CN108184327A - 用于鉴定耐药性结核的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于诊断和表征结核感染的组合物和方法。特别地，本发明提供了用于鉴定耐药性结核的组合物和方法。

Description

用于鉴定耐药性结核的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年7月14日提交的美国临时申请序列号62/192,446的优先权，其通过引用整体并入本文。
技术领域
本文提供了用于诊断和表征结核感染的组合物和方法。特别地，本文提供了用于鉴定耐药性结核的组合物和方法。
背景技术
结核(TB)是主要影响肺(肺结核)的传染性疾病。患有肺结核的人对于其他人具有传染性，不治疗的情况下此人每年可传染10-15人。
TB与HIV紧密联系。患有HIV的人群发生TB的可能性是HIV阴性人群的37倍。2009年，TB占HIV阳性人群中25%的死亡数。尤其具有HIV高流行的发展中国家为TB高负担区域。
超过90%患有药物敏感性TB的人群可使用诸如利福平和异烟肼的一线药物联合在六个月内被治愈。治疗不适当、低顺应性或间歇疗法可导致发生针对一线药物的耐药性。有时甚至发生耐药性MTB菌的原发感染。
自2010年以来，新发肺结核的推荐治疗是六个月的联合抗生素，包含初始两个月利福平、异烟肼、吡嗪酰胺以及乙胺丁醇，后四个月仅利福平和异烟肼。在对异烟肼的耐药性高时，后四个月可添加乙胺丁醇作为替代。如果检测到多重耐药性TB，推荐使用至少四种有效抗生素治疗18至24个月。
当人感染有耐药性TB菌株时，则发生原发耐药性。患完全敏感性TB的人在治疗过程中可因治疗不适当、采用处方方案不适当(缺乏顺应性)或使用劣质药物治疗而发生继发性(获得性)耐药性。在许多发展中国家，耐药性TB是严重的公共健康问题，因为其治疗较长，并且需要较昂贵的药物。MDR-TB被定义为对两种最有效的一线TB药物利福平和异烟肼耐药。广泛耐药性TB还对六个类别的二线药物中的三种或更多种耐药。完全耐药性TB对所有当前使用的药物耐药。这在2003年于意大利首次被观察到，但是直到2012年才广泛报道，在伊朗和印度也有发现。
使用二线药物治疗MDR-TB较具挑战性、较昂贵、导致较严重的副作用，并且必须采用长达两年。MDR-TB的治愈率较低，通常为约50%至70%。
鉴定具有TB耐药性菌的患者以开始即刻治疗并减少耐药性MTB的扩散是重要的。
发明内容
本文提供了用于诊断和表征结核感染的组合物和方法。特别地，本文提供了用于鉴定耐药性结核的组合物和方法。
例如，在一些实施方案中，本公开内容提供了一种检测受试者中分枝杆菌复合群(MTB)的抗生素耐药性的方法，所述方法包括如下的至少一个步骤：使样品与一种或多种用于检测利福平和异烟肼耐药性基因存在的试剂接触；和使用所述试剂实施利福平和异烟肼耐药性检测分析。在一些实施方案中，所述试剂是例如一种或多种核酸引物和一种或多种核酸探针。在一些实施方案中，所述分析进一步包括如下步骤：使来自受试者的样品与一种或多种用于检测MTB存在的试剂接触；和使用所述试剂实施MTB检测分析。在一些实施方案中，先于利福平和异烟肼耐药性检测分析实施MTB检测分析。在一些实施方案中，MTB检测分析与利福平和异烟肼耐药性检测分析是核酸扩增分析(例如实时PCR)。在一些实施方案中，利福平和异烟肼耐药性检测分析检测选自例如rpoB RRDR、katG或inhA上游启动子的一个或多个靶区中的突变。在一些实施方案中，rpoB中的突变是位于选自例如D516V、H526Y、H526D或S531L的一个或多个氨基酸的突变。在一些实施方案中，katG突变是氨基酸改变S315T1，并且inhA上游启动子突变是核酸突变C-15T。在一些实施方案中，MTB检测分析检测选自IS6110或PAB的一个或多个靶区。在一些实施方案中，第一和第二试剂是SEQ ID NO:1-21中的一种或多种。在一些实施方案中，样品是例如痰、支气管灌洗液(BAL)或N-乙酰基-L-胱氨酸(NALC)沉淀物。在一些实施方案中，MTB是选自例如结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、牛分枝杆菌BCG(Mycobacterium bovis BCG)、卡氏分枝杆菌(Mycobacterium canettii)、田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)、山羊分枝杆菌(Mycobacterium caprae)或海豹分枝杆菌(Mycobacterium pinnipedii)的一种或多种分枝杆菌。在一些实施方案中，所述方法进一步包括基于MTB检测分析结果诊断受试者中MTB感染的步骤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括基于利福平和异烟肼耐药性检测分析来鉴定所述MTB对利福平和/或异烟肼具有耐药性的步骤。在一些实施方案中，先于利福平和异烟肼检测分析实施MTB检测分析。在一些实施方案中，所述方法进一步包括基于MTB检测分析结果与利福平和异烟肼检测分析结果确定治疗行动过程的步骤。在一些实施方案中，所述方法进一步包括施用治疗的步骤。在一些实施方案中，所述治疗包括施用联合抗生素6个月(例如，受试者对其无耐药性的抗生素)。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在治疗过程中或之后重复检测步骤一次或多次的步骤。
其它实施方案提供了一种检测受试者中分枝杆菌复合群(MTB)的存在和抗生素耐药性的方法，所述方法包括：a)使来自受试者的样品与一种或多种用于检测MTB存在的第一试剂接触；b)使用所述第一试剂实施MTB检测分析；c)使所述样品与一种或多种用于检测利福平和异烟肼耐药性基因存在的第二试剂接触；d)使用所述第二试剂实施利福平和异烟肼耐药性检测分析；和e)基于所述MTB检测分析和所述利福平和异烟肼检测分析的结果确定治疗行动过程。
其它实施方案还提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含：一种或多种用于检测利福平和异烟肼耐药性基因存在的试剂，和任选一种或多种用于检测MTB存在的试剂。在一些实施方案中，所述试剂盒进一步包含一种或多种选自例如对照核酸、缓冲剂、核酸聚合酶或说明书的另外组分。
其它实施方案在本文有描述。
附图说明
图1显示了相关rpoB突变的测定。
图2显示了相关KatG和inhA启动子突变的测定。
图3显示了利福平和异烟肼的药物敏感性菌(图3A)和药物耐药性(图3B)菌的检测结果。
图4显示了MTB突变的核苷酸和氨基酸序列。
发明详述
本发明提供了用于诊断和表征结核感染的组合物和方法。特别地，本发明提供了用于鉴定耐药性结核的组合物和方法
定义
本文使用的“一个”或“一种”或“所述”可指一个(种)或多于一个(种)。例如，“一个”小机械可指一个小机械或多个小机械。
本文使用的术语“核酸分子”是指任何包含核酸的分子，包括但不限于DNA或RNA。此术语涵盖包含DNA和RNA的任何已知碱基类似物的序列，所述类似物包括但不限于4-乙酰胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、吖丙啶基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D-甘露糖基Q核苷(beta D mannosylqueosine)、5'-甲氧基羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、oxybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧基乙酸、假尿嘧啶、Q核苷、2-硫代胞嘧啶和RN2,6-二氨基嘌呤。
术语“基因”是指包含产生多肽、前体或RNA(例如rRNA、tRNA)所需的编码序列的核酸(例如DNA)序列。所述多肽可由全长编码序列或编码序列的任何部分编码，只要保持全长或片段的所需活性或功能特性(例如，酶活性、配体结合、信号转导、免疫原性等)。此术语还涵盖结构基因的编码区，和位于编码区邻近的序列，所述序列在5’和3’端的任一端约1kb或更长的距离，使得所述基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区5’和存在于mRNA的序列被称为5’非翻译序列。位于编码区3’或下游和存在于mRNA的序列被称为3’非翻译序列。术语“基因”涵盖基因的cDNA形式和基因组形式两者。基因的基因组形式或克隆包含被称为“内含子”或“干预区”或“干预序列”的非编码序列间断的编码区。内含子是被转录为核RNA(hnRNA)的基因区段；内含子可包含诸如增强子的调节元件。内含子被从核转录本或原始转录本去除或“剪除”；因此在信使RNA(mRNA)转录本中不存在内含子。翻译过程中mRNA发挥指定新生多肽中氨基酸的序列或顺序的作用。
术语“引物”指寡核苷酸，无论其是在经纯化的限制性消化物中天然存在或是合成产生的，所述寡核苷酸当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下时(即，存在核苷酸和诱导剂诸如DNA聚合酶和在合适的温度和pH下)，能够作为合成的起始点而起作用。引物优选是单链的以用于扩增的最大效率，但可选地也可为双链的。如果是双链的，则在用于制备延伸产物前首先将引物处理以分开其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物应足够长以在诱导剂存在的情况下引发延伸产物的合成。引物的精确长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。
本文使用的术语“扩增子”是指经扩增反应产生的核酸。扩增子通常是双链DNA，然而，其可为RNA和/或DNA:RNA。扩增子包含与样品核酸互补的DNA。在一些实施方案中，引物对被构建成自样品核酸产生扩增子。这样，任何给定的扩增子序列可包含引物对，引物对的互补物，以及被扩增以产生扩增子的样品核酸区。本领域技术人员理解所设计的掺入扩增子中的引物对序列可取代引物结合位点的天然序列，及其互补物。在某些实施方案中，在使用引物扩增靶区之后将所产生的具有引物序列的扩增子用于后续的分析。在一些实施方案中，扩增子进一步包含适于后续分析的长度。
术语“扩增(amplifying或amplification)”在核酸的上下文中指产生多个拷贝的多核苷酸、或多核苷酸的部分，通常从少量的多核苷酸开始(例如，少至单个多核苷酸分子)，其中扩增产物或扩增子通常是可检测的。多核苷酸的扩增涵盖多种化学和酶促过程。在聚合酶链反应(PCR)或连接酶链反应(LCR)过程中从一个或几个拷贝的靶DNA或模板DNA分子产生多个DNA拷贝是扩增的形式。扩增不限于起始分子的严格复制。例如，使用逆转录(RT)-PCR从样品中有限量的RNA产生多个cDNA分子是扩增的形式。此外，在转录过程期间从单一DNA分子产生多个RNA分子也是扩增的形式。
本文使用的术语“固体支持物”是指不溶解于核酸纯化或分离中所使用的水溶液的基质或其它固体材料。例如，在一些实施方案中，固体支持物是核酸纯化和分离中所使用的基质。其实例包括但不限于微珠、颗粒、树脂、层析柱等。在一些实施方案中，固体支持物被增强核酸结合的材料包覆或功能化。
本文使用的术语“受试者”和“患者”是指任何动物，例如狗、猫、鸟、牲畜，特别是哺乳动物，优选人。
本文使用的术语“样品”以其最广泛的含义使用。在一种含义中，其意指包括来自任何来源的典型部分或培养物，包括生物来源和环境来源。生物样品可获自动物(包括人)，并且涵盖液体(例如痰)、固体、组织以及气体。生物样品包括血液产物，例如血浆、血清等。在一些实施方案中，样品包括细胞(例如细菌细胞)组织或自所述细胞或组织分离的核酸(例如DNA或RNA)。环境样品包括环境材料，例如表面物质、土壤、泥、淤泥、生物被膜、水以及工业样品。然而，所述实例不应解释为限制适于本公开内容的样品类型。
技术实施方案
尽管本文的公开内容涉及某些示例的实施方案，应理解这些实施方案通过实例的方式而非限制的方式提供。
I. 检测分析
本公开内容的实施方案提供了用于检测抗生素耐药性MTB和任选MTB存在的多部分分析。在一些实施方案中，所述分析首先检测MTB复合群细菌(例如，包括但不限于结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、卡氏分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、山羊分枝杆菌以及海豹分枝杆菌的一种或多种)的存在与否。本公开内容不限于特定的MTB靶。其实例包括但不限于IS6110或PAB。IS6110的Genbank登录号是X17348，PAB的Genbank登录号是M30046。
如果检测到MTB菌(或已知样品为MTB阳性)，则实施测定细菌中利福平和/或异烟肼耐药性存在与否的分析。在一些实施方案中，在无MTB检测阶段的情况下(例如，当个体已被诊断有MTB感染)实施所述分析的抗生素耐药性阶段。在一些实施方案中，在不进行进一步样品制备的情况下于MTB检测阶段之后实施所述分析的耐药性检测相。
在一些实施方案中，基于rpoB中的突变(例如，包括但不限于D516V、H526Y、H526D或S531L)测定利福平耐药性。图1显示了相关rpoB突变的测定。
在一些实施方案中，基于katG和inhA启动子突变(例如，包括但不限于katG中的S315T1和inhA启动子中的C-15T)测定异烟肼耐药性。图2显示了相关katG和inhA突变的测定。
用于鉴定上述突变的示例引物和探针示于SEQ ID NO: 1-21。本公开内容不限于SEQ ID NO: 1-21中描述的引物和探针。本公开内容进一步考虑包含SEQ ID NO: 1-21的序列，SEQ ID NO: 1-21的变体(例如，包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多核苷酸添加(例如添加至3’或5’端)、缺失(例如在中间，或自3’或5’端)或取代)，能够在低至高严谨条件下与SEQ ID NO: 1-21杂交的多核苷酸序列，等等，基本由其组成或由其组成。在一些实施方案中，变体包含非天然核苷酸。在一些实施方案中，核酸包含标记物(例如本文描述的那些)。
在一些实施方案中，如下列实施例1中所述，使用实时PCR/探针检测分析(RT-PCR)示例本公开内容。然而，本公开内容不限于RT-PCR。其它的检测方法在下文描述。
任何合适的样品可用于本文公开的组合物和方法。在一些实施方案中，样品是痰、唾液、支气管灌洗液(BAL)或任何前述样品的N-乙酰基-L-胱氨酸(NALC)沉淀物。在一些实施方案中，在分析之前处理样品(例如分离细菌DNA、改进纯度、去除可影响分析操作的物质等)。在一些实施方案中，在不进一步处理的情况下使用样品。
在一些实施方案中，样品制备和分析操作是自动化的(例如使用自动化样品处理、扩增以及分析系统)。在一些实施方案中，使用市售的系统(例如，可获自Abbott，AbbottPark，IL；参见例如美国专利第8,703,445号，其通过引用整体并入本文)。
在一些实施方案中，本公开内容提供了用于分析和显示数据的软件和计算机处理器以及显示屏(例如，计算机、便携机、智能手机、平板电脑等)。
在一些实施方案中，以系统或试剂盒的形式提供分析组分。在一些实施方案中，试剂盒包含分析试剂(例如核酸引物或探针、缓冲剂、对照物、dNTP等)、对照物、软件、说明书等。在一些实施方案中，在一个或多个分开的容器(例如小瓶、孔、试管等)中提供试剂。例如，在一些实施方案中，样品制备试剂、MTB检测试剂以及抗生素耐药性检测突变各自在分开的容器中提供。
在一些实施方案中，MTB检测和突变分析测定是核酸检测分析(例如，扩增、测序、杂交等)。核酸扩增技术的示例非限制性实例包括但不限于聚合酶链反应(PCR)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、转录介导的扩增(TMA)、连接酶链反应(LCR)、链置换扩增(SDA)和基于核酸序列的扩增(NASBA)。本领域普通技术人员应认识到某些扩增技术(例如PCR)需要在扩增前将RNA逆转录为DNA(例如RT-PCR)，而其它扩增技术直接扩增RNA(例如TMA和NASBA)。
在一些实施方案中，使用核酸测序方法(例如用于检测所扩增的核酸)。在一些实施方案中，本文提供的技术可用于第二代(又称为下一代或下-代)、第三代(又称为下-下-代)或第四代(又称为N3-代)测序技术，包括但不限于焦磷酸测序、连接测序、单分子测序、合成测序(SBS)、半导体测序、大规模并行克隆、大规模并行单分子SBS、大规模并行单分子实时、大规模并行单分子实时纳米孔技术等。Morozova和Marra于Genomics, 92: 255(2008)提供了一些此类技术的综述，通过引用该综述整体并入本文。本领域普通技术人员应认识到，由于RNA在细胞中较不稳定，较易于在实验上受核酸酶攻击，通常在测序前将RNA逆转录为DNA。
多种DNA测序技术是合适的，包括基于荧光的测序方法(见，例如，Birren等，Genome Analysis: Analyzing DNA, 1, Cold Spring Harbor, N.Y.，其通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，此技术可用于本领域技术人员理解的自动化测序技术。在一些实施方案中，此技术可用于分区扩增子的并行测序(Kevin McKernan等，PCT公开号：WO2006084132，其通过引用整体并入本文)。在一些实施方案中，此技术可通过并行寡核苷酸延伸用于DNA测序(见，例如，Macevicz等，美国专利号5,750,341；和Macevicz等，美国专利号6,306,597，通过引用这些文献整体均并入本文)。此技术可应用的测序技术的其它实例包括Church polony技术(Mitra等，2003, Analytical Biochemistry 320, 55-65；Shendure等，2005 Science 309, 1728-1732；美国专利号6,432,360，美国专利号6,485,944，美国专利号6,511,803；通过引用这些文献整体并入本文)，454皮滴度焦磷酸测序技术(Margulies等，2005 Nature 437, 376-380；US 20050130173，通过引用这些文献整体并入本文)，Solexa单碱基添加技术(Bennett等，2005, Pharmacogenomics, 6, 373-382；美国专利号6,787,308；美国专利号6,833,246，通过引用这些文献整体并入本文)，Lynx大规模并行信号测序技术(Brenner等，(2000). Nat. Biotechnol. 18:630-634；美国专利号5,695,934；美国专利号5,714,330，通过引用这些文献整体并入本文)，Adessi PCR集落技术(Adessi 等，(2000). Nucleic Acid Res. 28, E87；WO 00018957，通过引用这些文献整体并入本文)。
下一代测序(NGS)方法共有以下共同特征：大规模并行、高通量策略，目标在于与较早测序方法相比成本较低(见，例如，Voelkerding等，Clinical Chem., 55: 641-658,2009；MacLean等，Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296，通过引用这些文献各自整体并入本文)。NGS方法广义上可被分为通常使用模板扩增的那些和不使用模板扩增的那些。需要扩增的方法包括Roche商业化的作为454技术平台的焦磷酸测序(例如GS 20和GS FLX)；Life Technologies/Ion Torrent；Illumina，GnuBio商业化的Solexa平台；以及AppliedBiosystems商业化的支持寡核苷酸连接和检测(SOLiD)平台。非扩增方法(也称为单分子测序)分别通过Helicos BioSciences商业化的HeliScope平台，VisiGen，Oxford NanoporeTechnologies Ltd.和Pacific Biosciences商业化的新兴平台示例。
在焦磷酸测序(Voelkerding等，Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean等，Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296; 美国专利号6,210,891; 美国专利号6,258,56，通过引用这些文献各自整体并入本文)，将模板DNA进行片段化、末端修复，连接至适配子，并通过使用携带与适配子互补的寡核苷酸的微珠捕获单模板分子来进行原位克隆扩增。将各携带单模板类型的微珠分区到油包水微泡中，并且使用被称为乳液PCR的技术对模板进行克隆扩增。在扩增之后破坏乳液，在测序反应过程中将微珠沉积至作为流动池发挥作用的皮滴度板(picotitre plate)的各孔中。在测序酶和诸如荧光素酶的荧光报告物的存在下，流动池中发生四种dNTP试剂中的各试剂的有序、反复引入。在合适的dNTP添加至测序引物的3’端的情况中，所导致的ATP生成使得孔内爆发荧光，这使用CCD照相机记录。可实现读数长度大于或等于400个碱基，并且可实现106个序列读数，产生多达5亿个碱基对(Mb)的序列。
在Solexa/Illumina平台(Voelkerding等，Clinical Chem., 55: 641-658,2009；MacLean等，Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296；美国专利号6,833,246；美国专利号7,115,400；美国专利号6,969,488，通过引用各文献整体并入本文)中，以较短长度读数形式产生测序数据。在该方法中，单链片段化DNA被末端修复以产生5’-磷酸化的钝末端，之后是Klenow介导的单个A碱基添加至片段的3’端。A添加有利于T突出端适配子寡核苷酸的添加，其后续用于捕获散布有寡核苷酸锚的流动池表面上的模板-适配子分子。所述锚用作PCR引物，但是由于模板的长度及其接近其它邻近锚寡核苷酸，PCR延伸导致分子“拱起(arching over)”以与邻近的锚寡核苷酸杂交而形成流动池表面上的桥结构。这些DNA环被变性和裂解。然后使用可逆性染料终止剂对正向链进行测序。所掺入的核苷酸序列通过检测掺入后荧光来确定，在下一循环的dNTP添加之前去除各荧光和封闭剂(fluor andblock)。序列读数长度范围为36个核苷酸至超过250个核苷酸，每一分析运行的总输出超过十亿个核苷酸对。
使用SOLiD技术对核酸分子测序(Voelkerding等，Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean等，Nature Rev. Microbiol., 7: 287-296; 美国专利号5,912,148;美国专利号6,130,073，通过引用这些文献各自整体并入本文)还涉及模板的片段化、连接寡核苷酸适配子、附着微珠以及通过乳液PCR克隆扩增。在此之后，将携带模板的微珠固定化于玻璃流动池的衍生表面，并将与适配子寡核苷酸互补的引物退火。然而，不利用此引物用于3’延伸，其取而代之地用于提供5’磷酸基团用于连接查询探针(interrogationprobe)，所述探针包含两个探针特异性碱基，之后是6个简并碱基和4个荧光标记物之一。在SOLiD系统中，查询探针具有在各探针的3’末端处两个碱基和5’末端4个荧光之一的16种可能的组合。荧光颜色和由此各探针的身份对应于特定的颜色-空间编码方案。多轮(通常7轮)探针退火、连接以及荧光检测之后是变性，然后使用相对于起始引物偏移1个碱基的引物进行第二轮测序。以此方式，模板序列可经计算性重建，并且模板碱基被查询两次，导致精确度增加。序列读数长度平均为35个核苷酸，每一测序运行的总输出超过40亿个碱基。
在某些实施方案中，此技术可用于纳米孔测序(见，例如Astier等，J. Am. Chem.Soc. 2006 Feb 8; 128(5):1705–10，其通过引用整体并入本文)。纳米孔测序背后的理论与当纳米孔浸于导电流体和电位(伏特)施加于其上时所发生的相关联。在这些条件下，可观察到由于离子通过纳米孔导电产生的轻微电流，并且电流量对纳米孔的尺寸非常敏感。由于核酸的各碱基通过纳米孔，这导致通过纳米孔的电流幅值改变，其对于四种碱基中的各碱基来说不同，由此使得测定DNA分子的序列。
在某些实施方案中，此技术可用于Helicos BioSciences的HeliScope(Voelkerding等，Clinical Chem., 55: 641-658, 2009; MacLean等，Nature Rev.Microbiol., 7: 287-296; 美国专利号7,169,560; 美国专利号7,282,337; 美国专利号7,482,120; 美国专利号7,501,245; 美国专利号6,818,395; 美国专利号6,911,345; 美国专利号7,501,245，通过引用这些文献各自整体并入本文)。模板DNA被片段化并在3’端被多聚腺苷酸化，最终的腺苷酸携带荧光标记物。将变性的多聚腺苷酸模板片段与流动池表面的多聚(dT)寡核苷酸连接。通过CCD照相机记录所捕获的模板分子的起始物理位置，然后裂解并洗除标记物。通过添加聚合酶和顺序添加荧光标记的dNTP试剂实现测序。掺入事件导致对应于dNTP的荧光信号，在各轮dNTP添加前通过CCD照相机捕获信号。序列读数长度范围为25-50个核苷酸，每一分析运行的总输出超过10亿个核苷酸对。
Ion Torrent技术是一种基于对DNA聚合过程中释放的氢离子的检测的DNA测序方法(见，例如Science 327(5970): 1190 (2010); 美国专利申请公布号20090026082,20090127589, 20100301398, 20100197507, 20100188073, 以及20100137143，出于所有目的通过引用这些文献整体并入本文)。微孔包含待测序的模板DNA链。在微孔层之下是超敏ISFET离子传感器。所有层均包含在CMOS半导体芯片内，所述芯片与用于电子工业的相似。当dNTP被掺入生长的互补链中时，氢离子被释放，这触发超敏离子传感器。如果均聚物重复存在于模板序列中，在单个循环中将有多个dNTP分子掺入。这导致相应数量被释放的氢和按比例较高的电子信号。此技术不同于其它测序技术在于不使用修饰的核苷酸或光学。Ion Torrent测序仪的每一碱基精确度是50个碱基读数约99.6%，每一运行产生约100Mb至100 Gb。读数长度为100-300个碱基对。5个重复长度的均聚物重复的精确度为约98%。离子半导体测序的益处是测序速度快，预付和操作成本低。
此技术可用于Stratos Genomics, Inc.开发的另一核酸测序方法，并涉及Xpandomers的使用。此测序过程通常包括提供由模板指导的合成所产生的子链。子链通常包含对应于靶核酸整体或一部分的连续核苷酸序列的序列中偶联的多个亚单位，其中，各亚单位包含系链，至少一种探针或核苷碱基残基，以及至少一个可选择性裂解的键。一个或多个可选择性裂解的键被裂解而产生长度大于所述子链的多个亚单位的Xpandomer。Xpandomer通常包含系链，和报告元件，所述报告元件用于解析对应于靶核酸整体或一部分的连续核苷酸序列的序列中的遗传信息。然后，检测Xpandomer的报告元件。基于Xpandomer的方法相关的其它细节在例如2008年6月19日提交的标题为“High Throughput NucleicAcid Sequencing by Expansion(通过扩增的高通量核酸测序)”的美国专利公开号20090035777(其通过引用整体并入本文)中有描述。
其它新兴单分子测序方法包括使用VisiGen平台通过合成的实时测序(Voelkerding等，Clinical Chem., 55: 641–58, 2009; 美国专利号7,329,492; U.S.Pat. App. Ser. No. 11/671956; U.S. Pat. App. Ser. No. 11/781166，通过引用这些文献各自整体并入本文)，其中使用荧光修饰的聚合酶和荧光受体分子使固定化、引发的DNA模板经受链延伸，当添加核苷酸时导致可检测的荧光共振能量转移(FRET)。
在一些实施方案中，检测方法使用杂交分析。核酸杂交技术的示例的非限制性实例包括但不限于微列阵，包括但不限于DNA微列阵(例如cDNA微列阵和寡核苷酸微列阵)。DNA微列阵，通常称为基因芯片、DNA芯片或生物芯片，是附着于固体表面(例如玻璃、塑料或硅芯片)的微观DNA斑点集合，其形成阵列，目的在于表达谱分析或同时监测成千上万基因的表达水平。附着的DNA区段称为探针，成千上万个探针可用于单个DNA微列阵。微阵列通过比较疾病和正常细胞的基因表达可用于鉴定疾病基因或转录本。可使用多种技术制造微阵列，包括但不限于，使用细尖针印刷至载玻片上，使用预先制备的掩蔽物的照相平版印刷，使用动态微镜装置的照相平版印刷，喷墨打印，或微电极阵列上的电化学。
Southern和Northern印迹分别用于检测特定的DNA或RNA序列。将自样品提取的DNA或RNA片段化，在基质凝胶上电泳分离，转移至膜过滤器。结合DNA或RNA的过滤器经受与标记探针杂交，所述标记探针与目的序列互补。检测与过滤器结合的杂交探针。该程序的变型为逆Northern印迹，其中附着于膜的基质核酸为所分离的DNA片段的集合，探针是自组织提取并标记的RNA。
一种示例的检测方法—杂交保护分析(HPA)涉及将化学发光寡核苷酸探针(例如吖啶酯(AE)标记的探针)与靶序列杂交，选择性水解存在于未杂交的探针上的化学发光标记物，测量光度计中保留的探针所产生的化学发光。见，例如美国专利号5,283,174和Norman C. Nelson等，Nonisotopic Probing, Blotting, and Sequencing, 第17章(Larry J. Kricka编辑，第2版，1995，这些文献各自通过引用整体并入本文)。
将荧光团与核酸探针连接为本领域公知，可通过任何可得方法实现。例如，可将荧光团与特定的核苷酸共价连接，并可使用标准技术例如缺口平移、随机引发、PCR标记等将所标记的核苷酸掺入探针。或者，荧光团可经由接头共价连接至已经被转氨化的探针的脱氧胞苷核苷酸。用于标记探针的方法描述于美国专利号5,491,224和MolecularCytogenetics:Protocols and Applications (2002), Y.-S. Fan, 编辑, 第 2章“Labeling Fluorescence In Situ Hybridization Probes for Genomic Targets,” L.Morrison 等人, 第21-40页, Humana Press，这两份文献均通过引用其关于标记探针的描述而并入本文。
可用于标记探针的示例性荧光团包括德克萨斯红(Molecular Probes, Inc.,Eugene, Oreg.)、级联蓝乙酰基叠氮化物(Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.)、SPECTRUMORANGETM□(Abbott Molecular, Des Plaines, Ill.)和SPECTRUMGOLDTM□(Abbott Molecular)。
可用于本文描述的方法中的荧光团的实例是：7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(AMCA)；5-(和-6)-羧基-X-罗丹明、丽丝胺罗丹明B、5-(和-6)-羧基荧光素；荧光素-5-异硫氰酸酯(FITC)；7-二乙基氨基香豆素-3-羧酸、四甲基-罗丹明-5-(和-6)-异硫氰酸酯；5-(和-6)-羧基四甲基罗丹明；7-羟基香豆素-3-羧酸；6-[荧光素5-(和-6)-甲酰胺基]己酸；N-(4,4-二氟-5,7-二甲基-4-硼-3a,4a二氮杂-3-引达省丙酸(indacenepropionic acid)；曙红-5-异硫氰酸酯；赤藓红-5-异硫氰酸酯；5-(和-6)-羧基罗丹明6G；和级联蓝乙酰基叠氮化物(Molecular Probes，Inc.，Eugene，Oreg.)。
可使用荧光显微镜和对于每种荧光团的适当滤光片或通过使用双重或三重带通滤光片组来观察多种荧光团以观察探针。参见例如Bittner等人的美国专利号5,776,688，其通过引用并入本文。可使用任何合适的显微镜成像方法来显现杂交探针，包括自动化数字成像系统，例如可从MetaSystems或Applied Imaging获得的那些。或者，可使用诸如流式细胞术的技术来检查染色体探针的杂交模式。
也可通过本领域公知的方法例如用生物素或地高辛(digoxygenin)间接地标记探针。然而，随后使用二级检测分子或进一步处理来可视化标记的探针。例如，用生物素标记的探针可通过与可检测标记物例如荧光团缀合的抗生物素蛋白来检测。此外，抗生物素蛋白可与酶标记物如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶缀合。可使用酶的底物在标准比色反应中检测此类酶标记物。碱性磷酸酶的底物包括5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯和硝基蓝四唑鎓。二氨基苯甲酸酯可用作辣根过氧化物酶的底物。杂交的生物素或其它间接标记的探针的荧光检测可通过使用市售的酪酰胺放大系统来实现。
可使用其它试剂或染料代替荧光团作为含标记物的部分。可连接探针的合适的标记物包括但不限于放射性同位素、荧光团、发色团、质量标记物、电子致密颗粒、磁性颗粒、自旋标记、发射发光的分子、电化学活性分子、酶、辅因子和酶底物。发光剂包括例如含放射性发光、化学发光、生物发光和磷光标记物的部分。或者，可使用通过间接方法可视化的检测部分。例如，可使用本领域已知的常规方法用生物素或地高辛标记探针，然后进一步处理用于检测。含有生物素的探针的可视化可通过与可检测标记物缀合的抗生物素蛋白的随后结合来实现。可检测标记物可为荧光团，在这种情况下可如上文针对ISH所述实现探针的可视化和辨别。
在一些实施方案中，探针被设计成具有在整个核酸中以共同间隔放置的标记物(例如每3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个一个标记物组)。
在一些实施方案中，探针文库包含具有不同可检测标记物(例如，不同颜色的荧光信号)的探针。
或者，与靶区杂交的探针可通过标记物部分与合适底物的酶促反应用于产生不溶性颜色产物来显现。可通过随后与缀合至碱性磷酸酶(AP)或辣根过氧化物酶(HRP)的抗生物素蛋白和合适底物孵育来检测组内的含生物素的探针。5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸和硝基蓝四唑鎓(NBT)用作碱性磷酸酶的底物，而二氨基联苯胺用作HRP的底物。
在使用荧光团标记的探针或探针组合物的实施方案中，检测方法可涉及荧光显微术、流式细胞术或用于确定探针杂交的其它方法。任何合适的显微镜成像方法可结合本公开内容的方法使用以观察多种荧光团。在使用荧光显微镜的情况下，可在适于激发每种荧光团的光下并且使用一种或多种合适的滤光片来观察杂交样品。或者，可使用诸如MetaSystems、BioView或Applied Imaging系统的自动化数字成像系统。
II. 诊断、治疗以及监测
本公开内容的实施方案提供了用于诊断MTB、确定MTB感染的抗生素耐药性状况以及确定和施用治疗行动过程(例如，用于治疗结核或其它MT感染)的组合物和方法。
在一些实施方案中，向使用本文描述的方法鉴定为抗生素敏感性的个体施用结核的标准治疗(例如，初始两个月利福平、异烟肼、吡嗪酰胺以及乙胺丁醇，后四个月仅利福平和异烟肼)。
如果鉴定出对一种或多种抗生素耐药，则使用备选的治疗。在一些实施方案中，向使用本文描述的方法鉴定为具有多重耐药的MTB的个体施用贝达喹啉(bedaquiline)。
在一些实施方案中，重复本文描述的抗生素耐药性MTB分析多次(例如，每个月一次，每6个月一次，每年一次，或数年一次)以确定在治疗过程中MTB感染是否变得耐药。在一些实施方案中，在MTB感染复发后重复分析。
本公开内容考虑能够接收、处理以及传递信息到实施分析的实验室、信息提供者、医疗人员以及受试者的任何方法；和从实施分析的实验室、信息提供者、医疗人员以及受试者接收、处理以及传递信息的任何方法。例如，在本公开内容的一些实施方案中，自受试者获取样品(例如痰或BAL样品)，将其递交至位于世界任何部分(例如在不同于受试者所居住的国家或最终使用信息的国家的国家)的谱分析服务机构(例如，医疗机构的临床实验室，基因组谱分析商业机构等)以生成原始数据。当样品包含组织或其它生物样品时，受试者可拜访医疗中心以获得样品并送至谱分析中心，或受试者可自身采集样品(例如痰样品)和直接将其送至谱分析中心。谱分析服务机构一旦接收样品，则对其进行处理并产生谱(例如MTB抗生素抗药性谱)，这对于所述受试者所需的诊断或预后信息来说具有特异性。
然后，通过治疗的临床医师以适于解释的格式制备谱数据。例如，所制备的格式可提供受试者的诊断或风险评价(例如，耐药性MTB的存在)连同特定治疗选择的建议，而非提供原始数据。所述数据可通过任何合适的方法展示给临床医师。例如，在一些实施方案中，谱分析服务机构生成可为临床医师打印(例如在护理点)或可在计算机显示器上展示给临床医师的报告。
在一些实施方案中，首先在护理点或在区域机构对信息进行分析。然后将原始数据送至中心处理机构以进一步分析和/或将原始数据转化为可用于临床医师或患者的信息。中心处理机构提供数据分析的隐私(所有数据均以统一的安全协议储存在中心机构)、速度以及统一性的优势。然后，中心处理机构可调控受试者治疗后的数据结局。例如，使用电子通信系统，中心机构可将数据提供给临床医师、受试者或研究者。
在一些实施方案中，受试者能够使用电子通信系统直接获取数据。受试者可基于结果选择进一步的干预或咨询。在一些实施方案中，所述数据用于研究用途。例如，所述数据可用于进一步优化包含或去除作为特定病症或疾病阶段的有用指示物的标记物。
实验
实施例1
此实施例描述MTB检测分析。
MTB分析是用于MTB复合群的直接、定性检测的定性体外聚合酶链反应(PCR)分析。MTB复合群包括8个分枝杆菌种类：结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、卡氏分枝杆菌、田鼠分枝杆菌、山羊分枝杆菌、海豹分枝杆菌。
将用于MTB分析的样本，包括分析对照，上样于自动化仪器上。使用来自Abbott m TMSample Preparation SystemDNA的DNA GPR样品制备试剂提取DNA。将扩增/检测试剂并入主混合物(mastermix)，并通过m2000sp转移至96孔PCR盘。通过m2000sp将样品洗脱液添加至96孔PCR盘用于后续的扩增/检测反应。同样，样品制备和PCR平板制备也可手工实施。手工密封平板并将其转移至m2000rt用于扩增和实时荧光检测反应。对于每一运行使用阴性对照和阳性对照。在m2000rt工作站自动报告患者结果。具有小于或等于预定值的有效循环数的信号被认为是阳性。无扩增或具有大于预定值的有效循环数的信号被认为是阴性。当IC无效时，使阴性信号无效。
Abbott实时MTB寡核苷酸试剂(代码08N15L或8N15L0099)包括PCR寡核苷酸缓冲剂、超纯水、dNTP、一种正向引物、一种反向引物和一种用于TB IS6110的探针、一种正向引物、一种反向引物、一种用于TB PAB的探针、一种正向引物、一种反向引物、和一种用于IC的IC探针，以及ROX被动参照标准。将寡核苷酸试剂填充并装配至Abbott实时MTB扩增试剂盒。
激活试剂(代码51-503200)包含MgCl2，TaqGold酶的辅助因子。激活试剂通过混合氯化镁、Tris、KCl、Proclin 950、叠氮化钠以及超纯水而制备。过滤之后，将激活试剂(代码51-503200FL)填充并装配至Abbott实时MTB扩增试剂盒。
通过将AmpliTaq Gold DNA聚合酶(代码33794)填充至小瓶(代码3379400FL)制备酶试剂。在填充之后，将其装配至Abbott实时MTB扩增试剂盒。
Abbott实时MTB对照用于评价运行有效性。对照试剂盒由阳性对照和阴性对照组成。阳性对照由二元靶PAB/IS6110质粒DNA、Proclin 950、叠氮化钠以及于TE缓冲液中的多聚dA:dT组成。阴性对照由TE缓冲液、Proclin 950、叠氮化钠组成。将阴性对照(代码8N15Z0001)和阳性对照(代码8N15W0001)填充、标记并包装至Abbott实时MTB对照试剂盒。
样品制备试剂盒
Abbott样品制备系统(List 6K12-24)包含使用非特异性捕获化学方法分离DNA的通用试剂。这些试剂由Promega Corporation为Abbott Laboratories制造，并由AbbottLaboratories分配。
实时MTB扩增试剂盒配方
* KRAS 5X PCR寡核苷酸缓冲液包含Tris、EDTA、EGTA、KCl、叠氮化钠以及Proclin950。
** 激活试剂在包含Tris、KCl、叠氮化钠以及Proclin 950的缓冲液中。
对照试剂盒配方
* 对照试剂包含叠氮化钠和Proclin 950。
循环条件
实施例2
此实施例描述了实施MTB RIF/INH耐药性分析的实验方案。
A.试剂
扩增试剂盒
实时MTB RIF/INH耐药性扩增试剂盒包含3个试剂包和2个内对照瓶(所描述的核酸的序列在下文给出)。
(1)试剂包A
1瓶MTB RIF-1耐药性寡核苷酸试剂A：PCR寡核苷酸缓冲液、超纯水、ProClin 950、叠氮化钠、dNTP、IC反向引物、IC正向引物、IC探针、rpoB正向引物、rpoB反向引物、rpoB rPb1探针、rpoB rPb2探针、rpoB rPb3、以及rpoB Pb4探针；
1瓶AmpliTaq Gold DNA聚合酶；
1瓶激活试剂。
(2)试剂包B
1瓶MTB RIF-2耐药性寡核苷酸试剂B：PCR寡核苷酸缓冲液、ProClin 950、叠氮化钠、超纯水、dNTP、IC反向引物、IC正向引物、IC探针、rpoB正向引物、rpoB反向引物、rpoB Pb5、rpoB Pb6、rpoB rPb7以及rpoB Pb8探针；
1瓶AmpliTaq Gold DNA聚合酶；
1瓶激活试剂。
(3)试剂包C
1瓶MTB INH耐药性寡核苷酸试剂C：PCR寡核苷酸缓冲液、ProClin 950、叠氮化钠、超纯水、dNTP、IC反向引物、IC正向引物、IC探针、katG正向引物、katG反向引物、inhA正向引物、inhA反向引物、katGrPbwtS315-13b探针、katGrPbm315T1-13b探针、inhA rPbwt-16探针以及inhA rPbm15T-14探针；
1瓶AmpliTaq Gold DNA聚合酶；
1瓶激活试剂。
(4)内对照
2瓶MTB内对照
寡核苷酸试剂被填充并装配至Abbott实时MTB RIF/INH耐药性扩增试剂盒。
激活试剂包含MgCl2、TaqGold酶的辅助因子。
激活试剂通混合氯化镁、Tris、KCl、Proclin 950、叠氮化钠以及超纯水而制备。过滤之后，将激活试剂填充并装配至Abbott实时MTB RIF/INH耐药性扩增试剂盒。
通过将AmpliTaq Gold DNA聚合酶填充至小瓶制备酶试剂。在填充之后，将其装配至Abbott实时MTB RIF/INH耐药性扩增试剂盒。
对照试剂盒
Abbott实时MTB RIF/INH耐药性对照用于评价运行有效性。对照试剂盒包含阳性对照和阴性对照。阳性对照由包含5种具有三个靶区的DNA序列的质粒DNA(rpoB RIF耐药性确定区(RRDR)野生型、katG野生型、inhA上游启动子(USP)野生型、katG突变、inhA上游启动子(USP)突变)、Proclin 950、叠氮化钠以及TE缓冲液中的多聚dA:dT组成。阴性对照由TE缓冲液、Proclin 950、叠氮化钠组成。将阴性对照和阳性对照填充、标记并包装至Abbott实时MTB RIF/INH耐药性对照试剂盒。
样品制备试剂盒
Abbott样品制备系统(List 6K12-24)包含使用非特异性捕获化学方法分离DNA的通用试剂。这些试剂由Promega Corporation为Abbott Laboratories制造，并由AbbottLaboratories分配。
实时MTB扩增试剂盒配方
* 寡核苷酸混合物(RIF-1(试剂A)、RIF-2(试剂B)、以及INH(试剂C)在含Tris、EDTA、EGTA、KCl、引物、探针、以及约0.085%叠氮化钠和0.15%Proclin 950的PCR寡核苷酸缓冲液中。
** 激活试剂在含Tris、KCl、0.084%叠氮化钠以及0.15% Proclin 950的缓冲液中。
对照试剂盒配方
对照 组分 目标水平
阴性对照* TE缓冲液 N/A
阳性对照** MTB耐药性wt-15T-315T1质粒DNA 4E5拷贝数/mL
TE缓冲液 N/A
多聚dA:dT** N/A
* 阴性对照试剂在含Tris、EDTA、0.085%叠氮化钠以及0.15% Proclin 950的缓冲液中。
**阳性对照(PC)试剂在含Tris、EDTA、1.5 UG/ML终浓度的多聚dA:dT、PC质粒、约0.085%叠氮化钠以及0.15% Proclin 950的缓冲液中。
核酸引物和探针
rpoB FP 5’-GAG GCG ATC ACA CCG CAG ACG TT-3’ (SEQ ID NO:1)
rpoB RP 5’-TCC AGC CCG GCA CGC TCA CGT-3’(SEQ ID NO:2)
katG FP 5’-TCC GCT GGA GCA GAT GGG CTT G-3 (SEQ ID NO:3)
katG RP 5’-CGA GGA AAC TGT TGT CCC ATT TCG-3’(SEQ ID NO:4)
inhA FP 5’-ACG TTA CGC TCG TGG ACA TAC CGA-3’(SEQ ID NO:5)
inhA RP 5’-ACT GAA CGG GAT ACG AAT GGG-3’(SEQ ID NO:6)
rpoB rPb1 5’-CFR 610-GCT GGC TGG TGC C-MGB-DQ-3’(SEQ ID NO:7)
rpoB rPb2 5’-NED-TCT GGT CCA TGA ATT-MGB-3’(SEQ ID NO:8)
rpoB rPb3 5’-VIC-CAA CCC CGA CAG C-MGB-3’(SEQ ID NO:9)
rpoB Pb4 5’-6FAM-CTG TCG GCG CTG G-MGB-3’(SEQ ID NO:10)
rpoB Pb5 5’-CFR610-CAG CTG AGC CAA TT-MGB-3’(SEQ ID NO:11)
rpoB Pb6 5’-NED-AGA ACA ACC CGC TG-MGB-3’(SEQ ID NO:12)
rpoB rPb7 5’-VIC-CTT GTG GGT CAA CC-MGB-3’(SEQ ID NO:13)
rpoB Pb8 5’-6FAM-AGC GCC GAC TGT CG-MGB-3’(SEQ ID NO:14)
katGrPbwtS315-13b 5’-NED-ATG CCG CTG GTG A-MGB-3’(SEQ ID NO:15)
katGrPbm315T1-13b 5’-6FAM-ATG CCG GTG GTG A-MGB-3’(SEQ ID NO:16)
inhA rPbwt-16 5’-CFR610-ACA ACC TAT CGT CTC G-MGB-3’(SEQ ID NO:17)
inhA rPbm15T-14 5’-VIC-CAA CCT ATC ATC TC-MGB-3’(SEQ ID NO:18)
IC FP 196 5’ CTA CAG CAG AGT TGG CAG CTT CAC TTT C 3’(SEQ ID NO:19)
IC RP 310 5’ GTC TGG CCT TTC AGC AAG TTT C 3’(SEQ ID NO:20)
内对照探针：5’ Quasar-GApdC GAG pdUpdUpdC ApdUG AGG
GpdCA-BHQ2 dT 3’(SEQ ID NO:21)
热稳定AmpliTaq Gold DNA聚合酶
#pdU=5'PROPYNYL dU *pdC=5'PROPYNYL dC. MGB-DQ = EDQ, CFR610 =
Cal Fluor Red 610。
下表描述了rpoB引物、katG引物、inhA引物、内对照引物以及内对照探针：
下表描述了各探针的突变覆盖。
下列是rpoB、katG以及inhA上游启动子的引物和探针/突变的genBank登录号或TB耐药性突变数据库参考。
rpoB F1210-23: 5’-GAG GCG ATC ACA CCG CAG ACG TT-3’ (gb/AL123456)RIF-1小瓶和RIF-2小瓶
rpoB R1394-21: 5’-TCC AGC CCG GCA CGC TCA CGT-3’ (gb/AL123456) RIF-1小瓶和RIF-2小瓶
katG F873-22:5’-TCC GCT GGA GCA GAT GGG CTT G-3’ (gb/AL123456) INH小瓶
katG R1000-24:5’-CGA GGA AAC TGT TGT CCC ATT TCG-3’ (gb/AL123456) INH小瓶
inhA F1673379-24:5’-ACG TTA CGC TCG TGG ACA TAC CGA-3’ (gb/AL123456) INH小瓶
inhA R1673492-21:5’-ACT GAA CGG GAT ACG AAT GGG-3’ (gb/AL123456) INH小瓶
rpoB rPb1(rPb1288-13(1h)):5’-CalFluoRed 610-GCTGGCTGGTGCC-MGB-3’ (gb/AL123456, Rv0667) RIF-1小瓶
rpoB rPb2 (rPb1309-15(2c)):5’-NED-TCTGGTCCATGAATT-MGB-3’ (gb/AL123456,Rv0667) RIF-1小瓶
rpoB rPb3(rPb1329-13(3S)):5’-VIC-CAACCCCGACAGC-MGB-3’ (gb/AL123456,Rv0667) RIF-1小瓶
rpoB Pb4(Pb1345-13(4k)):5’-6FAM-CTGTCGGCGCTGG-MGB-3’ (gb/AL123456,Rv0667) RIF-1小瓶
rpoB Pb5(Pb1285-14(5a)):5’-CalFluoRed 610-CAGCTGAGCCAATT-MGB-3’ (gb/AL123456, Rv0667) RIF-2小瓶
rpoB Pb6(Pb1307-14(6d)):5’-NED-AGAACAACCCGCTG-MGB-3’ (gb/AL123456,Rv0667) RIF-2小瓶
rpoB rPb7(rPb1338-14(7h):5’-VIC-CTTGTGGGTCAACC-MGB-3’ (gb/AL123456,Rv0667) RIF-2小瓶
rpoB Pb8(Pb1337-14(8J)):5’-6FAM-AGCGCCGACTGTCG-MGB-3’ (gb/AL123456,Rv0667) RIF-2小瓶
rpoB探针覆盖的典型突变：
rpoB rPb1(rPb1288-13(1h)): 5’-CalFluoRed 610-GCTGGCTGGTGCC-MGB-3’ (氨基酸507-511; 例如Q510E,gb/EF628328)
rpoB rPb2 (rPb1309-15(2c)): 5’-NED-TCTGGTCCATGAATT-MGB-3’(氨基酸513-518;例如D516V, gb/JF269609; D516Y,gb/HQ286625)
rpoB rPb3(rPb1329-13(3S)): 5’-VIC-CAACCCCGACAGC-MGB-3’ (氨基酸520-524; 例如L521M, gb/AB711174)
rpoB Pb4(Pb1345-13(4k)): 5’-6FAM-CTGTCGGCGCTGG-MGB-3’ (氨基酸530-533; 例如S531L, gb/HM179030, S531W, gb/GU904014)
rpoB Pb5(Pb1285-14(5a)): 5’-CalFluoRed 610-CAGCTGAGCCAATT-MGB-3’ (氨基酸510-514; 例如L511P,gb/JQ414016)
rpoB Pb6(Pb1307-14(6d)): 5’-NED-AGAACAACCCGCTG-MGB-3’ (氨基酸517-521; 例如N518I, gb / AB711171)
rpoB rPb7(rPb1338-14(7h): 5’-VIC-CTTGTGGGTCAACC-MGB-3’ (氨基酸523-527; 例如H526Y, gb/AY271365; H526D, gb/HQ844251)
rpoB Pb8(Pb1337-14(8J)): 5’-6FAM-AGCGCCGACTGTCG-MGB-3’ (氨基酸527-531; 例如L530M, gb /DQ205438)
katG探针所覆盖的典型突变：
inhA上游启动子(USP)探针覆盖的典型突变：
B. 分析方案
将Abbott实时MTB RIF/INH耐药性分析的样本，包含分析对照物，上样于m2000sp仪器上。使用DNA样品制备试剂从Abbott mTM Sample Preparation SystemDNA提取DNA。将扩增/检测试剂并入主混合物，并通过m2000sp转移至96孔PCR盘。通过m2000sp将样品洗脱液添加至96孔PCR盘用于后续的扩增/检测反应。同样，样品制备和PCR平板制备也可手工实施。手工密封平板并将其转移至m2000rt用于扩增和实时荧光检测反应。每一运行需要阴性对照和阳性对照。在m2000rt工作站自动报告患者结果。
循环条件：
C. 结果
图3显示了用于药物敏感性(图3A)和耐药性(图3B)细菌的利福平和异烟肼检测结果。
另外，检测了来自Kreiswirth博士(TB耐药性方面的专家)的70个纯化的临床MTB基因组DNA样品。所有70个基因组DNA样品均具有DST结果和测序结果。在临床样品中检测到下列突变：rpoB：L533P、S531L、S531W、S531F、H526Y、H526D、H526R、H526N、D516V、D516Y、D516G、D516A、H512R、L511P以及插入514-515。katG：S315T1、S315N以及S315I。inhA上游启动子： C15T和T8A。
结果如下所示：
还分析了获自孟加拉国的290个MTB培养的临床分离物。
结果如下所示：
所有290个培养的临床分离物均具有DST结果。使用AM灭活试剂(IR)处理这些培养的临床分离物(经热灭活)，然后通过m2000sp样品制备处理。
本说明书提及的所有专利、专利申请公开、期刊文章、教科书以及其它公开文献均表明本公开内容所属领域技术人员的水平。所有这些公开文献均通过引用并入本文，其程度等同于各公开文献被具体和单个指明通过引用并入一样。

Claims (34)

1.一种检测受试者中分枝杆菌复合群(MTB)的存在和抗生素耐药性的方法，所述方法包括如下步骤：
a) 使所述样品与一种或多种用于检测利福平和异烟肼耐药性基因存在的第一试剂接触；和
b) 使用所述第二试剂实施利福平和异烟肼耐药性检测分析。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法进一步包括如下步骤：c) 使来自受试者的样品与一种或多种用于检测MTB存在的第二试剂接触；和d) 使用所述第一试剂实施MTB检测分析。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述第一试剂和第二试剂选自一种或多种核酸引物和一种或多种核酸探针。
4.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述MTB检测分析与利福平和异烟肼耐药性检测分析是核酸扩增分析。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述扩增分析是实时PCR。
6.根据权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述利福平和异烟肼耐药性检测分析检测选自rpoB RRDR、katG以及inhA上游启动子的一个或多个靶区中的突变。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述rpoB中的突变位于选自D516V、H526Y、H526D和S531L的一个或多个氨基酸。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述katG突变是氨基酸改变S315T1，并且所述inhA上游启动子突变是核酸突变-C15T。
9.根据权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述MTB检测分析检测选自IS6110和PAB的一个或多个靶区。
10.根据权利要求4所述的方法，其中所述第一试剂和第二试剂是SEQ ID NO: 1-21中的一种或多种。
11.根据权利要求1至10任一项所述的方法，其中所述样品选自痰、BAL以及痰和BAL的NALC沉淀物。
12.根据权利要求1至11任一项所述的方法，其中所述MTB是选自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、非洲分枝杆菌(Mycobacterium africanum)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、牛分枝杆菌BCG(Mycobacterium bovis BCG)、卡氏分枝杆菌(Mycobacterium canettii)、田鼠分枝杆菌(Mycobacterium microti)、山羊分枝杆菌(Mycobacterium caprae)以及海豹分枝杆菌(Mycobacterium pinnipedii)的一种或多种分枝杆菌。
13.根据权利要求1至12任一项所述的方法，所述方法进一步包括基于所述MTB检测分析结果诊断所述受试者中MTB感染的步骤。
14.根据权利要求1至13任一项所述的方法，所述方法进一步包括基于所述利福平和异烟肼耐药性检测分析来鉴定所述MTB对利福平和/或异烟肼具有耐药性的步骤。
15.根据权利要求1至14任一项所述的方法，其中先于所述利福平和异烟肼检测分析实施所述MTB检测分析。
16.根据权利要求1至15任一项所述的方法，所述方法进一步包括基于所述MTB检测分析与所述利福平和异烟肼检测分析的结果确定治疗行动过程的步骤。
17.根据权利要求16所述的方法，所述方法进一步包括施用所述治疗的步骤。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述治疗包括施用联合抗生素6个月。
19.根据权利要求15至18任一项所述的方法，所述方法进一步包括在所述治疗过程中或之后重复权利要求1所述的方法的步骤。
20.一种检测受试者中分枝杆菌复合群(MTB)的存在和抗生素耐药性的方法，所述方法包括如下步骤：
a) 使所述样品与一种或多种用于检测利福平和异烟肼耐药性基因存在的第二试剂接触；
b) 使用所述第二试剂实施利福平和异烟肼耐药性检测分析；以及
c) 基于所述MTB检测分析和所述利福平和异烟肼检测分析的结果确定治疗行动过程。
21.根据权利要求20所述的方法，所述方法进一步包括施用所述治疗的步骤。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述治疗包括施用联合抗生素6个月。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述抗生素包括所述受试者对其不具有耐药性的抗生素。
24.根据权利要求20至23任一项所述的方法，所述方法进一步包括在所述治疗过程中或之后重复权利要求18所述的方法的步骤。
25.一种试剂盒，所述试剂盒包含：一种或多种用于检测利福平和异烟肼耐药性基因存在的试剂。
26.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述第一试剂和第二试剂选自一种或多种核酸引物和一种或多种核酸探针。
27.根据权利要求26所述的试剂盒，其中所述引物为扩增引物。
28.根据权利要求25所述的试剂盒，其中所述用于检测利福平和异烟肼耐药性基因存在的试剂包括用于检测选自rpoB RRDR、katG以及inhA上游启动子的一个或多个靶区中的突变的试剂。
29.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述rpoB中的突变位于选自D516V、H526Y、H526D以及S531L的一个或多个氨基酸。
30.根据权利要求28所述的试剂盒，其中所述katG突变是氨基酸改变S315T1，并且所述inhA上游启动子突变是核酸突变-C15T。
31.根据权利要求25至30任一项所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含一种或多种用于检测MTB存在的试剂。
32.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述用于检测MTB存在的试剂包括用于检测选自IS6110和PAB的一个或多个靶区的试剂。
33.根据权利要求25至30任一项所述的试剂盒，其中所述第一试剂和第二试剂是SEQID NO: 1-21中的一种或多种。
34.根据权利要求25至33任一项所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含选自对照核酸、缓冲剂、核酸聚合酶以及说明书的一种或多种另外组分。
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