RU2258740C2 - СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПОМОЩЬЮ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ-RAMIL (РЕВЕРТАЗНОЕ АМПЛИФИКАЦИОННОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ (REVERTASE AMPLIFICATION ILLATION) ИЛИ РНК-аза H ЗАВИСИМОЕ АМПЛИФИКАЦИОННОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ (RNAase Н-DEPENDENT AMPLIFICATION ILLATION) - Google Patents
СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПОМОЩЬЮ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ-RAMIL (РЕВЕРТАЗНОЕ АМПЛИФИКАЦИОННОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ (REVERTASE AMPLIFICATION ILLATION) ИЛИ РНК-аза H ЗАВИСИМОЕ АМПЛИФИКАЦИОННОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ (RNAase Н-DEPENDENT AMPLIFICATION ILLATION) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2258740C2 RU2258740C2 RU2003125814/13A RU2003125814A RU2258740C2 RU 2258740 C2 RU2258740 C2 RU 2258740C2 RU 2003125814/13 A RU2003125814/13 A RU 2003125814/13A RU 2003125814 A RU2003125814 A RU 2003125814A RU 2258740 C2 RU2258740 C2 RU 2258740C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- primers
- amplification
- reaction
- illation
- dna
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в молекулярно-генетической диагностике. Предложенный способ изотермической реакции амплификации предусматривает инкубирование в присутствии буферной системы одноцепочечной пробы исследуемой нуклеиновой кислоты с обратной транскриптазой M-MuLV или AMV с фрагментом Кленова (3'-5'ехо-) или без него, дезоксинуклеозидтрифосфатами и двумя парами специфических рибоолигонуклеотидных праймеров, где последовательность первой пары праймеров идентична 5'-концевой последовательности смысловой цепи исследуемой нуклеиновой кислоты, а последовательность второй пары праймеров комплементарна 3'-концевой последовательности смысловой цепи. Праймеры каждой пары различаются между собой наличием на 3'-конце одного из них дополнительных нуклеотидов. Применение изобретения позволяет удешевить детекцию микроорганизмов. 1 з.п. ф-лы, 1 ил.
Description
Изобретение относится к области биохимии, в частности к молекулярно-генетическим методам детекции микроорганизмов.
Одним из молекулярно-генетических методов детекции микроорганизмов является SDA (Strand Displacement Amplification) [1].
Амплификация с вытеснением цепи (SDA) использует свойство ДНК-полимеразы, лишенной экзонуклеазной активности синтезировать новую цепь ДНК, вытесняя рестрицированную цепь. Предварительно в ходе инициирования реакции с использованием специальных затравок создается сайт рестрикции для эндонуклеаз, например Hinc II. Поскольку в качестве предшественников в синтезе используются модифицированные дезоксинуклеозидтрифосфаты, такие как тиопроизводные аденозина (в случае использования эндонуклеазы рестрикции Hinc II) гидролиз рестриктазой Hinc II приводит к образованию насечки (гидролизуется одна цепь), в то время как вторая цепь остается нативной. SDA относится к классу изотермических реакций. Изотермические методы в отличие от ПЦР и ЛЦР позволяют отказаться от сложной и дорогостоящей аппаратуры и использовать в качестве инкубаторов лабораторные термостаты. Этот метод амплификации позволяет получить до 106-107 копий на одну используемую матрицу.
Цель изобретения - разработка нового молекулярно-генетического метода детекции микроорганизмов.
Предлагаемый метод детекции микроорганизмов отличается от метода SDA тем, что в качестве затравки используются 4 рибоолигонуклеотидных праймера, комплементарных к соответствующим последовательностям на противоположных цепях нуклеиновой кислоты: первые два ("А", "В") - комплементарные к участкам однонитевых фрагментов нуклеиновой кислоты, остальные два ("a", "b") - идентичные "А" или "В", но имеющие дополнительные нуклеотиды в направлении 3' (так называемые "3' концевые участки") также комплементарные к участкам однонитевых фрагментов нуклеиновой кислоты.
Рибоолигонуклеотиды "А" и "В" после отжига на ДНК матрицах (схема №1) и инициации синтеза новых цепей ДНК обратной транскриптазой M-MuLV или AMV с или без полимеразы фрагмент Кленова (3'-5' ехо-) удаляются от матриц в результате их расщепления РНК-азой Н, присутствующей в вышеперечисленных РНК зависимых ДНК полимеразах.
Рибоолигонуклеотиды "А" и "В" после отжига на РНК матрицах (схема 2) инициируют синтез новых цепей ДНК обратной транскриптазой M-MuLV или AMV. После элонгации ДНК матричные РНК разрушаются в результате их расщепления РНК-азой Н. Образующиеся в результате разрушения РНК-ДНК дуплексов однонитевые участки ДНК служат местом отжига для праймеров "В" и "А". Обратная транскриптаза M-MuLV или AMV синтезирует новую цепь ДНК на матрице ДНК с одновременным вытеснением недорушенной матричной РНК в РНК-РНК дуплексе (праймер - РНК матрица) и окончательной достройкой ДНК на комплементарном рибоолигонуклеотидам "А" и "В" участке. Затем только вышеперечисленные праймеры будут субстратами для РНК-азы Н.
Образующиеся в результате разрушения РНК-ДНК дуплексов однонитевые участки ДНК служат местом отжига для копий ранее расщепленных праймеров, которые являются затравками для последующего синтеза ДНК с одновременным вытеснением ранее синтезированных благодаря отсутствию экзонуклеазных активностей на ДНК у вышеперечисленных полимераз.
После синтеза новых цепей вышеперечисленными полимеразами освобождаются ранее синтезированные цепи ДНК, которые служат матрицами для праймеров "В" и "А".
Синтез новых цепей и последующее их вытеснение позволяет праймерам "а" и "b" гибридизироваться с ними так называемыми "З' концевыми участками" и инициировать синтез ДНК, а также достроить обратной транскриптазе M-MuLV или AMV участок гибридизированной матрицы, комплементарный праймеру "А" в случае отжига праймера "а", и комплементарного праймеру "В" после отжига праймера "b".
Рибоолигонуклеотиды "а" и "b" после отжига и инициации синтеза новых цепей ДНК обратной транскриптазой M-MuLV или AMV с или без полимеразы фрагмент Кленова (3'-5' ехо-) также удаляются от матриц в результате их расщепления РНК-азой Н, присутствующей в вышеперечисленных РНК зависимых ДНК полимеразах.
Образующиеся в результате разрушения РНК-ДНК дуплексов однонитевые участки ДНК служат местом отжига для праймеров "А" и "В", а также, но в гораздо меньшей степени, копий ранее расщепленных праймеров "а" и "b" (реакция проходит в изотермических условиях при температуре 37°С, более благоприятных для отжига праймеров "А" и "В"), которые являются затравками для последующего синтеза ДНК с одновременным вытеснением ранее синтезированных благодаря отсутствию экзонуклеазных активностей на ДНК у вышеперечисленных полимераз.
Такая стратегия позволяет проводить амплификацию ДНК в прогрессии, достаточной для последующей визуализации (из одной исследуемой мишени молекулы ДНК или РНК может амплифицироваться до 1011 копий двухцепочечной ДНК с тупыми концами за 4-6 часов), причем образующиеся ампликоны идентифицируются в электрофореграммах как следующие фрагменты:
")(" - амплифицированные двухцепочечные фрагменты ДНК с тупыми концами, ограниченные по 5' концам последовательностями дезоксирибонуклеотидов, идентичными последовательностям рибонуклеотидов в так называемых "3' концевых участках" рибоолигонуклеотидов "а" и "b"
"][" - не менее чем в 8 раз слабее сигнал (часто не видимый в электрофореграмме) по сравнению с ")(", что связано с механизмом амплификации и короче ")(" на число ограниченных по 5' концам последовательностям дезоксирибонуклеотидов, идентичных последовательностям рибонуклеотидов в так называемых "3' концевых участках" рибоолигонуклеотидов "а" и "b".
В процессе амплификации двухцепочечных фрагментов с тупыми концами ")(" и "][" нарабатываются так называемые "фоновые" фрагменты ДНК, обладающие разным размером ампликонов (недосинтезированные и не вытесненные цепи ДНК, недорушенные затравки на матрицах в момент непосредственного анализа).
Поэтому для детекции в RAMIL следует ориентироваться на самый яркий сигнал с заданной длиной ампликонов.
Условия проведения реакции.
Ревертазное амплификационное заключение (Revertase Amplificaton Illation) на примере детекции Chlamydia psittaci:
RAMIL выполняется в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкл охлажденной в ледяной бане, но предварительно денатурированной кипячением исследуемой пробы ДНК, подготовленной любым методом выделения нуклеиновых кислот для молекулярно-генетических исследований; 75 мкМ КС1, 50 мМ Tris-HCl (pH 8,3 при 25°С), 3 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, 200 мкМ dNTP, no 1 мкМ каждого из четырех рибоолигонуклеотидных праймеров ("А", "В", "а", "b"), 5 единиц обратной транскриптазы M-MuLV или AMV.
Реакцию проводят при температуре 37°С в условиях термостата в течение 4-6 часов с последующей визуализацией амплифицированной ДНК методом гель электрофореза. Для этого продукты амплификации смешивают с буфером для нанесения проб (0,25% бромфенолового синего, 40% (вес-объем) сахарозы в Н2О) в соотношении 6:1. Полученную смесь вносят в лунки 2% агарозного геля, приготовленного на ТАЕ буфере (0,04 М трис-ацетат, 0,002 М ЭДТА, pH 8,0) с содержанием бромистого этидия 0,5 мкг/мл и подвергают горизонтальному электрофорезу в ТАЕ буфере при напряжении 5 В/см в течение 1-1,5 часов с последующим просматриванием в УФ-трансиллюминаторе (290-330 нм).
РНК-аза В зависимое амплификационное заключение (RNase Н-dependent Amplificaton Illation) на примере детекции Chlamydia psittaci:
RAMIL выполняется в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкл охлажденной в ледяной бане, но предварительно денатурированной кипячением исследуемой пробы ДНК, подготовленной любым методом выделения нуклеиновых кислот для молекулярно-генетических исследований; 50 мкМ КС1, 20 мМ Tris-HCl (pH 7,8 при 25°С), 5 мМ MgCl2, 7,5 мМ DTT, 200 мкМ dNTP, по 1 мкМ каждого из четырех рибоолигонуклеотидных праймеров ("А", "В", "а", "b"), 2 единицы обратной транскриптазы M-MuLV или AMV, 5 единиц полимеразы фрагмент Кленова (3'-5' exo-).
Реакцию проводят при температуре 37°С в условиях термостата в течение 4-6 часов с последующей визуализацией амплифицированной ДНК методом гель электрофореза. Для этого продукты амплификации смешивают с буфером для нанесения проб (0,25% бромфенолового синего, 40% (вес-объем) сахарозы в Н2О) в соотношении 6:1. Полученную смесь вносят в лунки 2% агарозного геля, приготовленного на ТАЕ буфере (0,04 М трис-ацетат, 0,002 М ЭДТА, pH 8,0) с содержанием бромистого этидия 0,5 мкг/мл и подвергают горизонтальному электрофорезу в ТАЕ буфере при напряжении 5 В/см в течение 1-1,5 часов с последующим просматриванием в УФ-трансиллюминаторе (290-330 нм).
Рибоолигонуклеотидные праймеры выбраны на основе анализа консервативного участка генома Chlamydia psittaci (СР. SEQ):
5'[(gcaagacactc)ctcaaagccat]taattgcctacaggatatcttgtctggctttaacttgg acgtggtgccgccagaagagcaaattagaatagcgagcacaaaaagaaaagatactaagc ataatctttagaggtgagtatgaaaaaactcttgaaatcggcattattgtttgccgctac gggttccgctctctccttacaagccttgcctgtagggaacccagctgaaccaagtttattaat[cgatggcact(atgtgggaagg)]3'
CP. SEQ представляет собой последовательность длиной 264 пары нуклеотидов (п.н.), включившую в себя 139 п.н. из 5'-не транслируемого региона и 125 п.н. из транслируемого региона, кодирующего синтез первых 41-42 аминокислот большого белка наружной мембраны возбудителя.
Рибоолигонуклеотидный праймер "A" 5'(gcaagacacuc)3' идентичен основаниям - 139-129 5'не транслируемого региона;
рибоолигонуклеотидный праймер "a" 5'[(gcaagacacuc)cucaaagccau]3' идентичен основаниям - 139-118 5' не транслируемого региона;
рибоолигонуклеотидный праймер "В" 5' (ccuucccacau)3' комплементарен к основаниям 115-125 транслируемого региона;
рибоолигонуклеотидный праймер "b" 5' [(ccuucccacau)agugccaucg]3' комплементарен к основаниям 105-125 транслируемого региона.
Результатом предлагаемого метода RAMIL со специфичными для Chlamydia psittaci рибоолигонуклеотидными праймерами "А", "В", "а", "b" проб ДНК штаммов Chl. psittaci "КС-93", "ПП-87", "250" является амплификация специфичного фрагмента ДНК хламидий длиной 242 пар нуклеотидов (см. чертеж).
Источник информации
1. STRAND DISPLACEMENT AMPLIFICATION /Inventor - Walker/ United States Patent №5,455,166 / Date of Patent *Oct.3, 1995.
Claims (2)
1. Способ детекции микроорганизмов с помощью изотермической реакции амплификации, включающий подготовку одноцепочечной пробы исследуемой нуклеиновой кислоты, внесение указанной пробы в реакционную смесь, состоящую из буферной системы, олигонуклеотидных праймеров, полимеразы и dNTPS, инкубацию реакционной смеси при температуре 37°С в термостате в течение 4-6 ч и анализ продуктов реакции методом гель-электрофореза на предмет выявления специфичного для определенного микроорганизма амплифицированного фрагмента ДНК, отличающийся тем, что указанная изотермическая реакция амплификации является реакцией RAMIL, которая предусматривает, что в качестве полимеразы применяют обратную транскриптазу M-MuLV или AMV с фрагментом Кленова (3'-5'ехо-) или без него и используют четыре рибоолигонуклеотидных праймера "А", "а" и "В", "b", где праймер "а" отличается от "А", а праймер "b" - от "В" наличием дополнительных нуклеотидов на их 3'-конце, причем праймеры "А" и "а" идентичны 5'-концевой последовательности смысловой цепи исследуемой нуклеиновой кислоты, а "В" и "b" комплементарны ее 3'-концевой последовательности.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что детектируемым микроорганизмом является Chlamydia psittaci, а указанные праймеры имеют следующие нуклеотидные последовательности:
"А" - 5'gcaagacacuc3';
"а" - 5'gcaagacacuccucaaagccau3';
"В" - 5'ссuuсссасаu3';
"b" - 5'ccuucccacauagugccaucg3'.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2003125814/13A RU2258740C2 (ru) | 2003-08-21 | 2003-08-21 | СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПОМОЩЬЮ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ-RAMIL (РЕВЕРТАЗНОЕ АМПЛИФИКАЦИОННОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ (REVERTASE AMPLIFICATION ILLATION) ИЛИ РНК-аза H ЗАВИСИМОЕ АМПЛИФИКАЦИОННОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ (RNAase Н-DEPENDENT AMPLIFICATION ILLATION) |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2003125814/13A RU2258740C2 (ru) | 2003-08-21 | 2003-08-21 | СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПОМОЩЬЮ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ-RAMIL (РЕВЕРТАЗНОЕ АМПЛИФИКАЦИОННОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ (REVERTASE AMPLIFICATION ILLATION) ИЛИ РНК-аза H ЗАВИСИМОЕ АМПЛИФИКАЦИОННОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ (RNAase Н-DEPENDENT AMPLIFICATION ILLATION) |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2003125814A RU2003125814A (ru) | 2005-02-20 |
RU2258740C2 true RU2258740C2 (ru) | 2005-08-20 |
Family
ID=35218425
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2003125814/13A RU2258740C2 (ru) | 2003-08-21 | 2003-08-21 | СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПОМОЩЬЮ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ-RAMIL (РЕВЕРТАЗНОЕ АМПЛИФИКАЦИОННОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ (REVERTASE AMPLIFICATION ILLATION) ИЛИ РНК-аза H ЗАВИСИМОЕ АМПЛИФИКАЦИОННОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ (RNAase Н-DEPENDENT AMPLIFICATION ILLATION) |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2258740C2 (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8221975B2 (en) | 2007-08-16 | 2012-07-17 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Method for detection of microorganism |
-
2003
- 2003-08-21 RU RU2003125814/13A patent/RU2258740C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
GUATELLI JC, WHITFIELD KM, KWOH DY, BARRINGER KJ, RICHMAN DD, GINGERAS TR., Proc Nati Acad Sci, USA, 1990, Oct;87(19). SHIBATA H, TAHIRA Т, HAYASHI К., Genome Res. 1995 Nov;5(4). * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8221975B2 (en) | 2007-08-16 | 2012-07-17 | Morinaga Milk Industry Co., Ltd. | Method for detection of microorganism |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2003125814A (ru) | 2005-02-20 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU647411B2 (en) | Enhanced nucleic acid amplification process | |
JP3433929B2 (ja) | 核酸配列の増幅方法 | |
EP2606148B1 (en) | Helicase dependent isothermal amplification using nicking enzymes | |
Karami et al. | A review of the current isothermal amplification techniques: applications, advantages and disadvantages | |
US20090068643A1 (en) | Dual Function Primers for Amplifying DNA and Methods of Use | |
CA2877368C (en) | Kit for isothermal dna amplification starting from an rna template | |
JP2000505312A (ja) | 標的核酸配列増幅 | |
US10415082B2 (en) | Thermolabile exonucleases | |
AU2006227225A1 (en) | Methods, compositions, and kits for detection of micro ma | |
CA2439074A1 (en) | Methods and compositions for amplification of rna sequences | |
JP2004535162A (ja) | Rna配列の増幅のための方法および組成物 | |
EP3152324B1 (en) | Strand-invasion based dna amplification method | |
CN104093850A (zh) | 用于减少非特异性核酸扩增的方法和试剂盒 | |
WO2011012330A1 (en) | Method of normalized quantification of nucleic acids using anchor oligonucleotides and adapter oligonucleotides | |
KR20150098928A (ko) | 핵산과 신호 프로브의 비대칭 등온증폭을 이용한 핵산의 검출방법 | |
JP6029636B2 (ja) | Rnaの検出方法 | |
JP2015033390A (ja) | Rnaの正規化した定量化方法 | |
CN103667252A (zh) | 一种核酸扩增方法 | |
RU2258740C2 (ru) | СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПОМОЩЬЮ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ-RAMIL (РЕВЕРТАЗНОЕ АМПЛИФИКАЦИОННОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ (REVERTASE AMPLIFICATION ILLATION) ИЛИ РНК-аза H ЗАВИСИМОЕ АМПЛИФИКАЦИОННОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ (RNAase Н-DEPENDENT AMPLIFICATION ILLATION) | |
KR101785687B1 (ko) | 다중 증폭 이중 시그널 증폭에 의한 타겟 핵산 서열의 검출 방법 | |
JP2007319096A (ja) | エンドヌクレアーゼのニッキング活性を利用した核酸増幅法 | |
JPH06327500A (ja) | 核酸配列の増幅方法および検出方法 | |
RU2258741C1 (ru) | Способ детекции микроорганизмов с помощью изотермической реакции амплификации-ера (экзонуклеазно-полимеразная амплификация (exonuclease-polimerase amplification) | |
CN111334562A (zh) | 一种含有修饰引物的核酸扩增方法和试剂盒 | |
JPH0767646A (ja) | 試料中に含まれる特定rna配列を鋳型とする核酸配列の増幅方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20070822 |