CN103667252A - 一种核酸扩增方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种核酸扩增方法及其试剂盒。本发明利用限制性切刻酶进行双链DNA和/或单链DNA的扩增。除额外加入限制性切刻酶外不需要添加任何另外的试剂，也就不存在这些物质对后续TMA或NASBA反应的影响，因此可以避免额外添加限制性寡核苷酸造成的扩增效率降低、非特异产物增加的问题。本发明所述方法及试剂盒可以用于任何类型的DNA、样品中待检病毒DNA以及基因组DNA，不仅可以用于DNA混合样本的多重检测，还适用于DNA和RNA混合样本的多重检测，与其他相关技术结合，能广泛地应用于分子诊断、科学研究、防疫检测、法医鉴定等领域。

Description

一种核酸扩增方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种核酸扩增方法。
背景技术
聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术是20世纪80年代分子生物学领域的一项革命性突破。经过几十年的改进，PCR方法已从定性发展为定量，能够在几个小时内从几个拷贝或单个细胞开始扩增到数十亿特异性的核酸片段。
尽管PCR技术长期占据着核酸扩增技术的垄断地位，但后续研发的一系列等温（isothermal）核酸扩增技术正逐渐成为PCR技术的替代方法而被广泛应用。这些扩增技术应用不同的原理和方法，可在某一特定温度条件下（如37℃），实现核酸（DNA或RNA）的扩增。国际国内已有的恒温扩增技术如：核酸序列扩增技术(Nucleic acid sequence based amplification,NASBA)、转录介导扩增技术（transcription-mediated amplification,TMA）、链置换扩增技术（Strand Displacement Amplification,SDA）、滚环扩增技术（Rolling CircleAmplification,RCA）、解链酶扩增技术（Helicase DependantAmplification,HAD）、单引物等温扩增技术（Single primer isothermalamplification,SPIA）和切刻内切酶核酸恒温扩增（Nicking endonucleasemediated amplification,NEMA）等等。其中，核酸序列扩增技术（NASBA）和转录介导扩增技术（TMA）是目前国际上最成熟的恒温扩增技术，在研究及临床检验领域被广泛应用。本发明方法与这两种技术紧密相关。
NASBA和TMA两种核酸扩增方法都需要四种酶活性来完成：依赖RNA的DNA聚合酶活性、依赖DNA的DNA聚合酶活性、RNA酶H活性和RNA聚合酶活性。这些活性中的一些可以联合在一种酶中，所以通常只有2或3种酶是必需的。两种方法的区别在于所选择的逆转录酶不同，NASBA方法使用禽成肌细胞瘤病毒(AMV)逆转录酶，而TMA方法选用莫洛尼属白血病病毒(M-MLV)逆转录酶。它们的扩增原理相似:目标序列在逆转录酶作用下，以引物为引导进行逆转录，逆转录酶的RNA酶H活性将杂合链上的RNA降解以后，合成带双链T7启动子序列的DNA，并在T7 RNA多聚酶作用下，转录出成千上万个目标RNA序列，这些RNA又可以作为模板进行下一个循环，整个反应是一个自催化过程。最后可通过一些方法（比如添加分子信标探针）检测扩增产物来定量或定性靶核酸。实际上，从样品中的单链RNA开始，一旦将所有的成分放在一起，并将混合物置于适当的温度以让酶都有活性，整个一系列事件就会发生，无需人为干预。
勿庸置疑，TMA或NASBA技术扩增方法对于单链RNA的扩增特别有效。然而当对只以双链DNA的形式存在（环状或线性）的靶核酸实施TMA或NASBA的扩增方法时，必须将DNA转变成单链核酸，合成出RNA。
在EP397269中描述了一种方法，双链DNA用限制性内切酶进行预处理，之后用加热分离步骤使其形成单链DNA。在该方法中使用第一引物P1（启动子引物），其3`部分含有与DNA双链中的一条3`末端准确互补的序列，以及5`末端含有可被RNA聚合酶（如T7）识别的启动子序列。其中第一引物的5`启动子序列可以作为用于从DNA链3`末端开始延伸反应的模板。因此，通过依赖DNA的DNA聚合酶可形成双链启动子，结果产生的复合物可以作为对于依赖DNA的RNA聚合酶的模板从而合成RNA的多重拷贝。随后的反应进程与普通的TMA或NASBA方法完全一致。其反应过程如图1。当DNA是单链时，限制性寡核苷酸（RP）或限制性引物含有与包括目标DNA的限制位点的区域互补的序列，将其和限制性内切酶一起添加，如图2。限制性寡核苷酸的功能可以合并入含有可被依赖DNA的RNA聚合酶识别的启动子序列的寡核苷酸内。bioMerieux公司采用该方法解决HBV的等温扩增（NASBA）问题，95%的检出率为242 WHO IU/mL，50%的检出率为35 WHO IU/mL。
内切酶酶切变性使待测DNA变成单链进而形成所需RNA的设计打破了NASBA或TMA不能扩增DNA的禁锢，无疑具有非凡的意义。但是也存在明显的缺点：
1、该方法的使用前提是必需首先明确待测样本为单链还是双链DNA，从而采取不同的策略（是否添加RP）来进行。
2、额外核苷酸序列（RP）的添加势必会对扩增反应体系产生不利影响，引物间非特异性结合的几率增大；酶切之后的产物势必会引起非特异性产物的增加等等。而引物间非特异性结合的几率增大和非特异性产物的增加都将导致整个体系的有效扩增效率降低。
3、即便限制性寡核苷酸的功能可以合并入含有可被依赖DNA的RNA聚合酶识别的启动子序列的寡核苷酸内，但其经酶切后仍然会形成两条额外序列（这两条序列对整个扩增反应体系而言不是必需的），仍无法避免非特异性产物增加的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的针对现有技术中额外添加RP造成的扩增效率降低、非特异产物增加的问题，提供一种扩增效率高、非特异产物少的切刻酶耦联转录介导的核酸扩增方法。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种核酸扩增方法为在含有所选限制位点切割DNA的限制性切刻酶的反应混合物中进行转录扩增。
本发明利用限制性切刻酶进行双链DNA和/或单链DNA的扩增。除额外加入限制性切刻酶外不需要添加任何另外的试剂（比如限制性寡核苷酸RP），也就不存在这些物质对后续TMA或NASBA反应的影响，因此可以避免额外添加RP造成的扩增效率降低、非特异产物增加的问题。
进一步的，该方法从存在于样品中的DNA开始，其具体包括以下步骤：
A、在扩增缓冲液中温育待测样品，该温育体系中含有：
一或多种能够在所选限制位点切割DNA的限制性切刻酶，该限制性切刻酶在该DNA的一条链上形成特定的3`末端；
启动子引物，该启动子引物的5`区域包含被依赖DNA的RNA聚合酶所识别的启动子序列且其3`区域与该DNA链的特定的3`末端反向互补；
第二或反向引物，其具有与启动子引物相反的极性且含有目标序列的5`末端；
B、将如此形成的反应混合物在适当的条件下保持足够的时间，以进行限制性切刻酶的消化；
C、将样品以足以失活限制性切刻酶和/或导致双链的单链化的温度和时间进行加热处理；
D、向样品中加入下列试剂，
具有依赖RNA的DNA聚合酶活性的酶
具有依赖DNA的DNA聚合酶活性的酶
具有RNaseH活性的酶
具有RNA聚合酶活性的酶
F、将如此形成的反应混合物在适当的条件下保持足够的时间，以进行扩增。
在一些实施例中，所述样品中的DNA为双链且该DNA具有一种或多种限制性切刻酶酶切位点，所述启动子引物含有可被依赖DNA的RNA聚合酶识别的启动子序列且其3`区域与该DNA酶切链特定的3`末端反向互补。即对于双链DNA模板，先将双链DNA用限制性切刻酶进行预处理使得在其一条链的特定位置形成缺刻，之后用加热分离步骤使双链DNA彼此分离形成单链，并且被切刻的一条链在切刻位置断开暴露出该位置的3`端。在该方法中使用第一引物P1(启动子引物)，其3`部分含有与该暴露的3`末端准确互补的序列，以及5`末端含有可被RNA聚合酶（如T7）识别的启动子序列。其中第一引物的5`启动子序列可以作为用于从DNA链3`末端开始延伸反应的模板。因此，通过依赖DNA的DNA聚合酶可形成双链启动子，结果产生的复合物可以作为对于依赖DNA的RNA聚合酶的模板从而合成RNA的多重拷贝。后续反应为普通的TMA或NASBA过程。其反应示意图如图3。
在一些实施例中，所述样品中的DNA为单链且该DNA具有一种或多种限制性切刻酶酶切位点，所述启动子引物含有与包括目标单链DNA的限制位点的区域互补的序列和可被依赖DNA的RNA聚合酶识别的启动子序列。即对于单链DNA模板，启动子引物先与单链DNA复性形成切刻酶酶切位点。在该方法中使用启动子引物，其3`部分含有与切点位置的3`末端准确互补的序列，以及5`末端含有可被RNA聚合酶（如T7）识别的启动子序列。复性后的产物用限制性切刻酶进行预处理使得在待测DNA的特定位置形成缺刻，之后用加热分离步骤使模板DNA在切点位置断裂，暴露出该位置的3`端。随后的复性过程，启动子引物与切点位置的3`末端准确互补，该引物的5`启动子序列可以作为用于从DNA链3`末端开始延伸反应的模板。因此，通过依赖DNA的DNA聚合酶可形成双链启动子，结果产生的复合物可以作为对于依赖DNA的RNA聚合酶的模板从而合成RNA的多重拷贝。后续反应为普通的TMA或NASBA过程。其反应示意图如图4。
在一些实施例中，所述样品中的DNA为单链和双链的混合物且该两种或多种DNA具有一种或多种相同或不同的限制性切刻酶酶切位点，实现不同核酸模板的同时检测。
进一步的，本发明所述核酸扩增方法的具体步骤为：
a)在限制性切刻酶发挥活性的温度及离子浓度条件下温育，
对于双链DNA模板，限制性切刻酶识别特异性核酸序列，在其中一条核酸链上切割形成一个切口；
对于单链DNA模板，启动子引物（P1）与单链DNA结合形成限制性切刻酶识别的特异性核酸序列，在模板链上切割形成一个切口；
b)加热使被切的那条链在切刻位置断开暴露出该位置的3`端，双链DNA或者启动子引物（P1）与单链DNA结合形成的局部双链彼此分离，同时限制性切刻酶也被失活；
c）随后进行复性过程，启动子引物（P1）的3`部分与该暴露的3`末端准确互补，其5`末端含有可被RNA聚合酶识别的启动子序列，该序列可以作为用于从DNA链3`末端开始延伸反应的模板；
d）向反应体系中加入酶混合物，依赖DNA的DNA聚合酶活性以启动子引物为模板，从DNA链3`末端和启动子引物的3`末端同时开始延伸反应使形成双链DNA（含启动子引物序列）；
e)依赖DNA的RNA聚合酶活性的酶准确识别双链启动子序列，以双链DNA为模板转录出与该DNA链互补的RNA链；
f)将第二引物P2和产生于步骤（e）中的RNA转录物退火；
g)在由依赖RNA的DNA聚合酶活性催化的反应中延伸第二引物形成第一RNA/cDNA杂交核酸分子；
h）RNaseH的活性选择性地除去第一RNA/cDNA杂交核酸分子的RNA以获得第一单链cDNA分子；
i）将启动子引物（P1）和获得的第一单链cDNA序列退火；
j）使用启动子引物（P1）作为模板，在由DNA聚合酶催化的反应中延伸第一单链cDNA分子的3`末端，形成包含双链启动子位点的第一部分双链DNA分子；
k）在由DNA依赖性RNA聚合酶催化的反应中，使用步骤（j）的第一部分双链DNA分子制备多个与e）步极性一致的RNA转录物，所述DNA依赖性RNA聚合酶具有对于启动子引物（P1）中的启动子序列的特异性；
l）循环重复步骤f）至步骤k），进而合成RNA的多重拷贝，扩增反应缓冲液中加入检测试剂（比如分子信标探针等）可实时监控RNA的生成。
在一些实施例中如果启动子引物P1的3`末端进行了封闭，使其不会延伸，则降低了副产物的生成，能提高体系的检测灵敏度，此时依赖DNA的RNA聚合酶活性的酶准确识别双链启动子序列，以单链DNA为模板转录出与该DNA链互补的RNA链。
本发明所述方法，所述样品可以为任何类型的DNA、待检病毒DNA以及基因组DNA。作为优选，所述样品为含有乙型肝炎病毒DNA的样品或梅毒螺旋体病毒DNA的样品。
在一些实施例中，所述温育的温度为35~45℃。更优选为41℃。
在一些实施例中，所述加热的温度为92~98℃。更优选为95℃。
限制性切刻酶为一类特异的核酸内切酶，通过辨别特异的核苷酸序列来切割双链DNA的特定位点，其并不切断DNA分子的双链，而只切断双链中的一条链。然后利用聚合酶活性，以切口的3`末端为起点，以未被切断的单链为模板，合成新链。目前已知的限制性切刻酶均适用于本发明所述核酸扩增方法，如，Nb.BtsI、Nt.CviPII、N.AlwI、Nb.BbvCI、Nt.BbvCI、N.BstNBI、Nb.Bsm。
其中，作为优选，所述限制限制性切刻酶为Nb.BtsI或Nt.CviPII。
在一个具体实施例中，所述样品为含有乙型肝炎病毒DNA时，考虑到保守区域，所述限制性切刻酶为Nt.CviPII，其酶切位点如下：
5`…^CCD…3`
3`…GGH…5`
其中，D=A或G或T，不为C；H=A或C或T，不为G。
本发明还提供了一种核酸扩增试剂盒，包括启动子引物、反向引物、分子信标探针和限制性切刻酶。
进一步的，所述试剂盒还可以包括核酸扩增的其他组分，如反应缓冲液组分、TMA酶组分等。其中所述反应缓冲液组分包括Tris-HCl、MgCl2、KCl、DMSO、DTT、各种dNTP和NTP（即dNTP包括dATP、dTTP、dGTP和dCTP，NTP包括ATP、UTP、GTP和CTP），所述TMA酶组分包括海藻糖（Trehalose）、牛血清白蛋白（BSA）、M-MLV和T7 RNA聚合酶。
在一个具体实施例中，所述样品为含有乙型肝炎病毒DNA时，所述试剂盒包括启动子引物、反向引物、分子信标探针和限制性切刻酶，其中所述启动子引物具有SEQ ID No:1所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No:2所示核苷酸序列，所述分子信标探针具有SEQ ID No:3所示核苷酸序列，所述限制性切刻酶为Nt.CviPII。具体序列见表1。
表1扩增乙型肝炎病毒DNA的试剂盒的引物及探针序列
Figure BDA00002119743700071
*粗斜体表示T7启动子序列，带下划线的斜体表示探针的茎干序列
在一个具体实施例中，一种扩增乙型肝炎病毒DNA的试剂盒包括50mMpH8.5Tris-HCl、8.66mM MgCl2、70mM KCl、11 v/v % DMSO、3.3mM DTT、1.25mM的各种dNTP和NTP、0.1μM具有SEQ ID No:1所示核苷酸序列的启动子引物F201111-1、0.1μM具有SEQ ID No:2所示核苷酸序列的反向引物R708、0.05μM具有SEQ ID No:3所示核苷酸序列的分子信标探针MB713、1U的限制性切刻酶Nt.CviPII.、0.07M Trehalose、22.5μg BSA、400UM-MLV和100U T7 RNA聚合酶。
在一个具体实施例中，所述样品为含有梅毒螺旋体DNA时，所述试剂盒包括启动子引物、反向引物、分子信标探针和限制性切刻酶，其中所述启动子引物具有SEQ ID No:4所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No:5所示核苷酸序列，所述分子信标探针具有SEQ ID No:6所示核苷酸序列，所述限制性切刻酶为Nb.BtsI。具体序列见表2。
表2扩增梅毒螺旋体DNA的试剂盒的引物及探针序列
Figure BDA00002119743700081
*粗斜体表示T7启动子序列，带下划线的斜体表示探针的茎干序列
在一个具体实施例中，一种扩增梅毒螺旋体DNA的试剂盒包括50mMpH8.5Tris-HCl、8.66mM MgCl2、70mM KCl、11 v/v % DMSO、3.3mM DTT、1.25mM的各种dNTP和NTP、0.1μM具有SEQ ID No:4所示核苷酸序列的启动子引物F400806、0.1μM具有SEQ ID No:5所示核苷酸序列的反向引物R400806-3、0.05μM具有SEQ ID No:6所示核苷酸序列的分子信标探针MBP3、1U的限制性切刻酶Nt.CviPII.、0.07M Trehalose、22.5μg BSA、400UM-MLV和100U T7 RNA聚合酶。
作为优选，所述启动子引物3`端带有氨基修饰。
作为优选，所述反向引物的5`端第13位为锁核酸碱基。
与现有技术相比，本发明所述切刻酶藕链转录介导的核酸扩增方法用于双链DNA和/或单链DNA的扩增与检测具有独特的优势。由于其除额外加入限制性切刻酶外不需要添加任何另外的试剂（比如限制性寡核苷酸RP），也就不存在这些物质对后续TMA或NASBA反应的影响，在单链DNA的扩增方面优势更为突出。本发明所述方法及试剂盒可以用于任何类型的DNA、样品中待检病毒DNA以及基因组DNA，尤其是对于来自乙型肝炎病毒（HBV）的DNA的扩增和检测特别有用。在HBV的正链长度不定（正链长度为负链的50%-100%）的情况下，特别是在血液筛查过程中，pooling的血样中HBV的亚型可能存在差异，检测区域的双链和单链问题不能很好确定时，本发明所述方法及试剂盒就会突显出其优越性能，不用区别单链或双链，只要能选择较佳的切刻酶位点，即可进行HBV的检测。此外，本发明所述方法及试剂盒不仅可以用于DNA混合样本的多重检测，即含有多种DNA模板、单链和/或双链；还适用于DNA和RNA混合样本的多重检测，如HBV-HCV-HIV三联筛查。与其他相关技术结合，能广泛地应用于分子诊断、科学研究、防疫检测、法医鉴定等领域。
附图说明
图1示双链DNA-NASBA反应机制示意图；
图2示单链DNA-NASBA反应机制示意图；
图3示本发明所述切刻酶藕链转录介导的核酸扩增方法双链DNA-NETAS反应机制示意图；
图4示本发明所述切刻酶藕链转录介导的核酸扩增方法单链DNA-NETAS反应机制示意图；
图5示实施例1采用限制性内切酶对不同浓度的核酸进行扩增（对照组）扩增曲线图；
图6示实施例1采用限制性切刻酶对不同浓度的核酸进行扩增（本方案组）扩增曲线图；
图7示实施例1扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果图，其中1-8泳道（对照组）为核酸绝对输入量分别为50000IU、5000IU、500IU、50IU、5IU、2.55IU、1.25IU、阴性对照；9-16泳道（本方案组）为核酸绝对输入量分别为50000IU、5000IU、500IU、50IU、5IU、2.55IU、1.25IU、阴性对照；泳道M为RNA marker，从上至下依次为1000nt、800nt、600nt、400nt、300nt、200nt、100nt；目的条带A为对照组扩增目的产物；目的条带B为本方案组扩增目的产物；
图8示实施例2 HBV DNA的扩增的Nt.CviPII酶切活性的10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果图，其中1号泳道为未添加Nt.CviPII的孵育产物；2号泳道为添加Nt.CviPII的孵育产物；泳道D为单链DNA marker；
图9示实施例2不加入限制性切刻酶Nt.CviPII检测天然HBV病毒核酸的扩增检测曲线图；
图10示实施例2加入限制性切刻酶Nt.CviPII检测天然HBV病毒核酸的扩增检测曲线图；
图11示实施例3 TP DNA的扩增的Nb.BtsI酶切活性的10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果图，其中D泳道为单链DNA marker；1号泳道为未添加Nb.BtsI的孵育产物；2号泳道为添加Nb.BtsI的孵育产物；
图12示实施例3不加入限制性切刻酶Nb.BtsI检测梅毒螺旋体病毒核酸的检测扩增曲线图；
图13示实施例3加入限制性切刻酶Nb.BtsI检测梅毒螺旋体病毒核酸的检测扩增曲线图；
图14示实施例3检测梅毒螺旋体病毒的扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果图，其中1-8号泳道为不加Nb.BtsI组，自左向右依次为3L、4L、5L、6L、7L、8L、  9L，阴性对照；9-16号泳道为加Nb.BtsI组，自左向右依次为3L、4L、5L、6L、7L、8L、9L，阴性对照；R泳道为RNA marker。
具体实施方式
本发明实施例公开了切刻酶耦联转录介导的核酸扩增方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。
实施例1：分别采用限制性内切酶和限制性切刻酶对不同浓度的核酸进行扩增，比较检测灵敏度和扩增产物的特异性
1、按照中国专利CN02807389.4的方法，采用限制性内切酶对不同浓度的核酸进行扩增（对照组）：
反应条件：一个保守的限制性内切酶XbaI编码于HBV DNA的S-gen的保守区域内（根据EcoRI位点的nt244-285）内。当S-区域的这部分能够成为负极性的单链DNA时，加入与包含限制位点序列的区域互补的寡核苷酸（“限制性引物”（RP）），从而为所有存在的基因组DNA形成双链限制位点。用本公司研发的HBV质控品核酸（包含待检部位，单链DNA）进行梯度检测，每次测定用5μL的提取液（绝对输入量分别为50000IU、5000IU、500IU、50IU、5IU、2.5IU、1.25IU）。限制性内切酶消化在下列条件下进行：缓冲液40mM Tris-HClpH8.5，12mM MgCl2，70mM KCl，15%v/v DMSO，5mM DTT，1mM的各种dNTP，2mM ATP，2mM CTP，2mM UTP，1.5mM GTP，0.5mM ITP，0.2μM表3中的正向引物S-p3.8，0.2μM表3中的反向引物S-p4.5，0.1μM表3中的分子信标探针S-WT2，0.17μM限制性引物（RP-3）和3个单位的限制性内切酶XbaI。在于41℃温育15min之后，加热失活限制性内切酶，并将DNA模板于95℃变性5min，将反应混合物冷却至41℃并保持5min，在此期间发生引物的杂交。随后加入酶混合物（22.5μg BSA,400U的M-MLV和100U的T7 RNA聚合酶），并通过轻轻反复吹吸和短时间离心将反应混合物混合，然后开始扩增和实验检测。将反应混合物在Mx3000P（STRATAGENE）中于41℃温育90min，并每分钟进行荧光检测。反应物于485nm激发，于520nm测量到发射信号。
表3  采用限制性内切酶方法涉及的引物和探针序列
  名称   序列
  S-p3.8   5`-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAGACTCGTGGTGGACTTCTCTCA-3`
  S-p4.5   5`-GAACCAACAAGAAGATGAGGCA-3`
  S-WT2 5`-FAM-CGATCGAGGGACTGCGAATTTTGGCCGATCG-BHQ 1-3`
  RP-3   5`-AATACCGCAGAGTCTAGACTCGTGG-NH2-3`
2、按照本发明所述方法，采用限制性切刻酶对不同浓度的核酸进行扩增（本方案组）：
反应条件：一个保守的限制性切刻酶Nt.CviPII编码于HBV DNA的S-gen的保守区域内（根据EcoRI位点的nt257-262，--TGGˇTGGˇA--）。当S-区域的这部分能够成为负极性的单链DNA时，加入启动子引物，在该方法中使用启动子引物，其3`部分含有与切点位置的3`末端准确互补的序列，以及5`末端含有可被RNA聚合酶（如T7）识别的启动子序列。从而为所有存在的基因组DNA形成双链限制位点。用本公司研发的HBV质控品核酸（包含待检部位，单链DNA）进行梯度检测，每次测定用5μL的提取液（绝对输入量分别为50000IU、5000IU、500IU、50IU、5IU、2.5IU、1.25IU）。限制性切刻酶消化在下列条件下进行：缓冲液40mM Tris-HCl pH8.5，12mM MgCl2，70mM KCl，15% v/vDMSO，5mM DTT，1mM的各种dNTP，2mM ATP，2mM CTP，2mM UTP，1.5mM GTP，0.5mM ITP，0.1μM表4中的启动子引物F201111-1，0.1μM表4中的反向引物R708，0.067μM表4中的分子信标探针MB713和1U的限制性切刻酶Nt.CviPII（实验结果表明，Nt.CviPII的用量在1U-3U之间体系扩增检测灵敏度没有明显差异，1U稍优）。在于41℃温育15min之后，加热失活限制性切刻酶，并将DNA模板于95℃变性5min，将反应混合物冷却至41℃并保持5min，在此期间发生引物的杂交。随后加入酶（22.5ug BSA，400U的M-MLV和100U的T7 RNA聚合酶），并通过轻轻反复吹吸和短时间离心将反应混合物混合，然后开始扩增和实验检测。将反应混合物在Mx3000P（STRATAGENE）中于41℃温育90min，并每分钟进行荧光检测。反应物于485nm激发，于520nm测量到发射信号。
表4采用限制性切刻酶方法涉及的引物和探针序列
Figure BDA00002119743700121
*粗斜体表示T7启动子序列，带下划线的斜体表示探针的茎干序列
3、实验结果与分析
扩增曲线图见图5和图6，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，结果见图7。由图5和图6可见，在相同核酸输入量条件下，本发明所述采用限制性切刻酶扩增的方法的达到阳性的时间（time-to-point，TTP）晚于采用限制性内切酶扩增的方法；但采用限制性内切酶扩增的方法仅能检出绝对输入量50000IU和5000IU的核酸样本，而所述采用限制性切刻酶扩增的方法可以检出绝对输入量50000IU和5000IU、500IU、50IU、5IU、2.5IU的核酸样本，灵敏度高于对照组3个数量级。由图7可见，采用限制性内切酶扩增的方法的每个泳道都有弥散条带，底部的非特异条带很多；而本发明所述采用限制性切刻酶扩增的方法的扩增产物较为干净，非特异性扩增产物较少。结果表明对于HBV(单链DNA)的扩增检测本发明所述采用限制性切刻酶扩增的切刻酶耦联的转录介导扩增方法优于采用限制性内切酶扩增的内切酶耦联的转录介导扩增方法。
实施例2：HBV DNA的扩增(模板为单链DNA)
一个保守的限制性切刻酶Nt.CviPII编码于HBV DNA的S-gen的保守区域内（根据EcoRI位点的nt257-262，--TGGˇTGGˇA--）。当S-区域的这部分能够成为负极性的单链DNA时，加入启动子引物，在该方法中使用启动子引物，其3`部分含有与切点位置的3`末端准确互补的序列，以及5`末端含有可被RNA聚合酶（如T7）识别的启动子序列。从而为所有存在的基因组DNA形成双链限制位点。每次测定用6μL的提取液。限制性切刻酶消化在下列条件下进行：TMA缓冲液50mM Tris-HCl pH8.5，8.66mM MgCl2，70mM KCl，11%v/vDMSO，3.3mM DTT，1.25mM的各种dNTP和NTP，0.1μM表5中的启动子引物F201111-1，0.1μM表5中的反向引物R708，0.067μM表5中的分子信标探针MB713和1U的限制性切刻酶Nt.CviPII（实验结果表明，Nt.CviPII的用量在1U-3U之间体系扩增检测灵敏度没有明显差异，1U稍优）。在于41℃温育15min之后，加热失活限制性切刻酶，并将DNA模板于95℃变性5min，将反应混合物冷却至41℃并保持5min，在此期间发生引物的杂交。随后加入TMA酶混合物（0.07M Trehalose，22.5ug BSA,400U的M-MLV和100U的T7 RNA聚合酶），并通过轻轻反复吹吸和短时间离心将反应混合物混合，然后开始扩增和实验检测。将反应混合物在Mx3000P（STRATAGENE）中于41℃温育90min，并每分钟进行荧光检测。反应物于485nm激发，于520nm测量到发射信号。
表5HBV DNA的扩增的引物和探针序列
Figure BDA00002119743700131
*粗斜体表示T7启动子序列，带下划线的斜体表示探针的茎干序列
1、确定Nt.CviPII在上述酶切反应buffer中的效果
反应缓冲液：50mM Tris-HCl pH8.5，8.66mM MgCl2，70mM KCl，11% v/vDMSO，3.3mM DTT，1.25mM的各种dNTP和NTP，引物F201111-1、2U的限制性切刻酶Nt.CviPII、含酶切位点的部分模板序列（具体序列见表6）。于41℃温育15min之后，加热失活限制性切刻酶。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图8。
表6.HBV DNA的扩增的Nt.CviPII酶切活性验证所用寡核苷酸
Figure BDA00002119743700141
*粗体部分为Nt.CviPII酶切位点
cBN1013中有两个Nt.CviPII酶切位点，故cBN1013寡核苷酸被切割后得到16mer+34mer和19mer+31mer四条带，得到的34mer和19mer的序列，由于还有Nt.CviPII的酶切位点，故又会被切掉3个碱基，从而成为31mer和16mer两条带。因此理论上最终电泳图上清晰可见34mer、31mer和16mer三条带。由图8可见，未添加Nt.CviPII的孵育产物仅有两条模板条带；添加Nt.CviPII的孵育产物在电泳图上清晰可见34mer、31mer和16mer三条带和一条模板条带，与预期一致，表明Nt.CviPII在HBV TMA体系中是有活性的。
2、比较使用和不使用限制性切刻酶的效果
试剂材料名称和用量及具体操作如上所述，扩增模板为天然HBV病毒核酸。多份HBV临床阳性样本混匀后经High Pure Viral Nucleic Acid Kit(Roche,lot 11858874001)提取基因组，得到的核酸用HBV第二代国际标准品（WHO，97/750）定值，为2.4583e+008IU/mL。该核酸经10倍稀释5个梯度，其核酸绝对输入量分别为150000IU/反应、15000IU/反应、1500IU/反应、150IU/反应和15IU/反应。以该5种浓度核酸为模板比较使用和不使用限制性切刻酶的扩增效果，用扩增曲线形态及TTP评价，结果见图9和图10.
由图9和图10结果可见，加入Nt.CviPII后扩增灵敏度提高了3个数量级。相同模板输入量条件下，加入Nt.CviPII组的TTP相对于不加Nt.CviPII组少10min左右。结果表明本发明所述切刻酶耦联的转录介导扩增方法用于HBV天然病毒核酸检测时，最低检测灵敏度可达到15IU/反应或者更低。
实施例3：梅毒螺旋体（treponema pallidum，TP）DNA的扩增(模板为双链DNA)
一个保守的限制性切刻酶Nb.BtsI位点编码于TP DNA的DNA polymerase Igene(polA)的保守区域内，在负链上，酶切位点为3`-CGTCACˇNN-5`。天然状态下的TP DNA为双链，每次测定用6μL TP DNA溶液。限制性切刻酶消化在下列条件下进行：TMA缓冲液（50mM Tris-HCl pH8.5，8.66mM MgCl2，70mM KCl，11% v/v DMSO，3.3mM DTT，1.25mM的各种dNTP和NTP，0.1μM表7中的启动子引物F400806，0.1μM表7中的反向引物R400806-3，0.067μM表7中的分子信标探针MBP3和2U的限制性切刻酶Nb.BtsI（实验结果表明该切刻酶的用量在1U-5U范围内扩增效果没有明显差异，2U的效果稍优）。于41℃温育15min之后，加热失活限制性切刻酶，并将DNA模板于95℃变性5min，此时双链DNA的正链和负链彻底分离，负链与切刻酶酶切位点处断裂暴露出切点的3`端。将反应混合物冷却至41℃并保持5min，在此期间发生引物的杂交，启动子引物（F400806）的3`部分含有与切点位置的3`末端准确互补的序列，以及5`末端含有可被RNA聚合酶（如T7）识别的启动子序列。随后加入TMA酶混合物（0.07M Trehalose，22.5ug BSA,400U的M-MLV和100U的T7 RNA聚合酶），并通过轻轻反复吹吸和短时间离心将反应混合物混合，然后开始扩增和实时检测。在M-MLV作用下形成双链T7启动子，随后由于T7RNA聚合酶的作用转录形成大量RNA。将反应混合物在Mx3000P（STRATAGENE）中于41℃温育90min，并每分钟进行荧光检测。反应物于485nm激发，于520nm测量到发射信号。
表7  TP DNA扩增的引物和探针序列
Figure BDA00002119743700151
*粗斜体表示T7启动子序列，带下划线的斜体表示探针的茎干序列
1、确定Nb.BtsI在上述酶切反应buffer中的效果
反应缓冲液：50mM Tris-HCl pH8.5，8.66mM MgCl2，70mM KCl，11% v/vDMSO，3.3mM DTT，1.25mM的各种dNTP和NTP，2U的限制性切刻酶Nb.BtsI，含Nb.BtsI酶切位点的TP1寡核酸酸序列及其反向互补序列cTP1（具体序列见表8）。于41℃温育15min之后，加热失活限制性切刻酶。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测结果如图11。
表8  TP DNA的扩增的Nb.BtsI酶切活性验证所用寡核苷酸
Figure BDA00002119743700161
*粗体部分为Nb.BtsI酶切位点
cTP1中有一个Nb.BtsI酶切位点，故cTP1寡核苷酸被切割后理论上应该得到28mer和32mer两条带。由图11可见，未添加Nb.BtsI的孵育产物为两条大于60mer的条带；添加Nb.BtsI的孵育产物仅有一条大于60mer的条带，同时增加了两条分别为32mer和28mer的条带，与预期一致，表明Nb.BtsI在TP TMA体系中是有活性的。
2、比较使用和不使用限制性切刻酶的效果
试剂材料名称和用量及具体操作如上所述。用PCR方法拼接构建包括引物、探针序列位置的双链DNA。琼脂糖电泳后切胶回收备用。得到的模板核酸(6.03×1011copies/ul)10倍梯度稀释为9个梯度（分别为1L、2L、3L、4L、5L、6L、7L、8L、9L）。以3L、4L、5L、6L、7L、8L、9L浓度核酸为模板，比较使用和不使用限制性切刻酶的扩增效果，用扩增曲线形态及TTP和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析评价。扩增检测结果见图12和图13。扩增产物进行PAGE检测，结果见图14。
由图12和图13结果可见，加入Nb.BtsI后扩增灵敏度提高了2个数量级。相同模板输入量条件下，加入Nb.BtsI组的TTP相对于不加Nb.BtsI组少10min左右。由图14结果可见，不添加Nb.BtsI组能稳定检出3L、4L、5L、6L的核酸模板，而添加Nb.BtsI组能稳定检出3L、4L、5L、6L、7L和8L的核酸模板。结果表明，加入Nb.BtsI后扩增灵敏度提高了2个数量级。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Figure IDA00002119744600011
Figure IDA00002119744600021

Claims (13)

1.一种核酸扩增方法，其特征在于，该方法从存在于样品中的DNA开始，其具体包括以下步骤：
A、在扩增缓冲液中温育待测样品，该温育体系中含有：
一或多种能够在所选限制位点切割DNA的限制性切刻酶，该限制性切刻酶在该DNA的一条链上形成特定的3`末端；
启动子引物，该启动子引物的5`区域包含被依赖DNA的RNA聚合酶所识别的启动子序列且其3`区域与该DNA链特定的3`末端反向互补；
第二或反向引物，其具有与启动子引物相反的极性且含有目标序列的5`末端；
B、将如此形成的反应混合物在适当的条件下保持足够的时间，以进行限制性切刻酶的消化；
C、将样品以足以失活限制性切刻酶和/或导致双链的单链化的温度和时间进行加热处理；
D、向样品中加入下列试剂，
具有依赖RNA的DNA聚合酶活性的酶
具有依赖DNA的DNA聚合酶活性的酶
具有RNaseH活性的酶
具有RNA聚合酶活性的酶
F、将如此形成的反应混合物在适当的条件下保持足够的时间，以进行扩增。
2.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述样品中的DNA为双链且该DNA具有一种或多种限制性切刻酶酶切位点，所述启动子引物含有可被依赖DNA的RNA聚合酶识别的启动子序列且其3`区域与该DNA酶切链特定的3`末端反向互补。
3.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述样品中的DNA为单链且该DNA具有一种或多种限制性切刻酶酶切位点，所述启动子引物含有与包括目标单链DNA的限制位点的区域互补的序列和可被依赖DNA的RNA聚合酶识别的启动子序列。
4.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述样品中的DNA为单链和双链的混合物且该两种或多种DNA具有一种或多种相同或不同的限制性切刻酶酶切位点，实现不同核酸模板的同时检测。
5.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述样品为含有乙型肝炎病毒DNA的样品或梅毒螺旋体病毒DNA的样品。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述温育的温度为35~45℃。
7.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述加热的温度为92~98℃。
8.根据权利要求1的方法，其特征在于，所述限制性切刻酶为Nb.BtsI或Nt.CviPII。
9.一种核酸扩增试剂盒，其特征在于，包括启动子引物、反向引物、分子信标探针和限制性切刻酶。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述启动子引物具有SEQ ID No:1所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No:2所示核苷酸序列，所述分子信标探针具有SEQ ID No:3所示核苷酸序列，所述限制性切刻酶为Nt.CviPII。
11.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述启动子引物具有SEQ ID No:4所示核苷酸序列，所述反向引物具有SEQ ID No:5所示核苷酸序列，所述分子信标探针具有SEQ ID No:6所示核苷酸序列，所述限制性切刻酶为Nb.BtsI。
12.根据权利要求10或11所述的试剂盒，其特征在于，所述启动子引物3`端带有氨基修饰。
13.根据权利要求10或11所述的试剂盒，其特征在于，所述反向引物的5`端第13位为锁核酸碱基。
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