CN111635932B - 一种核酸聚合酶活性检测方法的应用及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种应用于抗体封闭核酸聚合酶活性评估和核酸聚合酶延伸活性评估的核酸聚合酶活性检测方法及试剂盒，所述核酸聚合酶活性检测方法为：检测核酸聚合酶延伸活性的模板为单链DNA，所述单链DNA与对应单链DNA设计的引物结合后加入核酸聚合酶进行qPCR链式反应，基于反应结果分析核酸聚合酶的活性。该检测方法及试剂盒解决了以PCR反应所产生的引物二聚体以及非特异性产物为检测结果的复杂体系，其能够直接以单链DNA作为模板，进行qPCR链式反应来评估抗体封闭核酸聚合酶的活性和评估核酸聚合酶的延伸活性。

Description

一种核酸聚合酶活性检测方法的应用及试剂盒

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，特别是涉及一种核酸聚合酶活性检测方法的应用及试剂盒。

背景技术

聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)是常用的分子检测技术，PCR技术是以双链DNA作为模板，单链寡核苷酸为引物，通过热稳定的DNA聚合酶在一定反应环境内催化引物按碱基互补配对原则沿着模板链延伸。经过热变性、退火、延伸三个步骤的重复循环，实现在体外将特定的核苷酸片段进行指数级扩增的目的。

PCR发生循环反应时对不同的循环步骤有不同的温度，要求的温度分别为变性(90℃左右)、退火(50℃左右)、延伸(70℃左右)。Taq DNA聚合酶在90℃以上仍能保持一定活性，因而是PCR反应常用的聚合酶。

TaqDNA聚合酶的最高生物学活性温度在70℃～75℃，然而PCR反应在升温时(20℃～70℃)，TaqDNA聚合酶仍然有一定的聚合酶活性，如果没有进行热启动封闭，那么聚合酶就可能在该环境下进行催化延伸，容易使PCR反应发生引物二聚体以及非特异性的扩增，影响产物的特异性。因此如何在初始循环的热变性前将TaqDNA聚合酶及高保真聚合酶的延伸活性进行抑制成为了现今的研究热点。研究发现可以通过对酶进行化学修饰、物理隔绝法、抗原抗体法、设计特殊的引物或者用基因工程的方法对酶进行结构改造来将TaqDNA聚合酶在未达到最适反应温度前的酶延伸活性进行抑制，实现热启动的目的。

目前检测聚合酶的延伸活性的抑制效果常用的手段是通过设计某些特定的容易出现非特异扩增的引物，以某些复杂的双链DNA为模板，进行PCR反应(变性、复性、延伸)，最后通过产物电泳的方法，观察电泳条带的结果(非特异条带、引物二聚体)是否存在或量的多少来判断非特异扩增结果，进而推测在初始变性前(20℃～70℃)聚合酶的延伸活性是否被抑制。目前对聚合酶延伸活性的检测没有相关的针对性的试剂盒，在进行聚合酶延伸活性的检测时，需要花费大量时间准备实验材料，且实验需要的实验材料较多，操作繁杂，难以快速完成检测。

针对上述问题，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的是提供一种应用于抗体封闭核酸聚合酶活性评估和核酸聚合酶延伸活性评估的核酸聚合酶活性检测方法及试剂盒，该检测方法及试剂盒解决了以PCR反应所产生的引物二聚体以及非特异性产物为检测结果的复杂体系，其能够直接以单链DNA作为模板，进行qPCR链式反应来评估抗体封闭核酸聚合酶的活性和评估核酸聚合酶的延伸活性。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种核酸聚合酶活性检测方法的应用,核酸聚合酶活性检测方法应用于抗体封闭核酸聚合酶活性的评估和核酸聚合酶延伸活性的评估，所述核酸聚合酶活性检测方法为：

检测核酸聚合酶延伸活性的模板为单链DNA，所述单链DNA与对应单链DNA设计的引物结合后加入核酸聚合酶进行qPCR链式反应，基于反应结果分析核酸聚合酶的活性。

优选的，核酸聚合酶活性检测方法应用于抗体封闭Taq DNA聚合酶、高保真聚合酶活性的评估和Taq DNA聚合酶、高保真聚合酶延伸活性的评估。

一种实现上述应用的试剂盒，包含10×PCR buffer、dNTP、荧光染料以及上述的单链DNA和对应单链DNA设计的引物。

优选的，所述单链DNA的序列如SEQ ID NO:1所示。

优选的，对应单链DNA设计的引物序列如SEQ ID NO:2所示。

优选的，所述单链DNA的结构为：

一种上述试剂盒的使用方法，单链DNA、对应单链DNA设计的引物、10×PCRbuffer、dNTP、H₂O和荧光染料组成初步反应体系，所述单链DNA与对应单链DNA设计的引物的结合在初步反应体系中完成，所述单链DNA与对应单链DNA设计的引物结合后加入核酸聚合酶进行荧光定量PCR链式反应。

优选的，所述初步反应体系的反应条件为95℃反应3min后自然冷却，所述荧光定量PCR链式反应的反应程序为：37℃，20s预变性，然后按37℃反应3s,37℃反应3min进行链式循环反应99次。

优选的，所述初步反应体系中各组分的含量为：

与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

本发明提供了一种应用于抗体封闭核酸聚合酶活性评估和核酸聚合酶延伸活性评估的核酸聚合酶活性检测方法及试剂盒，该检测方法及试剂盒解决了以PCR反应所产生的引物二聚体以及非特异性产物为检测结果的复杂体系，其能够直接以单链DNA作为模板，单链DNA与对应单链DNA设计的引物在初步反应体系中结合后，加入核酸聚合酶进行qPCR链式反应，基于反应结果来评估抗体封闭核酸聚合酶的活性和评估核酸聚合酶的延伸活性；本发明提供的实现核酸聚合酶活性检测方法的应用的试剂盒，操作方便，反应体系简单、反应温和，所需实验材料少，对仪器设备要求低，其能够准确且快速简洁的评估抗体封闭核酸聚合酶的活性或评估核酸聚合酶的延伸活性，具有实际的应用价值。

附图说明

图1为单链DNA的结构。

图2为实施例2中抗体封闭核酸聚合酶活性的扩增曲线。

图3为实施例2中抗体封闭核酸聚合酶活性的溶解曲线。

图4为实施例3中不同酶活性检测的电泳图。

图5为实施例3中不同核酸聚合酶活性检测的扩增曲线。

图6为实施例3中不同核酸聚合酶活性检测的溶解曲线。

图7为实施例4中核酸聚合酶活性检测的扩增曲线。

具体实施方式

为了使本领域的人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合本发明的附图，对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其它类同实施例，都应当属于本申请保护的范围。

实施例1

本具体实施例中提供的核酸聚合酶活性检测方法的应用，应用于抗体封闭核酸聚合酶活性的评估和核酸聚合酶延伸活性的评估，其所针对的核酸聚合酶为Taq DNA聚合酶，尤其适用于Taq酶和高保真聚合酶。

所述的核酸聚合酶活性检测方法具体为：

(1)以10×PCR buffer、H₂O、dNTP、单链DNA模板和对应单链DNA设计的引物和荧光染料作为初步反应体系进行反应使初步反应体系中的单链模板和引物结合，初步反应体系的反应条件为95℃反应3min后自然冷却。

(2)向初步反应体系中加入核酸聚合酶进行qPCR链式反应，qPCR链式反应的反应程序为：37℃，20s预变性，然后按37℃反应3s,37℃反应3min进行链式循环反应99次。

(3)基于qPCR链式反应的结果分析核酸聚合酶的活性。

本具体实施例还提供了一种实现上述应用的试剂盒，该试剂盒包括10×PCRbuffer、dNTP、荧光染料以及单链DNA和对应单链DNA设计的引物，其中，单链DNA的序列如SEQ ID NO:1所示，单链DNA的结构如图1所示。本具体实施例提供的单链DNA的二级结构较少，这是因为DNA二级结构的打开需要一定的能量，设计单链模板时，二级结构少可以保证在较低温度下(如37度)形成完全单链状态，便于引物结合及延伸。

对应单链DNA设计相应的引物，对应单链DNA设计的引物序列如SEQ ID NO:2所示。

上述试剂盒的使用方法即为上述的核酸聚合酶活性检测方法，其中核酸聚合酶活性检测方法中步骤(1)的初步反应体系中各组分的含量为：

步骤(2)中核酸聚合酶的加入量根据核酸聚合酶的活性来定。

步骤(2)中qPCR链式反应的反应程序不仅限于上述公开的程序，qPCR链式反应使用恒温延伸作为反应条件即可，反应设定的温度可根据检测预实验时反应结果的快慢来调节设定。

实施例2应用实施例1提供的试剂盒评估抗体封闭核酸聚合酶活性

以Taq DNA聚合酶(KAPA 2G FAST DNA聚合酶，KAPA Biosystem)、能够封闭TaqDNA聚合酶活性的1抗体(菲鹏生物股份有限公司(Fapon Biotech Inc.),Taq antibody)、不能够封闭Taq DNA聚合酶活性的2抗体(菲鹏生物股份有限公司(Fapon Biotech Inc.),Pfu antibody)和KAPA 2G快速热启动DNA聚合酶(KAPA Hot Start 2G Fast，KAPABiosystem，该酶结合了一个能够使它在首次变性步骤前失活的抗体)为实验材料，以实施例1提供的试剂盒及其使用方法来评估不同核酸聚合酶的延伸活性，具体为：

(1)分别构建五组初步反应体系：

(2)五组初步反应体系均在95℃反应3min后自然冷却，使得单链模板和引物充分结合。

(3)分别向五组初步反应体系中加入1μl 0.5U的KAPA 2G FAST DNA聚合酶、1μl0.5U的KAPA 2G FAST DNA聚合酶和1抗体的混合物、1μl 0.5U的KAPA 2G FAST DNA聚合酶和2抗体的混合物、1μl 0.5U的KAPA 2G快速热启动DNA聚合酶和1μl H₂O进行qPCR链式反应，qPCR链式反应的反应程序为：37℃，20s预变性，然后按37℃反应3s,37℃反应3min进行链式循环反应99次，最后建立熔解曲线，基于扩增曲线和溶解曲线评估抗体封闭Taq DNA聚合酶活性。

按上述试验方法进行试验，试验结果如图2和图3所示，图2和图3中标记1、2、3、4、5分别对应加入KAPA 2G FAST DNA聚合酶的无抗体体系、加入KAPA 2GFAST DNA聚合酶和2抗体的混合物的第一封闭体系、加入KAPA 2G快速热启动DNA聚合酶的第二封闭体系、加入KAPA 2G FAST DNA聚合酶和1抗体的混合物的第三封闭体系、加入1μl H₂O的无酶体系。由图2和图3可以看出，能够封闭Taq DNA聚合酶活性的1抗体可以封闭Taq DNA聚合酶，KAPA2G快速热启动DNA聚合酶在首次变性步骤前处于失活状态，不能够促使反应体系进行延伸反应，不能封闭Taq DNA聚合酶活性的2抗体不能够封闭Taq DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶依旧就有延伸活性，Taq DNA聚合酶是具有延伸活性的，其能够实现单链DNA的延伸。上述试验结果与预期试验结果相同，表明本发明提供的试剂盒可以用于评估抗体封闭核酸聚合酶活性。

该试剂盒极大地简化了操作过程、节省了实验投入的开支，降低了研发成本，极其适用于企业大量生产研发中对封闭核酸聚合酶活性的抗体的筛选。

实施例3应用实施例1提供的试剂盒评估不同核酸聚合酶的延伸活性

以A酶(Vazyme Taq DNA聚合酶，Vazyme)、B酶(KAPA 2G FAST DNA聚合酶，KAPABiosystem)为实验材料。

首先采用常规实验方法检测相同酶活力单位下A酶和B酶的扩增活性，即以人基因组DNA为模板，以对应人基因组DNA设计的引物为引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳实验，实验结果如图4所示，由图4可以看出，相同酶活力单位下，B酶的延伸活性比A酶的延伸活性高。

以实施例1提供的试剂盒及其使用方法来评估不同核酸聚合酶的延伸活性，具体为：

(1)分别构建七组初步反应体系：

(2)七组初步反应体系均在95℃反应3min后自然冷却，使得单链模板和引物充分结合。

(3)分别向七组初步反应体系中加入1μl H₂O、1μl 0.05U的A酶、1μl 0.1U的A酶、1μl 0.5U的A酶、1μl 0.05U的B酶、1μl 0.1U的B酶和1μl 0.5U的B酶进行qPCR链式反应，qPCR链式反应的反应程序为：37℃，20s预变性，然后按37℃反应3s,37℃反应3min进行链式循环反应99次，最后建立熔解曲线，基于扩增曲线和溶解曲线评估A酶、B酶的延伸活性。

按上述试验方法进行试验，试验结果如图5和图6所示，图中标记1、2、3、4、5、6、7分别为加入0.5U的B酶的体系、加入0.1U的B酶的体系、加入0.5U的A酶的体系、加入0.05U的B酶的体系、加入0.1U的A酶的体系、加入0.05U的A酶的体系和加入H₂O的无酶体系。由图5和图6可以看出，相同的酶活力单位下，B酶的产物量比A酶高，即B酶的延伸能力比A酶高，即B酶的实际酶活比A酶高。上述试验结果与预期试验结果相同，表明本发明提供的试剂盒可以用于评估不同核酸聚合酶的延伸活性。

由图5和图6还可以看出，对于同一核酸聚合酶，起始阶段，酶活力单位数高的酶活性大，这与实际情况也相符，表明本发明提供的试剂盒可以用于评估核酸聚合酶的延伸活性。

该试剂盒极大地简化了评估不同核酸聚合酶的延伸活性的操作过程、节省了实验投入的开支，降低了研发成本，极其适用于企业大量生产研发中对不同核酸聚合酶延伸活性的筛选。

实施例4应用实施例1提供的试剂盒评估高保真聚合酶的延伸活性

以KAPA HiFi高保真酶(KAPA Biosystem)为实验材料，对不同酶活力单位的KAPAHiFi高保真酶进行酶活力验证实验，正常情况下，酶活力单位数高的酶活性大。以实施例1提供的试剂盒及其使用方法来评估不同核酸聚合酶的延伸活性，具体为：

(1)分别构建四组初步反应体系：

(2)四组初步反应体系均在95℃反应3min后自然冷却，使得单链模板和引物充分结合。

(3)分别向四组初步反应体系中加入1μl H₂O、1μl 0.05U的KAPA HiFi高保真酶、1μl 0.1U的KAPA HiFi高保真酶和1μl 0.5U的KAPA HiFi高保真酶进行qPCR链式反应，qPCR链式反应的反应程序为：然后按37℃反应3s,37℃反应30s进行链式循环反应99次，基于扩增曲线评估高保真酶的活性。

按上述试验方法进行试验，试验结果如图7所示，图7中标记1、2、3、4分别为加入0.5U的KAPA HiFi高保真酶的体系、0.1U的KAPA HiFi高保真酶的体系、0.05U的KAPA HiFi高保真酶的体系和H₂O的无酶体系。由图7可以看出，酶活力单位数高的酶活性大。上述试验结果与预期试验结果相同，表明本发明提供的试剂盒可以用于评估高保真聚合酶的延伸活性。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

序列表

<110> 北京启衡星生物科技有限公司

<120> 一种核酸聚合酶活性检测方法的应用及试剂盒

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 100

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agacctagaa ttgcgtatga ttaacagaat atagaggtgg aggcgaaata tgggccagag 60

ttattgacta gcgatgtgtc tctcaaaggt aaaaatgttt 100

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aaacattttt acctttga 18

Claims (6)

1.一种核酸聚合酶活性检测方法的应用,其特征在于，核酸聚合酶活性检测方法应用于抗体封闭核酸聚合酶活性的评估和核酸聚合酶延伸活性的评估，所述核酸聚合酶活性检测方法为：

检测核酸聚合酶延伸活性的模板为单链DNA，所述单链DNA与对应单链DNA设计的引物结合后加入核酸聚合酶进行qPCR链式反应，基于反应结果分析核酸聚合酶的活性，所述单链DNA的序列如SEQ ID NO:1所示，对应单链DNA设计的引物序列如SEQ ID NO:2所示，所述单链DNA的结构为：

2.根据权利要求1所述的核酸聚合酶活性检测方法的应用，其特征在于，核酸聚合酶活性检测方法应用于抗体封闭Taq DNA聚合酶、高保真聚合酶活性的评估和Taq DNA聚合酶、高保真聚合酶延伸活性的评估。

3.一种实现如权利要求1或2所述应用的试剂盒，其特征在于，包含10×PCR buffer、dNTP、荧光染料以及单链DNA和对应单链DNA设计的引物。

4.一种如权利要求3所述试剂盒的使用方法，其特征在于，单链DNA、对应单链DNA设计的引物、10×PCR buffer、dNTP、H₂O和荧光染料组成初步反应体系，所述单链DNA与对应单链DNA设计的引物的结合在初步反应体系中完成，所述单链DNA与对应单链DNA设计的引物结合后加入核酸聚合酶进行荧光定量PCR链式反应。

5.根据权利要求4所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述初步反应体系的反应条件为95℃反应3min后自然冷却，所述荧光定量PCR链式反应的反应程序为：37℃，20s预变性，然后按37℃反应3s,37℃反应3min进行链式循环反应99次。

6.根据权利要求5所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述初步反应体系中各组分的含量为：

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