RU2258741C1 - Способ детекции микроорганизмов с помощью изотермической реакции амплификации-ера (экзонуклеазно-полимеразная амплификация (exonuclease-polimerase amplification) - Google Patents
Способ детекции микроорганизмов с помощью изотермической реакции амплификации-ера (экзонуклеазно-полимеразная амплификация (exonuclease-polimerase amplification) Download PDFInfo
- Publication number
- RU2258741C1 RU2258741C1 RU2003133652/13A RU2003133652A RU2258741C1 RU 2258741 C1 RU2258741 C1 RU 2258741C1 RU 2003133652/13 A RU2003133652/13 A RU 2003133652/13A RU 2003133652 A RU2003133652 A RU 2003133652A RU 2258741 C1 RU2258741 C1 RU 2258741C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- primers
- exonuclease
- microorganisms
- detection
- amplification
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биохимии и может быть использовано в молекулярно-генетической диагностике. Предложенный способ изотермической реакции амплификации предусматривает инкубирование в присутствии буферной системы одноцепочечной пробы исследуемой нуклеиновой кислоты с полимеразой, экзонуклеазой Т7, α-S-dNTPs и двумя парами специфических дезоксирибоолигонуклеотидных праймеров, где последовательность первой пары праймеров идентична 5'-концевой последовательности смысловой цепи исследуемой нуклеиновой кислоты, а последовательность второй пары праймеров комплементарна 3'-концевой последовательности смысловой цепи. Праймеры каждой пары различаются между собой наличием на 3'-конце одного из них дополнительных нуклеотидов. Применение изобретения позволяет удешевить детекцию микроорганизмов. 1 ил.
Description
Изобретение относится к области биохимии, в частности к молекулярно-генетическим методам детекции микроорганизмов.
Одним из молекулярно-генетических методов детекции микроорганизмов является SDA (Strand Displacement Amplification) [1].
Амплификация с вытеснением цепи (SDA) использует свойство ДНК-полимеразы, лишенной экзонуклеазной активности синтезировать новую цепь ДНК, вытесняя рестрицированную цепь. Предварительно в ходе инициирования реакции с использованием специальных затравок создается сайт рестрикции для эндонуклеаз, например HincII. Поскольку в качестве предшественников в синтезе используются модифицированные дезоксинуклеозидтрифосфаты, такие как тиопроизводные аденозина (в случае использования эндонуклеазы рестрикции HincII), гидролиз рестриктазой HincII приводит к образованию насечки (гидролизуется одна цепь), в то время как вторая цепь остается нативной. SDA относится к классу изотермических реакций. Изотермические методы в отличие от ПЦР и ЛЦР позволяют отказаться от сложной и дорогостоящей аппаратуры и использовать в качестве инкубаторов лабораторные термостаты. Этот метод амплификации позволяет получить до 106-107 копий на одну используемую матрицу [1].
Цель изобретения - разработка нового молекулярно-генетического метода детекции микроорганизмов.
Предлагаемый метод детекции микроорганизмов отличается от метода SDA тем, что амплификация исследуемого участка генома происходит в результате использования 4 дезоксирибоолигонуклеотидных праймеров, комплементарных к соответствующим последовательностям на противоположных цепях нуклеиновой кислоты: первые два ("А", "В") - комплементарные к участкам однонитевых фрагментов нуклеиновой кислоты, остальные два ("a", "b") - идентичные "А" или "В", но имеющие дополнительные нуклеотиды в направлении 3' (так называемые "3' концевые участки") также комплементарные к участкам однонитевых фрагментов нуклеиновой кислоты.
Дезоксирибоолигонуклеотиды "А" и "В" после отжига на ДНК матрицах (схема №1) и инициации синтеза новых цепей ДНК полимеразой фрагмент Кленова (3'-5' ехо-) [2] удаляются от матриц в результате их расщепления ферментом экзонуклеаза Т7, присутствующей в реакционной смеси.
Экзонуклеаза Т7 катализирует ступенчатое удаление мононуклеотидов с 5' конца двухцепочечной ДНК [3], освобождая место отжига для копий или других дезоксирибоолигонуклеотидных праймеров.
Активность экзонуклеазы Т7 на синтезированные цепи ДНК блокируется в результате использования тиопроизводных дезоксинуклеозидтрифосфатов -[alpha]-S-dNTPs: [alpha]-S-dATP, [alpha]-S-dCTP, [alpha]-S-dGTP и [alpha]-S-dTTP [1].
Образующиеся в результате разрушения праймеров однонитевые участки ДНК служат местом отжига для копий ранее расщепленных праймеров, которые являются затравками для последующего синтеза ДНК с одновременным вытеснением ранее синтезированных цепей.
После синтеза новых цепей ДНК полимеразой фрагмент Кленова (3'-5' ехо-) освобождаются ранее синтезированные цепи ДНК, которые служат матрицами для праймеров "В" и "А".
Синтез новых цепей и последующее их вытеснение позволяет праймерам "а" и "b" гибридизироваться с ними так называемыми "3' концевыми участками" и инициировать синтез ДНК.
Дезоксирибоолигонуклеотиды "а" и "b" после отжига и инициации синтеза новых цепей ДНК и гибридизированных матриц полимеразой фрагмент Кленова (3'-5' ехо-) также удаляются от матриц в результате их расщепления ферментом экзонуклеаза Т7, присутствующей в реакционной смеси.
Образующиеся в результате разрушения праймеров однонитевые участки ДНК служат местом отжига для праймеров "А" и "В", а также, но в гораздо меньшей степени копий ранее расщепленных праймеров "а" и "b" (реакция проходит в изотермических условиях при температуре 37°С, более благоприятных для отжига праймеров "А" и "В"), которые являются затравками для последующего синтеза ДНК с одновременным вытеснением ранее синтезированных цепей.
Такая стратегия позволяет проводить амплификацию ДНК в прогрессии, достаточной для последующей визуализации (из одной исследуемой мишени молекулы ДНК может амплифицироваться до 1011 копий двухцепочечной ДНК с тупыми концами за 4-6 часов), причем образующиеся ампликоны идентифицируются в электрофореграммах как следующие фрагменты:
")(" - амплифицированные двухцепочечные фрагменты ДНК с тупыми концами, ограниченные по 5' концам последовательностями дезоксирибонуклеотидов, идентичных так называемым "3' концевым участкам" праймеров "а" и "b";
"][" - не менее чем в 8 раз слабее сигнал (часто не видимый в электрофореграмме) по сравнению с ")(", что связано с механизмом амплификации и короче ")(" на число ограниченных по 5' концам последовательностей дезоксирибонуклеотидов, идентичных так называемым "3' концевым участкам" праймеров "а" и "b".
В процессе амплификации двухцепочечных фрагментов с тупыми концами ")(" и "][" нарабатываются так называемые "фоновые" фрагменты ДНК, обладающие разным размером ампликонов (недосинтезированные и не вытесненные цепи ДНК, недорушенные затравки на матрицах в момент непосредственного анализа).
Поэтому для детекции в ЕРА следует ориентироваться на самый яркий сигнал с заданной длиной ампликонов.
Условия проведения реакции
Экзонуклеазно-полимеразная амплификация (Exonuclease-Polymerase Amplification) на примере детекции Chlamydia psittaci:
ЕРА выполняется в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 2 мкл охлажденной в ледяной бане, но предварительно денатурированной кипячением исследуемой пробы ДНК, подготовленной любым методом выделения нуклеиновых кислот для молекулярно-генетических исследований; 50 mM ацетата калия, 20 mM трис-ацетата (рН 7.9), 10 mM ацетата магния, 1 mM дитиотрейтола, 200 мкМ [alpha]-S-dNTPs, по 1 мкМ каждого из четырех дезоксирибоолигонуклеотидных праймеров ("А", "В", "а", "b"), 5 единиц фрагмента Кленова (3'-5' ехо-), 1 единица экзонуклеазы Т7.
Реакцию проводят при температуре 37°С в условиях термостата в течение 4-6 часов с последующей визуализацией амплифицированной ДНК методом гель электрофореза. Для этого продукты амплификации смешивают с буфером для нанесения проб (0,25% бромфенолового синего, 40% (вес-объем) сахарозы в Н2О) в соотношении 6:1. Полученную смесь вносят в лунки 2% агарозного геля, приготовленного на ТАЕ буфере (0,04 М трис-ацетат, 0,002 М ЭДТА, рН 8,0) с содержанием бромистого этидия 0,5 мкг/мл, и подвергают горизонтальному электрофорезу в ТАЕ буфере при напряжении 0 В/см в течение 1-1,5 часов с последующим просматриванием в УФ-трансиллюминаторе (290-330 нм).
Дезоксирибоолигонуклеотидные праймеры выбраны на основе анализа консервативного участка генома Chlamydia psittaci (СР. SEQ):
5'[(gcaagacactc)ctcaaagccat]taattgcctacaggatatcttgtctggctttaacttgg acgtggtgccgccagaagagcaaattagaatagcgagcacaaaaagaaaagatactaagc ataatctttagaggtgagtatgaaaaaactcttgaaatcggcattattgtttgccgctac gggttccgctctctccttacaagccttgcctgtagggaacccagctgaaccaagtttatt aat[cgatggcact(atgtgggaagg)]3'.
СР. SEQ представляет собой последовательность длиной 264 пары нуклеотидов (п.н.), включившую в себя 139 п.н. из 5'-не транслируемого региона и 125 п.н. из транслируемого региона, кодирующего синтез первых 41-42 аминокислот большого белка наружной мембраны возбудителя.
Дезоксирибоолигонуклеотидный праймер "А" 5'(gcaagacactc)3' идентичен основаниям - 139-129 5' не транслируемого региона;
Дезоксирибоолигонуклеотидный праймер "a" 5'[(gcaagacactc)ctcaaagccat]3' идентичен основаниям - 139-118 5' не транслируемого региона;
Дезоксирибоолигонуклеотидный праймер "В" 5'(ccttcccacat)3' комплементарен к основаниям 115-125 транслируемого региона;
Дезоксирибоолигонуклеотидный праймер "b" 5'[(ccttcccacat)agtgccatcg]3' комплементарен к основаниям 105-125 транслируемого региона.
Результатом предлагаемого метода ЕРА со специфичными для Chlamydia psittaci дезоксирибоолигонуклеотидными праймерами "А", "В", "а", "b" проб ДНК штаммов Chl. psittaci "КС-93", "ПП-87", "250" является амплификация специфичного фрагмента ДНК хламидий длиной 242 пар нуклеотидов (чертеж).
Источники информации
1. STRAND DISPLACEMENT AMPLIFICATION /Inventor - Walker/ United States Patent №5,455,166 / Date of Patent *Oct.3, 1995.
2. Derbyshire, V. et al. (1988) Science 240, 199-201.
3. Kerr, С. and Sadowski, P. D. (1972)./.J.Biol. Chem. 247, 305-318.
Claims (1)
- Способ детекции микроорганизмов с помощью изотермической реакции амплификации, включающий подготовку одноцепочечной пробы исследуемой ДНК, внесение указанной пробы в реакционную смесь, состоящую из буферной системы, олигодезоксирибонуклеотидных праймеров, полимеразы и dNTPs, инкубацию реакционной смеси при температуре 37°С в термостате в течение 4-6 ч и анализ продуктов реакции методом гель-электрофореза на предмет выявления специфичного для определенного микроорганизма амплифицированного фрагмента, отличающийся тем, что осуществляют изотермическую реакцию амплификации, обозначаемую как ЕРА, которая предусматривает, что в качестве dNTPs применяют α-S-dNTPs, в реакционную смесь добавляют экзонуклеазу Т7 и используют четыре олигодезоксирибонуклеотидных праймера "А", "а" и "В", "b", где праймер "а" отличается от "А", а праймер "b" - от "В" наличием дополнительных нуклеотидов на их 3'-конце, причем праймеры "А" и "а" идентичны 5'-концевой последовательности смысловой цепи исследуемой нуклеиновой кислоты, а "В" и "b" комплементарны ее 3'-концевой последовательности.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2003133652/13A RU2258741C1 (ru) | 2003-11-18 | 2003-11-18 | Способ детекции микроорганизмов с помощью изотермической реакции амплификации-ера (экзонуклеазно-полимеразная амплификация (exonuclease-polimerase amplification) |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2003133652/13A RU2258741C1 (ru) | 2003-11-18 | 2003-11-18 | Способ детекции микроорганизмов с помощью изотермической реакции амплификации-ера (экзонуклеазно-полимеразная амплификация (exonuclease-polimerase amplification) |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2003133652A RU2003133652A (ru) | 2005-06-27 |
RU2258741C1 true RU2258741C1 (ru) | 2005-08-20 |
Family
ID=35836284
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2003133652/13A RU2258741C1 (ru) | 2003-11-18 | 2003-11-18 | Способ детекции микроорганизмов с помощью изотермической реакции амплификации-ера (экзонуклеазно-полимеразная амплификация (exonuclease-polimerase amplification) |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2258741C1 (ru) |
-
2003
- 2003-11-18 RU RU2003133652/13A patent/RU2258741C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
GUATELLI JC, WHITFIELD KM, KWOH DY, BARRINGER KJ, RICHMAN DD, GINGERAS TR., Proc Nati Acad Sci USA 1990 Oct;87(19). SHIBATA H, TAHIRA T, HAYASHI K., Genome Res. 1995, Nov;5(4). * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
RU2003133652A (ru) | 2005-06-27 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2003272438B2 (en) | Helicase dependent amplification of nucleic acids | |
AU770217B2 (en) | Ligation assembly and detection of polynucleotides on solid-support | |
JP2022008577A (ja) | 限られたヌクレオチド組成を有するプライマーを用いた増幅 | |
JP3433929B2 (ja) | 核酸配列の増幅方法 | |
CA2877368C (en) | Kit for isothermal dna amplification starting from an rna template | |
EP2143805A1 (en) | Asymmetric pcr amplification, its special primer and application | |
WO2005095654A1 (en) | Helicase-dependent amplification of circular nucleic acids | |
CA2439074A1 (en) | Methods and compositions for amplification of rna sequences | |
EP3152324B1 (en) | Strand-invasion based dna amplification method | |
EP2171099A1 (en) | Nested multiplex amplification method for identification of multiple biological entities | |
EP1446508A2 (en) | A method of reducing non-specific amplification in pcr | |
US7892797B2 (en) | Single enzyme system for fast, ultra long PCR | |
US20120142059A1 (en) | Sequence amplification with target primers | |
EP0869187A2 (en) | Replication of nucleic acids using single-strand DNA binding proteins | |
RU2258741C1 (ru) | Способ детекции микроорганизмов с помощью изотермической реакции амплификации-ера (экзонуклеазно-полимеразная амплификация (exonuclease-polimerase amplification) | |
US20070122827A1 (en) | Target nucleic acid signal detection | |
RU2258740C2 (ru) | СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПОМОЩЬЮ ИЗОТЕРМИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ АМПЛИФИКАЦИИ-RAMIL (РЕВЕРТАЗНОЕ АМПЛИФИКАЦИОННОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ (REVERTASE AMPLIFICATION ILLATION) ИЛИ РНК-аза H ЗАВИСИМОЕ АМПЛИФИКАЦИОННОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ (RNAase Н-DEPENDENT AMPLIFICATION ILLATION) | |
JP4186269B2 (ja) | 核酸合成法 | |
Saunders et al. | DNA amplification: general concepts and methods | |
US20060019288A1 (en) | Methods, reaction mixtures, and kits for ligating polynucleotides | |
US6605435B1 (en) | Method for amplifying all of the DNA fragments in a sample, including small and damaged fragments, by pretreating the fragments with P1 nuclease | |
JP2008178338A (ja) | 断片化核酸が混入する核酸試料中の標的核酸を増幅する核酸増幅方法、及びそのキット | |
KR20140073214A (ko) | 표적 핵산을 증폭 또는 분석하는 방법 및 표적 핵산을 증폭하기 위한 키트 또는 조성물 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20051119 |