JP3080178B2 - 核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キット - Google Patents
核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キットInfo
- Publication number
- JP3080178B2 JP3080178B2 JP03046193A JP4619391A JP3080178B2 JP 3080178 B2 JP3080178 B2 JP 3080178B2 JP 03046193 A JP03046193 A JP 03046193A JP 4619391 A JP4619391 A JP 4619391A JP 3080178 B2 JP3080178 B2 JP 3080178B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- nucleic acid
- nucleotide
- sequence
- acid sequence
- linear probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は核酸の増幅方法およびそ
のための試薬キットに関する。この発明は特に、塩基配
列が既知の核酸を、その初期に存在する量に比較して、
より大量に生成させる方法に関する。本発明を実施する
ことにより、遺伝病、癌、感染症などの診断を行うこと
が容易となる。
のための試薬キットに関する。この発明は特に、塩基配
列が既知の核酸を、その初期に存在する量に比較して、
より大量に生成させる方法に関する。本発明を実施する
ことにより、遺伝病、癌、感染症などの診断を行うこと
が容易となる。
【０００２】
【従来技術】近年、ハイブリダイゼーションによる核酸
の検出は遺伝病、癌、感染症などの診断のために有効な
手段として汎用されるようになってきた。核酸検出法に
おいて、標的とする塩基配列は、対象となる核酸のほん
の僅かな部分である場合があり、非放射性標識プローブ
や末端を放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチドプ
ローブを用いた検出法では、感度上の問題等によりその
検出が困難である。そのため、プローブ検出システムの
感度を向上させるための努力が多くなされている（WO87
/03622など）。また、感度向上の手段として、標的とす
る核酸をＤＮＡポリメラーゼにより増幅させる方法（特
開昭61-274697号公報；以下「PCR」と略すことがある）
が開示されている。しかし、この方法では複雑な温度の
調節が必要であり、専用の機器を必要とするという欠点
がある。 ＤＮＡリガーゼを用いる増幅法も開示され
ている(WO89/12696 、特開平2-2934号公報など) 。しか
し、これらの方法ではＤＮＡリガーゼが平滑末端を連結
する反応 (blunt end ligation) により非特異的増幅が
起こる。この問題の回避法として、WO89/12696では３組
以上のプローブを用いているが、プローブ数が多くコス
ト高となってしまう欠点がある。また、ＲＮＡポリメラ
ーゼを用いてＤＮＡよりＲＮＡが生成されることは周知
であり、ＲＮＡポリメラーゼを用いて核酸の増幅を行う
方法も開示されている(WO89/01050)。しかしながら、こ
の方法ではＲＮＡポリメラーゼによる転写増幅のみでは
充分な増幅は困難である。従って、生成したＲＮＡに再
度逆転写酵素を作用させＤＮＡを生成させる操作を実施
している。一方、標的とする核酸にプローブをハイブリ
ダイズさせた後、正しくハイブリダイズしたプローブの
みを増幅する方法（BIO/TECHNOLOGY vol.6, 1197, 198
8）も知られている。しかしこの方法では、非特異反応
により結合したプローブも増幅され、ブランク値の上昇
をきたすという問題がある。
の検出は遺伝病、癌、感染症などの診断のために有効な
手段として汎用されるようになってきた。核酸検出法に
おいて、標的とする塩基配列は、対象となる核酸のほん
の僅かな部分である場合があり、非放射性標識プローブ
や末端を放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチドプ
ローブを用いた検出法では、感度上の問題等によりその
検出が困難である。そのため、プローブ検出システムの
感度を向上させるための努力が多くなされている（WO87
/03622など）。また、感度向上の手段として、標的とす
る核酸をＤＮＡポリメラーゼにより増幅させる方法（特
開昭61-274697号公報；以下「PCR」と略すことがある）
が開示されている。しかし、この方法では複雑な温度の
調節が必要であり、専用の機器を必要とするという欠点
がある。 ＤＮＡリガーゼを用いる増幅法も開示され
ている(WO89/12696 、特開平2-2934号公報など) 。しか
し、これらの方法ではＤＮＡリガーゼが平滑末端を連結
する反応 (blunt end ligation) により非特異的増幅が
起こる。この問題の回避法として、WO89/12696では３組
以上のプローブを用いているが、プローブ数が多くコス
ト高となってしまう欠点がある。また、ＲＮＡポリメラ
ーゼを用いてＤＮＡよりＲＮＡが生成されることは周知
であり、ＲＮＡポリメラーゼを用いて核酸の増幅を行う
方法も開示されている(WO89/01050)。しかしながら、こ
の方法ではＲＮＡポリメラーゼによる転写増幅のみでは
充分な増幅は困難である。従って、生成したＲＮＡに再
度逆転写酵素を作用させＤＮＡを生成させる操作を実施
している。一方、標的とする核酸にプローブをハイブリ
ダイズさせた後、正しくハイブリダイズしたプローブの
みを増幅する方法（BIO/TECHNOLOGY vol.6, 1197, 198
8）も知られている。しかしこの方法では、非特異反応
により結合したプローブも増幅され、ブランク値の上昇
をきたすという問題がある。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、標的
とする核酸を簡便に増幅させる方法を提供することであ
る。
とする核酸を簡便に増幅させる方法を提供することであ
る。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らはこれらの課
題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、プローブとして
標的核酸の存在下でのみ環状となりうるヌクレオチドを
用いることにより、上記課題が解決されることを見出し
て、本発明を完成させるに到った。即ち、本発明は検体
試料中の標的核酸配列（Ａ）の存在の結果として環状化
するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌク
レオチド（Ｂ）と、少なくともこの直鎖状プローブヌク
レオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配列を有するプライ
マーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、標的核酸配列（Ａ）
に直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）をハイブリダイズ
させ、直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）を環状化し、
生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型と
し、プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し、鋳型と相
補的な配列の繰り返した配列を有する一本鎖核酸を生成
させることにより、核酸配列を増幅させることを特徴と
する核配列の増幅方法である。また本発明の核酸を増幅
するための試薬キットは、検体試料中の標的核酸配列
（Ａ）の存在の結果として環状化するように設計された
配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、該直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配
列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）、連結手段、
核酸ポリメラーゼおよびヌクレオチド三リン酸を含む核
酸増幅用試薬キットである。
題を解決すべく鋭意研究を進めた結果、プローブとして
標的核酸の存在下でのみ環状となりうるヌクレオチドを
用いることにより、上記課題が解決されることを見出し
て、本発明を完成させるに到った。即ち、本発明は検体
試料中の標的核酸配列（Ａ）の存在の結果として環状化
するように設計された配列を有する直鎖状プローブヌク
レオチド（Ｂ）と、少なくともこの直鎖状プローブヌク
レオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配列を有するプライ
マーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、標的核酸配列（Ａ）
に直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）をハイブリダイズ
させ、直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）を環状化し、
生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型と
し、プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用し、鋳型と相
補的な配列の繰り返した配列を有する一本鎖核酸を生成
させることにより、核酸配列を増幅させることを特徴と
する核配列の増幅方法である。また本発明の核酸を増幅
するための試薬キットは、検体試料中の標的核酸配列
（Ａ）の存在の結果として環状化するように設計された
配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、該直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配
列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）、連結手段、
核酸ポリメラーゼおよびヌクレオチド三リン酸を含む核
酸増幅用試薬キットである。
【０００５】本発明では、検出したい標的配列とハイブ
リッドを形成することにより、リガ9 ゼを用いて環状化
することが可能となるように設計された核酸分子を使用
し、該環状化した核酸分子を鋳型として、ポリメラーゼ
反応により核酸配列を増幅させる。本発明における標的
核酸（Ａ）は、単鎖でも二重鎖でもよく、比較的純粋な
状態であっても、核酸の混合物の一成分であってもよ
い。本発明に関する標的核酸の配列は長さ、構造等に特
に制限されない。
リッドを形成することにより、リガ9 ゼを用いて環状化
することが可能となるように設計された核酸分子を使用
し、該環状化した核酸分子を鋳型として、ポリメラーゼ
反応により核酸配列を増幅させる。本発明における標的
核酸（Ａ）は、単鎖でも二重鎖でもよく、比較的純粋な
状態であっても、核酸の混合物の一成分であってもよ
い。本発明に関する標的核酸の配列は長さ、構造等に特
に制限されない。
【０００６】本発明におけるプローブヌクレオチド
（Ｂ）とは、検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の存在の
結果として環状化するように設計された配列を有する直
鎖状プローブヌクレオチドである（図１および図２のＢ
参照）。プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’
末端は図２に示されるように、標的核酸とアニールする
部分を有する。該アニール部分は、それぞれ６〜40ヌク
レオチド、好ましくは各々10〜30ヌクレオチドの長さが
使用される。５’末端と３’末端に位置する上記アニー
ル部分間を結ぶ配列の長さは、一般的に１〜1000個、好
ましくは10〜100 個のヌクレオチドであればよい。ま
た、この領域にＲＮＡポリメラーゼのアンチプロモータ
ー配列を含ませることも可能である。このＲＮＡポリメ
ラーゼのアンチプロモーター配列を持ったプローブヌク
レオチドを用いた場合、プライマーヌクレオチドとして
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を持つヌクレオ
チドを用いることにより、プロモーターに応じたＲＮＡ
ポリメラーゼ、およびリボヌクレオチド(ATP, CTP, GT
P, UTP)を作用させれば、プローブヌクレオチドの相補
鎖が繰り返し並んだＲＮＡを合成することが可能であ
る。
（Ｂ）とは、検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の存在の
結果として環状化するように設計された配列を有する直
鎖状プローブヌクレオチドである（図１および図２のＢ
参照）。プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’
末端は図２に示されるように、標的核酸とアニールする
部分を有する。該アニール部分は、それぞれ６〜40ヌク
レオチド、好ましくは各々10〜30ヌクレオチドの長さが
使用される。５’末端と３’末端に位置する上記アニー
ル部分間を結ぶ配列の長さは、一般的に１〜1000個、好
ましくは10〜100 個のヌクレオチドであればよい。ま
た、この領域にＲＮＡポリメラーゼのアンチプロモータ
ー配列を含ませることも可能である。このＲＮＡポリメ
ラーゼのアンチプロモーター配列を持ったプローブヌク
レオチドを用いた場合、プライマーヌクレオチドとして
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を持つヌクレオ
チドを用いることにより、プロモーターに応じたＲＮＡ
ポリメラーゼ、およびリボヌクレオチド(ATP, CTP, GT
P, UTP)を作用させれば、プローブヌクレオチドの相補
鎖が繰り返し並んだＲＮＡを合成することが可能であ
る。
【０００７】本発明のプライマーヌクレオチド（Ｃ）
は、プローブヌクレオチド（Ｂ）と少なくとも部分的に
相補的な配列を有していれば、構造、長さなどに制限さ
れない。長さは一般的には、６〜40ヌクレオチド、好ま
しくは10〜30ヌクレオチドが使用される。また、プロー
ブヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼのアンチプロモー
ター配列を含む場合には、プライマーヌクレオチドにプ
ロモーター配列を含ませたものを使用することが可能で
ある。これらのオリゴヌクレオチド（Ｂ）および（Ｃ）
は、例えばＡＢＩ社（Applied Biosystems Inc. ）のＤ
ＮＡシンセサイザー 391型を用いて、ホスホアミダイト
法により合成できる。他にもリン酸トリエステル法、Ｈ
−ホスホネート法、チオホスファイト法等いかなる方法
で合成してもよい。また、生物学的起源、例えば制限エ
ンドヌクレアーゼ消化物から単離してもよい。プローブ
ヌクレオチド（Ｂ）の５’末端にはリン酸基を付加して
おくことが好ましい。リン酸基の付加は、例えばＡＴＰ
の存在下で、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより行う
ことができる。
は、プローブヌクレオチド（Ｂ）と少なくとも部分的に
相補的な配列を有していれば、構造、長さなどに制限さ
れない。長さは一般的には、６〜40ヌクレオチド、好ま
しくは10〜30ヌクレオチドが使用される。また、プロー
ブヌクレオチドがＲＮＡポリメラーゼのアンチプロモー
ター配列を含む場合には、プライマーヌクレオチドにプ
ロモーター配列を含ませたものを使用することが可能で
ある。これらのオリゴヌクレオチド（Ｂ）および（Ｃ）
は、例えばＡＢＩ社（Applied Biosystems Inc. ）のＤ
ＮＡシンセサイザー 391型を用いて、ホスホアミダイト
法により合成できる。他にもリン酸トリエステル法、Ｈ
−ホスホネート法、チオホスファイト法等いかなる方法
で合成してもよい。また、生物学的起源、例えば制限エ
ンドヌクレアーゼ消化物から単離してもよい。プローブ
ヌクレオチド（Ｂ）の５’末端にはリン酸基を付加して
おくことが好ましい。リン酸基の付加は、例えばＡＴＰ
の存在下で、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼにより行う
ことができる。
【０００８】本発明で使用される核酸ポリメラーゼは、
ヘリカーゼ様活性を持つ核酸ポリメラーゼであれば、Ｄ
ＮＡポリメラーゼであっても、ＲＮＡポリメラーゼであ
ってもよい。例えばφ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いれ
ば、環状核酸分子を鋳型として、鋳型と相補的な配列が
繰り返し並んだ核酸を合成することが可能である（J.Bi
ol. Chem. 264, 8935, 1989 ）。他にも、Ｍ２ＤＮＡポ
リメラーゼ、E. coli ＤＮＡポリメラーゼIII 、Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６Ｒ
ＮＡポリメラーゼなどが利用できる。
ヘリカーゼ様活性を持つ核酸ポリメラーゼであれば、Ｄ
ＮＡポリメラーゼであっても、ＲＮＡポリメラーゼであ
ってもよい。例えばφ２９ＤＮＡポリメラーゼを用いれ
ば、環状核酸分子を鋳型として、鋳型と相補的な配列が
繰り返し並んだ核酸を合成することが可能である（J.Bi
ol. Chem. 264, 8935, 1989 ）。他にも、Ｍ２ＤＮＡポ
リメラーゼ、E. coli ＤＮＡポリメラーゼIII 、Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６Ｒ
ＮＡポリメラーゼなどが利用できる。
【０００９】本発明の核酸増幅方法は、標的核酸配列
（Ａ）に上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）をハイ
ブリダイズさせ、直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）を
環状化し、生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）
を鋳型として、プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
し、鋳型と相補的な配列の繰り返した配列を有する一本
鎖核酸を生成させることにより核酸配列を増幅させる。
（Ａ）に上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）をハイ
ブリダイズさせ、直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）を
環状化し、生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）
を鋳型として、プライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
し、鋳型と相補的な配列の繰り返した配列を有する一本
鎖核酸を生成させることにより核酸配列を増幅させる。
【００１０】本発明の核酸増幅法としては、次のような
実施態様が挙げられる。（１）検体試料中の標的核酸配
列（Ａ）の存在の結果として環状化するように設計され
た配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、
少なくとも該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分
的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド
（Ｃ）を用いて、下記の操作（ａ）〜（ｅ）を行うこと
を特徴とする核酸配列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作
（ａ）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチ
ド（Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド
（Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも1 回
繰り返す。
実施態様が挙げられる。（１）検体試料中の標的核酸配
列（Ａ）の存在の結果として環状化するように設計され
た配列を有する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、
少なくとも該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分
的に相補的な配列を有するプライマーヌクレオチド
（Ｃ）を用いて、下記の操作（ａ）〜（ｅ）を行うこと
を特徴とする核酸配列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作
（ａ）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチ
ド（Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド
（Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも1 回
繰り返す。
【００１１】（２）検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用い
て、下記の操作（ａ）〜（ｅ）を行うことを特徴とする
核酸配列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
プライマーヌクレオチド（Ｃ）とのハイブリッドを形成
させる。 操作（ｂ）：検体試料中の標的核酸（Ａ）を、操作
（ａ）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチ
ド（Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（b ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド
（Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも1 回
繰り返す。
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用い
て、下記の操作（ａ）〜（ｅ）を行うことを特徴とする
核酸配列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
プライマーヌクレオチド（Ｃ）とのハイブリッドを形成
させる。 操作（ｂ）：検体試料中の標的核酸（Ａ）を、操作
（ａ）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチ
ド（Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（b ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド
（Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも1 回
繰り返す。
【００１２】（３）検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用い
て、下記の操作（ａ）〜（ｄ）を行うことを特徴とする
核酸配列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、
標的核酸配列（Ａ）およびプライマーヌクレオチド
（Ｃ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端
を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成した環状ヌクレオチド
（Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作（ｄ）：必要により、操作（ｃ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｃ）を少なくとも1 回
繰り返す。
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的
な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用い
て、下記の操作（ａ）〜（ｄ）を行うことを特徴とする
核酸配列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、
標的核酸配列（Ａ）およびプライマーヌクレオチド
（Ｃ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端
を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成した環状ヌクレオチド
（Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作（ｄ）：必要により、操作（ｃ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｃ）を少なくとも1 回
繰り返す。
【００１３】（４）検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド （Ｂ）と部分的に相補
的な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用い
て、下記の操作（ａ）〜（ｅ）を行うことを特徴とする
核酸配列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の隣
接した直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と
３’末端を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とす
る。 操作（ｃ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作
（ｂ）で生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）と
アニールさせる。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド
（Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも1 回
繰り返す。
存在の結果として環状化するように設計された配列を有
する直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも
該直鎖状プローブヌクレオチド （Ｂ）と部分的に相補
的な配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用い
て、下記の操作（ａ）〜（ｅ）を行うことを特徴とする
核酸配列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の隣
接した直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と
３’末端を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とす
る。 操作（ｃ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作
（ｂ）で生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）と
アニールさせる。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド
（Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも1 回
繰り返す。
【００１４】本発明の上記実施態様（３）の理解のため
に、図２に本発明の原理を模式的に示す。以下、図を用
いて本発明を説明する。尚、図中Ａは標的核酸、Ｂは直
鎖状プローブヌクレオチド、Ｂ’は環状化プローブヌク
レオチド、Ｃはプライマーヌクレオチド、Ｄは核酸ポリ
メラーゼを示す。 操作（ａ）：直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）中の検
出配列と標的核酸（Ａ）中の標的配列とのハイブリッド
を形成させる。同時に又は別々にプライマーヌクレオチ
ド（Ｃ）を該プローブヌクレオチド（Ｂ）にアニールさ
せる（図２（ａ）参照）。標的核酸が二重鎖の場合は加
熱、アルカリ処理、酸処理などにより変性して一本鎖と
する。加熱変性は例えば80〜105 ℃で１〜５分間処理す
ることで実施できる。アルカリ処理は例えば、0.2 〜１
規定のＮａＯＨ存在下で、１〜30分間処理し、等量のＨ
Ｃｌで中和して用いることができる。酸処理は例えば0.
01〜１規定のＨＣｌ存在下で、１〜30分処理し、ＮａＯ
Ｈで中和して用いることができる。他の方法として酵素
的に鎖分解を行なうこともできる。アニールは、好まし
くはプローブヌクレオチド（Ｂ）およびプライマーヌク
レオチド（Ｃ）について、それぞれ、最大のアニール選
択性をもたらすように、選択された温度において行う。
一般的には標的核酸（Ａ）とプローブヌクレオチド
（Ｂ）、およびプローブヌクレオチド（Ｂ）とプライマ
ーヌクレオチド（Ｃ）がそれぞれ特異的に結合し、且つ
ミスマッチによる非特異的結合が最小となるように、昇
温させて行われる。
に、図２に本発明の原理を模式的に示す。以下、図を用
いて本発明を説明する。尚、図中Ａは標的核酸、Ｂは直
鎖状プローブヌクレオチド、Ｂ’は環状化プローブヌク
レオチド、Ｃはプライマーヌクレオチド、Ｄは核酸ポリ
メラーゼを示す。 操作（ａ）：直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）中の検
出配列と標的核酸（Ａ）中の標的配列とのハイブリッド
を形成させる。同時に又は別々にプライマーヌクレオチ
ド（Ｃ）を該プローブヌクレオチド（Ｂ）にアニールさ
せる（図２（ａ）参照）。標的核酸が二重鎖の場合は加
熱、アルカリ処理、酸処理などにより変性して一本鎖と
する。加熱変性は例えば80〜105 ℃で１〜５分間処理す
ることで実施できる。アルカリ処理は例えば、0.2 〜１
規定のＮａＯＨ存在下で、１〜30分間処理し、等量のＨ
Ｃｌで中和して用いることができる。酸処理は例えば0.
01〜１規定のＨＣｌ存在下で、１〜30分処理し、ＮａＯ
Ｈで中和して用いることができる。他の方法として酵素
的に鎖分解を行なうこともできる。アニールは、好まし
くはプローブヌクレオチド（Ｂ）およびプライマーヌク
レオチド（Ｃ）について、それぞれ、最大のアニール選
択性をもたらすように、選択された温度において行う。
一般的には標的核酸（Ａ）とプローブヌクレオチド
（Ｂ）、およびプローブヌクレオチド（Ｂ）とプライマ
ーヌクレオチド（Ｃ）がそれぞれ特異的に結合し、且つ
ミスマッチによる非特異的結合が最小となるように、昇
温させて行われる。
【００１５】操作（ｂ）：上記プローブヌクレオチド
（Ｂ）の５’末端と３’末端を連結させ、環状化プロー
ブヌクレオチド（Ｂ’）とする（図２（ｂ）参照）。該
プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端がハ
イブリッド形成の結果、隣接する場合、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、大腸菌(E. coli) ＤＮＡリ
ガーゼ、Thermus thermophilus ＤＮＡリガーゼ等の連
結酵素を使用する方法が好ましい。また互いに隣接して
いない場合、ＤＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写
酵素によりギャップを埋めた後、連結酵素により連結す
ることができる。この場合、ギャップ部分がＡ−Ｔペア
のみ、またはＣ−Ｇペアのみで構成されるようにプロー
ブヌクレオチド（Ｂ）を設計しておけば、添加するモノ
ヌクレオチドをそれぞれＡ，ＴまたはＣ，Ｇのみとする
ことでミスマッチによりアニールしたオリゴヌクレオチ
ドが間違って伸長されることを防止する方法もとること
ができる。連結酵素を使用する連結方法については、特
開昭63-22197号公報および WO90/01069 に開示の方法
等、公知の手法により行うことができる。本発明におい
て、標的核酸とアニールするオリゴヌクレオチド部分は
６〜40ヌクレオチド、好ましくは10〜30ヌクレオチドの
長さのものが使用される。
（Ｂ）の５’末端と３’末端を連結させ、環状化プロー
ブヌクレオチド（Ｂ’）とする（図２（ｂ）参照）。該
プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端がハ
イブリッド形成の結果、隣接する場合、Ｔ４ＤＮＡリガ
ーゼ、Ｔ７ＤＮＡリガーゼ、大腸菌(E. coli) ＤＮＡリ
ガーゼ、Thermus thermophilus ＤＮＡリガーゼ等の連
結酵素を使用する方法が好ましい。また互いに隣接して
いない場合、ＤＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写
酵素によりギャップを埋めた後、連結酵素により連結す
ることができる。この場合、ギャップ部分がＡ−Ｔペア
のみ、またはＣ−Ｇペアのみで構成されるようにプロー
ブヌクレオチド（Ｂ）を設計しておけば、添加するモノ
ヌクレオチドをそれぞれＡ，ＴまたはＣ，Ｇのみとする
ことでミスマッチによりアニールしたオリゴヌクレオチ
ドが間違って伸長されることを防止する方法もとること
ができる。連結酵素を使用する連結方法については、特
開昭63-22197号公報および WO90/01069 に開示の方法
等、公知の手法により行うことができる。本発明におい
て、標的核酸とアニールするオリゴヌクレオチド部分は
６〜40ヌクレオチド、好ましくは10〜30ヌクレオチドの
長さのものが使用される。
【００１６】操作（ｃ）：操作（ｂ）で環状化したプロ
ーブヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型に、また該プローブヌ
クレオチド（Ｂ’）にアニールしたプライマーヌクレオ
チド（Ｃ）を利用して、核酸ポリメラーゼ（Ｄ）を用い
て核酸合成反応を行う（図２（Ｃ）参照）。該操作は、
例えばｄＮＴＰ(dATP, dCTP, dGTP, dTTP の4 種のデオ
キシリボヌクレオチド) およびＤＮＡポリメラーゼ（例
えばφ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍ２ＤＮＡポリメラー
ゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Thermus aquaticus ＤＮ
Ａポリメラーゼ、Thermus thermophilus ＤＮＡポリメ
ラーゼ等の核酸合成能力の高い酵素）を用いて、上記環
状ヌクレオチドを鋳型にして伸長反応を行わせることに
よって行われる。この方法は、例えばジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular
Biology; 56, 341-361, 1971 ）に記載されている技術
及び条件を用いることができる。これらの酵素は、ＤＮ
Ａの二重鎖の部分を剥しながらプライマー伸長物の合成
をすすめていくことができるので、当該操作に先だっ
て、必ずしも標的核酸（Ａ）と環状化プローブヌクレオ
チド（Ｂ’）を分離する必要はない。プライマー伸長物
は、標的配列と相同な配列を有するので、該伸長物は操
作（ａ）における標的核酸（Ａ）と同様にプローブヌク
レオチド（Ｂ）の標的核酸として利用されうる。この一
連の操作を繰り返すことにより核酸の特定の配列を簡便
に大量に得ることができる。また、プローブヌクレオチ
ド（Ｂ）、プライマーヌクレオチド（Ｃ）にそれぞれア
ンチプロモーター配列、プロモーター配列が含まれてい
る場合には、核酸ポリメラーゼとして、プロモーターに
応じたＲＮＡポリメラーゼを用いることができる。当該
操作は、ＮＴＰ（ATP, CTP, GTP, UTPの4種のリボヌク
レオチド）およびＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６Ｒ
ＮＡポリメラーゼなど）を用いて該環状ヌクレオチドを
鋳型にしてＲＮＡ合成反応を行わせることにより行われ
る。ＲＮＡポリメラーゼ反応の結果として、プローブヌ
クレオチド（Ｂ）の相補鎖が繰り返し並んだＲＮＡが合
成されるが、このＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用い
てｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡにプライマーヌクレ
オチド（Ｃ）をアニールさせることにより、繰り返しＲ
ＮＡポリメラーゼを作用させて大量にRNAを合成するこ
とも可能である。操作（ｄ）：必要により、操作（ｃ）
で生成した増幅核酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｃ）
を少なくとも一回繰り返す。
ーブヌクレオチド（Ｂ’）を鋳型に、また該プローブヌ
クレオチド（Ｂ’）にアニールしたプライマーヌクレオ
チド（Ｃ）を利用して、核酸ポリメラーゼ（Ｄ）を用い
て核酸合成反応を行う（図２（Ｃ）参照）。該操作は、
例えばｄＮＴＰ(dATP, dCTP, dGTP, dTTP の4 種のデオ
キシリボヌクレオチド) およびＤＮＡポリメラーゼ（例
えばφ２９ＤＮＡポリメラーゼ、Ｍ２ＤＮＡポリメラー
ゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Thermus aquaticus ＤＮ
Ａポリメラーゼ、Thermus thermophilus ＤＮＡポリメ
ラーゼ等の核酸合成能力の高い酵素）を用いて、上記環
状ヌクレオチドを鋳型にして伸長反応を行わせることに
よって行われる。この方法は、例えばジャーナル・オブ
・モレキュラー・バイオロジー（Journal of Molecular
Biology; 56, 341-361, 1971 ）に記載されている技術
及び条件を用いることができる。これらの酵素は、ＤＮ
Ａの二重鎖の部分を剥しながらプライマー伸長物の合成
をすすめていくことができるので、当該操作に先だっ
て、必ずしも標的核酸（Ａ）と環状化プローブヌクレオ
チド（Ｂ’）を分離する必要はない。プライマー伸長物
は、標的配列と相同な配列を有するので、該伸長物は操
作（ａ）における標的核酸（Ａ）と同様にプローブヌク
レオチド（Ｂ）の標的核酸として利用されうる。この一
連の操作を繰り返すことにより核酸の特定の配列を簡便
に大量に得ることができる。また、プローブヌクレオチ
ド（Ｂ）、プライマーヌクレオチド（Ｃ）にそれぞれア
ンチプロモーター配列、プロモーター配列が含まれてい
る場合には、核酸ポリメラーゼとして、プロモーターに
応じたＲＮＡポリメラーゼを用いることができる。当該
操作は、ＮＴＰ（ATP, CTP, GTP, UTPの4種のリボヌク
レオチド）およびＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ７Ｒ
ＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６Ｒ
ＮＡポリメラーゼなど）を用いて該環状ヌクレオチドを
鋳型にしてＲＮＡ合成反応を行わせることにより行われ
る。ＲＮＡポリメラーゼ反応の結果として、プローブヌ
クレオチド（Ｂ）の相補鎖が繰り返し並んだＲＮＡが合
成されるが、このＲＮＡを鋳型として逆転写酵素を用い
てｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡにプライマーヌクレ
オチド（Ｃ）をアニールさせることにより、繰り返しＲ
ＮＡポリメラーゼを作用させて大量にRNAを合成するこ
とも可能である。操作（ｄ）：必要により、操作（ｃ）
で生成した増幅核酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｃ）
を少なくとも一回繰り返す。
【００１７】
【発明の効果】本発明の増幅法によれば、プローブヌク
レオチド（Ｂ）の２つの末端が標的核酸（Ａ）にアニー
ルして連結された場合にのみ増幅反応が行われる。した
がってオリゴヌクレオチドの塩基配列による特異性と、
２つの末端が連結される条件を満たす特異性の２つの特
異性が要求され、それだけ非特異反応が抑制される。し
たがって核酸の特定の配列のみを増幅することが可能で
ある。また、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラー
ゼを用いることにより、環状化したプローブヌクレオチ
ド１分子から複数の核酸配列が生成されるので、効率よ
く増幅することが可能である。生成した核酸配列を利用
して反応をサイクル化することにより、より大量に増幅
することもまた可能である。さらに、本発明の増幅法は
プローブを増幅する方法ではないので、ミスマッチや非
特異的ハイブリダイゼーションにより残存したプローブ
の増幅がなく、Ｓ／Ｎ（Signal/Noise）比を増加させる
ことができる。
レオチド（Ｂ）の２つの末端が標的核酸（Ａ）にアニー
ルして連結された場合にのみ増幅反応が行われる。した
がってオリゴヌクレオチドの塩基配列による特異性と、
２つの末端が連結される条件を満たす特異性の２つの特
異性が要求され、それだけ非特異反応が抑制される。し
たがって核酸の特定の配列のみを増幅することが可能で
ある。また、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポリメラー
ゼを用いることにより、環状化したプローブヌクレオチ
ド１分子から複数の核酸配列が生成されるので、効率よ
く増幅することが可能である。生成した核酸配列を利用
して反応をサイクル化することにより、より大量に増幅
することもまた可能である。さらに、本発明の増幅法は
プローブを増幅する方法ではないので、ミスマッチや非
特異的ハイブリダイゼーションにより残存したプローブ
の増幅がなく、Ｓ／Ｎ（Signal/Noise）比を増加させる
ことができる。
【００１８】
【実施例】以下に、本発明の実施例及び比較例を例示す
ることによって、本発明の効果をより一層明確なものと
するが、本発明はこれらの実施例によって限定されな
い。 （実施例1 ）各種オリゴヌクレオチドの合成 ABI 社DNA シンセサイザー391 型を用いて、ホスホアミ
ダイト法にて下記配列のオリゴヌクレオチドを合成し
た。プローブヌクレオチド（第一オリゴヌクレオチド
）：本オリゴヌクレオチドは腸炎ビブリオTDH(Thermo
stable Direct Haemolysin) 遺伝子の87番目から 104番
目、および 105番目から 126番目のヌクレオチド配列、
T7プロモーター配列と相補的な配列を有する（配列表1
）。また、５’末端にリン酸基が結合している。プ
ライマーヌクレオチド（第二オリゴヌクレオチド）：
本オリゴヌクレオチドはT7プロモーターの配列を有する
（配列表2 ）。手法はABI 社マニュアルに従い、0.2 μ
M スケールで実施した。各種オリゴヌクレオチドの脱保
護はアンモニア水で55℃で一夜実施した。精製はファル
マシア社製FPLCで逆相カラムにて実施した。なお合成し
たオリゴヌクレオチドは必要により以下の方法で5'末端
にリン酸基を結合させた。 オリゴヌクレオチド 5 〜 20 pmoles 10×T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液 10 μl 1 mM ATP 1 μl T4ポリヌクレオチドキナーゼ 10 単位 水を加えて全量を100 μl として、37℃で 1時間反応さ
せる。ここで、10×T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液
とは、 0.5M Tris-HCl(pH8.0) 0.1M MgCl2 0.1M 2-メルカプトエタノール を示す。
ることによって、本発明の効果をより一層明確なものと
するが、本発明はこれらの実施例によって限定されな
い。 （実施例1 ）各種オリゴヌクレオチドの合成 ABI 社DNA シンセサイザー391 型を用いて、ホスホアミ
ダイト法にて下記配列のオリゴヌクレオチドを合成し
た。プローブヌクレオチド（第一オリゴヌクレオチド
）：本オリゴヌクレオチドは腸炎ビブリオTDH(Thermo
stable Direct Haemolysin) 遺伝子の87番目から 104番
目、および 105番目から 126番目のヌクレオチド配列、
T7プロモーター配列と相補的な配列を有する（配列表1
）。また、５’末端にリン酸基が結合している。プ
ライマーヌクレオチド（第二オリゴヌクレオチド）：
本オリゴヌクレオチドはT7プロモーターの配列を有する
（配列表2 ）。手法はABI 社マニュアルに従い、0.2 μ
M スケールで実施した。各種オリゴヌクレオチドの脱保
護はアンモニア水で55℃で一夜実施した。精製はファル
マシア社製FPLCで逆相カラムにて実施した。なお合成し
たオリゴヌクレオチドは必要により以下の方法で5'末端
にリン酸基を結合させた。 オリゴヌクレオチド 5 〜 20 pmoles 10×T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液 10 μl 1 mM ATP 1 μl T4ポリヌクレオチドキナーゼ 10 単位 水を加えて全量を100 μl として、37℃で 1時間反応さ
せる。ここで、10×T4ポリヌクレオチドキナーゼ緩衝液
とは、 0.5M Tris-HCl(pH8.0) 0.1M MgCl2 0.1M 2-メルカプトエタノール を示す。
【００１９】（実施例2 ）標的核酸を増幅するためのキ
ット （ア）実施例1 の第一オリゴヌクレオチド （イ）実施例1 の第二オリゴヌクレオチド （ウ）T4 DNAリガーゼ（東洋紡製）、T7 RNAポリメラー
ゼ（東洋紡製）、ATP 、CTP 、GTP 、UTP
ット （ア）実施例1 の第一オリゴヌクレオチド （イ）実施例1 の第二オリゴヌクレオチド （ウ）T4 DNAリガーゼ（東洋紡製）、T7 RNAポリメラー
ゼ（東洋紡製）、ATP 、CTP 、GTP 、UTP
【００２０】（実施例3）実施例2 のキットを用いた標
的核酸の増幅方法(1) 操作(a) 実施例1 の第一オリゴヌクレオチド0.１mol
と、TDH 産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精
製したゲノム核酸1 μg とを共に10μl のリガーゼ用反
応液に加えた。94℃に 2分間保った後、50℃に5 分間保
温し、アニールさせた。リガーゼ用反応液 66 mM Tris-HCl(pH7.6) 6.6 mM MgCl2 10 mM ジチオスレイトール 66μM ATP 操作(b) 上記反応液10μl に、第二オリゴヌクレオチド
0.1nmol を加え、操作(a) と同様の操作により、環状
化した第一オリゴヌクレオチドにアニールさせた。 操作(c) 次に、T4 DNAリガーゼ 1単位（東洋紡製）を加
え、37℃で 1時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの
5'末端と3'末端を連結させた。 操作(d)上記反応液に水40μl 、T7 RNAポリメラーゼ反
応液50μl 、およびT7 RNAポリメラーゼ 10 単位を加
え、操作(b) で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型
として、37℃で30分間保温することにより増幅反応を実
施した。 T7 RNAポリメラーゼ反応液 80 mM Tris-HCl(pH8.0) 10 mM ジチオスレイトール 4 mM スペルミジン 8 mM MgCl2 50 mM NaCl 160 μg/ml BSA 0.02 % トリトン X-100 2 mM ATP, CTP, GTP, UTP 操作(e) その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジ
ウムブロマイド染色法により合成された RNAを確認し
た。結果は113merより高分子側に、スメア上にRNA が合
成されていた。これは、第一オリゴヌクレオチドが連結
され、この環状分子を鋳型として鋳型より長いRNA 分子
が合成されたことを示している。
的核酸の増幅方法(1) 操作(a) 実施例1 の第一オリゴヌクレオチド0.１mol
と、TDH 産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精
製したゲノム核酸1 μg とを共に10μl のリガーゼ用反
応液に加えた。94℃に 2分間保った後、50℃に5 分間保
温し、アニールさせた。リガーゼ用反応液 66 mM Tris-HCl(pH7.6) 6.6 mM MgCl2 10 mM ジチオスレイトール 66μM ATP 操作(b) 上記反応液10μl に、第二オリゴヌクレオチド
0.1nmol を加え、操作(a) と同様の操作により、環状
化した第一オリゴヌクレオチドにアニールさせた。 操作(c) 次に、T4 DNAリガーゼ 1単位（東洋紡製）を加
え、37℃で 1時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの
5'末端と3'末端を連結させた。 操作(d)上記反応液に水40μl 、T7 RNAポリメラーゼ反
応液50μl 、およびT7 RNAポリメラーゼ 10 単位を加
え、操作(b) で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型
として、37℃で30分間保温することにより増幅反応を実
施した。 T7 RNAポリメラーゼ反応液 80 mM Tris-HCl(pH8.0) 10 mM ジチオスレイトール 4 mM スペルミジン 8 mM MgCl2 50 mM NaCl 160 μg/ml BSA 0.02 % トリトン X-100 2 mM ATP, CTP, GTP, UTP 操作(e) その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジ
ウムブロマイド染色法により合成された RNAを確認し
た。結果は113merより高分子側に、スメア上にRNA が合
成されていた。これは、第一オリゴヌクレオチドが連結
され、この環状分子を鋳型として鋳型より長いRNA 分子
が合成されたことを示している。
【００２１】（実施例4）実施例2 のキットを用いた標
的核酸の増幅方法(2) 操作(a) 実施例1 の第一オリゴヌクレオチド0.1nmol
と第二オリゴヌクレオチド 0.1nmolとを10μl のリガ
ーゼ用反応液に加えた。94℃に2 分間保った後50℃に5
分間保温し、アニールさせた。 操作(b) 上記反応液に、TDH 産性腸炎ビブリオの培養菌
体から分離、部分精製したゲノム核酸1 μg を加え第一
オリゴヌクレオチドとアニールさせ、T4 DNAリガーゼ
1単位（東洋紡製）を加え、37℃で1 時間反応させるこ
とにより、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3'末端を
連結させた。 操作(c) 上記反応液10μl に水40μl 、T7 RNAポリメラ
ーゼ反応液50μl 、およびT7 RNAポリメラーゼ 10 単位
を加え、操作(b) で連結した環状オリゴヌクレオチドを
鋳型として、37℃で30分間保温することにより増幅反応
を実施した。 操作(d) その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジ
ウムブロマイド染色法により合成されたRNA を確認し
た。結果は113merより高分子側に、スメア上にRNA が合
成されていた。これは、第一オリゴヌクレオチドが連結
され、この環状分子を鋳型として鋳型より長いRNA 分子
が合成されたことを示している。
的核酸の増幅方法(2) 操作(a) 実施例1 の第一オリゴヌクレオチド0.1nmol
と第二オリゴヌクレオチド 0.1nmolとを10μl のリガ
ーゼ用反応液に加えた。94℃に2 分間保った後50℃に5
分間保温し、アニールさせた。 操作(b) 上記反応液に、TDH 産性腸炎ビブリオの培養菌
体から分離、部分精製したゲノム核酸1 μg を加え第一
オリゴヌクレオチドとアニールさせ、T4 DNAリガーゼ
1単位（東洋紡製）を加え、37℃で1 時間反応させるこ
とにより、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3'末端を
連結させた。 操作(c) 上記反応液10μl に水40μl 、T7 RNAポリメラ
ーゼ反応液50μl 、およびT7 RNAポリメラーゼ 10 単位
を加え、操作(b) で連結した環状オリゴヌクレオチドを
鋳型として、37℃で30分間保温することにより増幅反応
を実施した。 操作(d) その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジ
ウムブロマイド染色法により合成されたRNA を確認し
た。結果は113merより高分子側に、スメア上にRNA が合
成されていた。これは、第一オリゴヌクレオチドが連結
され、この環状分子を鋳型として鋳型より長いRNA 分子
が合成されたことを示している。
【００２２】（実施例5 ）実施例2 のキットを用いた標
的核酸の増幅方法(3) 操作(a) 実施例1 の第一オリゴヌクレオチド0.１mol
と第二オリゴヌクレオチド 0.1nmolとを、TDH 産性腸
炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲノム核
酸 1μg と共に10μl のリガーゼ用反応液に加えた。94
℃に2 分間保った後、50℃に5 分間保温し、アニールさ
せた。 操作(b) 次に、T4 DNAリガーゼ 1単位（東洋紡製）を加
え、37℃で 1時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの
5'末端と3'末端を連結させた。 操作(c) 上記反応液10μl に水40μl 、下記反応液50μ
l 、およびT7 RNAポリメラーゼ10 単位を加え、操作(b)
で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、増
幅反応を実施した。 操作(d) その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジ
ウムブロマイド染色法により合成されたRNA を確認し
た。結果は113merより高分子側に、スメア上にRNA が合
成されていた。これは、第一オリゴヌクレオチドが連結
され、この環状分子を鋳型として鋳型より長いRNA分子
が合成されたことを示している。
的核酸の増幅方法(3) 操作(a) 実施例1 の第一オリゴヌクレオチド0.１mol
と第二オリゴヌクレオチド 0.1nmolとを、TDH 産性腸
炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲノム核
酸 1μg と共に10μl のリガーゼ用反応液に加えた。94
℃に2 分間保った後、50℃に5 分間保温し、アニールさ
せた。 操作(b) 次に、T4 DNAリガーゼ 1単位（東洋紡製）を加
え、37℃で 1時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの
5'末端と3'末端を連結させた。 操作(c) 上記反応液10μl に水40μl 、下記反応液50μ
l 、およびT7 RNAポリメラーゼ10 単位を加え、操作(b)
で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、増
幅反応を実施した。 操作(d) その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジ
ウムブロマイド染色法により合成されたRNA を確認し
た。結果は113merより高分子側に、スメア上にRNA が合
成されていた。これは、第一オリゴヌクレオチドが連結
され、この環状分子を鋳型として鋳型より長いRNA分子
が合成されたことを示している。
【００２３】（実施例６） 実施例2 のキットを用いた標的核酸の増幅方法(4) 操作(a) 実施例1 の第一オリゴヌクレオチド0.１mol と、TDH
産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲ
ノム核酸1 μg とを共に10μl のリガーゼ用反応液に加
えた。94℃に2 分間保った後50℃に5 分間保温し、アニ
ールさせた。 操作(b) 次に、T4 DNAリガーゼ 1単位（東洋紡製）を加え37℃で
1時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3'
末端を連結させた。 操作(c) 上記反応液10μl に、第二オリゴヌクレオチド0.1nmo
l を加え、操作(a) と同様の操作により、環状化した第
一オリゴヌクレオチドにアニールさせた。次に反応液
に水40μl 、下記反応液50μl 、およびT7 RNAポリメラ
ーゼ 10 単位を加え、操作(b) で連結した環状オリゴヌ
クレオチドを鋳型として、37℃で30分間保温することに
より増幅反応を実施した。 操作(d) その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロ
マイド染色法により合成されたDNA を確認した。結果は
113merより高分子側に、スメア上にRNA が合成されてい
た。これは、第一オリゴヌクレオチドが連結され、この
環状分子を鋳型として鋳型より長いRNA 分子が合成され
たことを示している。 （実施例７） 標的核酸を増幅するためのキット(2) （ア）実施例１の第一オリゴヌクレオチド （イ）実施例１の第二オリゴヌクレオチド （ウ）T4 DNAリガーゼ（東洋紡製）、Tth DNA ポリメラ
ーゼ（東洋紡製）、dATP、dCTP、dGTP、dTTP （実施例８） 実施例７のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法 操作(a) 実施例１の第一オリゴヌクレオチド0.１mol と、TDH
産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲ
ノム核酸１μg とを共に10μl のリガーゼ用反応液に加
えた。94℃に２分間保った後50℃に５分間保温し、アニ
ールさせた。対照として、ゲノム核酸を混合しない反応
液を用意した。 リガーゼ用反応液 66 mM Tris-HCL (pH7.6) 6.6 mM MgCl2 10 mM ジチオスレイトール 66 μM ATP 操作(b) 上記反応液10μｌに、第二オリゴヌクレオチド0.1 mo
l を加え、操作(a) と同様の操作により、環状化した第
一オリゴヌクレオチドにアニールさせた。 操作(c) 次に、T4 DNAリガーゼ 1単位（東洋紡製）を加え37℃で
１時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3'
末端を連結させた。 操作(d) 上記反応液に水40μl 、Tth DNA ポリメラーゼ反応液50
μl 、およびTth DNAポリメラーゼ４単位を加え、操作
(c) で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、
75℃で60分間保温することにより増幅反応を実施した。 67 mM Tris-HCL (pH8.8) 16.6 mM (NH4)2SO4 6.7 mM MgCl2 2 mM dATP, dGTP, dTTP, dCTP その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロ
マイド染色法により合成されたDNA を確認した。結果は
113merより高分子側に、スメア上にRNA が合成されてい
た。これは、第一オリゴヌクレオチドが連結され、この
環状分子を鋳型として鋳型より長いRNA 分子が合成され
たことを示している。
産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲ
ノム核酸1 μg とを共に10μl のリガーゼ用反応液に加
えた。94℃に2 分間保った後50℃に5 分間保温し、アニ
ールさせた。 操作(b) 次に、T4 DNAリガーゼ 1単位（東洋紡製）を加え37℃で
1時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3'
末端を連結させた。 操作(c) 上記反応液10μl に、第二オリゴヌクレオチド0.1nmo
l を加え、操作(a) と同様の操作により、環状化した第
一オリゴヌクレオチドにアニールさせた。次に反応液
に水40μl 、下記反応液50μl 、およびT7 RNAポリメラ
ーゼ 10 単位を加え、操作(b) で連結した環状オリゴヌ
クレオチドを鋳型として、37℃で30分間保温することに
より増幅反応を実施した。 操作(d) その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロ
マイド染色法により合成されたDNA を確認した。結果は
113merより高分子側に、スメア上にRNA が合成されてい
た。これは、第一オリゴヌクレオチドが連結され、この
環状分子を鋳型として鋳型より長いRNA 分子が合成され
たことを示している。 （実施例７） 標的核酸を増幅するためのキット(2) （ア）実施例１の第一オリゴヌクレオチド （イ）実施例１の第二オリゴヌクレオチド （ウ）T4 DNAリガーゼ（東洋紡製）、Tth DNA ポリメラ
ーゼ（東洋紡製）、dATP、dCTP、dGTP、dTTP （実施例８） 実施例７のキットを用いた標的核酸の増幅、検出方法 操作(a) 実施例１の第一オリゴヌクレオチド0.１mol と、TDH
産性腸炎ビブリオの培養菌体から分離、部分精製したゲ
ノム核酸１μg とを共に10μl のリガーゼ用反応液に加
えた。94℃に２分間保った後50℃に５分間保温し、アニ
ールさせた。対照として、ゲノム核酸を混合しない反応
液を用意した。 リガーゼ用反応液 66 mM Tris-HCL (pH7.6) 6.6 mM MgCl2 10 mM ジチオスレイトール 66 μM ATP 操作(b) 上記反応液10μｌに、第二オリゴヌクレオチド0.1 mo
l を加え、操作(a) と同様の操作により、環状化した第
一オリゴヌクレオチドにアニールさせた。 操作(c) 次に、T4 DNAリガーゼ 1単位（東洋紡製）を加え37℃で
１時間反応させ、第一オリゴヌクレオチドの5'末端と3'
末端を連結させた。 操作(d) 上記反応液に水40μl 、Tth DNA ポリメラーゼ反応液50
μl 、およびTth DNAポリメラーゼ４単位を加え、操作
(c) で連結した環状オリゴヌクレオチドを鋳型として、
75℃で60分間保温することにより増幅反応を実施した。 67 mM Tris-HCL (pH8.8) 16.6 mM (NH4)2SO4 6.7 mM MgCl2 2 mM dATP, dGTP, dTTP, dCTP その後、アガロースゲルで電気泳動し、エチジウムブロ
マイド染色法により合成されたDNA を確認した。結果は
113merより高分子側に、スメア上にRNA が合成されてい
た。これは、第一オリゴヌクレオチドが連結され、この
環状分子を鋳型として鋳型より長いRNA 分子が合成され
たことを示している。
【００２４】
配列番号：１ 配列の長さ：１１３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 存在位置：32..48 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：Ｔ７プロモーター配列と相補的な配列 存在位置：１..18 他の特徴：腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haem
olysin) 遺伝子の105番目から 126番目の配列と相補的
な配列 存在位置：92..113 他の特徴：腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haem
olysin) 遺伝子の87番目から 104番目の配列と相補的な
配列 配列 GATGAGATAT TGTTTGTTGT TCAAATCTCC CTATAGTGAG TCGTATTAAA ACTATTCTAT 60 AGTGTCACCT AAATGATCCA CTAGTTCTAG AGCGGTTTCC TGCCCCCGGT TCT 113
olysin) 遺伝子の105番目から 126番目の配列と相補的
な配列 存在位置：92..113 他の特徴：腸炎ビブリオTDH(Thermostable Direct Haem
olysin) 遺伝子の87番目から 104番目の配列と相補的な
配列 配列 GATGAGATAT TGTTTGTTGT TCAAATCTCC CTATAGTGAG TCGTATTAAA ACTATTCTAT 60 AGTGTCACCT AAATGATCCA CTAGTTCTAG AGCGGTTTCC TGCCCCCGGT TCT 113
【００２５】配列番号：２ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 トポロジー：一本鎖 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 存在位置：1..17 特徴を決定した方法：Ｓ 他の特徴：T7プロモーターの配列を有する 配列 TAATACGACT CACTATA 17
【図１】第一オリゴヌクレオチド（プローブヌクレオチ
ド）の構造を示した図である。
ド）の構造を示した図である。
【図２】本発明の原理を模式的に示した図である。
【図３】実施例３、４、5 および6 において合成された
ＲＮＡの電気泳動パターンを示す。
ＲＮＡの電気泳動パターンを示す。
【図４】実施例８において合成されたＤＮＡの検出結果
を示す図である。
を示す図である。
図２中、Ａは標的核酸、Ｂは第一オリゴヌクレオチド
（プローブヌクレオチド）、Ｂ’は環状化した第一オリ
ゴヌクレオチド、Ｃは第二オリゴヌクレオチド（プライ
マーヌクレオチド）およびＤは核酸ポリメラーゼを示
す。 図３中、レーン１、２、３および４はそれぞれ実施例
３、４、５および６の試料に対応している。矢印は、鋳
型として用いた第一オリゴヌクレオチドの位置を示す。 図４中、レーン１は反応液中にゲノム核酸を加えた場
合、レーン２は加えなかった場合を示す。
（プローブヌクレオチド）、Ｂ’は環状化した第一オリ
ゴヌクレオチド、Ｃは第二オリゴヌクレオチド（プライ
マーヌクレオチド）およびＤは核酸ポリメラーゼを示
す。 図３中、レーン１、２、３および４はそれぞれ実施例
３、４、５および６の試料に対応している。矢印は、鋳
型として用いた第一オリゴヌクレオチドの位置を示す。 図４中、レーン１は反応液中にゲノム核酸を加えた場
合、レーン２は加えなかった場合を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】 検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の存在
の結果として環状化するように設計された配列を有する
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくともこの
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な
配列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、
標的核酸配列（Ａ）に直鎖状プローブヌクレオチド
（Ｂ）をハイブリダイズさせ、直鎖状プローブヌクレオ
チド（Ｂ）を環状化し、生成した環状プローブヌクレオ
チド（Ｂ’）を鋳型として、プライマーヌクレオチド
（Ｃ）を利用し、鋳型と相補的な配列の繰り返した配列
を有する一本鎖核酸を生成させることにより、核酸配列
を増幅させることを特徴とする核酸配列の増幅方法。 - 【請求項２】 検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の存在
の結果として環状化するように設計された配列を有する
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも該直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配
列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、下
記の操作（ａ）〜（ｅ）を行うことを特徴とする核酸配
列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作
（ａ）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチ
ド（Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド
（Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも1 回
繰り返す。 - 【請求項３】 検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の存在
の結果として環状化するように設計された配列を有する
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも該直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配
列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、下
記の操作（ａ）〜（ｅ）を行うことを特徴とする核酸配
列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
プライマーヌクレオチド（Ｃ）とのハイブリッドを形成
させる。 操作（ｂ）：検体試料中の標的核酸（Ａ）を、操作
（ａ）で生成したハイブリッド中のプローブヌクレオチ
ド（Ｂ）とアニールさせる。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成したアニール物中の直鎖
状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端を
連結させて、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド
（Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも1 回
繰り返す。 - 【請求項４】 検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の存在
の結果として環状化するように設計された配列を有する
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも該直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配
列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、下
記の操作（ａ）〜（ｄ）を行うことを特徴とする核酸配
列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、
標的核酸配列（Ａ）およびプライマーヌクレオチド
（Ｃ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と３’末端
を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とする。 操作（ｃ）：操作（ｂ）で生成した環状ヌクレオチド
（Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作（ｄ）：必要により、操作（ｃ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｃ）を少なくとも1 回
繰り返す。 - 【請求項５】 検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の存在
の結果として環状化するように設計された配列を有する
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と、少なくとも該直
鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配
列を有するプライマーヌクレオチド（Ｃ）を用いて、下
記の操作（ａ）〜（ｅ）を行うことを特徴とする核酸配
列の増幅方法。 操作（ａ）：上記直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）と
標的核酸配列（Ａ）とのハイブリッドを形成させる。 操作（ｂ）：操作（ａ）で生成したハイブリッド中の隣
接した直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）の５’末端と
３’末端を連結させ、環状ヌクレオチド（Ｂ’）とす
る。 操作（ｃ）：プライマーヌクレオチド（Ｃ）を操作
（ｂ）で生成した環状プローブヌクレオチド（Ｂ’）と
アニールさせる。 操作（ｄ）：操作（ｃ）で生成した環状ヌクレオチド
（Ｂ’）を鋳型とし、ヘリカーゼ様活性を有する核酸ポ
リメラーゼおよびプライマーヌクレオチド（Ｃ）を利用
して核酸配列を増幅させる。 操作（ｅ）：必要により、操作（ｄ）で生成した増幅核
酸配列を用いて、操作（ａ）〜（ｄ）を少なくとも1 回
繰り返す。 - 【請求項６】 検体試料中の標的核酸配列（Ａ）の存在
の結果として環状化するように設計された配列を有する
直鎖状プローブヌクレオチド（Ｂ）、該直鎖状プローブ
ヌクレオチド（Ｂ）と部分的に相補的な配列を有するプ
ライマーヌクレオチド（Ｃ）、連結手段、核酸ポリメラ
ーゼおよびヌクレオチド三リン酸を含む核酸増幅用試薬
キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03046193A JP3080178B2 (ja) | 1991-02-18 | 1991-02-18 | 核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キット |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03046193A JP3080178B2 (ja) | 1991-02-18 | 1991-02-18 | 核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04262799A JPH04262799A (ja) | 1992-09-18 |
| JP3080178B2 true JP3080178B2 (ja) | 2000-08-21 |
Family
ID=12740228
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03046193A Expired - Lifetime JP3080178B2 (ja) | 1991-02-18 | 1991-02-18 | 核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キット |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3080178B2 (ja) |
Families Citing this family (114)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6096880A (en) | 1993-04-15 | 2000-08-01 | University Of Rochester | Circular DNA vectors for synthesis of RNA and DNA |
| US7135312B2 (en) | 1993-04-15 | 2006-11-14 | University Of Rochester | Circular DNA vectors for synthesis of RNA and DNA |
| SE9400522D0 (sv) | 1994-02-16 | 1994-02-16 | Ulf Landegren | Method and reagent for detecting specific nucleotide sequences |
| USRE38442E1 (en) * | 1994-06-22 | 2004-02-24 | Mount Sinai School Of Medicine | Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM) |
| US6593086B2 (en) | 1996-05-20 | 2003-07-15 | Mount Sinai School Of Medicine Of New York University | Nucleic acid amplification methods |
| US5942391A (en) * | 1994-06-22 | 1999-08-24 | Mount Sinai School Of Medicine | Nucleic acid amplification method: ramification-extension amplification method (RAM) |
| GB9414934D0 (en) * | 1994-07-25 | 1994-09-14 | Raggio Italgene Spa | Method and reagents for the detection of target nuceic acid sequences |
| SE9403805D0 (sv) * | 1994-11-07 | 1994-11-07 | Ulf Landegren | Method of preparing oligonucleotide probes or primers, vector therefor and use thereof |
| JP3974941B2 (ja) | 1995-11-21 | 2007-09-12 | イェール ユニバーシティ | 単分子セグメントの増幅および検出 |
| US5854033A (en) | 1995-11-21 | 1998-12-29 | Yale University | Rolling circle replication reporter systems |
| AU704750B2 (en) | 1995-12-05 | 1999-05-06 | Jorn Erland Koch | A cascade nucleic acid amplification reaction |
| JPH09252783A (ja) * | 1996-03-26 | 1997-09-30 | Nippon Suisan Kaisha Ltd | 腸炎ビブリオ検出のためのヌクレオチドおよびそれを用いた検出法 |
| US5866336A (en) * | 1996-07-16 | 1999-02-02 | Oncor, Inc. | Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon |
| US6117635A (en) * | 1996-07-16 | 2000-09-12 | Intergen Company | Nucleic acid amplification oligonucleotides with molecular energy transfer labels and methods based thereon |
| WO2000004193A1 (en) | 1998-07-20 | 2000-01-27 | Yale University | Method for detecting nucleic acids using target-mediated ligation of bipartite primers |
| EP1114184A2 (en) | 1998-09-15 | 2001-07-11 | Yale University | Molecular cloning using rolling circle amplification |
| CA2342837A1 (en) | 1998-09-15 | 2000-03-23 | Yale University | Artificial long terminal repeat vectors |
| US5942609A (en) * | 1998-11-12 | 1999-08-24 | The Porkin-Elmer Corporation | Ligation assembly and detection of polynucleotides on solid-support |
| US6858412B2 (en) | 2000-10-24 | 2005-02-22 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Direct multiplex characterization of genomic DNA |
| US6573051B2 (en) | 2001-03-09 | 2003-06-03 | Molecular Staging, Inc. | Open circle probes with intramolecular stem structures |
| US7838270B2 (en) | 2001-05-22 | 2010-11-23 | The University Of Chicago | Target-dependent transcription using deletion mutants of N4 RNA polymerase |
| JP2005052002A (ja) * | 2001-07-06 | 2005-03-03 | Wakunaga Pharmaceut Co Ltd | 非環状核酸断片の増幅方法 |
| CA2930400A1 (en) | 2003-02-26 | 2004-09-10 | Callida Genomics, Inc. | Apparatus with pixel alignment system for analyzing nucleic acid |
| WO2005113804A1 (en) | 2004-05-20 | 2005-12-01 | Trillion Genomics Limited | Use of mass labelled probes to detect target nucleic acids using mass spectrometry |
| ES2502815T3 (es) | 2004-10-27 | 2014-10-06 | Cepheid | Reacciones de amplificación de ácido nucleico de múltiples estadios en sistema cerrado |
| US20060160102A1 (en) | 2005-01-18 | 2006-07-20 | Hossein Fakhrai-Rad | Identification of rare alleles by enzymatic enrichment of mismatched heteroduplexes |
| US7393665B2 (en) | 2005-02-10 | 2008-07-01 | Population Genetics Technologies Ltd | Methods and compositions for tagging and identifying polynucleotides |
| CN101238221B (zh) | 2005-04-12 | 2011-11-16 | Novia公司名下的现场Rcp公司 | 新型环形探针及其在鉴定生物分子中的用途 |
| ATE483032T1 (de) | 2005-04-12 | 2010-10-15 | Olink Ab | Verfahren zur herstellung von oligonukleotiden |
| EP3492602A1 (en) | 2005-06-15 | 2019-06-05 | Complete Genomics, Inc. | Single molecule arrays for genetic and chemical analysis |
| EP1762627A1 (de) | 2005-09-09 | 2007-03-14 | Qiagen GmbH | Verfahren zur Aktivierung einer Nukleinsäure für eine Polymerase-Reaktion |
| CA2624324A1 (en) | 2005-10-06 | 2007-04-19 | Lucigen Corporation | Thermostable viral polymerases and methods of use |
| WO2007044245A2 (en) | 2005-10-07 | 2007-04-19 | Callida Genomics, Inc. | Self-assembled single molecule arrays and uses thereof |
| WO2007120208A2 (en) | 2005-11-14 | 2007-10-25 | President And Fellows Of Harvard College | Nanogrid rolling circle dna sequencing |
| WO2007092538A2 (en) | 2006-02-07 | 2007-08-16 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for making nucleotide probes for sequencing and synthesis |
| US8900828B2 (en) | 2006-05-01 | 2014-12-02 | Cepheid | Methods and apparatus for sequential amplification reactions |
| US8119352B2 (en) | 2006-06-20 | 2012-02-21 | Cepheld | Multi-stage amplification reactions by control of sequence replication times |
| US7910354B2 (en) | 2006-10-27 | 2011-03-22 | Complete Genomics, Inc. | Efficient arrays of amplified polynucleotides |
| US20090111705A1 (en) | 2006-11-09 | 2009-04-30 | Complete Genomics, Inc. | Selection of dna adaptor orientation by hybrid capture |
| BRPI0807826A2 (pt) | 2007-02-02 | 2014-08-05 | Genera Biosystems Ltd | " geração de moléculas de ácido nucleico ". |
| US7635566B2 (en) | 2007-06-29 | 2009-12-22 | Population Genetics Technologies Ltd. | Methods and compositions for isolating nucleic acid sequence variants |
| US8951731B2 (en) | 2007-10-15 | 2015-02-10 | Complete Genomics, Inc. | Sequence analysis using decorated nucleic acids |
| US8415099B2 (en) | 2007-11-05 | 2013-04-09 | Complete Genomics, Inc. | Efficient base determination in sequencing reactions |
| US8617811B2 (en) | 2008-01-28 | 2013-12-31 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for efficient base calling in sequencing reactions |
| WO2009073629A2 (en) | 2007-11-29 | 2009-06-11 | Complete Genomics, Inc. | Efficient shotgun sequencing methods |
| US8592150B2 (en) | 2007-12-05 | 2013-11-26 | Complete Genomics, Inc. | Methods and compositions for long fragment read sequencing |
| GB2477439B (en) | 2008-11-07 | 2012-02-15 | Sequenta Inc | Methods for correlating clonotypes with a disease in a patient |
| US8628927B2 (en) | 2008-11-07 | 2014-01-14 | Sequenta, Inc. | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
| EP2387627B1 (en) | 2009-01-15 | 2016-03-30 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Adaptive immunity profiling and methods for generation of monoclonal antibodies |
| US8790873B2 (en) | 2009-01-16 | 2014-07-29 | Affymetrix, Inc. | DNA ligation on RNA template |
| US20120122161A1 (en) | 2009-05-22 | 2012-05-17 | Esther Musgrave-Brown | Sorting Asymmetrically Tagged Nucleic Acids by Selective Primer Extension |
| EP2435461B1 (en) | 2009-05-29 | 2017-08-09 | Life Technologies Corporation | Scaffolded nucleic acid polymer particles and methods of making and using |
| US9524369B2 (en) | 2009-06-15 | 2016-12-20 | Complete Genomics, Inc. | Processing and analysis of complex nucleic acid sequence data |
| SG10201403451QA (en) | 2009-06-25 | 2014-09-26 | Hutchinson Fred Cancer Res | Method of measuring adaptive immunity |
| EP3029141A1 (en) | 2009-08-20 | 2016-06-08 | Population Genetics Technologies Ltd. | Compositions and methods for intramolecular nucleic acid rearrangement |
| US20120245041A1 (en) | 2009-11-04 | 2012-09-27 | Sydney Brenner | Base-by-base mutation screening |
| WO2011101744A2 (en) | 2010-02-22 | 2011-08-25 | Population Genetics Technologies Ltd. | Region of interest extraction and normalization methods |
| WO2011107887A2 (en) | 2010-03-02 | 2011-09-09 | Population Genetic Technologies Ltd. | Methods for replicating polynucleotides with secondary structure |
| WO2011139371A1 (en) | 2010-05-06 | 2011-11-10 | Sequenta, Inc. | Monitoring health and disease status using clonotype profiles |
| WO2011161549A2 (en) | 2010-06-24 | 2011-12-29 | Population Genetics Technologies Ltd. | Methods and compositions for polynucleotide library production, immortalization and region of interest extraction |
| EP2606343A4 (en) | 2010-08-18 | 2017-08-16 | Life Technologies Corporation | Chemical coating of microwell for electrochemical detection device |
| EP2623613B8 (en) | 2010-09-21 | 2016-09-07 | Population Genetics Technologies Ltd. | Increasing confidence of allele calls with molecular counting |
| EP2659408B1 (en) | 2010-12-29 | 2019-03-27 | Life Technologies Corporation | Time-warped background signal for sequencing-by-synthesis operations |
| EP3582224A1 (en) | 2010-12-30 | 2019-12-18 | Life Technologies Corporation | Models for analyzing data from sequencing-by-synthesis operations |
| US20130060482A1 (en) | 2010-12-30 | 2013-03-07 | Life Technologies Corporation | Methods, systems, and computer readable media for making base calls in nucleic acid sequencing |
| US10241075B2 (en) | 2010-12-30 | 2019-03-26 | Life Technologies Corporation | Methods, systems, and computer readable media for nucleic acid sequencing |
| EP3904536A1 (en) | 2011-12-09 | 2021-11-03 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Diagnosis of lymphoid malignancies and minimal residual disease detection |
| US9499865B2 (en) | 2011-12-13 | 2016-11-22 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Detection and measurement of tissue-infiltrating lymphocytes |
| US9194840B2 (en) | 2012-01-19 | 2015-11-24 | Life Technologies Corporation | Sensor arrays and methods for making same |
| WO2013124743A1 (en) | 2012-02-22 | 2013-08-29 | Population Genetics Technologies Ltd. | Compositions and methods for intramolecular nucleic acid rearrangement ii |
| WO2013128281A1 (en) | 2012-02-28 | 2013-09-06 | Population Genetics Technologies Ltd | Method for attaching a counter sequence to a nucleic acid sample |
| WO2013134162A2 (en) | 2012-03-05 | 2013-09-12 | Sequenta, Inc. | Determining paired immune receptor chains from frequency matched subunits |
| ES2582554T3 (es) | 2012-05-08 | 2016-09-13 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Composiciones y método para medir y calibrar el sesgo de la amplificación en reacciones de PCR multiplexadas |
| US9646132B2 (en) | 2012-05-11 | 2017-05-09 | Life Technologies Corporation | Models for analyzing data from sequencing-by-synthesis operations |
| US9914968B2 (en) | 2012-09-26 | 2018-03-13 | Cepheid | Honeycomb tube |
| CA2886647A1 (en) | 2012-10-01 | 2014-04-10 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Immunocompetence assessment by adaptive immune receptor diversity and clonality characterization |
| WO2015160439A2 (en) | 2014-04-17 | 2015-10-22 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Quantification of adaptive immune cell genomes in a complex mixture of cells |
| KR20230169418A (ko) | 2013-03-13 | 2023-12-15 | 메소 스케일 테크놀러지즈, 엘엘시 | 개선된 분석 방법 |
| US10114015B2 (en) | 2013-03-13 | 2018-10-30 | Meso Scale Technologies, Llc. | Assay methods |
| US9708658B2 (en) | 2013-03-19 | 2017-07-18 | New England Biolabs, Inc. | Enrichment of target sequences |
| US9708657B2 (en) | 2013-07-01 | 2017-07-18 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method for generating clonotype profiles using sequence tags |
| CN105683980B (zh) | 2013-10-04 | 2018-08-24 | 生命科技股份有限公司 | 在使用终止化学物质的测序中建立分阶段效应模型的方法和系统 |
| WO2015083004A1 (en) | 2013-12-02 | 2015-06-11 | Population Genetics Technologies Ltd. | Method for evaluating minority variants in a sample |
| US9476853B2 (en) | 2013-12-10 | 2016-10-25 | Life Technologies Corporation | System and method for forming microwells |
| EP3114240B1 (en) | 2014-03-05 | 2019-07-24 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods using randomer-containing synthetic molecules |
| US10066265B2 (en) | 2014-04-01 | 2018-09-04 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Determining antigen-specific t-cells |
| US11390921B2 (en) | 2014-04-01 | 2022-07-19 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Determining WT-1 specific T cells and WT-1 specific T cell receptors (TCRs) |
| CA2948547A1 (en) | 2014-05-15 | 2015-11-19 | Meso Scale Technologies, Llc. | Assay methods and kits for detecting an analyte of interest |
| US10246701B2 (en) | 2014-11-14 | 2019-04-02 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Multiplexed digital quantitation of rearranged lymphoid receptors in a complex mixture |
| JP2017537657A (ja) | 2014-12-11 | 2017-12-21 | ニユー・イングランド・バイオレイブス・インコーポレイテツド | 標的配列の濃縮 |
| US11047008B2 (en) | 2015-02-24 | 2021-06-29 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods for diagnosing infectious disease and determining HLA status using immune repertoire sequencing |
| CA2979726A1 (en) | 2015-04-01 | 2016-10-06 | Adaptive Biotechnologies Corp. | Method of identifying human compatible t cell receptors specific for an antigenic target |
| US10428325B1 (en) | 2016-09-21 | 2019-10-01 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Identification of antigen-specific B cell receptors |
| US10487358B2 (en) | 2016-09-23 | 2019-11-26 | Grail, Inc. | Methods of preparing and analyzing cell-free nucleic acid sequencing libraries |
| WO2018085862A2 (en) | 2016-11-07 | 2018-05-11 | Grail, Inc. | Methods of identifying somatic mutational signatures for early cancer detection |
| EP3551768B1 (en) | 2016-12-12 | 2024-03-06 | Grail, LLC | Methods for tagging and amplifying rna template molecules for preparing sequencing libraries |
| US10982351B2 (en) | 2016-12-23 | 2021-04-20 | Grail, Inc. | Methods for high efficiency library preparation using double-stranded adapters |
| ES2874143T3 (es) | 2017-01-10 | 2021-11-04 | Paragon Genomics Inc | Métodos y composiciones para reducir códigos de barras, moleculares redundantes creados en reacciones de prolongación de cebadores |
| US11274344B2 (en) | 2017-03-30 | 2022-03-15 | Grail, Inc. | Enhanced ligation in sequencing library preparation |
| US11118222B2 (en) | 2017-03-31 | 2021-09-14 | Grail, Inc. | Higher target capture efficiency using probe extension |
| WO2018183942A1 (en) | 2017-03-31 | 2018-10-04 | Grail, Inc. | Improved library preparation and use thereof for sequencing-based error correction and/or variant identification |
| WO2019055819A1 (en) | 2017-09-14 | 2019-03-21 | Grail, Inc. | METHODS FOR PREPARING A SEQUENCING LIBRARY FROM SINGLE STRANDED DNA |
| US11851650B2 (en) | 2017-09-28 | 2023-12-26 | Grail, Llc | Enrichment of short nucleic acid fragments in sequencing library preparation |
| US11254980B1 (en) | 2017-11-29 | 2022-02-22 | Adaptive Biotechnologies Corporation | Methods of profiling targeted polynucleotides while mitigating sequencing depth requirements |
| WO2019118925A1 (en) | 2017-12-15 | 2019-06-20 | Grail, Inc. | Methods for enriching for duplex reads in sequencing and error correction |
| WO2019126803A1 (en) | 2017-12-22 | 2019-06-27 | Grail, Inc. | Error removal using improved library preparation methods |
| JP2022511931A (ja) | 2018-12-13 | 2022-02-01 | ディーエヌエー スクリプト | 細胞および生体分子上へのオリゴヌクレオチドの直接合成 |
| CA3121923A1 (en) | 2018-12-18 | 2020-06-25 | Wenying Pan | Methods for detecting disease using analysis of rna |
| JP2022515912A (ja) | 2019-01-03 | 2022-02-22 | ディーエヌエー スクリプト | オリゴヌクレオチドセットのワンポット合成 |
| CN115768899A (zh) | 2020-03-09 | 2023-03-07 | 詹森生物科技公司 | 用于定量重组载体核酸整合的组合物和方法 |
| US10941453B1 (en) | 2020-05-20 | 2021-03-09 | Paragon Genomics, Inc. | High throughput detection of pathogen RNA in clinical specimens |
| KR20240033032A (ko) | 2021-07-09 | 2024-03-12 | 세페이드 | 높은 수준의 다중화 반응 용기, 시약 점적 장치 및 관련 방법 |
| US11680293B1 (en) | 2022-04-21 | 2023-06-20 | Paragon Genomics, Inc. | Methods and compositions for amplifying DNA and generating DNA sequencing results from target-enriched DNA molecules |
| WO2024003332A1 (en) | 2022-06-30 | 2024-01-04 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Controlling for tagmentation sequencing library insert size using archaeal histone-like proteins |
-
1991
- 1991-02-18 JP JP03046193A patent/JP3080178B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04262799A (ja) | 1992-09-18 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3080178B2 (ja) | 核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キット | |
| JP3085409B2 (ja) | 標的核酸配列の検出方法およびそのための試薬キット | |
| AU770217B2 (en) | Ligation assembly and detection of polynucleotides on solid-support | |
| JP2807202B2 (ja) | 核酸の高感度検出方法 | |
| JP3514630B2 (ja) | 核酸配列の増幅および検出 | |
| JP6382189B2 (ja) | Ｒｎａテンプレートから開始する等温ｄｎａ増幅用のキット | |
| EP0682120B1 (en) | Selective amplification of target polynucleotide sequences | |
| US5525462A (en) | Nucleic acid sequence amplification method, detection method, and reagent kit therefor | |
| JP2000505312A (ja) | 標的核酸配列増幅 | |
| JPH048293A (ja) | ライゲーシヨン可能なヘアピンプローブ及びその転写を用いた核酸の増巾方法 | |
| JP2005509433A (ja) | 多重ｐｃｒ | |
| JPH0636760B2 (ja) | 核酸の増幅法 | |
| JPH10510161A (ja) | 末端反復増幅方法 | |
| JP3403405B2 (ja) | 核酸伸長検定 | |
| JPH0723800A (ja) | 核酸の検出方法 | |
| JPH04229200A (ja) | 改良ｌｃｒ法 | |
| US20140004509A1 (en) | Kit for isothermal dna amplification starting from an rna template | |
| JPH05146299A (ja) | 核酸配列の増幅方法およびそのための試薬キツト | |
| EP3252168B1 (en) | Pcr primer linked to complementary nucleotide sequence or complementary nucleotide sequence including mis-matched nucleotides and method for amplifying nucleic acid using same | |
| US9777319B2 (en) | Method for isothermal DNA amplification starting from an RNA template | |
| JP3084733B2 (ja) | 標的核酸の増幅方法、検出方法およびそのためのキット | |
| JPH06327500A (ja) | 核酸配列の増幅方法および検出方法 | |
| JPH0767646A (ja) | 試料中に含まれる特定ｒｎａ配列を鋳型とする核酸配列の増幅方法 | |
| JP2021505199A (ja) | 鋳型切り換え機構を通じて核酸ライブラリを調製するためのシステムと方法 | |
| JP3275969B2 (ja) | 核酸配列の増幅方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080623 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080623 Year of fee payment: 8 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090623 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090623 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100623 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100623 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110623 Year of fee payment: 11 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110623 Year of fee payment: 11 |