CN102534036B - 一种Taq DNA聚合酶冷启动活性检测方法 - Google Patents
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Abstract
发明是一种TaqDNA聚合酶冷启动活性检测方法，根据模板设计引物和假模板，将与假模板5’端部分互补的正义引物或反义引物混合后进行变性退火反应，得到二者的混合物；然后将所得混合物与PCR反应所需要的各种成分，模板DNA，5’端部分不与假模板互补的正义引物或反义引物，PCR缓冲液，氯化镁，dNTP混合物和待测定的TaqDNA聚合酶,加入同一个PCR管中进行PCR反应，根据PCR产物的检测结果判断待测DNA聚合酶是否具有冷启动活性；该方法具有操作简便，灵敏度高的特点，极微弱的冷启动活性也可以被有效检测，克服了现有方法的主观性和随意性。
Description
技术领域
本发明涉及一种酶活性的检测方法，具体说是一种Taq DNA聚合酶冷启动活性检测方法。
背景技术
1985年，美国Cetus公司的Kary.B.Mullis发明了具有划时代意义的聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR），实现了人们在体外无限扩增DNA片段的梦想。而Saiki首次应用PCR法成功的扩增了人β-珠蛋白DNA，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。
Mullis在建立PCR发明的初期，采用非常简单的三种温度水浴进行实验，应用的是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段来催化复性引物的延伸效应。其缺点是：①Klenow片段不耐高温， 90℃会变性失活，每次循环都要重新补加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。此种以Klenow片段催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow片段不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶失活，每加入一次酶只能完成一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。
1988年，Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA聚合酶。此酶的发现使PCR技术进入了实用阶段，随后PE-Cetus公司推出了第一台自动化PCR热循环仪，使该技术的自动化成为现实。PCR技术在微生物学，遗传病学，肿瘤学和法医学领域中的应用越来越广。
随着PCR技术的应用，发现PCR产物中经常会出现非特异性扩增片段和引物二聚体，影响PCR的扩增效率和目的DNA片段的产量。经过研究发现，Taq DNA聚合酶的最适反应温度虽然在72℃，但是在室温及其以下温度，Taq DNA聚合酶仍然具有聚合酶活性，可以延伸错配的引物，如引物自身，引物之间，引物和模板等非特异性产物，一旦形成，就会被有效扩增，从而产生大量非特异性扩增和引物二聚体。为了与耐热DNA聚合酶的热启动活性相区别，我们将耐热DNA 聚合酶这种在室温及其以下温度所具有的活性定义为DNA 聚合酶冷启动活性 。
常用的限制DNA 聚合酶冷启动活性的方法是在冰上配制PCR反应液，并将其置于预热的PCR仪，这种方法并不能完全抑制DNA 聚合酶冷启动活性，因此并不能完全消除非特异性产物的扩增。为了限制Taq DNA聚合酶冷启动活性，降低非特异性扩增和引物二聚体的产生，提高目的片段的产量，人们想出了各种各样的办法，如成分隔离，化学修饰，抗体，突变等，并在实际实验中取得了良好的效果。但是，虽然大多厂商宣称其产品具有热启动活性，其实并没有客观有效的手段来证明其没有冷启动活性，多是提供一张PCR扩增产物的电泳图，显示热启动DNA聚合酶扩增条带清晰，没有非特异性扩增和引物二聚体。因为一般的Taq DNA聚合酶也可以扩增出没有非特异性扩增和引物二聚体的清晰的目的条带。我们检索文献发现目前尚缺乏客观有效的技术手段来检测Taq DNA聚合酶冷启动活性。
发明内容
本发明针对上述问题的不足之处，提供一种Taq DNA 聚合酶冷启动活性检测方法，该方法操作简便，灵敏度高，微弱的冷启动活性也可以被有效检测。
一种Taq DNA 聚合酶冷启动活性检测方法，其具体操作步骤为：
（1）引物和假模板的设计及合成
选择任意一段已知序列的DNA作为模板，根据模板DNA序列，利用引物设计软件设计一对PCR引物，并进行人工合成，其包括正义引物和反义引物；人工合成一DNA片段，使其5‘端部分与上述PCR引物的正义引物或反义引物互补，3‘端部分与模板DNA的序列完全不同，将这段DNA命名为假模板；假模板3‘端部分与模板DNA的序列完全不同的部分，其长度为3～30个碱基，优选为8～18个碱基。
（2）PCR反应前假模板与引物的处理
用水分别稀释合成的正义引物、反义引物和假模板，然后分别取稀释后的假模板以及5’端部分与假模板互补的正义引物或反义引物，混合均匀，使假模板的摩尔浓度与5’端部分与假模板互补的正义引物或反义引物的摩尔浓度比为1:1～1:1.1，使其充分变性，然后缓慢复性，得到混合物Ⅰ，备用；
（3）PCR反应体系的配制
将模板DNA、混合物Ⅰ、5’端部分不与假模板互补的反义引物或正义引物、PCR缓冲液、氯化镁、dNTP混合物和待测定的Taq DNA聚合酶,加入同一个PCR管中，组成PCR反应体系；
（4）PCR反应
将步骤（3）所制备PCR反应体系放入PCR仪中25℃ 放置60 min，接着进入PCR反应，其具体反应条件，可根据所使用引物进行设定；PCR反应结束后获得相应的PCR反产物；
（5）Taq DNA聚合酶的冷启动活性的判断
采用琼脂糖凝胶电泳法检测上述步骤（4）所获得PCR反产物，根据检测结果判断Taq DNA聚合酶的是否具有冷启动活性；判断标准为，上述步骤（4）PCR反应没有获得相应大小的DNA片段，则证明所测Taq DNA聚合酶有冷启动活性，反之，上述步骤（4）PCR反应获得相应大小的DNA片段，则所测Taq DNA聚合酶无冷启动活性。
本发明也可以采用实时荧光PCR技术检测Taq DNA聚合酶的冷启动活性，其具体操作步骤为：步骤（1）、步骤(2)同上述步骤，在步骤（3）所制备的PCR反应体系中加入DNA荧光染料如SYBR Green Ⅰ，在步骤（4）中应用实时荧光PCR仪进行PCR扩增反应，根据相应的扩增曲线或者Ct值来判断有无Taq DNA聚合酶冷启动活性，判定标准为：有明显S型扩增曲线，或者Ct值小于35，则所测TAGDNA聚合酶无冷启动活性；没有明显S型扩增曲线，或者Ct值大于或等于35，则所测Taq DNA聚合酶有冷启动活性。
关于具体操作步骤中假模板与引物的说明：如果在步骤（1）中所设计的假模板与正义引物互补则，则步骤（2）中则选择正义引物与假模板混合制备混合物Ⅰ，步骤(3)中由模板DNA、混合物Ⅰ、反义引物、PCR缓冲液、氯化镁、dNTP混合物和待测定的Taq DNA聚合酶组成PCR体系；如果在步骤（1）中设计的假模板与反义引物互补，则在步骤（2）中则选择反义引物与假模板混合制备混合物Ⅰ，步骤(3)中由模板DNA、混合物Ⅰ、正义引物、PCR缓冲液、氯化镁、dNTP混合物和待测定的Taq DNA聚合酶组成PCR体系；
有益效果
本发明的一种Taq DNA聚合酶冷启动活性检测方法，设计了假模板，PCR反应前将其先在PCR仪中25oC放置60min，如果Taq DNA聚合酶具有冷启动活性，则引物沿着假模板进行延伸，造成引物的3‘末端的序列与模板不能配对，则接下来的PCR扩增正常不能进行，PCR扩增结束以后没有相应目的条带的出现；如果该Taq DNA聚合酶不具有冷启动活性，则在PCR仪中25oC放置60min的过程中不进行反应，不影响接下来PCR扩增，PCR扩增结束以后有相应目的条带的出现；本发明通过RCR反应，琼脂糖凝胶电泳或者实时荧光PCR技术检测PCR产物，根据结果来判断Taq DNA聚合酶是否具有冷启动活性，操作简便，灵敏度高，微弱的Taq DNA聚合酶冷启动活性也可以被有效检测。本发明一种Taq DNA聚合酶冷启动活性检测方法，建立了Taq DNA聚合酶冷启动活性的检测标准，克服现有方法的主观性和随意性，客观、高效。本发明可促进热启动Taq DNA聚合酶相关技术的发展，带动PCR相关技术的改进，具有较强的实用性,；本发明不仅可以用于Taq DNA聚合酶冷启动活性的检测，还可以用于其他耐热DNA聚合酶的冷启动活性的检测，如Tth DNA 聚合酶、pfu DNA 聚合酶等。
附图说明
图1是以pGEM-5Zf（+）为模板对待测DNA 聚合酶冷启动活性检测的琼脂糖凝胶电泳图；
图中标号：1为T1+（T2+T3）+模板+待测DNA 聚合酶Ⅰ，2为T1+（T2+T3）+模板+待测Taq DNA聚合酶Ⅱ ，3为T1+（T2+T3）+水+待测TaqDNA 聚合酶Ⅰ，4为T1+（T2+T3）+水+待测Taq DNA聚合酶Ⅱ，5为T1+T3 +模板+待测Taq DNA 聚合酶Ⅰ，6为400bp DNA Marker。
图2是以人基因组HLA-DRA1基因为模板对待测Tth DNA 聚合酶冷启动活性检测的琼脂糖凝胶电泳图；
图中标号：1和2为T4+（T5+T6）+模板+待测Tth DNA 聚合酶Ⅲ，3和4为T4+（T5+T6）+模板+待测Tth DNA 聚合酶Ⅳ。
图3是以小鼠基因组DNA为模板对待测Taq DNA 聚合酶冷启动活性检测的琼脂糖凝胶电泳图；
图中标号：1和2为T7+（T8+T9）+模板+待测Taq DNA 聚合酶Ⅵ，3和4为T7+（T8+T9）+模板+待测Taq DNA 聚合酶Ⅴ，5为DNA Marker。
图4采用实时荧光PCR法，以pGEM-5Zf（+）为模板对待测Taq DNA 聚合酶Ⅶ和Taq DNA 聚合酶Ⅷ冷启动活性检测结果图。
具体实施方式
以下结合实施例，通过对购买自不同公司的Taq DNA聚合酶冷启动活性的检测对本发明进一步阐述，但不以任何方式限制本发明。
实施例一
以质粒pGEM-5Zf（+）为模板，对待测Taq DNA聚合酶进行的DNA 聚合酶冷启动活性检测，具体操作步骤如下：
（1）引物和假模板的设计及合成
参考GenBank上登录的质粒pGEM-5Zf（+）全基因序列，利用PP5.0软件设计一对引物，序列如下：T1：5'-GTTTTTCCATAGGCTCCGC-3'，T2: 5'-TAGCACCGCCTACATACCTC-3'，进行人工合成，这对引物理论上扩增序列长度401bp，其碱基序列如SEQ ID NO：4。同时设计假模板T3，序列如下：T3：5'-AAGCAGTTCACTAGAGGTATGTAGGCGGTGCTA -3'，其中，T3的3‘末端与T2完全互补，5’末端的13个碱基则与模板质粒pGEM-5Zf（+）的序列完全不同。
（2）PCR反应前假模板与引物的处理
分别将合成后的引物T1和T2及假模板T3，用灭菌的超纯水适量稀释到50微摩尔/L；取50微升的T2与50微升的T3加入到200微升离心管中，混合均匀后，置于沸腾地水浴锅中10分钟，取出200微升离心管将其冷却至室温，得到T2和T3的混合物，置于-20℃冰箱保存备用。
（3） PCR反应体系的配制
取PCR反应管a，加入的20倍PCR缓冲液2.5μL， 50mmol/L 氯化镁 1.5μL，10mmol/L dNTP混合物 0.5 μL，引物T1 0.1μL、T2和T3混合物0.2μL,质粒pGEM-5Zf（+）1.0pg和2.5 U待检测Taq DNA聚合酶Ⅰ，然后加超纯水补至50μL；
取PCR反应管b，加入的20倍PCR缓冲液2.5μL， 50mmol/L 氯化镁 1.5μL，10mmol/L dNTP混合物 0.5 μL，引物T1 0.1μL、T2和T3混合物0.2μL, 质粒pGEM-5Zf（+）1.0pg和2.5 U待检测的Taq DNA聚合酶Ⅱ，然后加超纯水补至50μL；
取PCR反应管c, 加入的20倍PCR缓冲液2.5μL， 50mmol/L 氯化镁 1.5μL，10mmol/L dNTP混合物 0.5 μL，引物T1 0.1μL、T2和T3混合物0.2μL,超纯水1.0μL和2.5 U待检测的Taq DNA聚合酶Ⅰ，然后加超纯水补至50μL；取PCR反应管d, 加入的20倍PCR缓冲液2.5μL， 50mmol/L 氯化镁 1.5μL，10mmol/L dNTP混合物 0.5 μL，引物T1 0.1μL、T2和T3混合物0.2μL,超纯水1.0μL和2.5 U待检测的普通Taq DNA聚合酶，然后加超纯水补至50μL；
取PCR反应管e, 加入的20倍PCR缓冲液2.5μL， 50mmol/L 氯化镁 1.5μL，10mmol/L dNTP混合物 0.5 μL，引物T1 0.1μL、T3 0.1μL, 质粒pGEM-5Zf（+）1.0pg， 2.5 U待检测的Taq DNA聚合酶Ⅱ，然后加超纯水补至50μL；
（4） PCR反应
将上述步骤(3)所配制的各体系放入PCR仪器中进行反应，反应条件为：25℃ 60 min， 94℃ 5min后，进入循环：94℃ 30s，55℃ 30s， 72℃ 30s，总计35个循环，终延伸5 min；
（5）DNA 聚合酶冷启动活性的判断
将上述步骤(4)所得的各PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,电泳结束后用紫外扫描仪分析不同条带的光密度值，进而分析Taq DNA聚合酶的活性。结果见图1：
以T1和T3作为一对引物，进行PCR扩增，结果没有特异性目的条带的产生（图1中第5泳道），证明2条正义引物不能进行有效扩增。用T1与T2和T3作为引物（T2与T3事先退火），来检测Taq DNA聚合酶Ⅱ，结果PCR扩增以后没有目的条带出现(图1中第2泳道，第4泳道为阴性对照)，说明Taq DNA聚合酶Ⅱ具有冷启动活性，使T2沿T3进行延伸，造成引物T2的3‘末端的序列与模板不能配对，不能进行扩增；对于Taq DNA聚合酶Ⅰ，PCR扩增以后有相应目的条带的出现(图中第1泳道，第3泳道为阴性对照)，说明热启动Taq DNA聚合酶无冷启动活性，在室温下不能使T2沿T3进行延伸。
实施例二
以人全基因为模板对待测Tth DNA 聚合酶进行的DNA 聚合酶冷启动活性检测，具体操作步骤如下：
（1））引物和假模板的设计及合成
参考GenBank上登录的人HLA-DRA1全基因序列，利用引物设计软件primer5.0设计一对引物，序列如下： T4：5'-ATCCCTACTCGCCATCATTC-3'， T5: 5'-TCTCATCACCATCAAAGTCAAAC-3'，进行人工合成，这对引物理论上扩增序列长度223bp，其碱基序列如SEQ ID NO：8；同时设计假模板T6，序列如下：T6：5'-TACTAGCGCGTG GTTTGACTTTGATGGTGATGAGA-3'其中，T6的3‘末端与T5完全互补，5’末端的12个碱基则与模板人基因组的HLA-DRA1基因的相应序列完全不同，进行人工合成；
（2）PCR反应前假模板与引物的处理
分别将合成后的引物T4和T5及假模板T6，用灭菌的超纯水适量稀释到50微摩尔/L；取50微升的T5与51微升的T6加入到200微升离心管中，混合均匀后，置于沸腾地水浴锅中10分钟，取出200微升离心管，得到T5和T6的混合物，置于-20℃冰箱保存备用。
（3） PCR反应体系的配制
取PCR反应管f，加入的20倍PCR缓冲液2.5μL， 50mmol/L 氯化镁 1.5μL，10mmol/L dNTP混合物 0.5 μL，引物T4 0.1μL、T5和T6混合物0.2μL,人基因组DNA模板100ng和2.5 U待检测Tth DNA 聚合酶Ⅲ，然后加超纯水补至50μL；
取PCR反应管g，加入的20倍PCR缓冲液2.5μL， 50mmol/L 氯化镁 1.5μL，10mmol/L dNTP混合物 0.5 μL，引物T4 0.1μL、T5和T6混合物0.2μL,人基因组DNA模板100ng和2.5 U待检测Tth DNA 聚合酶Ⅲ，然后加超纯水补至50μL；
取PCR反应管h，加入的20倍PCR缓冲液2.5μL， 50mmol/L 氯化镁 1.5μL，10mmol/L dNTP混合物 0.5 μL，引物T4 0.1μL、T5和T6混合物0.2μL,人基因组DNA模板100ng和2.5 U待检测Tth DNA 聚合酶Ⅳ，然后加超纯水补至50μL；
取PCR反应管i，加入的20倍PCR缓冲液2.5μL， 50mmol/L 氯化镁 1.5μL，10mmol/L dNTP混合物 0.5 μL，引物T4 0.1μL、T5和T6混合物0.2μL,人基因组DNA模板100ng和2.5 U待检测Tth DNA 聚合酶Ⅳ，然后加超纯水补至50μL；
(4) PCR反应
将上述步骤（3）所配制的各体系放入PCR仪器中进行反应，反应条件为：25℃ 60 min， 94℃ 5min后，进入循环：94℃ 30s，55℃ 30s， 72℃ 30s，总计35个循环，终延伸5 min；
（5）DNA 聚合酶冷启动活性的判断
将上述步骤(4)所得的各PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,电泳结束后用紫外扫描仪分析不同条带的光密度值，进而分析Tth DNA 聚合酶的活性。结果见图2：
用T4、T5和T6的混合物PCR反应，来检测Tth DNA 聚合酶Ⅳ，结果没有目的条带出现(图2中第3泳道和第4泳道)，说明Tth DNA 聚合酶Ⅳ有冷启动活性；用T4、T5和T6的混合物PCR反应来检测Tth DNA 聚合酶Ⅲ，有相应目的条带的出现(图2中第1泳道和第2泳道)，说明待测Tth DNA 聚合酶Ⅲ无冷启动活性。
实施例三
以小鼠全基因为模板对待测的Taq DNA聚合酶进行的DNA 聚合酶冷启动活性检测，具体操作步骤如下：
（1）引物和假模板的序列的设计和处理
参考GenBank上登录的小鼠GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）全基因序列，利用引物设计软件primer5.0设计一对引物，序列如下：T7：5'- CCCCTGTTTCTTGTCTTTCA-3'， T8: 5'- GCTTCCCATTCTCGGCCTTG-3'，进行人工合成，这对引物理论上扩增序列长度191bp，其碱基序列如SEQ ID NO：12。同时设计假模板T9，序列如下： T9：5'- CGAATGTGAC CAAGGCCGAGAATGGGAAGC-3'， 其中，T9的3‘末端与T8完全互补，5’末端的10个碱基则与模板小鼠基因组DNA的序列完全不同，进行人工合成；
（2）PCR反应前假模板与引物的处理
分别将合成后的引物T7和T8及假模板T9，用灭菌的超纯水适量稀释到50微摩尔/L；取50微升的T8与55微升的T9加入到200微升离心管中，混合均匀后，置于沸腾地水浴锅中10分钟，取出200微升离心管，得到T5和T6的混合物，置于-20℃冰箱保存备用。
（3） PCR反应体系的配制
取PCR反应管j，加入的20倍PCR缓冲液2.5μL， 50mmol/L 氯化镁 1.5μL，10mmol/L dNTP混合物 0.5 μL，引物T7 0.1μL、T8和T9混合物0.2μL,小鼠基因组DNA模板100ng和2.5 U待检测Taq DNA聚合酶Ⅵ，然后加超纯水补至50μL；
取PCR反应管k，加入的20倍PCR缓冲液2.5μL， 50mmol/L 氯化镁 1.5μL，10mmol/L dNTP混合物 0.5 μL，引物T7 0.1μL、T8和T9混合物0.2μL,小鼠基因组DNA模板100ng和2.5 U待检测Taq DNA聚合酶Ⅵ，然后加超纯水补至50μL；
取PCR反应管l，加入的20倍PCR缓冲液2.5μL， 50mmol/L 氯化镁 1.5μL，10mmol/L dNTP混合物 0.5 μL，引物T7 0.1μL、T8和T9混合物0.2μL,小鼠基因组DNA模板100ng和2.5 U待检测Taq DNA聚合酶Ⅴ，然后加超纯水补至50μL；
取PCR反应管m，加入的20倍PCR缓冲液2.5μL， 50mmol/L 氯化镁 1.5μL，10mmol/L dNTP混合物 0.5 μL，引物T7 0.1μL、T8和T9混合物0.2μL,小鼠基因组DNA模板100ng和2.5 U待检Taq DNA聚合酶Ⅴ，然后加超纯水补至50μL；
（4）PCR反应
将上述步骤（3）所配制的各体系放入PCR仪器中进行反应，反应条件为：25℃ 60 min， 94℃ 5min后，进入循环：94℃ 30s，55℃ 30s， 72℃ 30s，总计35个循环，终延伸5 min；
（5）DNA 聚合酶冷启动活性的判断
将上述步骤(4)所得的各PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳,电泳结束后用紫外扫描仪分析不同条带的光密度值，进而分析Taq DNA聚合酶的活性。结果见图3：用T7、T8和T9的混合物进行PCR反应，来检测Taq DNA聚合酶Ⅴ，结果PCR扩增以后没有目的条带出现(图3中第3泳道和第4泳道)，说明Taq DNA聚合酶Ⅴ有冷启动活性；用T7、T8和T9的混合物进行PCR反应，有相应目的条带的出现(图3中第1泳道和第2泳道)，说明Taq DNA聚合酶Ⅵ没有冷启动活性。
实施例四
采用实时荧光PCR法，以pGEM-5Zf（+）为模板对待测Taq DNA聚合酶的冷启动活性检测，其具体操作步骤如下：
（1）引物和假模板的序列的设计和处理
同实施例一
（2）PCR反应前假模板与引物的处理
同实施例一
（3） PCR反应体系的配制
取PCR反应管n，加入的20倍PCR缓冲液2.5μL， 50mmol/L 氯化镁 1.5μL，的 10mmol/L dNTP混合物 0.5 μL，1×SYBR Green Ⅰ,引物T1 0.1μL、T2和T3混合物0.2μL,质粒pGEM-5Zf（+）1.0ng和2.5 U待检测Taq DNA聚合酶Ⅷ，然后加超纯水补至50μL；
取PCR反应管o，加入的20倍PCR缓冲液2.5μL， 50mmol/L 氯化镁 1.5μL，的 10mmol/L dNTP混合物 0.5 μL，1×SYBR Green Ⅰ,引物T1 0.1μL、T2和T3混合物0.2μL,质粒pGEM-5Zf（+）1.0ng和2.5 U待检测的Taq DNA聚合酶Ⅶ，然后加超纯水补至50μL；
取PCR反应管p, 加入的20倍PCR缓冲液2.5μL， 50mmol/L 氯化镁 1.5μL，的 10mmol/L dNTP混合物 0.5 μL，1×SYBR Green Ⅰ,引物T1 0.1μL、T2和T3混合物0.2μL,超纯水1.0μL和2.5 U待检测的Taq DNA聚合酶Ⅷ，然后加超纯水补至50μL；
取PCR反应管q, 加入的20倍PCR缓冲液2.5μL， 50mmol/L 氯化镁 1.5μL，的 10mmol/L dNTP混合物 0.5 μL，1×SYBR Green Ⅰ,引物T1 0.1μL、T2和T3混合物0.2μL,超纯水1.0μL和2.5 U待检测的Taq DNA聚合酶Ⅶ，然后加超纯水补至50μL；
取PCR反应管r, 加入的20倍PCR缓冲液2.5μL， 50mmol/L 氯化镁 1.5μL，的 10mmol/L dNTP混合物 0.5 μL，1×SYBR Green Ⅰ，引物T1 0.1μL、T3 0.1μL,质粒pGEM-5Zf（+）1.0ng 2.5 U待检测的Taq DNA聚合酶Ⅶ，然后加超纯水补至50μL；
（4） PCR反应
将上述步骤(3)所配制的各体系放入PCR仪器中进行反应，反应条件为：25℃ 60 min， 94℃ 5min后，进入循环：94℃ 30s，55℃ 30s， 72℃ 30s，总计40个循环，在72℃收荧光信号；根据Ct值分析Taq DNA聚合酶的冷启动活性。
（5） DNA 聚合酶冷启动活性的判断
根据实时荧光PCR仪的扩增曲线图可以判断DNA 聚合酶有无冷启动活性。结果见图4，用T1、T2和T3的混合物进行PCR反应，来检测Taq DNA聚合酶Ⅶ，扩增曲线平直，且其Ct值小于35，说明Taq DNA聚合酶Ⅶ有冷启动活性；用T1、 T2和T3作为引物对Taq DNA聚合酶Ⅷ，可见明显的S型扩增曲线，且其Ct值大于或等于35，说明Taq DNA聚合酶Ⅷ没有冷启动活性。
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<400> 3
aagcagttca ctagaggtat gtaggcggtg cta 33
<210> 4
<211> 401
<212> DNA
<213> Cloning vector pGEM-5Zf(+)
<400> 4
gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag 60
gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt 120
gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg 180
aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg 240
ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg 300
taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac 360
tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct a 401
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atccctactc gccatcattc 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
tctcatcacc atcaaagtca aac 23
<210> 7
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
tactagcgcg tggtttgact ttgatggtga tgaga 35
<210> 8
<211> 223
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
atccctactc gccatcattc tttcattcct cttggcccaa tctctctcca ccacttcctg 60
cctacatgta tgtaggttat tcatttccct ctcttgattc cccccaccca actctctttc 120
tccatttctt gcctttcaga agaacatgtg atcatccagg ccgagttcta tctgaatcct 180
gaccaatcag gcgagtttat gtttgacttt gatggtgatg aga 223
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cccctgtttc ttgtctttca 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gcttcccatt ctcggccttg 20
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
cgaatgtgac caaggccgag aatgggaagc 30
<210> 12
<211> 191
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 12
cccctgtttc ttgtctttca gatttggccg tattgggcgc ctggtcacca gggctgccat 60
ttgcagtggc aaagtggaga ttgttgccat caacgacccc ttcattgacc tcaactacat 120
ggtctacatg ttccagtatg actccactca cggcaaattc aacggcacag tcaaggccga 180
gaatgggaag c 191
Claims (2)
1.一种Taq DNA聚合酶冷启动活性检测方法，其特征在于： 其具体操作步骤为：
（1）引物和假模板的设计及合成
选择任意一段已知序列的DNA作为模板，根据模板DNA序列，利用引物设计软件设计一对PCR引物并进行人工合成，其包括正义引物和反义引物；人工合成一段DNA片段，使其5’端部分与上述PCR引物的正义引物或反义引物互补，3‘端部分与模板DNA的序列不同的部分，其长度为10～13个碱基，将这段DNA命名为假模板；
（2）PCR反应前假模板与引物的处理
用水分别稀释合成的正义引物、反义引物和假模板，然后分别取稀释后的假模板以及5’端部分与假模板互补的正义引物或反义引物，混合均匀，使假模板的摩尔浓度与5’端部分与假模板互补的正义引物或反义引物的摩尔浓度比为1:1～1:1.1，使其充分变性，然后缓慢复性，得到混合物Ⅰ，备用；
（3）PCR反应体系的配制
将模板DNA、混合物Ⅰ、5’端部分不与假模板互补的反义引物或正义引物、PCR缓冲液、氯化镁、dNTP和待测定的Taq DNA聚合酶,加入同一个PCR管中，组成PCR反应体系；
（4）PCR反应
将上述步骤（3）装有PCR反应体系的PCR管置于PCR仪中25℃ 放置60min，接着进入PCR反应， PCR反应结束后获得PCR反应产物；
（5）Taq DNA聚合酶的冷启动活性的判断
将上述步骤(4)所获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，电泳结束后用紫外扫描仪分析不同条带的光密度值，如果没有获得相应大小的DNA片段，则证明所测Taq DNA聚合酶有冷启动活性；反之，如果获得相应大小的DNA片段，则所测Taq DNA聚合酶无冷启动活性。
2.一种TaqDNA 聚合酶冷启动活性检测方法，其特征在于：其具体操作步骤为：
（1）引物和假模板的设计及合成
选择任意一段已知序列的DNA作为模板，根据模板DNA序列，利用引物设计软件设计一对PCR引物并进行人工合成，其包括正义引物和反义引物；人工合成一段DNA片段，使其5’端部分与上述PCR引物的正义引物或反义引物互补，3‘端部分与模板DNA的序列不同的部分，其长度为10～13个碱基，将这段DNA命名为假模板；
（2）PCR反应前假模板与引物的处理
用水分别稀释合成的正义引物、反义引物和假模板，然后分别取稀释后的假模板以及5’端部分与假模板互补的正义引物或反义引物，混合均匀，使假模板的摩尔浓度与5’端部分与假模板互补的正义引物或反义引物的摩尔浓度比为1:1～1:1.1，使其充分变性，然后缓慢复性，得到混合物Ⅰ，备用；
（3）PCR反应体系的配制
将模板DNA、混合物Ⅰ、5’端部分不与假模板互补的反义引物或正义引物、DNA荧光染料、PCR缓冲液、氯化镁、dNTP和待测定的Taq DNA聚合酶,加入同一个PCR管中，组成PCR反应体系；
（4）PCR反应
将上述步骤（3）装有PCR反应体系的PCR管置于实时荧光PCR仪中25℃放置60 min，接着进入PCR反应， PCR反应结束后获得PCR反应产物，由实时荧光PCR仪自动生成扩增曲线图谱和Ct值；
（5）Taq DNA聚合酶的冷启动活性的判断
根据上述步骤（4）由实时荧光PCR仪自动生成的荧光曲线和Ct值来判断有无Taq DNA聚合酶冷启动活性，判定标准为：检测荧光曲线有明显S型扩增曲线，或者Ct值小于35，则所测Taq DNA聚合酶无冷启动活性；荧光曲线没有明显S型扩增曲线，或者Ct值大于或等于35，则所测Taq DNA聚合酶有冷启动活性。
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