JP3080178B2 - 核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キット - Google Patents
核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キットInfo
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のための試薬キットに関する。この発明は特に、塩基配
列が既知の核酸を、その初期に存在する量に比較して、
より大量に生成させる方法に関する。本発明を実施する
ことにより、遺伝病、癌、感染症などの診断を行うこと
が容易となる。
の検出は遺伝病、癌、感染症などの診断のために有効な
手段として汎用されるようになってきた。核酸検出法に
おいて、標的とする塩基配列は、対象となる核酸のほん
の僅かな部分である場合があり、非放射性標識プローブ
や末端を放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチドプ
ローブを用いた検出法では、感度上の問題等によりその
検出が困難である。そのため、プローブ検出システムの
感度を向上させるための努力が多くなされている(WO87
/03622など)。また、感度向上の手段として、標的とす
る核酸をDNAポリメラーゼにより増幅させる方法(特
開昭61-274697号公報;以下「PCR」と略すことがある)
が開示されている。しかし、この方法では複雑な温度の
調節が必要であり、専用の機器を必要とするという欠点
がある。 DNAリガーゼを用いる増幅法も開示され
ている(WO89/12696 、特開平2-2934号公報など) 。しか
し、これらの方法ではDNAリガーゼが平滑末端を連結
する反応 (blunt end ligation) により非特異的増幅が
起こる。この問題の回避法として、WO89/12696では3組
以上のプローブを用いているが、プローブ数が多くコス
ト高となってしまう欠点がある。また、RNAポリメラ
ーゼを用いてDNAよりRNAが生成されることは周知
であり、RNAポリメラーゼを用いて核酸の増幅を行う
方法も開示されている(WO89/01050)。しかしながら、こ
の方法ではRNAポリメラーゼによる転写増幅のみでは
充分な増幅は困難である。従って、生成したRNAに再
度逆転写酵素を作用させDNAを生成させる操作を実施
している。一方、標的とする核酸にプローブをハイブリ
ダイズさせた後、正しくハイブリダイズしたプローブの
みを増幅する方法(BIO/TECHNOLOGY vol.6, 1197, 198
8)も知られている。しかしこの方法では、非特異反応
により結合したプローブも増幅され、ブランク値の上昇
をきたすという問題がある。
とする核酸を簡便に増幅させる方法を提供することであ
る。
題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、プローブとして
標的核酸の存在下でのみ環状となりうるヌクレオチドを
用いることにより、上記課題が解決されることを見出し
て、本発明を完成させるに到った。即ち、本発明は検体
試料中の標的核酸配列(A)の存在の結果として環状化
するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌク
レオチド(B)と、少なくともこの直鎖状プローブヌク
レオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプライ
マーヌクレオチド(C)を用いて、標的核酸配列(A)
に直鎖状プローブヌクレオチド(B)をハイブリダイズ
させ、直鎖状プローブヌクレオチド(B)を環状化し、
生成した環状プローブヌクレオチド(B’)を鋳型と
し、プライマーヌクレオチド(C)を利用し、鋳型と相
補的な配列の繰り返した配列を有する一本鎖核酸を生成
させることにより、核酸配列を増幅させることを特徴と
する核配列の増幅方法である。また本発明の核酸を増幅
するための試薬キットは、検体試料中の標的核酸配列
(A)の存在の結果として環状化するように設計された
配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B)、該直
鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配
列を有するプライマーヌクレオチド(C)、連結手段、
核酸ポリメラーゼおよびヌクレオチド三リン酸を含む核
酸増幅用試薬キットである。
リッドを形成することにより、リガ9 ゼを用いて環状化
することが可能となるように設計された核酸分子を使用
し、該環状化した核酸分子を鋳型として、ポリメラーゼ
反応により核酸配列を増幅させる。本発明における標的
核酸(A)は、単鎖でも二重鎖でもよく、比較的純粋な
状態であっても、核酸の混合物の一成分であってもよ
い。本発明に関する標的核酸の配列は長さ、構造等に特
に制限されない。
(B)とは、検体試料中の標的核酸配列(A)の存在の
結果として環状化するように設計された配列を有する直
鎖状プローブヌクレオチドである(図1および図2のB
参照)。プローブヌクレオチド(B)の5’末端と3’
末端は図2に示されるように、標的核酸とアニールする
部分を有する。該アニール部分は、それぞれ6〜40ヌク
レオチド、好ましくは各々10〜30ヌクレオチドの長さが
使用される。5’末端と3’末端に位置する上記アニー
ル部分間を結ぶ配列の長さは、一般的に1〜1000個、好
ましくは10〜100 個のヌクレオチドであればよい。ま
た、この領域にRNAポリメラーゼのアンチプロモータ
ー配列を含ませることも可能である。このRNAポリメ
ラーゼのアンチプロモーター配列を持ったプローブヌク
レオチドを用いた場合、プライマーヌクレオチドとして
RNAポリメラーゼのプロモーター配列を持つヌクレオ
チドを用いることにより、プロモーターに応じたRNA
ポリメラーゼ、およびリボヌクレオチド(ATP, CTP, GT
P, UTP)を作用させれば、プローブヌクレオチドの相補
鎖が繰り返し並んだRNAを合成することが可能であ
る。
は、プローブヌクレオチド(B)と少なくとも部分的に
相補的な配列を有していれば、構造、長さなどに制限さ
れない。長さは一般的には、6〜40ヌクレオチド、好ま
しくは10〜30ヌクレオチドが使用される。また、プロー
ブヌクレオチドがRNAポリメラーゼのアンチプロモー
ター配列を含む場合には、プライマーヌクレオチドにプ
ロモーター配列を含ませたものを使用することが可能で
ある。これらのオリゴヌクレオチド(B)および(C)
は、例えばABI社(Applied Biosystems Inc. )のD
NAシンセサイザー 391型を用いて、ホスホアミダイト
法により合成できる。他にもリン酸トリエステル法、H
−ホスホネート法、チオホスファイト法等いかなる方法
で合成してもよい。また、生物学的起源、例えば制限エ
ンドヌクレアーゼ消化物から単離してもよい。プローブ
ヌクレオチド(B)の5’末端にはリン酸基を付加して
おくことが好ましい。リン酸基の付加は、例えばATP
の存在下で、T4ポリヌクレオチドキナーゼにより行う
ことができる。
ヘリカーゼ様活性を持つ核酸ポリメラーゼであれば、D
NAポリメラーゼであっても、RNAポリメラーゼであ
ってもよい。例えばφ29DNAポリメラーゼを用いれ
ば、環状核酸分子を鋳型として、鋳型と相補的な配列が
繰り返し並んだ核酸を合成することが可能である(J.Bi
ol. Chem. 264, 8935, 1989 )。他にも、M2DNAポ
リメラーゼ、E. coli DNAポリメラーゼIII 、T7R
NAポリメラーゼ、T3RNAポリメラーゼ、SP6R
NAポリメラーゼなどが利用できる。
(A)に上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)をハイ
ブリダイズさせ、直鎖状プローブヌクレオチド(B)を
環状化し、生成した環状プローブヌクレオチド(B’)
を鋳型として、プライマーヌクレオチド(C)を利用
し、鋳型と相補的な配列の繰り返した配列を有する一本
鎖核酸を生成させることにより核酸配列を増幅させる。
実施態様が挙げられる。(1)検体試料中の標的核酸配
列(A)の存在の結果として環状化するように設計され
た配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、
少なくとも該直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分
的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド
(C)を用いて、下記の操作(a)〜(e)を行うこと
を特徴とする核酸配列の増幅方法。 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)と
標的核酸配列(A)とのハイブリッドを形成させる。 操作(b):プライマーヌクレオチド(C)を操作
(a)で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチ
ド(B)とアニールさせる。 操作(c):操作(b)で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド(B)の5’末端と3’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド(B’)とする。 操作(d):操作(c)で生成した環状ヌクレオチド
(B’)を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作(e):必要により、操作(d)で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作(a)〜(d)を少なくとも1 回
繰り返す。
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用い
て、下記の操作(a)〜(e)を行うことを特徴とする
核酸配列の増幅方法。 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)と
プライマーヌクレオチド(C)とのハイブリッドを形成
させる。 操作(b):検体試料中の標的核酸(A)を、操作
(a)で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチ
ド(B)とアニールさせる。 操作(c):操作(b )で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド(B)の5’末端と3’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド(B’)とする。 操作(d):操作(c)で生成した環状ヌクレオチド
(B’)を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作(e):必要により、操作(d)で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作(a)〜(d)を少なくとも1 回
繰り返す。
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用い
て、下記の操作(a)〜(d)を行うことを特徴とする
核酸配列の増幅方法。 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)、
標的核酸配列(A)およびプライマーヌクレオチド
(C)とのハイブリッドを形成させる。 操作(b):操作(a)で生成したハイブリッド中の直
鎖状プローブヌクレオチド(B)の5’末端と3’末端
を連結させ、環状ヌクレオチド(B’)とする。 操作(c):操作(b)で生成した環状ヌクレオチド
(B’)を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作(d):必要により、操作(c)で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作(a)〜(c)を少なくとも1 回
繰り返す。
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド (B)と部分的に相補
的な配列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用い
て、下記の操作(a)〜(e)を行うことを特徴とする
核酸配列の増幅方法。 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)と
標的核酸配列(A)とのハイブリッドを形成させる。 操作(b):操作(a)で生成したハイブリッド中の隣
接した直鎖状プローブヌクレオチド(B)の5’末端と
3’末端を連結させ、環状ヌクレオチド(B’)とす
る。 操作(c):プライマーヌクレオチド(C)を操作
(b)で生成した環状プローブヌクレオチド(B’)と
アニールさせる。 操作(d):操作(c)で生成した環状ヌクレオチド
(B’)を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作(e):必要により、操作(d)で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作(a)〜(d)を少なくとも1 回
繰り返す。
に、図2に本発明の原理を模式的に示す。以下、図を用
いて本発明を説明する。尚、図中Aは標的核酸、Bは直
鎖状プローブヌクレオチド、B’は環状化プローブヌク
レオチド、Cはプライマーヌクレオチド、Dは核酸ポリ
メラーゼを示す。 操作(a):直鎖状プローブヌクレオチド(B)中の検
出配列と標的核酸(A)中の標的配列とのハイブリッド
を形成させる。同時に又は別々にプライマーヌクレオチ
ド(C)を該プローブヌクレオチド(B)にアニールさ
せる(図2(a)参照)。標的核酸が二重鎖の場合は加
熱、アルカリ処理、酸処理などにより変性して一本鎖と
する。加熱変性は例えば80〜105 ℃で1〜5分間処理す
ることで実施できる。アルカリ処理は例えば、0.2 〜1
規定のNaOH存在下で、1〜30分間処理し、等量のH
Clで中和して用いることができる。酸処理は例えば0.
01〜1規定のHCl存在下で、1〜30分処理し、NaO
Hで中和して用いることができる。他の方法として酵素
的に鎖分解を行なうこともできる。アニールは、好まし
くはプローブヌクレオチド(B)およびプライマーヌク
レオチド(C)について、それぞれ、最大のアニール選
択性をもたらすように、選択された温度において行う。
一般的には標的核酸(A)とプローブヌクレオチド
(B)、およびプローブヌクレオチド(B)とプライマ
ーヌクレオチド(C)がそれぞれ特異的に結合し、且つ
ミスマッチによる非特異的結合が最小となるように、昇
温させて行われる。
(B)の5’末端と3’末端を連結させ、環状化プロー
ブヌクレオチド(B’)とする(図2(b)参照)。該
プローブヌクレオチド(B)の5’末端と3’末端がハ
イブリッド形成の結果、隣接する場合、T4DNAリガ
ーゼ、T7DNAリガーゼ、大腸菌(E. coli) DNAリ
ガーゼ、Thermus thermophilus DNAリガーゼ等の連
結酵素を使用する方法が好ましい。また互いに隣接して
いない場合、DNAポリメラーゼおよび/または逆転写
酵素によりギャップを埋めた後、連結酵素により連結す
ることができる。この場合、ギャップ部分がA−Tペア
のみ、またはC−Gペアのみで構成されるようにプロー
ブヌクレオチド(B)を設計しておけば、添加するモノ
ヌクレオチドをそれぞれA,TまたはC,Gのみとする
ことでミスマッチによりアニールしたオリゴヌクレオチ
ドが間違って伸長されることを防止する方法もとること
ができる。連結酵素を使用する連結方法については、特
開昭63-22197号公報および WO90/01069 に開示の方法
等、公知の手法により行うことができる。本発明におい
て、標的核酸とアニールするオリゴヌクレオチド部分は
6〜40ヌクレオチド、好ましくは10〜30ヌクレオチドの
長さのものが使用される。
ーブヌクレオチド(B’)を鋳型に、また該プローブヌ
クレオチド(B’)にアニールしたプライマーヌクレオ
チド(C)を利用して、核酸ポリメラーゼ(D)を用い
て核酸合成反応を行う(図2(C)参照)。該操作は、
例えばdNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP の4 種のデオ
キシリボヌクレオチド) およびDNAポリメラーゼ(例
えばφ29DNAポリメラーゼ、M2DNAポリメラー
ゼ、T7DNAポリメラーゼ、Thermus aquaticus DN
Aポリメラーゼ、Thermus thermophilus DNAポリメ
ラーゼ等の核酸合成能力の高い酵素)を用いて、上記環
状ヌクレオチドを鋳型にして伸長反応を行わせることに
よって行われる。この方法は、例えばジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular
Biology; 56, 341-361, 1971 )に記載されている技術
及び条件を用いることができる。これらの酵素は、DN
Aの二重鎖の部分を剥しながらプライマー伸長物の合成
をすすめていくことができるので、当該操作に先だっ
て、必ずしも標的核酸(A)と環状化プローブヌクレオ
チド(B’)を分離する必要はない。プライマー伸長物
は、標的配列と相同な配列を有するので、該伸長物は操
作(a)における標的核酸(A)と同様にプローブヌク
レオチド(B)の標的核酸として利用されうる。この一
連の操作を繰り返すことにより核酸の特定の配列を簡便
に大量に得ることができる。また、プローブヌクレオチ
ド(B)、プライマーヌクレオチド(C)にそれぞれア
ンチプロモーター配列、プロモーター配列が含まれてい
る場合には、核酸ポリメラーゼとして、プロモーターに
応じたRNAポリメラーゼを用いることができる。当該
操作は、NTP(ATP, CTP, GTP, UTPの4種のリボヌク
レオチド)およびRNAポリメラーゼ(例えば、T7R
NAポリメラーゼ、T3RNAポリメラーゼ、SP6R
NAポリメラーゼなど)を用いて該環状ヌクレオチドを
鋳型にしてRNA合成反応を行わせることにより行われ
る。RNAポリメラーゼ反応の結果として、プローブヌ
クレオチド(B)の相補鎖が繰り返し並んだRNAが合
成されるが、このRNAを鋳型として逆転写酵素を用い
てcDNAを合成し、このcDNAにプライマーヌクレ
オチド(C)をアニールさせることにより、繰り返しR
NAポリメラーゼを作用させて大量にRNAを合成するこ
とも可能である。操作(d):必要により、操作(c)
で生成した増幅核酸配列を用いて、操作(a)〜(c)
を少なくとも一回繰り返す。
レオチド(B)の2つの末端が標的核酸(A)にアニー
ルして連結された場合にのみ増幅反応が行われる。した
がってオリゴヌクレオチドの塩基配列による特異性と、
2つの末端が連結される条件を満たす特異性の2つの特
異性が要求され、それだけ非特異反応が抑制される。し
たがって核酸の特定の配列のみを増幅することが可能で
ある。また、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラー
ゼを用いることにより、環状化したプローブヌクレオチ
ド1分子から複数の核酸配列が生成されるので、効率よ
く増幅することが可能である。生成した核酸配列を利用
して反応をサイクル化することにより、より大量に増幅
することもまた可能である。さらに、本発明の増幅法は
プローブを増幅する方法ではないので、ミスマッチや非
特異的ハイブリダイゼーションにより残存したプローブ
の増幅がなく、S/N(Signal/Noise)比を増加させる
ことができる。
ることによって、本発明の効果をより一層明確なものと
するが、本発明はこれらの実施例によって限定されな
い。 (実施例1 )各種オリゴヌクレオチドの合成 ABI 社DNA シンセサイザー391 型を用いて、ホスホアミ
ダイト法にて下記配列のオリゴヌクレオチドを合成し
た。プローブヌクレオチド(第一オリゴヌクレオチド
):本オリゴヌクレオチドは腸炎ビブリオTDH(Thermo
stable Direct Haemolysin) 遺伝子の87番目から 104番
目、および 105番目から 126番目のヌクレオチド配列、
T7プロモーター配列と相補的な配列を有する(配列表1
)。また、5’末端にリン酸基が結合している。プ
ライマーヌクレオチド(第二オリゴヌクレオチド):
本オリゴヌクレオチドはT7プロモーターの配列を有する
(配列表2 )。手法はABI 社マニュアルに従い、0.2 μ
M スケールで実施した。各種オリゴヌクレオチドの脱保
護はアンモニア水で55℃で一夜実施した。精製はファル
マシア社製FPLCで逆相カラムにて実施した。なお合成し
たオリゴヌクレオチドは必要により以下の方法で5'末端
にリン酸基を結合させた。 オリゴヌクレオチド 5 〜 20 pmoles 10×T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液 10 μl 1 mM ATP 1 μl T4ポリヌクレオチドキナーゼ 10 単位 水を加えて全量を100 μl として、37℃で 1時間反応さ
せる。ここで、10×T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液
とは、 0.5M Tris-HCl(pH8.0) 0.1M MgCl2 0.1M 2-メルカプトエタノール を示す。
ット (ア)実施例1 の第一オリゴヌクレオチド (イ)実施例1 の第二オリゴヌクレオチド (ウ)T4 DNAリガーゼ(東洋紡製)、T7 RNAポリメラー
ゼ(東洋紡製)、ATP 、CTP 、GTP 、UTP
的核酸の増幅方法(1) 操作(a) 実施例1 の第一オリゴヌクレオチド0.1mol
と、TDH 産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精
製したゲノム核酸1 μg とを共に10μl のリガーゼ用反
応液に加えた。94℃に 2分間保った後、50℃に5 分間保
温し、アニールさせた。リガーゼ用反応液 66 mM Tris-HCl(pH7.6) 6.6 mM MgCl2 10 mM ジチオスレイトール 66μM ATP 操作(b) 上記反応液10μl に、第二オリゴヌクレオチド
0.1nmol を加え、操作(a) と同様の操作により、環状
化した第一オリゴヌクレオチドにアニールさせた。 操作(c) 次に、T4 DNAリガーゼ 1単位(東洋紡製)を加
え、37℃で 1時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの
5'末端と3'末端を連結させた。 操作(d)上記反応液に水40μl 、T7 RNAポリメラーゼ反
応液50μl 、およびT7 RNAポリメラーゼ 10 単位を加
え、操作(b) で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型
として、37℃で30分間保温することにより増幅反応を実
施した。 T7 RNAポリメラーゼ反応液 80 mM Tris-HCl(pH8.0) 10 mM ジチオスレイトール 4 mM スペルミジン 8 mM MgCl2 50 mM NaCl 160 μg/ml BSA 0.02 % トリトン X-100 2 mM ATP, CTP, GTP, UTP 操作(e) その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジ
ウムブロマイド染色法により合成された RNAを確認し
た。結果は113merより高分子側に、スメア上にRNA が合
成されていた。これは、第一オリゴヌクレオチドが連結
され、この環状分子を鋳型として鋳型より長いRNA 分子
が合成されたことを示している。
的核酸の増幅方法(2) 操作(a) 実施例1 の第一オリゴヌクレオチド0.1nmol
と第二オリゴヌクレオチド 0.1nmolとを10μl のリガ
ーゼ用反応液に加えた。94℃に2 分間保った後50℃に5
分間保温し、アニールさせた。 操作(b) 上記反応液に、TDH 産性腸炎ビブリオの培養菌
体から分離、部分精製したゲノム核酸1 μg を加え第一
オリゴヌクレオチドとアニールさせ、T4 DNAリガーゼ
1単位(東洋紡製)を加え、37℃で1 時間反応させるこ
とにより、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3'末端を
連結させた。 操作(c) 上記反応液10μl に水40μl 、T7 RNAポリメラ
ーゼ反応液50μl 、およびT7 RNAポリメラーゼ 10 単位
を加え、操作(b) で連結した環状オリゴヌクレオチドを
鋳型として、37℃で30分間保温することにより増幅反応
を実施した。 操作(d) その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジ
ウムブロマイド染色法により合成されたRNA を確認し
た。結果は113merより高分子側に、スメア上にRNA が合
成されていた。これは、第一オリゴヌクレオチドが連結
され、この環状分子を鋳型として鋳型より長いRNA 分子
が合成されたことを示している。
的核酸の増幅方法(3) 操作(a) 実施例1 の第一オリゴヌクレオチド0.1mol
と第二オリゴヌクレオチド 0.1nmolとを、TDH 産性腸
炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲノム核
酸 1μg と共に10μl のリガーゼ用反応液に加えた。94
℃に2 分間保った後、50℃に5 分間保温し、アニールさ
せた。 操作(b) 次に、T4 DNAリガーゼ 1単位(東洋紡製)を加
え、37℃で 1時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの
5'末端と3'末端を連結させた。 操作(c) 上記反応液10μl に水40μl 、下記反応液50μ
l 、およびT7 RNAポリメラーゼ10 単位を加え、操作(b)
で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、増
幅反応を実施した。 操作(d) その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジ
ウムブロマイド染色法により合成されたRNA を確認し
た。結果は113merより高分子側に、スメア上にRNA が合
成されていた。これは、第一オリゴヌクレオチドが連結
され、この環状分子を鋳型として鋳型より長いRNA分子
が合成されたことを示している。
産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲ
ノム核酸1 μg とを共に10μl のリガーゼ用反応液に加
えた。94℃に2 分間保った後50℃に5 分間保温し、アニ
ールさせた。 操作(b) 次に、T4 DNAリガーゼ 1単位(東洋紡製)を加え37℃で
1時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3'
末端を連結させた。 操作(c) 上記反応液10μl に、第二オリゴヌクレオチド0.1nmo
l を加え、操作(a) と同様の操作により、環状化した第
一オリゴヌクレオチドにアニールさせた。次に反応液
に水40μl 、下記反応液50μl 、およびT7 RNAポリメラ
ーゼ 10 単位を加え、操作(b) で連結した環状オリゴヌ
クレオチドを鋳型として、37℃で30分間保温することに
より増幅反応を実施した。 操作(d) その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロ
マイド染色法により合成されたDNA を確認した。結果は
113merより高分子側に、スメア上にRNA が合成されてい
た。これは、第一オリゴヌクレオチドが連結され、この
環状分子を鋳型として鋳型より長いRNA 分子が合成され
たことを示している。 (実施例7) 標的核酸を増幅するためのキット(2) (ア)実施例1の第一オリゴヌクレオチド (イ)実施例1の第二オリゴヌクレオチド (ウ)T4 DNAリガーゼ(東洋紡製)、Tth DNA ポリメラ
ーゼ(東洋紡製)、dATP、dCTP、dGTP、dTTP (実施例8) 実施例7のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法 操作(a) 実施例1の第一オリゴヌクレオチド0.1mol と、TDH
産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲ
ノム核酸1μg とを共に10μl のリガーゼ用反応液に加
えた。94℃に2分間保った後50℃に5分間保温し、アニ
ールさせた。対照として、ゲノム核酸を混合しない反応
液を用意した。 リガーゼ用反応液 66 mM Tris-HCL (pH7.6) 6.6 mM MgCl2 10 mM ジチオスレイトール 66 μM ATP 操作(b) 上記反応液10μlに、第二オリゴヌクレオチド0.1 mo
l を加え、操作(a) と同様の操作により、環状化した第
一オリゴヌクレオチドにアニールさせた。 操作(c) 次に、T4 DNAリガーゼ 1単位(東洋紡製)を加え37℃で
1時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3'
末端を連結させた。 操作(d) 上記反応液に水40μl 、Tth DNA ポリメラーゼ反応液50
μl 、およびTth DNAポリメラーゼ4単位を加え、操作
(c) で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、
75℃で60分間保温することにより増幅反応を実施した。 67 mM Tris-HCL (pH8.8) 16.6 mM (NH4)2SO4 6.7 mM MgCl2 2 mM dATP, dGTP, dTTP, dCTP その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロ
マイド染色法により合成されたDNA を確認した。結果は
113merより高分子側に、スメア上にRNA が合成されてい
た。これは、第一オリゴヌクレオチドが連結され、この
環状分子を鋳型として鋳型より長いRNA 分子が合成され
たことを示している。
olysin) 遺伝子の105番目から 126番目の配列と相補的
な配列 存在位置:92..113 他の特徴:腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haem
olysin) 遺伝子の87番目から 104番目の配列と相補的な
配列 配列 GATGAGATAT TGTTTGTTGT TCAAATCTCC CTATAGTGAG TCGTATTAAA ACTATTCTAT 60 AGTGTCACCT AAATGATCCA CTAGTTCTAG AGCGGTTTCC TGCCCCCGGT TCT 113
ド)の構造を示した図である。
RNAの電気泳動パターンを示す。
を示す図である。
(プローブヌクレオチド)、B’は環状化した第一オリ
ゴヌクレオチド、Cは第二オリゴヌクレオチド(プライ
マーヌクレオチド)およびDは核酸ポリメラーゼを示
す。 図3中、レーン1、2、3および4はそれぞれ実施例
3、4、5および6の試料に対応している。矢印は、鋳
型として用いた第一オリゴヌクレオチドの位置を示す。 図4中、レーン1は反応液中にゲノム核酸を加えた場
合、レーン2は加えなかった場合を示す。
Claims (6)
- 【請求項1】 検体試料中の標的核酸配列(A)の存在
の結果として環状化するように設計された配列を有する
直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくともこの
直鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な
配列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、
標的核酸配列(A)に直鎖状プローブヌクレオチド
(B)をハイブリダイズさせ、直鎖状プローブヌクレオ
チド(B)を環状化し、生成した環状プローブヌクレオ
チド(B’)を鋳型として、プライマーヌクレオチド
(C)を利用し、鋳型と相補的な配列の繰り返した配列
を有する一本鎖核酸を生成させることにより、核酸配列
を増幅させることを特徴とする核酸配列の増幅方法。 - 【請求項2】 検体試料中の標的核酸配列(A)の存在
の結果として環状化するように設計された配列を有する
直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくとも該直
鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配
列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、下
記の操作(a)〜(e)を行うことを特徴とする核酸配
列の増幅方法。 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)と
標的核酸配列(A)とのハイブリッドを形成させる。 操作(b):プライマーヌクレオチド(C)を操作
(a)で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチ
ド(B)とアニールさせる。 操作(c):操作(b)で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド(B)の5’末端と3’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド(B’)とする。 操作(d):操作(c)で生成した環状ヌクレオチド
(B’)を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作(e):必要により、操作(d)で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作(a)〜(d)を少なくとも1 回
繰り返す。 - 【請求項3】 検体試料中の標的核酸配列(A)の存在
の結果として環状化するように設計された配列を有する
直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくとも該直
鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配
列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、下
記の操作(a)〜(e)を行うことを特徴とする核酸配
列の増幅方法。 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)と
プライマーヌクレオチド(C)とのハイブリッドを形成
させる。 操作(b):検体試料中の標的核酸(A)を、操作
(a)で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチ
ド(B)とアニールさせる。 操作(c):操作(b)で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド(B)の5’末端と3’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド(B’)とする。 操作(d):操作(c)で生成した環状ヌクレオチド
(B’)を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作(e):必要により、操作(d)で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作(a)〜(d)を少なくとも1 回
繰り返す。 - 【請求項4】 検体試料中の標的核酸配列(A)の存在
の結果として環状化するように設計された配列を有する
直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくとも該直
鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配
列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、下
記の操作(a)〜(d)を行うことを特徴とする核酸配
列の増幅方法。 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)、
標的核酸配列(A)およびプライマーヌクレオチド
(C)とのハイブリッドを形成させる。 操作(b):操作(a)で生成したハイブリッド中の直
鎖状プローブヌクレオチド(B)の5’末端と3’末端
を連結させ、環状ヌクレオチド(B’)とする。 操作(c):操作(b)で生成した環状ヌクレオチド
(B’)を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作(d):必要により、操作(c)で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作(a)〜(c)を少なくとも1 回
繰り返す。 - 【請求項5】 検体試料中の標的核酸配列(A)の存在
の結果として環状化するように設計された配列を有する
直鎖状プローブヌクレオチド(B)と、少なくとも該直
鎖状プローブヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配
列を有するプライマーヌクレオチド(C)を用いて、下
記の操作(a)〜(e)を行うことを特徴とする核酸配
列の増幅方法。 操作(a):上記直鎖状プローブヌクレオチド(B)と
標的核酸配列(A)とのハイブリッドを形成させる。 操作(b):操作(a)で生成したハイブリッド中の隣
接した直鎖状プローブヌクレオチド(B)の5’末端と
3’末端を連結させ、環状ヌクレオチド(B’)とす
る。 操作(c):プライマーヌクレオチド(C)を操作
(b)で生成した環状プローブヌクレオチド(B’)と
アニールさせる。 操作(d):操作(c)で生成した環状ヌクレオチド
(B’)を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド(C)を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作(e):必要により、操作(d)で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作(a)〜(d)を少なくとも1 回
繰り返す。 - 【請求項6】 検体試料中の標的核酸配列(A)の存在
の結果として環状化するように設計された配列を有する
直鎖状プローブヌクレオチド(B)、該直鎖状プローブ
ヌクレオチド(B)と部分的に相補的な配列を有するプ
ライマーヌクレオチド(C)、連結手段、核酸ポリメラ
ーゼおよびヌクレオチド三リン酸を含む核酸増幅用試薬
キット。
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JP03046193A Expired - Lifetime JP3080178B2 (ja) | 1991-02-18 | 1991-02-18 | 核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キット |
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