KR100919262B1 - 식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품위해 미생물 검출방법 - Google Patents

식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품위해 미생물 검출방법

Info

Publication number
KR100919262B1
KR100919262B1 KR1020080056938A KR20080056938A KR100919262B1 KR 100919262 B1 KR100919262 B1 KR 100919262B1 KR 1020080056938 A KR1020080056938 A KR 1020080056938A KR 20080056938 A KR20080056938 A KR 20080056938A KR 100919262 B1 KR100919262 B1 KR 100919262B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
primer
pcr
chain reaction
polymerase chain
seq
Prior art date
Application number
KR1020080056938A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20080082561A (ko
Inventor
이강권
김정순
엄경화
권정연
Original Assignee
삼성에버랜드 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 삼성에버랜드 주식회사 filed Critical 삼성에버랜드 주식회사
Priority to KR1020080056938A priority Critical patent/KR100919262B1/ko
Publication of KR20080082561A publication Critical patent/KR20080082561A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100919262B1 publication Critical patent/KR100919262B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/143—Multiplexing, i.e. use of multiple primers or probes in a single reaction, usually for simultaneously analyse of multiple analysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품 위해 미생물 검출방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 대장균 O157:H7, 스타필로코커스 아우레우스, 바실러스 세레우스, 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 리스테리아 모노사이토게네스, 열시니아 엔테리콜리티카, 클로스트리디움 퍼프리젠스, 살모넬라 속 균주, 쉬겔라 속 균주 및 캠필로박터 제주니 각각의 특이 유전자를 신속 정확하게 증폭시킬 수 있는 PCR 프라이머, 상기 프라이머를 이용한 식중독 검출방법 및 검출키트를 제공한다.

Description

식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품 위해 미생물 검출방법{A PRIMER FOR DETECTING FOOD BORNE PATHOGENIC MICRO-ORGANISM AND A METHOD FOR DETECTING FOOD BORNE PATHOGENIC MICRO-ORGANISM USING THE SAME}
본 발명은 식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품위해 미생물 검출방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 컨벤셔널 중합효소연쇄반응(Conventional PCR)을 포함한 일반적인 중합효소연쇄반응뿐만 아니라, SYBR Green I을 이용한 리얼타임 중합효소연쇄반응(Real time PCR)에 사용가능 한 PCR프라이머들을 이용하여 식중독의 원인이 되는 식품 위해 미생물 즉, 병원성 미생물을 신속 정확하게 검출해 내는 방법에 관한 것이다.
학교 급식 등 단체급식의 확대 및 외식기회 증가 등의 식생활 패턴의 변화와, 지구 온난화 및 실내 온도 상승 등의 환경적인 변화로 인하여 식중독 발생 비율이 증가하면서 규모 면에서도 집단화, 대형화되고 있는 실정이어서 식품 안정성 확보를 위한 대책이 시급히 요구되고 있다.
식품 안전성 확보는 식품 안정성 확보를 위한 미생물학적 검사의 유효성을 확보하는 것과 직접적으로 연관되어 있다. 상기 미생물학적 검사의 가장 핵심적인 사항은 식중독 관련 미생물 및 부패미생물의 오염 여부를 판별하고 동정하는 것이다.
미생물학적인 측면에서 식품을 평가하는 데에는 두 가지 의의가 있다. 첫째, 식품의 품질관리를 목적으로 식품의 미생물 오염 정도와 그 식품에 이용되고 있는 유용한 미생물을 확인하는 것이고, 둘째, 어떤 식품이 어떤 병원성 미생물에 오염 되었는가 분석하는 것이다. 전자의 시험은 식품의 신선도를 보증하며 동시에 변패와 부패의 진행 정도를 판정하는데 이용된다. 식품위생적인 면에서는 후자를 중요시하며, 식중독사건에서 식품의 원인을 규명하는데 실시하는 시험도 이 범주에 속한다. 즉, 식품 안정성 확보를 위한 미생물학적 검사는 주로 상기의 후자와 관련이 있다고 할 수 있다.
상기 미생물학적 검사와 관련하여, 단시간에 집단적으로 발병할 수 있는 세균성 식품매개질환 특히, 세균성 식중독의 원인균을 조기에 발견하여 예방하고 집단발병의 확대를 막을 수 있는 관리시스템의 개발은 매우 중요한 문제이다.
식품매개로 인하여 사람에서 문제가 되는 질병은 250 여종 이상이 알려져 있으며, 이 중에서 축산물과 관련된 질환이 큰 부분을 차지하고 이와 관련된 주요한 병원체는 약 25종 정도가 알려져 있다. 축산물을 매개로 전파되는 중요한 병원체는 살모넬라 속 균주, 대장균O157, 리스테리아 모노사이토게네스, 캠필로박터 제주니, 스타필로코커스 아우레우스, 클로스트리디움 퍼프리젠스 등이 사람에게서 식중독을 유발시키는 것으로 보고되었다.
상기 식중독이란 발열, 구토질, 구토, 설사 및 복통 등의 증세를 동반하는 질환으로, 세균이 원인인 세균성 식중독이 대부분이다. 상기 세균성 식중독은 그 발병 형태에 따라 감염형과 독소형으로 분류된다. 감염형 식중독은 오염된 식품의 섭취시 세균이 장관 내에서 증식하여 일으키는 식중독으로, 살모넬라 속 균주(Salmonella spp), 대장균O157(Escherichia . coli O157 : H7, E. coli O157 : H7) 또는 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus) 등이 주된 원인균이다. 독소형 식중독은 식품 중에서 세균이 증식하면서 독소를 생산하여 식품 내에 존재하는 독소를 섭취함으로써 발생하는 식중독이다. 그러므로 이 경우 원인균이 식품 내에서 이미 사멸되었어도 독소가 잔존할 때에는 식중독이 발생할 수 있으며, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 또는 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens) 등이 주된 원인균이다.
미국 질병통제 및 예방센터(CDC)의 통계에 의하면, 식품매개에 의하여 연간 500만 건의 질병이 발생하고 있으며, 이 중 약 4,000명이 사망하는 것으로 알려져 있고, 대부분은 살모넬라 속 균주에 의한 식중독이 약 100만 내지 400만 명에게 발생하며, 이중 약 0.1%에 해당하는 약 2,000 여명이 사망하는 것으로 보고되었다. 또한, 대장균 O157:H7 에 의한 식중독은 연간 약 1만 명이 발생하여 약 300명이 사망하였으며, 리스테리아 모노사이토게네스의 경우, 연간 약 1,500명이 발생하여 약 400명이 사망하는 것으로 알려져 있어, 이들의 주요 병원성 세균에 의한 축산식품의 오염이 심각한 것으로 나타났다.
우리나라의 식중독 발생현황을 살펴보면, 원인식품으로는 육류 및 식육가공품이 약 50% 이상을 차지하고 있으며, 원인병원체는 살모넬라균이 약 50%, 포도상구균이 약 20% 인 것으로 알려져 있다. 정확한 원인균의 동정을 위해서 오염된 가검물이나 식품을 배양하여 생화학적 테스트를 수행하는 것을 원칙으로 하는데, 이는 최소 3일에서 수 주일이 소요된다. 이와 같은 배지법이나 생화학적 테스트는 공인검사법으로 널리 사용되고 있기는 하지만 원인병원체를 파악하고 역학조사를 완료하기 전에 이미 식중독이 집단적으로 확산될 가능성이 매우 높다.
일 예로, 현재 사용되는 살모넬라균 검출방법은, 완충성 펩톤수(BPW; Buffered Peptone Water)에서 전 배양하고 이를 선택배지에서의 배양하여 1차 검증한 다음 생화학적, 혈청학적 분석을 통하여 확인하는 방법이며, 통상 약 5일에서 6일이 소요된다.
따라서 추가적으로 유전자 스크리닝 검사법을 확보함으로써, 식중독 원인 병원체에 대한 조기진단을 가능하게 할 수 있다. 유전자검사법으로 처음 등장한 중합효소연쇄반응법은 각 균에 대한 특이적-독소유전자(toxin gene), 또는 공통적으로 가지고 있는 특정 유전자를 증폭시킴으로써 병원체의 유전자를 신속하고 정확하게 검출할 수 있다. 이 방법은 배지법이나 생화학적 테스트보다 신속하며, 특이도가 향상된 것이 특징이다. 상기와 같은 특징, 즉, 원인 병원체를 정확, 신속하게 확인할 수 있는 방법으로 해당 병원체의 특이적 유전자를 검사할 수 있으므로 중합효소연쇄반응법이 임상진단에 널리 보급되고 있다.
그러나, 기존에 사용된 중합효소연쇄반응법의 경우, 분석 가능한 균체량을 얻기 위하여 배양과정을 수행하고 있는 바 분석에 하루 이상이 소요된다는 문제점이 있으며, 더불어 유전자 증폭과정 후 확인 및 판정을 위하여 전기영동과 염색과정을 거치는 번거로움이 상존한다. 따라서, 최근에는 식품이라는 특이한 환경에서 감도를 더욱 높여 검출할 수 있는 방법에 관한 연구가 계속 수행되면서 다양한 중합효소연쇄반응법이 개발되고 있으며, 그 중에서도 리얼타임 중합효소연쇄반응법이 가장 주목을 받고 있다.
상기와 같이, 리얼타임 중합효소연쇄반응법과 같이 다양한 기술을 이용하여 신속하고 정확하며, 식중독 원인균의 배양과정이 생략된 식중독 원인균의 검출 및 이로부터 식품의 오염 정도를 검출할 수 있는 검출 방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.
상기 종래기술의 문제점을 해결하기, 본 발명은 식품 위해 미생물 검출용 프라이머를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 식품 위해 미생물 검출용 프라이머를 이용한 식품 위해 미생물 검출방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 식품 위해 미생물 검출용 프라이머, 반응완충액 및 중합효소를 포함하는 식품 위해 미생물 검출키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 식품 위해 미생물 검출용 프라이머를 제공한다.
상기 식품 위해 미생물이란 식품을 매개로 인간에게 발생하는 질병의 원인균을 의미하며, 바람직하게는 병원성 미생물, 더욱 바람직하게는 식중독을 유발하는 병원성 미생물일 수 있다.
상기 병원성 미생물은 바람직하게는 대장균O157(E. coli O157 : H7), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 열시니아 엔테리콜리티카(Yersinia entericolitica), 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens), 살모넬라 속 균주(Salmonella spp .), 쉬겔라 속 균주(Shigella spp .) 및 캠필로박터 제주니(Camphylobacter jejunii)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 것일 수 있다.
본 발명의 식품 위해 미생물 검출용 프라이머는 식품 위해 미생물의 특이 유전자를 탐지하여 식품 위해 미생물을 검출할 수 있는 프라이머를 의미하며, 바람직하게는 상기 병원성 미생물의 특이 유전자를 탐지하여, 병원성 미생물의 특이 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍일 수 있다.
본 발명의 프라이머 쌍은, 2종 이상의 식품 위해 미생물 검출을 위한 식품 위해 미생물 검출용 프라이머, 바람직하게는 10종의 식품 위해 미생물의 특이 유전자를 동시에 탐지할 수 있는 프라이머쌍으로, 구체적으로는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 대장균 O157:H7(E. coli O157 : H7) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 열시니아 엔테리콜리티카(Y. entericolitica) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 15의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 살모넬라 속균(Salmonella spp .) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 17의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 18의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 쉬겔라 속균(Shigella spp .) 검출용 프라이머 쌍; 및 서열번호 19의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 20의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 캠필로박터 제주니(Camphylobacter jejuni) 검출용 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 프라이머 쌍일 수 있다.
상기 프라이머 쌍은 각각 그 크기와 Melting Temperature(Tm) 즉, DNA의 이중가닥(double strand)이 한가닥으로 분리되는 온도가 상이하므로 상기 10종의 병원성 미생물의 특이 유전자를 동시에 탐지할 수 있다.
또한, 본 발명은 대장균O157(E. coli O157 : H7), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 열시니아 엔테리콜리티카(Yersinia entericolitica), 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens), 살모넬라 속 균주(Salmonella spp.), 쉬겔라 속 균주(Shigella spp .) 또는 캠필로박터 제주니(Camphylobacter jejunii)를 탐지할 수 있는 각 균주 특이적 PCR 프라이머쌍을 제공한다. 각 탐지 대상 균주별 특이적 PCR 프라이머쌍의 조합을 하기 표 1에 나타낸다.
미생물 No 방향 Primer sequence(5' → 3') 서열번호
E. coli O157 : H7 E1 정방향 GAT AGA CTT TTC GAC CCA ACA AAG 1
E2 역방향 CCG ATG TGG TCCCCT GAG 2 101
E3 역방향 TTG CTC AAT AAT CAG ACGAAG ATG 21 208
E4 역방향 CGT TGT CAC ACC GGG CAC TGA 22 304
E5 역방향 CCC CAC TCT GAC ACC ATC CT 23 625
S. aureus SA1 정방향 AAT TTA ACA GCT AAA GAG TTT GGT 3
SA2 역방향 TTC CCA CTA AAT GTG TTT CAT AA 24 122
SA3 역방향 TTC ATT AAA GAA AAA GTG TAC GAG 25 265
SA4 역방향 ACG TAT CTT CCA TGA ATG ATC TAA 4 622
B. cereus B1 정방향 GAC TAC ATT CAC GAT TAC GCA GAA 5
B2 역방향 GTA GAC CAA TTG TTG CTT GTA ATG G 26 164
B3 역방향 CTA TGC TGA CGA GCT ACA TCC ATA 27 303
B4 역방향 TTC CTA AAC TTG CAC CAT CTC GG 6 640
V. parahaemolyticus V1 정방향 CTC ATT TGT ACT GTT GAA CGC CTA 7
V2 역방향 AGG CGT CAT TGT TAT CAG AAG C 28 91
V3 역방향 TCA TGA GCA GAG GCG TCA TTG 29 101
V4 역방향 TAC TAC TGG CGC TTC TGG TTC 8 167
V5 역방향 AAT AGA AGG CAA CCA GTT GTT GAT 30 375
V6 역방향 GAC TGC CAT TCA TTT GAT GAT AGC 31 688
L. monocytogenes L1 정방향 CTG GCA CAA AAT TAC TTA CAA CGA 9
L2 역방향 TGG AGT GCT TAC TGC TTT GTC AG 32 83
L3 역방향 AAC TAC TGG AGC TGC TTG TTT TTC 10 451
L4 역방향 GTT ACC ACC CCA TGA ATA AGC 33 800
Y. enterocolitica Y1 정방향 AAT ACC GCA TAA CGT CTT CG 11
Y2 역방향 CTT CTT CTG CGA GTA ACG TC 12 330
Y3 역방향 CGG TAT TCC TCC AGA TCT CTA C 34 551
C. perfringens C1 정방향 TGA TAT GTC CAA AAA TGA ACC AGA 13
C2 역방향 TTG TGA TTC CCC TGT GTC AGG 14 220
C3 역방향 TGC CAT TCA TAT CTA GCT AAT GCT 35 260
C4 역방향 TTT CCT TTC TTC TGC AAA AGT CTC 36 402
C5 역방향 CCT GCT GTT CCT TTT TGA GAG 37 630
Salmonella sp . SAL1 정방향 GAA TCC TCA GTT TTT CAA CGT TTC 15
SAL2 역방향 CCA GAC GAA AGA GCG TGG TAA 38 60
SAL3 역방향 GTA TGC CCG GTA AAC AGA TGA GT 39 284
SAL4 역방향 TAG CCG TAA CAA CCA ATA CAA ATG 16 678
Shigella sp . SH1 정방향 CAG GCA TGA AAT TAA GCC TG 17
SH2 역방향 CTG CAT TCT GGC AAT CTC TTC ACA 40 110
SH3 역방향 GCA TCT GAC AGC AAT AGT ACA 41 355
SH4 역방향 TGT ACA TCG ATA ATA CCA AAC 18 445
C. jejuni CA1 정방향 ACT TCT TTA TTG CTT GCT GC 19
CA2 역방향 GCC ACA ACA AGT TAA AGA AGC 20 303
상세하게는 각 식품 위해 미생물을 검출할 수 있는 상기 표 1의 탐지 대상 균주별 특이적 PCR 프라이머의 조합은 하기와 같다.
본 발명의 대장균 O157:H7의 특이 유전자를 탐지할 수 있는 프라이머쌍으로, 구체적으로는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 대장균 O157:H7 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 21의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 대장균 O157:H7 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 22의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 대장균 O157:H7 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 23의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 대장균 O157:H7 검출용 프라이머 쌍일 수 있다.
본 발명의 스타필로코커스 아우레우스의 특이 유전자를 탐지할 수 있는 프라이머쌍으로, 구체적으로는 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 스타필로코커스 아우레우스 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 24의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 스타필로코커스 아우레우스 검출용 프라이머 쌍 및 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 25의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 스타필로코커스 아우레우스 검출용 프라이머 쌍일 수 있다.
본 발명의 바실러스 세레우스의 특이 유전자를 탐지할 수 있는 프라이머쌍으로, 구체적으로는 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 바실러스 세레우스 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 26의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 바실러스 세레우스 검출용 프라이머 쌍 및 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 27의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 바실러스 세레우스 검출용 프라이머 쌍일 수 있다.
본 발명의 비브리오 파라헤몰리티쿠스의 특이 유전자를 탐지할 수 있는 프라이머쌍으로, 구체적으로는 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티쿠스 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 28의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티쿠스 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 29의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티쿠스 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 30의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티쿠스 검출용 프라이머 쌍 및 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 31의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티쿠스 검출용 프라이머 쌍일 수 있다.
본 발명의 리스테리아 모노사이토게네스의 특이 유전자를 탐지할 수 있는 프라이머쌍으로, 구체적으로는 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 리스테리아 모노사이토게네스 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 32의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 리스테리아 모노사이토게네스 검출용 프라이머 쌍 및 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 33의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 리스테리아 모노사이토게네스 검출용 프라이머 쌍일 수 있다.
본 발명의 클로스트리디움 퍼프리젠스의 특이 유전자를 탐지할 수 있는 프라이머쌍으로, 구체적으로는 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 클로스트리디움 퍼프리젠스 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 35의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 클로스트리디움 퍼프리젠스 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 36의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 클로스트리디움 퍼프리젠스 검출용 프라이머 쌍 및 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 37의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 클로스트리디움 퍼프리젠스 검출용 프라이머 쌍일 수 있다.
본 발명의 살모넬라 속균의 특이 유전자를 탐지할 수 있는 프라이머쌍으로, 구체적으로는 서열번호 15의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 살모넬라 속균 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 15의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 38의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 살모넬라 속균 검출용 프라이머 쌍 및 서열번호 15의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 39의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 살모넬라 속균 검출용 프라이머 쌍일 수 있다.
본 발명의 쉬겔라 속균의 특이 유전자를 탐지할 수 있는 프라이머쌍으로, 구체적으로는 서열번호 17의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 18의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 쉬겔라 속균 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 17의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 40의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 쉬겔라 속균 검출용 프라이머 쌍 및 서열번호 17의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 41의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 쉬겔라 속균 검출용 프라이머 쌍일 수 있다.
*서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 대장균 O157:H7 검출용 프라이머 쌍은, 대장균 O157:H7 균주의 특이 유전자를 약 101 bp로 증폭시키고 Tm 값은 79℃를 나타낸다.
서열번호 1(E1) : 5'-GATAGACTTTTCGACCCAACAAAG-3'
서열번호 2(E2) : 5'-CCGATGTGGTCCCCTGAG-3'
상기 대장균 O157:H7 검출용 프라이머 쌍은 통상적인 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있으며, 바람직하게는 컨벤셔널 중합효소연쇄반응 또는 리얼타임 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있다.
서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호4의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 스타필로코커스 아우레우스 검출용 프라이머 쌍은, 스타필로코커스 아우레우스의 특이 유전자를 약 622 bp로 증폭시키고 Tm 값은 80.9℃를 나타낸다.
서열번호 3(SA1) : 5'-AATTTAACAGCTAAAGAGTTTGGT-3'
서열번호 4(SA4) : 5'-ACGTATCTTCCATGAATGATCTAA-3'
상기 스타필로코커스 아우레우스 검출용 프라이머 쌍은 통상적인 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있으며, 바람직하게는 컨벤셔널 중합효소연쇄반응 또는 리얼타임 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있다.
서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 바실러스 세레우스 검출용 프라이머 쌍은, 바실러스 세레우스의 특이 유전자를 약 640 bp로 증폭시키고 Tm 값은 82.7℃를 나타낸다.
서열번호 5(B1) : 5'-GACTACATTCACGATTACGCAGAA-3'
서열번호 6(B4) : 5'-TTCCTAAACTTGCACCATCTCGG-3'
상기 바실러스 세레우스 검출용 프라이머 쌍은 통상적인 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있으며, 바람직하게는 컨벤셔널 중합효소연쇄반응 또는 리얼타임 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있다.
서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티쿠스 검출용 프라이머 쌍은, 비브리오 파라헤몰리티쿠스의 특이 유전자를 약 167 bp로 증폭시키고 Tm 값은 82.7℃를 나타낸다.
서열번호7(V1) : 5'-CTCATTTGTACTGTTGAACGCCTA-3'
서열번호8(V4) : 5'-TACTACTGGCGCTTCTGGTTC-3'
상기 비브리오 파라헤몰리티쿠스 프라이머 쌍은 통상적인 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있으며, 바람직하게는 컨벤셔널 중합효소연쇄반응 또는 리얼타임 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있다.
서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 리스테리아 모노사이토제네스 검출용 프라이머 쌍은, 리스테리아 모노사이토제네스의 특이 유전자를 약 451 bp로 증폭시키고 Tm 값은 82.3℃를 나타낸다.
서열번호 9(L1) : 5'-CTGGCACAAAATTACTTACAACGA-3'
서열번호 10(L3) : 5'-AACTACTGGAGCTGCTTGTTTTTC-3'
상기 리스테리아 모노사이토제네스 검출용 프라이머 쌍은 통상적인 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있으며, 바람직하게는 컨벤셔널 중합효소연쇄반응 또는 리얼타임 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있다.
서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 열시니아 엔테리콜리티카 검출용 프라이머 쌍은, 열시니아 엔테리콜리티카의 유전자를 약 330 bp로 증폭시키고 Tm 값은 88℃를 나타낸다.
서열번호 11(Y1) : 5'-AATACCGCATAACGTCTTCG-3'
서열번호 12(Y2) : 5'-CTTCTTCTGCGAGTAACGTC-3'
상기 열시니아 엔테리콜리티카 검출용 프라이머 쌍은 통상적인 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있으며, 바람직하게는 컨벤셔널 중합효소연쇄반응 또는 리얼타임 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있다.
서열번호 13의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 클로스트리디움 퍼프리젠스 검출용 프라이머 쌍은, 클로스트리디움 퍼프리젠스의 특이 유전자를 약 220 bp로 증폭시키고 Tm 값은 78℃를 나타낸다.
서열번호 13(C1) : 5'-TGATATGTCCAAAAATGAACCAGA-3'
서열번호 14(C2) : 5'-TTGTGATTCCCCTGTGTCAGG-3'
상기 클로스트리디움 퍼프리젠스 검출용 프라이머 쌍은 통상적인 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있으며, 바람직하게는 컨벤셔널 중합효소연쇄반응 또는 리얼타임 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있다.
서열번호 15의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 살모넬라 속 균주 검출용 프라이머 쌍은, 살모넬라 속 균주의 특이 유전자를 약 678 bp로 증폭시키고 Tm 값은 86.7℃를 나타낸다.
서열번호 15(SAL1) : 5'-GAATCCTCAGTTTTTCAACGTTTC-3'
서열번호 16(SAL4) : 5'-TAGCCGTAACAACCAATACAAATG-3'
상기 살모넬라 속 균주 검출용 프라이머 쌍은 통상적인 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있으며, 바람직하게는 컨벤셔널 중합효소연쇄반응 또는 리얼타임 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있다.
서열번호 17의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 18의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 쉬겔라 속 균주 검출용 프라이머 쌍은, 쉬겔라 속 균주의 특이 유전자를 약 445 bp로 증폭시키고 Tm 값은 80.8℃를 나타낸다.
서열번호 17(SH1) : 5'-CAGGCATGAAATTAAGCCTG-3'
서열번호 18(SH4) : 5'-TGTACATCGATAATACCAAAC-3'
상기 쉬겔라 속 균주 검출용 프라이머 쌍은 통상적인 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있으며, 바람직하게는 컨벤셔널 중합효소연쇄반응 또는 리얼타임 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있다.
서열번호 19의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 20의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 캠필로박터 제주니 검출용 프라이머 쌍은, 캠필로박터 제주니의 특이 유전자를 약 303 bp로 증폭시키고 Tm 값은 80.7℃를 나타낸다.
서열번호 19(CA1) : 5'-ACTTCTTTATTGCTTGCTGC-3'
서열번호 20(CA2) : 5'-GCCACAACAAGTTAAAGAAGC-3'
상기 캠필로박터 제주니 검출용 프라이머 쌍은 통상적인 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있으며, 바람직하게는 컨벤셔널 중합효소연쇄반응 또는 리얼타임 중합효소연쇄반응에 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 식품 위해 미생물 검출용 프라이머 쌍을 이용한 식품 위해 미생물 검출방법에 관한 것이며, 바람직하게는 식품 위해 미생물 검출용 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)으로 식품 위해 미생물을 탐지하는 단계를 포함하는 식품 위해 미생물 검출방법에 관한 것일 수 있다.
본 발명의 또다른 구체에에서, 본 발명은 상기 식품 위해 미생물 검출용 중합효소연쇄반응 프라이머, 반응완충액 및 중합효소를 포함하는 식품 위해 미생물 검출키트를 제공한다.
본 발명의 검출방법 및 검출키트에서 상기 1종의 식품 위해 미생물에 대한 프라이머 쌍을 이용하여 각각의 식품 위해 미생물을 검출할 수 있다. 상기 1종의 병원성 미생물에 대한 프라이머 쌍을 이용하여 각각의 병원성 미생물을 검출할 수 있는 프라이머 쌍은 각 검출 미생물의 종류에 따라 상기 표 1의 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1 이상을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명의 검출방법 및 검출키트에서 하기 표 2의 2종 이상의 식품 위해 미생물의 특이 유전자를 검출할 수 있는 프라이머 쌍을 이용하여 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex Polymerase Chain Reaction)을 수행함으로써, 2종 이상의 식품 위해 미생물을 동시에 검출할 수 있다.
미생물 No 방향 Primer sequence(5'→3') 서열번호
E. coli O157 : H7 E1 정방향 GAT AGA CTT TTC GAC CCA ACA AAG 1
E2 역방향 CCG ATG TGG TCCCCT GAG 2
S. aureus SA1 정방향 AAT TTA ACA GCT AAA GAG TTT GGT 3
SA4 역방향 ACG TAT CTT CCA TGA ATG ATC TAA 4
B. cereus B1 정방향 GAC TAC ATT CAC GAT TAC GCA GAA 5
B4 역방향 TTC CTA AAC TTG CAC CAT CTC GG 6
V. parahaemolyticus V1 정방향 CTC ATT TGT ACT GTT GAA CGC CTA 7
V4 역방향 TAC TAC TGG CGC TTC TGG TTC 8
L. monocytogenes L1 정방향 CTG GCA CAA AAT TAC TTA CAA CGA 9
L3 역방향 AAC TAC TGG AGC TGC TTG TTT TTC 10
Y. enterocolitica Y1 정방향 AAT ACC GCA TAA CGT CTT CG 11
Y2 역방향 CTT CTT CTG CGA GTA ACG TC 12
C. perfringens C1 정방향 TGA TAT GTC CAA AAA TGA ACC AGA 13
C2 역방향 TTG TGA TTC CCC TGT GTC AGG 14
Salmonella sp . SAL1 정방향 GAA TCC TCA GTT TTT CAA CGT TTC 15
SAL4 역방향 TAG CCG TAA CAA CCA ATA CAA ATG 16
Shigella sp . SH1 정방향 CAG GCA TGA AAT TAA GCC TG 17
SH4 역방향 TGT ACA TCG ATA ATA CCA AAC 18
C. jejuni CA1 정방향 ACT TCT TTA TTG CTT GCT GC 19
CA2 역방향 GCC ACA ACA AGT TAA AGA AGC 20
상기 2종 이상의 식품 위해 미생물 검출을 위한 식품 위해 미생물 검출용 프라이머는 상기 10종의 식품 위해 미생물의 특이 유전자를 동시에 탐지할 수 있는 프라이머로 이루어진 군으로부터 2종 이상 선택된 프라이머 쌍일 수 있다. 상기 10종의 식품 위해 미생물의 특이 유전자를 동시에 탐지할 수 있는 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 2종 이상 선택된 프라이머 쌍은 상기 표 2에 나타낸 서열번호 1 내지 20에 기재된 프라이머로 이루어지는 각 균주 특이적 프라이머쌍일 수 있다.
바람직하게는, 상기 10종의 병원성 미생물의 특이 유전자를 동시에 탐지할 수 있는 프라이머 쌍은 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 대장균 O157:H7(E. coli O157 : H7) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 3의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 4의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 5의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 6의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 7의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 8의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 9의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 10의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 11의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 12의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 열시니아 엔테리콜리티카(Y. entericolitica) 검출용 프라이머 쌍; 및 서열번호 13의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 14의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 15의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 16의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 살모넬라 속균(Salmonella spp .) 검출용 프라이머 쌍; 서열번호 17의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 18의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 쉬겔라 속균(Shigella spp .) 검출용 프라이머 쌍; 및 서열번호 19의 염기서열을 포함하는 프라이머 및 서열번호 20의 염기서열을 포함하는 프라이머로 이루어진 캠필로박터 제주니(Camphylobacter jejuni) 검출용 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 2종 이상 선택된 것일 수 있다.
상기 표 2의 2종 이상의 식품 위해 미생물 검출을 위한 식품 위해 미생물 검출용 프라이머를 이용하는 경우 동일한 반응조건에 의해 다중 중합효소연쇄반응를 수행할 수 있으므로, 2종 이상의 식품 위해 미생물의 검출이 동시에 가능할 수 있다. 상기 다중 중합효소연쇄반응이란 2이상의 프라이머 쌍을 동시에 이용하여, 1종 이상의 주형 DNA, 바람직하게는 2종 이상의 주형 DNA에 대한 중합효소연쇄반응을 동시에 수행할 수 있는 중합효소연쇄반응일 수 있다.
상기 본 발명의 식품 위해 미생물 검출방법은 상기 본 발명의 식품 위해 미생물 검출용 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응으로 식품 위해 미생물을 탐지하는 단계를 포함하는 식품 위해 미생물 검출방법에 관한 것일 수 있다.
상기 검출방법이 상기 10종의 식품 위해 미생물 즉, 대장균O157(E. coli O157:H7), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 비브리오 파라헤몰리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 열시니아 엔테리콜리티카(Yersinia entericolitica), 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens), 살모넬라 속 균주(Salmonella spp .), 쉬겔라 속 균주(Shigella spp.) 및 캠필로박터 제주니(Camphylobacter jejunii)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 식품 위해 미생물을 검출하기 위한 것인 경우에는 바람직하게는 각 검출 미생물의 종류에 따라 상기 표 1의 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 1이상을 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하여 DNA를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 DNA를 이용하여 식품 위해 미생물의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는 검출방법일 수 있으며, 상기 증폭된 DNA를 이용하여 식품 위해 미생물의 존재 여부를 확인하는 단계는 증폭된 DNA 산물의 크기를 확인하여 수행할 수 있으며, 상기 증폭된 DNA 산물의 크기확인은 상기 증폭된 DNA 산물을 전기영동하여 수행할 수 있다. 상기 증폭된 DNA 산물의 크기의 확인은 사용된 프라이머를 이용하여 증폭할 경우 예상되는 DNA 산물의 크기, 바람직하게는 표 1의 증폭 산물의 크기와 일치하는지 여부를 확인하는 것일 수 있다.
상기 중합효소연쇄반응은 통상의 중합효소연쇄반응일 수 있으며, 바람직하게는 컨벤셔널 중합효소연쇄반응(Conventional PCR) 또는 리얼타임 중합효소연쇄반응((Real time PCR)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 리얼타임 중합효소연쇄반응일 수 있다. 상기 컨벤셔널 중합효소연쇄반응은 특정 DNA를 증폭한 후에, 특정 DNA의 증폭여부를 확인하는 단계를 추가로 수행하여야 하는 통상의 중합효소연쇄반응을 의미하며, 상기 특정 DNA의 증폭여부를 확인하는 단계는 전기영동 등을 통하여 증폭된 DNA 산물의 크기를 확인하는 방법으로 수행할 있다. 상기 리얼타임 중합효소연쇄반응은 바람직하게는 SYBR Green I을 이용한 리얼타임 중합효소연쇄반응일 수 있다.
또한, 각 검출 미생물의 종류에 따라 상기 표 1의 프라이머 쌍으로 이루어진 군에서 선택된 2 이상을 이용하는 경우에는 다중 중합효소연쇄반응을 이용할 수 있다.
상기 중합효소연쇄반응이 컨벤셔널 중합효소연쇄반응인 경우는, 상기 증폭된 DNA를 이용하여 식품 위해 미생물의 존재 여부를 확인하는 단계는 상기 증폭된 DNA 산물을 전기영동하여 상기 증폭된 DNA 산물의 크기를 확인하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 중합효소연쇄반응이 리얼타임 중합효소연쇄반응인 경우는, 상기 증폭된 DNA를 이용하여 식품 위해 미생물의 존재 여부를 확인하는 단계는 형광정도 즉, 형광공명에너지이동(fluorescence resonance energy transfer, FRET)을 측정하는 방법으로 수행할 수 있으며, 추가로 증폭된 DNA 산물의 이중나선이 분리되는 온도(melting temperature)를 확인하는 단계를 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 검출방법이 상기 10종의 식품 위해 미생물로 이루어진 군으로부터 선택된 2종의 식품 위해 미생물을 검출하기 위한 것인 경우에는 바람직하게는 상기 표 2의 프라이머 쌍으로 이루어진 군으로부터 선택된 2 이상을 이용하여 다중 중합효소연쇄반응을 수행하여 DNA를 증폭하는 단계; 및 상기 증폭된 DNA를 이용하여 식품 위해 미생물의 존재 여부를 확인하는 단계를 포함하는 검출방법일 수 있으며, 상기 증폭된 DNA를 이용하여 식품 위해 미생물의 존재 여부를 확인하는 단계는 증폭된 DNA 산물의 크기를 확인하여 수행할 수 있으며, 상기 증폭된 DNA 산물의 크기확인은 상기 증폭된 DNA 산물을 전기영동하여 수행할 수 있다. 상기 증폭된 DNA 산물의 크기의 확인은 사용된 프라이머를 이용하여 증폭할 경우 예상되는 DNA 산물의 크기, 바람직하게는 표 1의 증폭 산물의 크기와 일치하는지 여부를 확인하는 것일 수 있다.
상기 중합효소연쇄반응이 컨벤셔널 중합효소연쇄반응인 경우는, 상기 증폭된 DNA를 이용하여 식품 위해 미생물의 존재 여부를 확인하는 단계는 상기 증폭된 DNA 산물을 전기영동하여 상기 증폭된 DNA 산물의 크기를 확인하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 중합효소연쇄반응이 리얼타임 중합효소연쇄반응인 경우는, 상기 증폭된 DNA를 이용하여 식품 위해 미생물의 존재 여부를 확인하는 단계는 형광정도 즉, 형광공명에너지이동(fluorescence resonance energy transfer, FRET)을 측정하는 방법으로 수행할 수 있으며, 추가로 증폭된 DNA 산물의 이중나선이 분리되는 온도(melting temperature)를 확인하는 단계를 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 검출키트는 상기 미생물 검출용 프라이머 쌍 및 중합효소연쇄반응을 이용한 미생물 검출키트의 통상적인 구성성분을 포함하는 것일 수 있다. 상기 통상적인 구성성분은 반응완충액, Taq DNA 중합효소, dNTP 및 MgCl2 등일 수 있으며, SYBR Green I을 이용한 리얼타임 중합효소연쇄반응의 경우, SYBR Green I를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 식품 위해 미생물 검출키트의 바람직한 일예로, 본 발명의 검출키트는 (i) 상기 표 1의 각 균주별 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 1 이상 또는 서열번호 1 내지 20에 기재된 프라이머로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 각 균주 특이적 PCR 프라이머쌍; (ii) Taq DNA 중합효소(polymerase) 및 SYBR Green I을 포함하는 2X PCR Master Mix; 및 (iii) 주형 DNA 즉, 식품 위해 미생물이 발견될 수 있는 측정 대상 물질로부터 추출한 시료 DNA를 포함하는 것일 수 있다.
상기 중합효소연쇄반응은 통상의 중합효소연쇄반응용 기기를 사용하여 실시할 수 있으며, 상기 중합효소연쇄반응용 기기는 바람직하게는 리얼타임 중합효소연쇄반응용 기기, 열 블록 중합효소연쇄반응(Thermal Block PCR)용 기기, 마이크로 중합효소연쇄반응(Micro PCR)용 기기일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 리얼타임 중합효소연쇄반응용 기기일 수 있다. 일 예로, 7700 리얼타임 중합효소연쇄반응용 기기(ABI사, USA) 또는 TMC-1000 리얼타임 중합효소연쇄반응용 기기(삼성테크윈, 대한민국)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 미생물 검출방법에 사용되는 대상시료인 중합효소연쇄반응의 주형 DNA는 식품 위해 미생물이 발견될 수 있는 모든 물질, 바람직하게는 식품, 사료 및 가검물로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나, 더욱 바람직하게는 식품으로부터 추출한 것일 수 있다.
상기 주형 DNA 즉, 시료 DNA의 추출은 통상의 DNA 추출법으로 수행할 수 있으며, 상기 DNA 추출법은 바람직하게는 알카라인 추출법(Alkaline extraction method), 열수추출법, 컬럼(Column) 추출법 또는 페놀/클로로포름(Phenol/Chloroform) 추출법일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 알카라인 추출법(Alkaline extraction method)일 수 있다. 또한, 상기 DNA 추출법을 수행하기 전에, 병원성 미생물이 발견될 수 있는 물질 즉, 대상 물질 또는 검체를 멸균수 또는 생리식염수를 가하고 균질기를 활용하여 파쇄한 후에, 그 여액을 취하는 단계를 추가로 수행할 수 있다.
본 발명의 구체적인 일예로서, 시료 DNA의 추출은 식품 위해미생물에 오염되었다고 의심되는 대상 시료를 채취하는 단계; 이를 멸균수 또는 생리 식염수, 바람직하게는 0.85% 식염수에 현타한 후, 프로테나제 K(proteinase K)를 처리하는 단계 및 펠렛을 회수하고 DNA 추출법을 수행하는 단계를 포함하는 추출법으로 수행할 수 있다.
또한, 본 발명의 구체적인 일예로 상기 컬럼 추출법은
i) 진탕배양액 1 ml을 취하여 1.5 ml 튜브에 옮겨 12,000 rpm에서 5분간 원심 분리하는 단계; ii) 상층액을 버린 후, 펠렛(pellet)에 300 ul의 lysis A buffer(Food& Feed DNA Extraction kit, KoGeneBioTech), 30 ul의 lysis B buffer(Food& Feed DNA Extraction kit, KoGeneBioTech)를 첨가한 후 펠렛을 녹이는 단계; iii) 상기 lysis buffer와 펠렛을 65 ℃ 항온 수조(water bath)에서 1시간 반응시키는 단계; iv) 상기 단계 ii)의 lysis buffer와 동량(330 ul)의 클로로포름(chloroform)을 첨가하고 볼텍싱(vortex)을 수행하는 단계; v) 상기 혼합액을 12,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후, 200 ul의 상층액을 취하여 새로운 1.5 ml 튜브에 담고, 200 ul의 binding buffer와 200 ul의 isopropyl alcohol를 첨가하고 혼합하는 단계; vi) 상기 혼합액 600 ul를 취하여 컬럼 튜브(column tube)에 넣고, 12,000 rpm에서 2분간 원심 분리하는 단계; vii) collection tube를 비운 후 600 ul의 Wash buffer를 첨가하고 12,000 rpm에서 2분간 원심 분리하는 단계; viii) collection tube를 비운 후 500 ul의 Wash buffer를 첨가하고, 2,000 rpm에서 2분간 원심 분리하는 단계; ix) collection tube를 비운 후 12,000 rpm에서 3분간 원심 분리하는 단계 및 x) 150 ul의 TE buffer를 첨가하고 8,000 rpm에서 3분간 원심 분리하여, DNA 용출액을 모으는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 구체적인 일예로 상기 페놀/클로로포름 추출법은
i) 1 ml의 균 배양액을 1.5 ml 튜브에 옮기고, 12,000 rpm에서 5분간 원심 분리하는 단계; ii) 상층액을 버린 후, 펠렛에 467 ul의 TE buffer를 첨가하여 펠렛을 잘 현탁(suspension)하는 단계; iii) 추가로 30 ul의 10% SDS, 3 ul의 proK (20 mg/ul)를 첨가하고, 65 ℃에서 1시간 반응시키는 단계; iv) 25:24:1의 페놀/ 클로로포름/ 아이소아밀알코올 (페놀: 클로로포름: 아이소아밀알코올) 500 ul를 첨가하고 볼텍싱(vortex)을 수행하는 단계; v) 상기 혼합액을 12,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후, 400 ul의 상층액을 취하여 새로운 1.5 ml 튜브에 담고, 40 ul의 3M 소디윰 아세테이트(sodium acetate)와 800 ul의 100% 에탄올(EtOH)을 첨가하여 혼합하는 단계; vi) 상기 혼합액을 12,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후, 상층 액을 버리고 500 ul의 75% 에탄올(75% cold EtOH)를 첨가하는 단계; vii) 상기 혼합액을 12,000 rpm에서 10분간 원심 분리한 후, 상층액을 제거하고, 펠렛을 건조하는 단계, 및 viii) 150 ul의 TE buffer 또는 멸균수를 넣어 펠렛을 녹여 용출(elution)하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.
상기 vii) 단계의 펠렛의 건조는 바람직하게는 펠렛이 완전히 건조되지 않도록 수행하는 것일 수 있으며, 상기 추출된 DNA는 흡광도를 측정하고 농도를 계산하여 PCR 반응에 사용할 수 있다.
상기 중합효소연쇄반응용 혼합물(Mixture)은 상기 중합효소연쇄반응용 기기에 따라 적절한 조성으로 제조될 수 있다. 일 예로, ABI 7700의 경우, 상기 중합효소연쇄반응용 혼합물의 조성은 하기 표 3과 같을 수 있으며, 삼성 TMC-1000의 경우, 상기 중합효소연쇄반응용 혼합물의 조성은 하기 표 4와 같을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
SYBR Green I ABI 리얼타임 중합효소연쇄반응 Mixture 조성
농도 사용량(ul)
주형(10ng/ul) 5 ng 5
Primer (F,R) 5pmole/ul 20 pmole 4
50X ROX - 0.4
2X SYBR Green I Premix Ex Taq - 10
D.W. - 0.6
합계 - 20
SYBR Green I TMC-1000 PCR Mixture 조성
농도 사용량(ul)
주형(10ng/ul) 4 ng 4
Primer (F,R) 10pmole/ul 20 pmole 2
2X SYBR Green I Premix Ex Taq - 6
합계 12
상기 중합효소연쇄반응의 반응조건은 상기 중합효소연쇄반응의 종류, 중합효소연쇄반응용 기기의 종류 및 프라이머의 종류에 따라 통상의 반응조건을 선택하거나 적절하게 일부 변형된 조건을 선택될 수 있다. 상기 중합효소연쇄반응의 종류는 일예로, 리얼타임 중합효소연쇄반응, 컨벤셔널 중합효소연쇄반응, nested 중합효소연쇄반응, 다중 중합효소연쇄반응, 단일 중합효소연쇄반응 또는 마이크로 중합효소연쇄반응일 수 있다. 일 예로, ABI 7700의 경우, 상기 중합효소연쇄반응의 반응조건은 하기 표 5와 같을 수 있으며, 삼성 TMC-1000의 경우, 상기 중합효소연쇄반응의 반응조건은 하기 하기 표 6과 같을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
SYBR Green I ABI 리얼타임 중합효소연쇄반응 Running 조건
Temperature Cycle number
Denaturation 94 ℃ / 5 min 1
Amplification 94 ℃ / 30 sec 35
60 ℃ / 30 sec
72 ℃ / 30 sec
Final Extension 72 ℃ / 5 min 1
Analysis Denaturation 94 ℃ / 2 mim 1
Annealing 60 ℃ / 15 sec 1
Data collection 60 ℃ to 94 ℃ 19 min 59 sec
Denaturation 94 ℃ / 15 sec 1
SYBR Green I TMC-1000 PCR Running 조건
단계 Temperature Cycle number
Denaturation 94 ℃ / 10 min 1
Amplification 94 ℃ / 15 sec 50
55 ℃ / 15 sec
72 ℃ / 30 sec
Final Extension 72 ℃ / 5 min 1
Analysis Data collection 60 ℃ to 94 ℃
Ramp rate 0.2 ℃ / sec
본 발명의 검출방법은 특정 병원성 미생물에 대하여 효율적으로 검출할 수 있으며, 특히, 기존의 검출한계 약 105 CFU/㎖를 약 100 내지 10 CFU/㎖로 증진시킬 수 있으며, 프라이머 쌍의 종류에 따라, 2 이상의 병원성 미생물을 동시에 효율적으로 검출할 수 있다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명을 통하여 얻어진 10종의 병원성 미생물 검출용 프라이머 쌍은 살모넬라 속 균주, 스타필로코커스 아우레우스, 대장균 O157, 리스테리아 모노사이토게네스, 비브리오 파라헤몰리티쿠스, 열시니아 엔테리콜리티카, 쉬겔라 속, 바실러스 세레우스, 캠필로박터 제주니 및 클로스트리디움 엔테리콜리티카 각각의 특이 유전자를 신속 정확하게 증폭시키며, 100 내지 10 CFU/ml의 검출한계를 갖는다. 따라서, 상기 프라이머 쌍을 이용하여 병원성 미생물의 감염 여부를 5시간 이내에 진단할 수 있는 신속한 역학조사를 수행할 수 있다. 또한 본 발명에서 제시한 프라이머를 이용하여 세 그룹으로의 동시분석이 가능하며 이를 바탕으로 한 단일 또는 다중 중합효소연쇄반응을 이용한 식품 위해 미생물 검출용 제품의 상용화가 가능하여 산업적으로 그 효과가 매우 크다 할 것이다.
도 1은 대장균 O157:H7(Escherichia . coli O157:H7)에 대하여 제작된 다양한 PCR프라이머 세트를 이용하여 컨벤셔널 중합효소연쇄반응(Conventional PCR)을 수행한 결과이고,
도 2는 컨벤셔널 중합효소연쇄반응을 통하여 선별된 O157:H7(Escherichia . coli O157:H7) 검출용 PCR 프라이머 쌍을 이용한 리얼타임 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR) 결과이며,
도 3은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대하여 제작된 다양한 PCR프라이머 세트를 이용하여 컨벤셔널 중합효소연쇄반응(Conventional PCR)을 수행한 결과이고,
도 4는 컨벤셔널 중합효소연쇄반응을 통하여 선별된 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 검출용 PCR프라이머 쌍을 이용한 리얼타임 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR) 결과이며,
도 5은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대하여 제작된 다양한 PCR프라이머 세트를 이용하여 컨벤셔널 중합효소연쇄반응(Conventional PCR)을 수행한 결과이고,
도 6은 컨벤셔널 중합효소연쇄반응을 통하여 선별된 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 검출용 PCR프라이머 쌍을 이용한 리얼타임 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR) 결과이며,
도 7은 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)에 대하여 제작된 다양한 PCR프라이머 세트를 이용하여 컨벤셔널 중합효소연쇄반응(Conventional PCR)을 수행한 결과이고,
도 8은 컨벤셔널 중합효소연쇄반응을 통하여 선별된 비브리오 파라헤몰리티쿠스(Vibrio parahaemolyticus) 검출용 PCR프라이머 쌍을 이용한 리얼타임 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR) 결과이며,
도 9는 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes)에 대하여 제작된 다양한 PCR프라이머 세트를 이용하여 컨벤셔널 중합효소연쇄반응(Conventional PCR)을 수행한 결과이고,
도 10은 컨벤셔널 중합효소연쇄반응을 통하여 선별된 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes) 검출용 PCR프라이머 쌍을 이용한 리얼타임 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR) 결과이며,
도 11은 열시니아 엔테리콜리티카(Yersinia entericolitica)에 대하여 제작된 다양한 PCR프라이머 세트를 이용하여 컨벤셔널 중합효소연쇄반응(Conventional PCR)을 수행한 결과이고,
도 12는 컨벤셔널 중합효소연쇄반응을 통하여 선별된 열시니아 엔테리콜리티카(Yersinia entericolitica) 검출용 PCR프라이머 쌍을 이용한 리얼타임 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR) 결과이며,
도 13은 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens)에 대하여 제작된 다양한 PCR프라이머 세트를 이용하여 컨벤셔널 중합효소연쇄반응(Conventional PCR)을 수행한 결과이고,
도 14는 컨벤셔널 중합효소연쇄반응을 통하여 선별된 클로스트리디움 퍼프리젠스(Clostridium perfringens) 검출용 PCR프라이머 쌍을 이용한 리얼타임 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR) 결과이며,
도 15는 살모넬라 속 균주(Salmonella spp)에 대하여 제작된 다양한 PCR프라이머 세트를 이용하여 컨벤셔널 중합효소연쇄반응(Conventional PCR)을 수행한 결과이고,
도 16은 컨벤셔널 중합효소연쇄반응을 통하여 선별된 살모넬라 속 균주(Salmonella spp) 검출용 PCR프라이머 쌍을 이용한 리얼타임 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR) 결과이며,
도 17은 쉬겔라 속 균주(Shigella spp .)에 대하여 제작된 다양한 PCR프라이머 세트를 이용하여 컨벤셔널 중합효소연쇄반응(Conventional PCR)을 수행한 결과이고,
도 18은 컨벤셔널 중합효소연쇄반응을 통하여 선별된 쉬겔라 속 균주(Shigella spp .) 검출용 PCR프라이머 쌍을 이용한 리얼타임 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR) 결과이며,
도 19는 캠필로박터 제주니(Camphylobacter jejunii)에 대하여 제작된 다양한 PCR프라이머 세트를 이용하여 컨벤셔널 중합효소연쇄반응(Conventional PCR)을 수행한 결과이고,
도 20은 컨벤셔널 중합효소연쇄반응을 통하여 선별된 캠필로박터 제주니(Camphylobacter jejunii) 검출용 PCR프라이머 쌍을 이용한 리얼타임 중합효소연쇄반응(Real-Time PCR) 결과이며,
도 21은 살모넬라 속 균주 검출용 60 bp크기의 PCR프라이머를 이용하여 GC 함량 변화에 따른 Tm 값의 변화를 측정한 결과이고,
도 22는 5종의 식중독균 동시분석을 위한 각각의 Tm 값 차이를 나타낸 모식도이며,
도 23은 4종의 식중독균 동시분석을 위한 각각의 Tm 값 차이를 나타낸 모식도이고,
도 24는 SYBR Green I을 이용한 5종의 식중독균 동시분석을 위해 수행한 리얼타임 중합효소연쇄반응의 결과이며,
도 25는 SYBR Green I을 이용한 4종의 식중독균 동시분석을 위해 수행한 리얼타임 중합효소연쇄반응 결과이고,
도 26은 인위오염 식품에서의 대장균 O157:H7 PCR 검출 결과이며,
도 27는 인위오염 식품에서의 대장균 O157:H7 검출을 위한 ABI 리얼타임 중합효소연쇄반응 검출 결과이고,
도 28은 인위오염 식품에서의 대장균 O157:H7 검출을 위한 TMC-1000 리얼타임 중합효소연쇄반응 검출 결과이며,
도 29는 인위오염 식품에서의 스타필로코커스 아우레우스 PCR 검출 결과이고,
도 30은 인위오염 식품에서의 스타필로코커스 아우레우스 검출을 위한 ABI 리얼타임 중합효소연쇄반응 검출 결과이며,
도 31은 인위오염 식품에서의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 PCR 검출 결과이고,
도 32는 인위오염 식품에서의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 검출을 위한 ABI 리얼타임 중합효소연쇄반응 검출 결과이며,
도 33은 인위오염 식품에서의 비브리오 파라헤몰리티쿠스 검출을 위한 TMC-1000 리얼타임 중합효소연쇄반응 검출 결과이고,
도 34는 인위오염 식품에서의 리스테리아 모노사이토게네스 PCR 검출 결과이고,
도 35는 인위오염 식품에서의 리스테리아 모노사이토게네스 검출을 위한 ABI 리얼타임 중합효소연쇄반응 검출 결과이며,
도 36은 인위오염 식품에서의 리스테리아 모노사이토게네스 검출을 위한 TMC-1000 리얼타임 중합효소연쇄반응 검출 결과이고,
도 37은 인위오염 식품에서의 살모넬라 속 균주 PCR 검출 결과이고,
도 38은 인위오염 식품에서의 살모넬라 속 균주 검출을 위한 ABI 리얼타임 중합효소연쇄반응 검출 결과이고,
도 39은 인위오염 식품에서의 바실러스 세레우스 PCR 검출 결과이고,
도 40은 인위오염 식품에서의 바실러스 세레우스 검출을 위한 ABI 리얼타임 중합효소연쇄반응 검출 결과이며,
도 41은 인위오염 식품에서의 열시니아 엔테리콜리티카 PCR 검출 결과이고,
도 42는 인위오염 식품에서의 열시니아 엔테리콜리티카 검출을 위한 ABI 리얼타임 중합효소연쇄반응 검출 결과이고,
도 43은 인위오염 식품에서의 열시니아 엔테리콜리티카 검출을 위한 TMC-1000 리얼타임 중합효소연쇄반응 검출 결과이며,
도 44는 인위오염 식품에서의 쉬겔라 속 균주 PCR 검출 결과이고,
도 45는 인위오염 식품에서의 쉬겔라 속 균주 검출을 위한 ABI 리얼타임 중합효소연쇄반응 검출 결과이다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1 : 대장균 O157 : H7
대장균 O157:H7 병원성 균을 탐지할 수 있도록 설계 및 합성한 병원성 미생물 검출용 PCR 프라이머를 하기 표 7에 기재하였다.
방향 Primer sequence(5' → 3') 증폭산물의 크기
Forward GAT AGA CTT TTC GAC CCA ACA AAG
Reverse CCG ATG TGG TCC CCT GAG 101
GCC CTC GTA TAT CCA CAG CA 158
TTG CTC AAT AAT CAG ACGAAG ATG 208
TTG CCG TAT TAA CGA ACC CG 245
CGT TGT CAC ACC GGG CAC TGA 304
GAC ACG TTG CAG AGT GGT ATA ACT 349
GAA CTC CAT TAA CGC CAG ATA TGA T 424
AAG CGT AAG GCT TCT GCT GTG 501
CCC AGT TCA GAG TGA GGT CCA 596
CCC CAC TCT GAC ACC ATC CT 625
GAT GAT GGC AAT TCA GTA TAA CGG 719
TCA TTC CAC GGC GCG AAC 750
대장균 O157:H7에 대하여 제작된 상기 표 7의 다양한 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행한 결과를 도 1에 나타내었다.
상기 PCR은 대장균 0157:H7의 chromosomal DNA를 주형으로 하였으며, 상기 DNA의 추출은 하기의 Colum 추출법으로 추출하였다.
상기 Colum 추출법은 우선, 상기 대장균 O157:H7을 8시간 배양한 진탕배양액 1 ml을 취하여 1.5 ml 튜브에 옮겨 12,000 rpm에서 5분간 원심 분리한 후에, 상층액을 버리고, 펠렛(pellet)에 300 ul의 lysis A buffer(Food& Feed DNA Extraction kit, KoGeneBioTech, 대한민국), 30 ul의 lysis B buffer(Food& Feed DNA Extraction kit, KoGeneBioTech, 대한민국)를 첨가하여 펠렛을 녹였다. 상기 펠렛을 녹인 후에, 65 ℃ 항온 수조(water bath)에서 1시간 동안 반응을 시키고, 상기 lysis buffer와 동량(330 ul)의 클로로포름(chloroform)을 첨가하고 볼텍싱(vortex)을 수행한 후에, 상기 혼합액을 12,000 rpm에서 10분간 원심 분리하였다. 상기 원심분리를 수행한 후에 200 ul의 상층액을 취하여 새로운 1.5 ml 튜브에 담고, 200 ul의 binding buffer와 200 ul의 isopropyl alcohol를 첨가하고 혼합한 후에, 상기 혼합액 600 ul를 컬럼 튜브(column tube, 코스모진텍, 대한민국)에 넣고, 12,000 rpm에서 2분간 원심 분리한 후에, collection tube를 비운 후 600 ul의 Wash buffer를 첨가하고 12,000 rpm에서 2분간 원심 분리하고 다시 collection tube를 비운 후 500 ul의 Wash buffer를 첨가하고, 2,000 rpm에서 2분간 원심 분리한 후에, collection tube를 비운 후 12,000 rpm에서 3분간 원심 분리하였다. 상기 원심분리를 수행한 후에, 150 ul의 TE buffer를 첨가하고 8,000 rpm에서 3분간 원심 분리하여, DNA 용출액을 수집하였다.
상기 중합효소연쇄반응은 하기 표 8의 조성물 및 표 9의 조건으로 수행하였다.
중합효소연쇄반응 조성물의 조성
농도 사용량(ul)
주형(10ng/ul) 5 ng 5
Primer (F,R) 5pmole/ul 20 pmole 4
50X ROX 0.4
2X SYBR Green IPremix Ex Taq 10
D.W. 0.6
합계 20
중합효소연쇄반응 Running 조건
Temperature Cycle number
Denaturation 94 ℃ / 5 min 1
Amplification 94 ℃ / 30 sec 35
60 ℃ / 30 sec
72 ℃ / 30 sec
Final Extension 72 ℃ / 5 min 1
Analysis Denaturation 94 ℃ / 2 mim 1
Annealing 60 ℃ / 15 sec 1
Data collection 60 ℃ to 94 ℃ 19 min 59 sec
Denaturation 94 ℃ / 15 sec 1
상기 도 1의 M은 100bp Size marker, 레인 1 과 2는 101bp 프라이머 세트로 PCR한 것이고 레인 3 과 4는 158bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 5 와 6는 208bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 7 과 8는 245bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 9 와 10은 304bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 11 과 12는 349bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 13 과 14는 424bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 15 와 16은 501bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 17 과 18은 596bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 19 와 20는 625bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 21 와 22는 719bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 23 과 24는 750bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이다.
또한, 도 1의 홀수 레인의 경우는 E. coli KCTC1457 에서 추출된 Chromosomal DNA를 주형으로 사용하였고, 짝수 레인의 경우 대장균 O157:H7 에서 추출된 Chromosomal DNA를 주형으로 사용한 것이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, PCR 산물의 크기가 101 bp, 208 bp, 304 bp, 625 bp의 프라이머 쌍의 경우, 정상적인 PCR 반응을 확인할 수 있었으나, 158 bp, 349 bp, 596 bp, 719 bp, 750 bp의 프라이머 쌍은 E. coli KCTC1457를 주형으로 한 경우에도, 비특이적 PCR 산물이 관찰됨으로써 적합하지 않은 것으로 판단되었다. 또한, 245 bp, 424 bp, 501 bp의 프라이머 쌍은 대장균 O157:H7를 주형으로 한 경우에 증폭산물이 전혀 관찰되지 않음을 확인할 수 있었다. 따라서, 최종적으로 101 bp, 208 bp, 304 bp, 625 bp 사이즈를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 선별하였다.
상기 선별된 4종의 프라이머 쌍을 대상으로 리얼타임 중합효소연쇄반응을 수행하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
상기 리얼타임 중합효소연쇄반응은 하기 표 10의 조성물 및 표 11의 조건으로 수행하였다.
중합효소연쇄반응 조성물의 조성
농도 사용량(ul)
주형(10ng/ul) 5 ng 5
Primer (F,R) 5pmole/ul 20 pmole 4
50X ROX 0.4
2X SYBR Green I Premix Ex Taq 10
D.W. 0.6
합계 20
중합효소연쇄반응 Running 조건
Temperature Cycle number
Denaturation 94 ℃ / 5 min 1
Amplification 94 ℃ / 30 sec 35
60 ℃ / 30 sec
72 ℃ / 30 sec
Final Extension 72 ℃ / 5 min 1
Analysis Denaturation 94 ℃ / 2 mim 1
Annealing 60 ℃ / 15 sec 1
Data collection 60 ℃ to 94 ℃ 19 min 59 sec
Denaturation 94 ℃ / 15 sec 1
상기 도 2의 A, C에서 나타난 바와 같이, 101 bp와 304 bp 사이즈를 증폭시킬 수 있는 프라이머는 E. coli KCTC1457에서 피크가 생성되지 않고 정상적인 반응을 나타낸 반면, B에서 나타난 바와 같이, 208 bp 사이즈를 증폭시킬 수 있는 프라이머는 대장균 O157:H7과 동일한 Tm 값을 나타내었다. 또한 D에서 나타난 바와 같이, 625 bp 사이즈를 증폭시킬 수 있는 프라이머는 primer dimer에서 반응을 나타냈기 때문에 부적절한 것으로 확인되었다.
따라서, 상기 101 bp와 304 bp 사이즈를 증폭시킬 수 있는 프라이머를 대장균 O157:H7의 SYBR Green I system에 사용가능한 프라이머 쌍으로 선별되었다. 상기 101 bp의 Tm 값은 79.2 ℃, 304 bp의 Tm 값은 83.4 ℃ 이다.
실시예 2 : 스타필로코커스 아우레우스 ( Staphylococcus aureus )
스타필로코커스 아우레우스 병원성 균을 탐지할 수 있도록, 설계 및 합성한 병원성 미생물 검출용 PCR 프라이머를 하기 표 12에 기재하였다.
스타필로코커스 아우레우스 프라이머의 제작
방향 Primerr sequence(5' → 3') 증폭산물의 크기
Forward AAT TTA ACA GCT AAA GAG TTT GGT
Reverse TTC CCA CTA AAT GTG TTT CAT AA 122
TAA AAA TAC TTG AAC ACT TTC AT 200
TTC ATT AAA GAA AAA GTG TAC GAG 265
TAT CAA AGA ACC AAC CAT TAC C 388
CTT TAT GGA ATC CAG TAT CTT CAA 430
ACG TAT CTT CCA TGA ATG ATC TAA 517
ACG TAT CTT CCA TGA ATG ATC TAA 622
스타필로코커스 아우레우스에 대하여 제작된 상기 표 12의 다양한 프라이머 세트를 이용하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 PCR을 수행한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3의 M은 100bp Size marker, 레인 1 과 2는 122bp 프라이머 세트로 PCR한 것이고 레인 3 과 4는 200bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 5 와 6는 265bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 7 과 8는 388bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 9 와 10은 430bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 11 과 12는 517bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 13 과 14는 622bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이다.
또한, 도 3의 홀수 레인의 경우는 Staphylococcus cohnii KCTC3574을 사용하고 짝수 레인의 경우 스타필로코커스 아우레우스 KCTC1927에서 추출된 Chromosomal DNA를 주형으로 사용한 것이다.
상기 도 3에 나타낸 바와 같이, PCR 산물의 크기가 122 bp, 265 bp, 622 bp인 프라이머 쌍들은 비특이적 증폭 없이 정상적인 PCR 반응을 나타내었고, 200 bp, 388 bp, 517 bp 프라이머 쌍들은 Staphylococcus cohnii KCTC3574를 주형으로 한 경우에도, 비특이적 PCR 산물이 관찰됨으로써 적합하지 않은 것으로 판단되었다. 또한, 430 bp의 프라이머 쌍은 PCR 산물이 전혀 관찰되지 않았다. 따라서 스타필로코커스 아우레우스에 대한 검출용 프라이머로서 122 bp, 265 bp, 622 bp의 세 가지 프라이머 쌍을 선별하였다.
상기 선별된 3종의 프라이머 쌍을 이용하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 리얼타임 중합효소연쇄반응을 수행하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
상기 도 4의 A에서 나타낸 바와 같이, 122 bp 사이즈를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍은 프라이머 다이머(primer dimmer)의 증폭이 약하게 나타났으며, B에서 나타난 바와 같이, 265 bp 사이즈를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍은 비특이적 증폭을 나타내었다. C에 나타난 바와 같이, 622 bp 사이즈를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍은 프라이머 다이머나 비특이적 반응 없이 정상적인 반응이 진행되었으며, Tm 값이 80.8 ℃로 측정되어 SYBR Grenn I 시스템에 사용가능한 프라이머 쌍으로 선별되었다.
실시예 3 : 바실러스 세레우스 ( Bacillus cereus )
바실러스 세레우스 병원성 균을 탐지할 수 있도록, 설계 및 합성한 병원성 미생물 검출용 PCR 프라이머를 하기 표 13에 기재하였다.
바실러스 세레우스 프라이머의 제작
방향 Primerr sequence(5' → 3') 증폭산물의 크기
Forward GAC TAC ATT CAC GAT TAC GCA GAA
Reverse GAA CTG AAT AGC GTG TAA GTC T 130
GTA GAC CAA TTG TTG CTT GTA ATG G 164
CTA TGC TGA CGA GCT ACA TCC ATA 303
AAA TAC ACA TGC AAA TGC TCC G 389
AAT CCT TTC AAA GGT AGA AGA CC 441
TCC CGC TTG CCT TTT CAT AC 520
TTC CTA AAC TTG CAC CAT CTC GG 640
CTA AGT CTC ATT TTG TCG CCC T 800
바실러스 세레우스에 대하여 제작된 상기 표 13의 다양한 프라이머 세트를 이용하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 PCR을 수행한 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5의 M은 100bp Size marker, 레인 1 과 2는 164bp 프라이머 세트로 PCR한 것이고 레인 3 과 4는 130bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 5 와 6는 303bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 7 과 8는 389bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 9 와 10은 441bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 11 과 12는 520bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 13 과 14는 640bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 15 와 16은 800bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이다.
또한, 도 5의 홀수 레인의 경우는 Bacillus subtilis KCTC3013에서 추출된 Chromosomal DNA를 주형으로 사용하였으며, 짝수 레인의 경우 바실러스 세레우스 KCTC1661에서 추출된 Chromosomal DNA를 주형으로 사용하였다.
상기 도 5에 나타낸 바와 같이, PCR 산물의 크기가 164 bp, 303 bp, 640 bp인 프라이머 쌍들은 비특이적 증폭 없이 정상적인 PCR 반응을 나타내었으나, PCR 산물의 크기가 130 bp, 389 bp, 520 bp인 프라이머는 Bacillus subtilis KCTC3013를 주형으로 한 경우에도, 비특이적 PCR 산물이 관찰됨으로써 적합하지 않은 것으로 판단되었다. 또한, PCR 산물의 크기가 441 bp, 800 bp인 프라이머 쌍은 PCR 산물이 전혀 관찰되지 않았다. 따라서, 바실러스 세레우스에 대한 검출용 프라이머로서 164 bp, 303 bp, 640 bp의 세 가지 프라이머 쌍을 선별하였다.
상기 선별된 3종의 프라이머 쌍을 이용하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 리얼타임 중합효소연쇄반응을 수행하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
상기 도 6의 A와 B에서 나타낸 바와 같이, 164 bp 및 303 bp 사이즈를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍은 Bacillus subtilis KCTC3013과 바실러스 세레우스 KCTC1661에서 동일한 Tm 값을 나타내며 증폭되어 시스템에 적절하지 못한 프라이머로 판정되었다. C에 나타난 바와 같이, 640 bp 사이즈를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍은 정상적인 증폭을 나타내어, SYBR Grenn I 시스템에 사용가능한 프라이머 쌍으로 선별되었으며, Tm 값은 82.7 ℃이었다.
실시예 4 : 비브리오 파라헤몰리티커스( Vibrio parahaemolyticus )
비브리오 파라헤몰리티커스 병원성 균을 탐지할 수 있도록, 설계 및 합성한 병원성 미생물 검출용 PCR 프라이머를 하기 표 14에 기재하였다.
비브리오 파라헤몰리티커스 프라이머의 제작
방향 Primerr sequence(5' → 3') 증폭산물의 크기
Forward CTC ATT TGT ACT GTT GAA CGC CTA
Reverse AGG CGT CAT TGT TAT CAG AAG C 91
TCA TGA GCA GAG GCG TCA TTG 101
TAC TAC TGG CGC TTC TGG TTC 167
CAG CAG TAC GCA AAT CGG TAG TAA 267
AAT AGA AGG CAA CCA GTT GTT GAT 375
TGT CCG CCA GTG GCA AT 456
TGG ATC ATT TTG ACC TGC GAA A 543
AGA TGC TAC TTT AAT CTT CAT GCT GG 593
GAC TGC CAT TCA TTT GAT GAT AGC 688
비브리오 파라헤몰리티커스에 대하여 제작된 상기 표 14의 프라이머 세트를 이용하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 PCR을 수행한 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7의 M은 100bp Size marker, 레인 1 과 2는 91bp 프라이머 세트로 PCR한 것이고 레인 3 과 4는 101bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 5 와 6는 167bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 7 과 8는 304bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 9 와 10은 375bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 11 과 12는 456bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 13 과 14는 543bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 15 와 16은 688bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이다.
또한 도 7의 홀수 레인의 경우는 Vibrio alginolyticus KCCM40513에서 추출된 Chromosomal DNA를 주형으로 사용하였으며, 짝수 레인의 경우 비브리오 파라헤몰리티커스 KCCM41654에서 추출된 Chromosomal DNA를 주형으로 사용하였다.
상기 도 7에 나타낸 바와 같이, PCR 산물의 크기가 91 bp, 101 bp, 167 bp, 375 bp, 688 bp 인 프라이머 쌍들은 비특이적 증폭 없이 정상적인 PCR 반응을 나타내었으나, PCR 산물의 크기가 304 bp인 프라이머는 Vibrio alginolyticus KCCM40513를 주형으로 한 경우에도, 비특이적 PCR 산물이 관찰됨으로써 적합하지 않은 것으로 판단되었다. 또한, PCR 산물의 크기가 456 bp인 프라이머는 PCR 산물이 전혀 관찰되지 않았다. 따라서, 91 bp, 101 bp, 167 bp, 375 bp, 688 bp 인 프라이머 쌍을 선별하였다.
상기 선별된 5종의 프라이머 쌍을 이용하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 리얼타임 중합효소연쇄반응을 수행하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
상기 도 8의 A, B, D에서 나타낸 바와 같이, 91 bp, 101 bp, 및 375 bp 사이즈를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍은 Vibrio alginolyticus KCCM40513과 비브리오 파라헤몰리티커스 KCCM41654 모두에서 amplicon의 증폭이 나타났으며, 동일한 Tm 값을 나타낸 반면, C와 E에서 나타낸 바와 같이 167 bp, 및 688 bp 사이즈를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍은 정상적인 증폭을 나타내어, SYBR Grenn I 시스템에 사용가능한 프라이머 쌍으로 선별되었으며, 각각 84.9 ℃, 85.5 ℃의 Tm 값을 나타내었다.
실시예 5 : 리스테리아 모노사이토게네스( Listeria monocytogenes )
리스테리아 모노사이토게네스 병원성 균을 탐지할 수 있도록, 설계 및 합성한 병원성 미생물 검출용 PCR 프라이머를 하기 표 15에 기재하였다.
리스테리아 모노사이토게네스 프라이머의 제작
방향 Primerr sequence(5' → 3') 증폭산물의 크기
Forward CTG GCA CAA AAT TAC TTA CAA CGA
Reverse TGG AGT GCT TAC TGC TTT GTC AG 83
TGC TAC TTT AGG CGC AGG TGT 202
CCA TAA AGC CCA AAT AGT GTC ACC 271
CAT AAT GTC TTG AAC AGA AAC ACC G 304
TTT CAC TTC TGC TTT TGG AGT AGC 400
AAC TAC TGG AGC TGC TTG TTT TTC 451
AGG TGC TGT TTG TTG CTG TGT AG 504
GCA GGA GCT GGT TTT GCA G 539
GTT ACC ACC CCA TGA ATA AGC 800
리스테리아 모노사이토게네스에 대하여 제작된 상기 표 15에 나타낸 바와 같이 정방향 프라이머 1개와, 9가지 다른 역방향 프라이머의 조합으로 총9쌍의 프라이머 세트를 이용하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 PCR을 수행한 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9의 M은 100bp Size marker, 레인 1 과 2는 83bp 프라이머 세트로 PCR한 것이고 레인 3 과 4는 202bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 5 와 6는 271bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 7 과 8는 304bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 9 와 10은 400bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 11 과 12는 451bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 13 과 14는 539bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 15 와 16은 800bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이다.
또한 도 9의 홀수 레인의 경우는 Listeria grayi ATCC25400 에서 추출된 Chromosomal DNA를 주형으로 사용하였으며, 짝수 레인의 경우 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC86152에서 추출된 Chromosomal DNA를 주형으로 사용하였다.
상기 도 9에 나타낸 바와 같이, PCR 산물의 크기가 83 bp, 451 bp, 800 bp인 프라이머 쌍들은 비특이적 증폭 없이 정상적인 PCR 반응을 나타내었으나, PCR 산물의 크기가 271 bp, 271 bp인 프라이머는 Listeria grayi ATCC25400를 주형으로 한 경우에도, 비특이적 PCR 산물이 관찰됨으로써 적합하지 않은 것으로 판단되었다. 또한, PCR 산물의 크기가 400 bp인 프라이머는 PCR 산물이 전혀 관찰되지 않았다. 또한, PCR 산물의 크기가 202 bp인 프라이머는 PCR 산물의 크기가 예상과 다르게 관찰되어 프라이머 선별에서 탈락시켰다. 따라서, 83 bp, 451 bp, 800 bp 인 프라이머 쌍을 선별하였다.
상기 선별된 3종의 프라이머 쌍을 이용으로, 실시예 1에 기재된 방법으로 리얼타임 중합효소연쇄반응을 수행하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
상기 도 10의 A에서 나타낸 바와 같이, 83 bp 사이즈를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍은 Listeria grayi ATCC25400에서 동일한 Tm 값을 나타내며 peak를 나타내어 부적절한 것으로 판단하였다. C 에서 나타낸 바와 같이, 800 bp 사이즈를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍은 primer dimer가 약하게 peak로 나타나 부적절한 것으로 판단하였다. 이러한 경우에는 프라이머를 다시 제작하면 dimer를 제거할 수 있다. B에서 나타낸 바와 같이 451 bp 사이즈를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍은 정상적인 증폭을 나타내어, SYBR Green I 시스템에 사용가능한 프라이머 쌍으로 선별되었으며, 82.3℃의 Tm 값을 나타내었다.
실시예 6 : 열시니아 엔테리콜리티카( Yersinia entericolitica )
열시니아 엔테리콜리티카 병원성 균을 탐지할 수 있도록, 설계 및 합성한 병원성 미생물 검출용 PCR 프라이머를 하기 표 16에 기재하였다.
열시니아 엔테리콜리티카 프라이머의 제작
방향 Primerr sequence(5' → 3') 증폭산물의 크기
Forward AAT ACC GCA TAA CGT CTT CG
Reverse AGG CGT CAT TGT TAT CAG AAG C 91
GAT TGC GTC AGA AGT CGT CG 150
GCA AAT CGG TAG TAA TAG TGC C 212
CTT CTT CTG CGA GTA ACG TC 330
CGG TAT TCC TCC AGA TCT CTA C 551
GAC TGC CAT TCA TTT GAT GTA AGC 702
열시니아 엔테리콜리티카 에 대하여 제작된 상기 표 16의 프라이머 세트를 이용하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 PCR을 수행한 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11의 M은 100bp Size marker, 레인 1 과 2는 91bp 프라이머 세트로 PCR한 것이고 레인 3 과 4는 150bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 5 와 6는 212bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 7 과 8는 330bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 9 와 10은 551bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 11 과 12는 702bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이다.
또한 도 11의 홀수 레인의 경우는 Citrobacter freundii KCCM11931 에서 추출된 Chromosomal DNA를 주형으로 사용하였으며, 짝수 레인의 경우 열시니아 엔테리콜리티카 KCCM41657에서 추출된 Chromosomal DNA를 주형으로 사용하였다.
상기 도 11에 나타낸 바와 같이, PCR 산물의 크기가 91 bp, 330 bp, 551 bp를 나타내는 프라이머는 쌍들은 비특이적 증폭 없이 정상적인 PCR 반응을 나타내었으나, PCR 산물의 크기가 150 bp, 212 bp인 프라이머는 Citrobacter freundii KCCM11931를 주형으로 한 경우에도, 비특이적 PCR 산물이 관찰됨으로써 적합하지 않은 것으로 판단되었다. 또한, PCR 산물의 크기가 702 bp 증폭용 프라이머는 PCR 산물이 전혀 관찰되지 않았다. 따라서, 330 bp, 551 bp 인 프라이머 쌍을 선별하였다.
상기 선별된 2종의 프라이머 쌍을 이용하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 리얼타임 중합효소연쇄반응을 수행하였으며, 그 결과를 도 12에 나타내었다.
상기 도 12 에서 나타낸 바와 같이, 330bp와 551bp 사이즈를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍은 정상적인 증폭을 나타내어, SYBR Grenn I 시스템에 사용가능한 프라이머 쌍으로 선별되었으며, Tm 값은 각각 는 88.5℃ 및 88.4℃로 나타났다.
실시예 7 : 클로스트리디움 퍼프리젠스( Clostridium perfringens )
클로스트리디움 퍼프리젠스 병원성 균을 탐지할 수 있도록, 설계 및 합성한 병원성 미생물 검출용 PCR 프라이머를 하기 표 17에 기재하였다.
클로스트리디움 퍼프리젠스 프라이머의 제작
방향 Primerr sequence(5' → 3') 증폭산물의 크기
Forward TGA TAT GTC CAA AAA TGA ACC AGA
Reverse TAA GTA GAA CCT AAT TGA AGC 90
TTG TGA TTC CCC TGT GTC AGG 220
TGC CAT TCA TAT CTA GCT AAT GCT 260
TAG TGC ATA GCT TCT CCA AGA TAG A 309
TTT CCT TTC TTC TGC AAA AGT CTC 402
TCC CAA TCA TCC CAA CTA TGA CT 578
CCT GCT GTT CCT TTT TGA GAG 630
TCA CCA CTA GTT GAT ATG TAA GCT 728
클로스트리디움 퍼프리젠스에 대하여 제작된 상기 표 17의 프라이머 세트를 이용하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 PCR을 수행한 결과를 도 13에 나타내었다.
도 13의 M은 100bp Size marker, 레인 1 과 2는 90bp 프라이머 세트로 PCR한 것이고 레인 3 과 4는 220bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 5 와 6는 260bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 7 과 8는 309bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 9 와 10은 402bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 11 과 12는 578bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 13과 14는 630bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 15와 16은 728bp로 PCR 한 것이다.
또한, 도 13의 홀수 레인의 경우는 Camphylobacter jejuni(㈜코젠바이오텍, 대한민국)에서 추출된 Chromosomal DNA를 주형으로 사용하였으며, 짝수 레인의 경우 클로스트리디움 퍼프리젠스(KCCM41773, ㈜코젠바이오텍, 대한민국)에서 추출된 Chromosomal DNA를 주형으로 사용하였다.
상기 도 13에 나타낸 바와 같이, PCR 산물의 크기가 90 bp, 220 bp, 260 bp, 402 bp, 630 bp를 나타내는 프라이머는 쌍들은 비특이적 증폭 없이 정상적인 PCR 반응을 나타내었으나, PCR 산물의 크기가 578 bp, 728 bp 인 프라이머는 Camphylobacter jejuni를 주형으로 한 경우에도, 비특이적 PCR 산물이 관찰됨으로써 적합하지 않은 것으로 판단되었다. 또한, PCR 산물의 크기가 309 bp인 증폭용 프라이머는 PCR 산물이 전혀 관찰되지 않았다. 따라서, 220 bp, 260 bp, 402 bp, 630 bp인 프라이머 쌍을 선별하였다.
상기 선별된 4종의 프라이머 쌍을 이용하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 리얼타임 중합효소연쇄반응을 수행하였으며, 그 결과를 도 14에 나타내었다.
상기 도 14 에서 나타낸 바와 같이, 260bp 사이즈를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍만이 Camphylobacter jejuni와 클로스트리디움 퍼프리젠스 양자 모두 동일한 Tm 값에서 동일한 peak를 나타내어, 이를 제외한 220 bp, 402 bp, 630 bp 사이즈를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍이 SYBR Grenn I 시스템에 사용가능한 프라이머 쌍으로 선별되었으며, Tm 값은 각각 Tm 값은 78.0℃, 80.2 ℃ 및 80.7℃로 나타났다.
실시예 8 : 살모넬라 속 균주( Salmonella spp .)
살모넬라 속 균주 병원성 균을 탐지할 수 있도록, 설계 및 합성한 병원성 미생물 검출용 PCR 프라이머를 하기 표 18에 기재하였다.
살모넬라 속 균주 프라이머의 제작
방향 Primerr sequence(5' → 3') 증폭산물의 크기
Forward GAA TCC TCA GTT TTT CAA CGT TTC
Reverse CCA GAC GAA AGA GCG TGG TAA 60
GAA GCC CGA ACG TGG CGA 137
GTA TGC CCG GTA AAC AGA TGA GT 284
AAA GGA ACC GTA AAG CTG GCT 330
GGG TCA TCC CCA CCG AAA TAC 424
GAT CTG GGC GAC AAG ACC A 551
TAG CCG TAA CAA CCA ATA CAA ATG 678
TAC GTT TTG CTT CAC GGA ATT TAA 787
살모넬라 속 균주에 대하여 제작된 상기 표 18의 프라이머 세트를 이용하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 PCR을 수행한 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15의 M은 100bp Size marker, 레인 1 과 2는 60bp 프라이머 세트로 PCR한 것이고 레인 3 과 4는 137bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 5 와 6는 284bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 7 과 8는 330bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 9 와 10은 424bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 11 과 12는 551bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 13과 14는 678bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 15와 16은 787bp로 PCR 한 것이다.
또한, 도 15의 홀수 레인의 경우는 Shigella sonnei KCCM41282 에서 추출된 Chromosomal DNA를 주형으로 사용하였으며, 짝수 레인의 경우 Salmonella enteritidis KCCM12021에서 추출된 Chromosomal DNA를 주형으로 사용하였다.
상기 도 15에 나타낸 바와 같이, PCR 산물의 크기가 60 bp, 284 bp, 678 bp를 나타내는 프라이머는 비특이적 증폭 없이 정상적인 PCR 반응을 나타내었으나, PCR 산물의 크기가 137 bp, 330 bp, 551 bp인 프라이머는 Shigella sonnei KCCM41282를 주형으로 한 경우에도, 비특이적 PCR 산물이 관찰됨으로써 적합하지 않은 것으로 판단되었다. 또한, PCR 산물의 크기가 424 bp인 증폭용 프라이머는 PCR 산물이 전혀 관찰되지 않았다. 따라서, 60 bp, 284 bp, 678 bp 인 프라이머 쌍을 선별하였다.
상기 선별된 3종의 프라이머 쌍을 이용하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 리얼타임 중합효소연쇄반응을 수행하였으며, 그 결과를 도 16에 나타내었다.
상기 도 16 에서 나타낸 바와 같이, 60bp 사이즈를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍의 경우, Shigella sonnei KCCM41282와 Salmonella enteritidis KCCM12021 양자 모두 동일한 Tm 값에서 동일한 peak를 나타내었으며, 284bp 사이즈를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍의 경우, Shigella sonnei KCCM41282의 경우 증폭 산물이 전혀 관찰되지 아니하였으나, Salmonella enteritidis KCCM12021의 피크의 증폭정도가 약하게 나타났으며, Tm 값은 86.8℃이었고, 678bp 사이즈를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍의 경우, Shigella sonnei KCCM41282의 경우에도 증폭 산물이 관찰되었으나, 그 피크의 증폭정도가 약하며, 75℃미만에 나타났기 때문에 무시할수 있는 것이고, Tm 값이 86.7℃이므로, SYBR Green I 시스템에 사용가능한 프라이머로 선별되었다.
실시예 9 : 쉬겔라 속 균주( Shigella spp . )
쉬겔라 속 균주 병원성 균을 탐지할 수 있도록, 설계 및 합성한 병원성 미생물 검출용 PCR 프라이머를 하기 표 19에 기재하였다.
쉬겔라 속 균주 프라이머의 제작
방향 Primerr sequence(5' → 3') 증폭산물의 크기
Forward GAA TCC TCA GTT TTT CAA CGT TTC
Reverse CTG CAT TCT GGC AAT CTC TTC ACA 110
TTC AAA CTT CCC CCA ACA AGA 201
GCA TCT GAC AGC AAT AGT ACA 355
TGT ACA TCG ATA ATA CCA AAC 445
쉬겔라 속에 대하여 제작된 상기 표 19의 프라이머 세트를 이용하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 PCR을 수행한 결과를 도 17에 나타내었다.
도 17의 M은 100bp Size marker, 레인 1 과 2는 110bp 프라이머 세트로 PCR한 것이고 레인 3 과 4는 201bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 5 와 6는 355bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이고 레인 7 과 8는 445bp 프라이머 세트로 PCR 한 것이다.
또한, 도 17의 홀수 레인의 경우는 Salmonella typhimurium ATCC19585를 사용하고 짝수 레인의 경우 Shigella flexneri ATCC12022에서 추출된 Chromosomal DNA를 주형으로 사용하였다.
상기 도 17에 나타낸 바와 같이, PCR 산물의 크기가 110bp, 355bp, 445bp를 나타내는 프라이머는 비특이적 증폭 없이 정상적인 PCR 반응을 나타내었으나, PCR 산물의 크기가 110 bp primer인 프라이머는 Salmonella typhimurium ATCC19585를 주형으로 한 경우에도, 비특이적 PCR 산물이 관찰됨으로써 적합하지 않은 것으로 판단되었다. 따라서, 110bp, 355bp, 445bp인 프라이머 쌍을 선별하였다.
상기 선별된 3종의 프라이머 쌍을 이용하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 리얼타임 중합효소연쇄반응을 수행하였으며, 그 결과를 도 18에 나타내었다.
상기 도 18에 나타낸 바와 같이355 bp 사이즈를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍의 경우, Salmonella typhimurium ATCC19585에서도 약하지만 peak가 관찰되었고, primer의 dimer가 나타난 반면에, PCR 산물의 크기가 110 bp 및 445 bp인 증폭용 프라이머는 Shigella flexneri ATCC12022에서만 단일한 peak를 나타내었고, 445 bp인 증폭용 프라이머의 Tm 값이 80.9℃를 나타내었다. 따라서, 445 bp인 증폭용 프라이머 쌍이 SYBR Grenn I 시스템에 사용가능한 프라이머 쌍으로 선별되었다.
실시예 10: 캠필로박터 제주니( Camphylobacter jejuni )
캠필로박터 제주니 병원성 균을 탐지할 수 있도록, 설계 및 합성한 병원성 미생물 검출용 PCR 프라이머를 하기 표 20에 기재하였다.
캠필로박터 제주니 균주 프라이머의 제작
방향 Primerr sequence(5' → 3') 증폭산물의 크기
Forward ACT TCT TTA TTG CTT GCT GC
Reverse GCC ACA ACA AGT TAA AGA AGC 303
캠필로박터 제주니에 대하여 제작된 상기 표 20의 프라이머 세트를 이용하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 PCR을 수행한 결과를 도 19에 나타내었다.
도 19의 M은 100bp Size marker, 레인 1은 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC19113, 레인 2는 캠필로박터 제주니, 레인 3은 Salmonella choleraesuis KCCM41035, 레인 4 는 대장균 O157:H7, 레인 5는 E. coli KCTC1457, 레인 6은 스타필로코커스 아우레우스 KCTC1916, 레인 7은 바실러스 세레우스 KCTC1661, 레인 8은 Salmonella typhimurium KCTC2421, 레인 9는 스타필로코커스 아우레우스 KCTC1927, 레인 10은 Shigella boydii ATCC12034 그리고 레인 11은 비브리오 파라헤몰리티커스 ATCC11965를 사용하였다.
그 결과, 캠필로박터 제주니에서만 특이적인 303bp밴드를 나타내고 비특이적 증폭 없이 정상적인 PCR 반응을 나타내어 선별되었다.
상기 선별된 표 20의 프라이머 쌍을 이용하여, 실시예 1에 기재된 방법으로 리얼타임 중합효소연쇄반응을 3회 반복하여 수행하였으며, 그 결과를 도 20에 나타내었다.
상기 도 20에 나타낸 바와 같이, 상기 선별된 표 20의 프라이머 쌍의 경우, Tm 값이 80.7℃임이 확인되었다. 따라서, 상기 선별된 표 20의 프라이머 쌍이 SYBR Grenn I 시스템에 사용가능한 프라이머 쌍으로 선별되었다.
실시예 11: Primer modification 에 의한 Tm 값의 변화
SYBR Green I system에서 프라이머의 GC tailing이 Tm 값에 영향을 주는지 알아보기 위하여 살모넬라 속 균주를 탐지할 수 있는 PCR 산물의 크기가 60 bp인 프라이머에 GC를 4 또는 8개 임의로 추가하여 리얼타임 중합효소연쇄반응을 수행하여 그 결과를 도 21 및 하기 표 21에 나타내었다.
상기 중합효소연쇄반응 혼합물의 조성, 반응조건 및 시료 DNA는 상기 실시예 8의 시료 DNA와 실시예 1의 표 10의 조성 및 표 11의 조건을 사용하였다.
살모넬라 속 균주 탐지용 60bp 프라이머를 이용한 GC tailing 변화에 따른 Tm 값 변화 추이
방향 Primerr sequence(5' → 3') Tm 값
A 정향방 GAA TCC TCA GTT TTT CAA CGT TTC 78.4
역방향 CCA GAC GAA AGA GCG TGG TAA
B 정방향 GCGC GAA TCC TCA GTT TTT CAA CGT TTC 80.6
역방향 GCGC CCA GAC GAA AGA GCG TGG TAA
C 정방향 GCGCGCGC GAA TCC TCA GTT TTT CAA CGT TTC 82.5
역방향 GCGCGCGC CCA GAC GAA AGA GCG TGG TAA
상기 도 21 및 표 21에 나타낸 바와 같이, GC를 붙이지 않은 상태의 프라이머 쌍의 Tm 값은 78.4℃이고, GC 4개를 붙인 프라이머 쌍의 Tm 값은 80.6℃로 나타났고, GC 8개를 붙인 프라이머 쌍의 Tm 값은 82.5℃로 나타났다.
상기한 결과로부터, GC가 증가하면 Tm의 온도도 증가하며, 보통 GC 1개(2 bp 추가 tailing)를 추가하는 경우, 평균 0.5℃정도 Tm 값이 증가하는 것을 확인하였으며, 따라서, GC tailing을 통하여 프라이머의 Tm 값을 조절하는 것은 유효하지 않은 것으로 확인되었다.
실시예 12 : SYBR Green I system 적용을 위한 최적 primer 의 선정
병원성 미생물10종에 대하여 고안된 각각의 최적 프라이머쌍들을 이용하여 증폭된 amplicon들에 대한 Tm 값을 표 22에 나타내었다. 상기 표 22에서 서열번호 1 내지 20으로 기재된 프라이머는 단일 중합효소연쇄반응(single PCR) 혹은 다중 중합효소연쇄반응(multiplex PCR) 모두에서 최적의 프라이머 쌍임을 나타낸다.
SYBR Green I system 사용가능한 다양한 프라이머 쌍의 Tm 값
미생물 No primer sequence 증폭산물의 크기 Tm 서열번호
E. coli O157 : H7 E1 GAT AGA CTT TTC GAC CCA ACA AAG 1
E2E3E4E5 CCG ATG TGG TCCCCT GAGTTG CTC AAT AAT CAG ACGAAG ATGCGT TGT CAC ACC GGG CAC TGACCC CAC TCT GAC ACC ATC CT 101 208304625 7983.483.486.2 2212223
S. aureus SA1 AAT TTA ACA GCT AAA GAG TTT GGT 3
SA2SA3SA4 TTC CCA CTA AAT GTG TTT CAT AATTC ATT AAA GAA AAA GTG TAC GAGACG TAT CTT CCA TGA ATG ATC TAA 122265622 80.681.380.9 24254
B. cereus B1 GAC TAC ATT CAC GAT TAC GCA GAA 5
B2B3B4 GTA GAC CAA TTG TTG CTT GTA ATG GCTA TGC TGA CGA GCT ACA TCC ATATTC CTA AAC TTG CAC CAT CTC GG 164303640 80.282.182.7 26276
V. parahaemolyticus V1 CTC ATT TGT ACT GTT GAA CGC CTA 7
V2V3V4V5V6 AGG CGT CAT TGT TAT CAG AAG CTCA TGA GCA GAG GCG TCA TTGTAC TAC TGG CGC TTC TGG TTCAAT AGA AGG CAA CCA GTT GTT GATGAC TGC CAT TCA TTT GAT GAT AGC 91101167375688 81.281.784.985.585.5 282983031
L. monocytogenes L1 CTG GCA CAA AAT TAC TTA CAA CGA 9
L2L3L4 TGG AGT GCT TAC TGC TTT GTC AGAAC TAC TGG AGC TGC TTG TTT TTCGTT ACC ACC CCA TGA ATA AGC 83451800 78.682.382.8 321033
Y. enterocolitica Y1 AAT ACC GCA TAA CGT CTT CG 11
Y2Y3 CTT CTT CTG CGA GTA ACG TCCGG TAT TCC TCC AGA TCT CTA C 330551 8888 1234
C. perfringens C1 TGA TAT GTC CAA AAA TGA ACC AGA 13
C2C3C4C5 TTG TGA TTC CCC TGT GTC AGGTGC CAT TCA TAT CTA GCT AAT GCTTTT CCT TTC TTC TGC AAA AGT CTCCCT GCT GTT CCT TTT TGA GAG 220260402630 7878.38080.6 14353637
Salmonella sp . SAL1 GAA TCC TCA GTT TTT CAA CGT TTC 15
SAL2SAL3SAL4 CCA GAC GAA AGA GCG TGG TAAGTA TGC CCG GTA AAC AGA TGA GTTAG CCG TAA CAA CCA ATA CAA ATG 60284678 78.285.686.7 383916
Shigella sp . SH1 CAG GCA TGA AAT TAA GCC TG 17
SH2SH3SH4 CTG CAT TCT GGC AAT CTC TTC ACAGCA TCT GAC AGC AAT AGT ACATGT ACA TCG ATA ATA CCA AAC 110355445 8180.880.8 404118
C. jejuni CA1 ACT TCT TTA TTG CTT GCT GC 19
CA2 GCC ACA ACA AGT TAA AGA AGC 303 80.7 20
실시예 13: SYBR Green I을 이용한 다중 중합효소연쇄반응( Multiplex PCR using SYBR Green I)
13-1. 다중 중합효소연쇄반응 시스템의 구성( Multiplex PCR system )
상기 표 22에서 최적의 프라이머로 확인된 프라이머를 2그룹으로 나누었다. 제 1그룹으로 구분된 5-Plex PCR system은 대장균 O157:H7, 스타필로코커스 아우레우스, 살모넬라 속 균주, 비브리오 파라헤몰리티커스 및 리스테리아 모노사이토게네스으로 이루어졌고, 제 2그룹으로 구분된 4-Plex PCR system에는 바실러스 세레우스, 쉬겔라 속 균주, 열시니아 엔테리콜리티카 및 클로스트리디움 퍼프리젠스으로 이루어졌다.
또한, 캠필로박터 제주니의 경우는 미소호기성 세균으로 배양방법이 상기 균주들과 달라 단독 중합효소연쇄반응으로 사용되도록 디자인하였다. 각 그룹별로 프라이머 쌍은 Tm 값이 1.8 내지 2℃ 차이가 있도록 선택하였다.
13-2. 제 1그룹
상기 표 22 및 도 22에 나타낸 바와 같이, 대장균 O157:H7의 최적 프라이머인 101 bp 프라이머 쌍은 Tm이 79℃이었고, 208 bp, 304 bp 프라이머 쌍은 Tm이 83.4℃이었으며, 625 bp 프라이머 쌍은 Tm이 86.2℃로 확인되었고, 스타필로코커스 아우레우스의 경우, 122 bp 프라이머 쌍은 Tm이 80.6℃이었고, 265 bp 프라이머 쌍은 Tm이 81.3℃이었으며, 622 bp 프라이머 쌍은 Tm이 80.9℃로 확인되었다.
또한, 살모넬라 속 균주의 경우, 60 bp 프라이머 쌍은 Tm이 78.2℃이었고, 284 bp 프라이머 쌍은 Tm이 85.6℃이었으며, 678 bp 프라이머 쌍은 Tm이 86.7℃으로 확인되었으며, 비브리오 파라헤몰리티커스의 경우, 91 bp 프라이머 쌍은 Tm이 81.2℃이고, 101 bp 프라이머 쌍은 Tm이 81.7℃이며, 167 bp 프라이머 쌍은 Tm이 84.9℃이고, 375 bp 및 688 bp 프라이머 쌍은 Tm이 85.5℃으로 확인되었다.
또한, 리스테리아 모노사이코게네스의 경우는 83 bp 프라이머 쌍은 Tm이 78.6℃이고, 451 bp 프라이머 쌍은 Tm이 82.3 ℃이었으며, 800 bp 프라이머 쌍은 Tm이 82.8℃로 확인되었다.
5-Multiplex PCR 시스템을 개발하기 위해서는 Tm 값이 2℃정도씩 차이가 나는 것이 바람직하기 때문에 Tm 값을 기준으로 대장균 O157:H7은 Tm이 79℃인 101 bp의 프라이머 쌍을, 스타필로코커스 아우레우스는 Tm이 80.9℃인 622 bp의 프라이머 쌍을, 살모넬라 속 균주는 Tm이 86.7℃인 678 bp의 프라이머 쌍을, 비브리오 파라헤몰리티커스는 Tm이 84.9℃인 167 bp의 프라이머 쌍을, 리스테리아 모노사이토게네스는 Tm이 82.3℃인 451 bp의 프라이머 쌍을 선택하였으며, 최종 선택된 프라이머 염기서열은 하기 표 23에 명시하였다.
13-3. 제 2그룹
상기 표 22 및 도 23에 나타낸 바와 같이, 바실러스 세레우스는 164 bp 프라이머 쌍은 Tm이 80.2℃이었으며, 303 bp 프라이머 쌍은 Tm이 82.1℃로 확인되었고, 640 bp 프라이머 쌍은 Tm이 82.7℃이었고, 쉬겔라 속 균주는 113 bp 프라이머 쌍은 Tm이 81℃이었으며, 355 bp 및 445 bp 프라이머 쌍은 Tm이 80.8℃ 인 것으로 확인되었다.
또한, 열시니아 엔테리콜리티카는 330 bp 및 551 bp 프라이머 쌍 모두 Tm이 88℃이었으며, 클로스트리디움 퍼프리젠스의 경우, 220 bp 프라이머 쌍은 Tm이 78℃로 확인되었고, 260 bp 프라이머 쌍은 Tm이 78.3℃이었고, 402 bp 프라이머 쌍은 Tm이 80℃이며, 630 bp 프라이머 쌍은 Tm이 80.6℃인 것으로 확인되었다.
4-Multiplex PCR 시스템을 개발하기 위해서는 Tm 값이 2℃ 이상의 차이가 나타내는 것이 바람직하기 때문에 Tm 값을 기준으로 바실러스 세레우스는 Tm이 82.7℃인 640 bp 의 프라이머 쌍을, 쉬겔라 속 균주는 Tm이 80.8℃인 445 bp 의 프라이머 쌍을, 열시니아 엔테리콜리티카는 Tm이 88℃인 330 bp의 프라이머 쌍을, 클로스트리디움 퍼프리젠스는 Tm이 78℃인 220 bp 의 프라이머 쌍을, 선택하였으며, 최종 선택된 프라이머 염기서열은 하기 표 23에 명시하였다.
동시분석을 위하여 사용되는 SYBR Green I 시스템에서의 최적 프라이머 쌍
미생물 Primerr sequence(5' → 3') 서열번호 증폭산물의 크기 Tm
E. coli O157 : H7 F GAT AGA CTT TTC GAC CCA ACA AAG 1 101 79
R CCG ATG TGG TCCCCT GAG 2
S. aureus F AAT TTA ACA GCT AAA GAG TTT GGT 3 622 80.9
R ACG TAT CTT CCA TGA ATG ATC TAA 4
B. cereus F GAC TAC ATT CAC GAT TAC GCA GAA 5 640 82.7
R TTC CTA AAC TTG CAC CAT CTC GG 6
V. parahaemolyticus F CTC ATT TGT ACT GTT GAA CGC CTA 7 167 84.9
R TAC TAC TGG CGC TTC TGG TTC 8
L. monocytogenes F CTG GCA CAA AAT TAC TTA CAA CGA 9 451 82.3
R AAC TAC TGG AGC TGC TTG TTT TTC 10
Y. enterocolitica F AAT ACC GCA TAA CGT CTT CG 11 330 88
R CTT CTT CTG CGA GTA ACG TC 12
C. perfringens F TGA TAT GTC CAA AAA TGA ACC AGA 13 220 78
R TTG TGA TTC CCC TGT GTC AGG 14
Salmonella spp F GAA TCC TCA GTT TTT CAA CGT TTC 15 678 86.7
R TAG CCG TAA CAA CCA ATA CAA ATG 16
Shigella spp F CAG GCA TGA AAT TAA GCC TG 17 445 80.8
R TGT ACA TCG ATA ATA CCA AAC 18
C. jejuni F ACT TCT TTA TTG CTT GCT GC 19 303 80.7
R GCC ACA ACA AGT TAA AGA AGC 20
13-4. SYBR green I을 이용한 multiplex PCR 조건 확립
상기 실시예 13-2의 제 1그룹(5-plex)과 상기 실시예 13-3의 제2그룹(4-plex) 두 그룹의 프라이머의 최소농도를 알아보기 리얼타임 중합효소연쇄반응을 실시하고, 그 결과를 도 24 및 도 25에 나타내었다.
상기 중합효소연쇄반응은 7700 리얼타임 중합효소연쇄반응 기기(ABI사, USA)를 이용하여 실시하였으며, 중합효소연쇄반응 조성물(Mixture)의 조성 및 반응조건은 상기 표 3의 조성 및 표 5의 조건에 의하였으나, 다중 프라이머(Multi-primer)의 조건을 확립하기 위해 상기 실시예 13-2의 제1그룹과 상기 실시예 13-3의 제 2그룹의 프라이머를 2 pmol/ul로 희석하였으며, SYBR green I system에 사용된 시료 DNA 즉, 주형 DNA는 동일하게 10 ng/ul의 농도로 만들어 사용하였다.
상기 중합효소연쇄반응을 실시한 결과를 도 24 및 도 25에 나타내었다. 상기 도 24에서 1은 대장균 O157:H7, 2는 스타필로코커스 아우레우스, 3은 리스테리아 모노사이토게네스, 4는 비브리오 파라헤몰리티커스 및 5는 살모넬라 속 균주 즉, 살모넬라 엔터리티디스(Salmonella enteritidis)를 나타낸다. 상기 도 25에서 1은 클로스트리디움 퍼프리젠스, 2는 쉬겔라 속 균주 즉, 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 3은 바실러스 세레우스 및 4는 열시니아 엔테리콜리티카를 나타낸다.
상기 도 24 및 도 25에 나타난 바와 같이, 실시예 13-2의 제1그룹과 상기 실시예 13-3의 제 2그룹의 각각의 프라이머는 각각 예상된 값과 동일한 단일의 Tm 값(single Tm)을 나타내어 동시분석이 가능함을 보여주었다. 보다 상세하게는, 상기 도 24에서 대장균 O157:H7은 Tm값이 79℃이었고, 스타필로코커스 아우레우스는 Tm값이 80.9℃이었으며, 리스테리아 모노사이토게네스는 Tm값이 82.3℃이었고, 비브리오 파라헤몰리티커스는 Tm값이 84.9℃이었으며, 살모넬라 속 균주 즉, 살모넬라 엔터리티디스(Salmonella enteritidis)는 Tm값이 86.7℃이었다. 또한, 상기 도 25에서 클로스트리디움 퍼프리젠스는 Tm값이 78℃이었고, 쉬겔라 속 균주 즉, 쉬겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)는 Tm값이 80.8℃이었으며, 바실러스 세레우스는 Tm값이 82.7℃이었고, 열시니아 엔테리콜리티카는 Tm값이 88℃이었다.
상기 도 24 및 도 25에서 알 수 있듯이, 각각의 프라이머 쌍은 단 하나의 peak만을 나타내었으며, 그 Tm값이 각각 구분될 수 있는 단일의 Tm값으로 나타나 여러균주의 동시분석이 가능함을 보여주었다.
실시예 14: 오염된 식품에서 SYBR Green I PCR system 을 이용한 병원성 미생물의 검출
SYBR Green I system을 이용하여 식품에서 오염된 병원성 미생물을 검출여부를 직접 확인하기 위하여, 특정 식품에 인위적으로 병원성 미생물을 감염(spiking)시킨 뒤, 12시간 또는 음식의 종류 및 병원성 미생물에 따라 적정하게 변형된 시간 동안 미생물을 배양하였다. 상기 배양된 미생물의 검출정도를 SYBR green I PCR system을 이용하여 검사하였다. 실시예 14에서 적용된 병원성 미생물과 적용 식품군을 하기 표 24에 기재하였다.
음식 종류 및 감염시킨 병원성 미생물
Group 병원성 미생물 Food
Group I 대장균 O157:H7 햄버거 패티 분쇄가공계육
스타필로코커스 아우레우스 순대 김밥
비브리오 파라헤몰리티커스 해수 새우
리스테리아 모노사이토게네스 샐러드 아이스크림
살모넬라 속 균주 냉동 닭 샐러드
Group II 바실러스 세레우스 된장 고추장
열시니아 엔테리콜리티카 생수 우유
쉬겔라 속 균주 먹는샘물 굴
상기 미생물의 검출정도를 확인하기 위한 실험은 상기 식품으로부터 시료 DNA를 추출한 후, ABI 7700 또는 삼성 TMC-1000(㈜삼성테크원, 대한민국)을 이용하여 중합효소연쇄반응을 수행하였으며, 중합효소연쇄반응을 위한 조성물(Mixture)의 조성 및 반응조건은 상기 표3 내지 표 6에 의하였다. 상기 시료 DNA의 추출은 하기와 같은 방법으로 수행하였다.
상기 표 24의 식품검체에서 25g을 체취한 후, 225ml의 균주별 종균배지에 접종하여 8시간 배양하고, 상기 배양액 1ml를 1.5ml tube에 넣어 12,000rpm에서 5분간 원심분리하였다. 상기 원심분리한 배양액에서 상등액을 제거하고 침전물을 100ul의 Dnase free waater에 현탁한 후, 95℃에서 20분간 열처리하고 10,000rpm에서 10분간 재 원심분리하였다. 상기 원심분리된 혼합액으로부터 DNA를 회수하여 상기 시료 DNA를 추출하였다.
14-1. 대장균 O157 : H7 ( primer 101 bp )
대장균 O157:H7에 오염된 식품군들에 대해 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 쌍을 이용하여 각각 컨벤셔널 중합효소연쇄반응 및 리얼타임 중합효소연쇄반응을 수행하였으며, 리얼타임 중합효소연쇄반응은 ABI 7700 리얼타임 중합효소연쇄반응 기기 및 TMC-1000 리얼타임 중합효소연쇄반응 기기를 이용하여 수행하였고, 각각의 결과를 도 26 내지 28에 나타내었다. 상기 도 26의 각 레인은 하기와 같다.
레인 M : 사이즈마커(Size marker)
N: 음성 대조군(DNA 포함하지 않음)
1: 대장균 O157:H7 105 CFU/㎖ - 햄버거 패티
2: 대장균 O157:H7 105 CFU/㎖ - 분쇄가공 닭고기
3: 스타필로코커스 아우레우스 KCTC1927 105 CFU/㎖ - 순대
4: 스타필로코커스 아우레우스 KCTC1927 105 CFU/㎖ - 김밥
5: 비브리오 파라헤몰리티커스 KCCM41654 105 CFU/㎖ - 해수
6: 비브리오 파라헤몰리티커스 KCCM41654 105 CFU/㎖ - 새우
7: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC86152 105 CFU/㎖ - 샐러드
8: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC86152 105 CFU/㎖ - 아이스크림
9: 살모넬라 엔터리티디스 KCCM12021 105 CFU/㎖ - 냉동 닭
10: 살모넬라 엔터리티디스 KCCM12021 105 CFU/㎖ - 샐러드
11: 바실러스 세레우스 KCTC1661 105 CFU/㎖ - 된장
12: 바실러스 세레우스 KCTC1661 105 CFU/㎖ - 고추장
13: 열시니아 엔테리콜리티카KCCM41657 105 CFU/㎖ - 생수
14: 열시니아 엔테리콜리티카KCCM41657 105 CFU/㎖ - 우유
15: 쉬겔라 플렉스네리 ATCC12022 105 CFU/㎖ - 먹는 샘물
16: 쉬겔라 플렉스네리 ATCC12022 105 CFU/㎖ - 굴
P: 양성 대조군 (E.coli O157:H7 105 CFU/㎖)
상기 도 26에서 나타낸 바와 같이, 대장균 O157:H7를 접종한 식품과 양성대조군에서만 정확한 크기의 밴드(band)가 확인되었으며, 상기 도 27에 나타난 바와 같이, ABI 7700 기기를 이용한 SYBR green I PCR 산물의 Tm 값이 79.1℃의 Tm 값으로 나타났다. 보다 상세하게는, 대장균 O157:H7 PCR 산물의 Tm 값은 1차 식품의 분석결과에서 79.2℃를 나타냈고, 2차 식품의 분석결과에서 79.1℃를 나타냈다. 상기 결과로부터, ABI 7700을 이용한 SYBR Green I system의 오차 범위는 ± 0.2℃임이 확인되었으며, TMC-1000를 이용한 경우에는 오차 범위 즉, 1차 식품과 2차 식품간의 Tm 값의 차이가 ±1℃임이 확인되었다.
14-2. 스타필로코커스 아우레우스(622 bp primer )
스타필로코커스 아우레우스에 오염된 식품군들에 대해 서열번호 3 및 서열번호 4의 프라이머 쌍을 이용하여 각각 컨벤셔널 중합효소연쇄반응 및 리얼타임 중합효소연쇄반응을 수행하였으며, 리얼타임 중합효소연쇄반응은 ABI 7700 리얼타임 중합효소연쇄반응 기기를 이용하여 수행하였고, 각각의 결과를 도 29 및 도 30에 나타내었다. 상기 도 29의 각 레인은 하기와 같다.
레인 M : 사이즈마커(Size marker)
N: 음성 대조군(DNA 포함하지 않음)
1: 대장균O157:H7 105 CFU/㎖ - 햄버거 패티
2: 대장균O157:H7 105 CFU/㎖ - 분쇄가공 닭고기
3: 스타필로코커스 아우레우스KCTC1927 105 CFU/㎖ - 순대
4: 스타필로코커스 아우레우스KCTC1927 105 CFU/㎖ - 김밥
5: 비브리오 파라헤몰리티커스 KCCM41654 105 CFU/㎖ - 해수
6: 비브리오 파라헤몰리티커스 KCCM41654 105 CFU/㎖ - 새우
7: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC86152 105 CFU/㎖ - 샐러드
8: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC86152 105 CFU/㎖ - 아이스크림
9: 살모넬라 엔터리티디스 KCCM12021 105 CFU/㎖ - 냉동 닭
10: 살모넬라 엔터리티디스 KCCM12021 105 CFU/㎖ - 샐러드
11: 바실러스 세레우스 KCTC1661 105 CFU/㎖ - 된장
12: 바실러스 세레우스 KCTC1661 105 CFU/㎖ - 고추장
13: 열시니아 엔테리콜리티카KCCM41657 105 CFU/㎖ - 생수
14: 열시니아 엔테리콜리티카KCCM41657 105 CFU/㎖ - 우유
15: 쉬겔라 플렉스네리 ATCC12022 105 CFU/㎖ - 먹는 샘물
16: 쉬겔라 플렉스네리 ATCC12022 105 CFU/㎖ - 굴
P: 양성 대조군 (스타필로코커스 아우레우스KCTC1927 105 CFU/㎖)
상기 도 29에서 나타낸 바와 같이, 대장균 O157:H7를 접종한 식품과 양성대조군에서만 정확한 크기의 밴드(band)가 확인되었으며, 상기 도 30에 나타난 바와 같이, ABI 7700 기기를 이용한 SYBR green I PCR 산물의 Tm 값이 80.8℃의 Tm 값으로 나타났다. 보다 상세하게는, 산물의 Tm 값은 1차 식품 및 2차 식품의 분석결과에서 모두 80.8℃인 것으로 나타나, ABI 7700을 이용한 SYBR Green I system의 오차 범위는 ± 0℃인 것으로 확인되었다.
14-3. 비브리오 파라헤몰리티커스 (167 bp primer )
비브리오 파라헤몰리티커스에 오염된 식품군들에 대해 서열번호 7 및 서열번호 8의 프라이머 쌍을 이용하여 각각 컨벤셔널 중합효소연쇄반응 및 리얼타임 중합효소연쇄반응을 수행하였으며, 리얼타임 중합효소연쇄반응은 ABI 7700 리얼타임 중합효소연쇄반응 기기 및 TMC-1000 리얼타임 중합효소연쇄반응 기기를 이용하여 수행하였고, 각각의 결과를 도 31 내지 33에 나타내었다. 상기 도 31의 각 레인은 하기와 같다.
레인 M : 사이즈마커(Size marker)
N: 음성 대조군(DNA 포함하지 않음)
1: 대장균O157:H7 105 CFU/㎖ - 햄버거 패티
2: 대장균O157:H7 105 CFU/㎖ - 분쇄가공 닭고기
3: 스타필로코커스 아우레우스KCTC1927 105 CFU/㎖ - 순대
4: 스타필로코커스 아우레우스KCTC1927 105 CFU/㎖ - 김밥
5: 비브리오 파라헤몰리티커스 KCCM41654 105 CFU/㎖ - 해수
6: 비브리오 파라헤몰리티커스 KCCM41654 105 CFU/㎖ - 새우
7: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC86152 105 CFU/㎖ - 샐러드
8: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC86152 105 CFU/㎖ - 아이스크림
9: 살모넬라 엔터리티디스 KCCM12021 105 CFU/㎖ - 냉동 닭
10: 살모넬라 엔터리티디스 KCCM12021 105 CFU/㎖ - 샐러드
11: 바실러스 세레우스 KCTC1661 105 CFU/㎖ -된장
12: 바실러스 세레우스 KCTC1661 105 CFU/㎖ - 고추장
13: 열시니아 엔테리콜리티카KCCM41657 105 CFU/㎖ - 생수
14: 열시니아 엔테리콜리티카KCCM41657 105 CFU/㎖ - 우유
15: 쉬겔라 플렉스네리 ATCC12022 105 CFU/㎖ - 먹는 샘물
16: 쉬겔라 플렉스네리 ATCC12022 105 CFU/㎖ - 굴
P: 양성 대조군 (비브리오 파라헤몰리티커스 KCCM41654 105 CFU/㎖)
상기 도 31에서 나타낸 바와 같이, 비브리오 파라헤몰리티커스를 접종한 식품과 양성대조군에서만 정확한 크기의 밴드(band)가 확인되었으며, 상기 도 32에 나타난 바와 같이, ABI 7700 기기를 이용한 SYBR green I PCR 산물의 Tm 값이 84.9℃의 Tm 값으로 나타났다. 보다 상세하게는, 비브리오 파라헤몰리티커스 PCR 산물의 Tm 값은 1차 식품 및 2차 식품의 분석결과에서 모두 84.9℃인 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터, ABI 7700을 이용한 SYBR Green I system의 오차 범위는 ± 0℃임이 확인되었으며, TMC-1000를 이용한 경우에는 오차 범위 즉, 1차 식품과 2차 식품간의 Tm 값의 차이가 ±0.5℃임이 확인되었다.
14-4. 리스테리아 모노사이토게네스 (451 bp primer )
리스테리아 모노사이토게네스에 오염된 식품군들에 대해 서열번호 9 및 서열번호 10의 프라이머 쌍을 이용하여 각각 컨벤셔널 중합효소연쇄반응 및 리얼타임 중합효소연쇄반응을 수행하였으며, 리얼타임 중합효소연쇄반응은 ABI 7700 리얼타임 중합효소연쇄반응 기기 및 TMC-1000 리얼타임 중합효소연쇄반응 기기를 이용하여 수행하였고, 각각의 결과를 도 34 내지 36에 나타내었다. 상기 도 34의 각 레인은 하기와 같다.
레인 M : 사이즈마커(Size marker)
N: 음성 대조군(DNA 포함하지 않음)
1: 대장균O157:H7 105 CFU/㎖ - 햄버거 패티
2: 대장균O157:H7 105 CFU/㎖ - 분쇄가공 닭고기
3: 스타필로코커스 아우레우스KCTC1927 105 CFU/㎖ - 순대
4: 스타필로코커스 아우레우스KCTC1927 105 CFU/㎖ - 김밥
5: 비브리오 파라헤몰리티커스 KCCM41654 105 CFU/㎖ - 해수
6: 비브리오 파라헤몰리티커스 KCCM41654 105 CFU/㎖ - 새우
7: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC86152 105 CFU/㎖ - 샐러드
8: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC86152 105 CFU/㎖ - 아이스크림
9: 살모넬라 엔터리티디스 KCCM12021 105 CFU/㎖ - 냉동 닭
10: 살모넬라 엔터리티디스 KCCM12021 105 CFU/㎖ - 샐러드
11: 바실러스 세레우스 KCTC1661 105 CFU/㎖ - 된장
12: 바실러스 세레우스 KCTC1661 105 CFU/㎖ - 고추장
13: 열시니아 엔테리콜리티카KCCM41657 105 CFU/㎖ - 생수
14: 열시니아 엔테리콜리티카KCCM41657 105 CFU/㎖ - 우유
15: 쉬겔라 플렉스네리 ATCC12022 105 CFU/㎖ - 먹는 샘물
16: 쉬겔라 플렉스네리 ATCC12022 105 CFU/㎖ - 굴
P: 양성 대조군 (리스테리아 모노사이토게네스 ATCC86152 105 CFU/㎖)
상기 도 34에서 나타낸 바와 같이, 리스테리아 모노사이토게네스를 접종한 식품과 양성대조군에서만 정확한 크기의 밴드(band)가 확인되었으며, 상기 도 35에 나타난 바와 같이, ABI 7700 기기를 이용한 SYBR green I PCR 산물의 Tm 값이 82.3℃의 Tm 값으로 나타났다. 보다 상세하게는, 리스테리아 모노사이토게네스 PCR 산물의 Tm 값은 1차 식품 및 2차 식품의 분석결과에서 모두 82.3℃인 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터, ABI 7700을 이용한 SYBR Green I system의 오차 범위는 ± 0℃임이 확인되었으며, TMC-1000를 이용한 경우에는 오차 범위 즉, 1차 식품과 2차 식품간의 Tm 값의 차이가 ±1℃임이 확인되었다.
14-5. 살모넬라속 균주 (678 bp primer )
살모넬라속 균주에 오염된 식품군들에 대해 서열번호 15 및 서열번호 16의 프라이머 쌍을 이용하여 각각 컨벤셔널 중합효소연쇄반응 및 ABI 7700 리얼타임 중합효소연쇄반응 기기를 이용하여 리얼타임 중합효소연쇄반응을 수행하였으며, 리얼타임 중합효소연쇄반응을 수행하였고, 각각의 결과를 도 37 및 38에 나타내었다. 상기 컨벤셔널 중합효소연쇄반응을 수행한 PCR 산물의 전기영동시, 각 레인은 하기와 같다.
레인 M : 사이즈마커(Size marker)
N: 음성 대조군(DNA 포함하지 않음)
1: 대장균O157:H7 105 CFU/㎖ - 햄버거 패티
2: 대장균O157:H7 105 CFU/㎖ - 분쇄가공 닭고기
3: 스타필로코커스 아우레우스KCTC1927 105 CFU/㎖ - 순대
4: 스타필로코커스 아우레우스KCTC1927 105 CFU/㎖ - 김밥
5: 비브리오 파라헤몰리티커스 KCCM41654 105 CFU/㎖ - 해수
6: 비브리오 파라헤몰리티커스 KCCM41654 105 CFU/㎖ - 새우
7: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC86152 105 CFU/㎖ - 샐러드
8: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC86152 105 CFU/㎖ - 아이스크림
9: 살모넬라 엔터리티디스 KCCM12021 105 CFU/㎖ - 냉동 닭
10: 살모넬라 엔터리티디스 KCCM12021 105 CFU/㎖ - 샐러드
11: 바실러스 세레우스 KCTC1661 105 CFU/㎖ - 된장
12: 바실러스 세레우스 KCTC1661 105 CFU/㎖ - 고추장
13: 열시니아 엔테리콜리티카KCCM41657 105 CFU/㎖ - 생수
14: 열시니아 엔테리콜리티카KCCM41657 105 CFU/㎖ - 우유
15: 쉬겔라 플렉스네리 ATCC12022 105 CFU/㎖ - 먹는 샘물
16: 쉬겔라 플렉스네리 ATCC12022 105 CFU/㎖ - 굴
P: 양성 대조군 (살모넬라 엔터리티디스 KCCM12021 105 CFU/㎖)
살모넬라 엔터리티디스의 컨벤셔널 중합효소연쇄반응의 결과물을 전기영동 한 결과, 살모넬라 엔터리티디스를 접종한 식품과 양성대조군에서만 정확한 크기의 밴드(band)가 확인되었으며, 상기 도 38에 나타난 바와 같이, ABI 7700 기기를 이용한 SYBR green I PCR 산물의 Tm 값이 86.7℃의 Tm 값으로 나타났다. 보다 상세하게는, 살모넬라 엔터리티디스의 PCR 산물의 Tm 값은 1차 식품 및 2차 식품의 분석결과에서 모두 86.7℃인 것으로 확인되어, ABI 7700을 이용한 SYBR Green I system의 오차 범위는 ± 0℃임이 확인되었다.
14-6. 바실러스 세레우스 (640 bp primer )
바실러스 세레우스에 오염된 식품군들에 대해 서열번호 5 및 서열번호 6의 프라이머 쌍을 이용하여 각각 컨벤셔널 중합효소연쇄반응 및 ABI 7700 리얼타임 중합효소연쇄반응 기기를 이용하여 리얼타임 중합효소연쇄반응을 수행하였으며, 리얼타임 중합효소연쇄반응을 수행한 결과를 도 39 및 도 40에 나타내었다. 상기 컨벤셔널 중합효소연쇄반응을 수행한 PCR 산물의 전기영동시, 각 레인은 하기와 같다.
레인 M : 사이즈마커(Size marker)
N: 음성 대조군(DNA 포함하지 않음)
1: 대장균O157:H7 105 CFU/㎖ - 햄버거 패티
2: 대장균O157:H7 105 CFU/㎖ - 분쇄가공 닭고기
3: 스타필로코커스 아우레우스KCTC1927 105 CFU/㎖ - 순대
4: 스타필로코커스 아우레우스KCTC1927 105 CFU/㎖ - 김밥
5: 비브리오 파라헤몰리티커스 KCCM41654 105 CFU/㎖ - 해수
6: 비브리오 파라헤몰리티커스 KCCM41654 105 CFU/㎖ - 새우
7: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC86152 105 CFU/㎖ - 샐러드
8: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC86152 105 CFU/㎖ - 아이스크림
9: 살모넬라 엔터리티디스 KCCM12021 105 CFU/㎖ - 냉동 닭
10: 살모넬라 엔터리티디스 KCCM12021 105 CFU/㎖ - 샐러드
11: 바실러스 세레우스 KCTC1661 105 CFU/㎖ - 된장
12: 바실러스 세레우스 KCTC1661 105 CFU/㎖ - 고추장
13: 열시니아 엔테리콜리티카KCCM41657 105 CFU/㎖ - 생수
14: 열시니아 엔테리콜리티카KCCM41657 105 CFU/㎖ - 우유
15: 쉬겔라 플렉스네리 ATCC12022 105 CFU/㎖ - 먹는 샘물
16: 쉬겔라 플렉스네리 ATCC12022 105 CFU/㎖ - 굴
P: 양성 대조군 (바실러스 세레우스 KCTC1661 105 CFU/㎖)
바실러스 세레우스의 컨벤셔널 중합효소연쇄반응의 결과물을 전기영동 한 결과, 바실러스 세레우스를 접종한 식품과 양성대조군에서만 정확한 크기의 밴드(band)가 확인되었으며, 상기 도 40에 나타난 바와 같이, ABI 7700 기기를 이용한 SYBR green I PCR 산물의 Tm 값이 82.7℃의 Tm 값으로 나타났다. 보다 상세하게는, 바실러스 세레우스의 PCR 산물의 Tm 값은 1차 식품 및 2차 식품의 분석결과에서 모두 82.7℃인 것으로 확인되어, ABI 7700을 이용한 SYBR Green I system의 오차 범위는 ± 0℃임이 확인되었다.
14-7. 열시니아 엔테리콜리티카 (330 bp primer )
열시니아 엔테리콜리티카에 오염된 식품군들에 대해 서열번호 11 및 서열번호 12의 프라이머 쌍을 이용하여 각각 컨벤셔널 중합효소연쇄반응 및 리얼타임 중합효소연쇄반응을 수행하였으며, 리얼타임 중합효소연쇄반응은 ABI 7700 리얼타임 중합효소연쇄반응 기기 및 TMC-1000 리얼타임 중합효소연쇄반응 기기를 이용하여 수행하였고, 각각의 결과를 도 41 내지 43에 나타내었다. 상기 컨벤셔널 중합효소연쇄반응을 수행한 PCR 산물의 전기영동시, 각 레인은 하기와 같다.
레인 M : 사이즈마커(Size marker)
N: 음성 대조군(DNA 포함하지 않음)
1: 대장균O157:H7 105 CFU/㎖ - 햄버거 패티
2: 대장균O157:H7 105 CFU/㎖ - 분쇄가공 닭고기
3: 스타필로코커스 아우레우스KCTC1927 105 CFU/㎖ - 순대
4: 스타필로코커스 아우레우스KCTC1927 105 CFU/㎖ - 김밥
5: 비브리오 파라헤몰리티커스 KCCM41654 105 CFU/㎖ - 해수
6: 비브리오 파라헤몰리티커스 KCCM41654 105 CFU/㎖ - 새우
7: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC86152 105 CFU/㎖ - 샐러드
8: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC86152 105 CFU/㎖ - 아이스크림
9: 살모넬라 엔터리티디스 KCCM12021 105 CFU/㎖ - 냉동 닭
10: 살모넬라 엔터리티디스 KCCM12021 105 CFU/㎖ - 샐러드
11: 바실러스 세레우스 KCTC1661 105 CFU/㎖ - 된장
12: 바실러스 세레우스 KCTC1661 105 CFU/㎖ - 고추장
13: 열시니아 엔테리콜리티카KCCM41657 105 CFU/㎖ - 생수
14: 열시니아 엔테리콜리티카KCCM41657 105 CFU/㎖ - 우유
15: 쉬겔라 플렉스네리 ATCC12022 105 CFU/㎖ - 먹는 샘물
16: 쉬겔라 플렉스네리 ATCC12022 105 CFU/㎖ - 굴
P: 양성 대조군 (열시니아 엔테리콜리티카KCCM41657 105 CFU/㎖)
열시니아 엔테리콜리티카의 컨벤셔널 중합효소연쇄반응의 결과물을 전기영동 한 결과, 바실러스 세레우스를 접종한 식품과 양성대조군에서만 정확한 크기의 밴드(band)가 확인되었으며, 상기 도 42에 나타난 바와 같이, ABI 7700 기기를 이용한 SYBR green I PCR 산물의 Tm 값이 88.1℃의 Tm 값으로 나타났다. 보다 상세하게는, 리스테리아 모노사이토게네스 PCR 산물의 Tm 값은 1차 식품 및 2차 식품의 분석결과에서 모두 88.1℃인 것으로 확인되었다. 상기 결과로부터, ABI 7700을 이용한 SYBR Green I system의 오차 범위는 ± 0℃임이 확인되었으며, TMC-1000를 이용한 경우에는 오차 범위 즉, 1차 식품과 2차 식품간의 Tm 값의 차이가 ±1℃임이 확인되었다.
14-8. 쉬겔라속 균주 (445 bp primer )
쉬겔라속 균주에 오염된 식품군들에 대해 서열번호 17 및 서열번호 18의 프라이머 쌍을 이용하여 각각 컨벤셔널 중합효소연쇄반응 및 ABI 7700 리얼타임 중합효소연쇄반응 기기를 이용하여 리얼타임 중합효소연쇄반응을 수행하였으며, 리얼타임 중합효소연쇄반응을 수행한 결과를 도 44 및 도 45에 나타내었다. 상기 컨벤셔널 중합효소연쇄반응을 수행한 PCR 산물의 전기영동시, 각 레인은 하기와 같다.
레인 M : 사이즈마커(Size marker)
N: 음성 대조군(DNA 포함하지 않음)
1: 대장균O157:H7 105 CFU/㎖ - 햄버거 패티
2: 대장균O157:H7 105 CFU/㎖ - 분쇄가공 닭고기
3: 스타필로코커스 아우레우스KCTC1927 105 CFU/㎖ - 순대
4: 스타필로코커스 아우레우스KCTC1927 105 CFU/㎖ - 김밥
5: 비브리오 파라헤몰리티커스 KCCM41654 105 CFU/㎖ - 해수
6: 비브리오 파라헤몰리티커스 KCCM41654 105 CFU/㎖ - 새우
7: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC86152 105 CFU/㎖ - 샐러드
8: 리스테리아 모노사이토게네스 ATCC86152 105 CFU/㎖ - 아이스크림
9: 살모넬라 엔터리티디스 KCCM12021 105 CFU/㎖ - 냉동 닭
10: 살모넬라 엔터리티디스 KCCM12021 105 CFU/㎖ - 샐러드
11: 바실러스 세레우스 KCTC1661 105 CFU/㎖ - 된장
12: 바실러스 세레우스 KCTC1661 105 CFU/㎖ - 고추장
13: 열시니아 엔테리콜리티카KCCM41657 105 CFU/㎖ - 생수
14: 열시니아 엔테리콜리티카KCCM41657 105 CFU/㎖ - 우유
15: 쉬겔라 플렉스네리 ATCC12022 105 CFU/㎖ - 먹는 샘물
16: 쉬겔라 플렉스네리 ATCC12022 105 CFU/㎖ - 굴
P: 양성 대조군 (쉬겔라 플렉스네리 ATCC12022 105 CFU/㎖)
쉬겔라 플렉스네리의 컨벤셔널 중합효소연쇄반응의 결과물을 전기영동 한 결과, 바실러스 세레우스를 접종한 식품과 양성대조군에서만 정확한 크기의 밴드(band)가 확인되었으며, 상기 도 45에 나타난 바와 같이, ABI 7700 기기를 이용한 SYBR green I PCR 산물의 Tm 값이 80.9℃의 Tm 값으로 나타났다. 보다 상세하게는, 바실러스 세레우스의 PCR 산물의 Tm 값은 1차 식품 및 2차 식품의 분석결과에서 모두 82.7℃인 것으로 확인되어, ABI 7700을 이용한 SYBR Green I system의 오차 범위는 ± 0℃임이 확인되었다.
<110> SAMSUNG EVERLAND INC. <120> A PRIMER FOR DETECTING FOOD BORNE PATHOGENIC MICROORGANISM AND A METHOD FOR DETECTING FOOD BORNE MICROORGANISM USING THE SAME <130> dpp20070127kr <160> 41 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E1 <400> 1 gatagacttt tcgacccaac aaag 24 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E2 <400> 2 ccgatgtggt cccctgag 18 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA1 <400> 3 aatttaacag ctaaagagtt tggt 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA4 <400> 4 acgtatcttc catgaatgat ctaa 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B1 <400> 5 gactacattc acgattacgc agaa 24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B4 <400> 6 ttcctaaact tgcaccatct cgg 23 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V1 <400> 7 ctcatttgta ctgttgaacg ccta 24 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V4 <400> 8 tactactggc gcttctggtt c 21 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L1 <400> 9 ctggcacaaa attacttaca acga 24 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L3 <400> 10 aactactgga gctgcttgtt tttc 24 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y1 <400> 11 aataccgcat aacgtcttcg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y2 <400> 12 cttcttctgc gagtaacgtc 20 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C1 <400> 13 tgatatgtcc aaaaatgaac caga 24 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C2 <400> 14 ttgtgattcc cctgtgtcag g 21 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAL1 <400> 15 gaatcctcag tttttcaacg tttc 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAL4 <400> 16 tagccgtaac aaccaataca aatg 24 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH1 <400> 17 caggcatgaa attaagcctg 20 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH4 <400> 18 tgtacatcga taataccaaa c 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA1 <400> 19 acttctttat tgcttgctgc 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CA2 <400> 20 gccacaacaa gttaaagaag c 21 <210> 21 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E3 <400> 21 ttgctcaata atcagacgaa gatg 24 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E4 <400> 22 cgttgtcaca ccgggcactg a 21 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E5 <400> 23 ccccactctg acaccatcct 20 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA2 <400> 24 ttcccactaa atgtgtttca taa 23 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SA3 <400> 25 ttcattaaag aaaaagtgta cgag 24 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B2 <400> 26 gtagaccaat tgttgcttgt aatgg 25 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> B3 <400> 27 ctatgctgac gagctacatc cata 24 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V2 <400> 28 aggcgtcatt gttatcagaa gc 22 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V3 <400> 29 tcatgagcag aggcgtcatt g 21 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V5 <400> 30 aatagaaggc aaccagttgt tgat 24 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> V6 <400> 31 gactgccatt catttgatga tagc 24 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L2 <400> 32 tggagtgctt actgctttgt cag 23 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L4 <400> 33 gttaccaccc catgaataag c 21 <210> 34 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Y3 <400> 34 cggtattcct ccagatctct ac 22 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C3 <400> 35 tgccattcat atctagctaa tgct 24 <210> 36 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C4 <400> 36 tttcctttct tctgcaaaag tctc 24 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C5 <400> 37 cctgctgttc ctttttgaga g 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAL2 <400> 38 ccagacgaaa gagcgtggta a 21 <210> 39 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SAL3 <400> 39 gtatgcccgg taaacagatg agt 23 <210> 40 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH2 <400> 40 ctgcattctg gcaatctctt caca 24 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SH3 <400> 41 gcatctgaca gcaatagtac a 21

Claims (5)

  1. 서열번호 19의 염기서열로 이루어지는 프라이머 및 서열번호 20의 염기서열로 이루어지는 프라이머로 이루어지고 Tm 값이 80.7℃인 303 bp의 캠필로박터 제주니 특이적 유전자 산물을 증폭시키는 것을 특징으로 하는 캠필로박터 제주니(Camphylobacter jejuni) 검출용 프라이머.
  2. 제 1항의 캠필로박터 제주니(Camphylobacter jejuni) 검출용 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)으로 캠필로박터 제주니(Camphylobacter jejuni)를 탐지하는 단계를 포함하는 캠필로박터 제주니(Camphylobacter jejuni) 검출방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응은 다중 중합효소연쇄반응(Multiplex Polymerase Chain Reaction)인 캠필로박터 제주니(Camphylobacter jejuni)의 검출방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 중합효소연쇄반응은 리얼타임 중합효소연쇄반응(Real-Time Polymerase Chain Reaction)인 캠필로박터 제주니(Camphylobacter jejuni)의 검출방법.
  5. 중합효소연쇄반응(PCR)을 이용하여 캠필로박터 제주니(Camphylobacter jejuni)를 검출하는 제 1항의 캠필로박터 제주니(Camphylobacter jejuni) 검출용 프라이머, 반응완충액, dNTP 및 Taq DNA 중합효소를 포함하는 캠필로박터 제주니(Camphylobacter jejuni) 검출키트.
KR1020080056938A 2008-06-17 2008-06-17 식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품위해 미생물 검출방법 KR100919262B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020080056938A KR100919262B1 (ko) 2008-06-17 2008-06-17 식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품위해 미생물 검출방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020080056938A KR100919262B1 (ko) 2008-06-17 2008-06-17 식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품위해 미생물 검출방법

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020070023155A Division KR100920971B1 (ko) 2007-03-08 2007-03-08 식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품위해 미생물 검출방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20080082561A KR20080082561A (ko) 2008-09-11
KR100919262B1 true KR100919262B1 (ko) 2009-09-30

Family

ID=40021825

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020080056938A KR100919262B1 (ko) 2008-06-17 2008-06-17 식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품위해 미생물 검출방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100919262B1 (ko)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101250455B1 (ko) 2011-04-26 2013-04-08 건국대학교 산학협력단 신규한 혐기성 세균용 비선택배지 조성물 및 그 제조방법
KR102379552B1 (ko) 2020-09-21 2022-03-29 대한민국 리스테리아 모노사이토제네스 검출용 프라이머 세트, 조성물, 키트 및 이를 이용한 검출 방법

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101394589B1 (ko) * 2012-07-03 2014-05-12 건국대학교 산학협력단 캠필로박터에 대한 민감성 및 선택성을 개선한 배지 조성물 및 그 제조방법

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Abstract of J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet. Public Health, Vol.53(8) : 376-381 (2006.10.공개)*
Gen Bank Accession No. CP0005387(2007.01.09.공개)*

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101250455B1 (ko) 2011-04-26 2013-04-08 건국대학교 산학협력단 신규한 혐기성 세균용 비선택배지 조성물 및 그 제조방법
KR102379552B1 (ko) 2020-09-21 2022-03-29 대한민국 리스테리아 모노사이토제네스 검출용 프라이머 세트, 조성물, 키트 및 이를 이용한 검출 방법

Also Published As

Publication number Publication date
KR20080082561A (ko) 2008-09-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100920971B1 (ko) 식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품위해 미생물 검출방법
Mei et al. Development and application of a visual loop-mediated isothermal amplification combined with lateral flow dipstick (LAMP-LFD) method for rapid detection of Salmonella strains in food samples
US8524451B2 (en) Method for real-time detection of Salmonella in food using a cleavable chimeric probe
JP2008538075A (ja) 食中毒検出用プライマー、及び食品媒介病原菌の迅速検出方法
US8278041B2 (en) Compositions and methods for detecting food-borne pathogens
Bundidamorn et al. A new single-tube platform of melting temperature curve analysis based on multiplex real-time PCR using EvaGreen for simultaneous screening detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli, Salmonella spp. and Listeria monocytogenes in food
KR100919262B1 (ko) 식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품위해 미생물 검출방법
Skerniškytė et al. Detection of Salmonella spp., Y ersinia enterocolitica, L isteria monocytogenes and C ampylobacter spp. by real‐time multiplex PCR using amplicon DNA melting analysis and probe‐based assay
KR100919261B1 (ko) 식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품위해 미생물 검출방법
AU2018236835A1 (en) Compositions and methods for detecting gastrointestinal pathogen nucleic acid
US20230227921A1 (en) Methods and Compositions for Detecting Virulent and Avirulent Escherichia coli Strains
KR100919260B1 (ko) 식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품위해 미생물 검출방법
KR20080082553A (ko) 식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품위해 미생물 검출방법
KR20080082558A (ko) 식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품위해 미생물 검출방법
KR100853263B1 (ko) 살모넬라균 및 캠필러박터균의 검출을 위한올리고뉴클레오티드 프라이머, 이를 포함하는 조기진단키트 및 이를 이용한 검출방법
KR20160014960A (ko) 식중독 미생물의 병원성 유전자 실시간 동시 검출용 프라이머 세트 및 이의 용도
KR20080082559A (ko) 식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품위해 미생물 검출방법
KR20080082557A (ko) 식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품위해 미생물 검출방법
KR20080082560A (ko) 식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품위해 미생물 검출방법
KR20080082556A (ko) 식품 위해 미생물 검출용 프라이머 및 이를 이용한 식품위해 미생물 검출방법
KR20210103109A (ko) 열성 질환 원인체 검출용 프라이머 및 프로브 세트, 이를 포함하는 키트 및 이를 이용한 검출 방법
Kim Studies on PCR-based rapid detection systems for Salmonella spp.
KR20200059766A (ko) ceuE 타겟 유전자를 통해 캠필로박터 콜리를 신속검출할 수 있는 Singleplex Real-Time PCR 키트의 개발
US20120009575A1 (en) Inducible nucleic acid targets for detection of pathogens, methods and compositions thereof
AU2005203358A1 (en) Clonal identification of bacteria

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20120921

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130913

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140902

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150515

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151230

Year of fee payment: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170102

Year of fee payment: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180103

Year of fee payment: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181219

Year of fee payment: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191210

Year of fee payment: 12