효소 활성의 손실 또는 획득은 사람의 질환에 긴밀히 연루된다. 예를 들어, DNA 중합효소 활성과 유전자 이상 사이에 대두되고 있는 관계성은 이 효소를 항암 요법에 대한 표적으로서 지정한다(8, 9). DNA 중합효소의 결핍은 또한 미토콘드리아성 장애와 관계되었다(10). 또한, DNA 중합효소 활성의 측정은 무균성이 기대되는 주어진 환경이나 생물학적 바탕질 안에서 활성 DNA 중합효소를 은닉한 어떤 유기체를 실질적으로 검출할 수 있는 신속하며 민감한 진단 도구로서 사용될 수 있는 가능성을 가진다.
DNA 중합효소 활성을 시험관내 측정하는데 사용되는 가장 흔한 방법은 방사성 표지된 뉴클레오티드의 통합에 의존한다(11). 그러나, 이러한 DNA 중합효소 분석의 관례적 사용은 방사성 동위원소와 관련된 고유한 위험 및 제한으로 인하여 바람직하지 않다. 결과적으로, 지난 수십년에 걸쳐서 수많은 비-방사성 활성 시험관내 중합효소 분석이 개발되었다. 일부는 단일가닥 결합 단백질의 DNA 중합효소-매개 방출에 의해 발생된 형광(12)이나 PicoGreen™과 이중가닥 DNA의 결합(13, 14)의 측정에 의존한다. 다른 방법들은 형광-표지된 뉴클레오티드의 마이크로플레이트 결합 및 검출에 의존한다(15). 더 최근에는, 분자 비콘-기반(16) 및 전기화학-기반(17) DNA 중합효소 분석이 개발되었다. 방사성 활성의 사용은 성공적으로 피했지만 상기 분석들은 불량한 감도, 작은 선형 동적 측정 범위, 또는 정제된 중합효소의 사용과 같은 요인들에 의해서 제한된다.
당업자에게 자명한 대로, 본원에 설명된 본 발명에 따른 DNA 중합효소 연장 활성의 측정은, 제한은 아니지만, 후보-중합효소 저해제의 시험관내 스크리닝, 또는 광범위한 샘플 타입 안에서 존재하는 어떤 미생물(활성 DNA 중합효소를 은닉한)의 검출과 같은 광범위한 용도를 가진 유용한 도구이다. 이런 목적들을 의도할 때 방사성 표지된 뉴클레오티드를 통합하는 종래의 중합효소 분석의 관례적 사용은 매력적이지 않기 때문에 이것은 최신 기술을 능가하는 실질적인 개선이 된다. 결과적으로, 수많은 비-방사성 활성 DNA 중합효소 연장 분석이 최근 수십년 동안 개발되었다. 방사성 활성의 사용은 성공적으로 피했지만 현재 형광-기반 DNA 중합효소 분석도 역시 다양한 결함을 겪는다. 예를 들어, 몇 가지 기존의 비-방사성 활성 분석을 통한 DNA 중합효소 활성의 검출은 PicoGreen™과 새로-생성된 이중가닥 DNA의 결합에 의존한다(13, 14). 신선하게 세포용해된 유기체로부터 DNA 중합효소 활성을 분석하고자 할 때 PicoGreen™-기반 분석은 PicoGreen™와 게놈 DNA의 결합을 통한 바탕 형광에 의해서 방해받기 쉽다.
마이크로플레이트-기반 DNA 중합효소 분석이 또한 개발되었다(15). 생성물 또는 기질과 마이크로플레이트의 중간 결합 및/또는 변형된 dNTP의 DNA 중합효소에 의한 비효과적인 통합을 포함하는 수많은 이유로 인하여 마이크로플레이트-기반 분석의 감도 저하가 예상될 수 있다.
더 최근에는, 분자 비콘을 통한 DNA 중합효소 활성의 실시간 측정이 설명되었다(16).
개선된 감도에도 불구하고 분자 비콘 형광의 직접 측정도 역시 조 세포 세포용해물에의 노출에 의해서 잠재적으로 방해받을 수 있었다.
본 발명은 상기 설명된 대로 배경기술의 기술을 개선하며, 정제된 효소로부터 또는 조 미생물 세포용해물을 포함하는 미생물 세포용해물로부터 직접 DNA 중합효소 연장 활성을 측정할 수 있는 신속하고 매우 민감하며 정량적인 분석을 제공한다. 본원에 설명된 대로 본 발명은 주어진 샘플 바탕질 안에서 활성 DNA 중합효소를 함유하는 잠재적인 어떤 미생물의 민감한 검출을 향한 유의하며 예상치 않은 진전을 제공한다. 본 발명은 효소 주형 생성과 증폭(ETGA)을 위한 방법을 포함한다. 따라서, 본원에서 정량적 PCR 정보와 결합된 DNA 중합효소 연장 활성의 측정에 기초한 새로운 ETGA 방법의 최초 특성화가 설명된다. 본원 명세서의 나머지 부분에서 본 발명에 의해서 제공된 이런 타입의 진단 분석은 DPE-PCR로 언급된다. 본 발명의 DPE-PCR 분석은 낮은 수준의 정제된 효소를 검출하는데 사용될 수 있고, 미생물 세포 세포용해물로부터 직접 내인성 DNA 중합효소 연장 활성을 검출할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 바람직한 DPE-PCR 진단 분석의 도식적 개요로서, (단계 A) DNA 중합효소가 미리-아닐링된 올리고-1 및 올리고-2로 구성된 기질과 함께 인큐베이션된다. (단계 B) 37℃에서 20분 인큐베이션하는 동안 DNA 중합효소는 올리고-1의 3' 단부만을 연장시킨다. (단계 C) 이어서, 반응 혼합물 3μL를 우라실 DNA 글리코실라아제(UDG)를 함유한 핫 스타트 qPCR 반응에 넣는다. Taq의 활성화 전 UDG는 올리고-2 안에서 데옥시우리딘을 분해하여 올리고-1의 중합효소-매개 연장으로부터 유래된 단일가닥 생성물만을 남긴다. (단계 D) Taq의 활성화 후 올리고-1 연장 생성물에 프라이머 결합을 통해 증폭이 개시된다. (단계 E) Taqman 프로브를 통한 PCR 사이클링 및 검출.
도 2는 본 발명의 바람직한 구체예에 따른 DPE-PCR을 사용한 정제된 DNA 중합효소의 민감한 검출의 도식적 표현으로서, (A) DNA 중합효소 I의 상업적 공급원이 반응당 2x10-5 유닛(U)에서 시작하여 2x10-11U까지 10배 증감량으로 2번 중복 분석되었다. 대표 DPE-PCR 곡선이 각 중합효소 투입 수준과 투입 없는 대조군(NIC)에 대해 도시된다. (B) 2번의 독립적 실험으로부터 취해진, 중합효소 투입 수준당 n=4 데이터 포인트로부터 플롯이 구성되었고, 선형 회귀 분석이 수행되었다. (C) DNA 중합효소 I, Klenow, Klenow(exo-) 및 E. coli DNA 리가아제를 2x10-7U 함유하는 3번 중복 반응물이 NIC와 비교 분석되었다. 대표 DPE-PCR 곡선이 분석된 효소들 및 NIC 각각에 대해 제시된다. (D) dCTP 또는 ddCTP와 함께 dNTP 혼합물을 함유하는 반응물에서 DPE-PCR 신호가 비교되었고, DNA 기질 안에 dCTP 또는 ddCTP 통합을 위한 이용가능한 부위의 도식적 표현이 DPE-PCR 곡선 옆에 제시된다.
도 3은 본 발명의 바람직한 구체예에 따른 비드 세포용해와 DPE-PCR의 결합에 대한 도식적 개요이다.
도 4는 본 발명에 따른 DPE-PCR의 수행이 조 세포용해물에서 DNA 중합효소 연장 활성의 측정을 통해 그람 음성 및 그람 양성 박테리아의 민감하며 정량적인 검출을 어떻게 가능하게 하는지를 나타낸 그래프로서, (A) E. coli cfu가 양을 감소시키면서 비드 세포용해-결합 DPE-PCR에 스파이크되었다. 시약 바탕 수준을 모니터하기 위해 투입 없는 대조군(NIC)이 또한 포함되었다. 모든 cfu 스파이크 및 NIC는 3번 중복 수행되었다. 대표 DPE-PCR 곡선이 박테리아 투입의 각 수준에 대해 아래에 도시된다. 각 반응에 넣은 실제 cfu의 더 나은 추정값을 얻기 위한 노력으로서 콜로니 계수 평판 및 gsPCR이 수행되었고, 도 3에 추가로 제시된다. (B) E. coli DNA 중합효소 활성 및 선형 회귀 분석의 플롯이 제시된다. 그래프는 1x105 - 1x101 투입 cfu 범위에서 박테리아 스파이크의 3번 중복 반응으로부터 얻어진 평균 Ct 값을 사용하여 생성되었다. (C 및 D) cfu 적정 실험이 E. coli에 대해 상기 설명된 대로 정확하게 S. aureus에 대해 수행되었다. 각 반응에 넣은 실제 cfu의 더 나은 추정값을 얻기 위한 노력으로서 콜로니 계수 평판 및 gsPCR이 수행되었다.
도 5는 본 발명의 다른 바람직한 구체예에 따른 DPE-PCR에 의한 박테리아의 검출을 나타낸 그래프를 도시하며, (A) E. coli 현탁액 5μL가 50μM dCTP 또는 50μM ddCTP를 함유하는 dNTP 믹스로 이루어진 비드 세포용해-결합 DNA 중합효소 분석에 첨가되었다. E. coli-유래 DNA 중합효소 활성을 나타낸 DPE-PCR 곡선이 제시된다. 평판에 의해 결정된 대략적인 cfu 투입이 qPCR 그래프의 상부 왼쪽 영역에 제시된다. E. coli 현탁액 5μL가 50μM dCTP 또는 50μM ddCTP를 가진 dNTP 믹스로 이루어진 50μL 반응 버퍼를 함유하는 비드 세포용해 튜브에 첨가되었다. 세포용해 전 dCTP 1μL[2.5mM, 0.25mM, 0.025mM, 0.0025mM]가 선택된 ddCTP-함유 반응물에 첨가되었다. dCTP만 또는 ddCTP만 함유하는 반응물이 "비종결" 및 "종결" 비교제로서 병행 전개되었다. E.coli-유래 DNA 중합효소 활성을 나타낸 결과의 DPE-PCR 곡선이 제시된다. 평판에 의해 결정된 대략적인 cfu 투입이 qPCR 그래프의 상부 왼쪽 영역에 제시된다. (C) E. coli 유전자 특이적 PCR이 도 2B에 제시된 DNA 중합효소 검출에서 사용된 동일한 세포용해물에 대해 또한 수행되었다. 게놈 DNA의 gsPCR에 대한 박테리아 DNA 중합효소 검출의 dCTP-의존성 구제의 선형 플롯이 도시된다. 플롯은 나타낸 조건에서 3번 중복 반응으로부터의 평균 qPCR Ct 값을 사용하여 생성되었다. (D-F) ddCTP 종결 및 dCTP 구제 실험이 E. coli에 대해 상기 설명된 대로 정확하게 S. aureus에 대해 수행되었다.
도 6은 DPE-PCR이 열처리에 대한 반응에서 E. coli 생육성의 지시제인 본 발명의 다른 구체예를 예시한 그래프로서, (A) E. coli 현탁액(~2000 cfu/μL)의 200μL 알리쿼트들이 20분 동안 25℃, 45℃, 65℃, 85℃ 및 105℃에서 인큐베이션되었다. 가열 후 각 박테리아 스톡은 실온으로 냉각되었고, 5μL가 비드 세포용해-결합 DPE-PCR 분석에 전달되었다. 나타낸 온도에서 각각 처리 후 E. coli-유래 DNA 중합효소 활성을 나타낸 DPE-PCR 곡선이 제시된다. (B) 플롯은 E. coli 현탁액의 나타낸 온도 처리 후 3번 중복 DPE-PCR 반응 및 게놈 DNA(동일한 세포용해물로부터)의 gsPCR로부터 생성되었다. 각각의 처리된 E. coli 현탁액에 대해서 또한 평판이 병행하여 3번 중복 수행되었다. 대표 cfu 모니터링 플레이트가 그래프 아래에 제시되며, 이것은 각 온도에서 처리 후 박테리아 생육성 상태를 드러낸다. (C) DPE-PCR이 다양한 온도 처리에 대한 반응에서 게놈 DNA의 gsPCR과 비교된다. "qPCR 신호의 배수 감소"가 나타낸 등식을 사용하여 계산되었고, 얻어진 값들은 비교 막대 그래프를 생성하는데 사용되었다.
도 7은 DPE-PCR이 열처리에 대한 반응에서 S. aureus 생육성의 지시제인 본 발명의 다른 구체예를 예시한 그래프로서, (A) S. aureus 현탁액(~2000 cfu/μL)의 200μL 알리쿼트들이 20분 동안 25℃, 45℃, 65℃, 85℃ 및 105℃에서 인큐베이션되었다. 가열 후 각 박테리아 스톡은 실온으로 냉각되었고, 5μL가 비드 세포용해-결합 DPE-PCR 분석에 전달되었다. 나타낸 온도에서 각각 처리 후 S. aureus-유래 DNA 중합효소 활성을 나타낸 DPE-PCR 곡선이 제시된다. (B) 플롯은 S. aureus 현탁액의 나타낸 온도 처리 후 3번 중복 DPE-PCR 반응 및 게놈 DNA(동일한 세포용해물로부터)의 gsPCR로부터 생성되었다. 각각의 처리된 에스아우레우스 현탁액에 대해서 또한 평판이 병행하여 3번 중복 수행되었다. 대표 cfu 모니터링 플레이트가 그래프 아래에 제시되며, 이것은 각 온도에서 처리 후 박테리아 생육성 상태를 드러낸다. (C) DPE-PCR이 다양한 온도 처리에 대한 반응에서 게놈 DNA의 gsPCR과 비교된다. "qPCR 신호의 배수 감소"가 나타낸 등식을 사용하여 계산되었고, 얻어진 값들은 비교 막대 그래프를 생성하는데 사용되었다.
도 8은 본원에서 언급된 표 1을 제시하며, 본 발명의 교시에 따른 17개의 추가의 임상적으로 관련된 미생물 종들의 민감한 선형 검출을 보여주는 결과가 제시된다.
지난 50년 동안 DNA 중합효소 활성의 시험관내 측정은 필수적인 분자생물학 도구가 되었다. DNA 중합효소 활성을 시험관내 측정하는데 사용된 종래의 방법들은 방사성 뉴클레오티드의 이용으로 인하여 바람직하지 않다. 형광-기반 DNA 중합효소 분석이 개발되었지만, 이들도 역시 다양한 제한을 겪는다. 정제된 효소로부터 또는 미생물 세포용해물로부터 직접 DNA 중합효소 연장 활성을 측정할 수 있는 신속하고 매우 민감하며 정량적인 분석이 본원에 개시된다. 정제된 DNA 중합효소로 시험되었을 때 이 분석은 뛰어난 선형성(R2=0.992)을 나타내면서 2x10-11U만큼 적은 효소(~50분자)를 검출할 수 있는 것으로 판명되었다. 이 분석은 또한 R2=0.992를 유지하면서 비드 밀 세포용해와 결합되었을 때 투입된 그람 양성 또는 그람 음성 박테리아의 적어도 10 콜로니 형성 단위까지 내인성 DNA 중합효소 연장 활성을 검출할 수 있었다. 또한, 본원에 제시된 실험적 증거는 DNA 중합효소 연장 활성이 박테리아 생육성의 지시제임을 제시하며, 이것은 분석 신호와 박테리아 콜로니 형성 사이의 재현가능한 강한 일치에 의해서 증명되었다. 이와 함께, 본원에 설명된 본 발명의 새로운 방법은 주어진 샘플 바탕질 안에서 활성 DNA 중합효소를 함유하는 잠재적인 어떤 미생물의 민감한 검출을 향한 유의한 진전을 나타낸다.
전술한 개념과 본 발명의 이점을 더 예시하기 위하여 다음의 실시예가 본 발명의 예시로서 제공되며, 이들은 어떤 식으로든 본 발명의 제한으로서 해석되어서는 안 된다.
실시예
재료 및 방법:
DNA 기질 준비
DNA 기질(및 아래 제시된 qPCR 프라이머)의 서열을 T4 DNA 리가아제를 통해 박테리아-유래 ATP를 측정하는데 이미 사용된 DNA 올리고(18)로부터 개조했다. 간단히 말해서, 올리고 1과 올리고 2(도 1 참조)를 미리-아닐링하고, 0.01μM의 작업 농도로 희석했다.
상업용 중합효소를 사용한 DNA 중합효소 활성 반응
트리스 EDTA(T.E.) pH 8.0 중에 나타낸 U/μL 스톡으로 DNA Pol I(NEB cat# M0209L), Klenow(NEB cat# M0210S) 및 Klenow exo(-)(NEB cat# M0212S)를 희석했다. 시작하기 전 각 농도의 DNA 중합효소 스톡 2μL를 다음 성분들: 50μM dNTP, 20mM 트리스 pH 8.0, 10mM 황산암모늄, 10mM 염화칼륨, 2mM 황산마그네슘, 1% BSA, 0.1% 트리톤, 0.1% 트윈 및 0.001μM 미리-아닐링된 DNA 기질을 함유하는 50μL 중합효소 분석 혼합물에 넣었다. 반응물을 간단히 휘젓고 20분 동안 37℃에 두었다. 20분 후 각 반응물 3μL 바로 정량 PCR(qPCR) 반응에 넣었다.
qPCR에 의한 검출
다음 성분들: LightCycler 480 마스터 믹스(Roche cat# 04707494001), 각 프라이머 333nM, 166nM 표적 프로브(FAM), 166nM 내부 대조군 프로브(TxRed) 및 1.2U UDG(Bioline cat# BIO-20744)를 사용하여 qPCR 반응 마스터 믹스를 준비했다. PCR 저해를 모니터하기 위한 도구로서 각 qPCR 반응은 또한 경쟁 내부 대조군 DNA를 40 카피 포함했다. 각 qPCR 반응에서 3μL DNA 중합효소 반응물을 27μL 마스터 믹스에 첨가하고, SmartCycler(Cepheid, 캘리포니아 서니베일)에서 두 단계 qPCR을 다음과 같이 전개시켰다: 10분간 40℃ 및 10분간 50℃ 및 5분간 95℃에서 초기 인큐베이션(Taq를 활성화하기 위해서), 이후 95℃에서 5초 변성 및 65℃에서 20초 아닐링/연장 45 사이클. SmartCycler 소프트웨어에 의해 출현한 qPCR 곡선의 2차 유도 분석을 사용하여 사이클 역치(Ct) 값을 자동으로 생성했다.
박테리아 균주 및 배지
스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(ATCC 25923)와 에스체리키아 콜리(Escherichia coli)(ATCC 25922)를 이 연구에서 사용했다. 배양물을 브레인-하트 주입 액체 배지/아가(Teknova.) 내에서/위에서 성장시켰다. 시험된 추가의 17개 ATCC 참조 번호와 성장 배지는 도 5에 열거된다.
비드 밀 세포용해 후 박테리아 DNA 중합효소 활성의 검출
S. aureus 및 E. coli 배양물을 1.0±0.2의 OD600까지 성장시켰다(대략 1x109 cfu/mL). 각 유기체에 대해, 배양물 1mL를 펠릿화하고, T.E.로 3번 세척했다. 박테리아 현탁액을 T.E.로 연속 희석하고, 각 스톡 5μL를 세포용해-반응 버퍼 50μL를 함유하는 비드 세포용해-반응물에 첨가했다. 1x105 내지 1x100 cfu/반응의 적정 곡선을 박테리아 현탁액이 없는 3번 중복 반응물(투입 없는 대조군)을 포함하여 각 유기체에 대해서 3번 중복 수행했다. 5개 박테리아 스톡(또는 투입 없는 대조군)의 첨가 후, 세포용해/반응물 튜브를 2800rpm에서 6분 동안 비드 밀 작업하고, 이어서 20분 동안 37℃에서 인큐베이션했다. 20분 인큐베이션 후, 샘플을 5분 동안 95℃까지 가열하고 꺼내어 실온으로 냉각했다. 다음에, 샘플을 30초 동안 12k x g에서 회전시키고, 각 반응물 3μL를 qPCR에 넣었다. 각 박테리아 스톡 5μL를 평판하여 더 정확한 cfu 투입 수준을 얻었다. 또한, DNA 중합효소 검출에서 사용된 동일한 세포용해물에 대해 유기체-특이적 PCR을 수행했다. S. aureus 및 E. coli 유전자 특이적 PCR을 위한 프라이머 및 프로브 서열이 도 2에 열거된다.
디데옥시 종결 실험
ddCTP에 의한 정제된 DNA 중합효소 연장 활성의 종결:
50μM dCTP 또는 50μM ddCTP(Affymetrix #77332.)를 함유하는 dNTP 믹스를 사용하여 DNA 중합효소 분석 반응물을 상기 설명된 대로 준비했다. 어느 한 dNTP 믹스를 함유하는 반응물을 2x10-9U의 DNA 중합효소 I(New England Biolabs # M0209)로 스파이크했다. 반응물을 20분 동안 37℃에서 인큐베이션하고, 이어서 각 반응물 3μL를 qPCR에 넣었다.
ddCTP를 통한 미생물 검출의 제거:
S. aureus 및 E. coli 배양물을 상기 설명된 대로 성장, 세척 및 희석했다. 미생물 DNA 중합효소의 ddCTP-의존성 종결을 증명하기 위해서, 박테리아 스톡 5μL를 50μM dCTP 또는 50μM ddCTP와 함께 반응 버퍼 50μL를 함유하는 비드 세포용해 튜브에 첨가했다. 세포용해, 인큐베이션, 및 qPCR을 상기 설명된 대로 수행했다. 더 정확한 cfu 투입 수준을 결정하기 위해서 각 박테리아 스톡 5μL를 평판했다. 또한, DNA 중합효소 검출에서 사용된 동일한 세포용해물에 대해 게놈 DNA의 유전자 특이적 PCR을 수행했다.
미생물 검출의 dCTP 구제:
S. aureus 및 E. coli 배양물을 상기 설명된 대로 성장, 세척 및 희석했다. 박테리아 스톡 5μL를 50μM ddCTP와 함께 반응 버퍼 50μL를 함유하는 비드 세포용해 튜브에 첨가했다. 세포용해 전, 2.5mM, 0.25mM, 0.025mM, 0.0025mM의 dCTP 1μL를 ddCTP-함유 반응물에 첨가했다. 50μM dCTP만 및 ddCTP만 함유하는 반응물을 "비-종결" 및 "종결" 비교제로서 병행 전개시켰다. 세포용해, 인큐베이션, 및 qPCR을 상기 설명된 대로 수행했다. 더 정확한 cfu 투입 수준을 결정하기 위해서 각 박테리아 스톡 5μL를 평판했다. 또한, DNA 중합효소 검출에서 사용된 동일한 세포용해물에 대해 유전자-특이적 PCR을 수행했다.
생육성 평가 실험
S. aureus 및 E. coli 배양물을 상기 설명된 대로 성장, 세척 및 희석했다. 대략 2000 cfu/μL(T.E.중의)의 박테리아 스톡 200μL를 20분 동안 25℃, 45℃, 65℃, 85℃ 및 105℃에서 인큐베이션했다. 가열 후, 샘플을 실온으로 냉각하고, 각 박테리아 스톡 5μL를 반응 버퍼 50μL를 함유하는 비드 세포용해 튜브에 첨가했다. 세포용해, 인큐베이션, 및 qPCR을 상기 설명된 대로 수행했다. 또한, 각 박테리아 스톡(다양한 온도에서 처리된) 5μL를 T.E. 1mL에 첨가하고, 콜로니 수 결정을 위해서 50μL를 평판했다. 또한, DNA 중합효소 검출에서 사용된 동일한 세포용해물에 대해 유전자-특이적 PCR을 수행했다.
결과 및 고찰
본 발명의 개발에서, 본 발명은 정제된 상업용 공급원 또는 신선하게 세포용해된 세포로부터 유래된 DNA 중합효소 연장 활성을 측정할 수 있는 신속하고 간단하며 매우 민감하고 정량적인 분석을 개발하도록 설정되었으며, 이것은 공지된 기술의 앞에서 설명된 방법의 단점을 개선하며 능가한다. 도 1은 DNA 중합효소 연장 활성과 qPCR을 결합하는데 연루된 메커니즘의 도식적 개요를 도시힌다. 주목할 점은 올리고 2(도 1 참조, 단계 C)가 우라실 DNA 글리코실라아제(UDG)에 의해서 Taq 활성화 전에 제거되며, 이로써 PCR 사이클링 직전에 기질의 비-특이적 연장이 방지된다는 것이다. T4 DNA 리가아제 활성과 PCR 증폭을 관계시키는 미생물 검출 방법은 이미 보고되었는데(18), 이것은 우리의 DPE-PCR 분석과의 유사성들을 함유하며, ETGA 방법의 다른 예이다. 그러나, 본 발명의 개발 동안, NAD-의존성 DNA 리가아제 활성의 검출을 목표로 한 이 방법의 변형된 버전은 다양한 제한(미공개 데이터)을 겪었으며, 이것은 본원에 설명된 본 발명의 새로운 DNA 중합효소-기반 접근법의 개발을 초래했다.
정제된 DNA 중합효소 연장 활성의 민감하며 선형인 검출
상업적으로 이용가능한 DNA 중합효소 I를 사용하여 DPE-PCR 분석의 대략적인 분석 감도를 결정하기 위한 실험이 수행되었다. 도 2A에 도시된 대로, DNA 중합효소 I의 검출은 광범위한 투입 효소에 걸쳐서 달성되었다. 실제로 DNA 중합효소 I 연장 활성의 측정은 2x10-11 유닛(U)만큼 적은 효소에서도 달성된다(중합효소의 대략 50분자와 동등함). 우리가 알기로 이 수준에서 DNA 중합효소 연장 활성의 검출은 기존 DNA 중합효소 분석에서는 경쟁자가 없다. E. coli는 세포당 대략 400 DNA 중합효소 I 분자를 함유하는 것으로 보고되었으므로(11) 이론상 이 수준의 감도는 단일 미생물 검출을 가능하게 할 수 있다. 검출 실험에서 두 독립적 한계로부터의 데이터를 그래프로 작성한 후 회귀 분석도 또한 DPE-PCR 사이클 역치(Ct) 값과 투입된 상업용 DNA 중합효소 I의 유닛 사이에 강한 양성 선형 상관성(R2=0.992)을 나타냈다(도 2B). 감도 및 선형성 실험이 수행된 후에는 DPE-PCR 분석 신호가 고유한 엑소뉴클레아제 활성에 독립적인지의 여부를 결정하는 것이 중요했다. 이를 위해서, 우리는 계속해서 2x10-7U의 DNA 중합효소 I에 의해서 생성된 신호와 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성을 결여한 DNA 중합효소 I(Klenow) 및 모든 엑소뉴클레아제 활성을 결여한 다른 버전의 효소(Klenow exo-)로부터 생성된 신호를 비교했다. 추가적으로 특이성 및 바탕 신호 결정을 위해서 2x10-7U의 E. coli DNA 리가아제와 투입 없는 대조군(NIC)가 병행 시험되었다. 도 2C에 도시된 대로, 야생형 DNA 중합효소 I와 비교했을 때 Klenow와 Klenow exo-는 모두 유사한 수준에서 검출되었는데, 이는 DPE-PCR 분석 신호가 고유 엑소뉴클레아제 활성이 아니라 DNA 중합효소-의존성 연장으로부터 유래된다는 증거를 제공한다. 엑소뉴클레아제가 없는 중합효소를 사용한 것에 더하여, 우리는 DPE-PCR 분석 신호가 qPCR 전에 DNA 기질의 DNA 중합효소-의존성 연장으로부터 유래된다는 것을 더 증명하기 위한 셋업을 했다. 디데옥시 뉴클레오티드의 통합이 DNA 중합효소 사슬 연장 활성의 종결에 사용되는 잘 확립된 방법이므로(19, 20), 우리의 반응 믹스에서 dCTP를 디데옥시CTP(ddCTP)로 치환하는 것을 선택했다. 도 2D에 도시된 도해는 ddCTP가 DNA 중합효소에 의해 통합될 수 있는 기질 안의 첫 번째 가능한 위치를 드러낸다. ddCTP가 이 위치에 통합된다면, 올리고 1의 연장 생성물은 qPCR 프라이머 1에 의한 후속 검출에 있어서 길이가 불충분할 것이다(도 1). 도 2D에 도시된 대로, dCTP의 ddCTP로의 치환은 DNA 중합효소 I에 의해서 생성된 신호를 제거하며, 따라서 DPE-PCR 분석 신호가 qPCR 전에 기질의 DNA 중합효소 연장에 의존한다는 것을 증명한다. 저 카피 내부 증폭 대조군의 존재는 DNA 중합효소 분석 시약으로부터 전달된 적은 양의 ddCTP의 존재에 의해 qPCR이 억제되지 않았다는 것을 확인한다(도 1C 추가). 이에 더하여, 우리는 투입-DNA 중합효소의 부재하에(투입 없는 대조군) 약하지만 검출가능한 신호를 돌발적으로 관찰했던 것에 주목하는 것이 중요하다고 느꼈다. DPE-PCR 분석의 강력한 감도로 인해서 우리는, 제한은 아니지만 반응 조립 전 시약에 존재하는 DNA 중합효소 오염, 실험 셋업 동안 작업자에 의해서 도입된 DNA 중합효소 및/또는 Taq의 활성화 전에 올리고 2의 불완전한 변성(도 1)과 같은 몇 가지 가능한 출처로부터 약한 바탕 노이즈 신호가 유래될 수 있다는 것을 증명했다(미공개 데이터). 주목할 점은 바탕 노이즈의 이런 불규칙한 출처가 더 엄격한 시약 준비 과정과 우수한 무균 기술을 도입함으로써 제어될 수 있다는 것이다.
세포 세포용해물로부터 직접 내인성 DNA 중합효소 연장 활성의 측정을 통한 미생물의 민감한 보편적 검출
정제된 중합효소 활성을 검출하는데 더하여, 미생물-유래된 DNA 중합효소 활성을 측정하는 간단한 보편적인 방법은 매우 바람직할 것이다. 이것이 달성된다면 이러한 방법은 활발히 성장하는 배양물에서 후보 항균제의 스크리닝을 가능하게 할 수 있으며, 따라서 DNA 중합효소 연장 활성과 유기체 증식의 비교를 허용한다. 추가로, DNA 중합효소 연장 활성의 측정은 활성 DNA 중합효소를 은닉한 어떤 미생물의 존재에 대해서 환경적 또는 생물학적 샘플을 스크리닝하는데 사용될 수 있었다. 이를 위해서, 우리는 미생물 세포용해와 본 발명에 의해서 제공된 DPE-PCR 분석을 결합하는 간단한 방법을 개발했다. 도 3에 도시된 대로, 미생물을 함유한다고 알려진, 또는 의심되는 액체 샘플이 비드 밀 세포용해 튜브에 첨가되고, 파괴되고, DPE-PCR 분석으로 즉시 이송된다. 조 세포 세포용해물에서 미생물-유래 DNA 중합효소 연장 활성을 측정하는 우리의 분석의 능력을 증명하기 위해 하나의 그람 음성 박테리아(E. coli)와 하나의 그람 양성 박테리아(S. aureus)를 선택했다. 도 4A에 도시된 대로, 비드 밀 세포용해와 관계되었을 때 DPE-PCR 분석은 투입된 E. coli를 세포용해 튜브당 10 콜로니 형성 단위(cfu)까지 그리고 그 이하까지 광범위한 동적 범위를 검출할 수 있다. 또한, E. coli 검출의 선형 회귀 분석이 투입 박테리아의 10 cfu까지 수행되었고, 0.999의 R2 값에 의해서 나타난 대로 투입된 cfu와 DNA 중합효소 연장 활성 신호 사이에 강한 양성 선형 상관성을 나타냈다(도 4B). 콜로니 계수 평판 및 E. coli-유전자 특이적 qPCR(gsPCR)이 병행 전개되었으며, 이는 반응당 cfu의 투입 수준과 정확한 동일한 세포용해물로부터 온전한 게놈 DNA를 모니터하는 능력을 모두 확인한다. S. aureus 세포용해물로부터 DNA 중합효소 연장 활성이 유사한 투입 수준까지 검출되었다(도 4C). S. aureus 검출이 투입 박테리아의 10 cfu까지 플롯팅되었고, 또한 투입된 cfu와 DNA 중합효소 연장 활성 신호 사이에 강한 선형 상관성을 나타냈다(R2=0.999, 도 4D). 각 비드 세포용해 튜브에 존재하는 S. aureus의 양과 직접 분석가능한 게놈 DNA의 존재를 확인하기 위해서 콜로니 계수 평판과 gsPCR이 병행 수행되었다. E. coli 및 S. aureus 모두에 대한 평판, gsPCR 및 DNA 중합효소 활성의 완전한 표들은 도 3 및 4에서 찾을 수 있다. 우리는 계속해서 17개의 추가의 임상적으로 관련된 미생물로부터 DNA 중합효소 활성을 측정하는 DPE-PCR 분석의 능력을 시험했다. 표 1에 도시된 대로, 6개의 그람-음성 박테리아, 6개의 그람-양성 박테리아 및 5개의 칸디다 종들을 포함하는 모든 17개 추가 미생물로부터 DNA 중합효소 활성을 검출할 수 있었다. 17개의 추가의 미생물의 검출은 인상적으로 낮은 검출 한계에서 투입 cfu와의 강한 양성 선형 상관성을 나타냈다. 지금까지 우리는 실패 없이 총 31개의 상이한 미생물 종들을 유사하게 시험하고 검출했다(데이터 미도시). 선형 동적 범위의 상한은 아직 충분히 특성화되지 않았다. 17개의 추가의 미생물 각각에 대한 병행한 평판 데이터 및 DPE-PCR 결과를 함유한 더 많은 결과는 도 8에 제시된다. 이와 함께, 이들 데이터는 본 발명의 교시에 따라서 DPE-PCR의 성능은 통상의 멸균 환경에서 어떤 미생물의 민감한 검출을 위한 보편적인 "범용" 시험으로서 유용할 수 있는 가능성을 가진다는 개념을 뒷받침한다.
도 2D에 도시된 대로, 반응 믹스에서 dCTP의 ddCTP로의 치환은 우리의 분석 안에서 DNA 중합효소-의존성 연장 활성의 검출을 차단하기 위한 강력한 도구가 된다. 박테리아 스파이크로부터 유래된 신호가 세포용해물에 존재하는 다른 내인성 박테리아 효소 활성이 아니라 이들의 DNA 중합효소 연장 활성에 의존적이었다는 것을 증명하기 위해서 우리는 (dATP,dTTP,dGTP,ddCTP)를 함유하는 반응 믹스에 대해 (dATP,dTTP,dGTP,dCTP)를 함유하는 표준 DNA 중합효소 반응 믹스를 사용하여 E. coli와 S. aureus로부터 얻어진 DPE-PCR 신호를 비교하기 위한 실험을 셋업했다. 도 5A에 도시된 대로, 표준 반응 믹스와 비교했을 때 ddCTP의 치환은 E. coli cfu 스파이크로부터 유래된 신호의 발생을 차단했다(도 5A). 계속해서 100% ddCTP(50μM)를 함유하는 반응 믹스에 세포용해된 박테리아로부터의 DNA 중합효소 연장 활성과 dCTP로 양을 증가시키면서 스파이크된 50μM ddCTP를 함유하는 것들을 비교함으로써 dCTP 구제 실험이 수행되었다(구제 실험의 상세한 설명에 대한 재료 및 방법 참조). 도 5B는 증가한 양의 dCTP가 E. coli 세포용해물로부터 유래된 정량가능한 DNA 중합효소 연장 활성에 대해 구제 효과를 가진다는 것을 증명한다. 미생물 DNA 중합효소 연장 활성을 측정하는 것에 더하여, 동등한 양의 E. coli가 분석된 세포용해물 각각에 존재했음을 검증하기 위해서 gsPCR이 병행 전개되었다. 게놈 DNA의 존재에 대한 DNA 중합효소 활성의 그래프 비교가 도 5C에 제시된다. 계속해서 신호 종결(ddCTP를 통한) 및 dCTP 구제 실험이 S. aureus를 가지고 반복되었고, 유사한 결과가 얻어졌다(도 5D-F). E. coli 및 S. aureus 모두에 대한 DPE-PCR 및 gsPCR 데이터를 함유하는 표는 도 6 및 7에서 찾을 수 있다. qPCR로 전달된 낮은 수준의 ddCTP는 억제성이 없으며, 따라서 DNA 중합효소 활성 신호의 소실에 대해 책임이 없다는 것을 증명하기 위하여 qPCR 내부 대조군 값이 제공된다(도 6A 및 7A). 이와 함께, 도 5에 제시된 데이터는 DPE-PCR 분석이 미생물 DNA 중합효소 연장 활성을 특이적으로 검출하며, DNA 중합효소 이외의 다른 효소 활성을 통한 기질 변형으로부터는 신호가 유래되지 않는다는 주장을 강하게 뒷받침한다.
박테리아 생육성의 지시제로서 DNA 중합효소 연장 활성의 측정
박테리아 생육성을 결정하기 위한 종래의 방법은 고체 배지에서 특정한 미생물의 성장 및 시각화에 의존한다(21). 박테리아 성장 및 시각화는 현재 산업의 중요한 근본이지만, 종래의 cfu 생육성 결정 방법은 cfu 형성에 필요한 시간 길이로 인해서 바람직하지 않다. 또한, 고체 배지나 액체 배양물에서 성장하는 능력은 미생물마다 극적으로 다를 수 있으며, 따라서 특정한 까다로운 유기체의 검출을 잠재적으로 제한한다(22). 종래의 방법의 전술한 제한으로 인하여, 제약(23), 환경, 식품 가공 및 임상 시험의 광범위한 영역에서 미생물 생육성의 신속한 평가에 대한 필요성이 증가하고 있다. 결과적으로, 주어진 바탕질 안에서 미생물 생육성 상태를 빠르게 평가하기 위한 노력으로서 수많은 분자적 방법이 개발되었다(24). 신속하고 민감함에도 불구하고 핵산의 존재를 검출하는 분자적 방법은 종종 세포 생육성의 정확한 측정을 나타내지 못한다. 예를 들어, 내인성 DNA 또는 RNA의 증폭은 박테리아 생육성의 불량한 지시제인데, 세포 사망 후에도 핵산이 지속되기 때문이다(25, 26). 우리는 박테리아 생육성의 지시제로서 DNA 중합효소 연장 활성을 사용하는 것의 실현가능성을 결정하기 위한 셋업을 했다. 이를 위해서, 다양한 양의 열처리 후 박테리아 생육성의 지시제로서 DNA 중합효소 연장 활성과 게놈 DNA의 PCR-매개 검출을 비교하기 위한 실험이 설계되었다. 시작으로서 E. coli 현탁액이 고정된 시간 기간 동안 증가한 온도에서 처리되었다. 열처리 후, 박테리아는 계속해서 DNA 중합효소 연장 활성과 게놈 DNA의 둘 다의 존재에 대해 분석되었다. 또한, 생육성 cfu의 존재를 통해서 박테리아 생육성을 모니터하기 위해 열처리된 박테리아 스톡과 열처리되지 않은 박테리아 스톡이 병행하여 평판되었다. 도 6A는 나타낸 양의 열처리 후 측정된 E. coli DNA 중합효소 연장 활성의 수준을 나타낸다. 주목할 점은 45℃ 내지 65℃에서 박테리아 현탁액의 인큐베이션 후에 E. coli DNA 중합효소 연장 활성의 유의한 하락이 관찰되었다는 것이다(도 6A). 반면에, 동일한 세포용해물로부터 얻어진 gsPCR 신호는 모든 온도에서 상대적으로 일정한 채로 있었으며, 도 6B에서 DNA 중합효소 활성과 그래프 비교된다. 그래프 아래에 제시된 평판 결과는 증가한 수준의 열처리가 cfu 형성을 방지하기에 충분하며, DNA 중합효소 활성의 극적인 손실이 병행된다는 것을 더 증명하지만, 죽은 세포들도 여전히 이들의 원래 투입 수준에 아주 근접하게 게놈 DNA 수준에 기여하며, 이는 gsPCR이 생육성 세포의 존재에 대한 불량한 지시제임을 확인한다(도 6B). 도 6C에서 막대 그래프는 치사량의 열처리에 대한 반응에서 cfu의 소실을 모니터하는 DPE-PCR과 gsPCR의 상대적 능력을 더 강조한다. 계속해서 우리는 DNA 중합효소 연장 활성이 또한 그람 양성 유기체의 생육성 상태를 나타내는데 사용될 수 있는지의 여부를 시험하고자 했다. 선행한 E. coli 실험들이 동일한 조건에서 S. aureus를 가지고 반복되었다.
도 7A-C는 S. aureus를 가지고 반복된 열처리 실험으로부터 얻어진 유사한 결과를 나타낸다. 종합하면, 도 4, 6, 7, 및 도 8의 표 1에 나타낸 cfu의 존재와 DNA 중합효소 연장 활성 사이의 강한 일치는 본 발명에 따라서 수행된 DPE-PCR이 세포 생육성의 일반적인 지시제로서 사용될 수 있는 가능성을 가진다는 것과 추가로 세포 증식이나 생육성을 감소시키는 것을 목표로 한 다른 임상적으로 또는 제약학적으로 관련된 제제(정균제 및 살균제)에 노출된 미생물로부터 DNA 중합효소 연장 활성을 측정하는 것의 가능성이 존재할 수 있다는 것을 증명한다.
요약하면, 본 발명에 따라서, 새롭고 매우 민감하며 정략적이고 신속한 DPE-PCR 분석이 개발되었다. 극히 낮은 수준의 정제된 효소의 정량적 검출에 더하여, 우리는 비드 세포용해와의 결합을 통해서 10 cfu 미만의 박테리아로부터 DNA 중합효소 연장 활성을 재현 가능하게 측정하는 DPE-PCR의 능력을 증명했다. 또한, 우리는 7개 그람-음성 박테리아, 7개 그람-양성 박테리아 및 5개 칸디다 종들로 이루어진 일군의 미생물을 시험함으로써 미생물을 보편적으로 검출할 수 있는 DPE-PCR의 가능성을 증명했다. 또한, DPE-PCR 분석이 박테리아 생육성을 평가하는데 사용될 수 있다는 예비적 증거가 cfu의 존재에 의해서 나타난 대로 DNA 중합효소 연장 활성과 증식 사이의 재현가능한 강한 상관성을 통해서 제공되었다. 본원에 개시된 데이터를 고려하면 본원에 개시된 바람직한 DPE-PCR 분석과 같은 본 발명의 새로운 방법 및 기술은 현재 제약, 환경, 식품 및 임상 환경 안에서 광범위한 시험 용도를 위한 유용한 도구가 될 수 있는 가능성을 가진다고 생각된다.
본 출원을 통틀어서 인용된 모든 참고자료, 특허 및 공개된 특허출원의 내용은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허출원이 참고자료로 포함되도록 구체적으로 그리고 개별적으로 지시된 경우 그것과 동일한 정도까지 참고자료로 본원에 포함된다.
전술한 상세한 설명은 단지 명확한 이해를 위해서 주어졌으며, 그로부터 불필요한 제한은 부여되지 않아야 하고, 당업자에게는 변형이 자명할 것이다. 본원에 제공된 정보 중 어느 것도 선행기술이거나 또는 현재 청구된 발명과 관련된다는 것, 또는 구체적으로 또는 함축적으로 언급된 어떤 간행물도 선행기술이라는 것을 인정하는 것은 아니다.
달리 정의되지 않는다면 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 분야의 당업자에 의해서 통상 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 그것의 특정한 구체예들와 관련하여 설명되었지만, 추가의 변형이 있을 수 있다는 것과, 본 출원이 일반적으로 본 발명의 원리에 따른 그리고 본 발명이 속하는 분야 안에서 공지된 또는 통례의 실시에 들어가며 앞서 제시된 본질적인 특징들에 적용될 수 있는 본 개시로부터의 벗어남을 포함하는, 본 발명의 어떤 변화, 사용 또는 개조를 아우르도록 의도된다는 것이 이해될 것이다.
참고자료
1. Rothwell, P.J and Waksman, G. (2005) Structure and mechanism of DNA polymerases. Advan. Prot. Chem. 71 401-440.
2. Joyce, CM. and Steitz, T.A. (1994) Function and structure relationships in DNA polymerases. Annu. Rev. Biochem. 63, 777-822.
3. Mar Alba, M. (2001) Replicative DNA polymerases. Genome Biol. 2, 3002.1-3002.4.
4. Lehman, I., Bessman, M., Simms, E. and Kornberg, A. (1958) Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. I. preparation of substrates and partial purification of an enzyme from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 233, 163-170.
5. Hamilton, S.C., Farchaus, J.W., and Davis, M.C. (2001) DNA polymerases as engines for biotechnology. BioTechniques 31, 370-383.
6. Tarantino, P.M., Zhi, C, Wright, G.E., and Brown, N.C. (1999) Inhibitors of DNA polymerase III as novel antimicrobial agents and gram-positive bacteria. Antimicrob. Agents Chemother. 43, 1982-1987.
7. Kuhl, A., Svenstrup, N., Ladel, C, Otteneder, M., Binas, A., Schiffer, G., Brands, M., Lampe, T., Ziegelbauer, K., Rubsamen-Waigmann, H., Haebich, D. and Ehlert, K. (2005) Biological characterization of novel inhibitors of the gram-positive DNA polymerase IIIC enzyme. Antimicrob. Agents Chemother. 49, 987-995.
8. Lange, S.S., Takata, K. and Wood, R.D. (2011) DNA polymerases and cancer. Nat. Rev. Cancer 11, 96-110.
9. Martin, S.A., McCabe, N., Mullarkey, M., Cummins, R., Burgess, D.J., Nakabeppu, Y., Oka, S., Kay, E., Lord, C.J. and Ashworth, A. (2010) DNA polymerases as potential therapeutic targets for cancers deficient in the DNA mismatch repair proteins MSH2 or MLH1. Cancer Cell 17, 235-248.
10. Naviaux, R.K., Markusic, D., Barshop, B.A., Nyhan, W.L. and Haas, R.H. (1999) Sensitive assay for mitochondrial DNA polymerase γ. Clin. Chem. 45, 1725-1733.
11. Richardson, C.C., Schildkraut, C.L., Vasken Aposhian, H. and Kornberg, A. (1964) Enzymatic synthesis of deoxyribonucleic acid. J. Biol. Chem. 239, 222-232.
12. Griep, M.A. (1995) Flurescence recovery assay: A continuous assay for processive DNA polymerase applied specifically to DNA polymerase III holoenzyme. Anal. Biochem. 232, 180-189.
13. Seville, M., West A.B., Cull, M.G. and McHenry, C.S. (1996) Fluorometric assay for DNA polymerases and reverse transcriptase. Biotechniques 21, 664, 668, 670, 672.
14. Tveit, H. and Kristensen, T. (2001) Fluorescence-based DNA polymerase assay. Anal. Biochem. 289, 96-98.
15. Yu, Liming, Hu, G. and Howells, L. (2002) Fluorescence-based, high-throughput DNA polymerase assay. Biotechniques 33, 938-941.
16. Ma, C, Tang, Z., Wang, K., Tan, W., Li, J., Li, W., Li, Z., Yang, X., Li, H. and Liu, L. (2006) Real-time monitoring of DNA polymerase activity using molecular beacon. Anal. Biochem. 353, 141-143.
17. Luo, X. and Hsing I. (2011) Immobilization-free electrochemical DNA polymerase assay. Electroanalysis 23, 923-926.
18. Banin, S., Wilson, S. and Stanley C. (2007) The LiMA technology: measurement of ATP on a nucleic acid testing platform. Clin Chem 53, 2034-2036.
19. Toji, L. and Cohen, S.S. (1969) The enzymatic termination of polydeoxynucleotides by 2'3'-dideoxyadonsine triphosphate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63, 871-877.
20. Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467.
21. Davey, H.M. (2011) Life, death, and in-between: Meanings and methods in microbiology. Appl. Environ. Microbiol. 77, 5571-5576.
22. Rappe, M.S. and Giovannoni, S.J. (2003) The uncultured microbial majority. Annu. Rev. Microbiol. 57, 369-394.
23. Riley, B. (2004) Rapid microbiology methods in the pharmaceutical industry. Amer. Pharm. Rev. 1-4.
24. Keer, J.T. and Birch, L. (2003) Molecular methods for the assessment of bacterial viability. J. Microbio. Meth. 53, 175-183.
25. Masters, C, Shallcross, J. and Mackey, B. (1994) Effect of stress treatments on the detection of Listeria monocytogenes and enterotoxigenic Escherichia coli by the polymerase chain reaction. J. Appl. Bacteriol. 77, 73-79.
26. Sheridan, G.E.C., Masters, C.I., Shallcross, J.A. and Mackey, B.M. (1998) Detection of mRNA by reverse transcription-PCR as an indicator of viability in Escherichia coli cells. Appl. Environ. Microbiol. 64, 1313-1318.

Claims (10)

  1. DNA 중합효소 연장 활성의 측정에 의한 활성 DNA 중합효소를 함유하는 샘플 바탕질 안에서 미생물의 존재 또는 양의 검출을 위한 진단 분석을 수행하는 방법으로서, 상기 분석은 샘플 바탕질 안의 DNA 중합효소를 선택된 적합한 기질과 함께 인큐베이션하는 단계, 및 선택된 적합한 핵산 프로브의 사용을 통해 PCR 사이클링 및 검출을 수행하는 단계를 포함하며, 이로써 상기 미생물의 존재 또는 양의 표시로서 샘플 바탕질 안의 내인성 DNA 중합효소 연장 활성을 검출하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, DNA 중합효소 연장 활성의 측정은 상기 샘플 바탕질 안의 박테리아 생육성의 지시제인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 샘플 바탕질은 혈청임을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 샘플 바탕질은 혈장임을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 샘플 바탕질은 정제된 효소, 미생물 세포용해물 및 조 미생물 세포용해물로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 분석은 미생물 DNA 중합효소 연장 활성을 특이적으로 검출하며, 신호는 DNA 중합효소 이외의 다른 효소 활성을 통한 상기 기질의 변형으로부터는 유래되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 분석의 수행 전에, 상기 방법은 미생물을 함유한다고 알려진, 또는 미생물을 함유한다고 의심되는 미생물 세포용해물 또는 조 미생물 세포용해물을 비드 밀 세포용해 튜브에 첨가하는 단계, 미생물 세포를 파괴하는 단계, 및 파괴된 세포를 상기 분석의 인큐베이션 단계로 이송하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 분석이 미생물 DNA 중합효소 연장 활성을 특이적으로 검출하고, 분석 신호가 DNA 중합효소 이외의 다른 효소 활성을 통한 상기 기질의 변형으로부터는 유래되지 않는 것을 보장하기 위해서 상기 방법의 수행 중 적합한 지점에서 샘플 바탕질에 차단제를 첨가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 샘플 바탕질은 생물학적 샘플임을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 샘플 바탕질은 환경적 샘플임을 특징으로 하는 방법.
KR1020147021867A 2012-01-05 2013-01-03 개선된 dna 중합효소 활성 분석 및 생육성 미생물의 검출을 가능하게 하는 방법 KR20150005511A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261583568P 2012-01-05 2012-01-05
US61/583,568 2012-01-05
PCT/US2013/020180 WO2013103744A1 (en) 2012-01-05 2013-01-03 Improved dna polymerase activity assays and methods enabling detection of viable microbes

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20150005511A true KR20150005511A (ko) 2015-01-14

Family

ID=48745412

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020147021867A KR20150005511A (ko) 2012-01-05 2013-01-03 개선된 dna 중합효소 활성 분석 및 생육성 미생물의 검출을 가능하게 하는 방법

Country Status (10)

Country Link
US (1) US9708651B2 (ko)
EP (1) EP2800822B1 (ko)
JP (1) JP6388540B2 (ko)
KR (1) KR20150005511A (ko)
CN (1) CN104066853B (ko)
AU (1) AU2013206888A1 (ko)
CA (1) CA2897010C (ko)
ES (1) ES2624871T3 (ko)
IN (1) IN2014DN06516A (ko)
WO (1) WO2013103744A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201412316D0 (en) * 2014-07-10 2014-08-27 Momentum Bioscience Ltd Detecting the absence of micro-organisms
CN107541508A (zh) * 2016-06-24 2018-01-05 广州康昕瑞基因健康科技有限公司 模板‑引物核酸分子、聚合酶活性测定方法及试剂盒
CN106987643A (zh) * 2017-05-05 2017-07-28 广州和实生物技术有限公司 一种 Taq DNA 聚合酶活性检测方法
CN109609606B (zh) * 2018-11-28 2023-03-31 成都博奥晶芯生物科技有限公司 一种dna聚合酶的相对酶活的测定方法
GB201914538D0 (en) 2019-10-08 2019-11-20 Momentum Bioscience Ltd Microorganism capture from antimicrobial-containing solution
KR102441122B1 (ko) * 2020-05-11 2022-09-07 주식회사 엔지노믹스 폴리머라제 활성 측정 방법

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040005555A1 (en) * 2000-08-31 2004-01-08 Rothman Richard E. Molecular diagnosis of bactermia
EP2418018B1 (en) * 2004-12-23 2013-05-22 Abbott Point of Care Inc. Methods for the separation nucleic acids
GB0513535D0 (en) * 2005-07-01 2005-08-10 Iseao Technologies Ltd Improved methods of detecting microbes
US20080113349A1 (en) * 2006-11-03 2008-05-15 Pranvera Ikonomi Method for detecting the presence of mammalian organisms using specific cytochrome c oxidase I (COI) and/or cytochrome b subsequences by a PCR based assay
CA2692800A1 (en) * 2007-07-09 2009-01-15 Christopher John Stanley Detection of micro-organisms based on their nad-dependent dna ligase activity
JP2011188856A (ja) * 2010-03-11 2011-09-29 Samsung Techwin Co Ltd リアルタイムｐｃｒのための核酸テンプレートの製造
EA201291001A1 (ru) * 2010-04-16 2013-09-30 Зиус Сайентифик, Инк. Способы измерения ферментативной активности, полезные при определении жизнеспособности клеток в неочищенных образцах
KR20150009539A (ko) * 2012-04-12 2015-01-26 제우스 사이언티픽, 아이엔씨. 어떤 중합효소 연장 활성의 민감한, 정량적 측정에 유용한 중합효소 활성을 측정하고 생육성 세포의 존재를 결정하는 방법

Also Published As

Publication number Publication date
US20150004617A1 (en) 2015-01-01
EP2800822A1 (en) 2014-11-12
EP2800822A4 (en) 2015-08-26
CN104066853B (zh) 2019-05-31
US9708651B2 (en) 2017-07-18
EP2800822B1 (en) 2017-03-29
CA2897010A1 (en) 2013-07-11
CA2897010C (en) 2017-11-07
AU2013206888A1 (en) 2014-08-21
IN2014DN06516A (ko) 2015-06-12
CN104066853A (zh) 2014-09-24
WO2013103744A1 (en) 2013-07-11
JP6388540B2 (ja) 2018-09-12
ES2624871T3 (es) 2017-07-17
JP2015503925A (ja) 2015-02-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6258360B2 (ja) 抗生物質耐性細菌を検出するための方法およびキット
JP6603956B2 (ja) ポリメラーゼ活性を指標として非精製サンプル中の微生物の存在を検出する方法
CA2897010C (en) Improved dna polymerase activity assays and methods enabling detection of viable microbes
US20130059290A1 (en) Detection of nucleic acids in crude matrices
JP6496727B2 (ja) ベータラクタム系抗生物質に対する感受性を迅速に判定するためのアムジノシリン
JP2013537399A5 (ko)
CN106661625A (zh) 检测不存在微生物的方法和试剂盒
TWI465572B (zh) Method, composition and system of amplification and detection of target microbial DNA
US20160083776A1 (en) Methods for Measuring Polymerase Activity Useful for Sensitive, Quantitative Measurements of Any Polymerase Extension Activity and for Determining the Presence of Viable Cells
US20150057172A1 (en) Real-time pcr detection of mycobacterium tuberculosis complex
WO2019074091A1 (ja) ｍｅｃＡ遺伝子増幅用プライマーペア、ｍｅｃＡ遺伝子検出キット及びｍｅｃＡ遺伝子検出方法
Class et al. Patent application title: Methods for Detection of Micro-Organisms Inventors: Christopher John Stanley (Cambridge, GB) Stuart Wilson (London, GB) Assignees: MICROSEN MEDTECH LIMITED
JP2017175968A (ja) Ｐｃｒ反応溶液の検出感度を維持する方法

Legal Events

Date Code Title Description
A302 Request for accelerated examination
E902 Notification of reason for refusal