CN114350756A - 基于dna切刻/聚合链置换循环反应的全基因组自引发扩增方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了基于DNA切刻/聚合链置换循环反应的全基因组自引发扩增方法及试剂盒,属于分子生物学技术领域,先利用切刻酶在基因组相应的酶切位点上进行酶切形成缺口,然后在聚合酶的作用下进行延伸反应同时置换出单链,该过程所形成的双链DNA再次被切刻酶切割,多轮循环后该段基因序列可被线性扩增得到多拷贝的单链片段,从而实现全基因组的放大。因此本发明的基于酶切扩增技术的全基因组扩增方法有望应用于单细胞测序工作,提高疾病的诊断能力。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域,涉及全基因组扩增方法,具体涉及一种基于DNA切刻/聚合链置换循环反应的全基因组自引发扩增方法。
背景技术
DNA测序技术的发展可使我们更深层次地了解人类基因组,特别是了解与肿瘤有关的基因变异,这对于发展疾病的治疗和预后评估具有非常重要的意义。但是对于测序而言,DNA浓度是必要的限制,通常的解决方法是收集大量的细胞进行大量测量,而临床样本往往有限,不足以提供支持测序的浓度,且临床样本通常包含大量的正常细胞和少量的肿瘤细胞,测序得到的结果很难分析出肿瘤基因。虽然人体细胞的基因组大致相同,但是单个细胞还是会具有自己独特的基因组,体细胞会随着位置以及时间的不同,基因组发生不同的变化,包括单核苷酸变异以及结构的变化,这些都有可能导致癌症或其他疾病的发生。因此,发展单细胞测序工作对于基因的诊断具有重要意义。但是由于单细胞不能培养,所以需要借助手段,对单细胞基因进行扩增,以得到足够量的DNA进行测序工作。
全基因组测序(whole genome amplification,WGA)为对整个基因组序列进行非特异性扩增的一门技术,其目的是保证在没有序列倾向性的基础上尽可能多的扩增DNA浓度。该技术主要通过对微量DNA样本进行扩增,再将扩增产物进行后续分析,实现多位点,多基因以至全基因组的研究。最具有代表性的WGA方法是结合PCR技术尝试从单个细胞扩增整个人类基因组,其中最常见的是DOP-PCR,DOP-PCR的基本原理是利用3`端特异的核苷酸引物,在最初的较低退火温度下与基因组多段结合发生PCR扩增,接着在较高温度下,利用核苷酸引物的5`端特异序列,继续发生PCR扩增,实现微量DNA样本的大量扩增。PEP-PCR与DOP-PCR的不同之处在于:PEP-PCR的引物是由15个随机核苷酸组成的随机引物,能尽可能多的与基因组配合,进行整个基因组的放大。这些方法虽然简单,但是由于不同位点的PCR效率不同以及不同序列的密度不同,导致在PCR过程中往往会有大量信息的损失。而且由于PCR是指数增长的反应,所以会在快速扩增过程中引入偏差,聚合酶纠错能力不高,导致错误被保留,扩增产物与原始模板失真。利用基于PCR的放大方法进行扩增,会在指数放大循环过程中,引入更多偏差,出错率提高,导致测序工作无意义而且花费大。
多重链置换扩增(multiplex displacement amplification,MDA)是目前备受关注的一种扩增手段,是1998年由耶鲁大学Lizardi课题组首次提出。该方法利用phi29DNA聚合酶的高效扩增能力,结合链置换原理,利用随机引物可以进行高效的非特异扩增,具有高效性、均衡性以及高保真等特点。尽管该方法已经发展多年,还是存在以下问题:因为使用到随机引物,导致容易扩增很多不属于基因组的DNA序列;非特异性扩增容易导致不均匀放大整个基因组;指数放大的结果是导致最先被扩增的片段过表达,而且尚不清楚那些过表达的序列到底是因为本身序列比较多,还是由于随机偏差导致的。目前已经有多种策略来降低MDA扩增偏倚,包括反应样中增加海藻糖,减少反应体积或使用纳升级微流室减少孤立池中的多样性等方法。虽然这些方法在某方面减轻了MDA存在的问题,但无偏差,均衡扩增仍然是一个挑战。
因此,发展一种无偏差、覆盖广、高效的基于单细胞的扩增方法迫在眉睫。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点,本发明的目的在于提供基于DNA切刻/聚合链置换循环反应的全基因组自引发扩增方法及试剂盒,能够解决当前基因组基因扩增存在的出错率高、扩增产物片段小、扩增效率低的技术问题。
为了达到上述目的,本发明采用以下技术方案予以实现:
本发明公开了一种基于DNA切刻/聚合链置换循环反应的全基因组自引发扩增方法,包括:首先在基因组相应的酶切位点上采用切刻酶进行酶切形成缺口引发整个扩增反应,然后采用聚合酶进行延伸反应同时链置换得到单链,在聚合酶延伸之后所形成的双链DNA再次被切刻酶切割,在经过多轮切刻、聚合酶延伸并进行链置换的循环后该段基因序列能够被线性扩增得到多拷贝的单链片段,完成自引发扩增实现全基因组放大。
优选地,所述切刻酶为能够识别双链DNA且能够切刻单链DNA的内切酶,该内切酶在基因组具有切割位点。
优选地,所述切刻酶包括Nt.BbvCI、Nt.AlwI和Nt.CviPII。
优选地,所述聚合酶为同时具有5`-3`聚合酶活性以及链置换活性的聚合酶,且该聚合酶不具有5`-3`外切酶活性。
进一步优选地,所述聚合酶为Bst 2.0 DNA聚合酶。
本发明还公开了一种实现上述的基于DNA切刻/聚合链置换循环反应的全基因组自引发扩增方法的试剂盒,包括以下成分:
不同浓度的基因组DNA,10pg至2ng;
dNTP,终浓度为400μM;
切刻酶,浓度为2U至3.5U;
聚合酶,浓度为2U至8U;
无机焦磷酸酶,80μM;
终浓度为1X的缓冲液;
核酸染料,终浓度为0.5X;
用DEPC水补充反应体系总体积至20uL。
优选地,所述缓冲液为0.5×内切酶buffer和0.5×聚合酶buffer的混合液。
优选地,核酸染料采用终浓度为0.5X的SYBR Green。
优选地,所用dNTP中加入含有甲基化修饰的胞嘧啶,未修饰的胞嘧啶与已修饰的胞嘧啶用量比为6:4(即已修饰胞嘧啶终浓度为40μM)或8:2(已修饰胞嘧啶终浓度为20μM)。
优选地,该试剂盒反应时反应温度为55℃。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明公开的基于DNA切刻/聚合链置换循环反应的全基因组自引发扩增方法,不使用随机引物,而是先利用切刻酶在基因组相应的酶切位点上进行酶切形成缺口,然后在聚合酶的作用下进行延伸反应同时置换出单链,该过程所形成的双链DNA再次被切刻酶切割,多轮循环后该段基因序列可被线性扩增得到多拷贝的单链片段,从而实现全基因组的放大。因此本发明的基于酶切扩增技术的全基因组扩增方法有望应用于单细胞测序工作,提高疾病的诊断能力。该方法优势体现在:
第一,基于切刻酶切割产生缺口并利用聚合酶在缺口部分延伸产生单链核酸,由于酶切位点在基因组具有普遍性,因此该方法可以覆盖整个基因组,实现全基因组扩增。
第二,由于该方法不存在非特异性结合,产生非特异性扩增,因而不会产生扩增偏倚性,这弥补了现有的基于PCR进行全基因组扩增方法的不足;
第三,该方法扩增效率高,能将pg级的微量DNA有效扩增至μg,为后续的测序工作做准备。
第四,由于本发明的方法采用的线性扩增和指数扩增相比,一方面不会放大原有序列的含量差异,另一方面不会放大引入的错误。比如细胞内含量目标1序列:目标2序列=1:10,线性扩增后可能会是1:12,但是指数扩增后很大概率会是1:100。同样的,当引入错误碱基后,产生的错误序列在线性扩增中独立存在,在指数扩增中会被作为反应物再次放大。因此本发明的方法在扩增基因组时错误率会降低。
本发明还公开了基于上述方法的扩增试剂盒,试剂盒中包含的酶切扩增体系能够方便有效的完成上述扩增,实现全基因组的放大。
进一步地,为了阻止从头合成的新核酸链被切刻酶识别酶切,导致发生链置换反应进行扩增,产生背景,在dNTP中混入带有甲基化修饰的胞嘧啶,用于酶切反应可明显降低背景。
附图说明
图1为本方法的发明流程示意图;
图2为不同聚合酶对扩增结果的影响结果图;其中,(A)为Bst 2.0 DNA聚合酶的浓度为8U时优化Nt.BbvCI切刻酶的浓度条件下对基因组的扩增结果;(B)为Nt.AlwI浓度为0.2U时优化聚合酶的浓度条件下对基因组的扩增结果;(C)为Bst 2.0 DNA聚合酶的浓度为2U时优化Nt.CviPII的浓度条件下基因组的扩增结果。
图3为不同条件下的基因组扩增结果;其中,(A)为C:mC为6:4时,100pg基因组DNA,Bst 2.0 DNA聚合酶浓度为4.5U,切刻酶选择Nt.AlwI且浓度分别为0.8U和1.5U的基因组扩增结果;(B)为C:mC为8:2时,100pg基因组DNA,Bst 2.0 DNA聚合酶浓度为4.5U,切刻酶选择Nt.AlwI且浓度为0.4U与0.8U的基因组扩增结果。
图4为本方法扩增不同质量的正常人血液基因组DNA结果。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是,本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象,而不必用于描述特定的顺序或先后次序。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换,以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外,术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形,意图在于覆盖不排他的包含,例如,包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元,而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
下面结合附图对本发明做进一步详细描述:
参见图1,为本发明方法的流程示意图,首先利用切刻酶在基因组相应的酶切位点上进行酶切形成缺口,然后在聚合酶的作用下进行延伸反应同时置换出单链,该过程所形成的双链DNA再次被切刻酶切割,多轮循环后该段基因序列可被线性扩增得到多拷贝的单链片段,从而实现全基因组的放大。
本发明采用Nt.BbvCI、Nt.AlwI以及Nt.CviPII这三种切刻酶对基因组的扩增,将不同浓度的切刻酶、聚合酶与基因组DNA、没有修饰的dNTP、无机焦磷酸酶、缓冲液、SYBRGreen与DEPC水按照权利要求书中所述浓度与体积混合,进行基因组扩增,按照切刻酶在扩增过程中的效果对所选用的切刻酶种类、浓度进行优化;以及在使用Nt.AlwI切刻酶时对Bst 2.0 DNA聚合酶浓度进行优化。
结果如图2所示,图2中(A)Bst 2.0 DNA聚合酶的浓度为8U时Nt.BbvCI对基因组的扩增结果(B)Nt.AlwI对基因组的扩增结果(C)Bst 2.0 DNA聚合酶的浓度为2U时Nt.CviPII对基因组的扩增结果。从图中可以看出,3.5U的Nt.BbvCI组合8U的Bst 2.0 DNA聚合酶具有最高的扩增效率以及最优的信噪比;当切刻酶为0.2U的Nt.AlwI时,结合3U的Bst 2.0 DNA聚合酶反应结果最优;聚合酶浓度为2U时,Nt.CviPII 0.1U的扩增反应最迅速。
本发明还公开了基于DNA切刻/聚合链置换循环反应的全基因组自引发扩增方法的试剂盒,其中包含酶切扩增技术的反应体系包含以下成分:不同浓度的基因组DNA,400μM的dNTP,不同浓度的切刻酶和聚合酶,80μM的无机焦磷酸酶,缓冲液,核酸染料以及水,该反应体系总体积为20μL,反应温度为55℃。
进一步地,为降低检测背景,阻止从头合成的新核酸链被切刻酶识别酶切,加入含有甲基化修饰的胞嘧啶作为合成底物,其中未修饰的胞嘧啶与已修饰的胞嘧啶比例为6:4或8:2,将不同浓度的切刻酶与基因组DNA、Bst 2.0 DNA聚合酶、胞嘧啶经过修饰,且C:mC分别为6:4与8:2的dNTP、无机焦磷酸酶、缓冲液、SYBR Green与DEPC水按照权利要求书中所述浓度与体积混合,进行基因组扩增。实验结果如图3所示,图中(A)为C:mC为6:4时,100pg基因组DNA时,Bst 2.0 DNA聚合酶浓度为4.5U时,切刻酶选择Nt.AlwI且浓度从0.8U到1.5U的基因组扩增结果;(B)为C:mC为8:2时,100pg基因组DNA时,Bst 2.0 DNA聚合酶浓度为4.5U时,切刻酶选择Nt.AlwI且浓度从0.4U到0.8U的基因组扩增结果。可以看出,利用含有不同浓度的修饰胞嘧啶的dNTP进行DNA扩增,并在此基础上优化切刻酶Nt.AlwI浓度,结果显示而在8:2的比例下,0.8U的Nt.AlwI出现了最优的反应结果,信号呈线性扩增,背景被完全抑制。
实施例1:利用本发明所述方法扩增正常人血液基因组。
样本提取:取正常人血液2mL,使用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取血液中的DNA,最后用200μL洗脱液洗脱收集,取出10μL进行紫外定量,剩下的储存在-20℃下直到使用。在提取DNA时,需要将吸附材料置于室温放置数分钟,以彻底晾干其中残余的漂洗液,防止残留的乙醇影响后续的酶反应。酶切扩增反应结束的反应样使用超薄DNA产物纯化试剂盒提纯DNA,最后用30μL洗脱液收集DNA,为进一步增大基因组DNA的回收率,将上一步得到的洗脱液加回过滤柱中,再次离心。取出10μL进行紫外定量并记录。
紫外定量:将提取或纯化得到的DNA,取出10μL加入190μL的洗脱液制备成200μL的体积。在紫外定量时,首先使用200μL的洗脱液进行校准后,测量待测样本的吸光度,DNA应在OD260处有显著吸收峰,标准的OD260/OD280比值应为1.7-1.9,比值低于1.7说明有蛋白质污染,比值高于1.9这说明有RNA污染,需要进一步纯化。
配置酶切反应体系,取不同质量的基因组DNA(500pg、100pg、40pg、10pg、2ng及0ng),400μM的dNTP,4.5U Bst 2.0 DNA聚合酶和0.8U的Nt.AlwI,80μM的无机焦磷酸酶,0.5×内切酶buffer和0.5×聚合酶buffer混合缓冲液,核酸染料SYBR Green以及水,总体积为20μL。
将上述反应体系置于实时荧光定量PCR仪中,设置反应温度为55℃,对各样品采集随时间变化的荧光曲线。反应结果如图4所示。扩增产物再次进行紫外定量,结果如表1所示:
表1
由图4与表1可知,本发明方法可对来源于正常人血液的基因组DNA进行扩增,基因组DNA的量低至40pg依然有明显的扩增结果,扩增产物达896ng。对于2ng的基因组DNA扩增及纯化后可达4.8μg。
以上内容仅为说明本发明的技术思想,不能以此限定本发明的保护范围,凡是按照本发明提出的技术思想,在技术方案基础上所做的任何改动,均落入本发明权利要求书的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于DNA切刻/聚合链置换循环反应的全基因组自引发扩增方法,其特征在于,包括:首先在基因组相应的酶切位点上采用切刻酶进行酶切形成缺口引发整个扩增反应,然后采用聚合酶进行延伸反应同时链置换得到单链,在聚合酶延伸之后所形成的双链DNA再次被切刻酶切割,在经过多轮切刻、聚合酶延伸并进行链置换的循环后该段基因序列能够被线性扩增得到多拷贝的单链片段,完成自引发扩增实现全基因组放大。
2.根据权利要求1所述的基于DNA切刻/聚合链置换循环反应的全基因组自引发扩增方法,其特征在于,所述切刻酶为能够识别双链DNA且能够切刻单链DNA的内切酶,该内切酶在基因组具有切割位点。
3.根据权利要求2所述的基于DNA切刻/聚合链置换循环反应的全基因组自引发扩增方法,其特征在于,所述切刻酶包括Nt.BbvCI、Nt.AlwI和Nt.CviPII。
4.根据权利要求1所述的基于DNA切刻/聚合链置换循环反应的全基因组自引发扩增方法,其特征在于,所述聚合酶为同时具有5`-3`聚合酶活性以及链置换活性的聚合酶,且该聚合酶不具有5`-3`外切酶活性。
5.根据权利要求4所述的基于DNA切刻/聚合链置换循环反应的全基因组自引发扩增方法,其特征在于,所述聚合酶为Bst 2.0DNA聚合酶。
6.一种实现权利要求1~5中任意一项所述的基于DNA切刻/聚合链置换循环反应的全基因组自引发扩增方法的试剂盒,其特征在于,包括以下成分:
不同浓度的基因组DNA,10pg至2ng;
dNTP,终浓度为400μM;
切刻酶,浓度为2U至3.5U;
聚合酶,浓度为2U至8U;
无机焦磷酸酶,80μM;
终浓度为1X的缓冲液;
核酸染料,终浓度为0.5X;
用DEPC水补充反应体系总体积至20uL。
7.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所述缓冲液为0.5×内切酶buffer和0.5×聚合酶buffer的混合液。
8.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,核酸染料采用终浓度为0.5X的SYBRGreen。
9.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,所用dNTP中加入含有甲基化修饰的胞嘧啶,未修饰的胞嘧啶与已修饰的胞嘧啶用量比为6:4或8:2。
10.根据权利要求6所述的试剂盒,其特征在于,该试剂盒反应时反应温度为55℃。
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