JP2011188855A - 切断可能なキメラプローブを使用したサルモネラのリアルタイム検出方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】切断可能なキメラプローブを使用したサルモネラのリアルタイム検出方法を提供する。
【解決手段】食品及び表面でサルモネラ属細菌のリアルタイム検出方法を開示する。サルモネラは、培地で富化され、分析前に細胞密度を増大させる。ＤＮＡは、アジ化物、プロテイナーゼＫ及びデタージェントの存在下で、溶解によって回収される。サルモネラ属細菌のリアルタイム検出は、遺伝子特異的なプライマー及び切断可能なキメラ蛍光プローブを使用し、ＰＣＲ反応で行われる。該方法はまた、核酸増幅及び検出の効率を確認するための内部対照群を開示する。該方法は、処理量がかなり多い分析に使われうる。
【選択図】なし

Description

本発明は、食品及び表面に存在するサルモネラ（Salmonella）属の細菌をリアルタイムで検出するための方法及びテストキットに関する。
サルモネラ（Salmonella）は、ロッド状のグラム陰性腸内細菌（enterobacteria）である。サルモネラは、大腸菌（Escherichia）属に非常に近く、温血動物及び冷血動物で全世界的に発見されている。それらは、腸チフス（typhoid fever）、パラチフス（paratyphoid fever）、食品因性疾病（food-borne illness）、サルモネラ症（salmonellosis）のように、人間及び多くの動物で疾病を起こす。サルモネラに感染されたほとんどの患者で、感染後、１２時間ないし７２時間内に、下痢（diarrhea）、熱（fever）、嘔吐（vomiting）及び腹部痙攣（abdominal cramps）などが現れる。感染は、一般的に大便試料の培養を介して診断される。前記疾患は、４日ないし７日間持続する。多くの人々が治療を受けずとも回復するといっても、深刻な感染が起こりうる。乳児、老人及び弱い免疫システムを有した人は、他の人よりも深刻な疾患が発病しやすい。深刻な感染が発生する場合、サルモネラは、腸から血液に広まり、そのようになれば、他の身体部位に広まり、抗生物質で即時治療を受けなければ、死亡に至ることもある。
現在まで、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）及びサルモネラ・ボンゴリ（Salmonella bongori）の二種のサルモネラ種と、enterica（Ｉ）、salamae（ＩＩ）、arizonae（ＩＩＩａ）、diarizonae（ＩＩＩｂ）、houtenae（ＩＶ）及びindica（ＶＩ）の６個の重要血清型が知られている。多様な毒性要素を暗号化する多様ないくつかの病原性島（ＰＡＩ：pathogenicity island）には、サルモネラ属菌が棲息し、宿主に感染させる。２種の重要なＰＡＩは、サルモネラ病原性島１及び２（ＳＰＩ−１及びＳＰＩ−２：salmonella pathogenicity island １及び２）であり、宿主細胞への効果分子の輸送のための２種の異なるタイプＩＩＩ分泌システムを暗号化する。このような輸送を介して、バクテリアの内在化がなされ、それによって全身に伝播がなされる。サルモネラ・ボンゴリは、爬虫類に特異的であり、ヒト感染では、ほとんど発見されない。サルモネラ・エンテリカの何種かは、腸チフスのような深刻な疾患を起こす。さまざまな食品及び表面のサルモネラ感染は、米国・農務性食品安全監視局（United States Department of Agriculture Food Safety Inspection Service）によって、主要健康危害要素として認識されている。サルモネラは、冷凍によって破壊されない。
伝統的には、食品や表面にあるサルモネラは、古典的な微生物検出法によって検出されうるが、かような微生物検出法は、時間が多くかかり、労働集約的であり、敏感性が低く、高価であり、自動化し難い。ＤＮＡ増幅技術の出現で、現在は、加工しないか、あるいは加工した食品試料または表面採取テスト（surface wipe test）の核酸分析を利用して、サルモネラを検出できる。現在、核酸分析は、ほとんどの政府機関で、食品加工設備及び流通センタをモニタリングするための方法として採択している。核酸分析は、サルモネラ検出及び血清型識別だけではなく、サルモネラの発生を追跡することを可能にする。かようなモニタリングは、病院や医療団体に予告を行うことによって、公共保健及び安全性を向上させることができ、迅速な識別及び汚染源の分離を可能にする。
例えば、２００９年に米国・食品医薬品局（ＦＤＡ：Food and Drug Administration）は、サルモネラ・ティフィムリウム（salmonella typhimurium）の発生源に対して、ピーナッツ・コーポレーション・オブ・アメリカ（ＰＣＡ：Peanut Corporation of America）所有のジョージア州ブレイクリー（Blakely）にある植物まで追跡したし、商業的に作られたり、製造されたピーナッツバターが含まれた製品、及び公共施設で提供されるピーナッツバターを食べることを延期するようにと人々に要請した。米国の４６州で、少なくとも３４３ヵ所の食品会社で作られたクラッカー、エネルギーバー（energy bar）及びピーナッツバター・クッキーのような、少なくとも３，８６２個のピーナッツバターで作られた製品からサルモネラが発見されたと報告された。子犬の飼料もまた、影響を受けた。４６州以上の少なくとも６９１人が体調の不調を訴え、サルモネラは、少なくとも９人の命を奪った。ＰＣＡで作られたピーナッツバター及びピーナッツペーストは、クッキー、クラッカー、穀物、キャンディ及びアイスクリームのような数千枝種の生産物で材料として使われるために数百ヵ所の会社に供給され、それらはいずれも回収された。ある生産品は、小売店で直接消費者に販売された。従って、サルモネラ感染発生は、政府機関に困難な輸送業務を与えた。
サルモネラ発生に対する即時的であって、総合的な対応は、疑う余地もなく、財政、疾病の蔓延、さらに生命までも保護する。それにもかかわらず、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）増幅方法は、疑陽性（false positive）（特許文献１）及び偽陰性（false negative）（特許文献２，３，４，５）を検出しやすい。かような理由によって、テスト試料で、サルモネラ核酸配列の正確であって信頼性あるリアルタイム検出への技術分野の要求は、依然として満足されないでいる。
ＷＯ９５／３３８５４ ＷＯ９２／０１０５６ ＷＯ９５／００６６４ ＷＯ９２／０１０５６ ＷＯ９３／０４２０２
一具体例によれば、サルモネラ属細菌に特異的な浸湿遺伝子（invasion gene）を標的として、食品と表面とでサルモネラ属細菌のリアルタイム検出のためのキットを考案するにおいて、ＰＣＲ及びCataCleave技術が組み合わされた。他の様相によれば、サルモネラ属細菌と関連性のない核酸配列を内部対照群（internal control）として使用し、品質管理（quality control）問題を確認することによって、リアルタイム検出反応をモニタリングする方法を開示する。
一具体例で、サルモネラ標的ＤＮＡの存在を確認するために、試料を提供する段階、サルモネラ標的ＤＮＡにアニーリングすることができる増幅プライマーセットを提供する段階と、前記サルモネラ標的ＤＮＡに実質的に相補的なＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列に対して検出可能な標識を含むプローブを提供する段階と、増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液が存在し；ＲＮaｓｅ Ｈ活性がなされ、かつプローブが存在し、かつ前記プローブ内のＲＮＡ配列が、前記サルモネラ標的ＤＮＡのＰＣＲ切片内の相補的なＤＮＡ配列とＲＮＡ：ＤＮＡヘテロデュプレックス（heteroduplex）を形成できる条件下で、第１増幅プライマーと第２増幅プライマーとのＰＣＲ切片を増幅させる段階と、前記プローブ上の標識から放出される信号のリアルタイム増加を検出する段階であって、前記信号の増加は、前記試料中で、前記サルモネラ標的ＤＮＡの存在を示すことである段階と、を含む試料でサルモネラ属細菌をリアルタイムで検出する方法を開示する。
一様相で、前記プローブ上の標識から放出される信号のリアルタイム増加は、前記プローブと、前記ＰＣＲ切片の鎖のうち一つとから形成されるヘテロデュプレックスが、ＲＮaｓｅ Ｈによって切断されることから由来する。
前記サルモネラ標的ＤＮＡ配列は、ＩｎｖＡ遺伝子を含むことができる。
前記プローブのＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列は、互いに共有結合されうる。前記プローブ上の検出可能な標識は、ＦＲＥＴ対のような蛍光標識でありうる。前記増幅緩衝液は、ＨＥＰＥＳ緩衝液でありうる。前記プローブまたはＰＣＲ切片は、固体支持体に連結されうる。前記増幅ポリメラーゼ活性は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性であって、前記ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈの活性でありうる。前記ＲＮａｓｅ Ｈは、部位（site）非特異的または部位特異的でありうる。一具体例で、前記ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮａｓｅ ＨＩＩでありうる。他の具体例で、前記ＲＮａｓｅ ＨＩＩは、Pyrococcus furiosus、Thermus thermophilus、Pyrococcus horikoshiiまたはThermococcus litoralisから由来したものでありうる。前記試料は、食品試料または表面採取した試料を含むことができる。前記試料と共にテンプレート核酸は、ＰＣＲ増幅前に不活性化されたウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）を処理して、その後の汚染を防止できる。
一様相で、前記プローブは、配列番号７，１３または１４の配列を有することができる。
他の様相で、前記増幅プライマーセットは、配列番号１及び２のプライマーセット、配列番号３及び４のプライマーセット、及び配列番号５及び６のプライマーセットでありうる。
他の具体例で、サルモネラ標的ＲＮＡの存在を確認するために、試料を提供する段階、サルモネラｉｎｖＡ遺伝子標的核酸配列にアニーリングすることができるフォワード増幅プライマー及びリバース増幅プライマーのセットを提供する段階と、逆転写酵素活性及び前記リバース増幅プライマーの存在の下で、サルモネラｉｎｖＡ標的ＲＮＡを逆転写し、標的ｃＤＮＡ配列を生成する段階と、前記標的ｃＤＮＡ配列、増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液が存在し；ＲＮaｓｅ Ｈ活性され、かつプローブが存在し、かつ前記プローブ内のＲＮＡ配列が、前記サルモネラ標的ＤＮＡのＰＣＲ切片内の相補的なＤＮＡ配列とＲＮＡ：ＤＮＡヘテロデュプレックスを形成できる条件下で、フォワード増幅プライマーとリバース増幅プライマーとのＰＣＲ切片を増幅させる段階と、前記プローブ上の標識から放出される信号のリアルタイム増加を検出する段階であって、前記信号の増加は、前記試料中で、前記サルモネラ標的ＲＮＡの存在を示すことである段階と、を含む試料でサルモネラ属細菌をリアルタイムで検出する方法を開示する。
一様相で、前記プローブ上の標識から放出される信号のリアルタイム増加は、前記プローブのＲＮＡ配列と、前記サルモネラ標的ＲＮＡのｃＤＮＡ配列とに形成されるヘテロデュプレックスが、ＲＮaｓｅ Ｈによって切断されることから由来する。
一様相で、前記増幅プライマーセットは、配列番号１及び２のプライマーセット、配列番号３及び４のプライマーセット、及び配列番号５及び６のプライマーセットでありうる。
他の具体例は、サルモネラ標的ＤＮＡ配列にアニーリングすることができる増幅プライマーセット、サルモネラ標的ＤＮＡ配列に実質的に相補的なＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列を含むプローブ及び増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液及びＲＮａｓｅ Ｈを含む、試料でサルモネラ属細菌をリアルタイムで検出するためのキットを開示する。
他の具体例は、標的サルモネラｉｎｖＡＲＮＡ配列を逆転写し、標的ｃＤＮＡ配列を生成するための逆転写酵素活性、配列番号１及び２のプライマーセット、配列番号３及び４のプライマーセット、及び配列番号５及び６のプライマーセットからなる群から選択されるものであるサルモネラｉｎｖＡ標的ＤＮＡ配列にアニーリングすることができる増幅プライマーセット、増幅プライマーセット間の前記標的ｃＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅し、サルモネラｉｎｖＡ ＰＣＲ切片を生成するための増幅活性、検出可能な標識及び前記ＰＣＲ切片内のＤＮＡ配列に実質的に相補的なＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列を含むプローブ；ａｎＲＮaｓｅ Ｈ活性を含む、試料でサルモネラ属細菌をリアルタイムで検出するためのキットを開示する。
前記キットは、陽性内部対照群及び陰性対照群及びウラシル−Ｎ−グリコシラーゼをさらに含むことができる。前記サルモネラ標的ＤＮＡは、ＩｎｖＡ遺伝子を含むことができる。
前記キットの一様相で、前記プローブは、ＤＮＡ配列−ＲＮＡ配列−ＤＮＡ配列の構造を有し、前記プローブのＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列は、共有結合で連結され、前記プローブ上の検出可能な標識は、蛍光標識でありうる。他の具体例で、前記プローブは、ＦＲＥＴ対で標識されうる。前記プローブまたはＰＣＲ切片は、固体支持体に連結されうる。前記増幅緩衝液は、ＨＥＰＥＳでありうる。前記増幅ポリメラーゼ活性は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性であって、前記ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈの活性でありうる。
前記キットの他の様相で、前記プローブは、配列番号７，１３または１４の塩基配列を有するプローブを含むことができ、前記増幅プライマーセットは、配列番号１及び２のプライマーセット、配列番号３及び４のプライマーセット、及び配列番号５及び６のプライマーセットでありうる。
前記開示した具体例は、試料でリアルタイムでサルモネラ属細菌の核酸配列を検出するにおいて、多数の利点を有する。前記検出方法は、迅速であって正確であり、多量の試料を処理するのに適している。また、食品試料及び表面でのサルモネラ属細菌の検出のための、便利であって、ユーザ親和的であり、信頼性の高い診断キットが開示される。
CataCleaveプローブ技法を示した概略図である。 ＰＣＲ増幅産物のリアルタイムCataCleaveプローブ検出を示した概略図である。 CataCleaveプローブ及び配列番号１及び２の増幅プライマーを使用し、サケでサルモネラ属パラチフスＢ菌（Salmonella paratyphi Ｂ）の汚染いかんを検出したリアルタイムＰＣＲ反応結果である。 サルモネラ特異的なCataCleaveプローブを使用し、内部増幅対照群（internal amplification control）プラスミドの存在下で、サルモネラ・ティフィムリウムを検出したリアルタイムＰＣＲ反応結果である。 内部増幅対照群特異的なCataCleaveプローブ及び内部増幅対照群プラスミドテンプレートを使用したリアルタイムＰＣＲ反応結果である。 CataCleaveプローブ及び配列番号３及び４のＤＮＡ配列を有する増幅プライマーセット３３を使用し、サルモネラ・ティフィムリウムＤＮＡ配列を検出したリアルタイムＰＣＲ反応結果である。 CataCleaveプローブ及び配列番号５及び６のＤＮＡ配列を有する増幅プライマーセット３４を使用し、サルモネラ・ティフィムリウムＤＮＡ配列を検出したリアルタイムＰＣＲ反応結果である。 互いに異なる増幅プライマーセットによるリアルタイムＰＣＲ反応及びプライマー二量体形成の結果を示すグラフである。 CataCleaveプローブ及び配列番号１及び２の増幅プライマーセットを使用し、リアルタイムＰＣＲによってサルモネラ・ティフィムリウムゲノムＤＮＡの単一分子を検出した結果を示すグラフである。 CataCleaveプローブ及び配列番号１及び２の増幅プライマーセットを使用し、リアルタイムＰＣＲによってサルモネラ・ディケータ（salmonella decatur）のゲノムＤＮＡの単一分子を検出した結果を示すグラフである。 CataCleaveリアルタイムＰＣＲを利用した８セットのサルモネラＩｎｖＡ遺伝子プライマーの検出敏感度を比較した結果を図示するグラフである。 サルモネラｉｎｖＡ ＤＮＡ配列のリアルタイムＰＣＲ検出で、２個の互いに異なるCataCleaveプローブの効率性を比較した結果を図示するグラフである。 サルモネラｉｎｖＡ遺伝子ＤＮＡの１ないし１００，０００コピー（copy）のCataCleaveリアルタイムＰＣＲ検出での他のプローブ（CataCleave Ｉｎｖ−ＣＣ−probe ３）の効率性を示すグラフである。
明細書に開示された具体例の実験は、取り立てて表示されていなければ、当業界で知られている一般的な分子生物学的技法を使用した。かような技法は、当業者に周知されており、文献に十分に説明されている。例えば、Ausubel，et al．，ed．，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，Inc．，NY，N．Y．(1987-2008)、及びSambrook，etal．，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Edition，Cold Spring Harbor，N．Y．(1989)を参照した。
本明細書で、取り立てて定義されていないものであるならば、本明細書で使われたあらゆる技術的、科学的用語は、当業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。また本明細書は、詳細な説明及び請求項の解釈の一助とするサポートのために、用語の定義を提供する。結果として、定義が他の定義と一致しなければ、前記定義は、本明細書に説明されているものであると規定されるのである。
本明細書で使われた用語「核酸（nucleic acid）」は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを意味し、前記オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、変形されたり、または変形された塩基を含むことができる。オリゴヌクレオチドは、２ないし６０のヌクレオチドを含むヌクレオチドの単一鎖重合体である。ポリヌクレオチドは、２以上のヌクレオチドを含むヌクレオチドの重合体である。ポリヌクレオチドは、第２鎖が第１オリゴヌクレオチドの逆相補的（reverse complement）配列のオリゴヌクレオチドとアニーリングされたオリゴヌクレオチドを含む二重鎖ＤＮＡ、ジオキシミジンを含む単一鎖核酸重合体、単一鎖ＲＮＡ、二重鎖ＲＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡヘテロデュプレックスを含む単一鎖核酸重合体でありうる。核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、切片化された核酸、ミトコンドリアまたは葉緑体のような細胞小器官から得た核酸、及び微生物から得た核酸または生物学的試料内または試料上に存在しうるＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスを含むが、これらに限定されるものではない。核酸は、例えば、ＲＮＡ及びＤＮＡの場合のように、ある種の部分（moiety）から構成されているか、または、例えば、ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ（chimera）の場合のように、互いに異なる部分の混合でありうる。
「標的ＤＮＡ（target ＤＮＡ）」または「標的ＲＮＡ（target ＲＮＡ）」または「標的核酸（target nucleic acid）」、または「標的核酸配列（target nucleic acid sequence）」は、ＤＮＡ増幅によって、標的になる核酸を意味する。標的核酸配列は、ＰＣＲ（polymerase chain reaction）反応または逆転写酵素ＰＣＲ（reverse transcriptase−ＰＣＲ）反応で増幅されるためのテンプレートとして提供される。標的核酸配列は、自然発生的な分子及び合成分子をいずれも含むことができる。例えば、標的核酸配列は、ゲノムＤＮＡまたはゲノムＲＮＡを含むが、これらに限定されるものではない。
本明細書で使われた用語「標識（lable）」または「検出可能な標識（detectable label）」は、ヌクレオチド、ヌクレオチド重合体、または核酸結合因子に結合されたいかなる化学的部分をも意味することができ、前記結合は、共有結合または非共有結合でありうる。望ましくは、前記標識は、検出可能であり、本発明の実験者に検出されうる前記ヌクレオチドまたはヌクレオチド重合体でありうる。検出可能な標識は、発光分子、化学発光分子、蛍光色素、蛍光クエンチング剤（quenching agent）、色調分子、放射性同位元素またはシンチラント（scintillant）を含む。検出可能な標識はまた、任意の有用なリンカ分子（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ＨＲＰ、protein Ａ、protein Ｇ、抗体またはその断片、Ｇｒｂ２、ポリヒスチジン、Ｎｉ２＋、ＦＬＡＧタグ、ｍｙｃタグ）、重金属、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ及びルシフェラーゼ）、電子供与体（donor）／受容体（acceptor）、アクリジウムエステル、染料（dye）及び熱量測定基質（calorimetric substrate）を含む。また、表面プラズモン共鳴（surface Plasmon resonance）検出の場合のように、質量の変化（change in mass）を示すのに検出可能な標識が考慮されうる。当業者は、前記で言及されていない有用な検出可能な標識についても容易に認識しうるものであり、それらもまた、本発明の実施に使われうる。
サルモネラ標的配列の選択
ＤＮＡ増幅のための標的になるサルモネラ属細菌の核酸配列は、まず、当業界に知られているサルモネラ属細菌の核酸配列から選択した。本明細書で使われた用語「サルモネラ標的配列（Salmonella target sequence）」または「サルモネラ属細菌の標的配列」は、サルモネラ属に属するバクテリアの核酸配列を含むＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を意味する。これは、亜種： enterica（Ｉ）、salamae（ＩＩ）、arizonae（ＩＩＩａ）、diarizonae（ＩＩＩｂ）、houtenae（ＩＶ）及びindica（ＶＩ）を含むが、これらに限定されるものではないサルモネラ・エンテリカ種及びサルモネラ・ボンゴリ種を含むが、これらに限定されるものではない。例えば、亜種サルモネラ・エンテリカの血清群及び血清型（serovar）は、米国特許第７，６５９，３８１号明細書で確認することができ、これは、本明細書に参照として挿入される。
本発明による増幅のために標的になる例示的なサルモネラ核酸配列は、下記文献に開示されており、これらは、本明細書に参照として挿入される：LiuWQ et al．，“Salmonella paratyphi C：genetic divergencefrom Salmonella choleraesuis and pathogenic convergence with Salmonella typhi”，PLoS One，2009；4(2)：e4510；Thomson NR et al．，“Comparative genome analysis of Salmonella enteritidis PT4 and Salmonella gallinarum 287/91 provides insights into evolutionary and host adaptation pathways，“Genome Res，2008 Oct；18(10)：1624-37；Encheva V et al．，“Proteome analysis of serovars typhimurium and Pullorum of Salmonella enterica subspeciesI”，BMC Microbiol，2005 Jul 18；5：42；McClell and M et al．，“Comparison of genome degradation in Paratyphi A and Typhi，human-restricted serovars of Salmonella enterica that cause typhoid”，Nat Genet，2004 Dec；36(12)：1268-74；Chiu CH et al．，“Salmonella enterica serotype Choleraesuis：epidemiology，pathogenesis，clinical disease， and treatment，“Clin Microbiol Rev，2004 Apr；17(2)：311-22；Deng W et al．，“Comparative genomics of Salmonella enterica serovar Typhi strains Ty2 and CT18，”J Bacteriol，2003 Apr；185(7)：2330-7；Parkhil lJ et al．，“Complete genome sequence of amultiple drug resistant Salmonella enterica serovar Typhi C T18”，Nature，200 1Oct 25；413(6858)：848-52；McClell and M et al．，“Complete genome sequence of Salmonella enterica serovar typhimurium LT2，“Nature，2001 Oct 25；413(6858)：852-6．Salmonella enterica subsp．enterica serovar typhimurium str．ＬＴ２の完全なゲノム（４８５７４３２ ｂｐ）の例示的なヌクレオチド配列は、GenBank Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＮＣ＿００３１９７で確認することができる。
一具体例で、標的サルモネラＩｎｖＡ核酸配列にアニーリングされる前記増幅プローブは、配列番号７，１３または１４の配列を有するものでありうる。
他の具体例で、前記標的核酸配列は、下記ＤＮＡ配列を有するサルモネラ−特異的なＩｎｖＡ遺伝子核酸配列である。
配列番号１２、サルモネラ・エンテリカＩｎｖＡ遺伝子（GenBank Accession Ｎｏ．：Ｕ４３２７２．１）：
AACAGTGCTCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGTACTAATGGTGATGATCATTTCT
ATGTTCGTCATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCCTGATCGCACTGAATATCGTA
CTGGCGATATTGGTGTTTATGGGGTCGTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCAACG
TTTCCTGCGGTACTGTTAATTACCACGCTCTTTCGTCTGGCATTATCGATCAGTACCAGC
CGTCTTATCTTGATTGAAGCCGATGCCGGTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAATTCGTT
ATTGGCGATAGCCTGGCGGTGGGTTTTGTTGTCTTCTCTATTGTCACCGTGGTCCAGTTT
ATCGTTATTACCAAAGGTTCAGAACGCGTCGCGGAAGTCGCGGCCCGATTTTCTCTGGAT
GGTATGCCCGGTAAACAGATGAGTATTGATGCCGATTTGAAGGCCGGTATTATTGATGCG
GATGCTGCGCGCGAACGGCGAAGCGTACTGGAAAGGGAAAGCCAGCTTTACGGTTCCTTT
GACGGTGCGATGAAGTTTATCAAAGGTGACGCTATTGCCGGCATCATTATTATCTTTGTG
AACTTTATTGGCGGTATTTCGGTGGGGATGACCCGCCATGGTATGGATTTGTCCTCCGCT
CTGTCTACTTATACCATGCTGACCATTGGTGATGGTCTTGTCGCCCAGATCCCCGCATTG
TTGATTGCGATTAGTGCCGGTTTTATCGTGACTCGCGTAAATGGCGATAGCGATAATATG
GGGCGGAATATCATGACGCAGCTGTTGAACAACCCATTTGTATTGGTTGTTACGGCTATT
TTGACCATTTCAATGGGAACTCTGCCGGGATTCCCGCTGCCGGTATTTGTTATTTTATCG
GTGGTTTTAAGCGTACTCTTCTATTTTAAATTCCGTGAAGCAAAACGTAGCGCCGCCAAA
CCTAAAACCAGCAAAGGCGAGCAGCCGCTTAGTATTGAGGAAAAAGAAGGGTCGTCGTTG
GGACTGATTGGCGATCTCGATAAAGTCTCTACAGAGACCGTACCGTTGATATTACTTGTG
CCGAAGAGCCGGCGTGAAGATCTGGAAAAAGCTCAACTTGCGGAGCGTCTACGTAGTCAG
TTCTTTATTGATTATGGCGTGCGCCTGCCGGAAGTATTGTTACGCGATGGCGAGGGCCTG
GACGATAACAGCATCGTATTGTTGATTAATGAGATCCGTGTTGAACAATTTACGGTCTAT
TTTGATTTGATGCGAGTGGTAAATTATTCCGATGAAGTCGTGTCCTTTGGTATTAATCCA
ACAATCCATCAGCAAGGTAGCAGTCAGTATTTCTGGGTAACGCATGAAGAGGGGGAGAAA
CTCCGGGAGCTTGGCTATGTGTTGCGGAACGCGCTTGATGAGCTTTACCACTGTCTGGCG
GTGACCGTGGCGCGCAACGTCAATGAATATTTCGGTATTCAGGAAACAAAACATATGCTG
GACCAACTGGAAGCGAAATTTCCTGATTTACTTAAAGAAGTGCTCAGACATGCCACGGTA
CAACGTATATCTGAAGTTTTGCAGCGTTTATTAAGCGAACGTGTTTCCGTGCGTAATATG
AAATTAATTATGGAAGCGCTCGCATTGTGGGCGCCAAGAGAAAAAGATGTCATTAACCTT
GTAGAGCATATTCGTGGAGCAATGGCGCGTTATATTTGTCATAAATTCGCCAATGGCGGC
GAATTACGAGCAGTAATGGTATCTGCTGAAGTTGAGGATGTTATTCGCAAAGGGATCCGT
CAGACCTCTGGCAGTACCTTCCTCAGCCTTGACCCGGAAGCCTCCGCTAATTTGATGGAT
CTCATTACACTTAAGTTGGATGATTTATTGATTGCACATAAAGATCTTGTCCTCCTTACG
TCTGTCGATGTCCGTCGATTTATTAAGAAA
本明細書で使われた用語「オリゴヌクレオチド（oligonucleotide）」は、時には「プライマー」または「ポリヌクレオチド（polynucleotide）」と混用されうる。用語「プライマー」は、ＰＣＲ反応で、ＤＮＡ合成を始めるための開始点として作用するオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは、一般的に１５ないし３５個のヌクレオチドであり、前記標的配列に相補的な領域と混成化される。
一具体例で、増幅プライマーのセット（すなわち、フォワード・プライマー及びリバース・プライマー）は、配列番号１及び２のプライマーセット、配列番号３及び４のプライマーセット、または配列番号５及び６のプライマーセットでありうる。
「プライマー二量体（primer dimer）」は、ＰＣＲで潜在的に発生しうる副産物（by-product）であり、プライマー内の一連の相補的な塩基によって、互いに部分的に混成化されるプライマー分子によって構成される。その結果、ＤＮＡポリメラーゼは、プライマー二量体を増幅することになり、ＰＣＲ反応液との競争を誘発するので、従って、潜在的にＰＣＲ増幅のために標的になるＤＮＡ配列の増幅を阻害する。リアルタイムＰＣＲで、プライマー二量体は、敏感度を低下させて正確な定量（quantification）を妨害する。
図７は、サルモネラ（Salmonella）検出のためのプライマー配列が、プライマー二量体の形成（formation of primer-dimer）に対してスクリーニングされる方法について示している。ＰＣＲ反応は、Sybr Green Iの存在下で、フォワード・プライマー及びリバース・プライマーのセットを使用して行われた。この染料の蛍光放出強度は、デュプレックス（duplex）ＤＮＡ内に染料が挿入されるときに増大するので、核酸増幅反応で、非特異的なプローブとして提供されうる。前記反応は、４０ｎＭのフォワード・プライマー及びリバース・プライマー、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ及びSybr Green Iを含む実施例３に開示された適した反応緩衝液で行われる。温度サイクルリング（cycling）条件は、95°Cで５分、その後95°Cで１５秒、55°Cで１５秒、及び72°Cで３０秒を４０回反復する。リアルタイムデータは、72°C段階で収集する。増大したSybr Green I蛍光放出の結果は、Applied Biosystems ７５００ Fast Real-Time ＰＣＲ SystemまたはBiorad ＣＦＸ９６ real-time ＰＣＲ thermocyclerのような適切な装置を使用して、リアルタイムで検出できる。プライマー二量体形成は、プライマー特異的なテンプレートＤＮＡの存在下で見られるところと類似した、特徴的なｓ字形の放出プロファイルを引き起こす。前記図面は、有意のプライマー二量体が生成された３４個のうち３２個のプライマーセットが、その後の分析から除外されたということを示している。図５及び図６で開示されているように、最小限のプライマー二量体が形成されたプライマーセット３３及び３４がアッセイに使われた。
オリゴヌクレオチドは、適切な方法（例えば、化学的合成）によって合成されて製造され、これは、当業界に周知されている。また、オリゴヌクレオチドは、商業的な出所を介して便利に入手できる。
本明細書で、用語「アニーリング（annealing）」及び「混成化（hybridization）」は混用され、１つの核酸と他の核酸とが塩基対形成相互作用によって、デュプレックス、トリプレックス（triplex）、または他の高次元構造の形成を引き起こすことを意味する。一具体例で、一次相互作用は、例えば、Ａ／Ｔ及びＧ／Ｃのように、Watson／Crick及びHoogsteen型の水素結合による塩基特異的なものである。一具体例でまた、塩基スタッキング（base-stacking）及び疎水性相互作用がデュプレックス安定性に寄与できる。
本明細書で使われた用語「実質的に相補的な（substantially complementary）」は、配列内で十分に相補的な２個の核酸鎖がアニーリングされ、安定したデュプレックスを形成することを意味する。前記相補性は、完全である必要性はない；例えば、２個の核酸間に塩基対のミスマッチ（mismatch）がいくつかほどありえる。しかし、ミスマッチの数が多すぎて、最小限の厳格な混成化条件ですら混成化が起こらない場合には、前記配列は、実質的に相補的な配列ではない。本明細書で、２個の配列が「実質的に相補的」であると解釈されれば、前記配列は、選択された反応条件下で、互いにが混成化されうるように十分に相補的であることを意味する。特異性を達成できる十分な核酸の相補性と混成化の厳格性との関係は、当業界に周知されている。２個の実質的に相補的な鎖は、例えば、完全に相補的であるか、または、例えば、対をなす配列と対をなさない配列との差異点を十分に許す限り、１ないし多数のミスマッチを含むことができる。従って、「実質的に相補的」である配列は、二重鎖区域で、１００，９５，９０，８０，７５，７０，６０，５０％以下、または前記数字間のいかなる％の塩基対相補性をも有する配列を意味することができる。
当業者は、所望のサルモネラゲノム配列を増幅できるＰＣＲプライマーを考案する方法を知っているであろう。合成されたオリゴヌクレオチドは、一般的に、約55°CのＴｍを有する、２０ないし２６個の塩基対である。
テスト試料でのバクテリア核酸配列のための富化（enrichment）
標的サルモネラ配列を検出する１つの例示的な方法は、食品試料または表面採取物を提供する段階と、試料または採取物と成長培地とを混合し、培養してサルモネラの数または群集を増加させる段階（富化（enrichment））と、サルモネラ細胞を破砕する段階（溶解（lysis））と、前記得た溶解物（lysate）を標的サルモネラ配列の増幅及び検出に適用する段階と、を含む。食品試料は、サケのような魚類、牛乳やタマゴのような酪農製品、家禽類、果物ジュース、粉砕豚肉，豚肉，粉砕牛肉または牛肉のような肉類、ホウレンソウまたはアルファルファスプラウト（alfalfa sprout）のような野菜類、またはピーナッツバターのような加工された堅果類を含むことができるが、これらに限定されるものではない。
食品汚染に対する検出限界（ＬＯＤ：Limit of detection）は、２５ｇの固体または２５ｍｌの液体食品、または限定された空間の表面で検出されうるコロニー形成ユニット（ＣＦＵ：colony forming unit）の数について説明される。定義によれば、コロニー形成ユニットは、生きているバクテリア数の測定である。死んていたり、あるいは生きているあらゆる細胞を数える間接的な顕微鏡計数法とは異なり、ＣＦＵは、生きている細胞を測定する。１ＣＦＵ（１つのバクテリア細胞）は、成長して許容される条件下で、アガール・プレート上に１つのコロニーを形成する。United States Food Testing Inspection Serviceでは、最小ＬＯＤを、固体食品２５ｇまたは液体食品２５ｍＬの固体食品当たり１ＣＦＵ、または表面区域当たり１ＣＦＵと定義している。
実際、１ＣＦＵで食品試料または表面を反復的に接種し、富化過程でバクテリアが生き残るようにすることは不可能である。かような問題は、一つまたはさまざまな標的レベルで試料を接種し、最適確数法（ＭＰＮ：Ｐmost probable number）と呼ばれている統計的評価を使用して、結果を分析することによって克服されうる。
例えば、サルモネラ培養は、分光測定計で吸光度を測定することによって、具体的な細胞密度で育ちうる。前記標的の１０倍連続的希釈を介してアガール培地に塗抹し、生きているバクテリアを計数する。かようなデータは、塗抹された細胞密度に対するＣＦＵ／体積に係わる標準曲線を生成するのに使われる。ＭＰＮが有意であるために、さまざまな接種レベルでの試験試料が分析される。富化及び抽出後、少量の試料がリアルタイム分析のために除去される。最終目標は、２５％ないし７５％の間（すなわち、CataCleaveプローブを使用し、逆転写酵素ＰＣＲを利用したアッセイで、陽性試料テストの２５％ないし７５％の間であり、これは、下記で説明される）の有効化率（fractional recovery）を達成するものである。かような有効化率パーセントを選択する理由は、固体食品の試料２５ｇ、液体食品の試料２５ｍＬ、または表面の限定された空間について、０．３ＣＦＵないし１．３７５ＣＦＵ間のＭＰＮ値に変換されるためである。それらＭＰＮ値は、要求される１ＣＦＵ／試料のＬＯＤにまとめることができる。実際、それらの有効化率をを達成するために、希釈された接種源の体積を測定（標準曲線に基づく）することが可能である。
サルモネラ標的核酸配列のＰＣＲ増幅
プライマーが選択され、テスト試料内の核酸が準備されれば（実施例参照）、核酸増幅は、重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列基盤増幅（ＮＡＳＢＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、及びローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を含んだ多様な方法によって行われうる。前記重合酵素連鎖反応は、特異的な標的ＤＮＡ配列を増幅するのに最も一般的に使われる方法である。
「重合酵素連鎖反応（polymerase chain reaction）」あるいは「ＰＣＲ」は、一般的に、所望するヌクレオチド配列をインビトロ（in vitro）で増幅する方法を意味する。前記過程は、米国特許第４，６８３，２０２号明細書、同第４，６８３，１９５号明細書、同第４，８００，１５９号及び同第４，９６５，１８８号に詳細に説明されており、前記内容は、全体として本明細書に挿入される。一般的に、前記ＰＣＲ過程は、２倍モル濃度以上過量の、前記二重鎖標的配列の反対鎖に相補的なオリゴヌクレオチド・プライマーを、所望する標的配列を含む反応混合物に入れる段階からなる。前記反応混合物は、ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、温度サイクルリング・プログラムに適用し、前記ＤＮＡプライマーセット間の所望する標的配列を増幅する。
一具体例で使われうるプライマーは、配列番号１ないし６のＤＮＡ配列を有することができる。
本発明の一具体例で使われうるプローブ（時には「CataCleaveプローブ」を意味する）は、下記配列を有することができる：
５’−／ＦＡＭ／ＣＧＡＴＣＡＧｒＧｒＡｒＡｒＡＴＣＡＡＣＣＡＧ／ＩＡＢＦＱ）（配列番号７）
前記小文字「ｒ」は、ＲＮＡ塩基を意味する（すなわち、ｒＧは、リボグアノシンである）、または
５’−／ＦＡＭ／ＡＧＧＴＡＡＣＣｒＧｒＡｒＡｒＡＡＣＡＡＧＣＣ／３ＩＡＢｌｋ＿ＦＱ）（配列番号８）
本明細書で使われた用語「ＰＣＲ切片（ＰＣＲ fragment）」または「逆転写酵素ＰＣＲ切片（reverse transcriptase-ＰＣＲ fragment）」または「アンプリコン（amplicon）」は、特定の標的核酸の増幅によって生成されるポリヌクレオチド分子（または、集合的に分子の多数）を意味する。ＰＣＲ切片は、一般的に、ＤＮＡ ＰＣＲ切片を意味するが、これに限定されるものではない。ＰＣＲ切片は、単一鎖または二重鎖、または任意の濃度比によるその混合物でありうる。ＰＣＲ切片または逆転写酵素ＰＣＲ切片は、１００ないし５００個のヌクレオチド、またはそれ以上でありうる。
増幅「緩衝液（buffer）」は、増幅反応に添加され、前記増幅反応を調節することによって、前記増幅反応の一つ以上の要素の安定性、活性、及び／または寿命を変形させる化合物である。本発明の前記緩衝液は、ＰＣＲ増幅及びＲＮａｓｅ Ｈ切断活性と両立できる。緩衝液の例は、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３−（Ｎ−モルホリノ）−プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）及び酢酸塩またはリン酸塩を含む緩衝液などを含むが、これらに限定されるものではない。また、ＰＣＲ緩衝液は、一般的に、約７０ｍＭ以下のＫＣｌ、約１．５ｍＭまたはそれ以上のＭｇＣｌ２、約５０ないし２００μＭのそれぞれのｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含むことができる。本発明の緩衝液は、効率的な逆転写酵素ＰＣＲまたはＰＣＲ反応を最適化させるために添加物を含むことができる。
添加物は、前記組成物の一つ以上の要素の安定性、活性、及び／または寿命を変形させる組成物に添加される化合物である。一具体例で、前記組成物は、増幅反応組成物である。一具体例で、添加物は汚染された酵素の不活性化、蛋白質フォールディング（folding）の安定化、及び／または凝集の低減に影響を及ぼす。増幅反応に含まれうる添加物の例は、ベタイン、ホルムアミド、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＯＡｃ、ＭｇＣｌ２、ＮａＣｌ、ＮＨ４ＯＡｃ、ＮａＩ、Ｎａ（ＣＯ３）２、ＬｉＣｌ、ＭｎＯＡｃ、ＮＭＰ、トレハロース、ジメチルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」）、グリセロール、エチレングリコール、ジチオトレイトール（「ＤＴＴ」）、ピロホスファターゼ（Thermoplasma acidophilum無機ピロホスファターゼ（ＴＡＰ：inorganic pyrophosphatase）を含むが、これに限定されるものではない）、ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）、プロピレングリコール、グリシンアミド、ＣＨＥＳ、パーコール（percoll）、アウリントリカルボン酸、Tween ２０、Tween ２１、Tween ４０、Tween ６０、Tween ８５、Ｂｒｉｊ ３０、ＮＰ−４０、Triton Ｘ−１００、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、Mackernium、ＬＤＡＯ（Ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミン−Ｎ−オキシド）、Zwittergent ３−１０、Xwittergent ３−１４、Xwittergent ＳＢ ３−１６、Empigen、ＮＤＳＢ−２０、Ｔ４Ｇ３２、E. Coli ＳＳＢ、ＲｅｃＡ、ニッキング・エンドヌクレアーゼ（nicking endonuclease）、７−デアザＧ、ｄＵＴＰ、陰イオン・デタージェント（anionic detergent）、陽イオン・デタージェント（cationic detergent）、非イオン・デタージェント（non-ionic detergent）、zwittergent、ステロール、浸透調節物質（osmolyte）、陽イオン、及び増幅の効率を変化させることができるその他化合物、蛋白質、または補助因子を含むが、これらに限定されるものではない。一具体例で、２以上の添加物が増幅反応に含まれる。前記添加物が、ＲＮａｓｅ Ｈの活性を妨害するものでなければ、添加物は、プライマー・アニーリングの選択性を向上させるために選択的に添加されうる。
本明細書で使われた用語である、酵素に適用される「熱安定性（thermostable）」は、上昇した温度（例えば、55°C以上）で生物学的活性を維持したり、または加熱及び冷却の反復されたサイクルによって、生物学的活性を維持する酵素を意味する。熱安定性ポリヌクレオチド・ポリメラーゼは、特別にＰＣＲ増幅反応で使われうる。
本明細書で使われた用語「熱安定性ポリメラーゼ（thermostable polymerase）」は、熱に相対的に安定しており、それぞれのＰＣＲサイクル前に、酵素を添加する必要性を除去した酵素である。熱安定性ポリメラーゼの非制限的な例は、好熱性バクテリアであるThermus aquaticus（Ｔａｑポリメラーゼ）、Thermus thermophilus（Ｔｔｈポリメラーゼ）、Thermococcus litoralis（ＴｌｉポリメラーゼまたはＶＥＮＴポリメラーゼ）、Pyrococcus furiosus（ＰｆｕポリメラーゼまたはＤＥＥＰＶＥＮＴポリメラーゼ）、Pyrococcus woosii（Ｐｗｏポリメラーゼ）及び他のPyrococcus種、Bacillus stearothermophilus（Ｂｓｔポリメラーゼ）、Sulfolobus acidocaldarius（Ｓａｃポリメラーゼ）、Thermoplasma acidophilum（Ｔａｃポリメラーゼ）、Thermus ruber（Ｔｒｕポリメラーゼ）、Thermus brockianus（ＤＹＮＡＺＹＭＥポリメラーゼ）、Thermotoga neapolitana（Ｔｎｅポリメラーゼ）、Thermotoga maritima（Ｔｍａ）及びThermotoga属の他種（Ｔｓｐポリメラーゼ）、及びMethanobacterium thermoautotrophicum（Ｍｔｈポリメラーゼ）から分離したポリメラーゼを含むことができる。前記ＰＣＲ反応は、さらに効率的な標的配列の増幅を引き起こす相補的な性質を有する一つ以上の熱安定性ポリメラーゼ酵素を含むことができる。例えば、高い進行性（processivity）（広いヌクレオチド区画をコピーできる能力）を有するヌクレオチド・ポリメラーゼは、校正能（proofreading capability）（標的核酸配列の伸張の間、誤りを正しく修正できる能力）を有する他のヌクレオチド・ポリメラーゼと相互補完されうるので、高いフィデリティ（fidelity）を有する長い標的配列を複製できるＰＣＲ反応を生成させることができる。前記熱安定性ポリメラーゼは、野生型として使われうる。代案として、前記ポリメラーゼは、前記酵素の切片を含んだり、または前記ＰＣＲ反応を増進させることができる有利な特徴を提供する突然変異を含むように変形されうる。一具体例で、前記熱安定性ポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼでありうる。ＡｍｐｌｉＴａｑ、ＡｍｐｌｉＴａｑ Stoffel fragment、SuperＴａｑ、SuperＴａｑ plus、ＬＡ Ｔａｑ、ＬＡｐｒｏ Ｔａｑ及びＥＸ Ｔａｑを含む、向上された特徴を有したＴａｑポリメラーゼの多様な変形体が知られている。
サルモネラＲＮＡ標的核酸配列の逆転写酵素ＰＣＲ増幅
遺伝子発現を研究するために、最も広範囲に使われる技法のうち一つが、ＰＣＲによる増幅のために、ｍＲＮＡ配列をテンプレートとして、第１鎖ｃＤＮＡを活用することである。たびたびＰＣＲまたは逆転写酵素ＰＣＲとして解釈される前記方法は、ＰＣＲ過程の高い敏感性及び特異性を利用し、ＲＮＡの検出及び定量に広範囲に使われる。
終点（end-point）またはリアルタイム・アッセイとして行われる前記逆転写酵素ＰＣＲ過程は、２段階の分離された分子的合成を含む：（ｉ）ＲＮＡテンプレートからｃＤＮＡの合成、及び（ｉｉ）ＰＣＲ増幅を介して新しく合成されたｃＤＮＡの複製。逆転写酵素ＰＣＲとたびたび関連した技術的な問題を処理するための試みとして、前記過程の３種の基本的な段階を考慮し、多数のプロトコルが開発された：（ａ）ＲＮＡの変性（denaturation）及びリバース・プライマーの混成化、（ｂ）ｃＤＮＡの合成、及び（ｃ）ＰＣＲ増幅。いわゆる、「連結されていない（uncoupled）」逆転写酵素ＰＣＲ過程（例えば、二段階（two step）逆転写酵素ＰＣＲ）で逆転写は、逆転写酵素活性のための最適の緩衝液条件を使用し、独立的な段階として行われる。ｃＤＮＡ合成に続き、前記反応は、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ活性に最適の条件で、ＭｇＣｌ２及びジオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）の濃度が低下するように希釈した後、ＰＣＲを標準条件（米国特許第４，６８３，１９５号明細書及び同第４，６８３，２０２号明細書を参照）によって行う。これに反し、「連結された（coupled）」逆転写酵素ＰＣＲ法は、逆転写酵素及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼの活性のために、共通の緩衝液を使用する。第１バージョンで、リバース・プライマーのアニーリングは、酵素の添加前に分離された段階であり、その後、単一反応容器に添加する。他のバージョンで、逆転写酵素活性は、熱安定性Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼの構成要素である。アニーリング及びｃＤＮＡ合成は、Ｍｎ２＋の存在下で行われ、その後、ＰＣＲは、キレート試薬によってＭｎ２＋が除去された後、Ｍｇ２＋の存在下で行われる。最後に、前記「連続的な（continuous）」方法（例えば、ワンステップ（one step）逆転写酵素ＰＣＲ）は、前記逆転写酵素ＰＣＲの３段階を、成分または酵素添加のための反応チューブの開放を防止する１つの連続的な反応に統合する。連続的な逆転写酵素ＰＣＲは、熱安定性Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及びＴｔｈポリメラーゼの逆転写酵素活性を使用する単一酵素システム、及び開始温度が65°CであるＡＭＶ逆転写酵素及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼを使用する２酵素システムとして説明される。ＲＮＡ変性段階は省略する。
リアルタイムで最初の段階である逆転写ＰＣＲは、テンプレート特異的なＤＮＡプライマーの一つを使用し、相補的なＤＮＡ鎖を生成する。伝統的なＰＣＲ反応で、該生成物は変成され、第２テンプレート特異的なプライマーが前記ｃＤＮＡに結合され、デュプレックスＤＮＡを形成するように拡張される。この生成物は、温度サイクルリングの次の段階で増幅される。最も高い敏感性を維持するために、ｃＤＮＡの合成前に前記ＲＮＡは、分解されないことが重要である。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、ＲＮａｓｅ Ｈの基質になりうるために、反応緩衝液でのＲＮａｓｅ Ｈの存在は、前記過程の最初の段階で形成されるＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの願わない分解を引き起こすであろう。かような問題を克服する２種の主要方法が存在する。一つは、ＤＮＡ変性段階開始の高い温度の間に溶けうるワックスのような膜を使用することによって、逆転写反応の残りから、ＲＮａｓｅ Ｈを物理的に分離するのである。２番目の方法は、一般的に４５ないし55°Cの逆転写温度で不活性化されるように、ＲＮａｓｅ Ｈを変形させるのである。ＲＮａｓｅ Ｈを抗体と反応させたり、または可逆的な化学変形を含んださまざまな方法が当業界に知られている。例えば、本発明で使われたホットスタート（hot start）ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、ＲＮaｓｅ Ｈをアルカリ条件下で、シスアコニット酸無水物と反応させた後で生成された可逆的な化学変形を有するＲＮａｓｅ Ｈでありうる。変形された酵素が、Ｔｒｉｓ基盤の緩衝液と共に反応で使われるとき、温度を95°Cに上げ、溶液のｐＨを低くすれば、ＲＮａｓｅ Ｈ活性は回復される。この方法は、逆転写の開始前、反応混合物内にＲＮａｓｅ Ｈを含めるようにする。
本発明で使われうるＲＮaｓｅ Ｈ酵素及びホットスタートＲＮaｓｅ Ｈ酵素のさらなる例は、Walder et al．の米国特許出願第２００９／０３２５１６９号に開示されている。
ワンステップ逆転写酵素ＰＣＲは、連結されていない逆転写酵素ＰＣＲに比べて、数種の利点を提供する。ワンステップ逆転写酵素ＰＣＲは、連結されていない逆転写酵素ＰＣＲ（例えば、２段階の反応間で、成分または酵素の添加のために反応チューブを開くこと）に比べ、反応混合物試薬及び核酸産物の操作（handling）が少なく要求され、従って、労働強度が低く、要求される時間が短縮される。ワンステップ逆転写酵素ＰＣＲはまた、試料を少なく要求し、汚染の危険を低減させることができる。ワンステップ逆転写酵素ＰＣＲの敏感性及び特異性は、与えられた試料または病原性ＲＮＡの検出において、一つないしいくつかの遺伝子の発現レベルを研究するのに適すると証明されている。一般的に、かような過程は、ｃＤＮＡ合成を始めるために、遺伝子特異的なプライマーの使用を制限する。
それら逆転写酵素ＰＣＲ技法と組み合わされたリアルタイム検出によるＰＣＲ反応の動力学を測定する能力は、高い敏感度を有するＲＮＡコピー数を正確であって精密に決定する。これは、下記で説明される５’蛍光発生ヌクレアーゼ・アッセイ（Ｔａｑ−Ｍａｎ）またはエンドヌクレアーゼ・アッセイ（CataCleave）のような、蛍光二重標識された混成化プローブ技法による増幅過程の間のＰＣＲ産物の蛍光モニタリング及び測定を介して、逆転写酵素ＰＣＲ産物を検出することによって可能である。
CataCleaveプローブを利用したサルモネラ標的核酸配列のリアルタイムＰＣＲ
増幅後のアンプリコン検出は、多くの労働力が必要なだけではなく、時間もまた多くかかる。ＰＣＲ過程の間、増幅をモニタするために、リアルタイム方法が開発された。かような方法は、一般的に蛍光標識プローブを、新しく合成されたＤＮＡまたは二重鎖ＤＮＡ間に挿入されて蛍光放出が増大する染料に結合させる。
前記プローブは、一般的に標的がない場合、２つの発色団間での蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ：fluorescence resonance energy transfer）によって供与体放出が消滅されるように設計される。供与体発色団（donor chromophore）は、励起状態（excited state）で、発色団対が近距離に位置するときに、受容体発色団（acceptor chromophore）にエネルギーを伝達する。かような伝達は、常に非放射線で、対極子・対極子結合（dipole-dipole coupling）を介して起こる。発色団間の距離を十分に延長させるあらゆる工程は、ＦＲＥＴ効率を低下させ、供与体発色団放出を放射能的に検出させる。一般的な受容体発色団は、ＦＡＭ、ＴＡＭＲＡ、ＶＩＣ、ＪＯＥ、Ｃｙ３、Ｃｙ５及びTexas Redなどを含む。受容体発色団は、供与体の放出スペクトルと励起スペクトルとが重なることができるように選択される。例えば、かような結合対は、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡがある。また、広範囲な供与体をクエンチ（quench）する非蛍光受容体がありうる。それ以外にも、適した供与体受容体ＦＲＥＴ対の他の例は、当業者に周知されている。
ＰＣＲのリアルタイム検出のために使われうるＦＲＥＴプローブの共通的な例は、分子ビーコン（molecular beacon）、Ｔａｑ−Ｍａｎプローブ（例えば、米国特許第５，２１０，０１５号明細書及び同第５，４８７，９７２号明細書）、及びCataCleaveプローブ（例えば、米国特許第５，７６３，１８１号明細書）を含む。分子ビーコンは、単一鎖のオリゴヌクレオチドであり、非結合状態では、前記プローブは、供与体と受容体との発色団と近接しており、供与体放出を低減させることができる二次構造を形成するように考案されている。適切な反応温度で、ビーコンは、構造が解除され、特にアンプリコンに結合される。いったん解除されれば、供与体と受容体との発色団間の距離が延長され、ＦＲＥＴが変わることになり、特別な機器を利用して供与体放出をモニタできることになる。Ｔａｑ−Ｍａｎ技法及びCataCleave技法は、利用されるＦＲＥＴプローブが切断され、供与体と受容体との発色団がＦＲＥＴを変えるのに十分なほどに離れることになるという点で、分子ビーコンとは異なる。
Ｔａｑ−Ｍａｎ技法は、５’末端に供与体発色団で標識され、３’末端に受容体発色団で標識された単一鎖オリゴヌクレオチド・プローブを利用する。増幅のために利用される前記ＤＮＡポリメラーゼは、５’エキソヌクレアーゼ活性（exonucleaseactivity）→３’エキソヌクレアーゼ活性を有さねばならない。Ｔａｑ−Ｍａｎプローブは、プライマーが結合されるとき、共にアンプリコンの１つの鎖に結合される。ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを伸張させる間、ポリメラーゼは、結局結合されたＴａｑ−Ｍａｎプローブと対向することになる。このとき、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性が５’末端で始まり、順次にＴａｑ−Ｍａｎプローブを分解することになる。前記プローブが分解されるによって、プローブを含むモノヌクレオチドは、反応緩衝液にリリースされる。供与体が受容体から拡散されることによって、ＦＲＥＴは変わることになる。供与体からの放出は、プローブ切断を確認するためにモニタリングされる。Ｔａｑ−Ｍａｎの作用のために、特別なアンプリコンは、ＰＣＲのサイクルごとにただ１回ずつ検出されうる。Ｔａｑ−Ｍａｎ標的部位を介したプライマーの伸張は、二重鎖産物を生成し、アンプリコンが次のＰＣＲサイクルで変性されるまで、Ｔａｑ−Ｍａｎプローブの追加結合を防止する。
本明細書に参照として結合された米国特許第５，７６３，１８１号明細書の内容は、他のリアルタイム検出方法（CataCleaveと命名）を開示している。CataCleave技法は、プローブの切断がポリメラーゼ活性のない二次酵素によって行われるという点で、Ｔａｑ−Ｍａｎと異なる。CataCleaveプローブは、例えば、制限酵素またはＲＮａｓｅのようなエンドヌクレアーゼの標的分子内に配列を有している。一具体例で、CataCleaveプローブは、プローブの５’末端及び３’末端はＤＮＡにより、切断部位はＲＮＡによって構成されているキメラ構造を有している。前記プローブのＤＮＡ配列部分は、両末端や内部で、ＦＲＥＴ対で標識される。ＰＣＲ反応は、ＲＮＡ−ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ配列部分を特異的に切断することができるＲＮａｓｅ Ｈ酵素を含む。切断後、プローブの半分は、いずれも反応温度で標的アンプリコンで解離され、反応溶液に分散される。供与体及び受容体が分離されるほど、ＦＲＥＴは、Ｔａｑ−Ｍａｎプローブのような方法のように変わることになり、供与体放出は、モニタリングされうる。切断及び解離は、さらなるCataCleave結合のための部位を再生産する。かような方法で、プライマーがCataCleaveプローブ結合部位を介して伸張されるまで、単一アンプリコンを標的とし、またはプローブ切断を何回か反復できるようにする。
サルモネラ−特異的なCataCleaveプローブの標識
用語「プローブ（probe）」は、例えば、標的核酸配列のような特異的な核酸配列の相補的な領域を有する配列特異的な方法で混成化されるように考案された特異的な部分を含むポリヌクレオチドを含む。一具体例で、前記オリゴヌクレオチド・プローブは、１５ないし６０個のヌクレオチド範囲である。さらに望ましくは、前記オリゴヌクレオチド・プローブは、１８ないし３０個のヌクレオチド範囲である。本発明のオリゴヌクレオチド・プローブの正確な配列及び長さは、前記プローブが結合される標的ポリヌクレオチドの性質によって部分的に異なる。結合位置及び長さは、特定の具体例で、適切なアニーリング及び変成される特性をなすために多様でありうる。かような考案選択のための指針は、Ｔａｑ−ｍａｎアッセイまたはCataCleaveを開示する文献である米国特許第５，７６３，１８１号明細書、同第６，７８７，３０４号明細書及び同第７，１１２，４２２号に見出され、前記内容は、全体として本明細書に参照として挿入される。
本明細書で使われる用語「標識（label）」または「検出可能な標識（detectable label）」は、共有結合または非共有結合によってプローブに結合された蛍光色素化合物を含むCataCleaveプローブの任意の標識を意味することができる。
本明細書で使われる用語「蛍光色素（fluorochrome）」は、放出される光よりさらに短い波長の光によって励起される光を放出する蛍光化合物を意味する。用語「蛍光供与体（fluorescent donorまたはfluorescence donor）」は、本発明に開示されたアッセイで測定される光を放出する蛍光色素を意味する。さらに具体的に、蛍光供与体は、蛍光受容体によって吸収される光を提供する。用語「蛍光受容体（fluorescent acceptorまたはfluorescence acceptor）」は、蛍光供与体から放出されるエネルギーを吸収する第２蛍光色素またはクエンチング分子を意味する。第２蛍光色素は、蛍光供与体から放出されるエネルギーを吸収し、蛍光供与体によって放出される光よりさらに長い波長の光を放出する。クエンチング分子は、蛍光供与体によって放出されたエネルギーを吸収する。
いかなる発光分子、望ましくは、蛍光色素及び／または蛍光クエンチャー（quencher）も、本発明の実施に使われうる。前記発光分子は、例えば、Alexa Fluor ３５０、Alexa Fluor ４３０、Alexa Fluor ４８８、Alexa Fluor ５３２、Alexa Fluor ５４６、Alexa Fluor ５６８、Alexa Fluor ５９４、Alexa Fluor ６３３、Alexa Fluor ６４７、Alexa Fluor ６６０、Alexa Fluor ６８０、７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸、フルオレセイン、Oregon Green ４８８、Oregon Green ５１４、テトラメチルローダミン、ローダミンＸ、テキサスレッド染料、ＱＳＹ ７、ＱＳＹ ３３、Ｄａｂｃｙｌ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ ６５０１６６５、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ−Ｘ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ−Ｘ、ジアルキルアミノクマリン、Ｃｙ５．５、Ｃｙ５、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３、ＤＴＰＡ（Ｅｕ３＋）−ＡＭＣＡ及びＴＴＨＡ（Ｅｕ３＋）ＡＭＣＡを含むが、これらに限定されるものではない。
一具体例で、前記オリゴヌクレオチド・プローブの３’末端ヌクレオチドは、遮断されているか、または核酸ポリメラーゼによって拡張されないようになっている。かような遮断は、前記プローブの末端３’地域に、リポーター（reporter）分子またはクエンチャー分子を付着させることによって便利に行われる。
一具体例で、リポーター分子は、連結部分を介して、前記プローブの３’末端または５’末端の終端への付着のために由来した蛍光有機染料である。望ましくは、クエンチャー分子は、本発明の具体例によって、蛍光でもあり、蛍光ではなくもある、有機染料である。例えば、本発明の望ましい具体例で、前記クエンチャー分子は、非蛍光である。一般的に、クエンチャー分子が蛍光であるか、または非放射性の分解によってリポーターから伝えられるエネルギーを単純に放出するものであるならば、前記クエンチャーの吸収バンドは、前記リポーター分子の蛍光放出の吸収バンドと実質的に重なることになる。本明細書で、励起されたリポーター分子から吸収されるが、放射性のエネルギーを放出させない非蛍光クエンチャー分子を、発色性分子（chromogenic molecule）と解釈する。
リポーター・クエンチャー対は、例えば、フルオレセイン及びローダミン染料を含むキサンテン染料（xanthene dye）から選択されうる。オリゴヌクレオチドの結合のための結合部位として、または結合機能性（functionality）として使われうるフェニル部分上に置換基を有するそれら化合物の多様な適切な形態を広く商業的に入手できる。蛍光化合物の他の基は、アルファ位置またはベータ位置に、アミノ基を有するナフチルアミンである。前記ナフチルアミノ化合物は、１−ジメチルアミノナフチル−５−スルホネート、１−アニリノ−８−ナフタレンスルホネート及び２−ｐ−トルイジニル−６−ナフタレンスルホネートのような化合物を含む。他の染料は、３−フェニル−７−イソシアナートクマリン、９−イソチオシアナートアクリジン及びアクリジンオレンジのようなアクリジン；Ｎ−（ｐ−（２−ベンゾオキサゾリル）フェニル）マレイミド；ベンゾオキサジアゾール、スチルベン、ピレンなどを含む。
一具体例で、リポーター分子及びクエンチャー分子は、フルオレセイン及び非蛍光クエンチャー染料から選択される。
オリゴヌクレオチドの５’末端または３’末端に、リポーター分子またはクエンチャー分子を付着させる多様なリンキング部分（linking moiety）及び方法論は、下記参考文献に例示されいる：Eckstein，editor，Oligonucleotide and Analogues：A Practical Approach(IRL Press，Oxford，1991)；Zuckerman et al．，Nucleic Acid Research，15：5305-5321(1987)(3’thiol group on oligonucleotide)；Sharma et al．，Nucleic Acid Research，19：3019(1991)(3’sulfhydryl)；Giusti et al．，PCR Method and Applications，2：223-227(1993)，Fung et al．，米国特許第4，757，141号明細書(5’phosphoamino group via Amino link．II available from Applied Biosystems，Foster City，Calif．)Stabinsky，米国特許第4，739，044号(3’aminoalkylphosphoryl group)；Agrawal et al．，Tetrahedron Letters，31：1543-1546(1990)(attachment via phosphoramidate linkages)；Sproat et al．，Nucleic Acid Research，15：4837(1987)(5’mercapto group)；Nelson et al．，Nucleic Acid Research，17：7187-7194(1989)(3’amino group)など。
ローダミン及び非蛍光クエンチャー染料はまた、固相合成の開始段階で、オリゴヌクレオチドの３’末端に便利に付着されうる（例えば、Woo et al．，米国特許第５，２３１，１９１号明細書；及びHobbs，Jr．，米国特許第４，９９７，９２８号明細書参照）。
固体支持体へのサルモネラ特異的CataCleaveプローブの付着
本発明の一具体例で、オリゴヌクレオチド・プローブは、固体支持体に付着されうる。異なるプローブは、固体支持体に付着し、試料内の異なる標的配列を同時に検出するのに使われうる。異なる蛍光波長を有するリポーター分子は、異なるプローブに使われ、従って、異なるプローブに対する混成化が別個に検出されることを可能にする。
オリゴヌクレオチド・プローブの固定のための固体支持体の望ましい形態の例は、ポリスチレン、アビジン・コーティングされたポリスチレン・ビード・セルロース、ナイロン、アクリルアミド・ゲル及活性化されたデキストラン、統制された孔隙ガラス（ＣＰＧ：controlled pore glass）、ガラスプレート及び高交差結合（highly cross-linked）ポリスチレンを含む。かような固体支持体は、それらの化学的安定性、機能化（functionalization）の容易性及び良好に規定された表面面積のために、混成化及び診断研究において望ましい。統制された孔隙ガラス（５００Å、１，０００Å）及び非膨脹高交差結合ポリスチレン（１，０００Å）のような固体支持体が、オリゴヌクレオチド合成とのそれらの親和性（compatibility）のために特に望ましい。
オリゴヌクレオチド・プローブは、固体支持体に多様な方式で付着されうる。例えば、前記プローブは、前記プローブの３’末端または５’末端のヌクレオチドを、前記固体支持体に付着させることによって、前記固体支持体に付着されうる。しかし、前記プローブは、前記プローブを前記固体支持体から距離をおかせるリンカによって、前記固体支持体に付着されうる。前記リンカは、最も望ましくは、３０原子長以上、さらに望ましくは、５０原子長以上である。
固体支持体に固定されたプローブの混成化は、一般的に前記プローブが３０原子以上、さらに望ましくは、５０原子以上ほど、前記固体支持体から分離されることを必要とする。かような分離をなすために、リンカは、一般的に、前記リンカと３’ヌクレオシドとの間に位置したスペーサ（spacer）を含む。オリゴヌクレオチド合成のために、前記リンカアーム（arm）は、普通塩基性試薬によって切断され、オリゴヌクレオチドを前記固体支持体から自由にすることができるエステル結合によって、３’ヌクレオシドの３’−ＯＨに付着する。
オリゴヌクレオチド・プローブを固体支持体に付着させるのに使用できる多種のリンカが当業界に知られている。リンカは、標的配列が固体支持体に付着されたプローブに混成化されることを顕著に妨害しない任意の化合物によって形成されうる。リンカは、自動化された合成によって、リンカに容易に添加されうる同種重合体オリゴヌクレオチドから形成されうる。代案として、機能化されたポリエチレングリコールのようなポリマーが、前記リンカとして使われうる。かようなポリマーは、それらがプローブの標的オリゴヌクレオチドへの混成化を顕著に妨害しないために、同種重合体オリゴヌクレオチドに比べて望ましい。ポリエチレングリコールは、それが商業的に購入可能であり、有機培地及び水性培地いずれにも溶解可能であり、機能化するのに便利であり、オリゴヌクレオチド合成及び合成後の状態下で、完全に安定するために特に望ましい。
固体支持体、リンカ及びプローブ間の結合は、高温での塩基条件下で、塩基保護基の除去の間、望ましくは、切断されない。望ましい結合の例は、カルバメート結合及びアミド結合を含む。プローブの固定（immobilization）は、当業界に周知されており、業界の通常の技術者は、固定条件を決定できる。
本方法の一具体例によれば、混成化プローブは、固体支持体上に固定される。オリゴヌクレオチド・プローブは、混成化に有利な条件下で、核酸の試料と接触される。非混成化状態では、蛍光標識は、クエンチャーによって抑制される。標的と混成化されれば、蛍光標識は、クエンチャーから分離されて蛍光を発する。
また、固体支持体への混成化プローブの固定は、プローブに混成化された標的配列を試料から容易に分離させる。その後の段階で、分離された標的配列を固体支持体から分離し、研究者の特別の必要によって、当業界に周知されている方法で、加工（例えば、精製、増幅）されうる。
CataCleaveプローブを使用したサルモネラ標的核酸配列のリアルタイム検出
前記標識されたオリゴヌクレオチド・プローブは、試料内で、サルモネラ標的核酸配列のリアルタイム検出のためのプローブとして使われうる。
CataCleaveオリゴヌクレオチド・プローブは、まず、選択されたサルモネラ標的配列を含むＰＣＲアンプリコン内で発見される配列と相補的なＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列に合成される。一具体例で、前記プローブは、ＦＲＥＴ対、例えば、プローブの一末端は、フルオレセイン分子であり、他末端は、非蛍光クエンチャー分子で標識される。従って、前記プローブが、ＰＣＲアンプリコンと混成化されたとき、ＲＮａｓｅ Ｈ活性によって切断されうるＲＮＡ：ＤＮＡヘテロデュプレックス形態が形成される。
ＲＮａｓｅ Ｈは、ＲＮＡ・ＤＮＡ混成体で、ＲＮＡを加水分解する。この酵素は、初めウシの胸腺から確認されたが、その後、多様な生物で発見された。ＲＮａｓｅ Ｈ活性は、真核生物及びバクテリアに偏在して（ubiquitous）現れる。たとえＲＮａｓｅ Ｈが多様な分子量及び核溶解活性の蛋白質ファミリーによって構成されるとしても、基質必要物は、多様な同型（isotype）間で類似して現れる。例えば、これまで研究されたほとんどのＲＮａｓｅ Ｈは、エンドヌクレアーゼとして機能を行い、５’ホスフェート末端及び３’ヒドロキシル末端を有する切断生産物を生産するために、二価陽イオン（例えば、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋）を必要とする。
E. Coli由来のＲＮａｓｅ ＨＩは、ＲＮａｓｅ Ｈファミリーのうち最も周知されている。ＲＮａｓｅ ＨＩ以外にも、２番目のE. Coli ＲＮａｓｅ Ｈ、E. Coli ＲＮａｓｅ ＨＩＩがクローニングされて特性が確認された（Itaya，M．，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1990，87，8587-8591）。ＲＮａｓｅ ＨＩは、１５５個のアミノ酸からなっているのに対して、これは、２１３個のアミノ酸からなっている。E. Coli ＲＮａｓｅ ＨＩＩは、E. Coli ＲＮａｓｅ ＨＩと、ただ１７％の相同性（homology）を示すのみである。Ｓ．typhimuriumからクローニングされたＲＮａｓｅ Ｈは、E. Coli ＲＮａｓｅ ＨＩと、ただ１１個の位置で異なるのみであり、１５５個のアミノ酸からなっている（Itaya，M．and Kondo K．，Nucleic Acids Res．，1991，19，4443-4449）。
ＲＮａｓｅ Ｈ活性を示す蛋白質がクローニングされ、いくつかのウイルス、他のバクテリア及び酵母から精製された（Wintersberger，U．Pharmac．Ther．，1990，48，259-280）。多くの場合において、ＲＮａｓｅ Ｈ活性を有する蛋白質が、ＲＮａｓｅ Ｈが異なる酵素、普通ＤＮＡポリメラーゼまたはＲＮＡポリメラーゼのアミノ末端またはカルボキシ末端に融合された融合蛋白質に現れる。ＲＮａｓｅ Ｈドメインは、大腸菌ＲＮａｓｅ ＨＩと高い相同性があると持続的に明らかにされたが、他のドメインが実質的に多様であり、融合蛋白質の分子量及び他の特性が非常に多様である。
高等真核生物で、ＲＮａｓｅ Ｈの２個クラスは、分子量、二価陽イオンの効果、スルフヒドリル（sulfhydryl）試薬に対する感受性及び免疫学的交差反応性の差に基づいて、定義されてきた（Busen et al．，Eur．J．Biochem．，1977，74，203-208）。ＲＮａｓｅ ＨＩ酵素は、６８ないし９０ｋＤａ範囲の分子量を有し、Ｍｎ２＋またはＭｇ２＋によって、活性化され、スルフヒドリル試薬に無感受性であると報告されている。反対に、ＲＮａｓｅ ＨＩＩ酵素は、３１ないし４５ｋＤａ範囲の分子量を有し、Ｍｇ２＋を必要とし、スルフヒドリル試薬に高感受性を示し、Ｍｎ２＋によって抑制されると報告されている（Busen，W．，and Hausen，P．，Eur．J．Biochem．，1975，52，179-190；Kane，C．M．，Biochemistry，1988，27，3187-3196；Busen，W．，J．Biol．Chem．，1982，257，7106-7108）。
ＲＮａｓｅ ＨＩＩ特性を有する酵素が、ヒト胎盤からほぼ均質に精製された（Frank et al．，Nucleic Acids Res．，1994，22，5247-5254）。この蛋白質は、約３３ｋＤａの分子量を有し、６．５ないし１０のｐＨ範囲で活性化され、最適ｐＨが８．５ないし９であると報告されている。前記酵素は、Ｍｇ２＋を必要とし、Ｍｎ２＋及びｎ−エチルマレイミドによって抑制されると報告されている。切断反応の生成物は、３’ヒドロキシル末端及び５’ホスフェート末端を有する。
一具体例によれば、リアルタイム核酸増幅は、熱安定性核酸ポリメラーゼ、ＲＮａｓｅ Ｈ活性、サルモネラ標的ポリヌクレオチドに混成化されうるＰＣＲ増幅プライマー対、及び標識されたCataCleaveオリゴヌクレオチド・プローブの存在下で、標的ポリヌクレオチドで行われる。リアルタイムＰＣＲ反応の間、ＲＮａｓｅ Ｈによるプローブの切断は、蛍光クエンチャーから蛍光供与体を分離させ、試料内のサルモネラ標的ＤＮＡ配列のリアルタイム検出によって、プローブの蛍光をリアルタイムで増加させる。
図７から分かるように、一具体例で、リアルタイム核酸増幅は、約４０回以下のＰＣＲ増幅サイクルで、単一標的ＤＮＡ分子のリアルタイム検出を可能にする。
キット
本発明はまた、試料内のサルモネラ標的核酸配列のリアルタイム検出のための一つ以上の反応試薬を有する包装単位を含むキット形態を提供する。また前記キットは、一つ以上の下記の品目を含むことができる：緩衝液、使用説明書、及び陽性対照群または陰性対照群。キットは、本明細書に記述された方法を行うために、適切な割合で共に混合された反応試薬の容器を含むことができる。反応試薬容器は、望ましくは、前記方法を行うときに測定する段階を省略できるように、単位数量の反応試薬を含む。
キットはまた、これらに限定されるものではないが、熱安定ポリメラーゼ、熱安定ＲＮａｓｅ Ｈ、サルモネラ核酸標的配列を増幅させるために選択されたプライマー、及びリアルタイムＰＣＲ産物にアニーリングされる標識されたCataCleaveオリゴヌクレオチド・プローブを含むリアルタイムＰＣＲのための反応試薬を含み、本明細書に記述された方法論によって、サルモネラ標的核酸配列の検出を可能にする。キットは、２個以上のサルモネラ標的核酸配列の検出のための反応試薬を含むことができる。キット反応試薬はまた、適用できるＲＴ−ＰＣＲ分析のための反応試薬を含むことができる。他の具体例で、前記キット試薬は、生物学的試料からゲノムＤＮＡまたはゲノムＲＮＡを抽出するための試薬をさらに含む。また、キット試薬は、逆転写酵素ＰＣＲ分析に適用するための試薬を含むことができる。
一具体例で、前記増幅プライマーセットは、配列番号１及び２、または３及び４、または５及び６の配列を有する。
他の具体例で、前記CataCleaveオリゴヌクレオチド・プローブは、配列番号７または８または１３または１４の配列を有する。
試料でのサルモネラＩｎｖＡ遺伝子配列のリアルタイム検出例
実施例１によれば、食品試料（固体または液体）内または表面のサルモネラ種富化の実施例を示す。試料がテストされうるように、食品試料をプラスチック・バッグに入れ、正常な保管温度に近い温度で、２４ないし４８時間ほど培養する。かようなことは、試料が商業的な処理や国内の厨房で、一般的に扱われるところを倣ったものであり、自然に死んだり、またはバクテリア汚染物質が増殖されるようにするのである。具現するための目的として、汚染された試料を摸倣するために、実施例１で、サケにサルモネラパラチフスＢを人為的に接種した。正常には、前記試料は、生産施設から収得されたものとして処理されたものである。表面のために、試料を４インチｘ４インチ、または１インチｘ１インチとした。４ｘ４インチ試料は、Dey−Engley培地１０ｍＬが含まれた成分が明確に究明された溶液を、スポンジを利用して表面試料を清め、１Ｘ１インチ試料の場合は、Dey−Engley培地で湿した綿棒を利用してふき取った。スポンジと綿棒は、それぞれプラスチック・バッグに入れておいた。表面試料は、２４ないし４８時間の初期保管期間を経ない。初期保管期間後、さらに食品試料は、試料のマトリックス（sample matrix）によって、２５ｇまたは２５ｍＬでいくつかに分ける。前記部分は、富化（enrichment）するまで、個人プラスチック・バッグにおく。
表面及び部分の食品試料は、トリプチカーゼ豆培地（trypticase soy broth）２２５ｍＬで富化させる。それぞれのプラスチック・バッグに培地を追加した後、培地を密封し、内容物が試料を介して富化培地を分散させるために、ストマッカー機器（stomacher device）を利用して前記内容物を処理した。前記試料は、35°Cないし42°Cで、１８ないし２４時間の間培養する。培養期間の間、サルモネラは、汚染された内容物が入っている試料バッグで増殖する。富化は、汚染された試料で、サルモネラスレショルド値が、分析のための核酸の濃度を十分に超えるようにする。
実施例２で、一具体例として、核酸を見つけ出すために、富化された試料の溶解（lysis）を記載している。増殖された試料の小さい一部は、アジ化ナトリウム（sodiuma zide）、プロテイナーゼＫ（proteinase Ｋ）、及びデタージェントTriton Ｘ−１００で溶解される。前記プロテイナーゼＫ及びTriton Ｘ−１００は、バクテリア細胞壁を破り、核酸が外に出させる。アジ化ナトリウムの機能は、ほとんど知られていなかったが、溶解試薬の効率性を高めるための還元剤としての役割を行う。溶解後、前記試料は、プロテイナーゼＫを不活性化させるために、95°Cに加熱した。
図２では、食品及び表面で、サルモネラ属に係わる、組み合わされたＰＣＲ／CataCleaveプローブ検出方法の一具体例が例示されている。ＰＣＲプライマーは、配列番号１及び２を有し、サルモネラ種特異的な浸湿遺伝子の一部増幅のためのＰＣＲプライマーは、アンプリコンのリアルタイム検出のために使われうるCataCleaveと結合される。実施例３に開示された、熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及びウラシル−Ｎ−グリコリラーゼ（ＵＮＧ）を含む適切な反応緩衝液で、前記反応は行われる。反応サイクルの間、試料は、37°Cで最初に培養され、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼによって、以前検査から越えてきたウラシルを含むあらゆる核酸を切断する。かような物質は、サルモネラの疑陽性（false positive）検出を起こしうる汚染源である。ＵＮＧは、バクテリア溶解から得た核酸には影響を及ぼさないが、前記核酸は、チミジン（thymidine）位置にウラシル（uracil）を含まないためである。培養後、溶解から得た核酸は、高温で変性され、ＵＮＧは、不活性化される。温度が低くなるにつれ、浸湿遺伝子に特異的なプライマー及びCataCleaveプローブは、サルモネラ属特異的なアンプリコンに混成化される。混成化後、CataCleaveプローブは、ＲＮａｓｅ Ｈによって、ＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスのＲＮＡ部分が切断される。切断されることになれば、前記プローブ断片は、それらの標的から離れ、反応溶液で分散される。前記CataCleaveプローブは、蛍光供与体及びクエンチャーで標識され、損傷していない（intact）状態で、供与体からの蛍光は、大きく低減される。前記プローブ断片の分散は、供与体とクエンチャーとの間の距離を延長させ、供与体蛍光がそれ以上弱くならない。供与体蛍光放出のかような増大は、Applied Biosystems ７５００ Fast Real-Time ＰＣＲ SystemまたはBiorad ＣＦＸ９６ real-time ＰＣＲ thermocyclerのような適切な機器を利用してリアルタイムで検出されうる。
プローブ断片が標的から離れた後、他のCataCleaveプローブは、同じ場所に混成化され、切断反応が反復される。１つのアンプリコンが多様なCataCleaveプローブの切断のためのテンプレートとして作用することができるために、かようなサイクル過程は、信号を増幅することができる。かような時間の間、遺伝子特異的なプライマーは、ヌクレオシド三リン酸の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼによって伸張しうる。いったんプライマーがCataCleaveプローブ結合位置に伸張されれば、それ以上の切断は起こらない。伸張後、増幅サイクル及び検出サイクルが完了し、アンプリコンの数は二倍となる。このように、新しく合成されたアンプリコンは、次の増幅／検出サイクルで、テンプレートとして作用する。
図３では、サケに係わるリアルタイムＰＣＲ CataCleaveの結果の一具体例であり、サルモネラパラチフスＢを人為的に接種した。前記図面は、汚染されたサケサンプルから得た核酸が、前記検出のテンプレートとして使われうることを示している。十分な量のＤＮＡテンプレートが含まれた検出で、フルオレセイン放出強度記録（emission intensity trace）は、標的増幅と関連して、指数関数の特徴的な形態を有する。強度値（intensity value）は、結局試薬の一部のように渋滞状態となる。サルモネラで汚染されていないサンプルは、贋物増殖（mock enrichment）を利用して行った陰性対照群検出と比較して、蛍光放出でいかなる増大も示していない。
図４Ａ及び図４Ｂは、リアルタイムＰＣＲ CataCleave反応の組成物を検証するために、内部対照群の使用に係わる具体例である。試薬が、キット製造時に、品質管理細部事項（quality control specification）を充足するにしても、リアルタイム検出に使われた一つ以上の試薬が分解されうる可能性がある。かような条件下で、効果的な検出は失敗し、偽陰性結果が出てくることがある。かような場合は、リアルタイム反応で、サルモネラ種特異的なテンプレートの存在いかんによって、陽性結果を示すものであると知られている内部対照群（internal control）を含めて確認することができる。かような内部対照群の一実施例としては、サルモネラアンプリコンＤＮＡ配列と類似した長さであるが、サルモネラ増幅のためのプライマー及びプローブとは異なる結合部位を有する、短いランダムＤＮＡ配列を含むプラスミドでありうる。このように含まれた配列及びCataCleaveプローブは、サルモネラ種、または非常に関連性のいかなる生物体とも何らの相同性もあってはならない。実施例４は、かような内部対照群の形態を含む。内部対照群のコピー数は、サルモネラ・ティフィムリウムの効果的な増幅を干渉しないように制限される。
図５では、サルモネラゲノムＤＮＡの１ないし１０６のコピーを検出するための、組み合わされたＰＣＲ／CataCleaveプローブ検出方法の一具体例が例示されている。ＰＣＲプライマーは、配列番号３及び４を有し、サルモネラ種特異的な浸湿遺伝子の一部増幅のためのＰＣＲプライマーは、アンプリコンのリアルタイム検出のために使われうる配列番号１３のCataCleaveプローブと結合される。
プライマー及びプローブセット３３
かようなセットは、１４０９ないし１５６４を増幅し、前記プローブは、１４７３ないし１４８９に結合される、（Ｉｎｖ遺伝子配列Ｕ４３２７３参照）。
プライマー：
５’−ＡＣＧ ＣＧＣ ＴＴＧ ＡＴＧ ＡＧＣ ＴＴＴ ＡＣ（配列番号３）
５’−ＧＴＴ ＧＴＡ ＣＣＧ ＴＧＧ ＣＡＴ ＧＴＣ ＴＧ（配列番号４）
プローブ：
５’−／ＦＡＭ／ＣＧＧＴＡＴＴｒＣｒＡｒＧｒＧＡＡＡＣＡＡ／ＩａＢｌｋＦＱ／（配列番号１３）
小文字「ｒ」は、プローブでのＲＮＡを示す。供与体はＦＡＭであり、クエンチャーは、アイオワブラックＦＧ（Iowa Black ＦＱ）である。
実施例３に開示された、熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及びウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを含む適切な反応緩衝液で、前記反応は行われる。反応サイクルの間、サンプルは、37°Cで最初に培養され、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼによって、以前検査から越えてきたウラシルを含むあらゆる核酸は切断されうる。かような物質は、サルモネラの疑陽性検出を起こしう汚染源である。ＵＮＧは、バクテリア溶解から得た核酸には影響を及ぼさないが、前記核酸は、チミジン位置にウラシルを含まないためである。培養後、溶解から得た核酸は、高温で変成され、ＵＮＧは不活性化される。温度が低くなるにつれ、浸湿遺伝子に特異的なプライマー及びCataCleaveプローブは、サルモネラ属特異的なアンプリコンと混成化される。混成化後、CataCleaveプローブは、ＲＮａｓｅ Ｈによって、ＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスのＲＮＡ部分が切断される。切断されれば、前記プローブ断片は、それらの標的から離れ、反応溶液に分散される。前記CataCleaveプローブは、蛍光供与体及びクエンチャーで標識され、損傷されていない状態で、供与体からの蛍光は大きく低減される。前記プローブ断片の分散は、供与体とクエンチャーとの間の距離を延長させ、供与体蛍光がそれ以上弱くならない。供与体蛍光放出のかような増大は、Applied Biosystems７５００ Fast Real-Time ＰＣＲ SystemまたはBiorad ＣＦＸ９６ real-time ＰＣＲ thermocyclerのような適切な機器を利用してリアルタイムで検出されうる。プローブ断片が標的から離れた後、他のCataCleaveプローブは、同じ場所に混成化され、切断反応が反復される。１つのアンプリコンが多様なCataCleaveプローブの切断のためのテンプレートとして作用できるために、かようなサイクル過程は、信号を増幅できる。かような時間の間、遺伝子特異的なプライマーは、ヌクレオシド三リン酸の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼによって伸張しうる。いったんプライマーがCataCleaveプローブ結合位置に伸張されるならば、それ以上の切断は起こらない。伸張後、増幅サイクル及び検出サイクルが完了し、アンプリコンの数は二倍となる。このように、新しく合成されたアンプリコンは、次の増幅／検出サイクルでテンプレートとして作用する。
図５は、配列番号１３のCataCleaveプローブと組み合わされた配列番号３及び４のプライマー対が、４０またはそれ以下の増幅サイクルで、サルモネラゲノムＤＮＡの１つのコピーを検出することができるということを示している。
図６では、サルモネラゲノムＤＮＡの１ないし１０６のコピーを検出するための、組み合わされたＰＣＲ／CataCleaveプローブ検出方法の一具体例が例示されている。ＰＣＲプライマーは、配列番号５及び６を有し、サルモネラ種特異的な浸湿遺伝子の一部増幅のためのＰＣＲプライマーは、アンプリコンのリアルタイム検出のために使われうる配列番号１４のCataCleaveプローブと結合される。
プライマー及びプローブセット３４
かようなセットは、１４９２ないし１６０９を増幅し、前記プローブは、１５３０ないし１５５１に結合される（Ｉｎｖ遺伝子配列Ｕ４３２７３参照）。
プライマー：
５’−ＣＡＴ ＡＴＧ ＣＴＧ ＧＡＣ ＣＡＡ ＣＴＧ ＧＡ（配列番号５）
５’−ＣＧＧ ＡＡＡ ＣＡＣ ＧＴＴ ＣＧＣ ＴＴＡ ＡＴ（配列番号６）
プローブ：
５’−／ＦＡＭ／ＡＴＧＴＣＴＧＡＧｒＣｒＡｒＣｒＵＴＣＴＴＴＡＡＧＴ／ＩａＢｌｋＦＱ／（配列番号１４）
小文字「ｒ」は、プローブでのＲＮＡを示す。供与体はＦＡＭであり、クエンチャーは、アイオワブラックＦＧ（Iowa Black ＦＱ）である。
実施例３に開示された、熱安定性ＲＮａｓｅ Ｈ、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及びウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを含む適切な反応緩衝液で、前記反応は行われる。反応サイクルの間、サンプルは、37°Cで最初に培養され、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼによって、以前の検査から越えてきたウラシルを含むあらゆる核酸は切断されうる。かような物質は、サルモネラの疑陽性検出を起こしうる汚染源である。ＵＮＧは、バクテリア溶解から得た核酸には影響を及ぼさないが、前記核酸は、チミジン位置にウラシルを含まないためにある。培養後、溶解から得た核酸は、高温で変性され、ＵＮＧは不活性化される。温度が低くなるにつれ、浸湿遺伝子に特異的なプライマー及びCataCleaveプローブは、サルモネラ属特異的な核酸に混成化される。混成化後、CataCleaveプローブは、ＲＮａｓｅ Ｈによって、ＲＮＡ／ＤＮＡデュプレックスのＲＮＡ部分が切断される。切断されれば、前記プローブ断片は、それらの標的から離れ、反応溶液に分散される。前記CataCleaveプローブは、蛍光供与体及びクエンチャーで標識され、損傷されていない状態で、供与体からの蛍光は大きく低減される。前記プローブ断片の分散は、供与体とクエンチャーとの間の距離を延長させ、供与体蛍光がそれ以上弱くならない。供与体蛍光放出のかような増大は、Applied Biosystems ７５００ Fast Real-Time ＰＣＲ SystemまたはBiorad ＣＦＸ９６ real-time ＰＣＲ thermocyclerのような適切な機器を利用して、リアルタイムで検出されうる。プローブ断片が標的から離れた後、他のCataCleaveプローブは、同じ場所に混成化され、切断反応が反復される。１つのアンプリコンが多様なCataCleaveプローブの切断のためのテンプレートとして作用できるために、かようなサイクル過程は、信号を増幅できる。かような時間の間、遺伝子特異的なプライマーは、ヌクレオシド三リン酸の存在下で、ＤＮＡポリメラーゼによって伸張しうる。いったんプライマーがCataCleaveプローブ結合位置に伸張されるならば、それ以上の切断は起こらない。伸張後、増幅サイクル及び検出サイクルが完了し、アンプリコンの数は二倍となる。このように、新しく合成されたアンプリコンは、次の増幅／検出サイクルでテンプレートとして作用する。
図６は、配列番号１４のCataCleaveプローブと組み合わされた配列番号５及び６のプライマーセットが、４０回未満の増幅サイクル内で、サルモネラゲノムＤＮＡの信号コピーを検出できるということを示している。
本発明は、下記実施例によって詳細に説明され、それらは、いかなる方法によっても限定されるものではないと解釈されねばならない。
実施例１：サケでのサルモネラ属パラチフスＢ菌の富化（enrichment）
３００ｇ当たり４ＣＦＵのタイタ（titer）で、サルモネラ属パラチフスＢ菌をサケに接種した。サルモネラ・コロニーを５μｌのトリプチケースソイブロス（trypticase soy broth）に接種し、35°Cで一晩振盪培養した。前記培養液を１ｘ ＰＢＳ（phosphate buffered saline）に希釈し、サルモネラのタイタは、トリプチケースソイ寒天培地（trypticase soy agar）上でプレートカウント・アッセイ（plate count assay）によって決定された。サケ切り身（fillet）の重さを量り、１ｘ ＰＢＳに希釈されたサルモネラ属パラチフスＢ菌を、ピペットを利用して接種し、サケ切り身の表面上に押しなべて細菌を分布させた。前記処理されたサケを、プラスチック・バッグに入れて手でもみ込み、前記接種された細菌が押しなべて分布されるようにした。その後、前記バッグを密封し、4°Cで４８時間培養させた。
前記試料を、滅菌されたナイフをを利用して２５ｇずつの部分に分け、それぞれの部分をプラスチック・バッグに入れた。それぞれの部分を、２２５μｌのトリプチケースソイブロスに再懸濁し、ストマッカー機器（Stomacher ４００ circulator）を利用し、２５０ｒｐｍで２分間破砕させた。その後、試料を35°Cで１８ないし２４時間培養した。
実施例２：集積後のサルモネラ属パラチフスＢ菌の溶菌
前記サルモネラ集積（５μｌ）部分を、１ｍｇ／μｌのプロテイナーゼＫ、０．３１２５ｍｇ／μｌのアジ化ナトリウム、０．１２５％のTriton Ｘ−１００、及び１２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含む４５μｌの溶菌溶液に希釈させた。前記試料を、55°Cで１５分間培養させた後、95°Cで１０分間プロテイナーゼＫを不活性化させた後、4°Cに冷却させた。
実施例３：サケでのサルモネラ属パラチフスＢ菌のリアルタイム検出
リアルタイム反応は、２μｌの溶解物と、２３μｌのＰＣＲ反応ミックスとを混合した。前記ＰＣＲ反応ミックスは、３２ｍＭ ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）−ＫＯＨ ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、４ｍＭ酢酸マグネシウム、０．１１％ウシ血清アルブミン、１％ジメチルスルホキシド、８００μＭ Salmonellaフォワード・プライマー、８００μＭ Salmonellaリバース・プライマー、２００μＭ Salmonella CataCleaveプローブ、ｄＵＴＰ／ＮＴＰミックス（８０μＭ ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ及び１６０μＭｄ ＵＴＰ）、２．５ユニットのThermus aquaticus ＤＮＡ重合酵素、１ユニットのPyrococcus furiosis ＲＮａｓｅ ＨＩＩ、及び０．１ユニットのウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを含んでいる。
前記サルモネラのフォワード・プライマー及びリバース・プライマーは、サルモネラ浸湿遺伝子内に含まれた１８０ｂｐの切片を増幅させた。
前記プライマー及びプローブの配列は、次の通りである：
Salmonellaフォワード・プライマー：５’−ＴＣＧＴＣＡＴＴＣＣＡＴＴＡＣＣＴＡＣＣ（配列番号１）
Salmonellaリバース・プライマー：５’−ＴＡＣＴＧＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧＣＣＡＧＡＣＧＡＡ（配列番号２）
Salmonella CataCleaveプローブ：５’−／ＦＡＭ／ＣＧＡＴＣＡＧｒＧｒＡｒＡｒＡＴＣＡＡＣＣＡＧ／ＩＡＢＦＱ）（配列番号７）
前記小文字「ｒ」は、ＲＮＡ塩基を意味する（すなわち、ｒＧはリボグアノシンである）。
略語：ＦＡＭ：６−カルボキシフルオレセイン、ＢＨＱ：Integrated ＤＮＡ Technologies（Coralville、ＩＡ）社の短波長放出用Black Hole Quenche
反応は、常温で行われ、下記循環プロトコルを使用して、Roche Lightcycler ４８０で、リアルタイムＰＣＲ反応を進めた：37°Cで１０分；95°Cで１０分；その後、５０回の間増幅反応；95°Cで１５秒、60°Cで２０秒。
ＦＡＭ放出は、前記60°C段階の間にモニタリングされた。前記リアルタイムＦＡＭ信号の結果を、図３に示した。前記結果は、テストされた１１個の試料のうち９つで、サルモネラ属パラチフスＢ菌汚染に係わる陽性結果を示している。陰性対照群反応は、前記溶菌液の代わりに、２μｌの水が使われたことを除いては、前記反応成分がいずれも含まれた。前記データのＭＰＮ分析は、前記検出感度が０．７５ＣＦＵ／ｇであることを示している。
実施例４：リアルタイムＰＣＲ増幅反応の品質管理（quality control）確認
サルモネラ・ティフィムリウムをトリプチケースソイブロスに接種させ、35°Cで一晩振盪培養して最大細胞密度まで成長させた。前記集積（５μｌ）部分を、１ｍｇ／μｌのプロテイナーゼＫ、０．３１２５ｍｇ／μｌのアジ化ナトリウム、０．１２５％のTriton Ｘ−１００、及び１２．５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を含む４５μｌの溶菌溶液に希釈させた。前記試料を55°Cで１５分間培養させた後、95°Cで１０分間プロテイナーゼＫを不活性化させ、4°Cに冷却させた。
リアルタイム反応は、２μｌの溶解物と、２３μｌのＰＣＲ反応ミックスとを混合した。前記ＰＣＲ反応ミックスは、３２ｍＭ ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ ｐＨ７．８、１００ｍＭ酢酸ナトリウム、４ｍＭ酢酸マグネシウム、０．１１％ウシ血清アルブミン、１％ジメチルスルホキシド、８００μＭ Salmonellaフォワード・プライマー、８００μＭ Salmonellaリバース・プライマー、２００μＭ Salmonella CataCleaveプローブ、２００μＭ内部増幅対照群CataCleaveプローブ、１５コピーの内部増幅対照群プラスミド、ｄＵＴＰ／ＮＴＰミックス（８０μＭ ｄＧＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＡＴＰ及び１６０μＭ ｄＵＴＰ）、２．５ユニットのThermus aquaticus ＤＮＡ重合酵素、１ユニットのPyrococcus furiosis ＲＮａｓｅ ＨＩＩ、及び０．１ユニットのウラシル−Ｎ−グリコシラーゼを含んでいる。
前記プライマー及びプローブの配列は、次の通りである：
Salmonellaフォワード・プライマー：５’−ＴＣＧＴＣＡＴＴＣＣＡＴＴＡＣＣＴＡＣＣ（配列番号１）
Salmonellaリバース・プライマー：５’−ＴＡＣＴＧＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧＣＣＡＧＡＣＧＡＡ（配列番号２）
Salmonella CataCleaveプローブ：
５’−／ＦＡＭ／ＣＧＡＴＣＡＧｒＧｒＡｒＡｒＡＴＣＡＡＣＣＡＧ／ＩＡＢＦＱ／（配列番号７）
Salmonella 内部増幅対照群フォワード・プライマー：
５’−ＣＴＣＧＣＧＣＧＴＡＧＡＴＴＧＣＣＡＴＧＣＧＴＡＧＡＧＣ（配列番号９）
Salmonella 内部増幅対照群リバース・プライマー：
５’−ＧＴＧＡＡＣＣＣＡＣＴＴＧＣＣＴＴＴＧＣＧＴＣＴＴＡＡＴ（配列番号１０）
サルモネラ内部増幅対照群プローブ：
５’−／ＴＹＥ６６５／ＡＧＧＴＡＡＣＣｒＧｒＡｒＡｒＡＡＣＡＡＧＣＣ−／ＩＡＢＦＱ／（配列番号１１）
小文字「ｒ」は、ＲＮＡ塩基を意味する（すなわち、ｒＧはリボグアノシンである）。
略語：ＦＡＭ：６−カルボキシフルオレセイン；ＴＹＥ６６５：Integrated ＤＮＡ Technologies（Coralvile、ＩＡ）社のＣｙ５の変形体；ＩＡＢＦＱ：Intergrated ＤＮＡ Technologies（Coralville、ＩＡ）社の短波長放出のためのBlack Hole Quencher；ＩＡＢＲＱ：Intergrated ＤＮＡ Technologies（Coralville、ＩＡ）社の長波長放出のためのBlack Hole Quencher。
反応は、常温で行われ、下記循環プロトコルを使用して、Roche Lightcycler ４８０でリアルタイムＰＣＲ反応を進めた：37°Cで１０分、95°Cで１０分、その後、５０回間増幅反応、95°Cで１５秒、最後に60°Cで２０秒。
ＦＡＭ及びＴＹＥ６６５（Ｃｙ５チャネルで）は、前記60°C段階の間にモニタリングされた。前記リアルタイムＦＡＭ（サルモネラ・ティフィムリウム）及びＴＹＥ６６５（内部増幅対照群）信号の結果を、図４Ａ及び図４Ｂに示した。前記結果は、サルモネラ及び内部増幅対照群は、チャネル間に混線（closstalk）なしに同時に検出されうるということを示している。
サルモネラの存在に対する陽性である試料は、ＦＡＭチャネルで、特徴的なｓ字形のリアルタイム増幅信号を示している。同時に、ＣＹ５チャネルで、内部対照群がモニタされ、この信号はまた、内部増幅対照群プラスミドの存在に対して陽性になる。かような情報は、反応混合物のあらゆる要素が、品質管理細部事項内にあるということを確認するのに使われ、前記獲得したデータは、ＦＡＭチャネルで有効である。
実施例５：プライマー及びプローブ（１）の包括性（inclusivity）
実施例３と類似した過程によって、総１１６個の標準サルモネラ血清型（serovar）を対象でそれらの標的核酸の検出をテストした。
本実施例で、Maryland Department of Health and Mental Hygieneから提供された６０個のサルモネラ血清型を対象に、実施例３で使用したのと同じプライマー／プローブセットを使用して検出テストした。本実施例では、５ｍｌのテスト細胞懸濁液を、95°Cで１０分間、４５ｍｌの溶解緩衝液（２％Triton−Ｘ、５ｍｇ／ｍｌアジ化ナトリウム、０．２Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ＝８；A．Abolmaaty，C．Vu，J．Oliverand R．E．Levin Microbios 101，181-189，2000）内で抽出し、２ｍｌの溶解結果物をテンプレートとして使用する方法で、実施例３の過程を変形した。あらゆる血清型が効率的に検出された。その結果を下記表１に示した。
表１で、それぞれの細胞の最初の行は、サルモネラ種（血清型）の名称であり、２行目は、種またはaccession＃で、３行目は低減したＣｐである。
実施例６：プライマー及びプローブの包括性
実施例５と類似した過程によって、Manassas、ＶＡ（ＵＳＡ）のAmerican Type Culture Collection（ＡＴＣＣ）から購入した５４個のサルモネラ血清型を対象に、実施例３で使用したのと同じプライマー／プローブセットを使用して検出テストした。あらゆる血清型が効率的に検出された。その結果を下記表２に示した。
表２で、それぞれの細胞の最初の行は、サルモネラ種（血清型（serovar））の名称であり、２行目は、種またはaccession＃であり、３行目は、低減したＣｐである。
実施例７：食品試料のテスト
実施例５と類似した過程によって、多様な食品試料に、表３に開示されたサルモネラ血清型をそれぞれ接種した後、サルモネラ血清型検出テストを行った。結果を下記表３に示した。表３で、接種レベルから獲得された陽性比率をＡＯＡＣ International（Gaithersburg、ＭＤ、ＵＳＡ）によって、有効であると考慮される。
実施例８：ＩｎｖＡ遺伝子プライマーセットの比較
ＩｎｖＡ遺伝子プライマーは、下記論文から選択された：
Hoorfar J．et al．，J．Clin．Micro．38(2000)，pp．3429-3435
（１）SalmonellaＦ１：５’−ＴＣＧ ＴＣＡ ＴＴＣ ＣＡＴ ＴＡＣ ＣＴＡ ＣＣ（配列番号１）
（２）SalmonellaＲ：５’−ＡＡＡ ＣＧＴ ＴＧＡ ＡＡＡ ＡＣＴ ＧＡＧ ＧＡ（配列番号１８）
Trafny EA et al．，Lett．Appl．Micro．43(2006)，pp．673-679
（３）Ｓａｌ−ｉｎｖＦ：５’−ＡＣＡ ＧＴＧ ＣＴＣ ＧＴＴ ＴＡＣ ＧＡＣ ＣＴＧ ＡＡＴ（配列番号１５）
（４）Ｓａｌ−ｉｎｖＲ：５’−ＡＧＡ ＣＧＧ ＣＴＧ ＧＴＡ ＣＴＧ ＡＴＣ ＧＡＴ ＡＡＴ（配列番号１９）
Fey A．et al．，App．Env．Micro．70(2004)，pp．3618-3623
（５）Ｓａｌ−ＩｎｖＡ２−Ｆ１：５’ＧＡＴ ＴＣＴ ＧＧＴ ＡＣＴ ＡＡＴ ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＡＴ Ｃ（配列番号１６）
（６）Ｓａｌ−ＩｎｖＡ２−Ｒ１：５’ＧＣＣ ＡＧＧ ＣＴＡ ＴＣＧ ＣＣＡ ＡＴＡ ＡＣ（配列番号２０）
（７）Ｓａｌ−ＩｎｖＡ２−Ｆ２：５’−ＧＡＴ ＴＣＴ ＧＧＴ ＡＣＴ ＡＡＴ ＧＧＴ ＧＡＴ ＧＡＴ ＣＡＴ ＴＴＣ Ｔ（配列番号１７）
（８）Ｓａｌ−ＩｎｖＡ２−Ｒ２：５’−ＧＣＣ ＡＧＧ ＣＴＡ ＴＣＧ ＣＣＡ ＡＴＡ ＡＣＧ（配列番号２７）
それらプライマーのうち一部は変形し、下記のような新しいプライマーに製造された：
（９）ＩｎｖＡ−Ｓ１：５’−ＴＧＡ ＴＴＣ ＴＧＧ ＴＡＣ ＴＡＡ ＴＧＧ ＴＧＡ ＴＧ（配列番号２１）
（１０）ＩｎｖＡ−Ｓ２：５’−ＣＴＡ ＴＧＴ ＴＣＧ ＴＣＡ ＴＴＣ ＣＡＴ ＴＡＣ ＣＴＡ Ｃ（配列番号２２）
（１１）ＩｎｖＡ−Ｓ３：５’−ＣＣＧ ＴＧＧ ＴＣＣ ＡＧＴ ＴＴＡ ＴＣＧ（配列番号２３）
（１２）ＩｎｖＡ−Ａ１：５’−ＡＡＣ ＴＧＡ ＧＧＡ ＴＴＣ ＴＧＴ ＣＡＡ ＴＧＴ ＡＧ（配列番号２４）
（１３）ＩｎｖＡ−Ａ２：５’−ＡＡＡ ＡＡＣ ＴＧＡ ＧＧＡ ＴＴＣ ＴＧＴ ＣＡＡ ＴＧＴ ＡＧ（配列番号２５）
（１４）ＩｎｖＡ−Ａ３：５’−ＧＧＣ ＡＴＣ ＣＧＣ ＡＴＣ ＡＡＴ ＡＡＴ ＡＣ（配列番号２６）
（１５）Ｓａｌ−ＩｎｖＲ２：５’−ＴＡＣＴＧＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧＣＣＡＧＡＣＧＡＡ（配列番号２）
ＩｎｖＡ遺伝子候補群プライマー：
これら１５個のプライマーは、サルモネラ検出敏感性を決定し、プライマー二量体（互いにテンプレートとして作用するプライマーから由来したアンプリコン）の生成のために、マトリックス内でスクリーニングされた。分析後、８個のセットが感知するほどのプライマー二量体を形成せず、標的の１０ないし１，０００のコピー間で検出されうるということを発見した。それらのセットは、それぞれプライマー番号１−５，１−７，３−１４，４−５，４−７，８−５，９−５及び４−１５である。それらプライマーセットの一部に係わる代表的なデータを、図１０に示した。
前記結果は、他のプライマーセットと比較するとき、プライマーセット４−１５（配列番号１及び２；太い黒色線に該当する）がそれぞれの濃度で、Ｃｐ値が多いサイクルであるとき、他のプライマーセットを使用した同じ濃度に係わる相応する値より低いさらに良好な性能を示している。
実施例９：サルモネラＩｎｖＡ遺伝子CataCleaveプローブの比較
３個の互いに異なるプローブを合成して、効率性をテストした。
Ｉｎｖ−ＣＣ−probe１：５’−ＣＴＧ ＧＴＴ ＧＡｒＴ ｒＴｒＴｒＣ ＣＴＧ ＡＴＣ Ｇ（配列番号２８）
Ｉｎｖ−ＣＣ−probe２：５’−ＣＧＡ ＴＣＡ ＧｒＧｒＡ ｒＡｒＡＴ ＣＡＡ ＣＣＡ Ｇ（配列番号３０）
Ｉｎｖ−ＣＣ−probe ３：５’−ＣＡＧ ＴＴＴ ＴＴＣｒ ＡｒＡｒＣ ｒＧＴＴ ＴＣＣ ＴＧＣ（配列番号２９）
図１１（Ｉｎｖ−ＣＣ−probe１及び２）及び図１２（Ｉｎｖ−ＣＣ−probe ３）に、結果を示した。プローブ１，２及び３の比較から、低減されたＣｐ値、及び動的範囲（dynamic range）いずれについても、プローブ１より明白にさらに良好な性能を示している。図１２から分かるように、プローブ３は、本実験で切断されなかった。かような結果は、本発明の一具体例によるＩｎｖ−ＣＣ−probe２が、比較プローブ（comparative probe）に比べて、はるかに良好な効率性を示すということを示している。
本明細書で開示されたいかなる特許、特許出願、公開または他の開示資料は、その全体として本明細書に参照として挿入される。ここで、参照として挿入されるとするいかなる資料またはその一部も、本明細書の定義、陳述またはその他開示資料と矛盾する場合、挿入された資料と現在開示資料との間に、矛盾しないほどにのみ挿入されると解釈するのである。

Claims (54)

  1. ａ）サルモネラｉｎｖＡ遺伝子標的ＤＮＡの存在を確認するために、試料を提供する段階と、
    ｂ）配列番号１及び２のプライマーセット、配列番号３及び４のプライマーセット並びに配列番号５及び６のプライマーセットからなる群から選択されるサルモネラｉｎｖＡ遺伝子標的ＤＮＡにアニーリングすることができる増幅プライマーセットを提供する段階と、
    ｃ）前記サルモネラ標的ＤＮＡに実質的に相補的なＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列、並びに検出可能な標識を含むプローブを提供する段階と、
    ｄ）増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液；ＲＮaｓｅ Ｈ活性、及びプローブが存在し、かつ前記プローブ内のＲＮＡ配列が、前記サルモネラ標的ＤＮＡのＰＣＲ切片内の相補的なＤＮＡ配列とＲＮＡ：ＤＮＡヘテロデュプレックスを形成できる条件下で、第１増幅プライマーと第２増幅プライマーとの間のＰＣＲ切片を増幅させる段階と、
    ｅ）前記プローブ上の標識から放出される信号のリアルタイム増加を検出する段階であって、前記信号の増加は、前記試料中で、前記サルモネラ標的ＤＮＡの存在を示すことである段階と、
    を含む、試料でサルモネラ属細菌をリアルタイムで検出する方法。
  2. 前記プローブ上の標識から放出される信号のリアルタイム増加は、前記プローブと、前記ＰＣＲ切片の鎖のうち一つとの間に形成されるヘテロデュプレックスが、ＲＮaｓｅ Ｈによって切断されることから由来することを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記プローブのＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列は、共有結合によって連結されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  4. 前記プローブ上の検出可能な標識は、蛍光標識であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  5. 前記プローブは、ＦＲＥＴ対で標識されたことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  6. 前記増幅緩衝液は、Ｔｒｉｓ酢酸塩緩衝液をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  7. 前記ＰＣＲ切片は、固体支持体に連結されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  8. 前記増幅ポリメラーゼ活性は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  9. 前記ＲＮaｓｅ Ｈ活性は、熱安定性ＲＮaｓｅ Ｈ活性であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  10. 前記ＲＮaｓｅ Ｈ活性は、ホットスタートＲＮaｓｅ Ｈ活性であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  11. 前記試料は、食品試料を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  12. 前記試料は、表面採取試料を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  13. 前記試料内の核酸は、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ前処理されることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  14. 前記ウラシル−Ｎ−グリコリラーゼは、ＰＣＲ増幅前に不活性化されることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
  15. 前記プローブは、配列番号７，１３または１４の配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
  16. ａ）サルモネラｉｎｖＡ標的ＲＮＡの存在を確認するために、試料を提供する段階と、
    ｂ）配列番号１及び２のプライマーセット、配列番号３及び４のプライマーセットならびに配列番号５及び６のプライマーセットからなる群から選択される、サルモネラｉｎｖＡ標的核酸配列にアニーリングすることができるフォワード増幅プライマー及びリバース増幅プライマーのセットを提供する段階と、
    ｃ）検出可能な標識、及び前記サルモネラ標的ＲＮＡのｃＤＮＡに実質的に相補的なＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列を含むプローブを提供する段階と、
    ｄ）逆転写酵素活性及び前記リバース増幅プライマーの存在の下で、サルモネラｉｎｖＡ標的ＲＮＡを逆転写し、標的ｃＤＮＡ配列を生成する段階と、
    ｅ）前記プローブ内のＲＮＡ配列が、ＰＣＲ切片内の相補的な配列とＲＮＡ：ＤＮＡヘテロデュプレックスを形成できる条件下で、前記標的ｃＤＮＡ配列、増幅ポリメラーゼ活性、増幅緩衝液；ＲＮaｓｅ Ｈ活性、及びプローブが存在下で、フォワード増幅プライマーとリバース増幅プライマーと間のＰＣＲ切片を増幅させる段階と、
    ｆ）前記プローブ上の標識から放出される信号のリアルタイム増加を検出する段階であって、前記信号の増加は、前記試料中で、前記サルモネラ標的ＲＮＡの存在を示すことである段階と、
    を含む、試料でサルモネラ属細菌をリアルタイムで検出する方法。
  17. 前記プローブ上の標識から放出される信号のリアルタイム増加は、前記プローブのＲＮＡ配列と、前記サルモネラ標的ＲＮＡのｃＤＮＡ配列との間に形成されるヘテロデュプレックスが、ＲＮaｓｅ Ｈによって切断されることから由来することを特徴とする請求項１６に記載の方法。
  18. 前記プローブのＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列は、共有結合によって連結されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
  19. 前記プローブ上の検出可能な標識は、蛍光標識であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
  20. 前記プローブは、ＦＲＥＴ対で標識されたことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
  21. 前記増幅緩衝液は、Ｔｒｉｓ酢酸塩緩衝液を含むことを特徴とすることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
  22. 前記ＰＣＲ切片は、固体支持体に連結されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
  23. 前記増幅ポリメラーゼ活性は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
  24. 前記ＲＮaｓｅ Ｈ活性は、熱安定性ＲＮaｓｅ Ｈの活性であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
  25. 前記ＲＮaｓｅ Ｈ活性は、ホットスタートＲＮaｓｅ Ｈ活性であることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
  26. 前記試料は、食品試料を含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
  27. 前記試料は、表面採取試料を含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
  28. 前記試料内の核酸は、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ前処理されることを特徴とする請求項１６に記載の方法。
  29. 前記ウラシル−Ｎ−グリコリラーゼは、ＰＣＲ増幅前に不活性化されることを特徴とする請求項２８に記載の方法。
  30. 前記プローブは、配列番号７，１３または１４の配列を含むことを特徴とする請求項１６に記載の方法。
  31. ａ）配列番号１及び２のプライマーセット、配列番号３及び４のプライマーセット並びに配列番号５及び６のプライマーセットからなる群から選択されるサルモネラｉｎｖＡ標的ＤＮＡ配列にアニーリングすることができる増幅プライマーセットと、
    ｂ）検出可能な標識、並びに前記サルモネラｉｎｖＡ標的ＤＮＡ配列に実質的に相補的なＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列を含むプローブと、
    ｃ）増幅ポリメラーゼ活性と、
    ｄ）ＲＮaｓｅ Ｈ活性と、
    を含む、試料でサルモネラ属細菌をリアルタイムで検出するためのキット。
  32. 前記キットは、陽性内部対照群及び陰性対照群をさらに含むことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  33. 前記キットは、ウラシル−Ｎ−グリコリラーゼをさらに含むことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  34. 前記プローブのＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列は、共有結合によって連結されることを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  35. 前記プローブ上の検出可能な標識は、蛍光標識であることを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  36. 前記プローブは、ＦＲＥＴ対で標識されることを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  37. 前記プローブまたはＰＣＲ切片は、固体支持体に連結されたことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  38. 前記キットは、増幅緩衝液をさらに含むことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  39. 前記増幅ポリメラーゼ活性は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの活性であることを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  40. 前記ＲＮaｓｅ Ｈ活性は、熱安定性ＲＮaｓｅ Ｈの活性であることを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  41. 前記ＲＮaｓｅ Ｈ活性は、ホットスタートＲＮaｓｅ Ｈ活性であることを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  42. 前記プローブは、配列番号７，１３または１４の配列を含むことを特徴とする請求項３１に記載のキット。
  43. ａ）標的サルモネラｉｎｖＡＲＮＡ配列を逆転写し、標的ｃＤＮＡ配列を生成するための逆転写酵素活性と、
    ｂ）配列番号１及び２のプライマーセット、配列番号３及び４のプライマーセット並びに配列番号５及び６のプライマーセットからなる群から選択される前記標的ｃＤＮＡ配列にアニーリングすることができる増幅プライマーセットであるところの増幅プライマーセットと、
    ｃ）増幅プライマーセット間の前記標的ｃＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅し、サルモネラｉｎｖＡ ＰＣＲ切片を生成するための増幅活性と、
    ｄ）検出可能な標識、並びに前記ＰＣＲ切片内のＤＮＡ配列に実質的に相補的なＤＮＡ核酸配列及びＲＮＡ核酸配列を含むプローブと、
    ｅ）ＲＮaｓｅ Ｈ活性と、
    を含む、試料でサルモネラ属細菌をリアルタイムで検出するためのキット。
  44. 前記キットは、陽性内部対照群及び陰性対照群をさらに含むことを特徴とする請求項４３に記載のキット。
  45. 前記キットは、ウラシル−Ｎ−グリコリラーゼをさらに含むことを特徴とする請求項４３に記載のキット。
  46. 前記プローブのＤＮＡ配列及びＲＮＡ配列は、共有結合によって連結されることを特徴とする請求項４３に記載のキット。
  47. 前記プローブ上の検出可能な標識は、蛍光標識であることを特徴とする請求項４３に記載のキット。
  48. 前記プローブは、ＦＲＥＴ対で標識されることを特徴とする請求項４３に記載のキット。
  49. 前記プローブまたはＰＣＲ切片は、固体支持体に連結されることを特徴とする請求項４３に記載のキット。
  50. 前記キットは、増幅緩衝液をさらに含むことを特徴とする請求項４３に記載のキット。
  51. 前記キットは、増幅ポリメラーゼ活性をさらに含むことを特徴とする請求項４３に記載のキット。
  52. 前記ＲＮaｓｅ Ｈ活性は、熱安定性ＲＮaｓｅ Ｈの活性であることを特徴とする請求項４３に記載のキット。
  53. 前記ＲＮaｓｅ Ｈ活性は、ホットスタートＲＮaｓｅ Ｈ活性であることを特徴とする請求項４３に記載のキット。
  54. 前記プローブは、配列番号７，１３または１４の配列を含むことを特徴とする請求項４３に記載のキット。
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