CN106987643A - 一种 Taq DNA 聚合酶活性检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的一种Taq DNA聚合酶活性检测方法，该方法包括模板和引物的设计，PCR反应体系的配制、PCR反应条件的设置和TaqDNA聚合酶活性的判断。该方法操作简便，准确、灵敏度高，微弱的Taq DNA聚合酶活性也可以被有效检测。即解决了终点法的操作步骤多，耗时长，人为因素影响大的问题，也解决了荧光定量PCR检测法中受Taq酶活性的变化而影响检测准确性的问题。本发明的一种Taq DNA聚合酶活性检测方法，建立了Taq DNA聚合酶活性的检测标准，克服现有方法的主观性和随意性，客观、高效。本发明可促进Taq DNA聚合酶相关技术的发展，带动PCR相关技术的改进，具有较强的实用性；本发明不仅可以用于Taq DNA聚合酶活性的检测，还可以用于其他耐热DNA聚合酶的活性的检测，如Tth DNA聚合酶、pfu DNA聚合酶等。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种 Taq DNA 聚合酶活性检测方法。
背景技术
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。
PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，其最大特点是利用DNA在体外高温时变性会变成单链，低温时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，在DNA聚合酶最适反应温度下，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链,最终形成双链DNA。DNA聚合酶在PCR过程中起着至关重要的作用，其活性影响着整个扩增效率。
Taq DNA 聚合酶活性测定常用的方法有终点法和动力学方法两类。终点法是测定完成一定量反应所需要时间，如：ATP发光检测法，其原理是在DNA聚合酶催化DNA分子的聚合过程中伴随着焦磷酸（PPi）的生成，利用ATP硫酰化酶将焦磷酸定量转化成ATP，再利用虫荧光素酶系统发光检测ATP的量，从而确定PPi的量，以PCR反应体系中PPi
的量来反映Taq酶的活性。其缺点是，操作步骤多，耗时长，人为因素影响大；而动力学方法是测定一定时间内所起的化学反应量，如：荧光定量PCR检测法，其原理是：在PCR体系中加入荧光探针，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化监测产物量的变化，得到一条荧光扩增曲线图。在荧光信号指数扩增阶段，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，在这个阶段可以进行定量分析。实时荧光定量PCR具有较好的线性范围、灵敏度、特异性及重复性。但是Taq酶活性的变化不仅影响荧光定量PCR系统的检测极限，而且影响荧光定量PCR系统测量的准确性，PCR的特异性也会随Taq酶活性的变化而降低。后有报导采用嵌合荧光染料的荧光定量检测法来检测酶的活性，其原理是：利用DNA结合染料能够与双链DNA非特异性结合，发出能够被设备所采集的荧光，一个反应发出的全部荧光信号与扩增产生的双链DNA量呈正比，且会随扩增产物的增加而增加，通过实时监测反应体系中的DNA染料荧光强度，达到检测PCR产物的双链DNA的目的。但DNA结合染料没有特异性，不能识别特定的双链，只要是双链就会结合发光，对PCR反应中的非特异性扩增或是引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，对酶的活性判断存在严重的干扰。
发明内容
本发明的目的是提供一种Taq DNA 聚合酶活性检测方法，该方法操作简便，准确、灵敏度高，解决了现有技术中操作步骤多、耗时长、人为因素影响大的问题，而且本技术不受Taq酶活性的变化而影响检测准确性。
本发明的技术方案为：
一种 Taq DNA 聚合酶活性检测方法，包括如下步骤：
（1）引物和模板的设计及合成
选择任意一段已知序列的DNA作为模板，根据模板DNA序列，设计一条PCR 引物并进行人工合成；人工合成一段单链核酸片段，使其 5’端部分与上述PCR引物互补。将这段单链核酸片段命名为模板 ；
（2）PCR 反应前模板与引物的处理
用稀释液分别稀释合成的引物和模板，备用 ；
（3）PCR 反应体系的配制
将模板、引物、PCR 缓冲液、氯化镁、dNTP 、荧光染料和待测定的 Taq DNA 聚合酶，加入同一个 PCR 管中，组成 PCR 反应体系 ；
（4）PCR 反应
将上述步骤（3）装有 PCR 反应体系的 PCR 管置于能够读取荧光的设备中，设置PCR条件为，PCR 反应结束后获得 PCR 反应产物，由设备收集扩增曲线图谱 ；
（5）Taq DNA 聚合酶的判断
分析上述步骤 (4) 所获得的扩增曲线图谱得出该酶的初始线性斜率，将该斜率置于标准曲线中，计算出未知Taq DNA 聚合酶活性。
优选的，所述模板为一条单链核酸片段，片段长度为≥50bp。
优选的，所述引物长度为 3 ～ 30 个碱基，优选为 8 ～18 个碱基。
优选的，PCR 反应体系中的荧光染料为任何一种仅能作用于双链DNA，不能作用于单链核酸片段的染料，该染料作用于双链DNA前荧光信号微弱，荧光信号不被设备收集。
优选的，使用的设备为任何的能够读取荧光的设备，包括但不限于酶标板、荧光PCR仪等精确可控的仪器。
优选的，PCR条件根据不同的酶，引物退火温度的不同，其温度范围可在10℃—90℃之间，温育时间可为 20 min -60 min。
优选的，标准曲线的制备方法为，将已知活性的Taq DNA 聚合酶梯度稀释，分别加入PCR 反应体系中进行PCR反应，收集每种梯度单位活性初始斜率，制出标准曲线。
本发明的有益效果为：
本发明的一种 Taq DNA 聚合酶活性检测方法，操作简便，准确、灵敏度高，微弱的 TaqDNA 聚合酶活性也可以被有效检测。即解决了终点法的操作步骤多，耗时长，人为因素影响大的问题，也解决了荧光定量PCR检测法中受Taq酶活性的变化而影响检测准确性的问题。本发明的一种 Taq DNA 聚合酶活性检测方法，建立了Taq DNA聚合酶活性的检测标准，克服现有方法的主观性和随意性，客观、高效。本发明可促进Taq DNA 聚合酶相关技术的发展，带动 PCR 相关技术的改进，具有较强的实用性；本发明不仅可以用于 Taq DNA 聚合酶活性的检测，还可以用于其他耐热 DNA 聚合酶的活性的检测，如 Tth DNA 聚合酶、pfuDNA 聚合酶等。
附图说明
图1为酶活性标准曲线图。
图2为待测Taq DNA聚合酶单位活性荧光值
图3为Taq DNA 聚合酶各单位活性初始斜率
图4为Taq DNA 聚合酶各单位活性标准曲线。
具体实施方式
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
以人单链核酸片段为模板，对待测 Taq DNA 聚合酶进行的 DNA 聚合酶活性检测，具体操作步骤如下 ：
（1）引物和模板的设计及合成
参考 GenBank 上登录的16号染色体基因序列，设计单链核酸序列及与单链核酸互补的一条引物 ：
单链核酸序列：GAGCCCGCCGCCCGGCCCCGCGCAGGCCCCGCCCGGGACTCCCCTGCGGTCCAGGCCGCGCCCCGGGCTCCGCGCCAGCCAATGAGCGCCGCCCGGCCGGGCGTGCCCCCGCGCCCCAAGCATAAACCCTGGCGCGCTCGCGGGCCGGCACTCTTCTGGTCCCCACAGACTC（SEQ ID NO：1）
引物序列 ：5'-GAGTCTGTGGGGAG-3'（SEQ ID NO：2），两者均进行人工合成。
（2）PCR 反应前模板与引物的处理
分别将合成后的模板和引物，用灭菌的纯化水或是1*TE(pH8.0)适量稀释到 50 pmol/ul ；保存备用。
镁离子最佳浓度为5mmol/L、热启动DNA聚合酶最佳用量为5U/反应、UNG酶最佳用量为0.1U/反应、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）最佳浓度为0.24mmol/L。
（3） PCR 反应体系的配制
取PCR反应管加入10倍PCR缓冲液5μL，加入氯化镁使工作液浓度为5mmol/L、加入dNTPs使工作液浓度为0.24mmol/L，加入荧光染料使工作液浓度为1%，加入模板使工作液浓度为50 pmol/ul，加入引物使工作液浓度为5pmol/ul，加入待检测的 Taq DNA 聚合酶使工作液浓度为2.5U，然后加纯化水补至 50μL。
（4） PCR 反应
将上述步骤(3)所配制的各体系放入荧光定量PCR仪器中进行反应，反应条件为 ：37℃60 min。
（5）Taq DNA 聚合酶活性的判断
将上述步骤 (4) 所得的单位活性初始斜率，带入标准曲线中，即可计算出待检酶的活性。结果见图1和图2。
（6）Taq DNA 聚合酶活性标准曲线制作
标准曲线A点：取PCR反应管加入10倍PCR缓冲液5μL，加入氯化镁使工作液浓度为5mmol/L、加入dNTPs 使工作液浓度为0.24mmol/L，加入荧光染料使工作液浓度为1%，加入模板使工作液浓度为50 pmol/ul，加入引物使工作液浓度为5pmol/ul，不加Taq DNA 聚合酶，然后加纯化水补至 50μL。
标准曲线B点：取PCR反应管加入10倍PCR缓冲液5μL，加入氯化镁使工作液浓度为5mmol/L、加入dNTPs 使工作液浓度为0.24mmol/L，加入荧光染料使工作液浓度为1%，加入模板使工作液浓度为50 pmol/ul，加入引物使工作液浓度为5pmol/ul，加入已知浓度的标准Taq DNA 聚合酶，使工作液浓度为1U，然后加纯化水补至 50μL。
标准曲线C点：取PCR反应管加入10倍PCR缓冲液5μL，加入氯化镁使工作液浓度为5mmol/L、加入dNTPs 使工作液浓度为0.24mmol/L，加入荧光染料使工作液浓度为1%，加入模板使工作液浓度为50 pmol/ul，加入引物使工作液浓度为5pmol/ul，加入已知浓度的标准Taq DNA 聚合酶，使工作液浓度为1.5U，然后加纯化水补至 50μL。
标准曲线D点：取PCR反应管加入10倍PCR缓冲液5μL，加入氯化镁使工作液浓度为5mmol/L、加入dNTPs 使工作液浓度为0.24mmol/L，加入荧光染料使工作液浓度为1%，加入模板使工作液浓度为50 pmol/ul，加入引物使工作液浓度为5pmol/ul，加入已知浓度的标准Taq DNA 聚合酶，使工作液浓度为3U，然后加纯化水补至 50μL。
标准曲线E点：取PCR反应管加入10倍PCR缓冲液5μL，加入氯化镁使工作液浓度为5mmol/L、加入dNTPs 使工作液浓度为0.24mmol/L，加入荧光染料使工作液浓度为1%，加入模板使工作液浓度为50 pmol/ul，加入引物使工作液浓度为5pmol/ul，加入已知浓度的标准Taq DNA 聚合酶，使工作液浓度为4.5U，然后加纯化水补至 50μL。
将各反应体系放入荧光定量PCR仪器中进行反应，反应条件为 ：37℃ 60 min，扩增结束后收集Taq DNA 聚合酶各单位活性初始斜率，制出标准曲线。结果见图3和图4。
上述实施例只是对本发明方案的举例说明或解释，而不应理解为对本发明方案的限制，显然，本领域的技术人员可对本发明进行各种修改和变型而不脱离本发明的精神和范围。倘若这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则皆应属本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州和实生物技术有限公司
<120> 一种 Taq DNA 聚合酶活性检测方法
<130> 2017
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 172
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gagcccgccg cccggccccg cgcaggcccc gcccgggact cccctgcggt ccaggccgcg 60
ccccgggctc cgcgccagcc aatgagcgcc gcccggccgg gcgtgccccc gcgccccaag 120
cataaaccct ggcgcgctcg cgggccggca ctcttctggt ccccacagac tc 172
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gagtctgtgg ggag 14
Claims (8)
1.一种 Taq DNA 聚合酶活性检测方法，其特征在于 ：
（1）引物和模板的设计及合成
选择任意一段已知序列的DNA作为模板，根据模板DNA序列，设计一条PCR 引物并进行人工合成；人工合成一段单链核酸片段，使其 5’端部分与上述PCR引物互补，将这段单链核酸片段命名为模板 ；
（2）PCR 反应前模板与引物的处理
用稀释液分别稀释合成的引物和模板，备用 ；
（3）PCR 反应体系的配制
将模板、引物、PCR 缓冲液、氯化镁、dNTP 、荧光染料和待测定的 Taq DNA 聚合酶，加入同一个 PCR 管中，组成 PCR 反应体系 ；
（4）PCR 反应
将上述步骤（3）装有 PCR 反应体系的 PCR 管置于能够读取荧光的设备中，设置PCR条件为 37℃，60 min，PCR 反应结束后获得 PCR 反应产物，由设备收集扩增曲线图谱 ；
（5）Taq DNA 聚合酶的判断
分析上述步骤 (4) 所获得的扩增曲线图谱得出该酶的初始线性斜率，将该斜率置于标准曲线中，计算出未知Taq DNA 聚合酶活性。
2.如权利要求1所述的一种Taq DNA 聚合酶活性检测方法，其特征在于 ：所述模板为一条单链核酸片段，片段长度为≥50bp。
3.如权利要求1所述的一种Taq DNA 聚合酶活性检测方法，其特征在于 ：所述引物长度为 3 ～ 30 个碱基，优选为 8 ～18 个碱基。
4.如权利要求1所述的一种Taq DNA 聚合酶活性检测方法，其特征在于 ：稀释合成的引物和模板的稀释液可以是灭菌纯化水或是1*TE(pH8.0)。
5.如权利要求1所述的一种Taq DNA 聚合酶活性检测方法，其特征在于 ：PCR 反应体系中的荧光染料为任何一种仅能作用于双链DNA，不能作用于单链核酸片段的染料。
6.如权利要求1所述的一种Taq DNA 聚合酶活性检测方法，其特征在于：使用的设备为任何的能够读取荧光的设备，包括但不限于酶标板、荧光PCR仪等精确可控的仪器。
7.如权利要求1所述的一种Taq DNA 聚合酶活性检测方法，其特征在于：PCR条件根据不同的酶，其温度范围可在10℃—90℃之间，温育时间可为 20 min -60 min。
8.如权利要求1所述的一种Taq DNA 聚合酶活性检测方法，其特征在于：标准曲线的制备方法为，将已知活性的Taq DNA 聚合酶梯度稀释，分别加入PCR 反应体系中进行PCR反应，收集每种梯度单位活性初始斜率，制出标准曲线。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20170728 |
|
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |