JPH06327500A - 核酸配列の増幅方法および検出方法 - Google Patents
核酸配列の増幅方法および検出方法Info
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- JPH06327500A JPH06327500A JP11861693A JP11861693A JPH06327500A JP H06327500 A JPH06327500 A JP H06327500A JP 11861693 A JP11861693 A JP 11861693A JP 11861693 A JP11861693 A JP 11861693A JP H06327500 A JPH06327500 A JP H06327500A
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- Japan
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- nucleic acid
- rna
- sequence
- dna
- polymerase
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 目的とする特定核酸配列を簡便に増幅し、ま
た特定核酸を簡便に検出する方法を提供する。 【構成】 一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、ＲＮＡをプライマ
ーとしてＤＮＡポリメラーゼの存在下、ＤＮＡを合成
し、合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメ
ラーゼによりＲＮＡを合成することを特徴とする核酸配
列の増幅方法および前記増幅法により生成した核酸増幅
産物に、標識オリゴヌクレオチドを加え、ハイブリダイ
ゼーションを行い、標的核酸を検出する方法。
た特定核酸を簡便に検出する方法を提供する。 【構成】 一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、ＲＮＡをプライマ
ーとしてＤＮＡポリメラーゼの存在下、ＤＮＡを合成
し、合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメ
ラーゼによりＲＮＡを合成することを特徴とする核酸配
列の増幅方法および前記増幅法により生成した核酸増幅
産物に、標識オリゴヌクレオチドを加え、ハイブリダイ
ゼーションを行い、標的核酸を検出する方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、試料中に存在する特定
の核酸配列を増幅する方法および該核酸配列を検出する
方法に関する。特に、本発明は与えられた核酸から、任
意に特定の核酸配列を初期に存在する量に比較してより
大量に生成させる方法およびこの方法を用いて生成され
た核酸配列から目的の核酸配列を検出する方法に関す
る。
の核酸配列を増幅する方法および該核酸配列を検出する
方法に関する。特に、本発明は与えられた核酸から、任
意に特定の核酸配列を初期に存在する量に比較してより
大量に生成させる方法およびこの方法を用いて生成され
た核酸配列から目的の核酸配列を検出する方法に関す
る。
【０００２】
【従来技術】近年、核酸ハイブリダイゼーション法によ
る試料中の核酸配列の検出は、遺伝病、癌、感染症等の
診断のために有効な手段として汎用されてきている。核
酸配列検出法において、標的となる塩基配列は、対象と
なる核酸のほんのわずかな部分である場合が多く、酵素
やタンパクなどを標識とする非放射性標識プローブや末
端を放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチドプロー
ブを用いた検出法では、感度上の問題等によりその検出
が困難である。そのため、オリゴヌクレオチド・プロー
ブ検出システムの感度を向上させるためには多くの努力
がなされている（W087/03622など）。
る試料中の核酸配列の検出は、遺伝病、癌、感染症等の
診断のために有効な手段として汎用されてきている。核
酸配列検出法において、標的となる塩基配列は、対象と
なる核酸のほんのわずかな部分である場合が多く、酵素
やタンパクなどを標識とする非放射性標識プローブや末
端を放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチドプロー
ブを用いた検出法では、感度上の問題等によりその検出
が困難である。そのため、オリゴヌクレオチド・プロー
ブ検出システムの感度を向上させるためには多くの努力
がなされている（W087/03622など）。
【０００３】また、感度向上の手段として、目的とする
特定核酸配列を熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ等を使用し
て増幅させる方法（特開昭61-274697 号公報等；以下
「PCR」 と略すことがある）が広く知られている。しか
しこの方法では、プライマーのアニール、伸長反応、変
性を繰返すために加熱および冷却操作を繰り返して頻繁
に行なう必要があり、特別の機器を用いるか、又は繁雑
な労力を要する。また、該方法ではプライマーとして２
本のオリゴヌクレオチドを用いる必要があるが、これら
のプライマーが非特異的に試料中の核酸又は他の試料か
ら混入した核酸にアニールした場合でもＤＮＡポリメラ
ーゼによる増幅が起こる場合があり、プライマーの特異
性が厳しく要求されている。
特定核酸配列を熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ等を使用し
て増幅させる方法（特開昭61-274697 号公報等；以下
「PCR」 と略すことがある）が広く知られている。しか
しこの方法では、プライマーのアニール、伸長反応、変
性を繰返すために加熱および冷却操作を繰り返して頻繁
に行なう必要があり、特別の機器を用いるか、又は繁雑
な労力を要する。また、該方法ではプライマーとして２
本のオリゴヌクレオチドを用いる必要があるが、これら
のプライマーが非特異的に試料中の核酸又は他の試料か
ら混入した核酸にアニールした場合でもＤＮＡポリメラ
ーゼによる増幅が起こる場合があり、プライマーの特異
性が厳しく要求されている。
【０００４】さらにＤＮＡリガーゼを用いる増幅法も提
案されている(WO089/12696、特開平2-2934号公報など)
。しかし、この方法ではＤＮＡリガーゼが平滑末端を
連結する反応 (blunt end ligation)により非特異的増
幅が起こる。この回避法としてWO089/12696 では３組以
上のプローブを用いているが、プローブ数が多くコスト
高となってしまう。
案されている(WO089/12696、特開平2-2934号公報など)
。しかし、この方法ではＤＮＡリガーゼが平滑末端を
連結する反応 (blunt end ligation)により非特異的増
幅が起こる。この回避法としてWO089/12696 では３組以
上のプローブを用いているが、プローブ数が多くコスト
高となってしまう。
【０００５】さらにＤＮＡリガーゼとＤＮＡポリメラー
ゼを組合せた方法が提案され、その一つの方法(WO90/01
069)では、２組４本以上のオリゴヌクレオチドを用いる
必要があり、コストが高くなるという問題がある。他法
（特開平2-268683号公報）では、３本のオリゴヌクレオ
チドを必要とし、そのうちの２本は数十ヌクレオチドを
必要とするのでコストが高くなる。
ゼを組合せた方法が提案され、その一つの方法(WO90/01
069)では、２組４本以上のオリゴヌクレオチドを用いる
必要があり、コストが高くなるという問題がある。他法
（特開平2-268683号公報）では、３本のオリゴヌクレオ
チドを必要とし、そのうちの２本は数十ヌクレオチドを
必要とするのでコストが高くなる。
【０００６】また、ＲＮＡポリメラーゼを用いてＤＮＡ
よりＲＮＡが生成されることは周知であり、ＲＮＡポリ
メラーゼを用いて核酸配列の増幅を行う方法も提案され
ている(WO089/01050) 。しかしながら、この方法ではＲ
ＮＡポリメラーゼによる転写増幅のみでは充分な増幅は
困難である。従って、生成したＲＮＡに再度、逆転写酵
素を作用させＤＮＡを生成させる操作を実施している。
一般的に逆転写酵素によるＤＮＡへの転写は、ＤＮＡポ
リメラーゼによるＤＮＡ複製に比べて、読取り間違いを
生じ易いという欠点がある。
よりＲＮＡが生成されることは周知であり、ＲＮＡポリ
メラーゼを用いて核酸配列の増幅を行う方法も提案され
ている(WO089/01050) 。しかしながら、この方法ではＲ
ＮＡポリメラーゼによる転写増幅のみでは充分な増幅は
困難である。従って、生成したＲＮＡに再度、逆転写酵
素を作用させＤＮＡを生成させる操作を実施している。
一般的に逆転写酵素によるＤＮＡへの転写は、ＤＮＡポ
リメラーゼによるＤＮＡ複製に比べて、読取り間違いを
生じ易いという欠点がある。
【０００７】一方、目的とする核酸に核酸プローブをハ
イブリダイズさせた後、正しくハイブリダイズしたプロ
ーブのみを増幅する方法（BIO/TECHNOLOGY vol.6, 119
7, 1988）も知られている。しかしこの方法では、非特
異反応により結合したプローブも増幅され、ブランク値
の上昇をきたすという問題がある。
イブリダイズさせた後、正しくハイブリダイズしたプロ
ーブのみを増幅する方法（BIO/TECHNOLOGY vol.6, 119
7, 1988）も知られている。しかしこの方法では、非特
異反応により結合したプローブも増幅され、ブランク値
の上昇をきたすという問題がある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、目的
とする特定核酸配列を簡便に増幅し、また特定核酸を簡
便に検出する方法を提供することである。
とする特定核酸配列を簡便に増幅し、また特定核酸を簡
便に検出する方法を提供することである。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らはこれらの課
題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、ＲＮＡをプライ
マーとして用いることにより、上記課題が解決されるこ
とを見出して、本発明に到達した。
題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、ＲＮＡをプライ
マーとして用いることにより、上記課題が解決されるこ
とを見出して、本発明に到達した。
【００１０】即ち、本発明はＲＮＡポリメラーゼのプロ
モーター配列を有する一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、ＲＮＡ
をプライマーとしてＤＮＡポリメラーゼの存在下、ＤＮ
Ａを合成し、合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮ
ＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成することを特徴とす
る核酸配列の増幅方法である。
モーター配列を有する一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、ＲＮＡ
をプライマーとしてＤＮＡポリメラーゼの存在下、ＤＮ
Ａを合成し、合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮ
ＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成することを特徴とす
る核酸配列の増幅方法である。
【００１１】また本発明は下記操作を含むことを特徴と
する核酸配列の増幅方法である。 操作ａ） ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有
する一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、ＲＮＡをプライマーとし
てＤＮＡポリメラーゼの存在下、ＤＮＡを合成する。 操作ｂ） 合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型として、ＲＮ
ＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 操作ｃ） 前記一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、合成されたＲ
ＮＡをプライマーとしてＤＮＡポリメラーゼの存在下、
ＤＮＡを合成する。 操作ｄ） 操作ｂ）および操作ｃ）を少なくとも１回繰
り返す。
する核酸配列の増幅方法である。 操作ａ） ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有
する一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、ＲＮＡをプライマーとし
てＤＮＡポリメラーゼの存在下、ＤＮＡを合成する。 操作ｂ） 合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型として、ＲＮ
ＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 操作ｃ） 前記一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、合成されたＲ
ＮＡをプライマーとしてＤＮＡポリメラーゼの存在下、
ＤＮＡを合成する。 操作ｄ） 操作ｂ）および操作ｃ）を少なくとも１回繰
り返す。
【００１２】さらに本発明はＲＮＡポリメラーゼのプロ
モーター配列を有する一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡポ
リメラーゼ、４種のデオキシリボヌクレオシド三リン
酸、ＲＮＡポリメラーゼ、４種のリボヌクレオシド三リ
ン酸および反応緩衝液を含むことを特徴とする核酸配列
の増幅のための試薬である。
モーター配列を有する一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡポ
リメラーゼ、４種のデオキシリボヌクレオシド三リン
酸、ＲＮＡポリメラーゼ、４種のリボヌクレオシド三リ
ン酸および反応緩衝液を含むことを特徴とする核酸配列
の増幅のための試薬である。
【００１３】また本発明は上記増幅方法において生成し
た核酸増幅物に、検出されるべき配列及び／又はその変
異体とハイブリダイズすることができる標識されたオリ
ゴヌクレオチドプローブを加え、該ハイブリダイゼーシ
ョンが生じたか否かを決定することにより、標的核酸を
検出することを特徴とする標的核酸配列の検出方法であ
る。
た核酸増幅物に、検出されるべき配列及び／又はその変
異体とハイブリダイズすることができる標識されたオリ
ゴヌクレオチドプローブを加え、該ハイブリダイゼーシ
ョンが生じたか否かを決定することにより、標的核酸を
検出することを特徴とする標的核酸配列の検出方法であ
る。
【００１４】さらに本発明はＲＮＡポリメラーゼのプロ
モーター配列を有する一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡポ
リメラーゼ、４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸
（ｄＮＴＰｓ）、ＲＮＡポリメラーゼ、４種のリボヌク
レオシド三リン酸（ｒＮＴＰｓ）および反応緩衝液なら
びに検出されるべき配列及び／又はその変異体とハイブ
リダイズすることができる標識されたオリゴヌクレオチ
ドプローブを含むことを特徴とする核酸配列の検出のた
めの試薬である。
モーター配列を有する一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡポ
リメラーゼ、４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸
（ｄＮＴＰｓ）、ＲＮＡポリメラーゼ、４種のリボヌク
レオシド三リン酸（ｒＮＴＰｓ）および反応緩衝液なら
びに検出されるべき配列及び／又はその変異体とハイブ
リダイズすることができる標識されたオリゴヌクレオチ
ドプローブを含むことを特徴とする核酸配列の検出のた
めの試薬である。
【００１５】本発明においてプライマーとして使用する
ＲＮＡは、いかなるものでもよいが、試料中の標的核酸
を検出する場合には、試料中に含まれる少なくとも一つ
の特定核酸配列の一部の配列を含むＲＮＡであることが
好ましい。また特定核酸配列の一部の配列を含むＲＮＡ
としては、該特定核酸配列の一部の配列を含むＤＮＡを
鋳型とし、ＲＮＡポリメラーゼで合成されたＲＮＡであ
ってもよい。なお、該核酸は単鎖でも二重鎖でも良く、
比較的純粋な状態であっても、混合物の一成分であって
もよい。
ＲＮＡは、いかなるものでもよいが、試料中の標的核酸
を検出する場合には、試料中に含まれる少なくとも一つ
の特定核酸配列の一部の配列を含むＲＮＡであることが
好ましい。また特定核酸配列の一部の配列を含むＲＮＡ
としては、該特定核酸配列の一部の配列を含むＤＮＡを
鋳型とし、ＲＮＡポリメラーゼで合成されたＲＮＡであ
ってもよい。なお、該核酸は単鎖でも二重鎖でも良く、
比較的純粋な状態であっても、混合物の一成分であって
もよい。
【００１６】特定核酸配列の一部の配列を含むＤＮＡを
鋳型とし、ＲＮＡポリメラーゼで合成されたＲＮＡとし
ては、下記操作により得られたものが例示される。 例 Ａ：下記の操作を含むことを特徴とする核酸配列の
増幅方法。 操作ａ） ５’末端から３’末端に向って、少なくとも
特定核酸配列の一部に相補的な塩基配列およびＲＮＡポ
リメラーゼのプロモーター配列を順次有する第一オリゴ
ヌクレオチドおよび特定核酸配列の一部の３’下流の一
部に相補的な塩基配列を有する第二オリゴヌクレオチド
を試料中の核酸と混合して反応させ、試料中の特定核酸
配列に上記オリゴヌクレオチドをアニールする。 操作ｂ） 前記第一および第二オリゴヌクレオチドを連
結酵素により連結する。 操作ｃ） 操作ｂ）で得られた連結産物を鋳型として、
ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。
鋳型とし、ＲＮＡポリメラーゼで合成されたＲＮＡとし
ては、下記操作により得られたものが例示される。 例 Ａ：下記の操作を含むことを特徴とする核酸配列の
増幅方法。 操作ａ） ５’末端から３’末端に向って、少なくとも
特定核酸配列の一部に相補的な塩基配列およびＲＮＡポ
リメラーゼのプロモーター配列を順次有する第一オリゴ
ヌクレオチドおよび特定核酸配列の一部の３’下流の一
部に相補的な塩基配列を有する第二オリゴヌクレオチド
を試料中の核酸と混合して反応させ、試料中の特定核酸
配列に上記オリゴヌクレオチドをアニールする。 操作ｂ） 前記第一および第二オリゴヌクレオチドを連
結酵素により連結する。 操作ｃ） 操作ｂ）で得られた連結産物を鋳型として、
ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。
【００１７】例 Ｂ：下記の操作を含むことを特徴とす
る核酸配列の増幅方法。 操作ａ） ５’末端から３’末端に向って、少なくとも
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列および特定核酸
配列の一部に相補的な塩基配列を順次有する第一オリゴ
ヌクレオチドおよび特定核酸配列の一部の５’上流の一
部に相補的な塩基配列を有する第二オリゴヌクレオチド
を試料と混合して反応させ、試料中の特定核酸配列と上
記オリゴヌクレオチドをアニールする。 操作ｂ） 前記第一および第二オリゴヌクレオチドを連
結酵素により連結する。 操作ｃ） 操作ｂ）で得られた連結産物を一本鎖とし、
第二オリゴヌクレオチドと相補的な第三オリゴヌクレオ
チドをプライマーとしてＤＮＡポリメラーゼによりＤＮ
Ａを合成する。 操作ｄ） 操作ｃ）で合成されたＤＮＡを鋳型として、
ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成させる。
る核酸配列の増幅方法。 操作ａ） ５’末端から３’末端に向って、少なくとも
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列および特定核酸
配列の一部に相補的な塩基配列を順次有する第一オリゴ
ヌクレオチドおよび特定核酸配列の一部の５’上流の一
部に相補的な塩基配列を有する第二オリゴヌクレオチド
を試料と混合して反応させ、試料中の特定核酸配列と上
記オリゴヌクレオチドをアニールする。 操作ｂ） 前記第一および第二オリゴヌクレオチドを連
結酵素により連結する。 操作ｃ） 操作ｂ）で得られた連結産物を一本鎖とし、
第二オリゴヌクレオチドと相補的な第三オリゴヌクレオ
チドをプライマーとしてＤＮＡポリメラーゼによりＤＮ
Ａを合成する。 操作ｄ） 操作ｃ）で合成されたＤＮＡを鋳型として、
ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成させる。
【００１８】例Ｃ：下記の操作を含むことを特徴とする
核酸配列の増幅方法。 操作ａ） ５’末端から３’末端に向って、少なくとも
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列および特定核酸
配列の一部に相補的な塩基配列を順次有する第一オリゴ
ヌクレオチドを試料と混合して反応させ、試料中の特定
核酸配列と上記オリゴヌクレオチドをアニールする。 操作ｂ） 前記第一オリゴヌクレオチドをプライマーと
して伸長反応させる。 操作ｃ） 操作ｂ）で得られた伸長生成物を一本鎖に
し、該伸長生成物の一部に相補的な配列を有する第二オ
リゴヌクレオチドをアニールさせ、伸長反応させる。 操作ｄ） 操作ｃ）で得られた伸長生成物を鋳型とし、
ＲＮＡポリメラーゼでＲＮＡを合成させる。
核酸配列の増幅方法。 操作ａ） ５’末端から３’末端に向って、少なくとも
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列および特定核酸
配列の一部に相補的な塩基配列を順次有する第一オリゴ
ヌクレオチドを試料と混合して反応させ、試料中の特定
核酸配列と上記オリゴヌクレオチドをアニールする。 操作ｂ） 前記第一オリゴヌクレオチドをプライマーと
して伸長反応させる。 操作ｃ） 操作ｂ）で得られた伸長生成物を一本鎖に
し、該伸長生成物の一部に相補的な配列を有する第二オ
リゴヌクレオチドをアニールさせ、伸長反応させる。 操作ｄ） 操作ｃ）で得られた伸長生成物を鋳型とし、
ＲＮＡポリメラーゼでＲＮＡを合成させる。
【００１９】次に例Ａに記載されるＲＮＡをプライマー
とする核酸配列増幅方法について説明する。本発明の増
幅方法（例Ａ）は、下記操作を含むものである。 操作ａ） ５’末端から３’末端に向って、少なくと
も、特定核酸配列の一部に相補的な塩基配列およびＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター配列を順次有する第一オ
リゴヌクレオチドおよび特定核酸配列の一部の３’下流
の一部に相補的な塩基配列を有する第二オリゴヌクレオ
チドを試料中の核酸と混合して反応させ、試料中の特定
核酸配列と上記オリゴヌクレオチドをアニールする。 操作ｂ） 前記第一および第二オリゴヌクレオチドを連
結酵素により連結する。 操作ｃ） 操作ｂ）で得られた連結産物を鋳型としＲＮ
ＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 さらに本発明の増幅方法（例Ａ’）は、下記操作を含ん
でいてもよい。 操作ｄ） 操作ｃ）で得られたＲＮＡをプライマーと
し、操作ｃ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｃ）で得られたＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型と
し、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する。 操作ｅ） 操作ｄ）で合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 操作ｆ） 操作ｅ）で合成されたＲＮＡをプライマーと
し、操作ｃ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｃ）で得られたＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する。 これらの操作は逐次的に又は同時に行なうことができ
る。
とする核酸配列増幅方法について説明する。本発明の増
幅方法（例Ａ）は、下記操作を含むものである。 操作ａ） ５’末端から３’末端に向って、少なくと
も、特定核酸配列の一部に相補的な塩基配列およびＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター配列を順次有する第一オ
リゴヌクレオチドおよび特定核酸配列の一部の３’下流
の一部に相補的な塩基配列を有する第二オリゴヌクレオ
チドを試料中の核酸と混合して反応させ、試料中の特定
核酸配列と上記オリゴヌクレオチドをアニールする。 操作ｂ） 前記第一および第二オリゴヌクレオチドを連
結酵素により連結する。 操作ｃ） 操作ｂ）で得られた連結産物を鋳型としＲＮ
ＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 さらに本発明の増幅方法（例Ａ’）は、下記操作を含ん
でいてもよい。 操作ｄ） 操作ｃ）で得られたＲＮＡをプライマーと
し、操作ｃ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｃ）で得られたＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型と
し、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する。 操作ｅ） 操作ｄ）で合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 操作ｆ） 操作ｅ）で合成されたＲＮＡをプライマーと
し、操作ｃ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｃ）で得られたＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する。 これらの操作は逐次的に又は同時に行なうことができ
る。
【００２０】また本発明の増幅方法（例Ａ'') は，下記
操作を含む。 操作ａ） ５’末端から３’末端に向って、少なくと
も、特定核酸配列の一部に相補的な塩基配列およびＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター配列を順次有する第一オ
リゴヌクレオチドおよび特定核酸配列の一部の３’下流
の一部に相補的な塩基配列を有する第二オリゴヌクレオ
チドを試料中の核酸と混合して反応させ、試料中の特定
核酸配列と上記オリゴヌクレオチドをアニールする。 操作ｂ） 前記第一および第二オリゴヌクレオチドを連
結酵素により連結する。 操作ｃ） 操作ｂ）で得られた連結産物を鋳型としＲＮ
ＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 操作ｄ） 操作ｃ）で得られたＲＮＡをプライマーと
し、操作ｃ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｃ）で得られたＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型と
し、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する。 操作ｅ） 操作ｄ）で合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 操作ｆ） 操作ｅ）で合成されたＲＮＡをプライマーと
し、操作ｃ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｃ）で得られたＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する。 操作ｇ） 操作ｆ）で合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型と
してＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 操作ｈ） 操作ｇ）で合成されたＲＮＡをプライマーと
し、操作ｃ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｃ）で得られたＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する。 操作ｉ） 必要により操作ｇ）および操作ｈ）を少なく
とも一回繰り返す。
操作を含む。 操作ａ） ５’末端から３’末端に向って、少なくと
も、特定核酸配列の一部に相補的な塩基配列およびＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター配列を順次有する第一オ
リゴヌクレオチドおよび特定核酸配列の一部の３’下流
の一部に相補的な塩基配列を有する第二オリゴヌクレオ
チドを試料中の核酸と混合して反応させ、試料中の特定
核酸配列と上記オリゴヌクレオチドをアニールする。 操作ｂ） 前記第一および第二オリゴヌクレオチドを連
結酵素により連結する。 操作ｃ） 操作ｂ）で得られた連結産物を鋳型としＲＮ
ＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 操作ｄ） 操作ｃ）で得られたＲＮＡをプライマーと
し、操作ｃ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｃ）で得られたＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型と
し、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する。 操作ｅ） 操作ｄ）で合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 操作ｆ） 操作ｅ）で合成されたＲＮＡをプライマーと
し、操作ｃ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｃ）で得られたＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する。 操作ｇ） 操作ｆ）で合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型と
してＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 操作ｈ） 操作ｇ）で合成されたＲＮＡをプライマーと
し、操作ｃ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｃ）で得られたＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する。 操作ｉ） 必要により操作ｇ）および操作ｈ）を少なく
とも一回繰り返す。
【００２１】操作ｂ）で得られた連結ＤＮＡを分離する
操作を含んでいてもよい。好ましくは操作ｄ）の工程以
後に分離する操作を含む。これらの操作は逐次的に又は
同時に行なうことができる。
操作を含んでいてもよい。好ましくは操作ｄ）の工程以
後に分離する操作を含む。これらの操作は逐次的に又は
同時に行なうことができる。
【００２２】本発明の第一オリゴヌクレオチドは、５’
末端から３’末端に向って、少なくとも特定核酸配列の
一部に相補的な塩基配列とＲＮＡポリメラーゼのプロモ
ーター配列を順次有するように設計されており、第二オ
リゴヌクレオチドは特定核酸配列の一部の３’下流の一
部に相補的な塩基配列を有するように設計されていれ
ば、構造、長さに制限されない。一般的に、特定核酸の
一部に相補的な塩基配列の長さは、6 〜100 ヌクレオチ
ド、好ましくは10〜30ヌクレオチドの長さが使用され
る。
末端から３’末端に向って、少なくとも特定核酸配列の
一部に相補的な塩基配列とＲＮＡポリメラーゼのプロモ
ーター配列を順次有するように設計されており、第二オ
リゴヌクレオチドは特定核酸配列の一部の３’下流の一
部に相補的な塩基配列を有するように設計されていれ
ば、構造、長さに制限されない。一般的に、特定核酸の
一部に相補的な塩基配列の長さは、6 〜100 ヌクレオチ
ド、好ましくは10〜30ヌクレオチドの長さが使用され
る。
【００２３】本発明の第一オリゴヌクレオチドにおい
て、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と特定核酸
配列の一部に相補的な塩基配列との間に、所望によりス
ペーサーを設けることも可能である。このスペーサーは
一般的に１〜 100個、好ましくは１〜20個のヌクレオチ
ドであればよい。
て、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と特定核酸
配列の一部に相補的な塩基配列との間に、所望によりス
ペーサーを設けることも可能である。このスペーサーは
一般的に１〜 100個、好ましくは１〜20個のヌクレオチ
ドであればよい。
【００２４】本発明の一本鎖ＤＮＡは少なくとも操作
ｃ）で得られたＲＮＡと相同な配列、ＲＮＡポリメラー
ゼのプロモーター配列、操作ｃ）で得られたＲＮＡと相
補的な配列を有するように設計されていれば、構造、長
さに制限されない。一般的に、前記ＲＮＡの一部に相補
的およびまたは相同な塩基配列の長さは、6 〜100 ヌク
レオチド、好ましくは10〜30ヌクレオチドの長さが使用
される。
ｃ）で得られたＲＮＡと相同な配列、ＲＮＡポリメラー
ゼのプロモーター配列、操作ｃ）で得られたＲＮＡと相
補的な配列を有するように設計されていれば、構造、長
さに制限されない。一般的に、前記ＲＮＡの一部に相補
的およびまたは相同な塩基配列の長さは、6 〜100 ヌク
レオチド、好ましくは10〜30ヌクレオチドの長さが使用
される。
【００２５】これらオリゴヌクレオチドは、例えばABI
社（Applied Biosystems Inc. ）のＤＮＡシンセサイザ
ー391 型を用いてホスホアミダイト法により合成でき
る。他にもリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート
法、チオホスファイト法等いかなる方法で合成してもよ
い。また、生物学的起源、例えば制限エンドヌクレアー
ゼ消化物から単離してもよい。
社（Applied Biosystems Inc. ）のＤＮＡシンセサイザ
ー391 型を用いてホスホアミダイト法により合成でき
る。他にもリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート
法、チオホスファイト法等いかなる方法で合成してもよ
い。また、生物学的起源、例えば制限エンドヌクレアー
ゼ消化物から単離してもよい。
【００２６】操作ｃ）において生成した連結産物を分離
するには第一オリゴヌクレオチドおよびまたは第二オリ
ゴヌクレオチドにビオチンを結合させておき、連結反応
の後にアビジン結合磁性ビーズ等を用いることが可能で
ある。
するには第一オリゴヌクレオチドおよびまたは第二オリ
ゴヌクレオチドにビオチンを結合させておき、連結反応
の後にアビジン結合磁性ビーズ等を用いることが可能で
ある。
【００２７】本発明の特定核酸配列増幅のための試薬
は、５’末端から３’末端に向って、少なくとも、特定
核酸配列の一部に相補的な塩基配列およびＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を順次有する第一オリゴヌク
レオチド、特定核酸配列の一部の３’下流の一部に相補
的な塩基配列を有する第二オリゴヌクレオチド、連結酵
素、ＲＮＡポリメラーゼ、４種のリボヌクレオシド三リ
ン酸、ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシリボヌクレ
シチド三リン酸および反応緩衝液を含む。
は、５’末端から３’末端に向って、少なくとも、特定
核酸配列の一部に相補的な塩基配列およびＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を順次有する第一オリゴヌク
レオチド、特定核酸配列の一部の３’下流の一部に相補
的な塩基配列を有する第二オリゴヌクレオチド、連結酵
素、ＲＮＡポリメラーゼ、４種のリボヌクレオシド三リ
ン酸、ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシリボヌクレ
シチド三リン酸および反応緩衝液を含む。
【００２８】また本発明の核酸配列増幅のための試薬
は、上記成分の他に、前記第一および第二オリゴヌクレ
オチドを連結酵素により連結し、該連結産物を鋳型とし
ＲＮＡポリメラーゼにより合成したＲＮＡと相補的な配
列、同じＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメラーゼ
のプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを含む。
は、上記成分の他に、前記第一および第二オリゴヌクレ
オチドを連結酵素により連結し、該連結産物を鋳型とし
ＲＮＡポリメラーゼにより合成したＲＮＡと相補的な配
列、同じＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメラーゼ
のプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを含む。
【００２９】次に例示Ｂに記載されるＲＮＡをプライマ
ーとする核酸配列増幅方法を説明する。本発明の核酸配
列の増幅方法（例Ｂ）は、下記操作を含む。 操作ａ） ５’末端から３’末端に向って、少なくとも
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列および特定核酸
配列の一部に相補的な塩基配列を順次有する第一オリゴ
ヌクレオチドおよび特定核酸配列の一部の５’上流の一
部に相補的な塩基配列を有する第二オリゴヌクレオチド
を試料と混合して反応させ、試料中の特定核酸配列と上
記オリゴヌクレオチドをアニールする。 操作ｂ） 前記第一および第二オリゴヌクレオチドを連
結酵素により連結する。 操作ｃ） 操作ｂ）で得られた連結産物を一本鎖とし、
第二オリゴヌクレオチドと相補的な第三オリゴヌクレオ
チドをプライマーとしてＤＮＡポリメラーゼによりＤＮ
Ａを合成する。 操作ｄ） 操作ｃ）で合成されたＤＮＡを鋳型として、
ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 さらに本発明の増幅方法（例Ｂ’）は、下記操作を含ん
でいてもよい。 操作ｅ） 操作ｄ）で得られたＲＮＡをプライマーとし
て、操作ｄ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｄ）で得られたＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する。 操作ｆ） 操作ｅ）で合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＲＮポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 操作ｇ） 操作ｆ）で合成されたＲＮＡをプライマーと
し、操作ｄ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｄ）で得られたＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する。 これらの操作は逐次的に又は同時に行なうことができ
る。
ーとする核酸配列増幅方法を説明する。本発明の核酸配
列の増幅方法（例Ｂ）は、下記操作を含む。 操作ａ） ５’末端から３’末端に向って、少なくとも
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列および特定核酸
配列の一部に相補的な塩基配列を順次有する第一オリゴ
ヌクレオチドおよび特定核酸配列の一部の５’上流の一
部に相補的な塩基配列を有する第二オリゴヌクレオチド
を試料と混合して反応させ、試料中の特定核酸配列と上
記オリゴヌクレオチドをアニールする。 操作ｂ） 前記第一および第二オリゴヌクレオチドを連
結酵素により連結する。 操作ｃ） 操作ｂ）で得られた連結産物を一本鎖とし、
第二オリゴヌクレオチドと相補的な第三オリゴヌクレオ
チドをプライマーとしてＤＮＡポリメラーゼによりＤＮ
Ａを合成する。 操作ｄ） 操作ｃ）で合成されたＤＮＡを鋳型として、
ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 さらに本発明の増幅方法（例Ｂ’）は、下記操作を含ん
でいてもよい。 操作ｅ） 操作ｄ）で得られたＲＮＡをプライマーとし
て、操作ｄ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｄ）で得られたＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する。 操作ｆ） 操作ｅ）で合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＲＮポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 操作ｇ） 操作ｆ）で合成されたＲＮＡをプライマーと
し、操作ｄ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｄ）で得られたＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する。 これらの操作は逐次的に又は同時に行なうことができ
る。
【００３０】また本発明の増幅方法（例Ｂ'') は，下記
操作を含む。 操作ａ） ５’末端から３’末端に向って、少なくとも
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と、特定核酸配
列の一部に相補的な塩基配列を順次有する第一オリゴヌ
クレオチドおよび該特定核酸配列の一部の５’上流の一
部に相補的な塩基配列を有する第二オリゴヌクレオチド
を試料中の核酸と混合して反応させ、試料中の特定核酸
配列と上記オリゴヌクレオチドをアニールする。 操作ｂ） 前記第一および第二オリゴヌクレオチドを連
結酵素により連結する。 操作ｃ） 操作ｂ）で得られた連結産物を一本鎖にし、
第二オリゴヌクレオチドと相補的な第三オリゴヌクレオ
チドをプライマーとして、ＤＮＡポリメラーゼによりＤ
ＮＡを合成する。 操作ｄ） 操作ｃ）で合成されたＤＮＡを鋳型として、
ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 操作ｅ） 操作ｄ）で得られたＲＮＡをプライマーとし
て、操作ｄ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｄ）で得られたＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する。 操作ｆ） 操作ｅ）で合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 操作ｇ） 操作ｆ）で合成されたＲＮＡをプライマーと
し、操作ｄ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｄ）で得られたＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する。 操作ｈ） 操作ｇ）で合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 操作ｉ） 操作ｈ）で合成されたＲＮＡをプライマーと
し、操作ｄ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｄ）で得られたＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する。 操作ｊ） 必要により操作ｈ）および操作ｉ）を少なく
とも一回繰り返す。 これらの操作は逐次的に又は同時に行なうことができ
る。
操作を含む。 操作ａ） ５’末端から３’末端に向って、少なくとも
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と、特定核酸配
列の一部に相補的な塩基配列を順次有する第一オリゴヌ
クレオチドおよび該特定核酸配列の一部の５’上流の一
部に相補的な塩基配列を有する第二オリゴヌクレオチド
を試料中の核酸と混合して反応させ、試料中の特定核酸
配列と上記オリゴヌクレオチドをアニールする。 操作ｂ） 前記第一および第二オリゴヌクレオチドを連
結酵素により連結する。 操作ｃ） 操作ｂ）で得られた連結産物を一本鎖にし、
第二オリゴヌクレオチドと相補的な第三オリゴヌクレオ
チドをプライマーとして、ＤＮＡポリメラーゼによりＤ
ＮＡを合成する。 操作ｄ） 操作ｃ）で合成されたＤＮＡを鋳型として、
ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 操作ｅ） 操作ｄ）で得られたＲＮＡをプライマーとし
て、操作ｄ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｄ）で得られたＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する。 操作ｆ） 操作ｅ）で合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 操作ｇ） 操作ｆ）で合成されたＲＮＡをプライマーと
し、操作ｄ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｄ）で得られたＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する。 操作ｈ） 操作ｇ）で合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 操作ｉ） 操作ｈ）で合成されたＲＮＡをプライマーと
し、操作ｄ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｄ）で得られたＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型と
して、ＤＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成する。 操作ｊ） 必要により操作ｈ）および操作ｉ）を少なく
とも一回繰り返す。 これらの操作は逐次的に又は同時に行なうことができ
る。
【００３１】本発明の増幅方法では操作ｃ）で得られた
鋳型ＤＮＡを分離する操作を含んでいてもよい。
鋳型ＤＮＡを分離する操作を含んでいてもよい。
【００３２】本発明の第一オリゴヌクレオチドは、５’
末端から３’末端に向って、少なくとも、ＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列と特定核酸配列の一部に相補
的な塩基配列を順次有するように設計されており、第二
オリゴヌクレオチドは特定核酸配列の一部の３’下流の
一部に相補的な塩基配列を有するように設計されてい
る。第三オリゴヌクレオチドは、第二オリゴヌクレオチ
ドと相補的な配列に設計されていれば、構造、長さに制
限されない。一般的に、前記核酸の一部に相補的な塩基
配列の長さは、6 〜100 ヌクレオチド、好ましくは10〜
30ヌクレオチドの長さが使用される。
末端から３’末端に向って、少なくとも、ＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列と特定核酸配列の一部に相補
的な塩基配列を順次有するように設計されており、第二
オリゴヌクレオチドは特定核酸配列の一部の３’下流の
一部に相補的な塩基配列を有するように設計されてい
る。第三オリゴヌクレオチドは、第二オリゴヌクレオチ
ドと相補的な配列に設計されていれば、構造、長さに制
限されない。一般的に、前記核酸の一部に相補的な塩基
配列の長さは、6 〜100 ヌクレオチド、好ましくは10〜
30ヌクレオチドの長さが使用される。
【００３３】本発明の第一オリゴヌクレオチドにおい
て、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と特定核酸
配列の一部に相補的な塩基配列との間に、所望によりス
ペーサーを設けることも可能である。このスペーサーは
一般的に1 〜100 個、好ましくは1 〜20個のヌクレオチ
ドであればよい。
て、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と特定核酸
配列の一部に相補的な塩基配列との間に、所望によりス
ペーサーを設けることも可能である。このスペーサーは
一般的に1 〜100 個、好ましくは1 〜20個のヌクレオチ
ドであればよい。
【００３４】本発明の一本鎖ＤＮＡは、少なくとも操作
ｄ）で得られたＲＮＡと相同な配列、ＲＮＡポリメラー
ゼのプロモーター配列、操作ｄ）で得られたＲＮＡと相
補的な配列を有するように設計されていれば、構造、長
さに制限されない。一般的に、前記ＲＮＡの一部に相補
的およびまたは相同な塩基配列の長さは、6 〜100 ヌク
レオチド、好ましくは10〜30ヌクレオチドの長さが使用
される。
ｄ）で得られたＲＮＡと相同な配列、ＲＮＡポリメラー
ゼのプロモーター配列、操作ｄ）で得られたＲＮＡと相
補的な配列を有するように設計されていれば、構造、長
さに制限されない。一般的に、前記ＲＮＡの一部に相補
的およびまたは相同な塩基配列の長さは、6 〜100 ヌク
レオチド、好ましくは10〜30ヌクレオチドの長さが使用
される。
【００３５】操作ｄ）に於いて生成した連結産物を分離
するには第一およびまたは第二及びまたは第三オリゴヌ
クレオチドにビオチンを結合させておき、連結反応の後
にアビジン結合磁性ビーズ等を用いることが可能であ
る。
するには第一およびまたは第二及びまたは第三オリゴヌ
クレオチドにビオチンを結合させておき、連結反応の後
にアビジン結合磁性ビーズ等を用いることが可能であ
る。
【００３６】本発明の特定核酸配列を増幅するための試
薬は、５’末端から３’末端に向って、少なくともＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター配列および特定核酸配列
の一部に相補的な塩基配列を順次有する第一オリゴヌク
レオチド、特定核酸配列の一部の５’上流の一部に相補
的な塩基配列を有する第二オリゴヌクレオチド、連結酵
素、ＲＮＡポリメラーゼ、４種のリボヌクレオチド三リ
ン酸、ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシリボヌクレ
オチド三リン酸および反応緩衝液を含む。
薬は、５’末端から３’末端に向って、少なくともＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター配列および特定核酸配列
の一部に相補的な塩基配列を順次有する第一オリゴヌク
レオチド、特定核酸配列の一部の５’上流の一部に相補
的な塩基配列を有する第二オリゴヌクレオチド、連結酵
素、ＲＮＡポリメラーゼ、４種のリボヌクレオチド三リ
ン酸、ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシリボヌクレ
オチド三リン酸および反応緩衝液を含む。
【００３７】また本発明の核酸配列増幅のための試薬
は、上記成分の他に、前記第一および第二オリゴヌクレ
オチドを連結酵素により連結し、該連結産物を鋳型とし
ＲＮＡポリメラーゼにより合成したＲＮＡと相補的な配
列、同じＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメラーゼ
のプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを含む。
は、上記成分の他に、前記第一および第二オリゴヌクレ
オチドを連結酵素により連結し、該連結産物を鋳型とし
ＲＮＡポリメラーゼにより合成したＲＮＡと相補的な配
列、同じＲＮＡと相同な配列およびＲＮＡポリメラーゼ
のプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを含む。
【００３８】次に例示Ｃに記載されるＲＮＡをプライマ
ーとする核酸配列増幅方法を説明する。本発明の増幅方
法は、下記操作を含むものである。 操作ａ） ５’末端から３’末端に向って、少なくとも
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列および特定核酸
配列の一部に相補的な塩基配列を順次有する第一オリゴ
ヌクレオチドを試料と混合して反応させ、試料中の特定
核酸配列と上記オリゴヌクレオチドをアニールする。 操作ｂ） 前記第一オリゴヌクレオチドをプライマーと
して伸張反応させる。 操作ｃ） 操作ｂ）で得られた伸張生成物を一本鎖に
し、該伸張生成物の一部に相補的な配列を有する第二オ
リゴヌクレオチドをアニールさせ、伸張反応させる。 操作ｄ） 操作ｃ）で得られた伸張生成物を鋳型とし、
ＲＮＡポリメラーゼでＲＮＡを合成させる。 操作ｅ） 操作ｄ）で得られたＲＮＡをプライマーとし
て、操作ｄ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｄ）で得られたＲＮＡと相同な配列、ＲＮＡポリメラー
ゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型として
ＤＮＡを合成する。。 操作ｆ） 操作ｅ）で合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型と
してＲＮＡを合成する。 操作ｇ） 操作ｆ）で合成されたＲＮＡをプライマーと
し操作ｄ）に記載の一本鎖ＤＮＡ鋳型としてＤＮＡを合
成する。 これらの操作は逐次的に又は同時に行なうことができ
る。
ーとする核酸配列増幅方法を説明する。本発明の増幅方
法は、下記操作を含むものである。 操作ａ） ５’末端から３’末端に向って、少なくとも
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列および特定核酸
配列の一部に相補的な塩基配列を順次有する第一オリゴ
ヌクレオチドを試料と混合して反応させ、試料中の特定
核酸配列と上記オリゴヌクレオチドをアニールする。 操作ｂ） 前記第一オリゴヌクレオチドをプライマーと
して伸張反応させる。 操作ｃ） 操作ｂ）で得られた伸張生成物を一本鎖に
し、該伸張生成物の一部に相補的な配列を有する第二オ
リゴヌクレオチドをアニールさせ、伸張反応させる。 操作ｄ） 操作ｃ）で得られた伸張生成物を鋳型とし、
ＲＮＡポリメラーゼでＲＮＡを合成させる。 操作ｅ） 操作ｄ）で得られたＲＮＡをプライマーとし
て、操作ｄ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｄ）で得られたＲＮＡと相同な配列、ＲＮＡポリメラー
ゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型として
ＤＮＡを合成する。。 操作ｆ） 操作ｅ）で合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型と
してＲＮＡを合成する。 操作ｇ） 操作ｆ）で合成されたＲＮＡをプライマーと
し操作ｄ）に記載の一本鎖ＤＮＡ鋳型としてＤＮＡを合
成する。 これらの操作は逐次的に又は同時に行なうことができ
る。
【００３９】例示Ｃに記載されるＲＮＡをプライマーと
して、下記増幅を行うこともできる。必要により以下の
操作を含む 操作ａ） ５’末端から３’末端に向って、少なくとも
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列および特定核酸
配列の一部に相補的な塩基配列を順次有する第一オリゴ
ヌクレオチドを試料と混合して反応させ、試料中の特定
核酸配列と上記オリゴヌクレオチドをアニールする。 操作ｂ） 前記第一オリゴヌクレオチドをプライマーと
して伸張反応させる。 操作ｃ） 操作ｂ）で得られた伸張生成物を一本鎖に
し、該伸張生成物の一部に相補的な配列を有する第二オ
リゴヌクレオチドをアニールさせ、伸張反応させる。 操作ｄ） 操作ｃ）で得られた伸張生成物を鋳型とし、
ＲＮＡポリメラーゼでＲＮＡを合成させる。 操作ｅ） 操作ｄ）で得られたＲＮＡをプライマーとし
て、操作ｄ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｄ）で得られたＲＮＡと相同な配列、ＲＮＡポリメラー
ゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型として
ＤＮＡを合成する。。 操作ｆ） 操作ｅ）で合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型と
してＲＮＡを合成する。 操作ｇ） 操作ｆ）で合成されたＲＮＡをプライマーと
し操作ｄ）に記載の一本鎖ＤＮＡ鋳型としてＤＮＡを合
成する。 操作ｈ） 操作ｇ）で合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型と
してＲＮＡを合成する。 操作ｉ） 操作ｈ）で合成されたＲＮＡをプライマーと
し操作ｄ）に記載の一本鎖ＤＮＡ鋳型としてＤＮＡを合
成する。 操作ｊ） 必要により操作ｈ）および操作ｉ）を所望の
核酸量が得られるまで繰り返す。 これらの操作は逐次的に又は同時に行なうことができ
る。本発明では操作ｃ）で得られた鋳型ＤＮＡを分離す
る操作を含んでいてもよい。
して、下記増幅を行うこともできる。必要により以下の
操作を含む 操作ａ） ５’末端から３’末端に向って、少なくとも
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列および特定核酸
配列の一部に相補的な塩基配列を順次有する第一オリゴ
ヌクレオチドを試料と混合して反応させ、試料中の特定
核酸配列と上記オリゴヌクレオチドをアニールする。 操作ｂ） 前記第一オリゴヌクレオチドをプライマーと
して伸張反応させる。 操作ｃ） 操作ｂ）で得られた伸張生成物を一本鎖に
し、該伸張生成物の一部に相補的な配列を有する第二オ
リゴヌクレオチドをアニールさせ、伸張反応させる。 操作ｄ） 操作ｃ）で得られた伸張生成物を鋳型とし、
ＲＮＡポリメラーゼでＲＮＡを合成させる。 操作ｅ） 操作ｄ）で得られたＲＮＡをプライマーとし
て、操作ｄ）で得られたＲＮＡと相補的な配列、操作
ｄ）で得られたＲＮＡと相同な配列、ＲＮＡポリメラー
ゼのプロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡを鋳型として
ＤＮＡを合成する。。 操作ｆ） 操作ｅ）で合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型と
してＲＮＡを合成する。 操作ｇ） 操作ｆ）で合成されたＲＮＡをプライマーと
し操作ｄ）に記載の一本鎖ＤＮＡ鋳型としてＤＮＡを合
成する。 操作ｈ） 操作ｇ）で合成された２本鎖ＤＮＡを鋳型と
してＲＮＡを合成する。 操作ｉ） 操作ｈ）で合成されたＲＮＡをプライマーと
し操作ｄ）に記載の一本鎖ＤＮＡ鋳型としてＤＮＡを合
成する。 操作ｊ） 必要により操作ｈ）および操作ｉ）を所望の
核酸量が得られるまで繰り返す。 これらの操作は逐次的に又は同時に行なうことができ
る。本発明では操作ｃ）で得られた鋳型ＤＮＡを分離す
る操作を含んでいてもよい。
【００４０】本発明では、特定核酸の一部と同じ塩基配
列を持った伸長生成物を多量に得ることができる。更に
この生成物を測定すれば標的核酸の存在の有無を測定す
ることができる。
列を持った伸長生成物を多量に得ることができる。更に
この生成物を測定すれば標的核酸の存在の有無を測定す
ることができる。
【００４１】本発明の第一オリゴヌクレオチドは、５’
末端から３’末端に向って、少なくとも、ＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列と特定核酸配列の一部に相補
的な塩基配列を順次有するように設計されており、第二
オリゴヌクレオチドは特定核酸配列の一部の３’下流の
一部に相補的な塩基配列を有するように設計されてい
る。第二オリゴヌクレオチドは第一オリゴヌクレオチド
をプライマーとして伸張反応させた伸長生成物に相補的
なように設計されている。第三オリゴヌクレオチドは、
第二オリゴヌクレオチドと相補的な配列に設計されてい
れば、構造、長さに制限されない。一般的に、前記核酸
の一部に相補的な塩基配列の長さは、6〜100 ヌクレオ
チド、好ましくは10〜30ヌクレオチドの長さが使用され
る。
末端から３’末端に向って、少なくとも、ＲＮＡポリメ
ラーゼのプロモーター配列と特定核酸配列の一部に相補
的な塩基配列を順次有するように設計されており、第二
オリゴヌクレオチドは特定核酸配列の一部の３’下流の
一部に相補的な塩基配列を有するように設計されてい
る。第二オリゴヌクレオチドは第一オリゴヌクレオチド
をプライマーとして伸張反応させた伸長生成物に相補的
なように設計されている。第三オリゴヌクレオチドは、
第二オリゴヌクレオチドと相補的な配列に設計されてい
れば、構造、長さに制限されない。一般的に、前記核酸
の一部に相補的な塩基配列の長さは、6〜100 ヌクレオ
チド、好ましくは10〜30ヌクレオチドの長さが使用され
る。
【００４２】本発明の第一オリゴヌクレオチドにおい
て、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と特定核酸
配列の一部に相補的な塩基配列との間に、所望によりス
ペーサーを設けることも可能である。このスペーサーは
一般的に1 〜100 個、好ましくは1 〜20個のヌクレオチ
ドであればよい。
て、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列と特定核酸
配列の一部に相補的な塩基配列との間に、所望によりス
ペーサーを設けることも可能である。このスペーサーは
一般的に1 〜100 個、好ましくは1 〜20個のヌクレオチ
ドであればよい。
【００４３】本発明の一本鎖ＤＮＡは、少なくとも操作
ｄ）で得られたＲＮＡをプライマーとして、操作ｄ）で
得られたＲＮＡと相補的な配列、操作ｄ）で得られたＲ
ＮＡと相同な配列、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター
配列を含むように設計されていれば、構造、長さに制限
されない。一般的に、前記ＲＮＡの一部に相補的および
または相同な塩基配列の長さは、6 〜100 ヌクレオチ
ド、好ましくは10〜30ヌクレオチドの長さが使用され
る。
ｄ）で得られたＲＮＡをプライマーとして、操作ｄ）で
得られたＲＮＡと相補的な配列、操作ｄ）で得られたＲ
ＮＡと相同な配列、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター
配列を含むように設計されていれば、構造、長さに制限
されない。一般的に、前記ＲＮＡの一部に相補的および
または相同な塩基配列の長さは、6 〜100 ヌクレオチ
ド、好ましくは10〜30ヌクレオチドの長さが使用され
る。
【００４４】本発明の特定核酸配列を増幅するための試
薬は、５’末端から３’末端に向って、少なくともＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター配列および特定核酸配列
の一部に相補的な塩基配列を順次有する第一オリゴヌク
レオチド、第一オリゴヌクレオチドをプライマーとして
伸張反応させた伸長生成物に相補的な第二オリゴヌクレ
オチド、ＲＮＡポリメラーゼ、４種のリボヌクレオシド
三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシリボヌ
クレオシド三リン酸および反応緩衝液を含む。
薬は、５’末端から３’末端に向って、少なくともＲＮ
Ａポリメラーゼのプロモーター配列および特定核酸配列
の一部に相補的な塩基配列を順次有する第一オリゴヌク
レオチド、第一オリゴヌクレオチドをプライマーとして
伸張反応させた伸長生成物に相補的な第二オリゴヌクレ
オチド、ＲＮＡポリメラーゼ、４種のリボヌクレオシド
三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ、４種のデオキシリボヌ
クレオシド三リン酸および反応緩衝液を含む。
【００４５】また本発明は上記成分の他に前記第一オリ
ゴヌクレオチドをプライマーとして伸張反応させた伸張
生成物を一本鎖にし、該伸張生成物の一部に相補的な配
列を有する第二オリゴヌクレオチドをアニールさせ、伸
張反応させ、さらに得られた伸張生成物を鋳型とし、Ｒ
ＮＡポリメラーゼでＲＮＡを合成させたＲＮＡをプライ
マーとし、得られたＲＮＡと相補的な配列および該ＲＮ
Ａと相同な配列、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配
列を含む一本鎖ＤＮＡを含む。
ゴヌクレオチドをプライマーとして伸張反応させた伸張
生成物を一本鎖にし、該伸張生成物の一部に相補的な配
列を有する第二オリゴヌクレオチドをアニールさせ、伸
張反応させ、さらに得られた伸張生成物を鋳型とし、Ｒ
ＮＡポリメラーゼでＲＮＡを合成させたＲＮＡをプライ
マーとし、得られたＲＮＡと相補的な配列および該ＲＮ
Ａと相同な配列、ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配
列を含む一本鎖ＤＮＡを含む。
【００４６】本発明における試料中の核酸は単鎖でも二
重鎖でも良く、比較的純粋な状態であっても、また混合
物の一成分であってもよい。本発明では一本鎖ＤＮＡを
鋳型として、４種のデオキシリボヌクレオチドおよびＤ
ＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成し、合成された２
本鎖ＤＮＡを鋳型として、４種のリボヌクレオチドおよ
びＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡを合成する。こ
のような例えばジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー（Journal of Molecular Biology;56,341-361,
1971. ）に記載されている。
重鎖でも良く、比較的純粋な状態であっても、また混合
物の一成分であってもよい。本発明では一本鎖ＤＮＡを
鋳型として、４種のデオキシリボヌクレオチドおよびＤ
ＮＡポリメラーゼによりＤＮＡを合成し、合成された２
本鎖ＤＮＡを鋳型として、４種のリボヌクレオチドおよ
びＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡを合成する。こ
のような例えばジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー（Journal of Molecular Biology;56,341-361,
1971. ）に記載されている。
【００４７】本発明における４種のリボヌクレオシド三
リン酸とは、rNTP (rATP, rCTP, rGTP, rTTP) である。
本発明における４種のデオキシリボヌクレオシド三リン
酸とは、dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) である。
リン酸とは、rNTP (rATP, rCTP, rGTP, rTTP) である。
本発明における４種のデオキシリボヌクレオシド三リン
酸とは、dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) である。
【００４８】また本発明において使用するＲＮＡポリメ
ラーゼとしては、例えばT3RNA ポリメラーゼ、T7RNA ポ
リメラーゼまたはSP6RNAポリメラーゼなどが挙げられ
る。さらに本発明において使用するＤＮＡポリメラーゼ
としては、例えば大腸菌（E.coli）ＤＮＡポリメラーゼ
III、クレノウフラグメント(Klenow fragment) 、T4 DN
Aポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、Thermus aquatic
us DNA ポリメラーゼ、Thermus thermophilus DNAポリ
メラーゼ等が挙げられる。
ラーゼとしては、例えばT3RNA ポリメラーゼ、T7RNA ポ
リメラーゼまたはSP6RNAポリメラーゼなどが挙げられ
る。さらに本発明において使用するＤＮＡポリメラーゼ
としては、例えば大腸菌（E.coli）ＤＮＡポリメラーゼ
III、クレノウフラグメント(Klenow fragment) 、T4 DN
Aポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、Thermus aquatic
us DNA ポリメラーゼ、Thermus thermophilus DNAポリ
メラーゼ等が挙げられる。
【００４９】本発明の核酸配列の検出方法では、試料中
の核酸に対して上記操作（ａ）〜（ｆ）または操作
（ａ）〜（ｉ）を実施した後（例Ａのプライマー）、ま
たは操作（ａ）〜（ｇ）または操作（ａ）〜（ｊ）を実
施した後（例Ｂのプライマー）、または（ａ）〜（ｇ）
または（ａ）〜（ｊ）を実施した後（例Ｃのプライマ
ー）、生成物に検出されるべき配列配列及び／又はその
変異体とハイブリダイズすることができる標識されたオ
リゴヌクレオチドプローブを加え、該ハイブリダイゼー
ションが生じたか否かを決定することにより、標的核酸
を検出する。
の核酸に対して上記操作（ａ）〜（ｆ）または操作
（ａ）〜（ｉ）を実施した後（例Ａのプライマー）、ま
たは操作（ａ）〜（ｇ）または操作（ａ）〜（ｊ）を実
施した後（例Ｂのプライマー）、または（ａ）〜（ｇ）
または（ａ）〜（ｊ）を実施した後（例Ｃのプライマ
ー）、生成物に検出されるべき配列配列及び／又はその
変異体とハイブリダイズすることができる標識されたオ
リゴヌクレオチドプローブを加え、該ハイブリダイゼー
ションが生じたか否かを決定することにより、標的核酸
を検出する。
【００５０】上記増幅方法による生成物の検出は、一般
的な測定法で検出可能である。例えば電気泳動により一
定の長さの生成物を測定する、ＤＮＡポリメラーゼによ
る伸長生成の際に、添加するモノヌクレオチドとして32
Ｐなどの標識物を用いて、その放射活性を測定する、標
識プローブを用いて検出するなど公知の方法を用いるこ
とができる。標識プローブを用いる方法では、標識物と
して放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ビオ
チン、ハプテン等の公知の標識物質を標識した核酸プロ
ーブで測定することができる。核酸プローブとしては生
成物の一部と相補的塩基配列を持つように設計し、該核
酸プローブと、伸長生成物とをハイブリダイズさせ、該
プローブを検出することで実施できる。この場合、標識
プローブは新たに生成した配列に対してハイブリダイズ
するように設計されているので、既に存在している核酸
の影響を受けることなく、伸長反応により新たに生成し
た伸長生成物を、効率よく検出することができる。
的な測定法で検出可能である。例えば電気泳動により一
定の長さの生成物を測定する、ＤＮＡポリメラーゼによ
る伸長生成の際に、添加するモノヌクレオチドとして32
Ｐなどの標識物を用いて、その放射活性を測定する、標
識プローブを用いて検出するなど公知の方法を用いるこ
とができる。標識プローブを用いる方法では、標識物と
して放射性同位元素、酵素、蛍光物質、発光物質、ビオ
チン、ハプテン等の公知の標識物質を標識した核酸プロ
ーブで測定することができる。核酸プローブとしては生
成物の一部と相補的塩基配列を持つように設計し、該核
酸プローブと、伸長生成物とをハイブリダイズさせ、該
プローブを検出することで実施できる。この場合、標識
プローブは新たに生成した配列に対してハイブリダイズ
するように設計されているので、既に存在している核酸
の影響を受けることなく、伸長反応により新たに生成し
た伸長生成物を、効率よく検出することができる。
【００５１】また、本発明の特定核酸の検出用試薬は、
一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、４種のリ
ボヌクレオチド三リン酸および反応緩衝液ならびに検出
されるべき配列及び／又はその変異体とハイブリダイズ
することができる標識されたオリゴヌクレオチドプロー
ブを含むものである。本発明の増幅法及び検出法に用い
る要素、試薬をそれぞれ用意したキットにすることが可
能である。
一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、４種のリ
ボヌクレオチド三リン酸および反応緩衝液ならびに検出
されるべき配列及び／又はその変異体とハイブリダイズ
することができる標識されたオリゴヌクレオチドプロー
ブを含むものである。本発明の増幅法及び検出法に用い
る要素、試薬をそれぞれ用意したキットにすることが可
能である。
【００５２】
【発明の効果】本発明の増幅法によれば、ＲＮＡポリメ
ラーゼで合成されたＲＮＡがプライマーとして作用する
よう設計されるので、高い増幅効果が得られる。そのた
め所望の増幅効果を得るための反応時間が短くてすむ。
また試料中に標的核酸が存在する場合にのみ増幅効果が
現れるため、検出が容易である。
ラーゼで合成されたＲＮＡがプライマーとして作用する
よう設計されるので、高い増幅効果が得られる。そのた
め所望の増幅効果を得るための反応時間が短くてすむ。
また試料中に標的核酸が存在する場合にのみ増幅効果が
現れるため、検出が容易である。
【００５３】
【実施例】次に本発明を実施例及び比較例を用いて説明
する。
する。
【００５４】参考例１ 各種オリゴヌクレオチドの合成 ABI 社DNA シンセサイザー391 型を用いて、ホスホアミ
ダイト法にて下記配列のオリゴヌクレオチドを各種合成
した。 第１オリゴヌクレオチド(56bp): （配列表１） 腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haemolysin) 遺
伝子の 102番目から 123番目のヌクレオチド配列と相同
な配列および同遺伝子の 102番目から 123番目のヌクレ
オチド配列と相補的な配列および３つの制限酵素結合配
列を有する。配列順序は配列表１に記載されるとおりで
ある。 第２オリゴヌクレオチド(48bp): （配列表２） 腸炎ビブリオTDH 遺伝子の 102番目から 123番目のヌク
レオチド配列と相同な配列および制限酵素結合部位およ
び同遺伝子の 102番目から 123番目のヌクレオチド配列
と相補的な配列を有する。該オリゴヌクレオチドは第１
オリゴヌクレオチドと相補的配列を有し、第１オリゴヌ
クレオチドとアニールさせた時、制限酵素結合部位を形
成する。 第３オリゴヌクレオチド(47bp): （配列表３） 腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haemolysin) 遺
伝子の82番目から101番目のヌクレオチド配列と相補的
な配列およびRNA ポリメラーゼのプロモーター配列を有
する。 第４オリゴヌクレオチド(22bp): （配列表４） 腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haemolysin) 遺
伝子の102 番目から123 番目のヌクレオチド配列と相補
的な配列を有する。 第５オリゴヌクレオチド(47bp): （配列表５） RNA ポリメラーゼのプロモーター配列および腸炎ビブリ
オTDH(Thermostable Direct Haemolysin) 遺伝子の82番
目から101 番目のヌクレオチド配列と相同な配列を有す
る。 第６オリゴヌクレオチド(22bp): （配列表６） 腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haemolysin) 遺
伝子の102 番目から123 番目のヌクレオチド配列と相同
な配列を有する。
ダイト法にて下記配列のオリゴヌクレオチドを各種合成
した。 第１オリゴヌクレオチド(56bp): （配列表１） 腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haemolysin) 遺
伝子の 102番目から 123番目のヌクレオチド配列と相同
な配列および同遺伝子の 102番目から 123番目のヌクレ
オチド配列と相補的な配列および３つの制限酵素結合配
列を有する。配列順序は配列表１に記載されるとおりで
ある。 第２オリゴヌクレオチド(48bp): （配列表２） 腸炎ビブリオTDH 遺伝子の 102番目から 123番目のヌク
レオチド配列と相同な配列および制限酵素結合部位およ
び同遺伝子の 102番目から 123番目のヌクレオチド配列
と相補的な配列を有する。該オリゴヌクレオチドは第１
オリゴヌクレオチドと相補的配列を有し、第１オリゴヌ
クレオチドとアニールさせた時、制限酵素結合部位を形
成する。 第３オリゴヌクレオチド(47bp): （配列表３） 腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haemolysin) 遺
伝子の82番目から101番目のヌクレオチド配列と相補的
な配列およびRNA ポリメラーゼのプロモーター配列を有
する。 第４オリゴヌクレオチド(22bp): （配列表４） 腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haemolysin) 遺
伝子の102 番目から123 番目のヌクレオチド配列と相補
的な配列を有する。 第５オリゴヌクレオチド(47bp): （配列表５） RNA ポリメラーゼのプロモーター配列および腸炎ビブリ
オTDH(Thermostable Direct Haemolysin) 遺伝子の82番
目から101 番目のヌクレオチド配列と相同な配列を有す
る。 第６オリゴヌクレオチド(22bp): （配列表６） 腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haemolysin) 遺
伝子の102 番目から123 番目のヌクレオチド配列と相同
な配列を有する。
【００５５】手法はABI 社マニュアルに従い、0.2 μM
スケールで実施した。必要によりBiotin-ON Phosphoami
dite(TOYOBO)を用いて、5'末端にビオチンを結合させて
合成した。各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニ
ア水で55℃で一夜実施した。精製はファルマシア社製FP
LCで、MonoQ カラムまたは日立製作所製HPLCで、逆相カ
ラムにて実施した。なお合成したオリゴヌクレオチドは
必要により以下の方法で、5'末端にリン酸基を結合させ
た。 オリゴヌクレオチド 50〜200 pmoles 10× protruding end kinase buffer 10 μl 1 mM ATP 1 μl T4ポリヌクレオチドキナーゼ (東洋紡製) 10 単位 水を加えて全量を100 μl として、37℃で1 時間反応さ
せた。ここで 10 × protruding end kinase buffer と
は 0.5M Tris-HCl(pH8.0) 0.1M MgCl2 0.1M 2-メルカプトエタノール を示す。
スケールで実施した。必要によりBiotin-ON Phosphoami
dite(TOYOBO)を用いて、5'末端にビオチンを結合させて
合成した。各種オリゴヌクレオチドの脱保護はアンモニ
ア水で55℃で一夜実施した。精製はファルマシア社製FP
LCで、MonoQ カラムまたは日立製作所製HPLCで、逆相カ
ラムにて実施した。なお合成したオリゴヌクレオチドは
必要により以下の方法で、5'末端にリン酸基を結合させ
た。 オリゴヌクレオチド 50〜200 pmoles 10× protruding end kinase buffer 10 μl 1 mM ATP 1 μl T4ポリヌクレオチドキナーゼ (東洋紡製) 10 単位 水を加えて全量を100 μl として、37℃で1 時間反応さ
せた。ここで 10 × protruding end kinase buffer と
は 0.5M Tris-HCl(pH8.0) 0.1M MgCl2 0.1M 2-メルカプトエタノール を示す。
【００５６】実施例１ 鋳型用一本鎖核酸及びプライマー用二本鎖核酸の調製 予め5'末端をリン酸化した第１オリゴヌクレオチドおよ
び第２オリゴヌクレオチドをアニールさせた後、プラス
ミド・ベクターpTZ18U（ストラタジーン社製）を制限酵
素EcoRＩおよびSphIで切断した断片と結合させ、大腸菌
に形質転換の後、第１オリゴヌクレオチドおよび第２オ
リゴヌクレオチドを組込んだプラスミド(pRPTD) を含む
大腸菌を分離した。分離した大腸菌を培養の後、二本鎖
プラスミド、dspRPTD 及び一本鎖プラスミド、sspRPTD
を得た（図２）。二本鎖プラスミドは以下の実施例にお
いてプライマーとして使用する。一本鎖プラスミドは以
下の実施例において鋳型として使用する。
び第２オリゴヌクレオチドをアニールさせた後、プラス
ミド・ベクターpTZ18U（ストラタジーン社製）を制限酵
素EcoRＩおよびSphIで切断した断片と結合させ、大腸菌
に形質転換の後、第１オリゴヌクレオチドおよび第２オ
リゴヌクレオチドを組込んだプラスミド(pRPTD) を含む
大腸菌を分離した。分離した大腸菌を培養の後、二本鎖
プラスミド、dspRPTD 及び一本鎖プラスミド、sspRPTD
を得た（図２）。二本鎖プラスミドは以下の実施例にお
いてプライマーとして使用する。一本鎖プラスミドは以
下の実施例において鋳型として使用する。
【００５７】実施例２ 実施例１で得られた一本鎖プラスミド、sspRPTD １μg
及び二本鎖プラスミド、dspRPTD をBamHＩとPvuIで切断
したDNA 断片（２つの断片になっていて一方にT7RNA ポ
リメラーゼのプロモーター配列を含む）100, 10, 1, 0.
1, 0.01, 0ngとを各々、下記反応液20μl に加えた。65
℃に１分間保温した後、30℃に１分間保温し、T7RNA ポ
リメラーゼ 180単位、ポリメラーゼIII 150単位、β-
サブユニット 200単位、 RNasin 40単位、一本鎖結合タ
ンパク(SSB) １mgを加え、30℃、１時間保温した。 反応液 20mM Tris-HCl(pH 8.0) 8mM MgCl2 1mM ATP 8mM DTT 80 μg/ml BSA 100 μM ATP, GTP, CTP, UTP, dATP, dGTP, dCTP, dTT
P
及び二本鎖プラスミド、dspRPTD をBamHＩとPvuIで切断
したDNA 断片（２つの断片になっていて一方にT7RNA ポ
リメラーゼのプロモーター配列を含む）100, 10, 1, 0.
1, 0.01, 0ngとを各々、下記反応液20μl に加えた。65
℃に１分間保温した後、30℃に１分間保温し、T7RNA ポ
リメラーゼ 180単位、ポリメラーゼIII 150単位、β-
サブユニット 200単位、 RNasin 40単位、一本鎖結合タ
ンパク(SSB) １mgを加え、30℃、１時間保温した。 反応液 20mM Tris-HCl(pH 8.0) 8mM MgCl2 1mM ATP 8mM DTT 80 μg/ml BSA 100 μM ATP, GTP, CTP, UTP, dATP, dGTP, dCTP, dTT
P
【００５８】その後、アガロースゲルで電気泳動し、エ
チジウムブロマイド染色法により合成された二本鎖DNA
、dsDNA を確認した（図８）。図８においてレーン１
〜６はＤＮＡ断片100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0ngを順に示
す。マーカーはλHind IIIダイジェストを使用した。図
８から明らかなように、2.9Kb 付近に二本鎖DNA が合成
されていた。これは、二本鎖DNA から切断されたDNA を
鋳型としてRNA が合成され、それがプライマーとして一
本鎖DNA にアニールし、二本鎖DNA が合成されたことを
示している（図３）。
チジウムブロマイド染色法により合成された二本鎖DNA
、dsDNA を確認した（図８）。図８においてレーン１
〜６はＤＮＡ断片100, 10, 1, 0.1, 0.01, 0ngを順に示
す。マーカーはλHind IIIダイジェストを使用した。図
８から明らかなように、2.9Kb 付近に二本鎖DNA が合成
されていた。これは、二本鎖DNA から切断されたDNA を
鋳型としてRNA が合成され、それがプライマーとして一
本鎖DNA にアニールし、二本鎖DNA が合成されたことを
示している（図３）。
【００５９】実施例３ 参考例１の第３オリゴヌクレオチドの5'末端をリン酸化
したもの 10pmol 、第４オリゴヌクレオチド 10pmol、T
DH産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製した
ゲノム核酸 1ng, 100pgまたは 0pgとを共に 20 μl の
下記反応液に加えた。94℃に 5分間保った後、37℃に２
分間保温し、T4リガーゼを加え、37℃に30分間保温し、
第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌクレオチドを連
結させた後、一本鎖プラスミド、sspRPTD 1 μg を加え
た。94℃に１分間保温した後、30℃に１分間保温し、T7
RNA ポリメラーゼ 180単位、ポリメラーゼIII 150単
位、β- サブユニット 200単位、RNase インヒビター40
単位、一本鎖結合タンパク(SSB) １mgを加え、30℃、１
時間保温した。 反応液 20mM Tris-HCl(pH 8.0) 8mM MgCl2 1mM ATP 8mM DTT 80μg/ml BSA 100μM ATP, GTP, CTP, UTP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP
したもの 10pmol 、第４オリゴヌクレオチド 10pmol、T
DH産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製した
ゲノム核酸 1ng, 100pgまたは 0pgとを共に 20 μl の
下記反応液に加えた。94℃に 5分間保った後、37℃に２
分間保温し、T4リガーゼを加え、37℃に30分間保温し、
第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌクレオチドを連
結させた後、一本鎖プラスミド、sspRPTD 1 μg を加え
た。94℃に１分間保温した後、30℃に１分間保温し、T7
RNA ポリメラーゼ 180単位、ポリメラーゼIII 150単
位、β- サブユニット 200単位、RNase インヒビター40
単位、一本鎖結合タンパク(SSB) １mgを加え、30℃、１
時間保温した。 反応液 20mM Tris-HCl(pH 8.0) 8mM MgCl2 1mM ATP 8mM DTT 80μg/ml BSA 100μM ATP, GTP, CTP, UTP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP
【００６０】その後、アガロースゲルで電気泳動し、エ
チジウムブロマイド染色法により合成されたdsDNA を確
認した（図９）。図９においてレーン１〜３はゲノム核
酸１ng, 100pg, 0pgのものを順に示す。マーカーはλ H
ind IIIダイジェストを使用した。図９から明らかなよ
うに2.9Kb 付近に二本鎖DNA 、dsDNA が合成されてい
た。これは、第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌク
レオチドが連結し、連結されたDNA を鋳型としてRNA が
合成され、それがプライマーとして一本鎖DNA 、ssDNA
にアニールし、二本鎖DNA 、dsDNA が合成されたことを
示している（図４）。
チジウムブロマイド染色法により合成されたdsDNA を確
認した（図９）。図９においてレーン１〜３はゲノム核
酸１ng, 100pg, 0pgのものを順に示す。マーカーはλ H
ind IIIダイジェストを使用した。図９から明らかなよ
うに2.9Kb 付近に二本鎖DNA 、dsDNA が合成されてい
た。これは、第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌク
レオチドが連結し、連結されたDNA を鋳型としてRNA が
合成され、それがプライマーとして一本鎖DNA 、ssDNA
にアニールし、二本鎖DNA 、dsDNA が合成されたことを
示している（図４）。
【００６１】実施例４ 参考例１の第６オリゴヌクレオチドの5'末端をリン酸化
したもの 10pmol 、第５オリゴヌクレオチド 10pmol 、
TDH 産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製し
たゲノム核酸 1ng, 100pg または０ｇとを共に20μl の
下記反応液に加えた。94℃に５分間保った後、37℃に２
分間保温し、T4リガーゼを加え、37℃に30分間保温し、
第５オリゴヌクレオチドと第６オリゴヌクレオチドを連
結させた後、第４オリゴヌクレオチド 10pmol,一本鎖プ
ラスミド、sspRPTD １μg を加えた。94℃に１分間保温
した後、30℃に１分間保温し、T7RNA ポリメラーゼ 180
単位、ポリメラーゼIII 150単位、β サブユニット 20
0単位、RNase インヒビター40単位、一本鎖結合タンパ
ク(SSB１mgを加え、30℃、１時間保温した。 反応液 20mM Tris-HCl(pH 8.0) 8mM MgCl2 1mM ATP 8mM DTT 80μg/ml BSA 100μM ATP, GTP, CTP, UTP, dATP, dGTP, dCTP, dTT
P
したもの 10pmol 、第５オリゴヌクレオチド 10pmol 、
TDH 産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製し
たゲノム核酸 1ng, 100pg または０ｇとを共に20μl の
下記反応液に加えた。94℃に５分間保った後、37℃に２
分間保温し、T4リガーゼを加え、37℃に30分間保温し、
第５オリゴヌクレオチドと第６オリゴヌクレオチドを連
結させた後、第４オリゴヌクレオチド 10pmol,一本鎖プ
ラスミド、sspRPTD １μg を加えた。94℃に１分間保温
した後、30℃に１分間保温し、T7RNA ポリメラーゼ 180
単位、ポリメラーゼIII 150単位、β サブユニット 20
0単位、RNase インヒビター40単位、一本鎖結合タンパ
ク(SSB１mgを加え、30℃、１時間保温した。 反応液 20mM Tris-HCl(pH 8.0) 8mM MgCl2 1mM ATP 8mM DTT 80μg/ml BSA 100μM ATP, GTP, CTP, UTP, dATP, dGTP, dCTP, dTT
P
【００６２】その後、アガロースゲルで電気泳動し、エ
チジウムブロマイド染色法により合成されたdsDNA を確
認した（図１０）。図１０においてゲノム核酸１ng, 10
0pg,0ｇのものを順に示す。マーカーはλ Hind IIIダイ
ジェストを使用した。図１０から明らかなように2.9Kb
付近に二本鎖DNA 、dsDNA が合成されていた。これは、
第５オリゴヌクレオチドと第６オリゴヌクレオチドが連
結し、連結されたDNA を鋳型として第４オリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用い、２本鎖のDNAが合成さ
れ、そのDNA を鋳型としてRNA が合成され、それがプラ
イマーとして一本鎖DNA 、ssDNA にアニールし、二本鎖
DNA 、dsDNA が合成されたことを示している（図５）。
チジウムブロマイド染色法により合成されたdsDNA を確
認した（図１０）。図１０においてゲノム核酸１ng, 10
0pg,0ｇのものを順に示す。マーカーはλ Hind IIIダイ
ジェストを使用した。図１０から明らかなように2.9Kb
付近に二本鎖DNA 、dsDNA が合成されていた。これは、
第５オリゴヌクレオチドと第６オリゴヌクレオチドが連
結し、連結されたDNA を鋳型として第４オリゴヌクレオ
チドをプライマーとして用い、２本鎖のDNAが合成さ
れ、そのDNA を鋳型としてRNA が合成され、それがプラ
イマーとして一本鎖DNA 、ssDNA にアニールし、二本鎖
DNA 、dsDNA が合成されたことを示している（図５）。
【００６３】実施例５ 参考例１の第５オリゴヌクレオチド 10pmol 、TDH 産性
腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲノム
核酸１ng, 100pg または０ｇとを共に20μl の下記反応
液に加えた。94℃に 5分間保った後、37℃に２分間保温
し、クレノー DNAポリメラーゼを8.3 単位加え、37℃に
30分間保温し、第５オリゴヌクレオチドをプライマーと
してDNA 伸張反応をさせた後、第４オリゴヌクレオチド
10pmol,一本鎖プラスミド、sspRPTD 1μｇを加えた。
94℃に１分間保温した後、30℃に１分間保温し、T7RNA
ポリメラーゼ 180単位、ポリメラーゼIII 150単位、β-
サブユニット 200単位、RNase インヒビター40単位、一
本鎖結合タンパク(SSB)１mgを加え、30℃、１時間保温
した。 反応液 20mM Tris-HCl(pH 8.0) 8mM MgCl2 1mM ATP 8mM DTT 80μg/ml BSA 100μM ATP, GTP, CTP, UTP, dATP, dGTP, dCTP, dTT
P
腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲノム
核酸１ng, 100pg または０ｇとを共に20μl の下記反応
液に加えた。94℃に 5分間保った後、37℃に２分間保温
し、クレノー DNAポリメラーゼを8.3 単位加え、37℃に
30分間保温し、第５オリゴヌクレオチドをプライマーと
してDNA 伸張反応をさせた後、第４オリゴヌクレオチド
10pmol,一本鎖プラスミド、sspRPTD 1μｇを加えた。
94℃に１分間保温した後、30℃に１分間保温し、T7RNA
ポリメラーゼ 180単位、ポリメラーゼIII 150単位、β-
サブユニット 200単位、RNase インヒビター40単位、一
本鎖結合タンパク(SSB)１mgを加え、30℃、１時間保温
した。 反応液 20mM Tris-HCl(pH 8.0) 8mM MgCl2 1mM ATP 8mM DTT 80μg/ml BSA 100μM ATP, GTP, CTP, UTP, dATP, dGTP, dCTP, dTT
P
【００６４】その後、アガロースゲルで電気泳動し、エ
チジウムブロマイド染色法により合成されたdsDNA を確
認した（図１１）。図１１においてレーン１〜３はゲノ
ム核酸１ng, 100pg, 0ｇのものを順に示す。マーカーは
λ Hind IIIダイジェストを使用した。図１１から明ら
かなように2.9Kb 付近に二本鎖DNA 、dsDNA が合成され
ていた。これは、第５オリゴヌクレオチドがプライマー
としてDNA 伸張物が合成され、そのDNA を一本鎖とした
後、第４オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、
２本鎖のDNA が合成され、そのDNA を鋳型としてRNA が
合成され、それがプライマーとして一本鎖DNA 、ssDNA
にアニールし、二本鎖DNA 、dsDNA が合成されたことを
示している（図６）。
チジウムブロマイド染色法により合成されたdsDNA を確
認した（図１１）。図１１においてレーン１〜３はゲノ
ム核酸１ng, 100pg, 0ｇのものを順に示す。マーカーは
λ Hind IIIダイジェストを使用した。図１１から明ら
かなように2.9Kb 付近に二本鎖DNA 、dsDNA が合成され
ていた。これは、第５オリゴヌクレオチドがプライマー
としてDNA 伸張物が合成され、そのDNA を一本鎖とした
後、第４オリゴヌクレオチドをプライマーとして用い、
２本鎖のDNA が合成され、そのDNA を鋳型としてRNA が
合成され、それがプライマーとして一本鎖DNA 、ssDNA
にアニールし、二本鎖DNA 、dsDNA が合成されたことを
示している（図６）。
【００６５】実施例６ 参考例１の第３オリゴヌクレオチドの5'末端をリン酸化
したもの 10pmol 、第４オリゴヌクレオチドの5'末端を
ビオチン化したもの 10pmol 、TDH 産性腸炎ビブリオの
培養菌体から分離、部分精製したゲノム核酸１ng, 100p
g または０ｇとを共に20μl の下記連結反応液に加え
た。94℃に５分間保った後、37℃に２分間保温し、T4リ
ガーゼを 2.7単位加え、37℃に30分間保温し、第３オリ
ゴヌクレオチドと第４オリゴヌクレオチドを連結させ
た。ストレプトアビジン結合磁性ビーズ(Dynabeads:M-2
80) を40μl 加え混合した後、室温で10分間放置した。
磁石でビーズを集め、上澄みを捨てTE緩衝液を加え洗浄
した。３回洗浄した後、0.3N NaOH を20μl 入れ混合し
た後、室温に５分放置した。TE緩衝液で３回洗浄した
後、下記伸張反応液20μl 、一本鎖プラスミド、sspRPT
D 1 μg を加えた。65℃に１分間保温した後、30℃に１
分間保温し、T7RNA ポリメラーゼ 180単位、ポリメラー
ゼIII 150単位、β サブユニット 200単位、RNase イ
ンヒビター40単位、一本鎖結合タンパク(SSB) １mgを加
え、30℃、１時間保温した。 連結反応液 10mM Tris-HCl(pH 7.6) 7mM MgCl2 10mM DTT 1mM ATP 伸張反応液 20mM Tris-HCl(pH 8.0) 8mM MgCl2 1mM ATP 8mM DTT 80μg/ml BSA 100 μM ATP, GTP, CTP, UTP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP
したもの 10pmol 、第４オリゴヌクレオチドの5'末端を
ビオチン化したもの 10pmol 、TDH 産性腸炎ビブリオの
培養菌体から分離、部分精製したゲノム核酸１ng, 100p
g または０ｇとを共に20μl の下記連結反応液に加え
た。94℃に５分間保った後、37℃に２分間保温し、T4リ
ガーゼを 2.7単位加え、37℃に30分間保温し、第３オリ
ゴヌクレオチドと第４オリゴヌクレオチドを連結させ
た。ストレプトアビジン結合磁性ビーズ(Dynabeads:M-2
80) を40μl 加え混合した後、室温で10分間放置した。
磁石でビーズを集め、上澄みを捨てTE緩衝液を加え洗浄
した。３回洗浄した後、0.3N NaOH を20μl 入れ混合し
た後、室温に５分放置した。TE緩衝液で３回洗浄した
後、下記伸張反応液20μl 、一本鎖プラスミド、sspRPT
D 1 μg を加えた。65℃に１分間保温した後、30℃に１
分間保温し、T7RNA ポリメラーゼ 180単位、ポリメラー
ゼIII 150単位、β サブユニット 200単位、RNase イ
ンヒビター40単位、一本鎖結合タンパク(SSB) １mgを加
え、30℃、１時間保温した。 連結反応液 10mM Tris-HCl(pH 7.6) 7mM MgCl2 10mM DTT 1mM ATP 伸張反応液 20mM Tris-HCl(pH 8.0) 8mM MgCl2 1mM ATP 8mM DTT 80μg/ml BSA 100 μM ATP, GTP, CTP, UTP, dATP, dGTP, dCTP, dTTP
【００６６】その後、アガロースゲルで電気泳動し、エ
チジウムブロマイド染色法により合成されたdsDNA を確
認した（図１２）。図１２においてレーン１〜３はゲノ
ム核酸１ng, 100pg, 0ｇのものを順に示す。マーカーは
λ Hind IIIダイジェストを使用した。図５から明らか
なように2.9Kb 付近に二本鎖DNA 、dsDNA が合成されて
いた。これは、第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌ
クレオチドが連結し、連結されたDNA を鋳型としてRNA
が合成され、それがプライマーとして一本鎖DNA、ssDNA
にアニールし、二本鎖DNA 、dsDNAが合成されたことを
示している。（図７）。
チジウムブロマイド染色法により合成されたdsDNA を確
認した（図１２）。図１２においてレーン１〜３はゲノ
ム核酸１ng, 100pg, 0ｇのものを順に示す。マーカーは
λ Hind IIIダイジェストを使用した。図５から明らか
なように2.9Kb 付近に二本鎖DNA 、dsDNA が合成されて
いた。これは、第３オリゴヌクレオチドと第４オリゴヌ
クレオチドが連結し、連結されたDNA を鋳型としてRNA
が合成され、それがプライマーとして一本鎖DNA、ssDNA
にアニールし、二本鎖DNA 、dsDNAが合成されたことを
示している。（図７）。
【００６７】
配列番号：1 配列の長さ：56 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..4 特徴を決定した方法：S 他の特徴：制限酵素結合部位 存在位置：5..26 他の特徴：腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haem
olysin) 遺伝子の102番目から123 番目のヌクレオチド
配列と相同な配列を有する。 存在位置：27..30 他の特徴：制限酵素結合部位 存在位置：31..52 他の特徴：腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haem
olysin) 遺伝子の102番目から123 番目のヌクレオチド
配列と相補的な配列を有する。 存在位置：53..56 他の特徴：制限酵素結合部位 配列 AATTCCCCGG TTCTGATGAG ATATTGGATC CAATATCTCA TCAGAACCGG GGCATG 56
olysin) 遺伝子の102番目から123 番目のヌクレオチド
配列と相同な配列を有する。 存在位置：27..30 他の特徴：制限酵素結合部位 存在位置：31..52 他の特徴：腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haem
olysin) 遺伝子の102番目から123 番目のヌクレオチド
配列と相補的な配列を有する。 存在位置：53..56 他の特徴：制限酵素結合部位 配列 AATTCCCCGG TTCTGATGAG ATATTGGATC CAATATCTCA TCAGAACCGG GGCATG 56
【００６８】配列番号：2 配列の長さ：48 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..22 特徴を決定した方法：S 他の特徴：腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haem
olysin) 遺伝子の102番目から123 番目のヌクレオチド
配列と相同な配列を有する。 存在位置：23..26 他の特徴：制限酵素結合部位 存在位置：27..48 他の特徴：腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haem
olysin) 遺伝子の102番目から123 番目のヌクレオチド
配列と相補的な配列を有する。 配列 CCCCGGTTCT GATGAGATAT TGGATCCAAT ATCTCATCAG AACCGGGG 48
olysin) 遺伝子の102番目から123 番目のヌクレオチド
配列と相同な配列を有する。 存在位置：23..26 他の特徴：制限酵素結合部位 存在位置：27..48 他の特徴：腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haem
olysin) 遺伝子の102番目から123 番目のヌクレオチド
配列と相補的な配列を有する。 配列 CCCCGGTTCT GATGAGATAT TGGATCCAAT ATCTCATCAG AACCGGGG 48
【００６９】配列番号：3 配列の長さ：47 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..20 特徴を決定した方法：S 他の特徴：腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haem
olysin) 遺伝子の82番目から101 番目のヌクレオチド配
列と相補的な配列を有する。 存在位置：21..47 他の特徴：T7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列 配列 GCATGAAAAG GGACAGATGG CTCCCTATAG TGAGTCGTAT TAGAATT 47
olysin) 遺伝子の82番目から101 番目のヌクレオチド配
列と相補的な配列を有する。 存在位置：21..47 他の特徴：T7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列 配列 GCATGAAAAG GGACAGATGG CTCCCTATAG TGAGTCGTAT TAGAATT 47
【００７０】配列番号：4 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..22 特徴を決定した方法：S 他の特徴：腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haem
olysin) 遺伝子の102番目から123 番目のヌクレオチド
配列と相補的な配列を有する。 配列 CAATATCTCA TCAGAACCGG GG 22
olysin) 遺伝子の102番目から123 番目のヌクレオチド
配列と相補的な配列を有する。 配列 CAATATCTCA TCAGAACCGG GG 22
【００７１】配列番号：5 配列の長さ：47 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..27 特徴を決定した方法：S 他の特徴：T7 RNAポリメラーゼのプロモーター配列 存在位置：28..47 他の特徴：腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haem
olysin) 遺伝子の82番目から101 番目のヌクレオチド配
列と相補的な配列を有する。 配列 AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGCCA TCTGTCCCTT TTCATGC 47
olysin) 遺伝子の82番目から101 番目のヌクレオチド配
列と相補的な配列を有する。 配列 AATTCTAATA CGACTCACTA TAGGGAGCCA TCTGTCCCTT TTCATGC 47
【００７２】配列番号：6 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..22 特徴を決定した方法：S 他の特徴：腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haem
olysin) 遺伝子の102番目から123 番目のヌクレオチド
配列と相同な配列を有する。 配列 CCCCGGTTCT GATGAGATAT TG 22
olysin) 遺伝子の102番目から123 番目のヌクレオチド
配列と相同な配列を有する。 配列 CCCCGGTTCT GATGAGATAT TG 22
【図１】第１〜６オリゴヌクレオチドを示す。
【図２】実施例１における一本鎖プラスミドおよび二本
鎖プラスミドの構築を示す。
鎖プラスミドの構築を示す。
【図３】実施例２における二本鎖プラスミドの構築を示
す。
す。
【図４】実施例３における二本鎖プラスミドの構築を示
す。
す。
【図５】実施例４における二本鎖プラスミドの構築を示
す。
す。
【図６】実施例５における二本鎖プラスミドの構築を示
す。
す。
【図７】実施例６における二本鎖プラスミドの構築を示
す。
す。
【図８】実施例２における増幅産物の電気泳動を示す。
【図９】実施例３における増幅産物の電気泳動を示す。
【図１０】実施例４における増幅産物の電気泳動を示
す。
す。
【図１１】実施例５における増幅産物の電気泳動を示
す。
す。
【図１２】実施例６における増幅産物の電気泳動を示
す。
す。
Claims (5)
- 【請求項１】 ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
を有する一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、ＲＮＡをプライマー
としてＤＮＡポリメラーゼの存在下、ＤＮＡを合成し、
合成された二本鎖ＤＮＡを鋳型としてＲＮＡポリメラー
ゼによりＲＮＡを合成することを特徴とする核酸配列の
増幅方法。 - 【請求項２】 下記操作を含むことを特徴とする核酸配
列の増幅方法。 操作ａ） ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を有
する一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、ＲＮＡをプライマーとし
てＤＮＡポリメラーゼの存在下、ＤＮＡを合成する。 操作ｂ） 合成された二本鎖ＤＮＡを鋳型として、ＲＮ
ＡポリメラーゼによりＲＮＡを合成する。 操作ｃ） 前記一本鎖ＤＮＡを鋳型とし、合成されたＲ
ＮＡをプライマーとしてＤＮＡポリメラーゼの存在下、
ＤＮＡを合成する。 操作ｄ） 操作ｂ）および操作ｃ）を少なくとも１回繰
り返す。 - 【請求項３】 ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
を有する一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、
４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＲＮＡポリ
メラーゼ、４種のリボヌクレオシド三リン酸および反応
緩衝液を含むことを特徴とする核酸配列の増幅のための
試薬。 - 【請求項４】 請求項１または請求項２または請求項３
において生成した核酸増幅物に、検出されるべき配列及
び／又はその変異体とハイブリダイズすることができる
標識されたオリゴヌクレオチドプローブを加え、該ハイ
ブリダイゼーションが生じたか否かを決定することによ
り、標的核酸を検出することを特徴とする標的核酸配列
の検出方法。 - 【請求項５】 ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
を有する一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡポリメラーゼ、
４種のデオキシリボヌクレオシド三リン酸、ＲＮＡポリ
メラーゼ、４種のリボヌクレオシド三リン酸および反応
緩衝液ならびに検出されるべき配列及び／又はその変異
体とハイブリダイズすることができる標識されたオリゴ
ヌクレオチドプローブを含むことを特徴とする核酸配列
の検出のための試薬。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11861693A JPH06327500A (ja) | 1993-05-20 | 1993-05-20 | 核酸配列の増幅方法および検出方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11861693A JPH06327500A (ja) | 1993-05-20 | 1993-05-20 | 核酸配列の増幅方法および検出方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06327500A true JPH06327500A (ja) | 1994-11-29 |
Family
ID=14740958
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11861693A Pending JPH06327500A (ja) | 1993-05-20 | 1993-05-20 | 核酸配列の増幅方法および検出方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH06327500A (ja) |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2737223A1 (fr) * | 1995-07-24 | 1997-01-31 | Bio Merieux | Procede d'amplification de sequences d'acide nucleique par deplacement, a l'aide d'amorces chimeres |
| EP1366197A4 (en) * | 2001-03-09 | 2004-06-30 | Nugen Technologies Inc | METHODS AND COMPOSITIONS FOR AMPLIFYING RNA SEQUENCES |
| US7771934B2 (en) | 2000-12-13 | 2010-08-10 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and compositions for generation of multiple copies of nucleic acid sequences and methods of detection thereof |
| US7846666B2 (en) | 2008-03-21 | 2010-12-07 | Nugen Technologies, Inc. | Methods of RNA amplification in the presence of DNA |
| US7846733B2 (en) | 2000-06-26 | 2010-12-07 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification |
| US7939258B2 (en) | 2005-09-07 | 2011-05-10 | Nugen Technologies, Inc. | Nucleic acid amplification procedure using RNA and DNA composite primers |
| US8034568B2 (en) | 2008-02-12 | 2011-10-11 | Nugen Technologies, Inc. | Isothermal nucleic acid amplification methods and compositions |
-
1993
- 1993-05-20 JP JP11861693A patent/JPH06327500A/ja active Pending
Cited By (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1997004126A1 (fr) * | 1995-07-24 | 1997-02-06 | Bio Merieux | Procede d'amplification de sequences d'acide nucleique par deplacement, a l'aide d'amorces chimeres |
| FR2737223A1 (fr) * | 1995-07-24 | 1997-01-31 | Bio Merieux | Procede d'amplification de sequences d'acide nucleique par deplacement, a l'aide d'amorces chimeres |
| US7846733B2 (en) | 2000-06-26 | 2010-12-07 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and compositions for transcription-based nucleic acid amplification |
| US8334116B2 (en) | 2000-12-13 | 2012-12-18 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and compositions for generation of multiple copies of nucleic acid sequences and methods of detection thereof |
| US7771934B2 (en) | 2000-12-13 | 2010-08-10 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and compositions for generation of multiple copies of nucleic acid sequences and methods of detection thereof |
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| US7354717B2 (en) | 2001-03-09 | 2008-04-08 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and kits for amplification of RNA sequences using composite primers |
| US7771946B2 (en) | 2001-03-09 | 2010-08-10 | Nugen Technologies, Inc. | Methods, kits and compositions for single primer linear isothermal amplification of nucleic acid sequences |
| US8071311B2 (en) | 2001-03-09 | 2011-12-06 | Nugen Technologies, Inc. | Methods and compositions for amplification of RNA sequences |
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